JPH05508835A - 慢性関節リウマチの免疫診断検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 慢性関節リウマチの免疫診断検定法 本発明は慢性関節リウマチ（ＲＡ）の検定法に関する。さらに詳しくは、本発明 は、ＲＡが疑わしい又はＲＡの治療を行っている患者におけるヒト免疫グロブリ ンＡ−Ｉｌｌ−抗トリプシン複合体（Ｉ　ｇ　Ａ−ａｔＡＴ）の検定法に関する 。

従来技術の説明 慢性関節リウマチは、免疫性機能不全及び遺伝的感受性が関係する未解決の全身 性炎症として説明されてきている。これはしばしば、初期の段階では、鎮静と悪 化の繰り返しを特徴とし、その後の段階では、とりわけ骨及び軟骨の組織破壊を 導く慢性の肉芽化反応（パンヌス形成）を特徴とする。ＲＡにおける溝膜は過剰 活性的な、免疫学的に刺激されたリンパ器官の多（の特徴を有し、モしてＴサプ レッサ一対Ｔヘルパーの比率が著しく減少することが認められてきた。

ＲＡを他の急性又は慢性炎症疾患から見分ける確実な試験法はないので、ＲＡを 他の関節炎、　例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強直性を椎炎（ＡＳ ）、多関節性通風（ＰＡＧ）又は関節炎性乾せん（ＰＳＡ）から区別するのはし ばしば難しい。ＲＡの診断は通常、アメリカ・リウマチ協会（ＡＲＡ）の診断基 準： （１）　朝のこわばり； （２）　運動時の関節の圧痛及び痛み：（３）　関節の軟組織の腫れ： （４）　第２関節の軟組織の腫れ（３力月以内に）：（５）　対称関節（遠位指 節間関節は除く）の軟組織の腫れ；（６）　皮下結節 （７）　Ｘ線写真上の変化； （８）　リウマチ因子に対する血清の陽性：に従って行われ、これらの因子のう ち３つ又は４つの診断がなされると、ＲＡのおそれがあると考えられ、５つ以上 の因子の診断がなされるとＲＡと断定される。

最も広く用いられるＲＡの免疫診断検定法であるいわゆるワラ−・ローズ検定法 は、ＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体（リウマチ因子）に基づくものである。リウ マチ因子（ＲＦ）は、ＲＡに悩む人々の約６Ｏ−７０％に存在する。この試験は 、誤った陽性又は陰性が好ましくないほど多（出るものであり、そして治療に対 する反応を調べたり又は病気のプロセスの活性化又は再活性化を予想するもので はないので、満足なものではない。さらに、これは血球凝集又はラテックス凝集 終点に基づくものであるので、診療所ごとに標準化するのは難しい。さらに重要 なことは、この疾患の慢性的患者の約７０％のみに陽性の結果が出せるに過ぎず 、いづれにしても、ＲＦの免疫病理学的役割は未だ立証されていない。

最近、ＲＡにおける主要免疫病理学的因子としてＩｇＡとα１−抗トリプシン（ α、ＡＴ）との共有結合（Ｓ−５）複合体が注目され始めてきた。この複合体は ＩｇＡｉｌ髄腫症の患者の血清中にかなり高いレベルで見いだされるが、ＲＡ患 者の循環系でも異常に多量に検出された。次の証拠は、ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体 の循環量の測定が、一般に用いられる方法よりも適切な慢性関節リウマチの免疫 診断指標となることを示している： （１）　これは、未治療の慢性関節リウマチの実質的に全ての患者の循環及び関 節液中に異常に高レベルで存在する。（一般に用いられているリウマチ因子はそ のような患者の約７０％のみの血清中で検出されるに過ぎない）。

（２）　ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の血清レベルは、第２系統の抗リウマチ薬での 治療に対して有利な臨床反応を示す患者では明らかに低下する。

（３）　これはまた、びらん性関節変化を示す患者において異常に高レベルで検 出することができる。

（４）　リウマチ因子及び急性期タンパク質（例えば、ハプトグロビン及びＣ− 反応性タンパク質）のようなＲＡにおいて測定される他のいわゆる疾病マーカー とは異なり、試験管及び生体内いずれの研究においても、Ｉ　ｇ　Ａ　ｔｔ＋　 Ａ　Ｔ複合体の免疫病理学のもっともらしい説明となる。すなわち、ＩｇＡ−σ 、ＡＴ複合体の形成は、リウマチ患者の血清又は関節液において必要なａｌＡＴ 　（主な抗プロテアーゼの１種）全体の１／３を消費するばかりでなく、ＩｇＡ −ａ、ＡＴ複合体自体は、（別の補体経路の活性化に基づく細胞溶解プロセスに より）分離したマクロファージから分解性のタンパク分解酵素を放出しうる。さ らに、単離した複合Ｎｅｗ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１ 旦、ｐｐ、４３−４Ｖ、及びスタンウォース、　Ｄ、　Ｒ，、’金又はＤ−ペニ シラミンで治療した慢性関節リウマチにおけるＣ−反応性タンパクにより測定し た、免疫グロブリンＡ及びａ、−抗トリプシンの複合体の関係、その構成成分及 び急性期反応”、Ｂｒ１ｔｆｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ｏｇｙ１２６、ｐｐ、ａｓｌ−３５３（１９８７）参照）。

アガロースへの第二次元電気泳動によるその確認からなる、二次元免疫電気泳動 によるものである。その後、複合体の量を、面積測定法によりその沈殿のピーク （続いて乾燥及び染色したプレート上における）下の面積を測定することによっ て定量する（任意単位）。しかしながら、これは面倒で時間のかかる方法である 。

従って、ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の簡単な検定法が望まれる。初期の試みはＥＬ ＩＳＡを用いて行われ、これは、抗−ＩｇＡ又は抗−σ、ＡＴ抗体のいずれかを まず微量滴定プレートの穴に塗布し、その後１ｇＡ−ｇｌＡＴ複合体含有試験試 料と共にインキュベートし、それぞれ抗−ａ、ＡＴＩｇＧ又は抗−ＩｇＡＩｇＡ 抗体のいずれかと反応させ、最後に酵素標識した抗−ＩｇＧ抗体で明らかにする ものである。しかしながら、この方法は、患者からの試料中に定量化されない量 でやはり存在する非複合体化ＩｇＡ又はσ、ＡＴの結合が結果として生じ、これ がＩｇＡ−ａＩＡＴ複合体の定量測定を妨げるので、ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体の ＩｇＡ又はσ１ＡＴに対する抗体への結合に基づく検定法によって、そのような 複合体を確実に検出することはできないという問題がある。

従って、ヒトＩｇＡ　ａ＋ＡＴ複合体に特異的な抗体を製造する必要があった。

ウサギを精製１　ｇ　Ａ　ｆｉｔ　Ａ　Ｔ複合体で免疫化することによってこれ を行う初めの試みは、生じた抗血清がやはり非複合体化ＩｇＡ又はａ、ＡＴと反 応したので、失敗であった。

発明の概要 意外にも、遊離１ｇＡ及びσ、ＡＴとは実質的に非反応性であるが、自然に生じ る■ｇＡ１１ＡＴ複合体に対しては特異的な、単一クローン性抗体を製造しうろ ことを見いだした。さらに、そのような抗体を骨髄腫を有するマウスの牌細胞の フュージョンから製造しようと試みたところ、牌細胞の生成量は非常に少なく、 ハイブリドーマの生成は不可能であった。この問題の解決法を見いだすことが必 要であり、これは、マウスのマクロファージに対するヒトＩｇＡ−ａ、ＡＴ複合 体の毒性によって生じるものであった。単離した腹膜のマウスマクロファージを ヒトＩｇＡ−α、ＡＴ複合体と共にインキュベートすることにより、細胞質酵素 ＬＤ■（がたくさん放出され、その後、マクロファージが破壊されることが立証 された。

この問題は結局、下記のように解消された。

さらに、ヒトＩｇＡのＦ、Ｃ領域に見られるアミノ酸配列又はその類似物を有す る第１ペプチドフラグメント及びヒトσ、ＡＴに見られるアミノ酸配列又はその 類似物を有する第２ペプチドフラグメントからなり、上記第１及び第２フラグメ ントが互いに共有結合している、免疫抗原性ペプチドが合成された。上記ペプチ ドに対して生じる抗体は、遊離ヒトＩｇＡとは実質的に非反応性であり、遊離ヒ トａ、ＡＴとは実質的に非反応性であり、そして自然に生じるヒトＩｇＡ及びａ 、ＡＴの複合体（ＩｇＡ及びａ　ＩＡ　Ｔ　）と結合する。意外なことに、上記 ペプチドに対して出現したポリクローン性抗体は、遊離１ｇＡ及びα、ＡＴと実 質的に非反応性であることも分かった。特異性が同じ又はよりすぐれた単一クロ ーン性抗体が、これに対して出現可能なことは熱論のことである。さらに、自然 に生じる複合体に対抗する成分を有する最近開発されたキメラ抗体（ライヒマン 、Ｌ０、クラーク。

Ｍ９、ワルドマン、Ｈ０及びウィンター、Ｇｏ、ネイチャー　３３２、Ｉ）り、 ３２３−３２７、（１９８８）　）、単一鎖抗体（ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ３ ８１０１６４９、ジエネックス社）及び単一ドメイン抗体（ワード、Ｅ、Ｓ、　 、ギュツソウ、Ｄ８、グリフイス、　Ａ、　Ｄ、　、ジョーンズ、Ｐ、　Ｔ、及 び　ウィンター。

Ｇ１、ネイチャー　冬Ａ１、ｐｐ、５４４−５４６、（１９８９））及びペプチ ドの製造を予想することができる。

従って、本発明はヒト■ｇＡ−α、ＡＴ複合体の抗原性決定基に対して特異的な 抗体ドメインを含むリガンドを提供するものであり、この抗体ドメインは遊離ヒ ）ＩｇＡ及び遊離ヒトａ、−抗トリプシンと実質的に非反応性である。

本発明はまた、慢性関節リウマチ（ＲＡ）の指標としてのヒトＩｇＡ及びσ１− 抗トリブシン複合体（ＩｇＡ　ａ＋ＡＴ）を含有することが疑わしい分析物にお けるＲＡの検定法であって、上記複合体と上記リガンドとの免疫学的結合を検出 又は測定する上記の検定法を提供するものである。

さらに本発明は、ＲＡの指標としてのヒトＩｇＡ及びＧ１−抗トリプシン複合体 （ＩｇＡ−α＋ＡＴ）を含有することが疑わしい分析物におけるヒトＲＡの検定 法を実施するための検定キットを提供するものであり、このキットは、ＩｇＡ− ａ。

ＡＴＴ合体及び、抗体ドメインがＩｇＡ−σ、ＡＴの抗原性決定基に対しては特 異的であるが、遊離ヒトＩｇＡ及びヒトａ、ＡＴとは実質的に非反応性であるリ ガンドよりなるものである。　、 好ましい具体例の説明 本明細書を通して次の定義を用いる： ゛検定゛とは、検出又は測定法を意味する。

”　ＩｇＡ−ａ、ＡＴ複複合体色は、断りがなければ、ヒトの患者の血清に見い だされるような複合体を意味する。

Ｆａｂ’　フラグメントは、゛Ｙ°形抗体構造の２つの゛腕゛の１つの゛腕′を 表し：フラグメントは抗原と結合する能力を保持する。

Ｆ　（ａｂ’　）　２フラグメントは、ジスルフィド結合によって結合した２つ のＦａｂ”腕゛を表し；フラグメントは抗原と結合する能力を保持する。

Ｆｃフラグメントは、゛Ｙ゛形抗体の単一の゛尾゛又は中心軸を表す。

本発明のリガンドは、ヒトＩｇＡ及びヒトａ、ＡＴの複合体（Ｉｇ、Ａ−α、Ａ Ｔ）の抗原性決定基に対して特異的な抗体ドメインを含む。この抗体ドメインは 遊離ヒトＩｇＡ及びヒトσ、ＡＴと相対的に非反応性である。ヒトＩｇＡ及びヒ トα１ＡＴの複合体（ＩｇＡ−＋＋＋ＡＴ）は、慢性関節リウマチに悩む患者か らの分析物中に見られる自然に生じる複合体である。以下に例示するようにかな らずしもそうではないが、リガンドはそのような複合体に対して生じる単一クロ ーン性抗体よりなるのが最も好ましい。最も好ましい単一クローン性抗体は、下 記の特許供託物であるハイブリドーマから得られる。自然に生じる精製複合物に 対して生じるポリクローン性抗体は、ＩｇＡ　ａ＋ＡＴ複合体に特異性ではなく 、生じる抗血清は非複合体化ＩｇＡ及びσ、ＡＴと反応しないことも分かった。

あるいは、リガンドは本発明の合成ペプチドに対して生じる抗体であってもよい 。この合成ペプチドは、ＩｇＡ−ａＩＡＴ複合体に特異的な免疫抗原性決定基を 含むＩｇＡＨ鎖及びｇ、ＡＴ鎖配列の部分を表す短鎖ペプチドの共有結合物であ る。具体例において、本発明は、互いに共有結合した、ヒトＩｇＡのＦｃ領域に 見られるアミノ酸配列又はこの配列の類似物を有する第１ペプチドフラグメント 、及びヒトａ１ＡＴに見られるアミノ酸配列又はこの配列の類似物を有する第２ ペプチドフラグメントを提供しそして用いるものである。共有結合の好ましい形 は、ヒトＩｇＡないしヒトａＨＡＴのＦｃ領域において、ヒトＩｇＡのＣ末端に 関して、末端から２番目のシスティン残基の結合の免疫抗原性３次元的配座を保 護するＳ−８結合である。好ましいＩｇＡ−ａ、ＡＴＴ合体の構造はまだ完全に 解明されていない。しかしながら、共有Ｓ−８架橋は、ヒトσ、ＡＴの唯一のシ スティン残基（第２３２番）と、高分子量ＩｇＡの形成の際にα鎖が結合するこ とが知られているヒトＩｇＡのα鎖の末端から２番目のシスティン位置を占める システィン残基（第４９５番）との間に生じるようである。

第１ペプチドフラグメントは、ヒトＩｇＡのＣ末端に関して、末端から２番目の システィン残基を含有し、５−２０のアミノ酸残基、好ましくは１０−１５のア ミノ酸残基を含む、ヒトＩｇＡのＦｃ領域のアミノ酸配列又はその類似物に相当 するのが好ましい。第１ペプチドフラグメントは、ヒトＩｇＡａ鎖の残基４８７ −４９６に相当するアミノ酸配列 Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＧｌｕＪａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔ ｙｒ又はその類似物を少なくとも含有するのが好ましい。これは、安定な結合の 形成を導く最少の配列の長さである。最も好ましいのは、アミノ酸配列が、ヒト ＩｇＡσ鎖の残基４８４−４９６に相当するＶａ　１−８ｅｒ−Ｖａ　１−Ｖａ ｌ　−Ｍｅ　ｔ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｃ ｙｓ−Ｔｙｒ又はその類似物からなるものである。

第２ペプチドフラグメントは、ＩｇＡａ−鎮に共有結合するシスティン残基を含 み、５−２０のアミノ酸残基、好ましくは１０−１５のアミノ酸残基よりなる、 ヒトａ、ＡＴのアミノ酸配列又はその類似物に相当するのが好ましい。第２ペプ チドフラグメントは少な（とも、ヒトａｌ−ＡＴの残基２３１−２３４に相当す るアミノ酸配列 Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ 又はその類似物からなるのが好ましい。これは、安定な結合の形成を導く最少の 配列の長さと考えられる。最も好ましいのは、アミノ酸配列が、ヒトａＩＡＴの 残基２２５−２３７に相当する Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙ ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−３ｅｒ又はその類似物からなるものである。

従って、本発明の特に好ましい免疫抗原性ペプチドは少なくとも次のアミノ酸配 列： 又はその類似物からなる。

最も好ましいのは、免疫抗原性ペプチドが次のアミノ酸配列：又はその類似物（ 以後ペプチドＦＯ１７−ＦＯ１８と呼ぶ）からなるものである。

ＩｇＡ−σ、ＡＴ複合体（本来の複合体又は合成ペプチド）に対する抗体は、こ の分野で周知の方法によって容易に製造しつる。すなわち、ポリクローン性抗体 はウサギからしゃ血することによりて得ることができる。単一クローン性抗体は 、胛細抱を常に過剰に、フュージョン状態で用い、そして生じたハイブリドーマ の細胞溶解反応を必要ならば新鮮な牌細胞を加えることによって妨げる、マウス におけるケーラー・ミルスタイン法によって製造することができる。次に、ハイ ブリドーマを複合体に対する特異性についてふるい分けなければならない。その ような単一クローン性又はポリクロナール性抗体のＦａｂ’及びＦ　（ａｂ’　 ）　２フラグメントは、周知の方法で製造しつる。複合体に対する抗体ドメイン をもたらすこれらの分子のどのようなものも用いることができる。

診断の目的の場合、抗体は試験個体からの自然に生じたＩｇＡ−ａｌＡＴ複合体 と反応して、検出可能な生成物となる。ＩｇＡ−σ、ＡＴの存在を定量化するた めのどのような試験に用いられる抗体組成物も、自然に生じたＩｇＡ−ａ、ＡＴ 複合体の全てと反応するのに十分な抗体を含有していなければならない。抗体の そのような診断に有効な量は、当業者に周知の多くのファクターで多少変化する 。これらのファクターには、例えば用いる試験の感度及び特異性、使用器具及び 分析物の量が含まれる。血清試料は関節液よりもＲＡをよく示すので、血清試料 が最も好ましい分析物である。

好ましくは血清又は関節液における、ＩｇＡ−ａ、ＡＴ複合体のレベルの検出及 び測定は、診断が一般に難しい場合、゛初期の゛　（前びらん性段階）ＲＡ患者 のよりよい治療を促すために、ＲＡの予後の指標として用いてもよい。

酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）が本発明において好ましいが、他の検 定法、例えば放射免疫測定、沈殿、凝集、直接及び間接免疫蛍光検査及び補体結 合、を用いてもよい。これらの検定法には、競合、阻害又はサンドイッチタイプ のようなどのような方法も用いつる。

検定には一般に検出可能な標識が必要である。抗ＩｇＡ−σ、ＡＴ抗体、抗抗体 （例えば、ヤギ抗ウサギ血清）、抗ＩｇＡ抗体又は抗ＩｇＡ抗体を標識しうる。

有用な標識には、蛍光標識、例えばフルオレセイン、ローダミン又はアララミン 、及び放射性同位元素、例えば１４ｃ、１３１１．１２５Ｉ及びｓｓＳが含まれ る。好ましい酵素標識には、ホルセラディシュペルオキシダーゼ、β−Ｄ−グル コシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ とペルオキシダーゼ及び酸性ホスファターゼがある。

現在用いられている前記標識の検出法は周知であり、比色法、発光法及び蛍光法 、並びに放射性同位元素の各種装置による検出法が含まれる。

検定は通常、検出可能な生成物を支持体に結合し、非結合血清試料から確実に容 易に分離できるように行う。

有効な支持体には、ガラス又はプラスチック表面、特に試験管の内面又は試験プ レートの表面が含まれる。酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）又は放射免疫法（ ＲＩＡ）に有用な平らな面の一般的な例には、ガラス、ニトロセルロース紙又は プラスチック、例えばポリスチレン、ポリカーボネート又は各種ポリビニルが含 まれる。反応生成物を視覚的に検出することができる巨視的方法、例えば血液凝 集法、に使用しつる粒子には、ヒツジの赤血球又は人類の０赤面球のような生物 学的粒子、木炭、ベントナイト又はラテックスビーズのような生物学的に不活性 な粒子が含まれる。そのようなビーズはポリスチレン、ポリビニルピロリドン又 は各種ポリビニルから形成することができる。支持体面への付着は、公知の方法 による直接吸着、強制吸着又は化学カップリングによって行いうる。

好ましい結合式は次の通りである（＊；標識した物質）：サンドイッチ検定法 支持体／抗ＩｇＡ−σｒ　Ａ　Ｔ　／　Ｉ　ｇ　Ａ−むＡＴ分析物／抗ＩｇＡ＊ ；支持体／抗ＩｇＡ−ａ＋ＡＴ／ＩｇＡ−ａ＋ＡＴ分析物／抗ａ、ＡＴ＊；支持 体／抗ＩｇＡ−１１１ＡＴ／ＩｇＡ−ａ、ＡＴ分析物／抗ＩｇＡ−抗ａ、ＡＴ＊ （２番目の抗体は１番目の抗体と異なる特異性を有する）阻害検定法 支持体／ＩｇＡ−ａ、ＡＴ／抗１ｇＡ−ａ、ＡＴ＊　十　分析物（支持体／Ｉｇ Ａ−α、ＡＴの添加前に予備インキュベートした）広範囲のキットを本発明の検 定法の実施に用いることができる。これらは、本発明のリガンド及びＩｇＡ−ａ 　１ＡＴ複合体からなる。検定キ・ソトは、（Ａ）キットが、上記の他に、第１ リガンドと結合するとＩｇＡ−σ、ＡＴ１合体を検出することができる抗体ドメ インを含む第２検出リガンドを提供するサンドイッチ検定法、又は（Ｂ）検定キ ットの上記１ｇＡ−σ、ＡＴ複合体成分が免疫抗原性類似体であり、さらに好ま しくは自然に生じる複合体の免疫抗原性合成ペプチドである競合又は阻害検定法 のいずれかによる複合体の検定手段を提供するのが好ましい。

リガンドは、当業者には明らかなように、上記のポリクローン性又は単一クロー ン性抗体及びそのＦ　（ａｂ’　）　２フラグメント又は単一ドメイン又は単一 鎖抗体であるのが好ましい。

サンドイッチ検定法における検出リガンドは、複合体全体に対して特異的な抗体 である必要はない。分析物ＩｇＡ−α、ＡＴに標識を付ける手段を提供する（捕 捉抗体への分析物の付着を妨げることなく）どのようなりガントも用いることが できる。すなわち、これは、ＩｇＡ又はα、ＡＴに対して生じる抗体であるのが 都合よい。

サンドイッチ検定法における検出リガンド、競合検定法で分析物と競合する抗体 及び阻害検定法で分析物と予備反応する抗体は、どこかの段階で標識しなければ ならない。これらの試薬は容易に標識される結合として提供することができるが 、別の成分として標識される抗体をさらに提供することによってこれらを単に標 識するとさらに都合がよい。一般に、第２抗体は免疫グロブリンであり、それ以 上の抗体は異なる宿主動物において出現させた抗免疫グロブリンとする。

通常、キットの全ての成分は別々の容器内にある。

検定キットには、適当な洗浄液、酵素基質及びバッファー溶液に加えて、計算及 び結果の判断についてのアドバイスを含めた詳細な指示シートが付いている。

合成ペプチド又は自然に生じた精製ＩｇＡ　ａｌＡＴ複合体（共有結合した）は 比較的安定しているが、試験試料の取り扱いを誤る（例えば還元条件にさらす） と、解離したものになることがある。

血清及び関節液の試料のような分析物を、検定を待つ短時間の間、４℃に保つこ とが重要である。しかしながら、１日か２日試験することができないならば、緩 やかな遠心分離によりこれらから細胞及び非細胞片を除去した後、これらを冷凍 状態（−２０℃又は好ましくはこれ未満の温度）で貯蔵すべきである。

次の実施例は本発明を説明するものである。゛ツイーン゛は登録商標名である。

実施例１ ペプチドＦ０１７とＦ０１８との混合ジスルフィドの形成ＬＫＢ　Ｂｉｏｌｙｎ ｘ　４１７０ペプチド合成器中で９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏ ｃ）固相ペプチド合成を用いて、ペプチドＦＯ１７及びＦ０１８を合成した。両 ペプチドＦ０１７及びＦＯ１８中のシスティン（Ｃｙｓ）残基はＳ−トリフェニ ルメチル（ＴＲＴ）の側鎖保護がなされていた。

酢酸に加えた１５ＩＩＩＩＩＯ１のヨウ素：水（８：　２）を、酢酸−水（８： 　２）に加えた５ｍ１ｏｌＦ０１８及び５ｍｍｏｌＦ０１７の混合物に加えた。

混合物をそっと混合し、４℃で１６時間放置した。

ペプチドＦＯ１７−ＦＯ１８も別に同様に処理して、対照とする。各ペプチド調 製はメタノール勾配（Ａ＝水に加えた５％メタノール、Ｂ＝水に加えた９５％メ タノール）を有するＮｅｃｌｅｏｓｉｌ　５　Ｃ１８逆相　ＨＰＬＣカラム上で 行った。ＨＰＬＣ痕跡を比較し、ＦＯ１７及びＦＯ１８混合物から得た特別のピ ークからなるフラクションを集め、Ｆ０１７及びＦ０１８ペプチド複合体として 用いた。

同様な方法で、ペプチドＶａｌ−１１ｅｔ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ− Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−（：ｙｓ−Ｔｙｒ及びＨｉｓ−Ｃ７０−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを製造 することができる。

同様に、ペプチド結合、 も同じ方法で製造することができる。

ニューシーラント白ウサギに、精製ヒトＩｇＡ−ａｌＡＴ複合体２００μｇ又は 完全フロインドアジュバントに乳化させたペプチド結合物（ＦＯ１７−ＦＯ１８ ）２００μｇを皮下注射し、同量の複合体又は不完全フロインドアジュバント中 に乳化させたペプチド結合物を１４−２８日にさらに注射した。約１カ月後、動 物の血を採った。

実施例３ ２！」１■ｖ４ｈ５９−２１１カケ一一えｑ斉！開裂フラグメントの製墳１）８ ６．　５＋７）飽和（ＮＨ４）　２５０５ｍ液ｌ容量を、】−容量ノウサキ血清 に４℃で撹拌しながら漬加した（５０％飽和の最終塩濃度にした）。

６時間放置した後、沈殿物を遠心分離（３０分当たり３０００ｇ）によって分離 し、上澄みを捨てた。沈殿物を０．　３容量の０．０１燐酸塩バツフアーｐ）（ ８０に再溶解し−同じバッファーを３回変えて透析した。この最終透析溶液（例 えば、５ｍ１）を、０．０１Ｍ燐酸塩バッファーｐＨ８，０で予め平衡にしたＤ ＥＡＥ−セファデックスカラム（例えば、１２゜Ｏｘ１ｃｍ）上に置き、同じバ ッファーで溶離した。２．０ｍｌのフラクションを集めた。タンパク’ｘ＜すな わち、ＩｇＧ）に相当するフラクションをプールし、限外濾過により濃縮した。

勾配メーカー中の各バッファー３カラム容量を用い、塩勾配（すなわち、Ｏ，Ｏ ＩＭ−０、ＩＯＭ　ＰＯ４）を施すことによって、さらにＩｇＧ含有フラクショ ンをカラムから回収した。

全フラクションの組成物を回収し、これを抗全ヒト血清に対する免疫電気泳動に よってチェックし、そしてＩｇＧのみを含有するフラクシヨンをプールし、限外 濾過Ｊこよって濃縮し、そして−２０’Ｃより下の温度で貯蔵した。

本来のＩｇＧを、パパインによってヒンジ部分で加水分解すると、２つの抗原結 合フラグメント、Ｆａｂ’、　及び■］鎖のＣ−末端の半分のダイマー１つ、Ｆ Ｃ′、を生じる（ポーター１９５９）。これらは全て同じ大きさく分子量５０゜ ０００）であるが、イオン交換クロマトグラフィーで分離することができる。一 般に、免疫グロブリンのタンパク分解フラグメントは、非共有結合で保たれてい ないので、非変性条件下で分離することができる。

手順 １、１ｍｇのパラフィンを、１００μｌのＯ，１Ｍ燐酸ナトリウムバッファーに 溶解し、これの５０μ■をＩｇＧに素早く加える。そっと混合し、３７℃で一晩 （１６時間）インキュベートする。

２、　水、次いで３Ｘ５００ｍｌの０．０１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，５に対し て透析する。

３、イオン交換体を０．０１Ｍ酢酸塩バッファーで平衡にし、カラムに詰め、室 温の同じバッファーで洗浄する。

４　試料及び交換体の両方を十分に平衡にし、試料をカラムに入れ、そして２８ ０ｎｍでの吸光度がベースラインに戻るまで、少なくとも６０ｍ１の出発バッフ ァーで溶離する。次に線状勾配の全容積２００ｍ１の室温のＯ，ＯＩＭ−ＬＭ酢 酸塩全てを施す。５ｍｌのフラクションを集め、２８０ｎｍでの吸光度をモニタ ーする。

５、　出発バッファーで溶離したタンパク質及び勾配における第１のピークは主 としてＦａｂ’　からなる。第３のピークはＦｃである。３つのピークにおける タンパク質収率は、本来のＩｇＧの約９０％にすべきである。

（ｂ）　Ｆ　（ａｂ’　）２、Ｆａｂ’及びｐＦｃ’　７ラグメントの製造本来 のＩｇＧをペプシンでまた加水分解する。しかしながら、この酵素は、少なくと も１つのα−α鎖ジスルフィド結合のＣ末端側で開裂して、２価の抗原結合フラ グメント、Ｆ　（ａｂ’　）２を生じる。これはまた、Ｆｃ部分の一部を小さい ペプチドに分解して、α鎖のＣ末端の１／４のダイマー、ｐＦｃ’を生じる。Ｆ （ａｂ’　）２フラグメントは１価のＦａｂ’　フラグメントにすることができ る。

手順： １、　２ｍｇのタンパク質を、２００４１の酢酸塩バッファーに溶解し、これの １００μｍをＩｇＧ溶液に加える。そっと混合し、３７℃で一晩（１６時間）イ ンキュベートする。

２、２Ｍ）リス（約３００μｌ−これは不可逆的に酵素を不活性化する）で中和 し、１０分当たり２０００ｇで遠心分離して、沈殿物を除去する。

３、　上澄みをＧ−２００カラムにかけ、ＴＢＳで溶離する。２．５ｍｌのフラ クションを集め、２８０ｎｍでの吸光度をモニターする。

４、　第１の主ピークはＦ　（ａｂ’　）　２である。この前は非消化物質であ り、そのすぐ後ろはＦａｂ’又は無傷のＦｃである。これらのより少量の生成物 は時には、完全に分解されていないＦ　（ＡＢ’　）　２からのものであり、主 ピークの肩を形成する。次のピークのｐＦｃ’　及び小さなペプチドは全カラム 容積Ｆａｂ′に溶離される。必要ならば、次の手順によってＦ　（ａｂ’　）　 ２を直接Ｆａｂ’にすることができる： Ａ、　Ｆ　（ＡＢ’　）　２を含むフラクシヨンをプールし、５ｍｌに濃縮する （約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にすべきである）。０．５ｍｌの１．　Ｍ　 トリスバッファー及び５０μｌのＥＤＴＡ溶液を加える。

８、　５０μｌのジチオトレイトール溶液（新しく製造した１Ｍトリスバッファ ー中の０．１Ｍジチオトレイトール）を加え、撹拌しながら封管中、室温で１時 間インキュベートする。

Ｃ１氷上で冷却し、ホイルで覆い、５０μｍのヨードアセトアミド溶液を加えた 。撹拌しながら、水浴中で３０分間インキュベートする。

Ｄ、　５μｌのジチオトレイトール溶液を加え、室温で１５分間インキュベート し、混合物をＧ−２００カラムにかける。ペプシン消化物について溶離する。

本来の位置に未解離のＦ　（ＡＢ’　）　２の小さなピークがあり、続いてＦａ ｂ’の主ピークがある。

実施例４ ウサギ（ポリクローン性）抗複合体抗血清の特異性の評価０．０５Ｍ炭酸塩／炭 酸水素塩バッファー（ｐＨ９，６）中でつくった次のうちの１つ： （ｉ）ＩｇＡ−ａＩＡＴ　（５ｇｇ／ｍ＋）（ｉ　ｉ）　ＩｇＡ　（５℃１ｇ／ ｍ１）（ｉ　ｉ　ｉ　）　ａＩＡＴ　（５ａｇ／ｍ　ｌ　）の１２０μｍアリコ ートを用いて４℃にて一晩インキユベートすることにより、９６穴軟賀検定プレ ート（ファルコン３９１２）に抗原を塗布した。

次に、プレートを、０．０５％ツイーン２０を含有する燐酸塩バッファー生理食 塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，２（ＰＢＳ／ツイーン）でそれぞれ１分間、３回洗浄し た。

正常なウサギ血清（ＮＲ８）及び試験（抗複合体）ウサギ血清（１００μｌ）希 釈又はそのままないし５中に１の希釈）中で滴定し、抗原を塗布したプレートに 加えた。次に、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。（陰性対照： ＰＢＳ／ツイーンのみを使用したすなわちブランクプレート、正常なウサギ血清 でインキュベートした）。前記のように、インキュベート後、プレートを洗浄し た。

ヤギ抗つサギ／ＩｇＧ／西洋ワサビペルオキシダーゼの１００μｍアリコートを １／１００ＯＰＢＳ／ツイーンの希釈で加え、次に、プレートを１時間、３７℃ でインキュベートした。インキュベートした後、プレートを前記のように洗浄し た。

基質の１００μｌアリコートを加えた。基質は：２０ｍｇの０−フェニレンジア ミン ２５０μｍのＨ２０□：及び ５０ｍ１の０．１５Ｍクエン酸塩燐酸塩バッフｙ−（ｐＨ５）よりなる。

５−１５分間発色させ、そして２５μｍの２５％Ｈ２ＳＯ４を全ての穴に加える ことによって酵素色反応を停止した。

各穴の内容物の光学密度を、タイターチック自動操作プレートリーダーで４９２ ｎｍ　（ＯＤ４９２）において読み取った。表１に示す結果から、抗血清は複合 体に対してかなりの特異性を有し、高抗血清希釈で高い００４９２となり、ａ、 ＡＴに対していくらかの反応があり、ＩｇＡに対しては対照に比べ有意な差はな いことが分かる。

ＥＬＩＳＡによるポリクローン性ウサギ抗１ｇＡ−ａｔＡＴ複合体抗血清の特異 性の評価 ４９２ｎｍで測定した光学密度のゼロ平均値ＥＬＩＳＡプレート上の抗原塗布 Ｉ　Ａ　（５μｇ／ｍｌ）　ａ＋ＡＴ　（５μｇ／ｍｌ）　Ｉ　ｇＡ−ａ、ＡＴ 　（５μｇ／ｍ１）ＮＲ５抗　ＮＲ５抗　ＮＲ８抗 抗体　複合体　複合体　複合体 １／２　０．６６５　０．７０３　０．５ｇ５　１．５２６　０．７５４　１． ４４７１／４　０．４５２　０．４９６　０．３５３　１．５３６　０．５５１ 　１．４５５１／８　０．２５４　ｏ、２５θ　０．２３５　１．５５１１１　 ’０．３６２　１．４５７１／１６　０．Ｌｉ２　０．１７２　０．１７６　１ ．５７３　０．２５３　１．４５６１／３２　０．０４６　０．０８３　０．０ ９４　１．５１４　０．１４３　１．４５２１／６４　−　０．０３５　−　１ ．４２５　０．０８２　１．４４５１／１２８°　〜　０．００５　−　１．４ ２５　０．０５２　１．４３６１／２５６　−　−　１．０４　０．０１６　１ ．４３５１１５１２　−　−５　−　０．７９９　０．００１　１．４１２単一 クロ一ン性抗体の製造 複合体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内（ｉ、ｐ、　）注射した。不完全フロイ ンドアジュバント中に乳化させたＩｇＡ　ａｒＡＴ複合体を用いた注射を、１４ 日及び２８日に繰り返した。２８日以降に尾から採血した試料を、間接ＥＬＩＳ Ａにより抗ペプチド抗体の存在について検定した。フュージョンの３日前に、血 清抗体力価が増したマウスにＰＢＳ中のＩｇＡ−〇＋ＡＴ複合体５０！ｇをさら に補助単離し、洗浄した。牌細胞を対数増殖培養からのマウス骨髄腫細胞系（Ａ ｇ、８゜６５３又はＮＳＯ又はＮ５１）と融合させた。ケーラー及びミルスタイ ン法（ケーラー、Ｇ、及びミルスタイン、Ｃ１、ネイチャー（ロンドン）　２５ ６、ｐｐ。

４９５　（１９７５）の変形法によって、胛臓及び骨髄腫細胞を、４０％ＰＥＧ （ポリエチレングリコール　−　分子量１．４５０）を用いて、それぞれ２：１ の比率で融合させた。１ｍｌのＰＥＧを混合細胞（膵臓及び骨髄腫）のベレット に１分間にわたって滴加し、血清を含まない媒体で希釈した。融合懸濁液を９６ 穴プレートに分配し、ＨＡＴ　（ハイポキサンチン、アミノプテリン及びチミジ ン）含有媒体中で培養した。ハイブリドーマ細胞の不十分な成長は、注入したＩ ｇＡ−α、ＡＴ複合体によって細胞溶解されたものと置き換えるための新しいマ クロファージ源として、正常なマウスの牌細胞を加える（融合直後に）ことによ って調整した。

１０日後、ハイブリドーマの成長についてプレートを調べた。これらの細胞から 除いた上澄みを、間接ＥＬＩＳＡによって抗ＩｇＡ　ａ＋ＡＴ複合体抗体の存在 についてふるい分けた。次の結合式を用いた（＊＝標識した物質）：支持体／　 Ｉ　ｇ　Ａ　ｔｔＩＡ　Ｔ／抗ＩｇＡ−ａ、ＡＴ／ヤギ抗マウスＩｇＧ＊リドー マをフラスコ中で培養するか、あるいはマウス内で成長させた。１０５／１イブ リツド細胞を注入する数日前に、ブリスタンを投与した（０．５ｍｌ腹腔内注射 した）ＢＡＬＢ／ｃマウス内で、腹水を増加させた。腫瘍は２−４週間後に形成 すべきであり、そしてマウスを殺し、ピペットで腹腔の内容物を取り出すことに よって溜まった腹水を取り出した。腹水中の単一クローン性抗体の濃度は各腫瘍 継代で測定した：これは５−１５ｍｇ／ｍ！であった。

スクリーニング 単一クローン性抗体のスクリーニングに用いた手順は次の通りであった。以下の ものからなるプレートを準備した： （ａ）　ヒトＩｇＡ−α、ＡＴ複合体を塗布したプレート（５ｌｇタンパク質／ ｍ＋含有溶液で］インキュベートすることによる）　十　細胞上澄み　＋　ヤギ 抗マウスペルオキシダーゼ標識した抗体：（ｂ）　遊離ヒトＩｇＡ　（５μｇ／ ｍｌ溶液）を塗布したプレート＋その後の工程は上記の通り： （Ｃ）　遊離ヒトａ、ＡＴ　（５μｇ／ｍｌ溶液）を塗布したプレート士その後 の工程は上記の通り。

明らかに上記の系（ａ）においてのみ陽性に反応したこれらの上澄みを生じた細 胞を、ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体に特異性（遊離１ｇＡ又は遊離α、ＡＴには非反 応性であるが）の単一クローン性抗体を生成するハイブリドーマとして選んだ。

自然に生じるＩｇＡ−ａ、ＡＴ複合体に対する単一クローン性抗体を分泌する２ 種のそのようなハイブリドーマ細胞系を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、ＰＨＬＳ　Ｃｅｎｔ ｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、英国、ウイルトシアー州　ＳＰ４　０ＪＧ、セイルスベリ−、ポート ダウンに供託した。第１のＮＬＷ、５４と呼ぶものは、取得番号ＥＣＡＣＣ９０ ０２０６１１で１９９０年２月６日に、特許手続きのための微生物供託の国際登 録に関するブタベスト条約の規定のもとで供託した。ＮＬＷ、５０と呼ばれる最 も好ましい抗体は、取得番号ＥＣＡＣＣ９０１２１３０２として１９９０年１２ 月１３日に供託した。

実施例６ ２次元免疫電気泳動（２Ｄ−ＩＥＰ）によるＩｇＡ−σ、ＡＴ複合体の測定０． ０５Ｍバルビトンバッフｙ　ｐＨ８，６に１％アガロース（Ｓｅａ　ｋｅｍ　Ｈ ＧＴ　アガロース　ＩＣＮ　バイオメディカル社）を含む溶液を製造した。

４ｍｌのこの溶融アガロース溶液を、７．６Ｘ５．０ｃｍガラスプレート上に注 ぎ、硬化させ、その後、１．ＩＸ５．０ｃｍストリップをカットし、きれいな７ ゜６ｘ５．０ｃｍガラスプレート上に移した（１枚のプレート当たり１ストリツ プのアガロース）。直径２ｍｍの穴を、左端から１５ｍｍ及びプレートの底から ７ｍｍのアガロースにあけた。３μｌの試験血清を穴に入れ、ブロモフェノール のた。′より遅い′移動ピーク（ｔｇＡ−σ、ＡＴ複合体）領域を面積計を用い て測定し、複合体濃度を面積（ｃ　ｍ”）として表した。

試験を行った病理学的試料のＩｇＡ−σ、ＡＴ複合体濃度は、この方法で測定し た。結果は以下の表２に示す。

、’ｅ　ｉｌ　ノｔＪ　ＩＦｔ　試料　ＩｇＡ−＃ＩＡＴ　２Ｄ−ＩＥＰ複合体 濃度　ランク （２Ｉ）−ＩＥＰ値） （任意単位） Ｉ　ＲＡ　血清　４．　０５　４ ２　ＲＡ　血清　２．８０　５ ３　ひざの腫れ　血清　１．　００　９４　ＲＡ　血清　２．４０　７ ５　ＡＳ　血清　０．４５　１０ １０５Ｉ骨髄腫　血清　２６．００　１７　ＩｇＡ骨髄腫　血清　１２．００　 ２ｉ９　ＲＡ　関節液　２．　８０　５ ９　ＲＡ　血清　６．８５　３ 】０　多発性筋痛　血清　０．７０　１１１１　ＲＡ　血清　１．２０８ １２　ＲＡ＊　、関節液　０．　００　１２ＲＡ＝慢性関節リウマチ ＡＳ＝硬直性を椎炎 ＊＝ニステロイド療患者 実施例７ サンドイツチＥＬＩＳＡ検定によるＩｇＡ−σ、ＡＴ複合体の測定一般的な方法 塗布用バッファー（０１０５Ｍ　炭酸塩／炭酸水素塩バッファー　ｐＨ９，６） 中でっ（った最適濃度の第１すなわち捕捉抗体を、９６穴の軟質検定プレート（ ファルコン３９１２）に塗布した。この抗体の１２０μｌアリコート（例えば、 １、／１６０００希釈）を、３７℃で１時間、室温で１時間又は４℃で一晩イン キユベートすることによって、プレート上に吸着させた。次に、プレートを３回 、１分間、各回０．０５％ツイーン２０を含有する燐酸塩バッファー生理的食塩 水（ｐ）１７．２）で洗浄した。

ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体すなわち試験血清試料の１００μｍアリコート（２倍又 は５倍希釈した）をプレートに加え、１時間、３７℃でインキュベートした。次 に、プレートを前記のように洗浄した。

最適濃度の第２抗体の１００μｌアリコート（例えば１／６０００ウサギ抗Ｉｇ Ａ−４＋ＡＴ複合体）をプレートに加え、そして３７℃で１時間インキュベート した。プレートを前記のように再び洗浄した。次に、最適希釈の第３抗体のアリ コート１００μｌを加えた。この抗体（例えば、ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を酵素の 西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した。プレートを３７℃で１時間インキュベ ートシ、そして前記のように洗浄した。

酵素の西洋ワサビペルオキシダーゼのための基質の１００μｍアリコートを加え た。基質は２０ｍｇの０−フェニレンジアミン、２５０μｌのＨ２Ｏ２及び５０ ｍ１の０．１５Ｍクエン酸塩−燐酸塩バッファーよりなるものであった。５−１ ５分間発色させ、次に、酵素性色反応を２５ａｌの２５％Ｈ２Ｓ　Ｏ４を全ての 穴に加えることによって停止させた。各穴の内容物の光学密度を、タイターチッ ク自動操作プレートリーダーで４９２ｎｍ　（ＯＤ４９２）にて読み取った。

結果： ］、、　ＩｇＡ又はα、ＡＴに対するポリクローン性抗体を採り入れたサンドイ ッチＬＩＳＡ サンドイッチＥＬＩＳＡを実施するための手順は上記の通りであった。２匹のヒ ツジ及び２匹のウサギのポリクローン性抗１ｇＡ抗体を捕捉すなわち第１抗体と して用いて、４つの検定を行った。ＥＬＩＳＡ検定のための結合式は以下の通り であるニー 検定１：　支持体／Ｓｈ、（１）抗ＩｇＡ／ＩｇＡ−ａ＋ＡＴ複合体／Ｓ　ｈ、 抗１１＋ＡＴ十標識した抗ヒツジ抗体。

検定２　、　支持体／Ｓｈ、　（２）抗ＩｇＡ／ＩｇＡ−σ、　Ａ　Ｔ複合体／ Ｓ　ｈ、抗σ、ＡＴ＋標識した抗ヒツジ抗体。

検定３・　支持体／Ｒｂ、（１）抗１　ｇＡ／ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体／Ｓｈ　 抗α。

ＡＴ＋標識した抗ヒツジ抗体。

検定４．：　支持体／Ｒｂ、（２）抗！ｇＡ／ＩｇＡ−σ、ＡＴ複合体／Ｓｈ、 抗σ、ＡＴ十標識した抗ヒツジ抗体。

ｓｈ、＝ヒツジ Ｒｂ、＝ウサギ 上記検定１−４の結果は以下の表３に示す。試料１−１２は、実施例６の表２の 試料と同じであり、ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体濃度は２Ｄ−ＩＥＰで測定した。２ Ｄ−ＩＥＰにおけるこれらのランクは、比較が容易なように表３に示す。

飢 試料　検定１　検定２　検定３　検定４　２Ｄ−ＩＥＰで番号　０Ｄ４９２ラン ク　００４９２ランク　０Ｄ４９２ランク　０Ｄ４９２ランクのランク１、　０ ．８２ｇ　２　０．３５５　２　０．９００　２　０．３５５　２　４２、　０ ．９２４　ｉ　０．５７８　１　１．１５７　１　０．５７ｇ　１　６３、　０ ．６５７　７　０．１７３　４　０．１７６　５　０．１７３　４　９４、　０ ．６０７　９　０．１５３　９　０．１４４　１１　０．１５３　９　７５、　 ０．５８０　１０　０．１６４　７　０．１４１　！２　０．１６４　７　１０ ６、　０．７０２　４　０゜１６０　ｇ　０．１５５　８　０．１６０　ｇ　１ ７、　０．６６４　６　０゜１６７　６　０．１４７　１０　０．１６７　６　 ２８、　０．６５３　８　０．１５８　１０　０．１９１　４　０．１４８　１ ０　５９、　０．４０６　１２　０．１１６　１２　０．１５７　７　０．１１ ６　１２　３１０、　０．７６２　３　０．１７０　５　０．５６６　３　０． １７０　５　１１１１、　０．６６３　５　０．１７８　３　０．１５４　９　 ０．１７８　３　ｇ１２、　０．４６６　１１　０．１３２　１１　０．１５９ 　６　０．１３２　１１　１２ランク付けを比較することによって質的にわかる ように、そして統計的分析によって確かめることができるように、ＥＬＩＳＡで は２Ｄ−ＩＥＰの結果を確認できなかった。例えば、検定１及び３、試料６．７ 及び９では、２Ｄ−ＩＥＰＩが高いにもかかわらず、全て低い値となり、試料１ ０の複合体濃度は２Ｄ−ＩＥＰによると低いが、ＥＬＩＳＡ値は高かった。

検定２及び４、試料６．７及び９では、２Ｄ−ＩＥＰ値が高いにもかかわらず、 全て低いＥＬＩＳＡ値となった。これらの結果から、この方法は、ＩｇＡ−σ１ ＡＴ複合体の測定には使用できないことが分かる。２つの方法（ＥＬＩＳＡ及び ２Ｄ−ＩＥＰ）によって得られた結果の不一致はおそらく、遊離ＩｇＡが、ＥＬ ＩＳＡプレートに塗布した抗ＩｇＡに優先的に結合し、これによってＩｇＡ−σ １ＡＴ複合体の結合が妨げられることによるものであろう。

２、　ＩｇＡ又はα、ＡＴに対するポリクローン性抗体を採り入れたサンドイッ チＥＬＩＳＡシステム。捕捉抗体は抗α、ＡＴである。

サンドイッチＥＬＩＳＡ法を上記のように実施した。次の結合式を用いた：支持 体／Ｓ　ｈ、抗ａ、ＡＴ／ＩｇＡ−ａ、ＡＴ複合体／ポリクローン性抗１ｇＡ＋ 標識した抗体 この実施例では、異なる病理学的試料を測定し、２Ｄ−ＩＥＰによる同じ試料の 測定と比較した。結果は以下の表４に示す：÷　＝　ＯＤ（光学密度）単位 Ｐｃ　抗ａ、ＡＴ＋標識した抗しラン抗体６、　支持体／Ｒｂ、Ｐ　ｃ、　１ｒ ＋、Ｉ　ｇＡ−ｉ＋ＡＴ／　Ｔ　ｇＡ−ｚ＋ＡＴ複合体／　Ｍ　ｃ抗ｉ２＜Ａ− σｌＡＴ＋標識した抗体 Ｉ）１′？、＝精製複合体に対して生じるポリクローン性抗体、上記結合式に示 したようなＩｇＡ又はａ、ＡＴ。

Ｍｃ、一本発明１てよってハイブリドーマＮ１−ｗ５４により分泌された単一ク ローン性抗体。

上記結合式（３）を採り入れたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果は以下の表５に示 す。この表は、ＥＬＩＳＡから得た０Ｄ４９２値と２Ｄ−ＩＥＰからの結果との 比較を示す。

表５ 血清番号　２Ｄ−ＩＥＰ　ＥＬＩＳＡ（ＯＤ４９２）値　ランク　値　ランク １９　０．９　１０　０．６５　５ ２０　０．５　１１　０．６４　９ ２１　．１．５　９　０．６３　６ ２２　２．３　８　０．６３　６ ２３　２．５　７　領６３６ ２４　２．９　６　０．６０　１０ ２５　３．２　５　０．７７　３ ２６　３．５　４　０．６０　１０ ２７　３．９　３　０．７６　４ ２８　５．０　２　０．８１　２ 精製単離した ＩｇＡ−σＩＡＴ複合体 （２ｍｇ／ａ＋１）　（７，０）　１　０．　９９　Ｉ上記表５に示されるよう に、高い２Ｄ−ＩＥＰ値（＞３．　０単位）となる結合式（３）からの４つの試 料のうち３つはまた、より高い０Ｄ４９２を示す。低レベルの【ｇＡ−σ、ＡＴ 複合体を含有する血清試料では、測定したＥＬＩＳＡ値にほとんど差はないが、 この結果は検定感度を高めることによって補正することができる。

結合式１及び２を採り入れたＥＬＩＳＡ検定からの結果は、式（３）の場合に似 た傾向を示す。これらの結果から、サンドイッチ検定法では、検出抗体が複合体 全体に対する又はそのどちらかの成分に対する抗−となりうることが分かる。

結合式４．５及び６を採り入れた検定法から得た結果から、ポリクローン性ウサ ギ抗複合体抗体を塗布したプレートを用いることによって、ＩｇＡ−α、ＡＴ複 合体を測定することは不可能であることが分かる（データは示していない）。

９６穴の硬質プレート（ファルコン３０４０）に、５００μｇｍｌ−’ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）を塗布した。２００μＩのアリコートを各穴に加え、プレ ートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを３回、１分間、各回０． ０５％のツイーン２０を含有する燐酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）ＰＨ７ ゜２　（ＰＢＳ／ツイーン２０）で洗浄した６　ＩｇＡ　ａ１ＡＴ複合体すなわ ち試験血清試料の１００μｍアリコートを滴定しくＰＢＳ／ツイーン２０中での ２倍又は５倍希釈）、そしてＮＬＷ５４細胞系からのＩｇＡ−αＩＡＴ複合体に 対する単一クローン性抗体の１００μｍアリコートを、最適濃度のもの（例えば 、１／４００００の最終濃度にするために１／２００００）に加え、そしてプレ ートを一晩４℃でインキュベートした。

上記の一晩のインキュベートの後、プレートを３００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分 離し、９０μｌのアリコートを各穴から、ＩｇＡ−ａｌＡＴ複合体を予備塗布し た別のプレートに移した。このプレートを次のように予備塗布した。９６穴の軟 質検定プレート（ファルコン３９１２）に、塗布用バッファー（０，０５Ｍ炭酸 塩／炭酸水素塩バッファーｐＨ９，６）でつくった５μｇｍｌ−’濃度のｒｇＡ −σ。

ＡＴ複合体の１００１１１アリコートを塗布した。次に、このプレートを３７℃ で１時間、室温で２時間又は４℃で一晩インキユベートし、そして上記のように 洗そしてプレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを前記のよう に２ｎｍ　（ＯＤ４９２）にて読み取った。阻害率の計算は次の通りである：０ Ｄ４９２試料−０Ｄ４９２ブランク 阻害％　＝　１　−　Ｘ　１００ ０Ｄ４９２非阻害試料−〇Ｄ４９２ブランクこの検定法の結果は表６に示す。結 果を、一般的な２Ｄ−ＩＥＰ法による同じ血清の測定値と比較した。ＥＬＩＳＡ の結果は、標識した抗体を５０％阻害するの必要な血清（タイター）の希釈の逆 数によって表す。

リウマチ性　５０％阻害とず　ランク　２Ｄ−ＩＥＰ　２Ｄ−ＮＥＩフ血清　る 血清タイター　（任意面積　ランクの逆数　単位） ２９　４２３　３　０．７５　３ ３０　１４０５　５　１、ｉ５　４ ３１　１５５３　７　１．９０　５ ３２　２０５１　８　２．４５　６ ３３　１４９４　６　２．５０　７ ３４　１３１０　４　２．７５　８ ３５　５２　１　０．６０　１ ３６　３４４　２　０．６５　２ 表６のランク付けから分かるように、ＥＬＩＳＡと２Ｄ−ＩＥＰとはよく一致し た。これは統計的に約６９％として計算された。この割合は、血清３２（この試 料は最高のＥＬＩＳＡ阻害値を出した）の結果を無視すると、さらによくなる（ ８９％）。

実施例９ ２重抗体捕捉ＥＬＩＳＡによるＩｇＡ−αＩＡＴ複合体の測定塗布用バッファー （０，０５Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩、ｐＨ９，６）中につくった最適濃度の捕捉抗 体を、９６穴の軟質検定プレート（ファルコン３９１２）に塗布した。

１／１０００希釈の抗体のアリコート（１２０μｌ）を、３７℃で１時間、室温 で２時間又は４℃で一晩インキユベートすることによって、プレート上に吸着さ せた。次に、プレートを、０．０５％ツイーン２０を含有する燐酸塩バッファー 生理食塩水（ＰＢＳ）　、ｐＨ７，２で洗浄した（３×１分）。

上記の予備塗布したプレートに、本発明に従ってハイブリドーマＮＬＷ５４によ って分泌したようなＩ　ｇ　Ａ　ｔＢ　Ａ　Ｔ複合体に対する単一クローン性抗 体を加え、実施例７の方法に従って検定を行った。次の結合式を用いた：支持体 ／Ｍｅ、　ラット抗マウスＸ　ｇ　Ｇ　／　Ｍ　ｅ　７ウス抗１ｇＡ−ａ、ＡＴ 複合体／ＩｇＡ−ａ、ＡＴｌｊ合体／Ｐｅ、Ｒｈ、抗！ｇＡ　ａｌＡＴ／標識し た抗つサギ抗体Ｍｃ、＝単一　クローン性抗体 Ｐｃ、＝ポリクローン性抗体 Ｒｂ、＝ウサギ 上記二重抗体捕捉法による試験血清（慢性関節リウマチ及び正常な対照）のパネ ル中のＩｇＡ−σ、ＡＴ複合体レベルの測定結果を、２Ｄ−免疫電気泳動、単一 抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（結合式３による実施例７（３）のような）及び阻害ＥＬＩ ＳＡ法（実施例８のような）によって測定したＩｇＡ−α、ＡＴ複合体レベルと 比較した。これらの結果は表７に示す。

表７ 試料　２Ｄ−ＩＥＰ　二重Ａｂ　単−Ａｂ　阻害（ｃｍ２）　ＥＬＩＳＡ　ＥＬ ＩＳＡ　ＥＬＩＳＡ（血清希釈　（血清希釈　５０％抑制 御／４０）　１／４０）　タイター ０、Ｄ、４９２ｎｍ　Ｏ，Ｄ、４９２ｒｕｇ２９　０．５　０．２９８　０．６ ７４　１９５３０＊　１．２−０．５６４　０．８７７　３０９３１　３．３　 ０．３４２　０．６５４　２２１３２　３．９　０．５３８　０．７４８　３５ ６正常な血清　１．１　１３１０　０．６４４　２０２複合体含有　５．２　０ ．５７１　０．７９　４４３血清 この試料（＊）は、−貫して高いＥＬＩＳＡ値及び低い２Ｄ−ＩＥＰ値を示す点 で変則的である。これはおそらく、２Ｄ−ＩＥＰを誤って低く読み取うたためで あろう。

実施例１０ ＥＬＩＳＡシステムにおけるネズミ単一クローンＮＬＷ、５０及びＮＬＷ、５４ を用いた結果の比較 ＩｇＡ−α、ＡＴ複合体に対する単一クローン性抗体が、本発明によるハイブリ ドーマＮＬＷ、５０によって分泌される、二重抗体捕捉検定法も実施した。この 検定法では、ポリスチレンプレートを用いた（ダイナチック−イムロン４）。試 験血清を１／１００に希釈した他は、実施例９のようにして検定を行った。より すぐれた単一クローン性抗体をポリスチレンプレートと組み合わせて用いること によって、この検定法の感度が高くなった。次の結合式を用いた：支持体／ラッ トＭｃ抗マウスＩｇＧ／Ｍｃ抗ＩｇＡ−＋＋、ＡＴ／ＩｇＡ−ａ＋ＡＴ複合体／ Ｒｂ　Ｐｃ抗１ｇＡ−α、ＡＴ／標識したヤギ抗つサギ抗体Ｍｃ＝単一りローン 性抗体 Ｐｃ＝ポリクローン性抗体 Ｇ＝ヤギ Ｒｂ＝ウサギ 結果は以下の表８に示す。

血清　２Ｄ−ＩＥＰ結果　ＥＬＩＳＡ結果（ＯＤ４９２）試料　（任意単位）　 ＮＬＷ、　５０　ＮＩＪ、　５４値　ランク　値　ランク　値　ランク ３７　０．７５　１０　０．５７２　１０　０．６３４　８３８　１．２０　９ 　０．６２８　９　０．５９６　１０３９　１．４０　８　０．６８５　７　０ ．６３５　７４０　２．００　７　０．７２４　６　０．６３４　８４１　２． ５０　６　０．８８２　１　０．６６３　５４２　０．７５　５　０．８５１　 ３　０．８１３　２４３　３．３０　３　１６５１　８　０．６３７　６４４　 ３．６０　２　０．８６８　２　０．８９７　１４５　４．４０　１　０．７５ ６　５　０．６７９　４４６　３．００　４　０．７８１　４　０．７１２　３ ４７　０．６０　１１　０．３８６　１１　０．３７４　１１結果を、ＮＬＷ、 ５４及びＮＬＷ、５０のＥＬＩＳＡ結果対２Ｄ−ＩＥＰａＪ定としてプロットす ると、相関係数はそれぞれ０．５６及び領　７２となり　−ＮＬＷ、５０はＮＬ Ｗ、５４よりも少し敏感であり、その理由はそれがより好ましい抗体であるから であるということを確証している。

ポリスチレンプレート（ダイナチック−イムロン４）を用い、試験血清を１／１ ００に希釈した他は、実施例９のようにして、二抗体捕捉ＥＬＩＳＡ検定法を実 施した。ＥＬＩＳＡ検定法に１種又は２種の検出抗体を用いる効果を調べた。

次の結合式を用いた： （１）　支持体／ラットＭｃ抗マウスＩｇＧ／Ｍｃ抗１ｇＡ　ａ１ＡＴ／ＩｇＡ −α＋ＡＴ複合体／Ｓｃ　Ｐｃ抗ＩｇＡ／標識したＤ抗ヒツジ抗体（２）　支持 体／ラットＭｃ抗マウスＩｇＧ／Ｍｃ抗ＩｇＡ−ａ＋ＡＴ／ＩｇＡ−ａ＋ＡＴ？ ｌ１合体／標識したＳＣＰｃ抗！ｇＡＭ　ｃ　＝単一クローン性抗体 ｐｃ；ポリクローン性抗体 単−クローン性抗ＩｇＡ−σ、ＡＴ抗体は、本発明に従ってハイブリドーマＮＬ Ｗ、５０により分泌したものであった。

結果は以下の表９に示す。

暫 血清　ＩｇＡ−ａＩＡＴ　血清　Ｉ　ｇ　Ａ　ａｌＡＴ複合体濃度　複合体濃度 （任意単位）　（任意単位） 結合式　結合式　結合式　結合式 −□−−−□。□　２ ２　３．０　５．０　３０　０．３２　０．３８３　０．３　０．３９　３１　 ０．５８　１．０５４　０．４３　０．９　３２　０．２７　０．４７５　０． ８　１．９　３３　０．３６　０．８４６　０．４　０．５２　３４　０．３３ 　０．３９１０　０゜５　０．８　３６　０．５４　１．０５１２　０．５５　 １．１　３７　＜０．２　０．２９１４　０．３６　０．６６　３８　０．３　 ０．４０１５　０．５２　０．６７　４０　０．４５　０．５７１６　０．４１ 　０．８　４１　０．３４　０．６１１７　０．７２　４２　０．３２　０．４ ５１８　０．３５　０．５３　４４　０．３２５　０．３４１９　０．４１　０ ．６７　４５　０．５３　０．６９２０　０．６　１．４５　４７　０．３５　 ０．４１２２　０．４９　１．１　４８　０．２７５　０．３５２３　０．４５ 　０．６３　４９　０．４４　０．７４２４　＜０．２　＜０．２　５０　＜０ ．２　０．３２５　０．３９　０．４８　５１　０．５２　０．８５２６　０． ７５　１．７　５２　０．４６　０．６９この検定法の結果から、ＥＬＩＳＡ検 定法では慣例的な２つの検出抗体を用いる代わりに１つの検出抗体を用いたとき 、感度は低下しながったことが分かる。

これには、検定法の実施に必要な時間が１時間減少し、そしてまたそのような検 定法の実施コストが低下するという利点がある。

結合式１対結合式２で得た結果をプロットすることによって２つの検定法の結果 を比較すると、相関係数は０．８８であり、標準偏差は＜０．００１であり、こ れはかなり有意である。血清試料番号２を表す点は、この統計分析から除いた（ 含めると、相関係数は０．９７となる）。

実施例１２ １つの検出抗体のみを用いるＥＬＩＳＡサンドイッチ検定法と２Ｄ−ＩＥＰ測定 との比較 実施例９の方法に従って、二抗体捕捉ＥＬＩＳＡ検定法を実施した。ポリスチレ ンプレート（ダイナチック−イムロン４）を用い、検定血清は１／１００に希釈 した。単一クローン性捕捉抗体は、本発明に従ってハイブリドーマＮＬＷ、５０ により分泌したものであった。次の結合式を用いた：支持体／ラットＭｃ抗マウ スＩｇＧ／Ｍｅ抗ＩｇＡ　ａｌＡＴ／ＩｇＡ　ａｉＡＴ複合体／５ｃＰｃ抗１ｇ Ａ／標識したＤ抗ヒツジＩｇＡ抗体Ｍｃ＝単一りローン性抗体 Ｐｃ＝ポリクローン性抗体 ２Ｄ−ＩＥＰによるＩｇＡ−ｖ、ＡＴ複合体の測定は、実施例６に従つて実施し た。結果は以下の表１０に示す。

表１０ 血清　２Ｄ−ＩＥＰ（ｃｍリ　ＥＬＩＳＡ　（任意単位）値　ランク　値　ラン ク ３８　１．５　９　０．７７　８ ６　１．３　１１　０．８７　７ ８　３．０　３　２．３　３ ５４　３、　２　２　１．　２８　４ ４３　１．３　１１　０．５４　１２ ２９　１．１　１３　０．５６　１１ ３２　２．３　４　２．３５　２ ４５　１．４　１０　０．９６　５ ６５　１．８　７　０．９４　６ ２４　１．７　８　０．５８　９ ７　０．６　１５　０．４７　１３ ４４　３．３　１　２．５　１ ５８　２．３　４　０．５７　１０ ５０　２．２　６　０．４　１５ １、　０．９　．１４　０．４４　１４これらの試料を、２Ｄ−ＩＥＰ及びＥＬ ＩＳＡを比較するグラフ上にプロットすると、相関係数は０．７３となり、これ は有意である。

ブランク配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人： （ｉ　ｉ）発明の名称： （ｉｉｉ）配列の数 （ｉｖ）通信住所 （Ａ）住所： （Ｂ）街 （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ： （Ｖ）コンピューター読み取り可能な型式＝（Ａ）手段の種類 （Ｂ）コンピューター− （Ｃ）操作システム： （Ｄ）ソフトウェア： （ｖｉ）本出願データ： （ｖｉＤ従来の出願デ１り： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願口： （ｖｉｉｉ）代理人／代理人情報： （Ａ）氏名： （Ｂ）登録番号： （Ｃ）参照／整理番号： （ｉｘ）電気通信情報： （Ａ）電話： （Ｂ）ファックス： （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）種類：ポリペプチド （Ｃ）トポロジー二線状 （ｉ　ｉ）分子タイプ： （Ｖ）フラグメントタイプ：Ｃ末端フラグメント（ｉｘ）特徴： （Ｄ）他の情報：ヒトＩｇＡ鎖の残基４８７−４９６（ｘｉ）配列の説明：ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ＝１＝Ｖａｌ−Ｍｅｔ−＾Ｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｇｌ ｙ−Ｔｈｒ−（：ｙｓ−Ｔｙｒ（３）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２に関する情報：（ ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二１３アミノ酸 （Ｂ）種類：ポリペプチド （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉ　ｉ）分子タイプ： （Ｖ）フラグメントタイブニＣ末端フラグメント（ｉｘ）特徴： （Ｄ）他の情報：ヒトｒｇＡσ鎖の残基４８４−４９６（ｘｉ）配列の説明：Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２＋Ｖａ　ｌ−３ｅｒ１−３ｅｒ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−１ａ− Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−（：ｙｓ−Ｔｙｒ（４）ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）種Ｍ：ポリペプチド （Ｃ）トポロジー：線状 （ｉ　Ｄ分子タイプ： 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年１−１月２５１−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＩｇＡ及びα１−抗トリプシンの複合体の抗原決定基に対して特異性の 抗体ドメインを含むリガンドであって、該抗体ドメインは遊離ヒトＩｇＡ及び遊 離ヒトα１−抗トリプシンと実質的に非反応性である上記のリガンド。 ２．該ドメインが、ＩｇＡ及びα１−抗トリプシンの自然に生じる複合体（Ｉｇ Ａ−α１ＡＴ）に対して特異性である、請求項１のリガンド。 ３．該ドメインが、ヒトＩｇＡのＦｃ領域に見られるアミノ酸配列又はその類似 物を有する第１ペプチドフラグメント、及び第１ペプチドフラグメントに共有結 合し、そしてヒトα１ＡＴに見られるアミノ酸配列又はその類似物を有する第２ ペプチドフラグメントよりなる合成ペプチドに対して特異性である、請求項１の リガンド。 ４．単一クローン性抗体の形の請求項１、２又は３のリガンド。 ５．該抗体のＦａｂ′フラグメントの形の請求項１、２、３又は４のリガンド。 ６．該抗体のＦ（ａｂ′）２フラグメントの形の請求項１、２、３又は４のリガ ンド。 ７．ヒトＩｇＡのＦｃ領域に見られるアミノ酸配列又はその類似物を有する第１ ペプチドフラグメント及びヒトα１ＡＴに見られるアミノ酸配列又はその類似物 を有する第２ペプチドフラグメントよりなる免疫抗原性ペプチドであり、該第１ 及び第２ペプチドフラグメントは、それぞれシステイン残基を含有しかつ該シス テイン残基によって互いに共有結合している、免疫抗原性ペプチドであって、該 ペプチドに対して生じる抗体が、遊離ヒトＩｇＡと実質的に非反応性であり、遊 離ヒトα１ＡＴと実質的に非反応性であり、そしてヒトＩｇＡ及びα１ＡＴの自 然に生じる複合体に結合する、上記の免疫抗原性ペプチド。 ８．該第１ペプチドフラグメントが、ヒトＩｇＡのＣ末端に関して、ヒトＩｇＡ のＦｃ領域の端から２番目のシステイン残基を含むアミノ酸配列又はその類似物 よりなる、請求項７の免疫抗原性ペプチド。 ９．該第１ペプチドフラグメントが、 【配列があります】配列又はその類似物よりなる、請求項７又は８の免疫抗原性 ペプチド。 １０．該第１ペプチドフラグメントが、【配列があります】配列又はその類似物 よりなる、請求項９の免疫抗原性ペプチド。 １１．該第２ペプチドフラグメントが、【配列があります】配列又はその類似物 よりなる、請求項７、８、９又は１０の免疫抗原性ペプチド。 １２．該第２ペプチドが、 【配列があります】配列又はその類似物よりなる、請求項７、８、９又は１０の 免疫抗原性ペプチド。 １３．第１及び第２フラグメントが、 【配列があります】 配列又はその類似物よりなる、請求項７の免疫抗原性ペプチド。 １４．合成ペプチドが請求項７、８、９、１０、１１、１２又は１３で請求した ペプチドである、請求項３の抗体。 １５．ＥＣＡＣＣ　９０１２１３０２の取得番号で、Ｅｕｒｏｐｅａｎｎ　Ｃｏ ｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ＰＨＬ Ｓ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎ ｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、英国ウイルトシアー州ＳＰ４　ＯＪＧ、セイルスベリー 、ポートンダウンに１９９０年１２月１３日に供託したハイブリドーマ細胞系登 録ＮＬＷ．５０によって生成した抗体。 １６．慢性関節リウマチ（ＲＡ）の指標としてのヒトＩｇＡ及びα１−トリプシ ンの複合体（ＩｇＡ−α１ＡＴ）を含有することが疑わしい分析物におけるＲＡ の検定法であって、該複合体と、請求項１、２、３、４、５、６、１４又は１５ で請求のリガンドとの免疫学的結合を検出又は測定することよりなる、上記の方 法。 １７．検定が、サンドイッチタイプのものであり、並びに該ＩｇＡ−α１ＡＴを 、第１のすなわち捕捉リガンドとしての該リガンドに結合させることによって該 ＩｇＡ−α１ＡＴを捕捉し、そして該ＩｇＡ−α１ＡＴを、該ＩｇＡ−αｌＡＴ を検出しうる抗体ドメインを含む第２の標識又は検出リがンドに結合させること によって該結合を検定し、そしてこのように捕捉された標識の量を検定又は測定 することよりなる、請求項１６の方法。 １８．検定を溶液中で行い、捕捉リガンドを不溶性支持体に結合し、該結合の後 、支持体を溶液から分離し、支持体上の標識の存在又は量を検出又は測定する、 請求項１７の方法。 １９．検出リガンドがＩｇＡ、α１ＡＴ又はこれらの複合体に対する抗体である 、請求項１６、１７又は１８の方法。 ２０．ＲＡの指標として、ヒトＩｇＡ及びα１−トリプシンの複合体（ＩｇＡ− α１ＡＴ）を含むことが疑わしい分析物におけるヒト慢性関節リウマチの検定法 を実施するための検定キットであって、 （１）請求項１、２、３、４、５、６又は１４で請求のリガンド、及び（２）Ｉ ｇＡ−α１ＡＴ複合体 よりなる上記の検定キット。 ２１．該リガンド（１）を捕捉リガンドとして用い、複合体をキットの試験に提 供し、そしてさらに、 （３）該リガンド（１）に結合したとき、ＩｇＡ−α１ＡＴ複合体を検出しうる 抗体ドメインを含む、標識又は検出リガンドとして用いる第２リガンドよりなる 、請求項１７で請求したサンドイッチ検定に用いるための請求項２０の検定キッ ト。 ２２．キットの該ＩｇＡ−α１ＡＴ複合体成分が、これと競合的に結合する、自 然に生じる複合体の免疫抗原性類似体である、競合又は阻害検定に用いるための 請求項２０の検定キット。 ２３．該免疫抗原性類似体が請求項７−１３のいずれかのペプチドである、請求 項２２のキット。