JPH04356198A

JPH04356198A - モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法

Info

Publication number: JPH04356198A
Application number: JP3113007A
Authority: JP
Inventors: Yojiro Niitsu; 洋司郎新津; Yutaka Takago; 裕高後; Yoshihiro Mogi; 茂木　良弘; Reiji Nakatani; 中谷　玲二; Masahiro Nakajima; 正博中島; Hirokazu Yago; 弘和矢後; Yasuo Sakai; 康夫酒井; Hirotoshi Matsushita; 博俊松下
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1991-05-17
Filing date: 1991-05-17
Publication date: 1992-12-09
Anticipated expiration: 2015-03-13
Also published as: JP3018111B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は肝疾患により変動する肝
実質細胞膜のレセプターの１つであるアシアログリコプ
ロテインレセプター（ＡＧＰＲ）を認識するモノクロー
ナル抗体、並びにこれを使用するヒトＡＧＰＲの測定法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＡＧＰＲは、哺乳動物の肝実質細胞膜に
存在するレセプターの１つであり、脱シアル化された糖
タンパク質の異化に関与する。また、組織中、血液中の
ＡＧＰＲ量は種々の肝臓の疾患に応じて増減することが
知られている。

【０００３】従来、肝組織中のＡＧＰＲを測定する方法
としては、内藤らによる肝生検組織の抽出物をアイソト
ープ（１２５Ｉ等）標識アシアロオロソムコイド（リガ
ンド）を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏでの測定法〔肝臓、２
８巻、９号、（１９８７）、１１７９−１１８７　〕、
アイソトープ（９９ｍＴｃ）標識合成糖タンパク（ガラ
クトシルネオグリコアルブミン）を用いたｉｎ　ｖｉｖ
ｏ　での測定法〔Ｓｔａｄａｌｉｎｋ．　ｅｔ．　ａｌ
．，　Ｊ．　Ｎｕｃｌ．　Ｍｅｄ．　２５：７７９−７
８７、１９８４〕が知られている。また、血液中のＡＧ
ＰＲを測定する方法としては、新津らのウサギ抗ヒトＡ
ＧＰＲ抗血清を用いたスロットブロット法で検出したＡ
ＧＰＲのバンドをデンシトメーターにて測定する方法が
知られている〔１９８８年、日本内科学会〕。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
方法は何れも、煩雑であり、定量性に欠け、アッセイ系
としては不十分なものであった。従って、本発明の目的
は免疫学的手法を用いた簡便なヒトＡＧＰＲの測定法及
びこれに用いるモノクローナル抗体を提供することにあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】斯かる実情において、本
発明者らは鋭意検討した結果、精製ヒトＡＧＰＲを抗原
として使用してヒトＡＧＰＲに対するモノクローナル抗
体を得、さらにこれを利用することによりヒト血清や組
織中のヒトＡＧＰＲを簡便、かつ定量的に測定できるこ
とを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明はヒトＡＧＰＲを認識す
るモノクローナル抗体、及び当該モノクローナル抗体の
１種または２種以上を被検体と接触させて免疫測定する
ことを特徴とするヒトＡＧＰＲの測定法を提供するもの
である。

【０００７】本発明のヒトＡＧＰＲを認識するモノクロ
ーナル抗体は、例えば次のようにして製造される。

【０００８】先ず免疫原としてのＡＧＰＲは、公知の方
法、例えば、Ｂａｅｎｚｉｎｇｅｒ［Ｊａｃｑｕｅｓ　
Ｕ．　Ｂａｅｎｚｉｎｇｅｒ，　Ｙｖｏｎｎｅ　Ｍａｙ
ｎａｒｄ，　（１９８０），　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏ．　Ｃｈｅｍ．　ＵＳＡ　２５５，　４６０７−
４６１３］　の方法に従って、ヒト剖検肝より調製する
ことができる。詳しくは、ヒト剖検肝より調製したアセ
トンパウダーから界面活性剤を含む緩衝液でＡＧＰＲを
抽出し、抽出溶液にＣａＣｌ２　を加え、Ｄ−ガラクト
ース−アガロースゲル（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−Ａｇ
ａｒｏｓｅ　Ｇｅｌ）　を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより、精製ＡＧＰＲを調製することがで
きる。

【０００９】この精製ヒトＡＧＰＲを免疫原として使用
し、既知の細胞融合手段によって本発明の抗ヒトＡＧＰ
Ｒモノクローナル抗体を調製することができる。すなわ
ち、精製ヒトＡＧＰＲをマウスに免疫し、一定期間後、
マウスの脾臓を抽出する。抽出した脾臓細胞は、ポリエ
チレングリコールの存在下、ミエローマ細胞と融合せし
めた後、一定期間融合細胞を培養し、培養上清に産生さ
れた抗体のＡＧＰＲに対する反応性から、特異性の高い
抗ヒトＡＧＰＲモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを得ることができる。

【００１０】本発明のモノクローナル抗体の調製は、単
クローン化した上記のハイブリドーマをマウス腹腔内で
培養するか、または適当な培地中で培養することにより
実施される。たとえばマウス腹腔内で培養する場合であ
れば、あらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テ
トラメチルペンタデカン）を腹腔内に注射した後、所望
のハイブリドーマを腹腔内に投与し適当な期間飼育する
。ハイブリドーマの投与によりマウスの体内にハイブリ
ドーマによる腫瘍が形成され、それに伴い腹水中に高濃
度に本発明モノクローナル抗体が産生されてくるので、
この腹水を採取すれば本発明モノクローナル抗体を得る
ことができる。

【００１１】採取した腹水や培養液中の本発明モノクロ
ーナル抗体は、そのままでも使用可能であるが、例えば
硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテ
インＡ結合担体等により高度に精製して用いることがよ
り好ましい。

【００１２】こうして得たモノクローナル抗体は、例え
ばウエスタンブロッティング法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，　３１
１６，　１９７９）により特異性が確認できる。

【００１３】本発明モノクローナル抗体の１種または２
種以上を用いて通常の免疫学的測定法を実施すれば、血
清や組織中のヒトＡＧＰＲが迅速、簡便かつ正確に定量
される。

【００１４】次に、このモノクローナル抗体を使用して
、被検体、例えば血清中のヒトＡＧＰＲを測定する方法
について説明する。

【００１５】その方法として免疫測定法、すなわちオク
タロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫
測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイムノアッセイ
、フロロイムノアッセイなどの方法が利用できる。例え
ば、サンドイッチ酵素免疫測定法を用いる場合には、ヒ
トＡＧＰＲを認識する２種類のモノクローナル抗体の何
れか一方を不溶性担体に固定して不溶化抗体となし、他
方を酵素で標識し、これらを被検体と接触させてサンド
イッチ酵素免疫測定を行ってヒトＡＧＰＲを測定するこ
とができる。

【００１６】本発明に使用する不溶性担体としては、ポ
リエチレン、ポリプロピレンなどの各種合成ポリマー、
ガラス、シリコン、不溶性多糖などが挙げられ、これら
の担体は、球状、棒状、微粒子状等の形状で、あるいは
試験管、マイクロタイタープレートなどとして用いるこ
とができる。不溶化抗体の調製は、抗体を物理的吸着ま
たは共有結合によって不溶性担体に結合させることによ
って行われる。酵素標識抗体は公知の方法によって調製
することができるが、必要に応じて、使用する抗体を適
当なプロテアーゼにより限定分解した後、また還元剤の
存在下でＦ（ａｂ’）２　またはＦａｂ’とした後、酵
素で標識することもできる。抗体の標識に使用する酵素
としてはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ
、アルカリ性フォスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼなどが挙げられる。

【００１７】免疫反応は、先ず第一反応で、不溶化抗体
に被検体を接触させ、抗原を結合させて不溶化抗体−抗
原複合体とし、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合
させて不溶化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とするこ
とによって行われる。そして得られた複合体の酵素活性
を測定することによって、被検体中の抗原（ヒトＡＧＰ
Ｒ）の量を測定することができる。

【００１８】

【発明の効果】本発明によればヒトＡＧＰＲに対するモ
ノクローナル抗体を利用することにより、ヒト血清中、
組織または組織抽出物中のヒトＡＧＰＲを簡便かつ正確
に定量することができ、本発明測定法は肝疾患の診断法
として有用である。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２０】実施例１精製ヒトＡＧＰＲの調製：ヒト剖検肝より精製したアセ
トンパウダー２０ｇを０．２Ｍ　ＮａＣｌ　を含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（洗浄用緩衝液、ｐＨ７．８　）
で２回の洗浄後、０．４Ｍ　ＫＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００を含む２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（　抽
出用緩衝液、ｐＨ７．８　）で３回ＡＧＰＲの抽出を行
った。さらにＡＧＰＲを精製するため、抽出液に終濃度
が２５ｍＭになるようにＣａＣｌ２　を添加し、２５ｍ
Ｍ　ＣａＣｌ２を含む抽出用緩衝液にて緩衝化したＤ−
ガラクトース−アガロースゲル（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓ
ｅ−Ａｇａｒｏｓｅ　Ｇｅｌ）　と４℃にて一夜反応さ
せた。カラムに樹脂をつめ、ＣａＣｌ２　を含み、Ｔｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含まない抽出用緩衝液にてカラ
ムを洗浄した後、溶出用緩衝液（２０ｍＭ　酢酸アンモ
ニウム、１．２５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ５．１）にて溶出
を行うことによって精製ＡＧＰＲを調製した。

【００２１】実施例２ヒトＡＧＰＲを認識するモノクローナル抗体の調製：ヒ
トＡＧＰＲ２０μｇ　を１００μｌの完全フロイントア
ジュバンドとよく混合後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内
に２週間間隔で４回注射した。最終追加免疫から１ケ月
後に、ヒトＡＧＰＲ２０μｇ　を１００μｌの生理食塩
水に混ぜ、腹腔内に注射し、３日後脾臓を摘出し、よく
ほぐした後、培地（ＲＰＭＩ　１６４０）　でよく洗浄
する。この洗浄した脾細胞４×１０８　個と、同様に培
地でよく洗浄したマウスＳＰ２／０・Ａｇｌ４系のミエ
ローマ細胞４×１０７　個と混合し、培地に対し５０（
ｗ／ｖ）％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５４０
／ＧＫＮを１．５ｍｌ徐々に滴下し、１分間混和した。ＧＫＮ培地８ｍｌを徐々に加えてポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を希釈し、反応を停止した。１５００ｒｐ
ｍで５分間遠心し、細胞を集め、５０ｍｌのＨＡＴ　培
地に細胞を懸濁し、フィーダー細胞が含まれる９６穴マ
イクロ培養プレートの各ウエルに０．１ｍｌずつ分注し
、５％ＣＯ２の存在下、３７℃でインキュベイトした。

【００２２】１０日間インキュベイトした後、培養上清
について抗体価を調べ、抗体活性の強いウエルの細胞を
限界希釈法によりクローニングを行い、最終的に計２４
株のハイブリドーマが単離された。得られた２４株のハ
イブリドーマは、それぞれ３０２０１　、３０２０２　
、３０２０３　、３０２０４　、３０２０５　、３０２
０６　、３０２０７、３０２０８　、３０２０９　、３
０２１０　、３０２１１　、３０２１２　、３０２１３
　、３０２１４　、３０２１５　、３０２１６　、３０
２１７　、３０２１８　、３０２１９　、３０２２０　
、３０２２１　、３０２２２　、３０２２３　及び３０
２２５　と命名し、そのうち１０株について工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した。当該株名と受託番号
を表１に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】これらのハイブリドーマをプリスタンで処
理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入し、１０〜２
０日後にその腹水を採取してモノクローナル抗体を得た
。得られた抗体について、そのクラス及びサブクラスを
決定し、表２に示した。

【００２５】

【表２】

【００２６】実施例３ヒトＡＧＰＲを認識するモノクローナル抗体の反応性：
ヒト精製ＡＧＰＲ、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雄：４週齢
）、ラット（ＳＤ、雄：１０週齢）及びラビット肝臓ア
セトンパウダー抽出物をＳＤＳ　添加ポリアクリルアミ
ドゲルにて電気泳動し、さらにポリビニリデンジフルオ
ライド膜に電気的にブロッティングした。この膜を１０
％スキムミルクを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）　に
て、４℃で一夜静置してブロッキングを行った。０．０
５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２
）にて膜を洗浄後、一次抗体（抗ＡＧＰＲ　ＭｃＡｂ）
と室温で１時間、二次抗体としての２００倍希釈ビオチ
ン化抗マウスＩｇＧウマ抗体と室温で１時間、アビジン
ＤＨ−ビオチン化ペルオキシダーゼと室温で３０分間そ
れぞれ反応させた。膜をよく洗浄後、過酸化水素と３，
３′−ジアミノベンジジン塩酸塩を基質として酵素反応
を行った。

【００２７】その結果は表３に示すとおりであり、得ら
れたモノクローナル抗体がヒト肝臓ＡＧＰＲと反応する
事を確認した。またこれら交差反応による反応性の違い
（Ａｇ決定基認識の異同）から表３に示すようにＡ〜Ｅ
の５グループに分類した。

【００２８】

【表３】

【００２９】実施例４２ステップサンドイッチ酵素免疫測定法によるヒトＡＧ
ＰＲの測定：まず、抗体３０２２０またはマウスＩｇＧ
を１０　ｍＯＤとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．２
）−生理食塩水（以下ＰＢＳ）にて精製後、マイクロプ
レートに　２００μｌ／ウエルずつ分注し、４℃にて一
夜静置して固定化した。次いで１％牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）　及び０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を加えた
ＰＢＳ（以下ＢＳＡ−ＰＢＳ　）でよく洗浄後、精製Ａ
ＧＰＲをＢＳＡ−ＰＢＳでそれぞれ５ｎｇ／ｍｌ〜０．
０５ｎｇ／ｍｌまで４段階希釈したものを各々２００μ
ｌ／ウエルずつ加え、３７℃で１時間反応させた。よく
洗浄後、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識３０２０１モ
ノクローナル抗体を２００μｌ／ウエル加え、さらに３
７℃で１時間反応させた。よく洗浄後、過酸化水素とオ
ルトフェニレンジアミンを基質として酵素反応を行い、
酵素活性を測定した。活性は４９２ｎｍ／６３０ｎｍの
吸光度で表した。その結果を図１に示す。図１より３０
２２０と３０２０１−ＨＲＰ（標識体）とのサンドイッ
チ法によれば、濃度依存的に吸光度が上昇し、ＡＧＰＲ
が定量できることがわかる。

【００３０】実施例５２ステップサンドイッチ酵素免疫測定法によるヒト血清
ＡＧＰＲの測定：抗体Ｎｏ．３０２０８、３０２１８　
、３０２２０　またはマウスＩｇＧを１０　ｍＯＤとな
るようにＰＢＳにて調製後、マイクロプレートに　２０
０μｌ／ウエルずつ分注し、４℃で一夜静置して固定化
した。次いで、ＢＳＡ−ＰＢＳでよく洗浄後、ヒト血清
を　２００μｌ／ウエル〜２０μｌ／ウエルまで４段階
希釈したものを加え、３７℃で１時間反応させた。よく
洗浄した後、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識３０２２
０または３０２１１　モノクローナル抗体を２００μｌ
／ウエル加え、さらに３７℃で１時間反応させた。よく
洗浄後、過酸化水素とオルトフェニレンジアミンを基質
として酵素反応を行い、酵素活性を測定した。なお、活
性は４９２ｎｍ／６３０ｎｍにて吸光度として表した。その結果を図２〜図４に示す。図２〜図４より、本発明
モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法によれば、
血清量に依存して吸光度が上昇し、ヒト血清ＡＧＰＲの
定量ができることがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】２ステップサンドイッチ酵素免疫測定法におけ
るヒトＡＧＰＲ濃度と吸光度との関係を示す図である。

【図２】３０２２０−ＨＲＰ　を用いた２ステップサン
ドイッチ酵素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度
との関係を示す図である。

【図３】３０２１１−ＨＲＰ　を用いた２ステップサン
ドイッチ酵素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度
との関係を示す図である。

【図４】３０２１１−ＨＲＰ　を用いた２ステップサン
ドイッチ酵素免疫測定法における、ヒト血清量と吸光度
との関係を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ヒトアシアログリコプロテインレセプ
ターを認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】　　マウス、ラット及びラビットのアシア
ログリコプロテインレセプターとは反応せず、非還元状
態のヒトアシアログリコプロテインレセプターと高い反
応性を示すＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂアイ
ソタイプに属するモノクローナル抗体。
【請求項３】　　マウス、ラット及びラビットのアシア
ログリコプロテインレセプターとは反応せず、還元及び
非還元状態のヒトアシアログリコプロテインレセプター
と高い反応性を示すＩｇＧ１アイソタイプに属するモノ
クローナル抗体。
【請求項４】　　ヒト及びラットのアシアログリコプロ
テインレセプターと反応し、マウス及びラビットのアシ
アログリコプロテインレセプターと反応しないＩｇＧ１
またはＩｇＧ２ａアイソタイプに属するモノクローナル
抗体。
【請求項５】　　ヒト及びラビットのアシアログリコプ
ロテインレセプターと反応し、マウス及びラットのアシ
アログリコプロテインレセプターと反応しないＩｇＧ２
ａアイソタイプに属するモノクローナル抗体。
【請求項６】　　ヒト、ラット、マウス及びラビットの
アシアログリコプロテインレセプターと反応するＩｇＧ
１アイソタイプに属するモノクローナル抗体。
【請求項７】　　請求項１から６記載のモノクローナル
抗体より選ばれる１種または２種以上を被検体と接触さ
せて免疫測定を行うことを特徴とするアシアログリコプ
ロテインレセプターの測定法。