JP3018111B2 - モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法Info
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- JP3018111B2 JP3018111B2 JP3113007A JP11300791A JP3018111B2 JP 3018111 B2 JP3018111 B2 JP 3018111B2 JP 3113007 A JP3113007 A JP 3113007A JP 11300791 A JP11300791 A JP 11300791A JP 3018111 B2 JP3018111 B2 JP 3018111B2
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- hybridoma
- agpr
- igg
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は肝疾患により変動する肝
実質細胞膜のレセプターの１つであるアシアログリコプ
ロテインレセプター（AGPR）を認識するモノクローナル
抗体、並びにこれを使用するヒトAGPRの測定法に関す
る。
実質細胞膜のレセプターの１つであるアシアログリコプ
ロテインレセプター（AGPR）を認識するモノクローナル
抗体、並びにこれを使用するヒトAGPRの測定法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】AGPRは、哺乳動物の肝実質細胞膜に存在
するレセプターの１つであり、脱シアル化された糖タン
パク質の異化に関与する。また、組織中、血液中のAGPR
量は種々の肝臓の疾患に応じて増減することが知られて
いる。
するレセプターの１つであり、脱シアル化された糖タン
パク質の異化に関与する。また、組織中、血液中のAGPR
量は種々の肝臓の疾患に応じて増減することが知られて
いる。
【０００３】従来、肝組織中のＡＧＰＲを測定する方法
としては、内藤らによる肝生検組織の抽出物をアイソト
ープ（１２５Ｉ等）標識アシアロオロソムコイド（リガ
ンド）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定法〔肝臓、２
８巻、９号、（１９８７）、１１７９−１１８７〕、ア
イソトープ（９９ｍＴｃ）標識合成糖タンパク（ガラク
トシルネオグリコアルブミン）を用いたｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでの測定法〔Ｓｔａｄａｌｉｎｋ．ｅｔ．ａｌ．，
Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２５：７７９−７８７、１９８
４〕が知られている。また、血液中のＡＧＰＲを測定す
る方法としては、新津らのウサギ抗ヒトＡＧＰＲ抗血清
を用いたスロットブロット法で検出したＡＧＰＲのバン
ドをデンシトメーターにて測定する方法が知られている
〔１９８９年、日本内科学会〕。
としては、内藤らによる肝生検組織の抽出物をアイソト
ープ（１２５Ｉ等）標識アシアロオロソムコイド（リガ
ンド）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定法〔肝臓、２
８巻、９号、（１９８７）、１１７９−１１８７〕、ア
イソトープ（９９ｍＴｃ）標識合成糖タンパク（ガラク
トシルネオグリコアルブミン）を用いたｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでの測定法〔Ｓｔａｄａｌｉｎｋ．ｅｔ．ａｌ．，
Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２５：７７９−７８７、１９８
４〕が知られている。また、血液中のＡＧＰＲを測定す
る方法としては、新津らのウサギ抗ヒトＡＧＰＲ抗血清
を用いたスロットブロット法で検出したＡＧＰＲのバン
ドをデンシトメーターにて測定する方法が知られている
〔１９８９年、日本内科学会〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
方法は何れも、煩雑であり、定量性に欠け、アッセイ系
としては不十分なものであった。従って、本発明の目的
は免疫学的手法を用いた簡便なヒトAGPRの測定法及びこ
れに用いるモノクローナル抗体を提供することにある。
方法は何れも、煩雑であり、定量性に欠け、アッセイ系
としては不十分なものであった。従って、本発明の目的
は免疫学的手法を用いた簡便なヒトAGPRの測定法及びこ
れに用いるモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】斯かる実情において、本
発明者らは鋭意検討した結果、精製ヒトAGPRを抗原とし
て使用してヒトAGPRに対するモノクローナル抗体を得、
さらにこれを利用することによりヒト血清や組織中のヒ
トAGPRを簡便、かつ定量的に測定できることを見出し、
本発明を完成した。
発明者らは鋭意検討した結果、精製ヒトAGPRを抗原とし
て使用してヒトAGPRに対するモノクローナル抗体を得、
さらにこれを利用することによりヒト血清や組織中のヒ
トAGPRを簡便、かつ定量的に測定できることを見出し、
本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、ハイブリドーマ３０２
０９（微工研菌寄第１２２５４号）、ハイブリドーマ３
０２１８（微工研菌寄第１２２５７号）、またはハイブ
リドーマ３０２２０（微工研菌寄第１２２５８号）から
調製され、マウス、ラット及びラビットのＡＧＰＲとは
反応せず、非還元状態のヒトＡＧＰＲと高い反応性を示
すＩｇＧ1 、ＩｇＧ2a、またはＩｇＧ2bアイソタイプに
属するモノクローナル抗体を提供するものである。本発
明はまた、ハイブリドーマ３０２０２（微工研菌寄第１
２２５１号）、またはハイブリドーマ３０２０５（微工
研菌寄第１２２５２号）から調製され、マウス、ラット
及びラビットのＡＧＰＲとは反応せず、還元及び非還元
状態のヒトＡＧＰＲと高い反応性を示すＩｇＧ1 アイソ
タイプに属するモノクローナル抗体を提供するものであ
る。本発明はまた、ハイブリドーマ３０２０８（微工研
菌寄第１２２５３号）、またはハイブリドーマ３０２２
１（微工研菌寄第１２２５９号）から調製され、ヒト及
びラットのＡＧＰＲと反応し、マウス及びラビットのＡ
ＧＰＲと反応しないＩｇＧ1 またはＩｇＧ2aアイソタイ
プに属するモノクローナル抗体を提供するものである。
本発明はまた、ハイブリドーマ３０２１４（微工研菌寄
第１２２５６号）から調製され、ヒト及びラビットのＡ
ＧＰＲと反応し、マウス及びラットのＡＧＰＲと反応し
ないＩｇＧ2aアイソタイプに属するモノクローナル抗体
を提供するものである。本発明はまた、ハイブリドーマ
３０２０１（微工研菌寄第１２２５０号）、またはハイ
ブリドーマ３０２１１（微工研菌寄第１２２５５号）か
ら調製され、ヒト、ラット、マウス及びラビットのＡＧ
ＰＲと反応するＩｇＧ1 アイソタイプに属するモノクロ
ーナル抗体を提供するものである。本発明はまた、当該
モノクローナル抗体より選ばれる１種または２種以上を
被験体と接触させて免疫測定を行うことを特徴とするＡ
ＧＰＲの測定法を提供するものである。
０９（微工研菌寄第１２２５４号）、ハイブリドーマ３
０２１８（微工研菌寄第１２２５７号）、またはハイブ
リドーマ３０２２０（微工研菌寄第１２２５８号）から
調製され、マウス、ラット及びラビットのＡＧＰＲとは
反応せず、非還元状態のヒトＡＧＰＲと高い反応性を示
すＩｇＧ1 、ＩｇＧ2a、またはＩｇＧ2bアイソタイプに
属するモノクローナル抗体を提供するものである。本発
明はまた、ハイブリドーマ３０２０２（微工研菌寄第１
２２５１号）、またはハイブリドーマ３０２０５（微工
研菌寄第１２２５２号）から調製され、マウス、ラット
及びラビットのＡＧＰＲとは反応せず、還元及び非還元
状態のヒトＡＧＰＲと高い反応性を示すＩｇＧ1 アイソ
タイプに属するモノクローナル抗体を提供するものであ
る。本発明はまた、ハイブリドーマ３０２０８（微工研
菌寄第１２２５３号）、またはハイブリドーマ３０２２
１（微工研菌寄第１２２５９号）から調製され、ヒト及
びラットのＡＧＰＲと反応し、マウス及びラビットのＡ
ＧＰＲと反応しないＩｇＧ1 またはＩｇＧ2aアイソタイ
プに属するモノクローナル抗体を提供するものである。
本発明はまた、ハイブリドーマ３０２１４（微工研菌寄
第１２２５６号）から調製され、ヒト及びラビットのＡ
ＧＰＲと反応し、マウス及びラットのＡＧＰＲと反応し
ないＩｇＧ2aアイソタイプに属するモノクローナル抗体
を提供するものである。本発明はまた、ハイブリドーマ
３０２０１（微工研菌寄第１２２５０号）、またはハイ
ブリドーマ３０２１１（微工研菌寄第１２２５５号）か
ら調製され、ヒト、ラット、マウス及びラビットのＡＧ
ＰＲと反応するＩｇＧ1 アイソタイプに属するモノクロ
ーナル抗体を提供するものである。本発明はまた、当該
モノクローナル抗体より選ばれる１種または２種以上を
被験体と接触させて免疫測定を行うことを特徴とするＡ
ＧＰＲの測定法を提供するものである。
【０００７】本発明のヒトAGPRを認識するモノクローナ
ル抗体は、例えば次のようにして製造される。
ル抗体は、例えば次のようにして製造される。
【０００８】先ず免疫原としてのAGPRは、公知の方法、
例えば、Baenzinger[Jacques U. Baenzinger, Yvonne M
aynard, (1980), Journal of Bio. Chem. USA 255, 460
7-4613] の方法に従って、ヒト剖検肝より調製すること
ができる。詳しくは、ヒト剖検肝より調製したアセトン
パウダーから界面活性剤を含む緩衝液でAGPRを抽出し、
抽出溶液にCaCl2 を加え、Ｄ−ガラクトース−アガロー
スゲル(D-Galactose-Agarose Gel) を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより、精製AGPRを調製するこ
とができる。
例えば、Baenzinger[Jacques U. Baenzinger, Yvonne M
aynard, (1980), Journal of Bio. Chem. USA 255, 460
7-4613] の方法に従って、ヒト剖検肝より調製すること
ができる。詳しくは、ヒト剖検肝より調製したアセトン
パウダーから界面活性剤を含む緩衝液でAGPRを抽出し、
抽出溶液にCaCl2 を加え、Ｄ−ガラクトース−アガロー
スゲル(D-Galactose-Agarose Gel) を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより、精製AGPRを調製するこ
とができる。
【０００９】この精製ヒトAGPRを免疫原として使用し、
既知の細胞融合手段によって本発明の抗ヒトAGPRモノク
ローナル抗体を調製することができる。すなわち、精製
ヒトAGPRをマウスに免疫し、一定期間後、マウスの脾臓
を抽出する。抽出した脾臓細胞は、ポリエチレングリコ
ールの存在下、ミエローマ細胞と融合せしめた後、一定
期間融合細胞を培養し、培養上清に産生された抗体のAG
PRに対する反応性から、特異性の高い抗ヒトAGPRモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることがで
きる。
既知の細胞融合手段によって本発明の抗ヒトAGPRモノク
ローナル抗体を調製することができる。すなわち、精製
ヒトAGPRをマウスに免疫し、一定期間後、マウスの脾臓
を抽出する。抽出した脾臓細胞は、ポリエチレングリコ
ールの存在下、ミエローマ細胞と融合せしめた後、一定
期間融合細胞を培養し、培養上清に産生された抗体のAG
PRに対する反応性から、特異性の高い抗ヒトAGPRモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることがで
きる。
【００１０】本発明のモノクローナル抗体の調製は、単
クローン化した上記のハイブリドーマをマウス腹腔内で
培養するか、または適当な培地中で培養することにより
実施される。たとえばマウス腹腔内で培養する場合であ
れば、あらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テ
トラメチルペンタデカン）を腹腔内に注射した後、所望
のハイブリドーマを腹腔内に投与し適当な期間飼育す
る。ハイブリドーマの投与によりマウスの体内にハイブ
リドーマによる腫瘍が形成され、それに伴い腹水中に高
濃度に本発明モノクローナル抗体が産生されてくるの
で、この腹水を採取すれば本発明モノクローナル抗体を
得ることができる。
クローン化した上記のハイブリドーマをマウス腹腔内で
培養するか、または適当な培地中で培養することにより
実施される。たとえばマウス腹腔内で培養する場合であ
れば、あらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テ
トラメチルペンタデカン）を腹腔内に注射した後、所望
のハイブリドーマを腹腔内に投与し適当な期間飼育す
る。ハイブリドーマの投与によりマウスの体内にハイブ
リドーマによる腫瘍が形成され、それに伴い腹水中に高
濃度に本発明モノクローナル抗体が産生されてくるの
で、この腹水を採取すれば本発明モノクローナル抗体を
得ることができる。
【００１１】採取した腹水や培養液中の本発明モノクロ
ーナル抗体は、そのままでも使用可能であるが、例えば
硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテ
インＡ結合担体等により高度に精製して用いることがよ
り好ましい。
ーナル抗体は、そのままでも使用可能であるが、例えば
硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテ
インＡ結合担体等により高度に精製して用いることがよ
り好ましい。
【００１２】こうして得たモノクローナル抗体は、例え
ばウエスタンブロッティング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，４３５０〜４３
５４，１９７９）により特異性が確認できる。
ばウエスタンブロッティング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，４３５０〜４３
５４，１９７９）により特異性が確認できる。
【００１３】本発明モノクローナル抗体の１種または２
種以上を用いて通常の免疫学的測定法を実施すれば、血
清や組織中のヒトAGPRが迅速、簡便かつ正確に定量され
る。
種以上を用いて通常の免疫学的測定法を実施すれば、血
清や組織中のヒトAGPRが迅速、簡便かつ正確に定量され
る。
【００１４】次に、このモノクローナル抗体を使用し
て、被検体、例えば血清中のヒトAGPRを測定する方法に
ついて説明する。
て、被検体、例えば血清中のヒトAGPRを測定する方法に
ついて説明する。
【００１５】その方法として免疫測定法、すなわちオク
タロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫
測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイムノアッセ
イ、フロロイムノアッセイなどの方法が利用できる。例
えば、サンドイッチ酵素免疫測定法を用いる場合には、
ヒトAGPRを認識する２種類のモノクローナル抗体の何れ
か一方を不溶性担体に固定して不溶化抗体となし、他方
を酵素で標識し、これらを被検体と接触させてサンドイ
ッチ酵素免疫測定を行ってヒトAGPRを測定することがで
きる。
タロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫
測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイムノアッセ
イ、フロロイムノアッセイなどの方法が利用できる。例
えば、サンドイッチ酵素免疫測定法を用いる場合には、
ヒトAGPRを認識する２種類のモノクローナル抗体の何れ
か一方を不溶性担体に固定して不溶化抗体となし、他方
を酵素で標識し、これらを被検体と接触させてサンドイ
ッチ酵素免疫測定を行ってヒトAGPRを測定することがで
きる。
【００１６】本発明に使用する不溶性担体としては、ポ
リエチレン、ポリプロピレンなどの各種合成ポリマー、
ガラス、シリコン、不溶性多糖などが挙げられ、これら
の担体は、球状、棒状、微粒子状等の形状で、あるいは
試験管、マイクロタイタープレートなどとして用いるこ
とができる。不溶化抗体の調製は、抗体を物理的吸着ま
たは共有結合によって不溶性担体に結合させることによ
って行われる。酵素標識抗体は公知の方法によって調製
することができるが、必要に応じて、使用する抗体を適
当なプロテアーゼにより限定分解した後、また還元剤の
存在下でF(ab')2 またはFab'とした後、酵素で標識する
こともできる。抗体の標識に使用する酵素としてはβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性
フォスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げ
られる。
リエチレン、ポリプロピレンなどの各種合成ポリマー、
ガラス、シリコン、不溶性多糖などが挙げられ、これら
の担体は、球状、棒状、微粒子状等の形状で、あるいは
試験管、マイクロタイタープレートなどとして用いるこ
とができる。不溶化抗体の調製は、抗体を物理的吸着ま
たは共有結合によって不溶性担体に結合させることによ
って行われる。酵素標識抗体は公知の方法によって調製
することができるが、必要に応じて、使用する抗体を適
当なプロテアーゼにより限定分解した後、また還元剤の
存在下でF(ab')2 またはFab'とした後、酵素で標識する
こともできる。抗体の標識に使用する酵素としてはβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性
フォスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げ
られる。
【００１７】免疫反応は、先ず第一反応で、不溶化抗体
に被検体を接触させ、抗原を結合させて不溶化抗体−抗
原複合体とし、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合
させて不溶化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とするこ
とによって行われる。そして得られた複合体の酵素活性
を測定することによって、被検体中の抗原（ヒトAGPR）
の量を測定することができる。
に被検体を接触させ、抗原を結合させて不溶化抗体−抗
原複合体とし、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合
させて不溶化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とするこ
とによって行われる。そして得られた複合体の酵素活性
を測定することによって、被検体中の抗原（ヒトAGPR）
の量を測定することができる。
【００１８】
【発明の効果】本発明によればヒトAGPRに対するモノク
ローナル抗体を利用することにより、ヒト血清中、組織
または組織抽出物中のヒトAGPRを簡便かつ正確に定量す
ることができ、本発明測定法は肝疾患の診断法として有
用である。
ローナル抗体を利用することにより、ヒト血清中、組織
または組織抽出物中のヒトAGPRを簡便かつ正確に定量す
ることができ、本発明測定法は肝疾患の診断法として有
用である。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２０】実施例１ 精製ヒトAGPRの調製：ヒト剖検肝より精製したアセトン
パウダー20ｇを0.2M NaCl を含む20mMトリス塩酸緩衝液
（洗浄用緩衝液、pH7.8 ）で２回の洗浄後、0.4M KCl、
１％Triton X-100を含む20mM トリス塩酸緩衝液( 抽出
用緩衝液、pH7.8 )で３回AGPRの抽出を行った。さらにA
GPRを精製するため、抽出液に終濃度が25mMになるよう
にCaCl2 を添加し、25mM CaCl2を含む抽出用緩衝液にて
緩衝化したＤ−ガラクトース−アガロースゲル(D-Galac
tose-Agarose Gel) と４℃にて一夜反応させた。カラム
に樹脂をつめ、CaCl2 を含み、Triton X-100を含まない
抽出用緩衝液にてカラムを洗浄した後、溶出用緩衝液(2
0mM 酢酸アンモニウム、1.25M NaCl、pH5.1)にて溶出を
行うことによって精製AGPRを調製した。
パウダー20ｇを0.2M NaCl を含む20mMトリス塩酸緩衝液
（洗浄用緩衝液、pH7.8 ）で２回の洗浄後、0.4M KCl、
１％Triton X-100を含む20mM トリス塩酸緩衝液( 抽出
用緩衝液、pH7.8 )で３回AGPRの抽出を行った。さらにA
GPRを精製するため、抽出液に終濃度が25mMになるよう
にCaCl2 を添加し、25mM CaCl2を含む抽出用緩衝液にて
緩衝化したＤ−ガラクトース−アガロースゲル(D-Galac
tose-Agarose Gel) と４℃にて一夜反応させた。カラム
に樹脂をつめ、CaCl2 を含み、Triton X-100を含まない
抽出用緩衝液にてカラムを洗浄した後、溶出用緩衝液(2
0mM 酢酸アンモニウム、1.25M NaCl、pH5.1)にて溶出を
行うことによって精製AGPRを調製した。
【００２１】実施例２ ヒトAGPRを認識するモノクローナル抗体の調製：ヒトAG
PR20μg を100μlの完全フロイントアジュバンドとよく
混合後、BALB／ｃマウスの腹腔内に２週間間隔で４回注
射した。最終追加免疫から１ケ月後に、ヒトAGPR20μg
を100μlの生理食塩水に混ぜ、腹腔内に注射し、３日後
脾臓を摘出し、よくほぐした後、培地(RPMI 1640) でよ
く洗浄する。この洗浄した脾細胞４×108 個と、同様に
培地でよく洗浄したマウスSP2／0・Agl4系のミエローマ
細胞４×107 個と混合し、培地に対し50(w／v)％ポリエ
チレングリコール(PEG)1540／GKNを1.5ml徐々に滴下
し、１分間混和した。GKN培地８mlを徐々に加えてポリ
エチレングリコール(PEG)を希釈し、反応を停止した。1
500rpmで５分間遠心し、細胞を集め、50mlのHAT 培地に
細胞を懸濁し、フィーダー細胞が含まれる96穴マイクロ
培養プレートの各ウエルに0.1mlずつ分注し、５％CO2の
存在下、37℃でインキュベイトした。
PR20μg を100μlの完全フロイントアジュバンドとよく
混合後、BALB／ｃマウスの腹腔内に２週間間隔で４回注
射した。最終追加免疫から１ケ月後に、ヒトAGPR20μg
を100μlの生理食塩水に混ぜ、腹腔内に注射し、３日後
脾臓を摘出し、よくほぐした後、培地(RPMI 1640) でよ
く洗浄する。この洗浄した脾細胞４×108 個と、同様に
培地でよく洗浄したマウスSP2／0・Agl4系のミエローマ
細胞４×107 個と混合し、培地に対し50(w／v)％ポリエ
チレングリコール(PEG)1540／GKNを1.5ml徐々に滴下
し、１分間混和した。GKN培地８mlを徐々に加えてポリ
エチレングリコール(PEG)を希釈し、反応を停止した。1
500rpmで５分間遠心し、細胞を集め、50mlのHAT 培地に
細胞を懸濁し、フィーダー細胞が含まれる96穴マイクロ
培養プレートの各ウエルに0.1mlずつ分注し、５％CO2の
存在下、37℃でインキュベイトした。
【００２２】10日間インキュベイトした後、培養上清に
ついて抗体価を調べ、抗体活性の強いウエルの細胞を限
界希釈法によりクローニングを行い、最終的に計24株の
ハイブリドーマが単離された。得られた24株のハイブリ
ドーマは、それぞれ30201 、30202 、30203 、30204 、
30205 、30206 、30207、30208 、30209 、30210 、302
11 、30212 、30213 、30214 、30215 、30216 、30217
、30218 、30219 、30220 、30221 、30222 、30223
及び30225 と命名し、そのうち10株について工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した。当該株名と受託番号
を表１に示す。
ついて抗体価を調べ、抗体活性の強いウエルの細胞を限
界希釈法によりクローニングを行い、最終的に計24株の
ハイブリドーマが単離された。得られた24株のハイブリ
ドーマは、それぞれ30201 、30202 、30203 、30204 、
30205 、30206 、30207、30208 、30209 、30210 、302
11 、30212 、30213 、30214 、30215 、30216 、30217
、30218 、30219 、30220 、30221 、30222 、30223
及び30225 と命名し、そのうち10株について工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した。当該株名と受託番号
を表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】これらのハイブリドーマをプリスタンで処
理したBALB／ｃマウスの腹腔内に注入し、10〜20日後に
その腹水を採取してモノクローナル抗体を得た。得られ
た抗体について、そのクラス及びサブクラスを決定し、
表２に示した。
理したBALB／ｃマウスの腹腔内に注入し、10〜20日後に
その腹水を採取してモノクローナル抗体を得た。得られ
た抗体について、そのクラス及びサブクラスを決定し、
表２に示した。
【００２５】
【表２】
【００２６】実施例３ ヒトAGPRを認識するモノクローナル抗体の反応性：ヒト
精製AGPR、マウス（BALB／ｃ、雄：４週齢）、ラット
（SD、雄：10週齢）及びラビット肝臓アセトンパウダー
抽出物をSDS 添加ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
し、さらにポリビニリデンジフルオライド膜に電気的に
ブロッティングした。この膜を10％スキムミルクを含む
リン酸緩衝液(pH7.2) にて、４℃で一夜静置してブロッ
キングを行った。0.05％Tween 20を含むリン酸緩衝液(p
H7.2)にて膜を洗浄後、一次抗体(抗AGPR McAb)と室温で
１時間、二次抗体としての200倍希釈ビオチン化抗マウ
スIgGウマ抗体と室温で１時間、アビジンDH−ビオチン
化ペルオキシダーゼと室温で30分間それぞれ反応させ
た。膜をよく洗浄後、過酸化水素と３，３′−ジアミノ
ベンジジン塩酸塩を基質として酵素反応を行った。
精製AGPR、マウス（BALB／ｃ、雄：４週齢）、ラット
（SD、雄：10週齢）及びラビット肝臓アセトンパウダー
抽出物をSDS 添加ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
し、さらにポリビニリデンジフルオライド膜に電気的に
ブロッティングした。この膜を10％スキムミルクを含む
リン酸緩衝液(pH7.2) にて、４℃で一夜静置してブロッ
キングを行った。0.05％Tween 20を含むリン酸緩衝液(p
H7.2)にて膜を洗浄後、一次抗体(抗AGPR McAb)と室温で
１時間、二次抗体としての200倍希釈ビオチン化抗マウ
スIgGウマ抗体と室温で１時間、アビジンDH−ビオチン
化ペルオキシダーゼと室温で30分間それぞれ反応させ
た。膜をよく洗浄後、過酸化水素と３，３′−ジアミノ
ベンジジン塩酸塩を基質として酵素反応を行った。
【００２７】その結果は表３に示すとおりであり、得ら
れたモノクローナル抗体がヒト肝臓AGPRと反応する事を
確認した。またこれら交差反応による反応性の違い（Ag
決定基認識の異同）から表３に示すようにＡ〜Ｅの５グ
ループに分類した。
れたモノクローナル抗体がヒト肝臓AGPRと反応する事を
確認した。またこれら交差反応による反応性の違い（Ag
決定基認識の異同）から表３に示すようにＡ〜Ｅの５グ
ループに分類した。
【００２８】
【表３】
【００２９】実施例４ ２ステップサンドイッチ酵素免疫測定法によるヒトAGPR
の測定：まず、抗体30220またはマウスIgGを10 mODとな
るようにリン酸緩衝液（pH7.2）−生理食塩水（以下PB
S）にて精製後、マイクロプレートに 200μl／ウエルず
つ分注し、４℃にて一夜静置して固定化した。次いで１
％牛血清アルブミン(BSA) 及び0.05％ Tween 20を加え
たPBS（以下BSA-PBS ）でよく洗浄後、精製AGPRをBSA-P
BSでそれぞれ５ng／ml〜0.05ng／mlまで４段階希釈した
ものを各々200μl／ウエルずつ加え、37℃で１時間反応
させた。よく洗浄後、ペルオキシダーゼ(HRP)標識30201
モノクローナル抗体を200μl／ウエル加え、さらに37℃
で１時間反応させた。よく洗浄後、過酸化水素とオルト
フェニレンジアミンを基質として酵素反応を行い、酵素
活性を測定した。活性は492nm／630nmの吸光度で表し
た。その結果を図１に示す。図１より30220と30201-HRP
（標識体）とのサンドイッチ法によれば、濃度依存的に
吸光度が上昇し、AGPRが定量できることがわかる。
の測定：まず、抗体30220またはマウスIgGを10 mODとな
るようにリン酸緩衝液（pH7.2）−生理食塩水（以下PB
S）にて精製後、マイクロプレートに 200μl／ウエルず
つ分注し、４℃にて一夜静置して固定化した。次いで１
％牛血清アルブミン(BSA) 及び0.05％ Tween 20を加え
たPBS（以下BSA-PBS ）でよく洗浄後、精製AGPRをBSA-P
BSでそれぞれ５ng／ml〜0.05ng／mlまで４段階希釈した
ものを各々200μl／ウエルずつ加え、37℃で１時間反応
させた。よく洗浄後、ペルオキシダーゼ(HRP)標識30201
モノクローナル抗体を200μl／ウエル加え、さらに37℃
で１時間反応させた。よく洗浄後、過酸化水素とオルト
フェニレンジアミンを基質として酵素反応を行い、酵素
活性を測定した。活性は492nm／630nmの吸光度で表し
た。その結果を図１に示す。図１より30220と30201-HRP
（標識体）とのサンドイッチ法によれば、濃度依存的に
吸光度が上昇し、AGPRが定量できることがわかる。
【００３０】実施例５ ２ステップサンドイッチ酵素免疫測定法によるヒト血清
AGPRの測定：抗体No.30208、30218 、30220 またはマウ
スIgGを10 mODとなるようにPBSにて調製後、マイクロプ
レートに 200μl／ウエルずつ分注し、４℃で一夜静置
して固定化した。次いで、BSA-PBSでよく洗浄後、ヒト
血清を 200μl／ウエル〜20μl／ウエルまで４段階希釈
したものを加え、37℃で１時間反応させた。よく洗浄し
た後、ペルオキシダーゼ(HRP)標識30220または30211 モ
ノクローナル抗体を200μl／ウエル加え、さらに37℃で
１時間反応させた。よく洗浄後、過酸化水素とオルトフ
ェニレンジアミンを基質として酵素反応を行い、酵素活
性を測定した。なお、活性は492nm／630nmにて吸光度と
して表した。その結果を図２〜図４に示す。図２〜図４
より、本発明モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ
法によれば、血清量に依存して吸光度が上昇し、ヒト血
清AGPRの定量ができることがわかる。
AGPRの測定：抗体No.30208、30218 、30220 またはマウ
スIgGを10 mODとなるようにPBSにて調製後、マイクロプ
レートに 200μl／ウエルずつ分注し、４℃で一夜静置
して固定化した。次いで、BSA-PBSでよく洗浄後、ヒト
血清を 200μl／ウエル〜20μl／ウエルまで４段階希釈
したものを加え、37℃で１時間反応させた。よく洗浄し
た後、ペルオキシダーゼ(HRP)標識30220または30211 モ
ノクローナル抗体を200μl／ウエル加え、さらに37℃で
１時間反応させた。よく洗浄後、過酸化水素とオルトフ
ェニレンジアミンを基質として酵素反応を行い、酵素活
性を測定した。なお、活性は492nm／630nmにて吸光度と
して表した。その結果を図２〜図４に示す。図２〜図４
より、本発明モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ
法によれば、血清量に依存して吸光度が上昇し、ヒト血
清AGPRの定量ができることがわかる。
【図１】２ステップサンドイッチ酵素免疫測定法におけ
るヒトAGPR濃度と吸光度との関係を示す図である。
るヒトAGPR濃度と吸光度との関係を示す図である。
【図２】30220-HRP を用いた２ステップサンドイッチ酵
素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度との関係を
示す図である。
素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度との関係を
示す図である。
【図３】30211-HRP を用いた２ステップサンドイッチ酵
素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度との関係を
示す図である。
素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度との関係を
示す図である。
【図４】30211-HRP を用いた２ステップサンドイッチ酵
素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度との関係を
示す図である。
素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度との関係を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２２５９ (72)発明者 中谷 玲二 北海道札幌市中央区南４条西13丁目１− 11−901 (72)発明者 中島 正博 北海道札幌市白石区菊上町１−３−36 (72)発明者 矢後 弘和 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一 化学薬品株式会社 東京技術センター内 (72)発明者 酒井 康夫 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一 化学薬品株式会社 東京技術センター内 (72)発明者 松下 博俊 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一 化学薬品株式会社 東京技術センター内 (56)参考文献 特開 平１−39554（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ．Ｃｈ ｅｍ．ＵＳＡ，ｖＯＬ．225，（1980）, Ｐ．4607−4613 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 5/00 - 5/28 C12N 15/00 - 15/90 G01N 33/53 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 ハイブリドーマ３０２０９（微工研菌寄
第１２２５４号）、ハイブリドーマ３０２１８（微工研
菌寄第１２２５７号）、またはハイブリドーマ３０２２
０（微工研菌寄第１２２５８号）から調製され、マウ
ス、ラット及びラビットのアシアログリコプロテインレ
セプターとは反応せず、非還元状態のヒトアシアログリ
コプロテインレセプターと高い反応性を示すＩｇＧ1 、
ＩｇＧ2a、またはＩｇＧ2bアイソタイプに属するモノク
ローナル抗体。 - 【請求項２】 ハイブリドーマ３０２０２（微工研菌寄
第１２２５１号）、またはハイブリドーマ３０２０５
（微工研菌寄第１２２５２号）から調製され、マウス、
ラット及びラビットのアシアログリコプロテインレセプ
ターとは反応せず、還元及び非還元状態のヒトアシアロ
グリコプロテインレセプターと高い反応性を示すＩｇＧ
1 アイソタイプに属するモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ハイブリドーマ３０２０８（微工研菌寄
第１２２５３号）、またはハイブリドーマ３０２２１
（微工研菌寄第１２２５９号）から調製され、ヒト及び
ラットのアシアログリコプロテインレセプターと反応
し、マウス及びラビットのアシアログリコプロテインレ
セプターと反応しないＩｇＧ1 またはＩｇＧ2aアイソタ
イプに属するモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ハイブリドーマ３０２１４（微工研菌寄
第１２２５６号）から調製され、ヒト及びラビットのア
シアログリコプロテインレセプターと反応し、マウス及
びラットのアシアログリコプロテインレセプターと反応
しないＩｇＧ2aアイソタイプに属するモノクローナル抗
体。 - 【請求項５】 ハイブリドーマ３０２０１（微工研菌寄
第１２２５０号）、またはハイブリドーマ３０２１１
（微工研菌寄第１２２５５号）から調製され、ヒト、ラ
ット、マウス及びラビットのアシアログリコプロテイン
レセプターと反応するＩｇＧ1 アイソタイプに属するモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項６】 請求項１から５記載のモノクローナル抗
体より選ばれる１種または２種以上を被験体と接触させ
て免疫測定を行うことを特徴とするアシアログリコプロ
テインレセプターの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3113007A JP3018111B2 (ja) | 1991-05-17 | 1991-05-17 | モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3113007A JP3018111B2 (ja) | 1991-05-17 | 1991-05-17 | モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04356198A JPH04356198A (ja) | 1992-12-09 |
| JP3018111B2 true JP3018111B2 (ja) | 2000-03-13 |
Family
ID=14601103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3113007A Expired - Lifetime JP3018111B2 (ja) | 1991-05-17 | 1991-05-17 | モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3018111B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101828741B1 (ko) * | 2016-07-21 | 2018-02-12 | 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤 | 세퍼레이터 권취 코어 및 세퍼레이터 권회체 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3345507B2 (ja) * | 1994-04-20 | 2002-11-18 | 第一化学薬品株式会社 | アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬 |
| KR100394940B1 (ko) * | 1999-11-10 | 2003-08-19 | 주식회사 코비아스 | 간 질환 진단을 위한 혈중 아사이알로당단백질양의측정방법 및 측정용 킷트 |
| KR100455762B1 (ko) * | 2001-11-29 | 2004-11-06 | 네오바이오다임 주식회사 | 아사이알로당단백질 수용체 재조합 단백질을 이용한 아사이알로당단백질의 농도 측정방법 |
| EP3356415B1 (en) * | 2015-09-29 | 2024-05-01 | Amgen Inc. | Asgr inhibitors for reduzing cholesterol levels |
-
1991
- 1991-05-17 JP JP3113007A patent/JP3018111B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＡ，ｖＯＬ．２２５，（１９８０），Ｐ．４６０７−４６１３ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101828741B1 (ko) * | 2016-07-21 | 2018-02-12 | 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤 | 세퍼레이터 권취 코어 및 세퍼레이터 권회체 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04356198A (ja) | 1992-12-09 |
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