FI103975B - Immunodiagnostinen nivelreumakoe - Google Patents

Description

103975

Immunodiagnostinen nivelreumakoe - Immunodiagnostiskt led-inflammationstest 5 Tämän keksinnön kohteena on menetelmä nivelreuman (arthritis rheumatoides, RA) analysoimiseksi. Tarkemmin sanoen keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen immunoglobuliini A:n ja öi-anti-trypsiinin kompleksin (IgA-a^AT) analysoimiseksi potilaista, joiden epäillään sairastavan nivelreumaa tai joita hoidetaan 10 sen vuoksi.

Nivelreuma on määritetty tuntemattomasta syystä johtuvaksi sys-teemiseksi tulehdukseksi, jonka kehittymiseen immuunijärjestelmän toimintahäiriöillä ja geneettisellä taipumuksella on osan-15 sa. Varhaisemmissa vaiheissa sen piirteitä ovat oireiden vaih-televa lieveneminen ja paheneminen, myöhemmissä vaiheissa krooninen granulatamoottinen vaste (syövyttävä pannus) ja kudosten, erityisesti luun ja ruston tuhoutuminen. Nivelreumassa synovi-aalisella kalvolla ilmenee monia hyperaktiivisen immunologises-20 ti stimuloidun lymfoidisen elimen piirteitä, ja estäjä-T-solu-jen määrän suhteen auttaja-T-lymfosyytteihin on havaittu pie-. , : nenevän huomattavasti.

Koska ei ole olemassa yksiselitteistä testiä nivelreuman erot- | ; 25 tamiseksi muista akuuteista tai kroonisista inflammatorisista • · · : taudeista, nivelreuman erottaminen muista tulehduksellisista • · 2 103975 4) toisen nivelen pehmytkudoksen turvotus (alle kolmen kuukauden kuluessa edellisestä) 5) symmetrinen nivelparin pehmytkudoksen turvotus (ei distaa-linen interfalangeaalinen nivel 5 6) ihonalaiset kyhmyt 7) röntgenkuvissa havaittavat muutokset 8) reumatekijän seerumipositiivisuus, joista kolmen tai neljän kriteerin toteamisen jälkeen diagnoosi 10 on todennäköinen nivelreuma, ja viiden tai useamman toteamisen jälkeen diagnoosi on varma nivelreuma.

Eniten käytetty nivelreuman immunodiagnostinen määrityskoe on nk. Waaler-Rosen koe, joka perustuu IgG:n Fc-alueen vasta-ai-15 neeseen (reumatekijä). Reumatekijää (rheumatoid factor, RF) on nivelreumapotilailla läsnä noin 60-70%. Koe ei ole täysin tyydyttävä, sillä sen on todettu antavan luvattoman suuria määriä vääriä positiivisia tai negatiivisia tuloksia, eikä sen avulla voida nähdä hoitovastetta tai ennustaa aktivoitumista tai rau-20 hallisempaa vaihetta taudinkulussa. Lisäksi, koska se perustuu hemagglutinaation tai latex-agglutinaation päättymispisteeseen, . sen standardointi eri laboratorioiden kesken on vaikeaa. Mikä | , vakavampaa, se antaa positiivisen tuloksen vain noin 70 prosen-» * · '· tille tästä taudista kärsivistä, eikä reumatekijän immunopato-: 25 geenistä vaikutusta ole itse asiassa koskaan kumoamattomasti ·.: i todistettu.

• · • « · • · · • · Äskettäin on alkanut näyttää siltä, että kovalenttisesti sitoutunut (S-S) IgA:n ja α-antitrypsiinin (ci^AT) kompleksi olisi immunopatologisesti eräs tärkeimmistä tekijöistä nivelreumas-• · , /;·, sa. Tätä kompleksia on löydetty selvästi suurentuneita määriä • · ·

IgA-myelomatoosipotilaiden veren seerumista, mutta myös epänor- *·*'· maalin suuria määriä nivelreumapotilaiden verestä. Seuraavat « seikat viittaavat selvästi siihen, että verestä mitattava IgA-3:5 aiAT-kompleksipitoisuuden mittaaminen olisi merkityksellisempi nivelreuman indikaattori kuin nykyisin käytettävät: ♦ *« 3 103975 1) sitä on läsnä epänormaalin suuria määriä käytännöllisesti katsoen kaikilla hoitamattomasta kroonisesta nivelreumasta kärsivien potilaiden veressä ja nivelnesteissä. (Nykyisin haettava reumatekijä havaitaan seerumista vain noin 70 prosentilla 5 tällaisista potilaista).

2) IgA-öiAT-kompleksin pitoisuus seerumissa näyttää vähenevän potilailla, joiden kliininen vaste hoitoon toisen polven anti-reumaattisilla lääkeillä on hyvä.

10 3) Sitä on samoin havaittavissa epänormaalin suuria määriä selkärankareumapotilailla, joilla ilmenee erosiivisia nivelmuutoksia.

15 4) Toisin kuin nivelreumassa mitattvien niin sanottujen "tau-timarkkereiden" kuten reumatekijän ja akuutin faasin proteiinien (esim. haptoglobiini ja C-reaktiivinen proteiini) kohdalla, sekä in vitro että in vivo kokeet ovat tuoneet esiin todennäköisen selityksen IgA-a^AT-kompleksin immunopatogeenisyydelle. 20 IgA-oiiAT-kompleksin muodostuminen ei siis vain johda jopa kolmanneksen saatavilla olevan a^ATin (yksi tärkeimmistä anti-pro-. teaaseista) kulumiseen nivelreumapotilaan seerumissa tai nivel-| , nesteissä, vaan IgA-c^AT-kompleksi itse pystyy aiheuttamaan ' degradatiivisten proteolyyttisten entsyymien vapautumista eris-: -25 tetyistä makrofageista (sytolyyttinen prosessi, joka on riippu- φ · i vainen vaihtoehtoisen komplementaarisen reaktiosarjän aktivoi-• · s.’·· tuulisesta). Lisäksi injektoitaessa eristettyä kompleksia nor- maalin kaniinin polviniveliin on tuloksena nopeasti akuutti nivelreuma kliinisen tilan selvine anatomisine ja histopatolo- /.30 gisine piirteineen. (Ks. Stanworth, D.R., IgA dysfunction in • · • rheumatoid arthritis, Immunology Today, New Directions in Re- • · · ’· ^ search, 6, pp 43-45, 1985; Stanworth, D.R., The role of IgA in '* * the immunopathogenesis of rheumatoid arthtritis, Chapter 7 in '·’** Immunogenic Mechanisms of Arthritis, Eds. J. Goodacre and D.W.

.35 Carson, pp 122-142, 1987, sekä Dawes, P.T., Jackson R, Shad-.·. : forth, M.F., Lewin, I.V., and Stanworth, D.R., The relationship • s » 4 103975 between the complex of immunoglobulin A and o^-antitrypsin, its constituent components and the acute phase response, as measured by C-reactive protein in rheumatoid arthritis treated with gold or D-penicillamine, British Journal of Rheumatology, 26, 5 pp 351-353, 1987.)

Yleinen IgA-a,AT-kompleksin mittaustapa perustuu kaksiulotteiseen immunoelektroforeesiin, jossa suoritetaan ensimmäinen dimensionaalinen elektroforeettinen kompleksin erottaminen valo paasta a^ATrstä agaroosissa ja sitten sen tunnistaminen toisessa dimensionaalisessa elektroforeesissa agaroosia sisältäväksi antiseerumiksi, joka kohdistuu spesifisesti a^ATitä vastaan. Kompleksin määrä kvantitoidaan (satunnaisyksiköt) määrittämällä planimetrillä alue, joka jää sen saostuspiikin alapuolella 15 (myöhemmin kuivatulla ja värjätyllä alustalla). Tämä on kuitenkin työläs ja aikaa vievä menetelmä.

Oli siis toivottavaa saada aikaan helposti toteutettava määri-tyskoe IgA-ajAT-kompleksille. Aluksi yritettiin käyttää ELISA-20 määritysmenetelmää, jossa joko anti-IgA- tai anti-öjAT-vasta-aine levitettiin mikrotitterilevyjen kuoppiin, inkuboitiin IgA-cHjAT-kompleksia sisältävällä testinäytteellä, saatettiin reakti- « · . . oon joko anti-axAT-IgG- tai anti-IgA-IgG-vasta-aineen kanssa ja suorittamalla lopuksi kehitys entsyymimerkityllä anti-IgG-vas- I » « | ;"25 ta-aineella. Ongelmana on, että tällaista kompleksia ei voida i » · : luotettavasti havaita määrityskokeessa, joka riippuu IgA-öjAT- t · kompleksin sitoutumisesta IgA- tai ajAT-vasta-aineeseen, sillä • » · V · tällä tavalla meneteltäessä sitoutuu myös kompleksoitumatonta

IgA:ta tai a^ATitä, jota on läsnä määrittäraättömästi potilaan ;\;3 0 näytteessä, ja tämä luonnollisesti hankaloittaa IgA-ajAT-komp-• · .’1’. leksin kvantitatiivista mittaamista.

• · ·

Oli siis tarpeen kehittää spesifisesti ihmisen IgA-aiAT-komplek- ’ ' siin vastaan kohdistuva vasta-aine. Ensimmäinen yritys päästä •3 5 tähän immunisoimalla kaniineja puhdistetulla IgA-oiiAT-komplek- i · « « • · I « 5 103975 silla epäonnistui, sillä muodostuva antiseerumi reagoi myös kompleksoitumattoman IgA:n ja αχΑΤ:η kanssa.

Yllättäen havaittiin, että on mahdollista tuottaa monoklonaali-5 nen vasta-aine, joka käytännöllisesti katsoen ei reagoi vapaan IgA:n ja a^ATrn kanssa, mutta joka on spesifinen luonnon IgA-QxAT-kompleksille. Kun tällaisia vasta-aineita yritettiin valmistaa fuusioimalla hiiren pernasoluja myeloomasoluihin, havaittiin pernasolujen saantojen olevan niin pieniä, ettei hyb-10 ridomien tuottaminen ollut mahdollista. Täytyi löytää ratkaisu tähän ongelmaan, joka, kuten tuli ilmi, johtui ihmisen IgA-a^AT-kompleksin toksisuudesta hiiren makrofageihin nähden. Osoitettiin, että inkuboimalla eristettyjä peritoneaalisia hiiren mak-rofageja ihmisen IgA-a^AT-kompleksin kanssa tuloksena on olen-15 naista sytoplasmisen entsyymin LDH vapautumista ja sen jälkeen makrofagien tuhoutumista. Ongelma saatiin ratkaistuksi edempänä kuvattuun tapaan.

On syntetoitu immunogeeninen peptidi ensimmäisestä peptidifrag-20 mentista, jonka aminohapposekvenssi oli ihmisen IgA:n Fc-alu-eelta löytyvän kaltainen tai sen immunogeeninen analogi, ja . toisesta peptidifragmentista, jonka aminohapposekvenssi oli

i ' » M

| * ihmisen aj.AT:stä löytyvän kaltainen tai sen immunogeeninen ana-• * * ’’ logi; ensimmäinen ja toinen fragmentti olivat toisiinsa kova- t * i :'25 lenttisesti sitoutuneita. Tätä peptidiä vastaan kohdistuva :,· · vasta-aine ei olennaisesti reagoinut ihmisen vapaan IgA:n kans- Γ*.: sa, ei olennaisesti sitoutunut ihmisen vapaan axAT:n kanssa ja sitoutui ihmisen IgA:n ja α^ΑΤιη (IgA-a^AT) luonnolliseen komp- leksiin. Yllättäen havaittiin, että tätä peptidiä vastaan muo- .*3© dostetut polyklonaaliset vasta-aineet eivät olennaisesti rea-• ♦# , I./ goineet myöskään vapaan IgA:n ja a^ATin kanssa. Sitä vastaan i · * \ voidaan varmasti muodostaa yhtä spesifisiä tai spesifisempiä monoklonaalisia vasta-aineita. Lisäksi voidaan odottaa, että *ί"ί voidaan tuottaa äskettäin kehitettyjä kimeerisiä vasta-aineita 35, (Reichmann, L., Clark, M., Waldmann, H. and Winter G., Nature 332, pp 323-327, 1988), yksiketjuisia vasta-aineita (PCT-hake- « ♦ ♦ * · ♦ « * 103975 6 mus WO-88/01649, Genex Corporation) sekä yksidomeenisia vasta-aineita (Ward, E.S., Gussow, D., Griffiths, A.D., Jones, P.T. and Winter, G., Nature 341, pp 544-546, 1989), joissa on anti-elementtejä tälle luonnossa ilmenevälle kompleksille ja peptidille.

5 Tämän keksinnön kohteena on ligandi, jossa on ihmisen IgA:n ja oci-antitrypsiinin kompleksin antigeeniselle determinantille spesifinen vasta-ainealue, tämä vasta-ainealue ei olennaisesti reagoi ihmisen vapaan IgA:n tai ihmisen vapaan cti-antitrypsiinin 10 kanssa.

Keksinnön kohteena on myös menetelmä nivelreuman toteamiseksi analyytistä (analysoitavasta aineesta), jonka epäillään sisältävän ihmisen IgA:n ja oci-antitrypsiinin (IgA-a^AT) kompleksia 15 nivelreuman indikaattorina. Menetelmässä selvitetään eli mitataan mainitun kompleksin ja mainitun ligandin immunologista sitoutumista.

Keksinnön kohteena on lisäksi analyysikokonaisuus ("kitti"), jon-20 ka avulla voidaan toteuttaa menetelmä ihmisen nivelreuman toteamiseksi analyysin kohteesta, jolla epäillään olevan ihmisen IgA:n ja oci-antitrypsiinin (IgA-ajAT) kompleksia nivelreuman indikaattorina. Kitti sisältää IgA-otjAT-kompleksin ja ligandin, jonka '·; vasta-ainealue on spesifinen IgA-<XiAT:n antigeeniselle determi- 25 nantille, mutta joka olennaisesti ei reagoi ihmisen vapaan IgA:n tai ihmisen vapaan ax-AT:n kanssa.

«

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

30

Seuraavia määritelmiä käytetään kaikkialla tässä hakemuksessa.

"Määrityskoe" tarkoittaa havainnointi- tai mittausmenetelmää.

35 "IgA-aiAT-kompleksi" tarkoittaa ihmispotilaista löydettävää komp-leksia ellei muuta mainita tai asiayhteys muuten sitä osoita.

103975 7

Fab'-fragmentti tarkoittaa yhtä haaraa Y:n muotoisen vasta-ai-nerakenteen kahdesta haarasta; fragmentti säilyttää vasta-ai-nesitoutumiskykynsä.

5 F(ab')2-fragmentti tarkoittaa kahta Fab'-haaraa, jotka yhdistyvät disulfidisillan avulla; fragmentin vasta-ainesitoutumiskyky säilyy.

Fc-fragmentti tarkoittaa Y:n muotoisen vasta-aineen keskiakse-10 Iin "häntää".

Keksinnön mukaisissa ligandeissa on vasta-ainedomeeni (alue), joka on spesifinen ihmisen IgA:n ja a^ATm (IgA-a^AT) kompleksin antigeeniselle determinantille. Tämä vasta-ainedomeeni ei juu-15 ri reagoi ihmisen vapaan IgA:n ja vapaan ax-AT:n kanssa. IgA:n ja axAT:n (IgA-a^AT) kompleksi on luonnossa esiintyvä kompleksi, jota on läsnä nivelreumasta kärsiviltä potilailta otetuissa analyysinäytteissä. Edullisesti, mutta kuten edempänä tulee esiin, ei välttämättä, ligandissa on tällaista kompleksia vas-20 taan suunnattu monoklonaalinen vasta-aine. Suositeltavimmat monoklonaaliset vasta-aineet saadaan hybridomista, jotka ovat , oheenliitettyjen patenttivaatimusten kohteena. Puhdasta luon-

I I

, , nossa ilmenevää kompleksia vastaan suunnattujen polyklonaalis- f i l ; ’’ ten vasta-aineiden ei havaittu olevan spesifisiä IgA-a^AT-komp- : 'ύδ leksille, saatava antiseerumi reagoi myös kompleksoitumattoman « « ί,ί ί IgA:n ja αχΑΤ:η kanssa.

» t • · · « M f · ;T: Vaihtoehtoisesti ligandi voi olla vasta-aine, joka on suunnattu keksinnön mukaista synteettistä peptidiä vastaan. Tämä syn-,*30 teettinen peptidi on kovlenttisesti sitoutunut konjugaatti ly- f * ,···. hytketjuisista peptideistä, jotka edustavat niitä osia IgA:n : · i '· ^ raskaan ketjun ja at-AT-ketjun sekvensseistä, jotka sisältävät • ,;"J IgA-atAT-kompleksispesifisen immunogeenisen determinantin.

Eräässä tämän keksinnön erityisessä toteutusmuodossa valmiste- 3ίί taan ja käytetään ensimmäistä peptidifragmenttia, jonka amino-happosekvenssi on ihmisen IgA:n Fc-alueelta löytyvän kaltainen « - * • « 103975 8 tai tämän sekvenssin immunogeeninen analogi, ja toista peptidi-fragmenttia, jonka aminohapposekvenssi on ihmisen agATistä löytyvän kaltainen tai tämän sekvenssin immunogeeninen analogi, ja nämä ovat toisiinsa kovalenttisesti sitoutuneita. Suositeltava 5 sitoutumistapa on kovalenttinen S-S-sidos, jossa suhteessa ihmisen IgA:n C-päähän Fc-alueella viimeistä edellisen kyste-iinijäämän sidoksen immunogeeninen kolmiulotteinen konformaatio säilyy ihmisen IgA:sta ihmisen α^Τύίη. Suosi te ltavimman IgA-a^AT-kompleksin rakenne ei ole vielä täysin selvä. On kuitenkin 10 todennäköistä, että kovalenttinen S-S-silta on ihmisen axAT:n ainoan kysteiinijäämän (n:o 232) ja sellaisen kysteiinijäämän (n;o 495) välissä, jolla on toiseksi viimeisen kysteiinin asema ihmisen IgA:n α-ketjussa, johon J-ketjun tiedetään konjugoitu-van polymeerisen lgA:n muodostumisvaiheessa.

15

Ensimmäinen peptidifragmentti sai edullisesti olla sellainen ihmisen IgA:n Fc-alueen aminohapposekvenssi, joka sisältää toiseksi viimeisen kysteiinijäämän, suhteessa ihmisen IgA:n C-pää-hän, ja jossa on 5-20 aminohappojäämää, edullisesti 10-15 ami-20 nohappojäämää, tai sen immunogeeninen analogi. Ensimmäisessä peptidifragmentissa saisi edullisesti olla ainakin aminohapposekvenssi Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr, joka vastaa ihmisen IgA:n α-ketjun jäämiä 487-496, tai sen immunogeeni-':”: nen analogi. Tämä on minimisekvenssipituus, jolla muodostuu 25 stabiili konjugaatti. Edullisimmin aminohapposekvenssi saisi • i IV. olla Val-Ser-Val-Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr, joka • · :vastaa ihmisen IgA:n α-ketjun jäämiä 484-496, tai sen im- \·\ · munogeeninen analogi.

• · · • · • · · • · · * 1 30 Toinen peptidifragmentti saisi edullisesti olla sellainen ihmi sen öiATtn aminohapposekvenssi, joka sisältää kysteiinijäämän, '. 1: joka sitoutuu kovalenttisesti lgA:n α-ketjuun, ja jossa on 5- t · · : 20 aminohappojäämää, edullisesti 10-15 aminohappojäämää tai sen immunogeeninen analogi. Toisessa peptidifragmentissa saisi 35 edullisesti olla ainakin aminohapposekvenssi His-Cys-Lys-Lys, * 1 joka vastaa ihmisen a^ATrn jäämiä 231-234, tai sen immunogeeni- 103975 9 nen analogi. Tätä pidetään minimisekvenssipituutena, joka johtaa stabiiliin konjugaattiin. Edullisemmin aminohapposekvenssi saisi olla Gly-Met-Phe-Asn-Ile-Gln-His-Cys-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser, joka vastaa ihmisen α^ΑΤιη jäämiä 225-237, tai sen immunogeeni-5 nen analogi.

Keksinnön eräs erityisen suositeltava immunogeeninen peptidi sisältää vähintään seuraavan aminohapposekvenssin: 10 Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr

His-Cys-Lys-Lys tai sen immunogeenisen analogin.

15 Kaikkein suositeltavin immunogeeninen peptidi on peptidikonju-gaatti, jolla on seuraavanlainen aminohapposekvenssi:

Val-Ser-Val-Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr

Gly-Met-Phe-Asn-Ile-Gln-His-Cys-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser 20 tai sen immunogeeninen analogi (jota tästä eteenpäin nimitetään peptidiksi F017-F018).

igA-c^AT-kompleksille (luonnon kompleksille tai synteettiselle .·. 25 peptidille) voidaan valmistaa vasta-aineita alalla hyvin tun- ;·,·] nettuun tapaan. Polyklonaalisia vasta-aineita voidaan saada • * ’. *. immunisoitujen kaniinien verestä. Monoklonaalisia vasta-ainei- *;* ; ta voidaan valmistaa Köhler-Milsteinin menetelmällä hiirissä « · · ';]· sillä ehdolla, että fuusiossa käytetään ylimäärää pernasoluja 30 ja saatavien hybridomien sytolyysiä vastaan varaudutaan lisää- : mällä tuoreita pernasoluja tarvittaessa. Hybridomat seulotaan • · !.’· kompleksispesifisyys kriteerinä. Tällaisten monoklonaalisten - :":': tai polyklonaalisten vasta-aineiden Fab'- ja F(ab')2-fragmentit it]t. voidaan valmistaa tavallisin tunnetuin tavoin. Voidaan käyttää 35 mitä tahansa komplekseille vasta-ainedomeeneja tuottavia molekyylejä.

• I · · t · • « • · 103975 10

Diagnostisessa käytössä vasta-aine reagoi koehenkilön luonnon IgA-c^AT-kompleksin kanssa, ja saadaan havaittava tuote. Kaikissa testeissä, joissa kvantioidaan IgA-a^ATm läsnäoloa, vasta-ainekoostumuksissa tulee olla vasta-ainetta niin paljon, 5 että se reagoi kaikkien luonnon IgA-a,AT-kompleksien kanssa. Tällaiset diagnostisest tehoavat vasta-aine määrät vaihtelevat selvästi eri tekijöiden mukaan, jotka alan asiantuntijalle ovat itsestään selviä. Näitä tekijöitä ovat esimerkiksi käytettävän testin herkkyys ja spesifisyys, saatavilla oleva laitteisto 10 sekä analysoitavan aineen määrä. Suositeltavin analyytti on seeruminäyte, sillä se indikoi nivelreumaa paremmin kuin nivel-nesteet.

IgA-a^AT-kompleksimäärien selvittämistä eli mittaamista, edulli-15 semmin seerumista kuin nivelnesteistä, voidaan käyttää myös nivelreuman prognostisena indikaattorina auttamaan "varhaisemman" vaiheen (pre-erosiivinen vaihe) nivelreumapotilaita, joiden kohdalla diagnosointi on tavallisesti vaikeampaa.

20 Tässä keksinnössä suositellaan käytettäväksi ELISA-määritys-menetelmää (enzyme linked immunosorbent assay), mutta on mahdollista käyttää muitakin menetelmiä, esimerkiksi radioim-munosorbenttikoetta, saostusta, agglutinointia, suoraa ja epä-suoraa immunofluoresenssia tai komplementtifiksaatiota. Kokeet :\;25 voivat olla yhtä hyvin kompetitiivisia, inhibitioon perustuvia • · tai kerrostyyppiä.

9 m 9 9 9 9 9 9 9 9 I" J Yleensä määrityskokeissa käytetään havaittavaa leimaa. Voidaan * «« leimata anti-IgA-a^AT-vasta-aine, anti-vasta-aine (esim. vuohen • · · ’•**30 anti-kaniiniseerumi), anti-lgA-vasta-aine tai anti-a1-AT-vasta-aine. Sopivista leimoista voidaan mainita fluoreseiini, roda- • 9 miini ja auramiini sekä sellaiset radioisotoopit kuin 14C, 131I,

Ml V : 125I ja 35S. Suositeltavia entsyymileimoja ovat pipar juuriperok- sidaasi, β-D-glukosidaasi, β-D-galaktosidaasi, ureaasi, glu- • ,,,.:35 koosioksidaasi plus peroksidaasi sekä hapan fosfataasi.

t 103975 11

Nykyisin käytettävissä olevat menetelmät mainittujen leimojen havaitsemiseksi ovat tunnettuja ja niistä voidaan mainita kolo-rimetriset, luminometriset ja fluorometriset tekniikat samoin kuin erilaiset intrumentaalimenetelmät radioisotooppien havait-5 semiseksi.

Määrityskokeet toteutetaan tavallisesti niin, että havaittava tuote sidotaan alustalle, jotta sitoutumaton seeruminäyte erottuisi helposti.

10 Käyttökelpoisia alustoja ovat esimerkiksi lasiset tai muoviset pinnat, erityisesti koeputkien sisäpinnat tai testilevyjen pinnat. Tyyppiesimerkkeinä tasaisista pinnoista, joita voidaan käyttää entsyymiperustaisessa ELISA-immunomääritysmenetelmässä 15 tai radioaktiivisuusperustaisessa RIA-immunomääritysmenetelmäs-sä voidaan mainita lasi, nitroselluloosapaperi sekä erilaiset muovit kuten polystyreeni, polykarbonaatti ja erilaiset poly-vinyylit. Partikkeleista, joita voidaan käyttää makroskooppisissa menetelmissä, joissa reaktiotuote voidaan havaita visuaa-20 lisesti, esimerkiksi hemagglutinaatiomenetelmässä, voidaan mainita biologiset partikkelit kuten lampaan punasolut tai ihmisen veriryhmän 0 punasolut sekä biologisesti inertit partikkelit kuten hiili-, bentoniitti- tai latex-palloset. Tällaisten pal-: losten valmistusmateriaali voi olla polystyreeni, polyvinyyli- :’·.·25 pyrrolidoni ja erilaiset polyvinyylit.

* « • · · • « Φ • · : .·. Alustan pinnalle kiinnittyminen voi perustua suoraan adsorpti-• · · ! oon, pakotettuun adsorptioon tai kemialliseen liittämiseen tun-* * · netuin menetelmin.

• · · • · · • 30

Suositeltavia kerrosyhdistelmiä ovat seuraavat (* = leimattu • t substanssi) : • « « • · ♦ • # ♦ • · • · « » · • * ♦ 103975 12

Kerroskokeet: alusta/anti-IgA-ajAT/IgA-a^AT-analyytti/anti-IgA1 alusta/anti-IgA-aiAT/IgA-aiAT-analyytti/anti-aiAT1 alusta/anti-IgA-aiAT/IgA-aiAT-analyytti/anti-IgA-aiAT1 5 (toisen vasta-aineen spesifisyys erilainen kuin ensimmäisellä)

Inhibitiokokeet: alusta/IgA-o^AT/anti-IgA-a^AT1 + analyytti (esi-inkubointi ennen lisäämistä alusta/IgA-c^AT: lie) 10

Kompetitiiviset kokeet:

IgA-o^AT1 / alusta/anti-IgA-öjAT 15 \

IgA-Oj^AT-analyytti Tämän keksinnön toteuttamiseen voidaan käyttää hyvin erilaisia kokonaisuuksia ("kitti")· Niissä on keksinnön mukainen ligandi 20 sekä IgA-a^AT-kompleksi. On suositeltavaa, että määritysko- konaisuudessa on osat kompleksin määrittämiseksi joko A) ker- rosmenetelmällä, jolloin yllämainitun lisäksi kokonaisuudessa on toinen detektioligandi, jossa on vasta-ainedomeeni, joka ensimmäiseen ligandiin liitettynä voi havaita IgA-o^AT-komplek- 25 sin, tai B) kompetitiivisellä tai inhibitioon perustuvalla me- ·1·1; netelmällä, jossa määrityskokonaisuuden mainittu IgA-a^AT-komp-• « j leksikomponentti on luonnossa esiintyvän kompleksin immunogee- • #· « .·. : ninen analogi, edullisesti immunogeeninen synteettinen peptidi.

• · ·

Ligandit saisivat edullisesti olla edellä esiin tulleiden kai- • · · ’ 30 täisiä polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita, Fab'- tai F(ab')2-fragmentteja, yksidomeenisia tai yksiketjuisia vas- f · 1 *♦ “ ta-aineita, kuten alan asiantuntijalle on selvää.

• · · • · · * « » « ·...: Kerrosmenetelmässä detektioligandin ei tarvitse olla vasta-ai- : 35 ne, joka on spesifinen koko kompleksille. Voidaan käyttää mitä tahansa ligandia, jolla saadaan kiinnitettyä leima IgA-ctjAT-ana- « · • ti 103975 13 lyyttiin (vaikuttamatta analyytin sitoutumiseen sieppausvasta-aineeseen). Erittäin sopiva on IgA:ta tai axAT:tä vastaan suunnattu vasta-aine.

5 Kerroskokeessa detektioligandi, vasta-aine, joka kilpailee analyytin kanssa kompetitiivisessa määrityskokeessa, ja vasta-aine, joka annetaan etukäteen reagoida analyytin kanssa inhibi-tiokokeessa, tulee leimata jossain vaiheessa. Nämä reagenssit voivat olla valmiiksi leimattuja konjugaatteja, muta tavalli-10 sesti on edullisempaa vain leimata ne lisäämällä uusi vasta-aine, joka on leimattu erillisenä komponenttina. Tavallinen toinen vasta-aine on immunoglobuliini, ja uudella vasta-ainella saadaan anti-immunoglobuliinia kasvatettuna eri isäntäeläimes-sä.

15

Yleensä kaikki määrityskokonaisuuden komponentit pannaan eri astioihin.

Kokonaisuuteen tulee tavallisesti sopivia pesu-, entsyymisubst-20 raatti- ja puskuriliuoksia sekä yksityiskohtaiset käyttöohjeet, joissa neuvotaan kuinka tulokset lasketaan ja tulkitaan.

Vaikka synteettinen peptidi tai puhdistettu luonnon IgA-o^AT- ·;··* kompleksi (kovalenttiset sidokset) onkin suhteellisen stabiili, ;*.J25 se saattaa hajota, jos koenäytteitä käsitellään väärin (esimer-• · kiksi altistetaan pelkistäville olosuhteille).

• · • · • · * · ♦ • · · I On tärkeää pitää analyytit kuten seeruminäytteet ja nivelnes- I · · tenäytteet ^Cissa lyhyellä aikavälillä, ennen koetta. Jos • · · '·* *30 koetta ei voida suorittaa päivän tai kahden kuluessa, näytteet tulisi säilyttää jäädytettynä (edullisesti -20°C:ssa tai sitä • · kylmemmässä) sen jälkeen kun niistä on varovasti sentrifugoi- - : maila poistettu sellulaarinen ja ei sellulaarinen debris.

• > « · · • · 35 Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä. "Tween11 on rekisteröi- • » »t · • · . ty tavaramerkki.

« · • * • · 103975 14

Esimerkki 1

Sekadisulfidien muodostaminen peptidien F017 ja F018 väliin

Sekä peptidi F017 että F018 valmistettiin käyttämällä 9-fluo-5 renyylimetoksikarbonyyliä (Fmoc) kiinteän faasin peptidisynte-tointikemian avulla LKB Biolynx 4170 peptidisyntetisaattorissa. Sekä peptidissä F017 että F018 kysteiinijäämillä (Cys) oli si-vuketjusuojaus: S-trifenyylimetyyli (TRT).

10 Lisättiin 15 mmol jodia etikkahapossa ja vettä (8:2) seokseen, jossa oli 5 mmol F017 ja 5 mmol F018 etikkahapon ja veden seoksessa (8:2). Seosta sekoitettiin lisäyksen jälkeen varovasti ja annettiin sitten olla 4°C:ssa 16 tuntia.

15 Peptidejä F017 ja F018 käsiteltiin myös yksinään samaan tapaan, niin että saatiin verrokit. Kaikki peptidivalmisteet ajettiin sitten Necleosil 5 C18 käänteisfaasi-HPCL-kolonnin läpi me-tanoli gradienttina (A = 5 % metanolia vedessä, B = 95 % me-tanolia vedessä). Verrattiin HPLC-jälkiä, ja F017:n ja F018:n 20 seoksesta saadut lisäpiikkifraktiot koottiin ja käytettiin F017-F018 -peptidikompleksina.

Samaan tapaan voidaan valmistaa peptidit

Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr ja His-Cys-Lys-Lys.

:25

( 4 I

• %

Myös peptidikonjugaatti · • · • · · • · · ”1 Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr 1

His-Cys-Lys-Lys • · · *·’ ‘30 voidaan valmistaa samaan tapaan.

• · f ♦ 1 • · · • · I I I • 1 ·

« · I

• · • · > · · • · • » · _ t I · • · 103975 15

Esimerkki 2

Kaniinin anti-IgA-aiAT:n tuottaminen

Kaniineihin (New Zealand White) ruiskutettiin 200 μq puhdistet-5 tua ihmisen IgA-aaAT-kompleksia tai 200 μg peptidikonjugaattia (F017-F018) emulgoituna täydelliseen Freundin adjuvanttiin sub-kutaanisesti, ja sen jälkeen ruiskutettiin vielä sama määrä kompleksia tai peptidikonjugaattia epätäydellisen Freundin ad-juvantin kanssa 14 ja 28 päivän kuluttua. Noin kuukautta myö-10 hemmin eläimistä otettiin verta.

Esimerkki 3 lgG:n eristäminen kaniinin antiseerumista ja erilaisten cleavage- fragmenttien valmistaminen 15

Yksi tilavuus tyydyttynyttä (NH4)2S04 liuosta, pH 6,5, lisättiin yhteen tilavuuteen kaniinin seerumia (lopullinen suolapitoisuus 50 % tyydyttynyt) tipoittain samalla sekoittaen 4°C:ssa.

20 Annettiin olla 6 tuntia, sitten saos erotettiin sentrifugoimal- la (3000g, 30 minuuttia), supernatantti heitettiin pois. Saos uudelleenliuotettiin 0,3 tilavuuteen 0,01 M fosfaattipuskuria, pH 8,0, ja dialysoitiin vasten 3 vaihtoa samaa puskuriainetta.

Tämä lopullinen dialysoitu liuos (esim. 5 ml) pantiin DEAE- :’\:25 Sephadex-kolonniin (esim. 12,0 x lcm), joka oli etukäteen tasa-• « ;*·*. painotettu 0,01M fosfaattipuskurilla, pH 8,0, ja eluoitu samal-« » ; la puskurilla. Koottiin 2,0 ml:n fraktiot. Proteiinipiikkiä .·, : (eli IgG) vastaavat fraktiot koottiin ja konsentroitiin ultra- * · · suodattamalla. Kolonnista saatiin lisää IgG:tä sisältäviä •’*30 fraktioita lisäämällä suolagradienttia (0,01M - 0,10M P04), 3 kolonnitilavuutta jokaista puskuria gradienttivalmistimessa.

♦ · · I · · t · « » « · Kaikkien fraktioitten koostumus otettiin talteen ja tarkastet-: tiin immunoelektroforeesilla vasten anti-ihmiskokoseerumia, *,35 vain IgG:tä sisältävät fraktiot koottiin, konsentroitiin ult- • rasuodattamalla ja säilytettiin alle -20*C:ssa.

• * • » 103975 16

Proteolyyttisten cleavage-fragmenttien valmistaminen a) Fab'- ja Fc-fragmenttien valmistaminen:

Natiivia IgG:tä hydrolysoidaan ydinalueella papaiinilla ja saa-5 daan kaksi antigeeniä sitovaa fragmenttia, Fab' ja raskaan ketjun C-terminaalipuoliskon dimeeri, Fc' (Porter 1959). Ne ovat kaikki samankokoisia (molekyylipaino 50000), mutta ne voidaan erottaa ioninvaihtokromatografiän avulla. Yleensä immunoglobu-liinien proteolyyttiset fragmentit voidaan erottaa ei-denatu-10 roivissa olosuhteissa, koska niissä ei ole kovalenttisia sidoksia.

Menetelmä: 15 1. Liuotetaan 1 mg papaiinia 100 μΙΐΆΆη 0,1M natriumfosfaatti-puskuria ja lisätään nopeasti 50 μΐ tätä IgG:hen. Sekoitetaan varovasti ja inkuboiddan yli yön 37°C:ssa (16 tuntia).

2. Dialysoidaan vasten vettä ja sitten vasten 3 x 500 ml 0,01M 20 natriumasetaattia, pH 5,5.

3. Tasapainotetaan ioninvaihdin 0,01M asetaattipuskurilla ja pannaan kolonniin, pestään samalla puskurilla huoneen lämpöti-lassa.

25 • * ·*'*· 4. Kun sekä näyte että vaihdin ovat täysin tasapainossa, lisä- i » j .·. tään näyte kolonniin ja eluoidaan vähintään 60 ml :11a lähtöpus- # t» · .·. : kurlainetta kunnes absorbanssi 280 nm:ssa on palautunut perus- • f · tasolle. Lisätään sitten lineaarista gradienttia, kokonaisti- « « 4 * 30 lavuus 200 ml, 0,01 m - 1 M asetaattia, kaikki huoneen lämmös sä. Kootaan 5 ml:n fraktiot ja tutkitaan absorbanssi 280 « · « '· '· nm:ssa.

M *

T 4 f c f I I

·.·»· 5. Proteiini, joka on eluoitu lähtöpuskurilla, ja gradientin 35 ensimmäinen piikki muodostuvat pääasiallisesti Fab':sta. Koi- t « * 4 » « »44 I · '11 i · • « 103975 17 mas piikki on Fc. Kolmen piikin proteiinisaannon tulisi olla noin 90 % lähtö-IgG.stä.

b) F(ab')2-, Fab'- ja pFc'-fragmenttien valmistaminen: 5 Natiivia IgG:tä hydrolysoidaan samoin pepsiinillä. Tämä entsyymi lohkaisee kuitenkin C-terminaalipuolelta vähintään yhden α-α-ketjudisulfidisidoksen, ja saadaan kaksiarvoinen antigeeniä sitova fragmentti, F(ab')2. Se myös hajottaa osat Fc-osasta pieniksi peptideiksi, ja jäljelle jää α-ketjun C-terminaalinel-10 jänneksen dimeeri, pFc'. F(ab')2-fragmentti voidaan pelkistää yksiarvoiseksi Fab'-fragmentiksi.

Menetelmä: 15 1. Liuotetaan 2 mg proteiinia 200 μΐ^βη asetaattipusuria ja lisätään 100 μg tätä IgG-lluokseen. Sekoitetaan varovasti ja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa (16 tuntia).

2. Neutraloidaan 2 M Trisillä (noin 300 μΐ - tämä inaktivoi 20 entsyymin peruuttamattomasti), ja sentrifugoidaan, 2000xg, 10 minuuttia, kaiken saoksen poistamiseksi.

3. Supernatantti lisätään G-200-kolonniin ja eluoidaan : TBS:llä. Kotaan 2,5 ml:n fraktiot ja tutkitaan absorbanssi 280 :'·,·25 nm:ssa.

« « ·# « » « · « · 9 · • .·. 4. Ensimmäinen huomattava piikki on F(ab')2. Sen edellä on • i « V j hajottamatonta materiaalia, ja heti sen takana mahdollisesti • ·« .1./ muodostunut Fab' tai koskematon Fc. Nämä sivutuotteet eivät 9 · · *·1 130 aina täysin liukene F(ab')2:sta ja ne muodostavat laajenemia tärkeimpään piikkiin. pFc' seuraavassa piikissä ja pienet pep-V'S tidit eluoidaan kolonnin kokonaistilavuus-Fab':ssa. F(ab')2

# M

' v ' voidaan haluttaessa suoraan pelkistää Fab':ksi seuraavan mene- v .. telmän avulla: • 1 .-..:35 • » ' 1 » • f * » • 4 ·

• I

* 4 103975 18 A. Kootaan F(ab')2:ta sisältävät fraktiot ja konsentroidaan 5 ml:aan (tästä pitäisi tulla proteiinipitoisuudeksi noin 6 mg/ml). Lisätään 0,5 ml IM Tris-puskuriainetta ja 50 μΐ EDTA-liuosta.

5 B. Lisätään 50 μΐ ditiotreitoliliuosta (0,1M ditiotreitolia IM Tris-puskurissa, vasta valmistettua), ja inkuboidaan suljetussa koeputkessa huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan samalla sekoittaen.

10 C. Jäähdytetään jäillä, peitetään foliolla ja lisätään 50 μΐ jodoasetamidiliuosta. Inkuboidaan jääkylvyssä 30 minutin ajan samalla sekoittaen.

15 D. Lisätään 5 μΐ ditiotreitoliliuosta, inkuboidaan huoneen lämmössä 15 minuuttia ja lisätään seos G-200-kolonniin. Eluoidaan kuten peptidihajotuksessa. Muodostuu pieni piikki hajaantuma-tonta F(ab')2:ta alkuperäisessä kohdassa ja sen jälkeen pääasiallisin Fab'-piikki.

20

Esimerkki 4

Kaniinin (polyklonaalisen) anti-kompleksi-antiseeirumin spesifisyyden toteaminen 25 Päällystettiin 96-kuoppaisia taipuisia määrityskoelevyjä (Fal- « · con 3912) antigeenillä inkubointiin yli yön 4’’C:ssa, 20 μ1:η • · : .·, alkvootit yhtä seuraavista: • · · • · · · • ·

• · I

( i) IgA-öjAT (5 μg/ml) • · · *·’ 30 ( ii) IgA (5 μg/ml) (iii) ajAT (5 μg/ml) • t

·.*·: valmistettuna 0,05 M karbonaatti/bikarbonaattipuskuriin (pH

0’: 9,6).

•MM « · • · » I · • » f • · 103975 19

Levyt pestiin 3 kertaan 1 minuutti kerrallaan fosfaattipusku-roidulla suolaliuoksella (PBS), pH 7,2, 0,05 % Tween 20:tä (PBS/Tween).

5 Esimerkin 2 tapaan valmistettua normaalia (NRS) ja testi- (anti-kompleksi) kaniinin seerumia (100 μΐ) titrattiin PBS/Twee-nissa (laimentamaton yhteen kahdessa laimennuksessa tai laimen-tamaton yhteen viidessä laimennuksessa) ja lisättiin antigeenillä päällystetyille levyille. Levyjä inkuboitiin sitten 1 10 tunnin ajan 37°C:ssa (negatiivinen kontrolli: PBS/Tween käytettynä yksin tai pelkkä levy inkuboituna normaalilla kaniinin seerumilla). Inkuboinnin jälkeen levyt pestiin kuten edellä.

Lisättiin 100 μ1:η alikvootteja vuohen anti-kaniini/IgG/pipar-15 juuriperoksidaasia 1/1000:n laimennokseen PBS/Tweeniä, ja levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 "c:ssa. Inkuboinnin jälkeen levyt pestiin kuten edellä.

Lisättiin 100 μ1:η alikvootteja substraattia, joka sisälsi: 20 20 mg o-fenyleenidiamiinia, 250 μΐ H202 ja 50 ml 0,15 M sitraattifosfaattipuskuria (pH 5).

.'./25 Värin annettiin kehittyä 5-15 minuuttia, sitten entsymaattinen • · värireaktio lopetettiin lisäämällä 25 μΐ 2 5-prosenttista H2S04 « · ] kaikkiin kuoppiin.

• t • M · • * • » | • t ·

Kaikkien kuoppien sisällön optinen tiheys luettiin 492 nm:ssä • · · *·’ *30 (OD4 92) Titertekin automaattisella levynlukijalla. Taulukkoon 1 kootut tulokset osoittavat, että antiseerumi oli huomattavan • · ·.*·· spesifistä kompleksiin nähden, suurilla vasta-ainelaimennoksil-• « * : la saatiin suuri OD492, jonkin verran reagointia a^A^iin näh- den eikä huomattavaa eroa verrokkeihin IgA:ta vastaan.

• * • · • » i · • · * • i · • · 103975

it cor-inr^cocMincDincM^rH

Ti -η·ηο) οο-^ιηιηιηιη^ηηΗοοσι

5 -PWC

fö <D <T3 HHHHHHHHHHHrl

i Η I

. ft id

:f0 ' 6 P

,- O CO

H Ö -* <0 :* 1 > e a

H I

<u c

^ μ? ^tfHCMrorocMCMcOH

c coininiDin^coint-io in nt^mncsjHOOooii c cn «»>·>·>«-«.>· I ft oooooooooo C ^ cn

H

>-t w ^ s! >h I Φ

ζ > -H C

£ · W 10 -H

-H >-J X

η] (0 I ΦΙ c^kDioroM^inin cn co cd .TjCO rfj I .-1 Id HCMCOint^HCMCM^CTiCnr'' in ·« CO -H ft-p ΐηΐΟΐηΐηΐΛΙΟΊ"!ΐΌΝ^(Ν

Se h 4J e w .......-----

n C l—l C O Id ,—It—It—If—1(—It—li—1«—1(—IOOO

ω W <ϋ X >

w CM

c σι W ^ 5 « e w £ e

pH

Sh £} H tn

0)+-1 H

S Ό :rii in cm in m in co -i* in P ;< 1". mcoinnNm

.lj ·Η ft CO lOLflMCMHO I I I I I I

Ο Γ) B Hr, ft ------

CM H r ft 5? 5 OOOOOO

§ -P W π o .h o w a ft w > ϋ

« S μ H

p Φ (Ö H

D p C § < 5 Φ B g Ό I Φ

i; !>ι Ή C

I Φ (0 -H

h xl X (ϋ

Eh-η ΦΙ ·ίηΦθΝπΐηιη H 4-> I .—I ca vj*ocr>ini^cocoo

a -H ft -P ΙΟΓ-^CMHOOOIIII

:": ic p e to ***v*..*..

><Φ com oooooooo , , : σ ω φ χ > • . · Η -Η ' * I Ρ Η ”.·. -Η ft g : .· ρ ο \ C tn .... ι ρ ιη . « ·Η Ρ —-τ c φ η m <μ ^ r- ιο

• · -η -Ρ f< en cd cd in in H

.·!·. ·Η -H tTi ft MfimMMHO

... C H H S ------III III

• Id H OOOOOO

X o c . . c

... Φ -P

*. *: ω φ c ... -h ω o : : : h -h i p id :id Φ CÖ

Cd M CO) e CO ^00 ....: C :rd -HO rd COCM'tCMCDCMCM^*

• · 0:<Ö 1« C 4J<M-#iOHnCDHinrlOO

. rH g I C fi \ W w W<M in H CM

..... ,ft -r-l Id Φ QJHHHHHHH *-*>*

> * Cg e H H H H

* r—I CO CO "H Ή • o Φ id <d id ft ft > h Pi il 103975 21

Esimerkki 5

Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen Immunisointi: 5 BALB/c-hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) 50 Mg IgA-aiAT-kompleksia emulgoituna vastaviin määriin täydellistä Freundin adjuvanttia. Ruiskutukset toistettiin 14 ja 28 päivän kuluttua IgA-a^AT-kompleksi emulgoituna epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin. Verinäytteistä, jotka otettiin 28. päivänä tai 10 sitä myöhemmin, tutkittiin anti-peptidivasta-aineiden suhteen epäsuoralla ELISA-menetelmällä. Kolme päivää ennen fuusiota hiiret, joilla oli kohonneet seerumivasta-ainetitterit, saivat uuden tehosteruiskeen (i.p.), 50 Mg IgA-aiAT-kompleksia PBS:ssa.

15 Fuusioiminen:

Hyperimmunisoidut hiiret tapettiin servikaalidislokaatiota käyttäen, perna poistettiin, solut eristettiin ja pestiin. Pernasolut fuusioitiin hiiren myeloomasolulinjän soluihin (Ag. 8.653 tai NSO tai NS1), joita oli viljelty logaritmisesti kas-20 vattaen. Muunnellulla Köhler-Milsteinin menetelmällä (Köhler, G, and Milstein, C., Nature (London) 256, pp 495, 1975) fuusioitiin perna- ja myeloomasoluja suhteessa 2:1, lisäksi 40 % PEG (polyetyleeniglykoli, moolipaino 1450). Sekoitettujen solujen ·;·; (perna- ja myeloomasolut) pallukkaan lisättiin 1 ml PEG 1 mi-:25 nuutin aikana tipoittain ja laimennettiin seerumittomalla ela-tusaineella. Fuusiosuspensio levitettiin 96-kuoppaisille le- * · | ^ vyille ja sitä viljeltiin HAT:ia (hypoksantiini, aminopteriini • · · T ! ja tymidiini) sisältävässä elatusaineessa. Hybridomasolujen t i · huonoa kasvua parannettiin lisäämällä normaaleja hiiren per- • · · *·* *30 nasoluja (heti fuusion jälkeen) tuoreiden makrofagien lähteinä ja korvaamaan injektoidun IgA-o^AT-kompleksin sytolysoimia solu- • · • · · · _ ·. ·: Ja· « ♦ ·

• I I

• · · ' Levyt tutkittiin 10 päivän kuluttua hybridomien kasvua tark- • » .35 kaillen. Näistä soluista otettua supernatanttia seulottiin , anti-IgA-a^AT-kompleksivasta-aineiden havaitsemiseksi epäsuoran 1 · * * * 103975 22 ELISA-menetelmän avulla. Käytettiin seuraavanlaista kerrosyh-distelmää (* = leimattu substanssi): alusta/IgA-aiAT/anti-IgA-a^AT/vuohen anti-hiiri-IgG* 5

Kloonaus:

Kun positiivset solut oli identifioitu haluttua vasta-ainetta tuottaviksi, hybridisoluja kloonattiin rajoitetulla laimennoksella ja kloonit tutkittiin. Hybridomia viljeltiin pulloissa 10 tai kasvatettiin hiirissä. Askitesnestettä saatiin BALB/c-hii-ristä, joita oli käsitelty pristaanilla (0,5 ml injisoituna i.p.) muutamaa päivää ennen kuin ruiskutettiin 105 hybridisoluja. Tuumorin katsottiin muodostuneen noin 2-4 viikossa, ja kerääntynyt askitesneste otettiin talteen tappamalla hiiret ja 15 poistamalla mahaontelon sisältö pipetillä. Monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuus askitesnesteessä määritettiin kaikilla tuumoritapauksilla. Määrä vaihteli alueella 5-15 mg/ml.

Seulonta: 20 Monoklonaalisten vasta-aineiden seulomiseen käytetty menetelmä oli seuraavanlainen. Valmistettiin levyt seuraavin tavoin: a) levy päällystettiin ihmisen IgA-aiAT-kompleksilla (inkuboi-maila liuoksella, joka sisälsi proteiinia/ml) + solusuper-25 natantilla + vuohen anti-hiiri-peroksidaasi-leimatulla vasta- • · ;·.·. aineella, • · • · • · • · * • · · ! b) levy päällystettiin vapaalla ihmisen IgA:lla (5Mg/ml:n li- « · « uos) + seuraavat vaiheet kuten edellä, • · · ’·* ‘ 30 c) levy päällystettiin vapaalla ihmisen axAT:llä (5μg/ml:n li- t · V*: uos) + seuraavat vaiheet kuten edellä.

• M

t I < « * ·

Solut, jotka tuottivat supernatantit, jotka reagoivat positii- « · <i<<; 35 visesti vain yllä olevan systeemin a) mukaisesti, valittiin • * . hybridomiksi, jotka tuottivat spesifisesti IgA-ajAT-kompleksia t t • mi • I • · · « « f

• I

m lii 103975 23 vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita (ei reagointia vapaan lgA:n tai vapaan a,.AT:n kanssa).

Kaksi tällaista hybridomasolulinjaa, jotka erittävät mono-5 klonaalisia vasta-aineita luonnon IgA-aiAT-kompleksille, on talletettu Budapestin sopimuksen (the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure) mukaisesti : the European Collection of Animal Cell cultures, PHLS Centre for Applied 10 Microbiology and Research, Porton Down. Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, England. Ensimmäinen (NLW.54) talletettiin 6.2.1990 talletusnumerolla ECACC 90020611. Suositeltavin vasta-aine (NLW.50) talletettiin 13.12.1990 talletusnumerolla ECACC 90121302.

15

Esimerkki 6

IgA-a^AT-kompleksin mittaaminen kaksiulotteisella immunoelektro-foreesilla (2D-1EP) 20 Valmistettiin liuos l-prosenttista agaroosia (Sea kern HGT Agarose ICN Biomedical Ltd.) 0,05M barbitonipuskurissa, pH 8,6. 4 ml tätä sulatettua agaroosiliuosta kaadettiin 7,6 x 5,0 cm:n lasilevylle ja annettiin asettua. Sitten leikattiin 1,1 x 5,0 cm:n raidat ja siirrettiin puhtaille 7,6 x 5,0 cm:n lasilevyil- ;25 le (yksi raita agaroosia per levy). Agaroosiin leikattiin 2 • « * mm:n kuoppa, 155 mm vasemmasta reunasta ja 7 mm levyn pohjasta.

• ♦ j ^ Kuoppaan pantiin 3μ1 testiseerumia, ja näytteeseen lisättiin J*· | pieni tippa bromofenolisineä. Levyt pantiin elektroforeesi-• · » laitteeseen näytekuoppa lähimpänä katodia ja agaroosiraita pi- V *30 tuussuuntaan anodiin nähden. Agaroosille pantiin suodatin- imupaperit 1 cm:n päähän molemmista päistä. Levyt elektrofo- ί#*.ί resoitiin, 20mA/6 levyä jäähdyttäen, kunnes hitaammpin liikkuva • (albumiiniin sidottu) bromofenolisinimarkkeri saavutti imupape- ’ . rin laitteen anodipuolella (kesto noin 2 tuntia). 50 μΐ lam-• · 35 paan anti-ihmisen a^AT^ä lisättiin 4 ml:aan sulatettua agaroo-• » ♦ « · siä 56°C:ssa ja kaadettiin lasilevyille 1,1 x 7,6 cm:n raidan • · - » « « 103975 24 yläpuolella olevaan tilaan. Levyjä elektroforesoitiin 90° ensimmäisestä elektroforeesista, 20mA/6 levyä, yli yön. Levyt otettiin elektroforeesilaitteesta ja pantiin punnittujen suoda-tinpapereiden väliin 30 minuutiksi. Sitten levyt siirrettiin 5 inkubaattoriin, kunnes ne olivat täysin kuivat. Levyjä värjättiin 0,05-prosenttisella Coomassie Brilliant Blue väriaineella (Coomassie on rekisteröity tavaramerkki) 10 minuutin ajan ja huuhdottiin sitten metanolin/etikkahapon/veden seoksella (40:4:56) kunnes presipitiinilinjät olivat selvästi näkyvillä.

10 "Hitaammin" liikkuvan piikin (IgA-a^AT-kompleksi) alue mitattiin planimetrillä, ja kompleksikonsentraatio ilmoitettiin pinta-alana cm2:nä.

IgA-a^AT-kompleksin pitoisuus patologisten näytteiden tilasto-15 taulukon alaryhminä mitattiin tällä menetelmällä. Tulokset on koottu taulukkoon 2.

• « « · · « · · « ( • · • · « · · i · · • 1 · · • · • · # * 1 · « · • ♦ · ♦ · t 4 1 · m • · « f a • «· « · ·«· • 1 · « · · « * » · · « 1 « · « 9 . < 1 # · I 1 · « » • « 103975 25 TAULUKKO 2

Potilas Diagnoosi Näyte IgA-aiAT- 2D-IEP- kompleksi- sija 5 pitoisuus (2D-IEP-arvo) (satunnais- yksiköt) 10 1 RA Seerumi 4,05 4 2 RA Seerumi 2,80 5 3 Turvonnut polvi Seerumi 1,00 9 4 RA Seerumi 2,40 7 15 5 AS Seerumi 0,45 10 6 IgA-myelomatosis Seerumi 26,00 1 7 IgA-myelomatosis Seerumi 12,00 2 8 RA Nivelneste 2,80 5 9 RA Seerumi 6,85 3 20 10 Polymyalgia Seerumi 0,70 11 11 RA Seerumi 1,20 8 12 RA* Nivelneste 0,00 12 25 RA = nivelreuma (arthritis rheumatoides) « ' ' AS = selkärankareuma (spondylarthritis ankylopoietica) r r * = steroideilla hoidettu potilas ·· « « « · ft · « # • Esimerkki 7 • · ft ♦ ·\· 30 igA-aJVT-kompleksin mittaaminen kerros-ELISA-menetelmällä • « ~~ • ·» • · · • « *

Yleismenetelmä . , Taipuisa 96-kuoppainen koelevy (Falcon 3912) päällystettiin pitoisuudeltaan optimaalisella ensimmäisellä vasta-aineella tai « i « ’ 35 sieppausvasta-aineella päällystepuskuriaineessa (0,05M kar- 'J"i bonaatti/bikarbonaattipuskuri, pH 9,6). Tämän vasta-aineen *:·· 120μ1:η alikvootteja (1/16000 laimennos) absorboitiin levylle • f I < I • i : t 4 · « · « « · • 1 103975 26 inkuboimalla 37°C:ssa 1 tunnin ajan, 1 tunnin ajan huoneen lämmössä tai yön yli 4°C:ssa. Sitten levy pestiin 3 kertaa 1 minuutti kerrallaan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,2), joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä.

5

Levylle lisättiin Ι00μ1:η alikvootit IgA-atjAT-kompleksia tai testiseeruminäytteitä (laimennettuna 2 tai 5 kertaisesti) ja inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa. Sitten levyt pestiin kuten edellä.

10

Levylle lisättiin 100 μ1:η alikvootit toista pitoisuudeltaan optimaalista vasta-ainetta (esim. 1/6000 kaniinin anti-IgA-o^AT-kompleksi) ja inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Levy pestiin taas kuten edellä, sitten lisättiin 100 μ1:η alikvoo-15 tit kolmatta pitoisuudeltaan optimaalista vasta-ainetta. Tämä vasta-aine (esim. vuohen anti-kaniini-IgG) leimattiin entsyymi-piparjuuriperoksidaasilla. Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan ja pestiin sitten kuten edellä.

20 Lisättiin 100 μ1:η alikvootit substraattia entsyymipiparjuuri-peroksidaasille. Substraatti sisälsi 20 mg o-fenyleenidiamii-nia, 250 μΐ H202 ja 50 ml 0,15M sitraattifosfaattipuskuria, pH

5,0. Värin annettiin kehittyä 5-15 minuuttia ja sitten entsy-: maattinen värireaktio lopetettiin lisäämällä kaikkiin kuoppiin 25 25 μΐ 25-prosenttista H2S04. Kaikkien kuoppien optinen tiheys • » \ ! luettiin 492 nmrssa (OD492) automaattisella Titertek-levynluki- • Il ”* | jalla.

· · • · · • · • « · V ‘ Tulokset: 30 1. Kerros-ELISA:t joissa polyklonaalisia vasta-aineita IgA:ta :#’.j tai c^ATrtä vastaan. Sieppausvasta-aineena anti-IgA.

m • · · • · · ' . Kerros-ELISA-menetelmä toteutettiin kuten edellä kuvattiin.

I f

Suoritettiin 4 analyysikoetta käyttämällä kahta hiiren ja kahta

I « I I I

'35 kaniinin polyklonaalista anti-IgA-vasta-ainetta sieppausvasta- 103975 27 aineena tai ensimmäisenä vasta-aineena. Näiden ELISA-kokeiden kerrosyhdistelmät olivat:

Koe 1 : alusta/lammas (1) anti-IgA/IgA-ajAT-kompleksi/lampaan 5 anti-o^AT + leimattu anti-lammas-vasta-aine

Koe 2 : alusta/lammas (2) anti-IgA/IgA-a^AT-kompleksi/lampaan anti-a^AT + leimattu anti-lammas-vasta-aine 10 Koe 3: alusta/kaniinin (1) anti-lgA/lgA-atiAT-kompleksi/lampaan anti-a^AT + leimattu anti-lammas-vasta-aine

Koe 4: alusta/kaniinin (2) anti-IgA/IgA-a^AT-kompleksi/lampaan anti-o^AT + leimattu anti-lammas-vasta-aine 15

Kokeiden 1-4 tulokset on koottu taulukkoon 3. Näytteet 1-12 ovat samat kuin esimerkin 6 taulukossa 2, jossa IgA-axAT-komp-leksin pitoisuudet mitattiin 2D-IEP:llä. 2D-IEP-sijat on vertailun helpottamiseksi lisätty taulukkoon 3.

• « • · i • « t • < « « « • 1 • · * » » • 1 · • · · « • · • · « • · · • · • · · • « · • · · • · • t « • · · • · ·»»

• · I

• · t •

« I I

t · * · · » · · « • Il • « 28 103975 TAULUKKO 3 Näyte Koe 1 Koe 2 Koe 3 Koe 4 2D- n:o OD492 sija OD492 sija OD492 sija OD492 sija IEP- si ja 1. 0,828 2 0,355 2 0,900 2 0,355 2 4 2. 0,924 1 0,578 1 1,157 1 0,578 1 6 3. 0,657 7 0,173 4 0,176 5 0,173 4 9 ! 4. 0,607 9 0,153 9 1,144 11 0,153 9 7 5. 0,580 10 0,164 7 1,141 12 0,164 7 10 6. 0,702 4 0,160 8 1,155 8 0,160 8 1 7. 0,664 6 0,167 6 0,147 10 0,167 6 2 / 8. 0,653 8 0,158 10 1,191 4 0,148 10 5 • i • • · :·: : 9. 0,406 12 0,116 12 0,157 7 0,116 12 3 999 9 99 9 9 :T: 10. 0,762 3 0,170 5 1,566 3 0,170 5 11 11. 0,663 5 0,178 3 0,154 9 0,178 3 8 • · • · · 999 999 12. 0,466 11 0,132 11 0,159 6 0,132 11 12 • 1 • · · 103975 29

Kuten voidaan kvalitatiivisesti nähdä vertaamalla sijoja ja vahvistaa statistisin analyysein, ELISA:11a ei voitu vahvistaa 2D-IEP-tuloksia. Esimerkiksi kokeissa l ja 3, näytteiden 6, 7 ja 9 arvot olivat pienet huolimatta niiden suurista 2D-IEP-ar-5 voista, ja näytteessä 10 kompleksipitoisuudet näyttivät 2D-IEP:llä pieniltä, mutta ELISA:11a suurilta.

Kokeissa 2 ja 4 näytteillä 6, 7 ja 9 oli pienet ELISA-arvot huolimatta niiden suurista 2D-IEP-arvoista. Tulokset osoitta-10 vat, ettei tätä lähestymistapaa voida käyttää IgA-a^AT-kompleksien mittaamiseen. Ristiriitaisuudet näiden kahden menetelmän (ELISA ja 2D-IEP) tuloksissa johtuvat todennäköisesti siitä, että vapaa IgA sitoutuu preferentiaalisesti ELISA-levyä peittävään anti-IgA-vasta-aineeseen ja estää näin IgA-axAT-kompleksien 15 sitoutumisen.

2. Kerros-ELISA-systeemit, joissa käytetään polyklonaalisia vasta-aineita IgA:ta tai a^AT^ä vastaan. Sieppausvasta-aineena anti-öjAT.

20

Suoritettiin aiemmin kuvatun kaltainen kerros-ELISA. Käytettiin seuraavanlaista kerrosyhdistelmää: * » · · · * · alusta/lampaan anti-o^AT/IgA-o^AT-kompleksi/polyklonaalinen an- § · j'.·. 25 ti-IgA + leimattu vasta-aine.

v · • ·

» I I

• I t ”[ ! Tässä esimerkissä mitattiin erilaisia patologisia näytteitä ja • · · verrattiin samojen näytteiden 2D-IEP-mittaustuloksiin. Tulok- • · · • set on koottu taulukkoon 4.

• · • « · • · · • · 1

•I

• I I

• · · • « • » 103975 ·<ΰ I—I γΗ ft w

H

Q

M

ο ιηοοοιηοοο ω οωο^'ίοοο (o - P H'<MH<NOHl£>n)

-H (N H

ω X © i—I

a g o

M

td

rH

*H

•H

ω 0 c

Co t^rocot^^oor-'

© ^ r-LDOOOOOO

g \ Vfcvv»v».v

•h H OOOOOOOO

td

i—I

§ § g Co inNrlCOfflOttOffl

£> P OJ OOI^nJOOOOO

O O © \ »1.vv«.vvv

O ©H OOOOOOOO

< ω

En t

P

(DO ^HinonJOOn)

(Λ rH OO't^HHHOH

,¾ \ ·- V ^ ~ '

OH OOOOOOOO

rH

c

P

,,,,: r< ΟΟΟΗΗΓΜΓΊΓ^Η ' ' coin ΟΟΙ^ΗΓΜΗΟΗ H \ λ μ} H OHOOOOOH C" ', ' ω (-1

S

I > •

. . P

• · · -H

·· · w 1

·. ·; O g g S

G o o 1 .1ί1. O1 fiictJriirfJriJrfJHH ^

v · td S 2 S S S 2 oi j) C4J

-H "ti D g g © =0

. . >< 1H

... © Ui ·. 1: x x ... -H £>ί : : : .H ρω

• ε -H

’ -h C td 2 2

1- ω C

. c M -h c :·: S o p p td P C P -ö ^ ^ ’ H ©© O ,G © C W οω .:. -h > p -ö p tr> ft td © „ „ p td >, -h p -h <d λ c 11 11 .. o ©ii©tdPCH0 ^ „ :·,: ft &^ftPQ!5co<<io ♦ 1

• I

103975 31 Näillä kahdella menetelmällä saadut hyvin erilaiset tulokset, kuten esimerkiksi sijoista voidaan nähdä, johtuvat todennäköisesti siitä, että vapaa ααΑΤ sitoutuu preferentiaalisesti pääl-lystevasta-aineeseen ja estää siten IgA-ttjAT-kompleksin sitoutu-5 mistä.

3. ELISA-kerroskokeet vasta-aine (monoklonaalinen tai poly-klonaalinen) luonnon kompleksia vastaan sieppausvasta-aineena tai ensimmäisenä vasta-aineena.

10

Toteutettiin kerros-ELISA kuten edellä seuraavin kerrosyhdis-telmin: 1. alusta/Mk anti-IgA-a^AT/IgA-a^AT-kompleksi/Lm Pk anti-IgA + 15 leimattu anti-lammas-vasta-aine 2. alusta/Mk anti-IgA-aiAT/IgA-aiAT-kompleksi/Lm Pk anti-aiAT + leimattu anti-lammas-vasta-aine 20 3. alusta/Mk anti-IgA-a^AT/IgA-ajAT-kompleksi/Kn anti-IgA-a-jAT + leimattu anti-kaniini-vasta-aine 4. alusta/Kn Pk anti-IgA-öiAT/IgA-aiAT-kompleksi/Lm Pk anti-IgA + leimattu anti-lammas-vasta-aine . v 25 < 4 ! 5. alusta/Kn Pk anti-IgA-a-iAT/IgA-aiAT-kompleksi/Lm Pk anti- « « i *** | ααΑΤ + leimattu anti-lammas-vasta-aine ♦ · « * «« * · • * ϊ * · ** * 6. alusta/Kn Pk anti-IgA-ctiAT/IgA-aiAT-kompleksi/Mk anti-IgA- 30 αχΑΤ + leimattu vasta-aine « · * · · * ·« • · ;Τί Pk = polyklonaalinen vasta-aine puhdistettua kompleksia vas- ' fj]t. taan, IgA tai αχΑΤ kerrosyhdistelmien mukaan « « . Mk = hybridoma NLW54:n erittämä monoklonaalinen vasta-aine - · ♦ * · \ *35 keksinnön mukaisesti ·:* Lm = lammas Kn = kaniini t » • » · 4 * » 103975 32

Kohdan 3 mukaisen kerrosyhdistelmän kerros-ELISA-tulokset on koottu taulukkoon 5. Taulukossa verrataan OD492-arvoja ELISA:-11a 2D-lEP:llä saatuihin arvoihin.

5 TAULUKKO 5

Seerumi n:o 2D-IEP- ELISA- (OD492) 10 arvot sija arvot sija 19 0,9 10 0,65 5 20 0,5 11 0,64 9 21 1,5 9 0,63 6 15 22 2,3 8 0,63 6 23 2,5 7 0,63 6 24 2,9 6 0,60 10 25 3,2 5 0,77 3 26 3,5 4 0,60 10 20 27 3,9 3 0,76 4 28 5,0 2 0,81 2 puhdistettu eristetty ';"; igA-öiAT-kompleksi M (2mg/ml) (7,0) 1 0,99 1 25__ • 4 • ·

* I

• · · F · · »Il · • · # <^1

Kuten taulukosta 5 ilmenee, kolmella neljästä kerrosyhdistelmän 11« ’·’* (3) näytteestä on suuret 2D-IEP-arvot (>3,0 yksikköä) ja myös 30 suuremmat OD492-arvot. Vaikka seeruminäytteiden IgA-öiAT-komp- φ · *.’·· leksin pitoisuudet ovat pienemmät, erot mitattuihin ELISA-ar-·♦* ί#ί ί voihin ovat pienet, ja tulosta voidaan parantaa lisäämällä kokeen herkkyyttä.

« « f

4 I

. 35 Tulokset ELISA-kokeista, joissa käytetään kerrosyhdistelmiä 1 « ..li' ja 2 (tuloksia ei esitetty) ovat samansuuntaiset yhdistelmän • « • t « « 4 • · 103975 33 (3) tulosten kanssa. Nämä tulokset osoittavat, että kerros-analyysikokeessa havaitsemisvasta-aine voi olla anti- koko kompleksille tai jommalle kummalle sen komponentille. Tulokset määrityskokeista, joissa käytettiin kerrosyhdistelmiä 4, 5 ja 6 5 osoittivat, ettei IgA-axAT-kompleksia voida mitata käyttämällä polyklonaalisella kaniinin anti-kompleksi-vasta-aineella päällystettyjä levyjä (tuloksia ei esitetty).

Esimerkki 8 10 IgA-otJiT-kompleksin mittaaminen inhibitio-ELISA: 11a 96-kuoppainen jäykkä levy (Falcon 3040) päällystettiin 500 μg ml-1;lla naudan seerumialbumiinia (BSA). Kaikkiin kuoppiin lisättiin 200μ1:η alikvootit ja inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunnin 15 ajan. Levy pestiin 3 kertaa 1 minuutti kerrallaan fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) (pH 7,2), joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä (PBS/Tween 20). 100 μ1:η alikvootteja IgA-axAT- kompleksia tai testiseerumia titrattiin (2 tai 5 kertaiset laimennokset PBS/Tween 20:ssä), ja sitten lisättiin 100μ1:η ali-20 kvootit monoklonaalista vasta-ainetta IgA-axAT-kompleksille NLW54-solulinjalta optimipitoisuuteen (esim. 1/20000 ja lopullinen pitoisuus 1/40000) ja levyä inkuboitiin yli yön 47°C:ssa.

. Mainitun yli yön inkuboinnin jälkeen levyä sentrifugoitiin no- . 25 peudella 3000 kierrosta 15 minuutissa ja jokaisesta kuopasta I1 siirrettiin 90μ1:η alikvootit toiselle levylle, joka oli etukä- : ·’ teen päällystetty IgA-aiAT-kompleksilla. Etukäteen päällystämi-• · : nen suoritettiin seuraavaan tapaan. 96-kuoppainen taipuisa « « ’·.'·· koelevy (Falcon 3912) päällystettiin 100μ1:η alikvooteilla IgA- :130 axAT-kompleksia 5μg ml'1 pitoisuudella, valmistettuna päällyste-

puskurlaineessa (0,05M karbonaatti/bikarbonaattipuskuri pH

.•. j 9,6). Tätä levyä inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunnin ajan, 2 tuntia • · huoneen lämmössä tai yli yön 4°C:ssa, ja pestiin sitten yllä • « « kuvattuun tapaan.

« '35 9 9 t ♦ » 1 • I · 103975 34

Lisättiin 100 μ1:η alikvootit vasta-ainetta, joka oli leimattu entsyymipiparjuuriperoksidaasilla (esim. leimattu vuohien anti-hiiri-IgG, laimennos 1/1000), ja levyä inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunnin ajan. Levy epstiin kuten edellä. Lisättiin 100μ1:η ali-5 kvootit substraattiliuosta. Substraattiliuos sisälsi 20 mg o-fenyleenidiamiinia, 250 μΐ H202 ja 50 ml 0,15M sitraattifosfaat-tipuskuria, pH 5,0. Värin annettiin kehittyä 5-15 minuuttia, sitten entsymaattinen värireaktio lopetettiin lisäämällä kaikkiin kuoppiin 25 μΐ 25-prosenttista H2S04.

10

Kaikkien kuoppien optinen tiheys luettiin 492 nm:ssa (OD492) automaattisella Titertek-levynlukijalla. Prosentuaalinen inhi-bitio laskettiin: 15 inhibitio-% = 1- 0D492 näyte - OD492 tyhiä_ X 100 OD492 inhiboimaton näyte - OD492 tyhjä

Kokeen tulokset on koottu taulukkoon 6. Tuloksia verrattiin saman seerumin mittauksiin tavallisella 2D-IEP-menetelmällä.

20 ELISA-tulokset on ilmoitettu seerumin (titterin) laimennoksen käänteisarvona, joka täytyy lisätä, jotta päästäisiin 50-pro-senttiseen leimatun vasta-aineen inhibitioon.

I I I [ | I f

I I I

• I I f · • · · • · · • · • · • · • · · f · · • · · · • f • ft • «« • · · 1 • · t • · « • « • · · • ·« • « • I · « f f « « t · 9 • · I I • » 1 9 9 9 9 9 9 » • 9 TAULUKKO 6 35 103975 5 Reuma- Titteriseerumin sija 2D-IED 2D-IEP- seerumi käänteisarvo, jolla (Satunnaiset sija päästään 50-%reen alayksiköt) inhibitioon 10___ 29 423 3 0,75 3 30 1405 5 1,15 4 15 31 1553 7 1,90 5 32 2051 8 2,45 6 20 33 1494 6 2,50 7 34 1310 4 2,75 8 35 52 1 0,60 1 25 36 344 2 0,65 2 30

Kuten taulukon 6 sijoista ilmenee, ELISA- ja 2D-IEP-tulokset olivat yhteneväiset. Statistisesti laskettuna se on noin 69 %. Tulos on vielä selvempi (89%), jos seerumin 32 (näyte, josta • · jV. saatiin suurimmat ELISA-inhibitioarvot) jätetään huomiotta.

! .*35 • · · .·. ; Esimerkki 9 • ·»

IgA-aJiT-kompleksin mittaaminen kaksoivasta-ainesieppaus-ELISA:- • · « • 11a • · • * · ’·*40 96-kuoppaiset levyt (Falcon 3912) päällystettiin sieppausvas-« « · · taaineella, jonka pitoisuus oli optimaalinen, valmistettuna ·...: päällystyspuskurissa (0,05M karbonaatti/bikarbonaatti, pH 9,6).

» *

« · i t < I

• * · « · 36 103975

Alikvootteja vasta-ainetta (120μ1), laimennoksena 1/1000, absorboitiin inkubointilevylle 37°C:ssa 1 tunnin ajan, huoneen lämmössä 2 tuntia tai 4°C:ssa yli yön. Sitten levy pestiin (3 x 1 minuutti) fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), pH 5 7,2, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä.

Yllä mainitulle esipäällystetylle levylle lisättiin monoklonaa-lista vasta-ainetta IgA-otiAT-kompleksille, joka oli hybridoma NLW54:n erittämä keksinnön mukaisesti, ja määrityskoe suoritet-10 tiin esimerkissä 7 kuvattuun tapaan. Käytettiin seuraavanlaista kerrosyhdistelmää: alusta/Mk rottan anti-hiiri-IgG/Mk hiiren anti-IgA-ajAT-komplek-si/IgA-atjAT-kompleksi/ Pk Kn-anti-IgA-a^AT/leimattu anti-kanii-15 ni-vasta-aine

Mk = monoklonaalinen vasta-aine Pk = polyklonaalinen vasta-aine Kn = kaniini 20

Yllä mainitun kaksoisvasta-aineseippausmenetelmää käyttäen saatuja tuloksia igA-a^AT-kompleksien pitoisuuden märittämiseksi testiseerumeista (nivelreuma ja normaalikontrollit) verrattiin 2D-immunoelektroforeesimenetelmällä mitattuihin IgA-ctiAT-komp-. 2,5 leksipitoisuuksiin, yhtä vasta-ainesieppaajaa käyttäen suori-

« I I

[[ S tettuun ELISA:an (Kuten esimerkissä 7(3) kerrosyhdistelmä 3) • « · | ·' sekä inhibitio-ELISA-tekniikoihin (esimerkki 8). Tulokset on • · · i.: : koottu taulukkoon 7.

• · • · « • · · • · • · · • · · • 1 · • · «Il • · · • · • · f • · · • ♦ · TAULUKKO 7 37 103975 Näyte 2D-IEP Kaksois-Ab-ELISA Yksi-Ab-ELISA Inhibitio- (cm2) (seerumilaimenn. seerumilaimenn. ELISA, 50 % 5 1/40), OD 492 nm 1/40), OD 492 nm inhibitio- titteri 29 0,5 0,298 0,674 196 10 301 1,2 0,564 0,877 309 31 3,3 0,342 0,654 221 32 3,9 0,538 0,748 356

Norm.

seerumi 1,1 0,310 0,644 202 15 Kömpi. 5,2 0,571 0,79 443 sisältävä seerumi 20 Näyte (1) on epänormaali, näyttää jatkuvasti suuria ELISA-arvoja ja pieniä 2D-IEP-arvoja. Todennäköisesti sen antamat 2D-IEP-luvut ovat vääriä.

25 Esimerkki 10

Tulosten vertaaminen käyttämällä hiiren monoklonaalista NIW.50:tä ja NLW.54:ää ELISA-systeemissä

Suoritettiin kaksoisvasta-ainesieppauskoe, jossa monoklonaali-nen vasta-aine IgA-aiAT-kompleksille oli hybridoman NLW.50 erit- • /: tämä keksinnön mukaisesti. Tässä kokeessa käytettiin polysty- « · · r .·./ reenilevyjä (Dynatech-Immulon 4). Koe toteutettiin muutoin » · samoin kuin esimerkissä 9, mutta testiseerumi laimennettiin • · · suhteessa 1/100. Paremman monoklonaalisen vasta-aineen käyttä- .3¾ minen ja polystyreenilevyt paransivat herkkyyttä tässä kokees-• « « sa. Käytettiin seuraavanlaista kerrosyhdistelmää: I · 4 • » 4 • · > > 1

• I I

103975 38 alusta/rotan Mk anti-hiiri-IgG/Mk anti-IgA-ajAT/IgA-axAT-koinp-leksi/ Kn Pk anti-IgA-oiiAT/leiinattu vuohen anti-kaniini-vasta-aine 5 Mk = monoklonaalinen vasta-aine Pk = polyklonaalinen vasta-aine Kn = kaniini

Tulokset näkyvät taulukossa 8.

10 TAULUKKO 8 SEERUMI- 2D-IEP-TULOKSET ELISA-TULOKSET (OD492) 15 NÄYTE (satunnaisyksiköt) NLW.50 NLW.54 arvo sija arvo sija arvo sija 20 37 0,75 10 0,572 10 0,634 8 38 1,20 9 0,628 9 0,596 10 39 1,40 8 0,685 7 0,635 7 25 40 2,00 7 0,724 6 0,634 8 41 2,50 6 0,882 1 0,663 5 30 42 2,75 5 0,851 3 0,813 2 43 3,30 3 0,651 8 0,637 6 • · · * « ΐ ’ 44 3,60 2 0,868 2 0,897 1 » « ' .‘.35 45 4,40 1 0,756 5 0,679 4 • g « ’ • · 46 3,00 4 0,781 4 0,712 3 40 47 0,60 11 0,386 11 0,374 11 » · » » t • · · t * - — ------ — ---______- —....

Ml I % f • · * « · · • « 103975 39

Kun tulokset piirrettiin ELISA-tuloksina NLW.54:stä ja NLW.50:stä vs 2D-IEP-tulokset, korrelaatiokertoimet olivat 0,56 ja 0,72. Se vahvistaa, että NLW.50 on hieman herkempi kuin NLW.54, jonka takia sitä pidetään suositeltavampana.

5

Esimerkki 11

Yhden tai kahden detektiovasta-aineen vaikutus kaksoisvasta-ainesieppaus-ELISA-kokeessa 10 Kaksoisvasta-ainesieppaus-ELISA-koe suoritettiin muutoin kuten edellä kuvattiin esimerkissä 9, mutta käytettiin polystyreeni-levyjä (Dynatech-Immulon 4) ja seerumilaimmennosta 1/100. Tutkittiin yhden tai kahden detektiovasta-aineen käytön vaikutusta ELISA-määritysmenetelmässä. Käytettiin seuraavia kerrosyhdis-15 telmiä: 1) alusta/rotan Mk anti-hiiri-IgG/hiiren Mk anti-lgA-a1AT/IgA-öiAT-kompleksi/Lm Pk anti-IgA/aasin anti-lammas-leiroattu vasta-aine 20 2) alusta/rotan Mk anti-hiiri-IgG/hiiren Mk anti-IgA-a^AT/IgA-aiAT-kompleksi/Lm Pk anti-IgA-leimattu

Mk = monoklonaalinen vasta-aine * [ ; 25 Pk = polyklonaalinen vasta-aine 4 1 i t# 1 Lm = lcunnicis V 1 1 • · I I Monoklonaalinen anti-lgA-a,AT-vasta-aine oli hybridoman NLW.50 f » « " · erittämä keksinnön mukaisesti.

• a * « • 4 9 V · * # 1 V ' 30 Tulokset on koottu taulukkoon 9.

f a * « · V · · « · 919 VI» • · • i 1 1 / T | f • · f • I » · TAULUKKO 9 40 103975

IgA-αχΑΤ IgA- αχΑΤ

5 SEERUMI KOMPLEKSIPITOISUUS SEERUMI KOMPLEKSIPITOISUUS

(satunnaisyksiköt) (satunnaisyksiköt)

Sitout. Sitout. Sitout. Sitout.

yhdist.l yhdist.2 yhdist.l yhdist.2 ; ίο_________ 2 3,0 5,0 30 0,32 0.38 15 3 0,3 0,39 31 0,58 1,05 4 0,43 0,39 32 0,27 0,47 20 5 0,8 1,9 33 0,36 0,84 6 0,4 0,52 34 0,33 0,39 10 0,5 0,8 36 0,54 1,05 25 12 0,55 1,1 37 <0,2 0,29 14 0,36 0,66 38 0,3 0,40 30 15 0,52 0,67 40 0,45 0,57 16 0,41 0,8 41 0,34 0,61 17 0,72 42 0,32 0,45 Vö5 ; 18 0,35 0,53 44 0,325 0,34 V I l • · :v. 19 0,41 0,67 45 0,53 0,69 • · j.s’jiO 20 0,6 1,45 47 0,35 0,41 4 · 22 0,49 1,1 48 0,275 0,35 • · 1 • » · 23 0,45 0,63 49 0,44 0,74 45 : 24 <0,2 <0,2 50 <0,2 0,3 I · · # f •T: 25 0,39 0,48 51 0,52 0,85 ...φο 26 0,75 1,7 52 0,46 0,69 ΙΜΊ « « « » « » · * 1 41 103975 Tämän kokeen tulokset osoittavat, ettei herkkyys vähentynyt käytettäessä yhtä detektiovasta-ainetta kahden asemesta, kuten tavallisesti ELISA-kokeissa. Tästä on se etu, että kokeen toteuttamiseen käytettävä aika saadaan vähenemään yhteen tuntiin, 5 ja myös tällaisen kokeen toteutuskustannukset vähenevät.

Kun tulokssia vertailtiin piirtämällä kerrosyhdistelmästä 1 saatuja tuloksia kerrosyhdistelmän 2 tuloksiin, korrelaatioker-roin oli 0,88, ja keskipoikkeama <0,001 eli täysin merkitykse-10 tön. Seeruminäytettä 2 edustava piste on jätetty pois tästä statistisesta analyysistä (jos se otetaan mukaan, korrelaa-tiokerroin on 0,97).

Esimerkki 12 15 Kerros-ELISA-määrityskokeen vertailu yhtä detektiovasta-ainetta käyttäen vain 2D-IEP-mittauksina

Toteutettiin kaksoisvasta-ainesieppaus-ELISA-koe esimerkin 9 tapaan. Käytettiin polystyreenilevyjä (Dynatech-Immulon 4) ja 20 testiseerumi laimennettiin 1/100. Monoklonaalinen sieppausvas-ta-aine oli hybridoman NLW.50 erittämä keksinnön mukaisesti. Käytettiin seuraavanlaista kerrosyhdistelmää: alusta/rotan Mk anti-hiiri-IgG/Mk anti-IgA-c^AT/IgA-a^AT-komp- . 25 leksi/Lm Pk anti-IgA/leimattu aasin anti-lammas-IgA-vasta-aine • · · • 1 •« · • » · • ·1 Mk = monoklonaalinen vasta-aine • · • i « !<: : Pk = polyklonaalinen vasta-aine • · ·.1·; Lm = lammas • · · V : 3 0

IgA-a^AT-kompleksin 2D-IEP-mittaukset suoritettiin esimerkin 6 :1·.· tapaan. Tulokset on koottu taulukkoon 10.

• ·

* · · I

• i « · :35 » · • « < · • · · « 1 • « TAULUKKO 10 42 103975 SEERUMI 2D-IEP (cm2) ELISA (satunnaisyksiköt) 5 arvo sija arvo sija 38 1,5 9 0,77 8 10 6 1,3 11 0,87 7 8 3,0 3 2,3 3 15 54 3,2 2 1,28 4 43 1,3 11 0,54 12 29 1,1 13 0,56 11 20 32 2,3 4 2,35 2 45 1,4 10 0,96 5 25 65 1,8 7 0,94 6 24 1,7 8 0,58 9 7 0,6 15 0,47 13 30 44 3,3 1 2,5 1 58 2,3 4 0,57 10 i 35 50 2,2 6 0,4 15 • · « '· ” 1 0,9 14 0,44 14 • · · • * • · • « · : 4 o • « · • · · • ·

Kun näytteet piirrettiin graafisesti 2D-IEP:tä ja ELISA:aa verraten korrelaatiokerroin oli 0,73 eli huomattava.

« • · m • · 9 • · · · • * t » · · • · 103975 43

AVOIN SEKVENSSILISTA

(1) YLEISTIEDOT: (i) HAKIJA:

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS

5 (lii) SEKVENSSIEN NUMEROT

(iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE

(A) VASTAANOTTAJA: (B) KATUOSOITE: (C) KAUPUNKI: 10 (D) OSAVALTIO:

(E) VALTIO: USA

(F) POSTINUMERO: (v) TIETOKONEELLA LUETTAVA MUOTO: (A) TIEDONVÄLITYSTÄPÄ: 15 (B) TIETOKONE: (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: (D) OHJELMISTOT: (vi) NYKYISET HAKEMUSTIEDOT: (vii) AIEMMAT HAKEMUSTIEDOT: 20 (A) HAKEMUSNUMERO: (B) JÄTTÖPÄIVÄ: (viii) ASIAMIES/TOIMISTOTIEDOT: (A) NIMI: (B) REKISTERITUNNUS: • · « 1 < ] 25 (C) REFERENSSI/ASIAREKISTERITUNNUS: f · « ’· ” (ix) TELEKOMMUNIKAATIOTIEDOT: · · : V (A) PUHELINNUMERO: « · I (b) telefax-numero V·! (2) TIEDOT SEKVENSSISTÄ N:0 1 (SEQ ID NO:l) :T: 3o (i) sekvenssin ominaispiirteet: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (Β) TYYPPI: polypeptidi (C) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: ' 1 35 (v) FRAGMENTTITYYPPI: C-terminaalifragmentti (ix) ERIKOISPIIRTEET: · • · i « 103975 44 (D) MUUT TIEDOT: Jäämät 487-496 ihmisen IgA-ketjusta (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEQ ID NO: 1: Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr 487 490 495 5 (3) TIEDOT SEKVENSSISTÄ N:O 2 (SEQ ID NO:2) (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 13 aminohappoa (B) TYYPPI: polypeptidi (C) TOPOLOGIA: lineaarinen 10 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: (v) FRAGMENTTITYYPPI: C-terminaalifragmentti (ix) ERIKOISPIIRTEET: (D) MUUT TIEDOT: Jäämät 484-496 ihmisen IgAa-ketjusta (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEQ ID NO: 2: 15 Val-Ser-Val-Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr 484 485 490 495 (4) TIEDOT SEKVENSSISTÄ N:0 3 (SEQ ID NO:3) (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 4 aminohappoa 20 (B) TYYPPI: polypeptidi (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: (v) FRAGMENTTITYYPPI: internaalinen (ix) ERIKOISPIIRTEET: 25 (D) MUUT TIEDOT: Jäämät 231-234 ihmisen α^-ΑΤ-ketjusta V·· (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEQ ID NO: 3: ίHis-Cys-Lys-Lys ; 231 234 • · « « (4) TIEDOT SEKVENSSISTÄ N:0 4 (SEQ ID NO: 4) ,·;·30 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • « · (A) PITUUS: 13 aminohappoa , (B) TYYPPI: polypeptidi (C) TOPOLOGIA: lineaarinen · « * (il) MOLEKYYLITYYPPI: ':'35 (v) FRAGMENTTITYYPPI: inernaalinen ·:··: (ix) ERIKOISPIIRTEET:

• I I

— m » · * • · » • · 103975 45 (D) MUUT TIEDOT: Jäämät 225-237 ihmisen c^-AT-ketjusta (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEQ ID NO: 4: Gly-Met-Phe-Asn-Ile-Gln-His-Cys-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser 225 230 235 < «.IM I ( • I I > » • «4 « · »v · • · 4 f « • 4

• I

« « »

4 · I

• * * · • · f 4 4

* M

» · • « · 4 « ♦ 4 4 « »

* V

* · · • · f • « »44

* « · f I I

• · • · · * I 1 « ·

Claims (24)

103975

1. Ligandi, jossa on ihmisen IgA:n ja oti-antitrypsiinin kompleksin antigeeniselle determinantille spesifinen vasta-ainedo-meeni, joka ei olennaisesti reagoi ihmisen vapaan IgA:n ja ih- 5 misen vapaan o^-antitrypsiinin kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ligandi, tunnettu siitä, että domeeni on spesifinen luonnossa esiintyvälle IgA:n ja αχ-anti-trypsiinin kompleksille (IgA-ciiAT) . 10

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ligandi, tunnettu siitä, että domeeni on spesifinen synteettiselle peptidifragmentille, joka muodostuu ensimmäisestä peptidifragmentista, jonka aminohapposekvenssi on ihmisen IgA:n Fc-alueelta löytyvän aminohapposekvenssin 15 kaltainen tai sen immunogeeninen analogi, ja ensimmäiseen kova-lenttisesti sitoutuneesta toisesta peptidifragmentista, jonka aminohapposekvenssi on ihmisen ajATrstä löytyvän aminohapposekvenssin kaltainen tai sen immunogeeninen analogi.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen ligandi monoklonaa-lisen vasta-aineen muodossa. f

5. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3 tai 4 mukainen ligandi vasta- aineen Fab'-fragmentin muodossa. 25 :: 6. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3 tai 4 mukainen ligandi vasta- •.: aineen F(ab')2 - fragmentin muodossa. 7. immunogeeninen peptidi, jossa on ensimmäinen peptidifrag-30 mentti, jonka aminohapposekvenssi oli ihmisen IgA:n Fc-alueelta « löytyvän aminohapposekvenssin kaltainen tai sen immunogeeninen analogi, ja toinen peptidifragmentti, jonka aminohapposekvenssi " on ihmisen axAT:stä löytyvän aminohapposekvenssin kaltainen tai sen immunogeeninen analogi, sekä ensimmäisessä että toisessa pep-35 tidifragmentissa on kysteiinijäämä ja ne ovat toisiinsa kovalent-tisesti sitoutuneita näiden kysteiinijäämien kautta, tunnettu siitä, että tätä peptidiä vastaan suunnattu vasta-aine ei olen- 103975 naisesti reagoi ihmisen vapaan IgA:n kanssa, ei olennaisesti reagoi ihmisen vapaan cti-antitrypsiinin kanssa ja sitoutuu luonnossa esiintyvään ihmisen IgA:n ja αχ-AT:n kompleksiin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen immunogeeninen peptidi, tun nettu siitä, että ensimmäiseen peptidifragmenttiin kuuluu aminohapposekvenssi, jossa on ihmisen IgA:n Fc-alueen toiseksi viimeinen kysteiinijäämä tai sen immunogeeninen analogi, suhteessa ihmisen IgA:n C-päähän. 10

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen immunogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että ensimmäisessä peptidifragmentissa on sekvenssi Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr tai sen immunogeeninen analogi. 15

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen immunogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että ensimmäisessä peptidifragmentissa on sekvenssi Val-Ser-Val-Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr tai sen immunogeeninen analogi. 20

11. Patenttivaatimuksen 7, 8, 9 tai 10 mukainen immunogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että toisessa peptidifragmentissa on sekvenssi His-Cys-Lys-Lys tai sen immunogeeninen analogi.

12. Patenttivaatimuksen 7, 8, 9 tai 10 mukainen immunogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että toisessa peptidifragmentissa on sekvenssi Gly-Met-Phe-Asn-Ile-Gln-His-Cys-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser tai ·. sen immunogeeninen analogi.

13. Patenttivaatimuksen 7 mukainen immunogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen fragmentti muodostavat peptidin, jossa on sekvenssi I « ': Vai-Ser-Vai-Vai-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr

35 Gly-Met-Phe-Asn-Ile-Gln-His-Cys-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser tai sen immunogeeninen analogi. 103975

14. Patenttivaatimuksen 3 mukainen ligandi, tunnettu siitä, että domeeni on spesifinen patenttivaatimuksissa 7, 8, 9, 10, 11, 12 tai 13 mukaiselle peptidille.

15. Vasta-aine, joka on tuotettu käyttämällä hybridoomasolulinjaa NLW.50, joka on talletettu 13.12.1990 (the European Collection of Animal Cell Cultures PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, England) tal-letusnumerolla ECACC 90121302. 10

16. Menetelmä nivelreuman (RA) määrittämiseksi analyytistä, jonka epäillään sisältävän ihmisen IgA:n ja oti-antitrypsiinin (IgA-otjAT) kompleksia RA-indikaattorina, tunnettu siitä, että siinä detektoidaan tai mitataan mainitun kompleksin ja patenttivaati- 15 muksen l, 2, 3, 4, 5, 6 tai 14 ligandin tai patenttivaatimuksen 15 vasta-aineen immunologista sitoutumista.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityskoe on kerrostyyppiä ja siinä siepataan mainittu

20 IgA-αχΑΤ saattamalla se sitoutumaan mainittuun ligandiin, ensimmäiseen eli sieppausligandiin, määritetään sitoutuminen saattamalla IgA-axAT sitoutumaan toiseen, leimattuun eli detektioligan-diin, jossa on tämän IgA-o^Al^n havaitsemiseen pystyvä vasta-'·· ainedomeeni, ja detektoidaan tai mitataan näin siepatun leiman 25 määrä kun se on sitoutunut ensimmäiseen ligandiin, ja se voi olla vasta-ainedomeeni IgArlle, a^ATtlle tai niiden kompleksille. '/, 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityskoe toteutetaan liuoksessa, sieppausligandi sidottu-30 na liukenemattomaan alustaan, ja alustaan sitoutumisen jälkeen alusta erotetaan liuoksesta ja alustalla läsnä olevan leiman määrä detektoidaan tai mitataan.

19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että detektioligandi on vasta-aine IgA:lle, a^ATille tai niiden kompleksille. 103975

20. Analyysikitti, jonka avulla voidaan toteuttaa menetelmä ihmisen nivelreuman toteamiseksi analyytistä, jonka epäillään sisältävän ihmisen IgA:n ja αχ-antitrypsiinin (IgA-αχΑΤ) kompleksia nivelreuman indikaattorina, tunnettu siitä, että analyysikitti 5 sisältää l) patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5, 6 tai 14 ligandin tai patenttivaatimuksen 15 vasta-aineen, 10 2) IgA-otjAT-kompleksin.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen analyysikokonaisuus käytettäväksi patenttivaatimuksen 17 kerrosmääritysmenetelmässä, tunnettu siitä, että se sisältää myös 15 3. toisen ligandin, jonka vasta-ainedomeeni pystyy havaitsemaan IgA-αχΑΤ-kompleksin ligandiin l) sidottuna.

22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen analyysikokonaisuus käytet-20 täväksi kompetitiivisessa tai inhibitioon perustuvassa määritysmenetelmässä, jossa analyysikokonaisuuden IgA-αχ-AT-kömpieksi-komponentti on luonnossa ilmenevän kompleksin immunogeeninen ana- ' logi, joka sitoutuu kompetitiivisesti sen kanssa. • I * *

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen analyysikokonaisuus, tunnettu siitä, että mainittu immunogeeninen analogi on minkä tahansa pa- ·.· tenttivaatimuksen 7-13 mukainen peptidi. « « « «

30 Patentkrav