JPH0572207A - 非交差反応性ｃｅａ遺伝子系統群員抗体を用いる免疫検定方法 - Google Patents
非交差反応性ｃｅａ遺伝子系統群員抗体を用いる免疫検定方法Info
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- JPH0572207A JPH0572207A JP3042928A JP4292891A JPH0572207A JP H0572207 A JPH0572207 A JP H0572207A JP 3042928 A JP3042928 A JP 3042928A JP 4292891 A JP4292891 A JP 4292891A JP H0572207 A JPH0572207 A JP H0572207A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ＣＥＡ遺伝子系統群員の存在又は不存在の測
定に有用な免疫検定方法、ＣＥＡ遺伝子系統群間を識別
する方法と、更に、各種の特異抗体を提供する。 【構成】 本発明の方法は、試料中の血清又は血漿を該
ＣＥＡ遺伝子系統群員の一つに特異的な抗体と接触さ
せ、その際該抗体は他の該ＣＥＡ遺伝子系統群員とは交
差反応せず、該抗体が該特異的ＣＥＡ系統群員に結合し
て抗体−抗原生成物を形成するのに充分な条件下で該接
触が行われること、及び該抗体−抗原生成物を検出する
ことである。
定に有用な免疫検定方法、ＣＥＡ遺伝子系統群間を識別
する方法と、更に、各種の特異抗体を提供する。 【構成】 本発明の方法は、試料中の血清又は血漿を該
ＣＥＡ遺伝子系統群員の一つに特異的な抗体と接触さ
せ、その際該抗体は他の該ＣＥＡ遺伝子系統群員とは交
差反応せず、該抗体が該特異的ＣＥＡ系統群員に結合し
て抗体−抗原生成物を形成するのに充分な条件下で該接
触が行われること、及び該抗体−抗原生成物を検出する
ことである。
Description
【０００１】
【本発明の技術的背景】癌胎児性(carcinoembryonic)抗
原（ＣＥＡ）の腫瘍特異性の測定及び臨床的応用におけ
る主要な問題は、腫瘍により発現されるＣＥＡ遺伝子系
統群(family)の他の糖蛋白質との近接した相同性(homol
ogy)である。ＣＥＡは約８−１０の極めて類似した蛋白
質を符号化(encode)する遺伝子系統群の一つである、約
１８０ｋＤの分子量を有する糖蛋白質である。ＣＥＡは
結腸、乳及び肺の腫瘍の血清標識(marker)として使用さ
れている。ＣＥＡ遺伝子系統群の各構成員の間の高度の
構造的及び配列的類似性は、現在の免疫学的試薬の間に
見られる免疫学的交差反応性を説明するものである。
［シャイブリ(Shively)等、1985、ＣＥＡ関連抗原：分子
生物学及び臨床的意義。CRC Crit. Rev. Oncol. Hemat
ol. 2:355-399；バーネット( Barnett)等、1989、癌胎
児性抗原:選択的スプライシングは癌胎児性抗原系統群
の新物質をコード化する多重ｍＲＮＡを説明する。J. C
ell Biol. 108:267-276］。
原（ＣＥＡ）の腫瘍特異性の測定及び臨床的応用におけ
る主要な問題は、腫瘍により発現されるＣＥＡ遺伝子系
統群(family)の他の糖蛋白質との近接した相同性(homol
ogy)である。ＣＥＡは約８−１０の極めて類似した蛋白
質を符号化(encode)する遺伝子系統群の一つである、約
１８０ｋＤの分子量を有する糖蛋白質である。ＣＥＡは
結腸、乳及び肺の腫瘍の血清標識(marker)として使用さ
れている。ＣＥＡ遺伝子系統群の各構成員の間の高度の
構造的及び配列的類似性は、現在の免疫学的試薬の間に
見られる免疫学的交差反応性を説明するものである。
［シャイブリ(Shively)等、1985、ＣＥＡ関連抗原：分子
生物学及び臨床的意義。CRC Crit. Rev. Oncol. Hemat
ol. 2:355-399；バーネット( Barnett)等、1989、癌胎
児性抗原:選択的スプライシングは癌胎児性抗原系統群
の新物質をコード化する多重ｍＲＮＡを説明する。J. C
ell Biol. 108:267-276］。
【０００２】ＣＥＡとエピトープを分かち合う二つのＣ
ＥＡ系統群の構成員は、正常交差反応抗原(Normal Cros
s Reacting Antigen)（ＮＣＡ）及びトランスメンブラ
ン−ＣＥＡ（ＴＭ−ＣＥＡ）と称される、形質膜(membr
ane）にまたがり、そして細胞形質的領域を含む一連の
蛋白質である。我々はＣＥＡ、ＮＣＡをコード化し及び
ＴＭ−ＣＥＡを多重転写(transcript)する完全なｃＤＮ
Ａを単離し、配列決定し、これらのｃＤＮＡを発現する
トランスフェクションを行う細胞系統を産出した。これ
らは同時係属出願ＥＰ−Ａ２６３,９３３、ＥＰ−Ａ３
４６,７０２及びＥＰ−Ａ３４６,７１０及び論文の主題
項目である。バーネット等、前出；バーネット等、198
8、癌胎児性抗原系統群：ＮＣＡ及びＣＥＡをコード化
するｃＤＮＡの特性及びそれらの保存されたループ状領
域における非ランダム型変形の示唆。Genomics. 3:59-6
6；カマーク(Kamarck)等、1987、癌胎児性抗原系統群:
マウスのＬ−トランスフェクタントの発現及びバクテリ
オファージラムダｇｔｌｌにおける部分的ｃＤＮＡの特
性。Natl. Acad. Sci. USA 84:5350-5354。ＣＥＡ系統
群員蛋白質に特異的な抗体は、各種の疾病状態における
各種の表現のより良く且つ一層敏感な評価を可能とする
ものであろう。
ＥＡ系統群の構成員は、正常交差反応抗原(Normal Cros
s Reacting Antigen)（ＮＣＡ）及びトランスメンブラ
ン−ＣＥＡ（ＴＭ−ＣＥＡ）と称される、形質膜(membr
ane）にまたがり、そして細胞形質的領域を含む一連の
蛋白質である。我々はＣＥＡ、ＮＣＡをコード化し及び
ＴＭ−ＣＥＡを多重転写(transcript)する完全なｃＤＮ
Ａを単離し、配列決定し、これらのｃＤＮＡを発現する
トランスフェクションを行う細胞系統を産出した。これ
らは同時係属出願ＥＰ−Ａ２６３,９３３、ＥＰ−Ａ３
４６,７０２及びＥＰ−Ａ３４６,７１０及び論文の主題
項目である。バーネット等、前出；バーネット等、198
8、癌胎児性抗原系統群：ＮＣＡ及びＣＥＡをコード化
するｃＤＮＡの特性及びそれらの保存されたループ状領
域における非ランダム型変形の示唆。Genomics. 3:59-6
6；カマーク(Kamarck)等、1987、癌胎児性抗原系統群:
マウスのＬ−トランスフェクタントの発現及びバクテリ
オファージラムダｇｔｌｌにおける部分的ｃＤＮＡの特
性。Natl. Acad. Sci. USA 84:5350-5354。ＣＥＡ系統
群員蛋白質に特異的な抗体は、各種の疾病状態における
各種の表現のより良く且つ一層敏感な評価を可能とする
ものであろう。
【０００３】“癌胎児性抗原の酵素的免疫検定法”と題
した米国特許第４,４６７,０３１号は、二つの抗−ＣＥ
Ａ単クローン性抗体の第一のものが固体相に結合し、第
二の単クローン性体がペルオキシダーゼと共役する、Ｃ
ＥＡのサンドイッチ酵素免疫検定法に関する。
した米国特許第４,４６７,０３１号は、二つの抗−ＣＥ
Ａ単クローン性抗体の第一のものが固体相に結合し、第
二の単クローン性体がペルオキシダーゼと共役する、Ｃ
ＥＡのサンドイッチ酵素免疫検定法に関する。
【０００４】“癌検出の方法及び組成物”と題した米国
特許第４,４８９,１６７号は、ＣＥＡがヒト血清の正常
な成分であるアルファ−酸糖蛋白質（ＡＧ）と抗原決定
基を分かち合うことを記載している。そこに記載された
方法は一つの抗体としてＡＧを認識する抗体を用い、そ
して他のＣＥＡを認識するがＡＧを認識しない抗体を用
いる、固相サンドイッチ酵素免疫検定法に関する。
特許第４,４８９,１６７号は、ＣＥＡがヒト血清の正常
な成分であるアルファ−酸糖蛋白質（ＡＧ）と抗原決定
基を分かち合うことを記載している。そこに記載された
方法は一つの抗体としてＡＧを認識する抗体を用い、そ
して他のＣＥＡを認識するがＡＧを認識しない抗体を用
いる、固相サンドイッチ酵素免疫検定法に関する。
【０００５】“癌胎児性抗原に特異的な単クローン性抗
体”と題したＥＰ８３３０３７５９は“ＣＥＡに特異的
な”単クローン性抗体の生産及びそれらの免疫検定法に
おける使用に関している。
体”と題したＥＰ８３３０３７５９は“ＣＥＡに特異的
な”単クローン性抗体の生産及びそれらの免疫検定法に
おける使用に関している。
【０００６】“特異的ＣＥＡ−系統群抗原、それに特異
的な抗体及びそれらの使用方法”と題したＷＯ８４／０
２９８３は、試料中の下記の個々の成分を選択的に測定
するように設計された免疫検定法における、ＣＥＡ−胎
便（ＭＡ）−及びＮＣＡ−特異的エピトープへの単クロ
ーン性抗体の使用を目的としている。
的な抗体及びそれらの使用方法”と題したＷＯ８４／０
２９８３は、試料中の下記の個々の成分を選択的に測定
するように設計された免疫検定法における、ＣＥＡ−胎
便（ＭＡ）−及びＮＣＡ−特異的エピトープへの単クロ
ーン性抗体の使用を目的としている。
【０００７】“ＣＥＡ−系統群抗原、抗−ＣＥＡ抗体及
びＣＥＡ免疫検定法”と題した米国特許第４,８１８,７
０９号は、特異的ＣＥＡエピトープ及びＣＥＡ交差反応
抗原のエピトープに特異的な抗体を記載している。
びＣＥＡ免疫検定法”と題した米国特許第４,８１８,７
０９号は、特異的ＣＥＡエピトープ及びＣＥＡ交差反応
抗原のエピトープに特異的な抗体を記載している。
【０００８】従来の技術を参照してもＣＥＡ、ＮＣＡ及
びＴＭ−ＣＥＡ遺伝子系統群員蛋白質の間を区別できる
方法及び試薬は開示されていない。
びＴＭ−ＣＥＡ遺伝子系統群員蛋白質の間を区別できる
方法及び試薬は開示されていない。
【０００９】
【本発明の総括】癌患者の血清中のＣＥＡの測定は患者
の管理について臨床医に有用な情報を提供する。腫瘍標
識としてのＣＥＡの使用の限界は、感受性及び／又はそ
の特異性の欠如である。我々の結果によれば、腫瘍はＣ
ＥＡ遺伝子系統群の一つ以上の構成部員を表現できるこ
とが示された。多数の系統群員が表現できるという事実
によれば、ＣＥＡ間系統群の種々の群員に特異的な抗体
の生成は診断用及び治療用として有用な価値を有してい
る。診断的な用途は血清又は血漿中に見出される循環す
る抗原に対する癌患者の選別、及び腫瘍の像映のために
腫瘍細胞の表面に結合する単クローン性抗体の使用を含
んでいる。
の管理について臨床医に有用な情報を提供する。腫瘍標
識としてのＣＥＡの使用の限界は、感受性及び／又はそ
の特異性の欠如である。我々の結果によれば、腫瘍はＣ
ＥＡ遺伝子系統群の一つ以上の構成部員を表現できるこ
とが示された。多数の系統群員が表現できるという事実
によれば、ＣＥＡ間系統群の種々の群員に特異的な抗体
の生成は診断用及び治療用として有用な価値を有してい
る。診断的な用途は血清又は血漿中に見出される循環す
る抗原に対する癌患者の選別、及び腫瘍の像映のために
腫瘍細胞の表面に結合する単クローン性抗体の使用を含
んでいる。
【００１０】生(native)の細胞表面の抗原、その生を確
認する際に腫瘍細胞の表面に見出される、蛋白質に結合
又は付着する単クローン性抗体は、腫瘍の像映において
並びに効能ある治療法としての使用に用途を有してい
る。生の抗原への抗体の特異性とは、生存細胞の表面に
発現する抗原に、又は細胞によって分泌された両抗原に
結合する能力を称する。変性した抗原に対する抗体の特
異性とは、変性した又は展開された(unfolded)抗原に結
合する能力を称する。かような抗体は、他の方法ではそ
れらの生の状態における構造的類似性のために区別でき
ない抗原の間の差を区別することを可能とするので、生
体内又は試験管内研究に用途を有する。
認する際に腫瘍細胞の表面に見出される、蛋白質に結合
又は付着する単クローン性抗体は、腫瘍の像映において
並びに効能ある治療法としての使用に用途を有してい
る。生の抗原への抗体の特異性とは、生存細胞の表面に
発現する抗原に、又は細胞によって分泌された両抗原に
結合する能力を称する。変性した抗原に対する抗体の特
異性とは、変性した又は展開された(unfolded)抗原に結
合する能力を称する。かような抗体は、他の方法ではそ
れらの生の状態における構造的類似性のために区別でき
ない抗原の間の差を区別することを可能とするので、生
体内又は試験管内研究に用途を有する。
【００１１】本発明はＣＥＡ遺伝子系統群員の間を区別
する免疫検定方法に関し、該方法は（ａ）試料中の血清
又は血漿を該ＣＥＡ遺伝子系統群員の一つに特異的な抗
体と接触させ、その際該抗体は他の該ＣＥＡ遺伝子系統
群員とは交差反応せず、該抗体が該特異的ＣＥＡ系統群
員に結合して抗体−抗原生成物を形成するのに充分な条
件下で該接触が行われること、及び（ｂ）段階（ａ）の
該抗体−抗原生成物を検出すること、の段階を含んで成
る。
する免疫検定方法に関し、該方法は（ａ）試料中の血清
又は血漿を該ＣＥＡ遺伝子系統群員の一つに特異的な抗
体と接触させ、その際該抗体は他の該ＣＥＡ遺伝子系統
群員とは交差反応せず、該抗体が該特異的ＣＥＡ系統群
員に結合して抗体−抗原生成物を形成するのに充分な条
件下で該接触が行われること、及び（ｂ）段階（ａ）の
該抗体−抗原生成物を検出すること、の段階を含んで成
る。
【００１２】上記の方法は（ａ）トランスメンブラン癌
胎児性抗原（ＴＭ−ＣＥＡ）に特異的に結合するが癌胎
児性抗原（ＣＥＡ）又は正常な交差反応抗原（ＮＣＡ）
には特異的に結合しない；（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合
するがＴＭ−ＣＥＡ又はＮＣＡには特異的に結合しな
い；（ｃ）ＮＣＡには特異的に結合するがＣＥＡ又はＴ
Ｍ−ＣＥＡには特異的に結合しない；（ｄ）ＮＣＡ及び
ＣＥＡには特異的に結合するが、ＴＭ−ＣＥＡには特異
的に結合しない、及び（ｅ）ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡに
は特異的に結合するがＣＥＡには特異的に結合しない、
及び（ｆ）ＣＥＡ及びＴＭ−ＣＥＡには特異的に結合す
るが、ＮＣＡには特異的に結合しない抗体から成る部類
から選択された抗体を含むことができる。
胎児性抗原（ＴＭ−ＣＥＡ）に特異的に結合するが癌胎
児性抗原（ＣＥＡ）又は正常な交差反応抗原（ＮＣＡ）
には特異的に結合しない；（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合
するがＴＭ−ＣＥＡ又はＮＣＡには特異的に結合しな
い；（ｃ）ＮＣＡには特異的に結合するがＣＥＡ又はＴ
Ｍ−ＣＥＡには特異的に結合しない；（ｄ）ＮＣＡ及び
ＣＥＡには特異的に結合するが、ＴＭ−ＣＥＡには特異
的に結合しない、及び（ｅ）ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡに
は特異的に結合するがＣＥＡには特異的に結合しない、
及び（ｆ）ＣＥＡ及びＴＭ−ＣＥＡには特異的に結合す
るが、ＮＣＡには特異的に結合しない抗体から成る部類
から選択された抗体を含むことができる。
【００１３】本発明はＣＥＡ遺伝子系統群員であるＣＥ
Ａ、ＮＣＡ及びＴＭ−ＣＥＡの検出に関し、該ＣＥＡ系
統群員は生の蛋白質又は蛋白質の変性形態である。
Ａ、ＮＣＡ及びＴＭ−ＣＥＡの検出に関し、該ＣＥＡ系
統群員は生の蛋白質又は蛋白質の変性形態である。
【００１４】又上記の方法はパネル式検定法において、
該試料中の少なくとも二種の異なるＣＥＡ系統群員に結
合する、少なくとも二種の異なる抗体を含むことができ
る。かようなパネル検定法は総てのＣＥＡ系統群員と交
差反応する、少なくとも一種の交差反応抗体を含むこと
ができる。
該試料中の少なくとも二種の異なるＣＥＡ系統群員に結
合する、少なくとも二種の異なる抗体を含むことができ
る。かようなパネル検定法は総てのＣＥＡ系統群員と交
差反応する、少なくとも一種の交差反応抗体を含むこと
ができる。
【００１５】本発明の抗体は表１に総括されたように、
生の及び変性したＣＥＡ遺伝子系統群員と反応できるこ
とが示されている。
生の及び変性したＣＥＡ遺伝子系統群員と反応できるこ
とが示されている。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【本発明の詳述】多数の特異的交差反応性、非交差反応
性及び部分的に交差反応性の抗体が、生又は変性したＣ
ＥＡ遺伝子系統群員、ＴＭ−ＣＥＡ、ＮＣＡ及びＣＥＡ
の間の区別をするために産出された。抗体は一般に （ａ）トランスメンブラン癌胎児性抗原（ＴＭ−ＣＥ
Ａ）に特異的に結合するが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）又は
正常な交差反応抗原（ＮＣＡ）には特異的に結合しな
い；（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合するがＴＭ−ＣＥＡ又
はＮＣＡには特異的に結合しない；（ｃ）ＮＣＡには特
異的に結合するがＣＥＡ又はＴＭ−ＣＥＡには特異的に
結合しない；（ｄ）ＮＣＡ及びＣＥＡには特異的に結合
するが、ＴＭ−ＣＥＡには特異的に結合しない；（ｅ）
ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡには特異的に結合するがＣＥＡ
には特異的に結合しない；及び（ｆ）ＣＥＡ及びＴＭ−
ＣＥＡには特異的に結合するが、ＮＣＡには特異的に結
合しない抗体から成る部類から選択された抗体を含んで
いる。
性及び部分的に交差反応性の抗体が、生又は変性したＣ
ＥＡ遺伝子系統群員、ＴＭ−ＣＥＡ、ＮＣＡ及びＣＥＡ
の間の区別をするために産出された。抗体は一般に （ａ）トランスメンブラン癌胎児性抗原（ＴＭ−ＣＥ
Ａ）に特異的に結合するが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）又は
正常な交差反応抗原（ＮＣＡ）には特異的に結合しな
い；（ｂ）ＣＥＡに特異的に結合するがＴＭ−ＣＥＡ又
はＮＣＡには特異的に結合しない；（ｃ）ＮＣＡには特
異的に結合するがＣＥＡ又はＴＭ−ＣＥＡには特異的に
結合しない；（ｄ）ＮＣＡ及びＣＥＡには特異的に結合
するが、ＴＭ−ＣＥＡには特異的に結合しない；（ｅ）
ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡには特異的に結合するがＣＥＡ
には特異的に結合しない；及び（ｆ）ＣＥＡ及びＴＭ−
ＣＥＡには特異的に結合するが、ＮＣＡには特異的に結
合しない抗体から成る部類から選択された抗体を含んで
いる。
【００１８】ＣＥＡ又はＮＣＡと交差反応しない生のＴ
Ｍ−ＣＥＡに特異的である単クローン性抗体の例はＭｏ
Ａｂ１７６.７.３Ａ、１７６.７.４Ａ及び１７６.７.５
Ａ［ＡＴＴＣ番号１０４１１］を含む。
Ｍ−ＣＥＡに特異的である単クローン性抗体の例はＭｏ
Ａｂ１７６.７.３Ａ、１７６.７.４Ａ及び１７６.７.５
Ａ［ＡＴＴＣ番号１０４１１］を含む。
【００１９】ＴＭ−ＣＥＡ又はＮＣＡと交差反応しない
生のＣＥＡに特異的な単クローン性抗体の例はＭｏＡｂ
４６.１、５３.４、４６.５及び６９.２を含む。ＭｏＡ
ｂ４６.１及び５３.４はＭｏＡｂ４６.５及び６９.２よ
りも細胞表面に大きい結合親和力を示している。
生のＣＥＡに特異的な単クローン性抗体の例はＭｏＡｂ
４６.１、５３.４、４６.５及び６９.２を含む。ＭｏＡ
ｂ４６.１及び５３.４はＭｏＡｂ４６.５及び６９.２よ
りも細胞表面に大きい結合親和力を示している。
【００２０】生の、又は変性したＣＥＡ及びＴＭ−ＣＥ
Ａに交差反応せず、変性したＮＣＡに交差反応する単ク
ローン性抗体の例は免疫源（ＰＳＫＡＮＹ）X−ＫＬＨ ここでＸ＝２−５繰り返し単位に対するＭｏＡｂを含
む。
Ａに交差反応せず、変性したＮＣＡに交差反応する単ク
ローン性抗体の例は免疫源（ＰＳＫＡＮＹ）X−ＫＬＨ ここでＸ＝２−５繰り返し単位に対するＭｏＡｂを含
む。
【００２１】生のＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡに特異的であ
るが、ＣＥＡと交差反応しない単クローン性抗体の例は
ＭｏＡｂ１７６.４Ｇ２を含む。
るが、ＣＥＡと交差反応しない単クローン性抗体の例は
ＭｏＡｂ１７６.４Ｇ２を含む。
【００２２】生のＣＥＡ及びＮＣＡに特異的であるが、
ＴＭ−ＣＥＡに交差反応しない単クローン性抗体の例は
ＭｏＡｂ４６.４を含む。
ＴＭ−ＣＥＡに交差反応しない単クローン性抗体の例は
ＭｏＡｂ４６.４を含む。
【００２３】変性したＴＭ−ＣＥＡに特異的であるが、
ＴＭ−ＣＥＡ又はＮＣＡと交差反応しない、生の蛋白質
に特異的でない単クローン性抗体の例はＭｏＡｂ１３
０.１０［ＡＴＣＣ番号１０４１２］を含む。
ＴＭ−ＣＥＡ又はＮＣＡと交差反応しない、生の蛋白質
に特異的でない単クローン性抗体の例はＭｏＡｂ１３
０.１０［ＡＴＣＣ番号１０４１２］を含む。
【００２４】ＣＥＡ及びＴＭの両者に交差反応する単ク
ローン性抗体の例はＭｏＡｂ５３.５、４６.２及び１７
６.３Ｇ２を含む。
ローン性抗体の例はＭｏＡｂ５３.５、４６.２及び１７
６.３Ｇ２を含む。
【００２５】本発明の単クローン性抗体の代表的な実例
は下記のようにして製造できる：抗原ＴＭ−ＣＥＡの製
造のためには、米国特許出願番号第２３１,７４１号及
び２７４,１０７号を参照して参考とされたい。
は下記のようにして製造できる：抗原ＴＭ−ＣＥＡの製
造のためには、米国特許出願番号第２３１,７４１号及
び２７４,１０７号を参照して参考とされたい。
【００２６】細胞表面におけるＴＭ−ＣＥＡの濃度を増
大させたゲノムＤＮＡ−仲介遺伝子トランスフェクタン
ト(transfectant)細胞系統、２３.４１１（ＥＰ−Ａ３
４６,７１０）が抗原の給源として使用された。
大させたゲノムＤＮＡ−仲介遺伝子トランスフェクタン
ト(transfectant)細胞系統、２３.４１１（ＥＰ−Ａ３
４６,７１０）が抗原の給源として使用された。
【００２７】２３.４１１細胞のＴＸ−１００中の全細
胞溶解物をセファロース(Sepharose)−６ＭＢビーズに
結合した小麦芽凝集素（ＷＧＡ）に吸着させた。結合し
た糖蛋白質を０.３Ｍの競合する糖Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンで溶離した。ＷＧＡ溶離液を次いでＣＥＡ
及びＴＭ−ＣＥＡ抗原の両者を認識するアガロースビー
ズに結合したＭｏＡｂ５３.５に吸着させた。結合した
ＴＭ−ＣＥＡ抗原を次いで５０ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム、１％のＴＸ−１００、ｐＨ２.５で溶離し、溶離物
を０.１４容の１Ｍトリス塩基で中和し、抗原を生のコ
ンホメーションに保持した。貯留した抗原のアリコート
を次いでＷＧＡセファロースに再吸着し、洗浄し、０.
５％のＮａ−デオキシコレート活性剤の存在で溶離し
た。溶離した抗原を次いで透析して免疫処置のための抗
原水性液を製造する前に、活性剤を除去した。
胞溶解物をセファロース(Sepharose)−６ＭＢビーズに
結合した小麦芽凝集素（ＷＧＡ）に吸着させた。結合し
た糖蛋白質を０.３Ｍの競合する糖Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンで溶離した。ＷＧＡ溶離液を次いでＣＥＡ
及びＴＭ−ＣＥＡ抗原の両者を認識するアガロースビー
ズに結合したＭｏＡｂ５３.５に吸着させた。結合した
ＴＭ−ＣＥＡ抗原を次いで５０ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム、１％のＴＸ−１００、ｐＨ２.５で溶離し、溶離物
を０.１４容の１Ｍトリス塩基で中和し、抗原を生のコ
ンホメーションに保持した。貯留した抗原のアリコート
を次いでＷＧＡセファロースに再吸着し、洗浄し、０.
５％のＮａ−デオキシコレート活性剤の存在で溶離し
た。溶離した抗原を次いで透析して免疫処置のための抗
原水性液を製造する前に、活性剤を除去した。
【００２８】完全フロインド(Freund)アジュバント(adj
uvant)中で抗原の１：１水性エマルションをつくること
により免疫処置のための抗原を調製した。エマルション
の１０分の４（０.４）ｍｌを各Ｂａｌｂ／ｃマウスに
腹腔内的に注射した。免疫処置後７日にマウスから採取
した血清は、マウスの対照細胞系統ＬＴＫ−Ａに比較し
て２３.４１１細胞に対する大きな反応性を示した。最後
の追加抗原投与(boost)後１０日に脾臓を除去し、標準
的融合プロトコールを用いて骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−
ＡＧ８.６５３に融合した［カーニー(Kearney) J.F.、
ラドブランチ(Rad-brunch) A.、リースガング(Liesegan
g)B.及びラジェウスキー(Rajewsky)、1979、免疫グロブリ
ンの発現を喪失したが抗体の構成を可能とする新規骨髄
腫細胞系統がハイブリッド細胞系統を分泌した。J. Imm
uno. 1.123:1548-1550］。
uvant)中で抗原の１：１水性エマルションをつくること
により免疫処置のための抗原を調製した。エマルション
の１０分の４（０.４）ｍｌを各Ｂａｌｂ／ｃマウスに
腹腔内的に注射した。免疫処置後７日にマウスから採取
した血清は、マウスの対照細胞系統ＬＴＫ−Ａに比較し
て２３.４１１細胞に対する大きな反応性を示した。最後
の追加抗原投与(boost)後１０日に脾臓を除去し、標準
的融合プロトコールを用いて骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−
ＡＧ８.６５３に融合した［カーニー(Kearney) J.F.、
ラドブランチ(Rad-brunch) A.、リースガング(Liesegan
g)B.及びラジェウスキー(Rajewsky)、1979、免疫グロブリ
ンの発現を喪失したが抗体の構成を可能とする新規骨髄
腫細胞系統がハイブリッド細胞系統を分泌した。J. Imm
uno. 1.123:1548-1550］。
【００２９】トランスフェクタント細胞系統２３.４１
１が生の細胞表面抗原に結合する抗体のためのハイブリ
ドーマ上澄液を選別するために使用された。生存細胞を
最初の抗体として個々のハイブリドーマ上澄液を用いて
間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）により染色し、続いて蛍光活
性化細胞選別機(Fluorescence Activated Cell Sort-e
r)（ＦＡＣＳ）により分析した。引き続き特異的にＣＥ
Ａ及びＮＣＡを発現するマウス細胞トランスフェクタン
トを含むトランスフェクタント細胞パネルに対して、２
３.４１１細胞への結合を示すハイブリドーマ上澄液を
再選別した。抗原の特異性の測定が各ＭｏＡｂに対して
なされた。
１が生の細胞表面抗原に結合する抗体のためのハイブリ
ドーマ上澄液を選別するために使用された。生存細胞を
最初の抗体として個々のハイブリドーマ上澄液を用いて
間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）により染色し、続いて蛍光活
性化細胞選別機(Fluorescence Activated Cell Sort-e
r)（ＦＡＣＳ）により分析した。引き続き特異的にＣＥ
Ａ及びＮＣＡを発現するマウス細胞トランスフェクタン
トを含むトランスフェクタント細胞パネルに対して、２
３.４１１細胞への結合を示すハイブリドーマ上澄液を
再選別した。抗原の特異性の測定が各ＭｏＡｂに対して
なされた。
【００３０】抗原を免疫化する２３.４１１全細胞を用
いる免疫化プロトコールにより、総てのＣＥＡ系統群員
に交差反応するＩgＭ亜型(subtype)のＡｂを生産する一
つのハイブリドーマの生産が得られた。
いる免疫化プロトコールにより、総てのＣＥＡ系統群員
に交差反応するＩgＭ亜型(subtype)のＡｂを生産する一
つのハイブリドーマの生産が得られた。
【００３１】問題の三種のハイブリドーマ中で得られた
精製された抗原で免疫化されたマウスからの脾臓を用い
て三種の融合が行われた。融合１５７及び１５８は６５
０クローンをもたらし、１１４は２３.４１１に対し陽
性であった。１１４のうち２０をトランスフェクタント
細胞パネル選別後、更に亜クローン(subclone)化した。
２０のうち６種を更に亜クローン化すると、ＴＭ−ＣＥ
Ａに特異性を示すが極めて親和性に乏しいい一種のＭｏ
Ａｂ Ｃ１５８.７が得られた。別の融合体１７６が３６
０クローン中で得られ、そのうち３０種は２３.４１１
に対し陽性であった。３０のうち１４を更に亜クローン
化し、ＭｏＡｂ Ｃ１７６.７.１Ａ、Ｃ１７６.７.５
Ａ、Ｃ１７６.３Ｇ２及びＣ１７６.４Ｇ２が得られた。
ＭｏＡｂＣ１７６.７.１Ａ及びＣ１７６.３Ｇ２は同一
であることが決定された。抗体は総てＩｇＧ−１亜型で
あった。
精製された抗原で免疫化されたマウスからの脾臓を用い
て三種の融合が行われた。融合１５７及び１５８は６５
０クローンをもたらし、１１４は２３.４１１に対し陽
性であった。１１４のうち２０をトランスフェクタント
細胞パネル選別後、更に亜クローン(subclone)化した。
２０のうち６種を更に亜クローン化すると、ＴＭ−ＣＥ
Ａに特異性を示すが極めて親和性に乏しいい一種のＭｏ
Ａｂ Ｃ１５８.７が得られた。別の融合体１７６が３６
０クローン中で得られ、そのうち３０種は２３.４１１
に対し陽性であった。３０のうち１４を更に亜クローン
化し、ＭｏＡｂ Ｃ１７６.７.１Ａ、Ｃ１７６.７.５
Ａ、Ｃ１７６.３Ｇ２及びＣ１７６.４Ｇ２が得られた。
ＭｏＡｂＣ１７６.７.１Ａ及びＣ１７６.３Ｇ２は同一
であることが決定された。抗体は総てＩｇＧ−１亜型で
あった。
【００３２】上記の選別方法の結果として、三種の興味
ある単クローン性抗体が単離された。ＭｏＡｂ １７６.
７.１ＡはＴＭ−ＣＥＡに対し細胞表面特異性を呈する
が、三種の異なるトランスフェクタント細胞系統２３.
４１１、Ｅ２２.７及びＣ１６.６について発現されたよ
うなＣＥＡ又はＮＣＡには特異性が示されなかった。第
二の抗体１７６.４Ｇ２はＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡには
特異性を示したが、ＣＥＡには示さなかった。
ある単クローン性抗体が単離された。ＭｏＡｂ １７６.
７.１ＡはＴＭ−ＣＥＡに対し細胞表面特異性を呈する
が、三種の異なるトランスフェクタント細胞系統２３.
４１１、Ｅ２２.７及びＣ１６.６について発現されたよ
うなＣＥＡ又はＮＣＡには特異性が示されなかった。第
二の抗体１７６.４Ｇ２はＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡには
特異性を示したが、ＣＥＡには示さなかった。
【００３３】単クローン性抗体を図１−３、パネルＡ−
Ｆに示されるように、細胞表面抗原のような個々のＣＥ
Ａ系統群員生蛋白質を発現する６種（６）のトランスフ
ェクタント細胞系統への結合について分析した。結合は
各細胞系統について正常血清及び陽性対照Ａｂ（５３.
５）と比較して陰影付きヒストグラムにより示されてい
る。
Ｆに示されるように、細胞表面抗原のような個々のＣＥ
Ａ系統群員生蛋白質を発現する６種（６）のトランスフ
ェクタント細胞系統への結合について分析した。結合は
各細胞系統について正常血清及び陽性対照Ａｂ（５３.
５）と比較して陰影付きヒストグラムにより示されてい
る。
【００３４】ＭｏＡｂ １７６.７.５Ａは図１、パネル
Ａ、Ｅ、Ｆに示されるようにＴＭ−ＣＥＡを発現する細
胞系統（２３.４１１、Ｃ１６.６及びＥ２２.７）に結
合することによりＴＭ−ＣＥＡへの特異性を示す。Ｍｏ
Ａｂ１７６.３Ｇ２は図２、パネル、Ｃ及びＡ、Ｅ、Ｆ
に夫々示されるように細胞系統１ＬＶ７−１.２及び２
３.４１１、Ｃ１６.６、Ｅ２２.７に結合することによ
りＣＥＡ及びＴＭ−ＣＥＡの両者に特異性を示す。Ｍｏ
Ａｂ１７６.４Ｇ２は図３、パネルＡ、Ｅ、Ｆ及びＤに
示されるように細胞系統２３.４１１；Ｃ１６.６、Ｅ２
２.７及びＢＴ−２０.４に結合することによりＴＭ−Ｃ
ＥＡ及びＮＣＡ抗原に特異性を示す。ＭｏＡｂ１７６.
４Ｇ２は高濃度の抗体において極めて少量のＣＥＡ交差
反応性を呈した。
Ａ、Ｅ、Ｆに示されるようにＴＭ−ＣＥＡを発現する細
胞系統（２３.４１１、Ｃ１６.６及びＥ２２.７）に結
合することによりＴＭ−ＣＥＡへの特異性を示す。Ｍｏ
Ａｂ１７６.３Ｇ２は図２、パネル、Ｃ及びＡ、Ｅ、Ｆ
に夫々示されるように細胞系統１ＬＶ７−１.２及び２
３.４１１、Ｃ１６.６、Ｅ２２.７に結合することによ
りＣＥＡ及びＴＭ−ＣＥＡの両者に特異性を示す。Ｍｏ
Ａｂ１７６.４Ｇ２は図３、パネルＡ、Ｅ、Ｆ及びＤに
示されるように細胞系統２３.４１１；Ｃ１６.６、Ｅ２
２.７及びＢＴ−２０.４に結合することによりＴＭ−Ｃ
ＥＡ及びＮＣＡ抗原に特異性を示す。ＭｏＡｂ１７６.
４Ｇ２は高濃度の抗体において極めて少量のＣＥＡ交差
反応性を呈した。
【００３５】更にウェスターン(Western blot)分析法に
よる特性決定によって，ＦＡＣＳ分析により示された特
異性が確認された。ＭｏＡｂ１７６.７.５Ａを用いる引
き続いてのＦＡＣＳ及びＩＦＦ実験は、トランスフェク
タント細胞系統中に発現するもの以外の特異性抗原の給
源である、培養された細胞系統の細胞表面に生のＴＭ−
ＣＥＡの認識を示している。
よる特性決定によって，ＦＡＣＳ分析により示された特
異性が確認された。ＭｏＡｂ１７６.７.５Ａを用いる引
き続いてのＦＡＣＳ及びＩＦＦ実験は、トランスフェク
タント細胞系統中に発現するもの以外の特異性抗原の給
源である、培養された細胞系統の細胞表面に生のＴＭ−
ＣＥＡの認識を示している。
【００３６】生の蛋白質へのＣＥＡ抗体の生産：ヒトの
結腸腺癌細胞系統の活性剤抽出物の液体カラムクロマト
グラフィーによりＣＥＡを精製した。細胞ペレットを１
％トリトン(Triton)Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害剤
としてＥＤＴＡ及び弗化フェニルメチルスルホニル及び
ベンズアミジンを含む緩衝液中で音波処理した。引き続
きＣＥＡをバイオ−ゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラム［バイ
オラド(Bio-Rad)ラボラトリーズ(Laboratories)]の陰イ
オン交換クロマトグラフィー、カルボキシメチルセルロ
ース（バイオラド・ラボラトリーズ）の陽イオン交換ク
ロマトグラフィー及びバイオ−シル(Bio-Sil)ＴＳＫ−
４００及び−２５０カラム（バイオラド・ラボラトリー
ズ）のゲル透過クロマトグラフィーにより精製した。
結腸腺癌細胞系統の活性剤抽出物の液体カラムクロマト
グラフィーによりＣＥＡを精製した。細胞ペレットを１
％トリトン(Triton)Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害剤
としてＥＤＴＡ及び弗化フェニルメチルスルホニル及び
ベンズアミジンを含む緩衝液中で音波処理した。引き続
きＣＥＡをバイオ−ゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラム［バイ
オラド(Bio-Rad)ラボラトリーズ(Laboratories)]の陰イ
オン交換クロマトグラフィー、カルボキシメチルセルロ
ース（バイオラド・ラボラトリーズ）の陽イオン交換ク
ロマトグラフィー及びバイオ−シル(Bio-Sil)ＴＳＫ−
４００及び−２５０カラム（バイオラド・ラボラトリー
ズ）のゲル透過クロマトグラフィーにより精製した。
【００３７】マウスを完全フロイントアジュバントで
１：１に乳化したＣＥＡの水溶液で免疫処置した。不完
全フロイントアジュバント中で１：１に乳化した抗原の
追加刺激注射を、抗ＣＥＡ抗体の高い血清力価が検出さ
れるまで二週間間隔で投与した。こうした動物から脾臓
を取り出し、標準的な融合方法によりマウスの骨髄腫細
胞、Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８.６５３と融合した。抗ＣＥ
Ａ抗体の一次選別は、ＣＥＡと結合する固相のウサギの
多クローン性トラッピング(trapping)抗体を用い、次い
でマウスの抗ＣＥＡ抗体の存在を検出するためにハイブ
リドーマ培養上澄液を添加することによるサンドイッチ
ＥＬＩＳＡ検定法により行われた。培養上澄液からのマ
ウスの抗体の結合はペルオキシダーゼ共役抗マウスＩg
抗体を添加し、洗浄工程に続いて、ペルオキシダーゼ酵
素基質の添加により検出された。酵素による着色生成物
の生産は、ハイブリドーマ上澄液中の抗ＣＥＡ抗体の存
在を示した。
１：１に乳化したＣＥＡの水溶液で免疫処置した。不完
全フロイントアジュバント中で１：１に乳化した抗原の
追加刺激注射を、抗ＣＥＡ抗体の高い血清力価が検出さ
れるまで二週間間隔で投与した。こうした動物から脾臓
を取り出し、標準的な融合方法によりマウスの骨髄腫細
胞、Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８.６５３と融合した。抗ＣＥ
Ａ抗体の一次選別は、ＣＥＡと結合する固相のウサギの
多クローン性トラッピング(trapping)抗体を用い、次い
でマウスの抗ＣＥＡ抗体の存在を検出するためにハイブ
リドーマ培養上澄液を添加することによるサンドイッチ
ＥＬＩＳＡ検定法により行われた。培養上澄液からのマ
ウスの抗体の結合はペルオキシダーゼ共役抗マウスＩg
抗体を添加し、洗浄工程に続いて、ペルオキシダーゼ酵
素基質の添加により検出された。酵素による着色生成物
の生産は、ハイブリドーマ上澄液中の抗ＣＥＡ抗体の存
在を示した。
【００３８】合成ペプチドを用いる抗ＮＣＡ抗体の生産 独特なアミノ酸配列（ＣＥＡ及びＴＭ−１の配列と比較
して）の最長の隣接結合部はアミノ酸配列位置２１１−
２１４に所在するテトラペプチド、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎである。合成ペプチドＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（カップリング
の目的でＣｙｓが添加されたＮＣＡ配列の残基２１０−
２１５）をメリフィールド(Merrifield)固相合成化学を
用いて製造した。ペプチドエピトープとして一般に許容
された最小の大きさは約４アミノ酸であるから、アミノ
末端におけるＰｒｏ残基及びカルボキシ末端におけるＴ
ｙｒ残基は臨界的なテトラペプチド免疫源の、遊離のＮ
−及びＣ−末端を保護するために含有された。該ペプチ
ドを複素式二官能性カップリング剤、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（sulf
o-ＭＢＳ）を用いてアオガイヘモシアニン(keyhole lim
pet hemocyanin)（ＫＬＨ）にカップリングした。同じ
ペプチドを複素式二官能性カップリング剤、Ｎ−スクシ
ンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）を用いて牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に
カップリングした。
して）の最長の隣接結合部はアミノ酸配列位置２１１−
２１４に所在するテトラペプチド、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎである。合成ペプチドＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（カップリング
の目的でＣｙｓが添加されたＮＣＡ配列の残基２１０−
２１５）をメリフィールド(Merrifield)固相合成化学を
用いて製造した。ペプチドエピトープとして一般に許容
された最小の大きさは約４アミノ酸であるから、アミノ
末端におけるＰｒｏ残基及びカルボキシ末端におけるＴ
ｙｒ残基は臨界的なテトラペプチド免疫源の、遊離のＮ
−及びＣ−末端を保護するために含有された。該ペプチ
ドを複素式二官能性カップリング剤、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（sulf
o-ＭＢＳ）を用いてアオガイヘモシアニン(keyhole lim
pet hemocyanin)（ＫＬＨ）にカップリングした。同じ
ペプチドを複素式二官能性カップリング剤、Ｎ−スクシ
ンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）を用いて牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に
カップリングした。
【００３９】完全フロイントアジュバント中でペプチド
−ＫＬＨ（１００μｇ）のエマルションを用いてマウス
を免疫処置した。ペプチドの力価が上昇するまで不完全
フロイントアジュバント中のエマルションを追加刺激剤
として投与した。これらの動物からの脾臓細胞を標準的
技術を用いてマウスの骨髄腫細胞に融合した。ヘキサペ
プチド担体免疫源を用いて、我々は固相選別試薬として
ペプチドＢＳＡを用い、１１の異なる単クローン性抗ペ
プチド抗体を得た。引き続き、これらの抗体のいずれも
が生又は変性したＮＣＡ蛋白質のいずれにも結合できな
いことが見出された。二つの追加的な融合はこうした短
いペプチドに誘導された抗体が、全体的な（変性した）
蛋白質の構造に関連するこのペプチド配列に結合できな
いことを明らかにする同一の結果を与えた。周囲の配列
はＮＣＡ、ＣＥＡ及びＴＭ−ＣＥＡに共通であるから、
周囲の配列をも包含することによりペプチド免疫源を長
鎖化することは、交差反応性抗体を誘発する危険を冒す
ことになる。同じ技術を用いて四アミノ酸の多量体が製
造された。ペプチド−ＫＬＨ免疫源はｘ＝２−５の繰り
返し単位である繰り返し配列（ＰＳＫＡＮＹ）X−ＫＬ
Ｈから成る。免疫源（ＰＳＫＡＮＹ）3−ＫＬＨは変性
したＮＣＡ蛋白質と反応するＮＣＡに特異的な単クロー
ン性抗体を生じた。
−ＫＬＨ（１００μｇ）のエマルションを用いてマウス
を免疫処置した。ペプチドの力価が上昇するまで不完全
フロイントアジュバント中のエマルションを追加刺激剤
として投与した。これらの動物からの脾臓細胞を標準的
技術を用いてマウスの骨髄腫細胞に融合した。ヘキサペ
プチド担体免疫源を用いて、我々は固相選別試薬として
ペプチドＢＳＡを用い、１１の異なる単クローン性抗ペ
プチド抗体を得た。引き続き、これらの抗体のいずれも
が生又は変性したＮＣＡ蛋白質のいずれにも結合できな
いことが見出された。二つの追加的な融合はこうした短
いペプチドに誘導された抗体が、全体的な（変性した）
蛋白質の構造に関連するこのペプチド配列に結合できな
いことを明らかにする同一の結果を与えた。周囲の配列
はＮＣＡ、ＣＥＡ及びＴＭ−ＣＥＡに共通であるから、
周囲の配列をも包含することによりペプチド免疫源を長
鎖化することは、交差反応性抗体を誘発する危険を冒す
ことになる。同じ技術を用いて四アミノ酸の多量体が製
造された。ペプチド−ＫＬＨ免疫源はｘ＝２−５の繰り
返し単位である繰り返し配列（ＰＳＫＡＮＹ）X−ＫＬ
Ｈから成る。免疫源（ＰＳＫＡＮＹ）3−ＫＬＨは変性
したＮＣＡ蛋白質と反応するＮＣＡに特異的な単クロー
ン性抗体を生じた。
【００４０】選別検定法 抗体１７６.７.５Ａ（ＴＭ−ＣＥＡ特異性）及びＭｏＡ
ｂ ＣＩＩ１３.９ａ（ＣＥＡ、ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡ
と交差反応性）を用いるサンドイッチ免疫検定法が、癌
患者からの血清を選別するために使用された。抗体１７
６.７.５Ａはフルオレッセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）で標識され、抗体Ｉ１３.９ａはアルカリ性ホ
スファターゼに共役されている。二種の誘導された抗体
を血清と共にインキュベートし、その時間の間それらが
血清中でＴＭ−ＣＥＡと抗体−抗原−抗体サンドイッチ
を形成するか否かを分析した。２０分間後、抗フルオレ
ッセイン抗体で被覆された磁化性の粒子を添加し、複合
体を洗浄し、且つ酵素基質としてｐ−ニトロフェニルホ
スフェートを添加することにより検出した。反応速度は
４０５ｎｍで監視された。この方法を用いて結腸、肺、
乳及び膵臓癌を有すると診断された患者からの８０−９
０の血清を分析した。対照として喫煙習慣のない正常な
個人からの２０−３０の血清を分析した。癌患者からの
血清試料の１５ないし３０％以上が、全体的対照集団よ
りも大きいＴＭ−ＣＥＡ水準を実証した。
ｂ ＣＩＩ１３.９ａ（ＣＥＡ、ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡ
と交差反応性）を用いるサンドイッチ免疫検定法が、癌
患者からの血清を選別するために使用された。抗体１７
６.７.５Ａはフルオレッセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）で標識され、抗体Ｉ１３.９ａはアルカリ性ホ
スファターゼに共役されている。二種の誘導された抗体
を血清と共にインキュベートし、その時間の間それらが
血清中でＴＭ−ＣＥＡと抗体−抗原−抗体サンドイッチ
を形成するか否かを分析した。２０分間後、抗フルオレ
ッセイン抗体で被覆された磁化性の粒子を添加し、複合
体を洗浄し、且つ酵素基質としてｐ−ニトロフェニルホ
スフェートを添加することにより検出した。反応速度は
４０５ｎｍで監視された。この方法を用いて結腸、肺、
乳及び膵臓癌を有すると診断された患者からの８０−９
０の血清を分析した。対照として喫煙習慣のない正常な
個人からの２０−３０の血清を分析した。癌患者からの
血清試料の１５ないし３０％以上が、全体的対照集団よ
りも大きいＴＭ−ＣＥＡ水準を実証した。
【００４１】二つの抗体、単クローン性抗体１７６.７.
５ａ及びウサギの多クローン性抗ＣＥＡ［ダコ(DAKO)
社］を用いて追加的な分析が行われた。多クローン性抗
体（０.２μｇ）をｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸塩／炭酸水
素塩緩衝液中でインムロン・エリザ・プレート(Immulon
ELIZA plate)［ダイナテク・ラボラトリーズ(Dyna- te
ch Laboratories)社］のウェル中に３７℃で１時間吸収
させる。過剰の抗体を洗浄して除去し、０.０５％トゥ
イーン−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用い、３７
℃で１時間ウェルをブロック(block)する。ＴＭ−ＣＥ
Ａを含む細胞系統２３.４１１の溶解液を段階希釈して
抗体被覆ウェルに添加し、周囲温度で１時間インキュベ
ートする。ウェルを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに入れた抗体１
７６.７.５ａ１００μｌを各ウェルに添加し、周囲温度
で１時間インキュベートする。未結合の抗体を洗浄して
除去し、ＰＢＳ−Ｔ中のヤギの抗マウスＩｇＧ、Ａ、Ｍ
−ペルオキシダーゼ共役物を添加し、周囲温度で１時間
インキュベートする。１７６.７.５ａ抗体及び抗マウス
−酵素共役物の抗原依存性結合は、ウェルを洗浄後ペル
オキシダーゼ酵素基質の添加及び色の発現の監視により
検出される。
５ａ及びウサギの多クローン性抗ＣＥＡ［ダコ(DAKO)
社］を用いて追加的な分析が行われた。多クローン性抗
体（０.２μｇ）をｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸塩／炭酸水
素塩緩衝液中でインムロン・エリザ・プレート(Immulon
ELIZA plate)［ダイナテク・ラボラトリーズ(Dyna- te
ch Laboratories)社］のウェル中に３７℃で１時間吸収
させる。過剰の抗体を洗浄して除去し、０.０５％トゥ
イーン−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用い、３７
℃で１時間ウェルをブロック(block)する。ＴＭ−ＣＥ
Ａを含む細胞系統２３.４１１の溶解液を段階希釈して
抗体被覆ウェルに添加し、周囲温度で１時間インキュベ
ートする。ウェルを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに入れた抗体１
７６.７.５ａ１００μｌを各ウェルに添加し、周囲温度
で１時間インキュベートする。未結合の抗体を洗浄して
除去し、ＰＢＳ−Ｔ中のヤギの抗マウスＩｇＧ、Ａ、Ｍ
−ペルオキシダーゼ共役物を添加し、周囲温度で１時間
インキュベートする。１７６.７.５ａ抗体及び抗マウス
−酵素共役物の抗原依存性結合は、ウェルを洗浄後ペル
オキシダーゼ酵素基質の添加及び色の発現の監視により
検出される。
【００４２】本発明の主なる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【００４３】１．下記段階 （ａ）試料中の血清又は血漿をＣＥＡ遺伝子系統群員の
一つに特異的な抗体と接触させ、その際該抗体は他の該
ＣＥＡ遺伝子系統群員とは交差反応せず、該抗体を該特
異的ＣＥＡ系統群員に結合させて抗体−抗原生成物を形
成させるのに充分な条件下で該接触が行われること、及
び（ｂ）段階（ａ）の該抗体−抗原生成物を検出するこ
と、を含んで成る、ＣＥＡ遺伝子系統群の間の系統群員
を区別するための免疫検定方法。
一つに特異的な抗体と接触させ、その際該抗体は他の該
ＣＥＡ遺伝子系統群員とは交差反応せず、該抗体を該特
異的ＣＥＡ系統群員に結合させて抗体−抗原生成物を形
成させるのに充分な条件下で該接触が行われること、及
び（ｂ）段階（ａ）の該抗体−抗原生成物を検出するこ
と、を含んで成る、ＣＥＡ遺伝子系統群の間の系統群員
を区別するための免疫検定方法。
【００４４】２．該特異的抗体が（ａ）トランスメンブ
ラン癌胎児性抗原（ＴＭ−ＣＥＡ）には特異的に結合す
るが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）又は正常な交差反応抗原
（ＮＣＡ）には特異的に結合しない；（ｂ）ＣＥＡには
特異的に結合するがＴＭ−ＣＥＡ又はＮＣＡには特異的
に結合しない、及び（ｃ）ＮＣＡには特異的に結合する
がＣＥＡ又はＴＭ−ＣＥＡには特異的に結合しない抗体
から成る部類から選択される、上記１に記載の方法。
ラン癌胎児性抗原（ＴＭ−ＣＥＡ）には特異的に結合す
るが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）又は正常な交差反応抗原
（ＮＣＡ）には特異的に結合しない；（ｂ）ＣＥＡには
特異的に結合するがＴＭ−ＣＥＡ又はＮＣＡには特異的
に結合しない、及び（ｃ）ＮＣＡには特異的に結合する
がＣＥＡ又はＴＭ−ＣＥＡには特異的に結合しない抗体
から成る部類から選択される、上記１に記載の方法。
【００４５】３．更に（ｄ）ＴＭ−ＣＥＡ及びＣＥＡに
は特異的に結合するがＮＣＡには特異的に結合しない、
（ｅ）ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡには特異的に結合するが
ＣＥＡには特異的に結合しない、及び（ｆ）ＣＥＡ及び
ＮＣＡには特異的に結合するがＴＭ−ＣＥＡには特異的
に結合しない抗体を含んで成る、上記２に記載の方法。
は特異的に結合するがＮＣＡには特異的に結合しない、
（ｅ）ＴＭ−ＣＥＡ及びＮＣＡには特異的に結合するが
ＣＥＡには特異的に結合しない、及び（ｆ）ＣＥＡ及び
ＮＣＡには特異的に結合するがＴＭ−ＣＥＡには特異的
に結合しない抗体を含んで成る、上記２に記載の方法。
【００４６】４．該ＣＥＡ遺伝子系統群員がＣＥＡ、Ｔ
Ｍ−ＣＥＡ及びＮＣＡから成る部類から選択される、上
記１−３に記載の方法。
Ｍ−ＣＥＡ及びＮＣＡから成る部類から選択される、上
記１−３に記載の方法。
【００４７】５．該ＣＥＡ遺伝子系統群員蛋白質が生蛋
白質又は変性蛋白質である、上記４に記載の方法。
白質又は変性蛋白質である、上記４に記載の方法。
【００４８】６．該試料中の少なくとも二種の異なるＣ
ＥＡ系統群員に特異的に結合する少なくとも二種の抗体
を含んで成る、上記１−５に記載の方法。
ＥＡ系統群員に特異的に結合する少なくとも二種の抗体
を含んで成る、上記１−５に記載の方法。
【００４９】７．ＴＭ−ＣＥＡ、ＮＣＡ及びＣＥＡと交
差反応する、更に少なくとも一種の交差反応するＣＥＡ
を含んで成る、上記６に記載の方法。
差反応する、更に少なくとも一種の交差反応するＣＥＡ
を含んで成る、上記６に記載の方法。
【００５０】８．段階（ａ）の該抗体−抗原生成物が固
定化された支持体に結合され、及び（ｂ）支持体上にＣ
ＥＡ系統群員を結合している得られた固定化支持体を検
出可能な標識と接触させる、上記１に記載の免疫検定方
法。
定化された支持体に結合され、及び（ｂ）支持体上にＣ
ＥＡ系統群員を結合している得られた固定化支持体を検
出可能な標識と接触させる、上記１に記載の免疫検定方
法。
【００５１】９．（ａ）ＣＥＡ遺伝子系統群員の一種に
特異的な少なくとも一つの抗体、及び（ｂ）得られる段
階（ａ）の抗体−抗原生成物に結合する標識された抗体
を含み、該免疫検定法を実施するのに充分な量の試薬を
含んで成る、血清又は血漿中のＣＥＡ遺伝子系統群員の
間の識別を行うのに適当な免疫検定用キット。
特異的な少なくとも一つの抗体、及び（ｂ）得られる段
階（ａ）の抗体−抗原生成物に結合する標識された抗体
を含み、該免疫検定法を実施するのに充分な量の試薬を
含んで成る、血清又は血漿中のＣＥＡ遺伝子系統群員の
間の識別を行うのに適当な免疫検定用キット。
【００５２】１０．更に陽性対照として少なくとも一種
の交差反応するＣＥＡ系統群員抗体を含む、上記９に記
載のキット。
の交差反応するＣＥＡ系統群員抗体を含む、上記９に記
載のキット。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＭｏＡｂ１７６.７.５Ａの特異性を示す
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
【図２】図２はＭｏＡｂ１７６.３Ｇ２の特異性を示す
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図３】図３はＭｏＡｂ１７６.４Ｇ２の特異性を示す
ＦＡＣＳ分析の結果図である。各図面はＣＥＡ系統群員
生蛋白質を発現する６種のトランスフェクタント細胞系
統への結合についての分析結果であり、該結合は各細胞
系統について正常血清及び陽性対照Ａｂ（５３.５）と
比較して陰影付きヒストグラムにより示されている
ＦＡＣＳ分析の結果図である。各図面はＣＥＡ系統群員
生蛋白質を発現する６種のトランスフェクタント細胞系
統への結合についての分析結果であり、該結合は各細胞
系統について正常血清及び陽性対照Ａｂ（５３.５）と
比較して陰影付きヒストグラムにより示されている
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年７月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＭｏＡｂ１７６．７．５Ａの特異性を示
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
【図２】図２はＭｏＡｂ１７６．７．５Ａの特異性を示
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
【図３】図３はＭｏＡｂ１７６．７．５Ａの特異性を示
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
【図４】図４はＭｏＡｂ１７６．７．５Ａの特異性を示
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
【図５】図５はＭｏＡｂ１７６．７．５Ａの特異性を示
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
【図６】図６はＭｏＡｂ１７６．７．５Ａの特異性を示
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
すＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析の結果図であ
る。
【図７】図７はＭｏＡｂ１７６．３Ｇ２の特異性を示す
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図８】図８はＭｏＡｂ１７６．３Ｇ２の特異性を示す
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図９】図９はＭｏＡｂ１７６．３Ｇ２の特異性を示す
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
ＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１０】図１０はＭｏＡｂ１７６．３Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１１】図１１はＭｏＡｂ１７６．３Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１２】図１２はＭｏＡｂ１７６．３Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１３】図１３はＭｏＡｂ１７６．４Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１４】図１４はＭｏＡｂ１７６．４Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１５】図１５はＭｏＡｂ１７６．４Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１６】図１６はＭｏＡｂ１７６．４Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１７】図１７はＭｏＡｂ１７６．４Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。
【図１８】図１８はＭｏＡｂ１７６．４Ｇ２の特異性を
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。 各図面はＣＥＡ系統群員生蛋白質を発現する６種のトラ
ンスフエクタント細胞系統への結合についての分析結果
であり、該結合は各細胞系統について正常血清及び陽性
対照Ａｂ（５３．５）と比較して陰影付きヒストグラム
により示されている。
示すＦＡＣＳ分析の結果図である。 各図面はＣＥＡ系統群員生蛋白質を発現する６種のトラ
ンスフエクタント細胞系統への結合についての分析結果
であり、該結合は各細胞系統について正常血清及び陽性
対照Ａｂ（５３．５）と比較して陰影付きヒストグラム
により示されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トマス・バーネツト アメリカ合衆国コネチカツト州06712プロ スペクト・ルークストリート28 (72)発明者 マイケル・カマーク アメリカ合衆国コネチカツト州06525ベサ ニイ・ラツセルロード83 (72)発明者 ジヨン・ハート アメリカ合衆国コネチカツト州06492ウオ リングフオード・ウツドランドドライブ47
Claims (1)
- 【請求項１】 下記段階 （ａ）試料中の血清又は血漿をＣＥＡ遺伝子系統群員の
一つに特異的な抗体と接触させ、その際該抗体は他の該
ＣＥＡ遺伝子系統群員とは交差反応せず、該抗体を該特
異的ＣＥＡ系統群員に結合させて抗体−抗原生成物を形
成させるのに充分な条件下で該接触が行われること、及
び （ｂ）段階（ａ）の該抗体−抗原生成物を検出するこ
と、を含んで成る、ＣＥＡ遺伝子系統群の間の系統群員
を区別するための免疫検定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US480428 | 1990-02-15 | ||
| US07/480,428 US5200316A (en) | 1990-02-15 | 1990-02-15 | Immunoassay methods using noncross reactive cea gene family members antibodies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0572207A true JPH0572207A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=23907925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3042928A Pending JPH0572207A (ja) | 1990-02-15 | 1991-02-15 | 非交差反応性ｃｅａ遺伝子系統群員抗体を用いる免疫検定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5200316A (ja) |
| EP (1) | EP0446602A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0572207A (ja) |
| CA (1) | CA2036237A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2082605C (en) * | 1991-12-30 | 2005-02-01 | James J. Elting | Monitoring of nca-bt in blood samples of breast cancer patients |
| CA2118760C (en) * | 1993-04-21 | 2004-06-22 | William Jeffrey Allard | Diagnosis and monitoring of colon cancer patients by measurement of nca 50/90 in blood |
| CA2118759C (en) * | 1993-04-21 | 2004-06-22 | William Jeffrey Allard | Diagnosis and monitoring of lung cancer patients by measurement of nca 50/90 in blood |
| ATE235514T1 (de) * | 1994-12-28 | 2003-04-15 | Univ Kentucky | Monoklonaler anti-idiotypischer antikörper 3h1 aus maus |
| US20020098190A1 (en) * | 1997-06-13 | 2002-07-25 | Malaya Chatterjee | Compositions and methods for treating tumors bearing HMFG and CEA antigens |
| ATE431111T1 (de) * | 2001-02-27 | 2009-05-15 | Smith & Nephew Inc | Vorrichtung zur totalen knierekonstruktion |
| US6949629B2 (en) * | 2002-03-13 | 2005-09-27 | Aspenbio, Inc. | Methods for purifying selected CEA family member proteins |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4489167A (en) * | 1981-06-02 | 1984-12-18 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Methods and compositions for cancer detection |
| DE3263249D1 (en) * | 1981-08-21 | 1985-05-30 | Hoffmann La Roche | Method for the determination of carcinoembryonic antigen (cea) and suitable antibody solution for the determination |
| JPH0811075B2 (ja) * | 1982-06-30 | 1996-02-07 | 雄治 松岡 | 単クローン性抗ｃｅａ抗体 |
| US4818709A (en) * | 1983-01-21 | 1989-04-04 | Primus Frederick J | CEA-family antigens, Anti-CEA antibodies and CEA immunoassay |
| CA1274794A (en) * | 1983-01-21 | 1990-10-02 | Frederick James Primus | Specific cea-family antigens, antibodies specific thereto and their methods of use |
| US5122599A (en) * | 1986-08-13 | 1992-06-16 | Molecular Diagnostics, Inc. | CDNAS coding for members of the carcinoembryonic antigen family |
| ES2059330T3 (es) * | 1986-08-13 | 1994-11-16 | Miles Inc | Un cdna codificador de antigeno carcinoembrionico. |
-
1990
- 1990-02-15 US US07/480,428 patent/US5200316A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-02-05 EP EP91101487A patent/EP0446602A1/en not_active Withdrawn
- 1991-02-14 CA CA002036237A patent/CA2036237A1/en not_active Abandoned
- 1991-02-15 JP JP3042928A patent/JPH0572207A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0446602A1 (en) | 1991-09-18 |
| CA2036237A1 (en) | 1991-08-16 |
| US5200316A (en) | 1993-04-06 |
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