JPH07238099A - モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法Info
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- JPH07238099A JPH07238099A JP6028169A JP2816994A JPH07238099A JP H07238099 A JPH07238099 A JP H07238099A JP 6028169 A JP6028169 A JP 6028169A JP 2816994 A JP2816994 A JP 2816994A JP H07238099 A JPH07238099 A JP H07238099A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
Abstract
(57)【要約】
【構成】 抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
に特異的なモノクローナル抗体、及びこれを用いる抗ト
ロンビン・アンチトロンビンIII複合体の免疫学的測定
法。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴを特
異的に認識し、かつこれと高い親和性を有するものであ
る。従って、このモノクローナル抗体を用いることによ
り、検体中の交差反応物の影響を受けず、ＴＡＴ濃度を
精度良く測定することができ、特に血液凝固傾向の診断
等に有用である。
に特異的なモノクローナル抗体、及びこれを用いる抗ト
ロンビン・アンチトロンビンIII複合体の免疫学的測定
法。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴを特
異的に認識し、かつこれと高い親和性を有するものであ
る。従って、このモノクローナル抗体を用いることによ
り、検体中の交差反応物の影響を受けず、ＴＡＴ濃度を
精度良く測定することができ、特に血液凝固傾向の診断
等に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なモノクローナル
抗体、及びこれを用い、ヒト検体中のトロンビン・アン
チトロンビンIII複合体濃度を精度良く測定することが
でき、血液凝固傾向の診断に有用な免疫学的測定法に関
する。
抗体、及びこれを用い、ヒト検体中のトロンビン・アン
チトロンビンIII複合体濃度を精度良く測定することが
でき、血液凝固傾向の診断に有用な免疫学的測定法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトアンチトロンビンIII（以下、ＡＴI
II という）は、血液凝固系のセリンプロテアーゼの重
要なインヒビターであり、トロンビンを始めとして活性
化されたXII、XI、Ｘ、IX因子の活性を阻害する。ＡＴI
II とセリンプロテアーゼとの反応は、１：１のモル比
で進行し、ＡＴIII のアルギニン残基がセリンプロテア
ーゼの活性中心であるセリン残基とエステル結合して複
合体を形成することによりセリンプロテアーゼの活性を
抑制する。この様な複合体の一つとして、トロンビン・
アンチトロンビンIII複合体（以下、ＴＡＴという）が
挙げられる。ヒトの血液中におけるＴＡＴの増加は、血
液凝固機序の始動、及びその活性化によってトロンビン
又は他の血液凝固系のセリンプロテアーゼが生成された
ことを示すものと考えられている。従って、血液中のＴ
ＡＴの量を測定することにより、血液凝固系の動態の一
端を知り得るものと推察され、それによって血液凝固面
から患者の病態を解明すること、例えば血栓形成あるい
は汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）への病態の進展を
早期に予知し、適切な治療をすることが可能となる。
II という）は、血液凝固系のセリンプロテアーゼの重
要なインヒビターであり、トロンビンを始めとして活性
化されたXII、XI、Ｘ、IX因子の活性を阻害する。ＡＴI
II とセリンプロテアーゼとの反応は、１：１のモル比
で進行し、ＡＴIII のアルギニン残基がセリンプロテア
ーゼの活性中心であるセリン残基とエステル結合して複
合体を形成することによりセリンプロテアーゼの活性を
抑制する。この様な複合体の一つとして、トロンビン・
アンチトロンビンIII複合体（以下、ＴＡＴという）が
挙げられる。ヒトの血液中におけるＴＡＴの増加は、血
液凝固機序の始動、及びその活性化によってトロンビン
又は他の血液凝固系のセリンプロテアーゼが生成された
ことを示すものと考えられている。従って、血液中のＴ
ＡＴの量を測定することにより、血液凝固系の動態の一
端を知り得るものと推察され、それによって血液凝固面
から患者の病態を解明すること、例えば血栓形成あるい
は汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）への病態の進展を
早期に予知し、適切な治療をすることが可能となる。
【０００３】ヒト検体中のＴＡＴを免疫学的に測定する
方法として、抗ＴＡＴneoantigen−ポリクローナル抗体
を、125Ｉで標識したＴＡＴを用いてｉｎｈｉｂｉｔｉ
ｏｎａｓｓａｙすることによりＴＡＴを測定する方法
（Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｌ．Ｌａｕ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２５５，５８８５−５８９３（１９８０））；抗ト
ロンビン−ポリクローナル抗体を固相抗体に用い、抗Ａ
ＴIII −ポリクローナル抗体を酵素標識抗体に用いたサ
ンドイッチ系によるヒト検体中のＴＡＴの測定方法
（Ｈ．Ｐｅｌｚｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ＆ Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５９，１０１−１０６（１９８
８））などが提案されている。更に、Ｈ．Ｐｅｌｚｅｒ
らの方法に準じた、ポリクローナル抗体を用いたサンド
イッチ系のキット（特開平３−４８１５８号公報）が提
案され、商品化されている。
方法として、抗ＴＡＴneoantigen−ポリクローナル抗体
を、125Ｉで標識したＴＡＴを用いてｉｎｈｉｂｉｔｉ
ｏｎａｓｓａｙすることによりＴＡＴを測定する方法
（Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｌ．Ｌａｕ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２５５，５８８５−５８９３（１９８０））；抗ト
ロンビン−ポリクローナル抗体を固相抗体に用い、抗Ａ
ＴIII −ポリクローナル抗体を酵素標識抗体に用いたサ
ンドイッチ系によるヒト検体中のＴＡＴの測定方法
（Ｈ．Ｐｅｌｚｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ＆ Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５９，１０１−１０６（１９８
８））などが提案されている。更に、Ｈ．Ｐｅｌｚｅｒ
らの方法に準じた、ポリクローナル抗体を用いたサンド
イッチ系のキット（特開平３−４８１５８号公報）が提
案され、商品化されている。
【０００４】しかしながら、これらの測定方法は、いず
れもポリクローナル抗体を利用するため、抗体の均一性
に問題がある。すなわち、この均一でない抗体は検体中
に含まれる交差反応物と反応する確率が高く、測定値が
変動しやすいため、これまでの方法は、感度、精度、簡
便性などの点で、現在の医療ニーズに合致するものとは
言い難かった。
れもポリクローナル抗体を利用するため、抗体の均一性
に問題がある。すなわち、この均一でない抗体は検体中
に含まれる交差反応物と反応する確率が高く、測定値が
変動しやすいため、これまでの方法は、感度、精度、簡
便性などの点で、現在の医療ニーズに合致するものとは
言い難かった。
【０００５】かかる欠点を克服するにはモノクローナル
抗体の利用が考えられ、抗ＴＡＴモノクローナル抗体と
しては、固相化ＡＴIII 及び天然のＡＴIII とは反応し
ないセリンプロテアーゼ・ＡＴIII 複合体のＡＴIII の
ネオ抗原に対するモノクローナル抗体（Ｓ．Ａｓａｋｕ
ｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ，９５２，３７−４７（１９８８）及びフラ
ンス特許第２６４５６４７号）及び特開昭６２−１３８
１８７号公報が知られている。ところが、血液等の臨床
検体中のＴＡＴは種々の形態で存在するため、これらの
モノクローナル抗体を使用しても実際に臨床検体中のＴ
ＡＴを正確に測定することはできなかった。
抗体の利用が考えられ、抗ＴＡＴモノクローナル抗体と
しては、固相化ＡＴIII 及び天然のＡＴIII とは反応し
ないセリンプロテアーゼ・ＡＴIII 複合体のＡＴIII の
ネオ抗原に対するモノクローナル抗体（Ｓ．Ａｓａｋｕ
ｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ，９５２，３７−４７（１９８８）及びフラ
ンス特許第２６４５６４７号）及び特開昭６２−１３８
１８７号公報が知られている。ところが、血液等の臨床
検体中のＴＡＴは種々の形態で存在するため、これらの
モノクローナル抗体を使用しても実際に臨床検体中のＴ
ＡＴを正確に測定することはできなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＴＡＴを特異的に認識し、これと親和性が高く臨床
検体中のＴＡＴ測定に有用なモノクローナル抗体、及び
これを用いたＴＡＴの測定方法を提供することにある。
は、ＴＡＴを特異的に認識し、これと親和性が高く臨床
検体中のＴＡＴ測定に有用なモノクローナル抗体、及び
これを用いたＴＡＴの測定方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、Ａ
ＴIII が血液凝固系のセリンプロテアーゼと結合（不可
逆的結合）することによりネイティブなＡＴIII にない
新しい抗原部位が生じる（ネオ抗原）こと、またＡＴII
I がヘパリンと結合（可逆的結合）して構造変化を生じ
ることを利用し、他の条件においてもネオ抗原が生じる
と考え、ＡＴIII を固相化したり、ＡＴIII に抗体を結
合させることによってもセリンプロテアーゼと結合して
生じるネオ抗原と類似したネオ抗原が生じることを見出
した。更に、プロトロンビンにおいても固相化すること
によりα−トロンビンと類似のエピトープが生じること
を見い出した。かかる知見に基づき、モノクローナル抗
体を作成する際に、従来のスクリーニング法に加え、固
相化ＡＴIII や固相化プロトロンビンとも反応を示す抗
体を反応せしめるスクリーニング方法を新たに導入する
ことにより、従来とは異なる反応性を有するモノクロー
ナル抗体が得られ、これを用いれば臨床検体中のＴＡＴ
が正確に定量できることを見出し、本発明を完成するに
至った。
ＴIII が血液凝固系のセリンプロテアーゼと結合（不可
逆的結合）することによりネイティブなＡＴIII にない
新しい抗原部位が生じる（ネオ抗原）こと、またＡＴII
I がヘパリンと結合（可逆的結合）して構造変化を生じ
ることを利用し、他の条件においてもネオ抗原が生じる
と考え、ＡＴIII を固相化したり、ＡＴIII に抗体を結
合させることによってもセリンプロテアーゼと結合して
生じるネオ抗原と類似したネオ抗原が生じることを見出
した。更に、プロトロンビンにおいても固相化すること
によりα−トロンビンと類似のエピトープが生じること
を見い出した。かかる知見に基づき、モノクローナル抗
体を作成する際に、従来のスクリーニング法に加え、固
相化ＡＴIII や固相化プロトロンビンとも反応を示す抗
体を反応せしめるスクリーニング方法を新たに導入する
ことにより、従来とは異なる反応性を有するモノクロー
ナル抗体が得られ、これを用いれば臨床検体中のＴＡＴ
が正確に定量できることを見出し、本発明を完成するに
至った。
【０００８】すなわち、本発明は、遊離のプロトロンビ
ンとは反応せず；遊離及び固相化したトロンビン・アン
チトロンビンIII複合体、遊離のトロンビン並びに固相
化したプロトロンビンの三者と反応する抗トロンビン・
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を提供
するものである。
ンとは反応せず；遊離及び固相化したトロンビン・アン
チトロンビンIII複合体、遊離のトロンビン並びに固相
化したプロトロンビンの三者と反応する抗トロンビン・
アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を提供
するものである。
【０００９】また、本発明は、遊離のアンチトロンビン
IIIとは反応せず；遊離及び固相化したトロンビン・ア
ンチトロンビンIII複合体と反応し；セリンプロテアー
ゼと反応したアンチトロンビンIII、固相化したアンチ
トロンビンIII、及び抗アンチトロンビンIIIモノクロー
ナル抗体が反応したアンチトロンビンIIIに共通して生
じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応する抗トロ
ンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗
体を提供するものである。
IIIとは反応せず；遊離及び固相化したトロンビン・ア
ンチトロンビンIII複合体と反応し；セリンプロテアー
ゼと反応したアンチトロンビンIII、固相化したアンチ
トロンビンIII、及び抗アンチトロンビンIIIモノクロー
ナル抗体が反応したアンチトロンビンIIIに共通して生
じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応する抗トロ
ンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗
体を提供するものである。
【００１０】また、本発明は、遊離のアンチトロンビン
IIIとは反応せず；固相化したトロンビン・アンチトロ
ンビンIII複合体との反応性が、遊離のトロンビン・ア
ンチトロンビンIII複合体との反応性より強い抗トロン
ビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を提供するものである。
IIIとは反応せず；固相化したトロンビン・アンチトロ
ンビンIII複合体との反応性が、遊離のトロンビン・ア
ンチトロンビンIII複合体との反応性より強い抗トロン
ビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体
を提供するものである。
【００１１】更に、本発明は、上記モノクローナル抗体
の製造法及びこれを利用したＴＡＴの免疫学的測定法を
提供するものである。
の製造法及びこれを利用したＴＡＴの免疫学的測定法を
提供するものである。
【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴで
免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫
細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生さ
れる。
免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫
細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生さ
れる。
【００１３】免疫原として用いられるＴＡＴは、トロン
ビンとＡＴIII を結合させることにより作成される。こ
こで用いられるトロンビンとＡＴIII は、通常の市販さ
れているものであればいずれでも使用することができる
が、市販のトロンビン製剤には安定化剤としてタンパク
質が多く含まれるため、陽イオン交換樹脂やアフィニテ
ィークロマトグラフィー等により精製して得られるα−
トロンビンを使用するのが好ましい。トロンビンとＡＴ
III は、１：１〜１：５のモル比で混合し、結合したＴ
ＡＴはカラムクロマトグラフィー等で精製して用いるの
が好ましい。
ビンとＡＴIII を結合させることにより作成される。こ
こで用いられるトロンビンとＡＴIII は、通常の市販さ
れているものであればいずれでも使用することができる
が、市販のトロンビン製剤には安定化剤としてタンパク
質が多く含まれるため、陽イオン交換樹脂やアフィニテ
ィークロマトグラフィー等により精製して得られるα−
トロンビンを使用するのが好ましい。トロンビンとＡＴ
III は、１：１〜１：５のモル比で混合し、結合したＴ
ＡＴはカラムクロマトグラフィー等で精製して用いるの
が好ましい。
【００１４】次に、得られたＴＡＴを免疫原として用
い、常法により、ハイブリドーマ細胞を調製する。すな
わち、まず免疫原としてのＴＡＴを哺乳動物に注射して
免疫する。ここで免疫する哺乳動物は特に制限されず、
後の操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適
合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラッ
トなどが具体例として挙げられ、ＢＡＬＢ／ｃマウスが
一般的である。
い、常法により、ハイブリドーマ細胞を調製する。すな
わち、まず免疫原としてのＴＡＴを哺乳動物に注射して
免疫する。ここで免疫する哺乳動物は特に制限されず、
後の操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適
合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラッ
トなどが具体例として挙げられ、ＢＡＬＢ／ｃマウスが
一般的である。
【００１５】上記の免疫原を哺乳動物に免疫する方法と
しては特に制限されず、例えばＴＡＴ単独又は２種以上
を組合わせ、これを哺乳動物に皮下注射、腹腔内注射、
血管内注射、筋肉注射、脾臓内注射などによる方法や、
飼料又は水に加え、これと共に経口的に投与、免疫する
方法等の通常の方法が採用できる。また、免疫する際
に、必要に応じてアジュバントと併用することもでき
る。
しては特に制限されず、例えばＴＡＴ単独又は２種以上
を組合わせ、これを哺乳動物に皮下注射、腹腔内注射、
血管内注射、筋肉注射、脾臓内注射などによる方法や、
飼料又は水に加え、これと共に経口的に投与、免疫する
方法等の通常の方法が採用できる。また、免疫する際
に、必要に応じてアジュバントと併用することもでき
る。
【００１６】次に、免疫動物から採取した脾臓細胞をマ
ウス骨髄腫細胞と融合させる。マウス骨髄腫細胞として
は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ-）やチミジンキナーゼ
欠損（ＴＫ-）等の適切なマーカーを有するものが好ま
しい。融合は、公知の手法に準じて行うことができる。
また、融合促進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を用いることがで
きる。脾臓細胞と骨髄腫細胞との混合比は１：１〜１
０：１が好ましい。場合によっては、電気融合法等によ
り細胞融合を行うこともできる。
ウス骨髄腫細胞と融合させる。マウス骨髄腫細胞として
は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ-）やチミジンキナーゼ
欠損（ＴＫ-）等の適切なマーカーを有するものが好ま
しい。融合は、公知の手法に準じて行うことができる。
また、融合促進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を用いることがで
きる。脾臓細胞と骨髄腫細胞との混合比は１：１〜１
０：１が好ましい。場合によっては、電気融合法等によ
り細胞融合を行うこともできる。
【００１７】細胞融合した後、通常の選択用培地で培養
することによりハイブリドーマを選択的に得ることがで
きる。ハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなった
ところで目的とする抗体を産生する株の検索及びクロー
ニングを行う。抗原に特異的な抗体の検索は、一般に抗
体の検出に用いられている方法、例えば、ＥＬＩＳＡ
法、ＲＩＡ法等により行うことができる。また、選択さ
れたハイブリドーマを単クローン化するには、例えば限
界希釈法や軟寒天法により行うことができる。この際、
フィーダーとしてマウス胸腺細胞や腹腔マクロファー
ジ、あるいはこれらと同様の効果を有する公知の添加剤
を用いることが好ましい。
することによりハイブリドーマを選択的に得ることがで
きる。ハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなった
ところで目的とする抗体を産生する株の検索及びクロー
ニングを行う。抗原に特異的な抗体の検索は、一般に抗
体の検出に用いられている方法、例えば、ＥＬＩＳＡ
法、ＲＩＡ法等により行うことができる。また、選択さ
れたハイブリドーマを単クローン化するには、例えば限
界希釈法や軟寒天法により行うことができる。この際、
フィーダーとしてマウス胸腺細胞や腹腔マクロファー
ジ、あるいはこれらと同様の効果を有する公知の添加剤
を用いることが好ましい。
【００１８】得られた単クローン化ハイブリドーマを用
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の腹腔内で培養すればよい。ここで用いられる培地と
しては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれば特
に制限されず、例えば牛胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ
−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプト
マイシン）を含むＲＰＭＩ １６４０培地等が好適であ
る。培養は、例えば上記ハイブリドーマを１０ 4〜１０5
個／ml濃度で培地に加え、５％炭酸ガス濃度、３７℃の
条件下で２〜４日間程度行うのが好ましい。この培養に
より得られた上清を遠心分離等すれば、本発明のモノク
ローナル抗体を得ることができる。一方、腹腔内培養
は、ハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水
を回収すればよい。
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の腹腔内で培養すればよい。ここで用いられる培地と
しては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれば特
に制限されず、例えば牛胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ
−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプト
マイシン）を含むＲＰＭＩ １６４０培地等が好適であ
る。培養は、例えば上記ハイブリドーマを１０ 4〜１０5
個／ml濃度で培地に加え、５％炭酸ガス濃度、３７℃の
条件下で２〜４日間程度行うのが好ましい。この培養に
より得られた上清を遠心分離等すれば、本発明のモノク
ローナル抗体を得ることができる。一方、腹腔内培養
は、ハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水
を回収すればよい。
【００１９】このようにして得られた培養上清中の本発
明モノクローナル抗体はこのままでも使用可能である
が、例えば硫安沈澱による分画法、イオン交換クロマト
グラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗ＩｇＧ抗体カ
ラム等によって精製して用いることがより好ましい。ま
た、得られたモノクローナル抗体の特異性は、例えばウ
ェスタンブロッティング法、遊離の抗原を用いたＥＬＩ
ＳＡ、固相化抗原を用いたＥＬＩＳＡ、抗体結合抗原を
用いたＥＬＩＳＡなどにより、確認することができる。
明モノクローナル抗体はこのままでも使用可能である
が、例えば硫安沈澱による分画法、イオン交換クロマト
グラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗ＩｇＧ抗体カ
ラム等によって精製して用いることがより好ましい。ま
た、得られたモノクローナル抗体の特異性は、例えばウ
ェスタンブロッティング法、遊離の抗原を用いたＥＬＩ
ＳＡ、固相化抗原を用いたＥＬＩＳＡ、抗体結合抗原を
用いたＥＬＩＳＡなどにより、確認することができる。
【００２０】本発明モノクローナル抗体は、その反応性
により次の三種に大別することができる。 （１）遊離のプロトロンビンと反応せず；遊離及び固相
化したＴＡＴ、遊離のトロンビン並びに固相化したプロ
トロンビンと反応するモノクローナル抗体。このモノク
ローナル抗体には、後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６
２０２、２６２０３及び２６２０７が含まれる。より具
体的には、遊離のプロトロンビン、遊離のＡＴIII 、抗
ＡＴIII モノクローナル抗体とＡＴIII との結合物、固
相化したＡＴIII 、及び固相化したセリンプロテアーゼ
（活性化血液凝固第１０因子等）と反応したＡＴIII と
反応せず；遊離のＴＡＴ、固相化したＴＡＴ、抗ＡＴII
I モノクローナル抗体と反応したＴＡＴ、遊離のトロン
ビン、固相化したトロンビン及び固相化したプロトロン
ビンと反応するモノクローナル抗体である。
により次の三種に大別することができる。 （１）遊離のプロトロンビンと反応せず；遊離及び固相
化したＴＡＴ、遊離のトロンビン並びに固相化したプロ
トロンビンと反応するモノクローナル抗体。このモノク
ローナル抗体には、後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６
２０２、２６２０３及び２６２０７が含まれる。より具
体的には、遊離のプロトロンビン、遊離のＡＴIII 、抗
ＡＴIII モノクローナル抗体とＡＴIII との結合物、固
相化したＡＴIII 、及び固相化したセリンプロテアーゼ
（活性化血液凝固第１０因子等）と反応したＡＴIII と
反応せず；遊離のＴＡＴ、固相化したＴＡＴ、抗ＡＴII
I モノクローナル抗体と反応したＴＡＴ、遊離のトロン
ビン、固相化したトロンビン及び固相化したプロトロン
ビンと反応するモノクローナル抗体である。
【００２１】（２）遊離のアンチトロンビンIIIとは反
応せず；遊離及び固相化したＴＡＴと反応し；セリンプ
ロテアーゼと反応したＡＴIII 、固相化したＡＴIII 、
及び抗ＡＴIII モノクローナル抗体が反応したＡＴIII
に共通して生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノク
ローナル抗体。このモノクローナル抗体には、後記モノ
クローナル抗体Ｎｏ．２６２０５、２６２０８、２６２
０９、２６２１４、２６２１６、２６２１８及び２６２
１９が含まれる。より具体的には、遊離のＡＴIII 、遊
離のトロンビン、遊離のプロトロンビン、固相化したト
ロンビン及び固相化したプロトロンビンと反応せず；遊
離のＴＡＴ、固相化したＴＡＴ、抗ＡＴIII モノクロー
ナル抗体と反応したＴＡＴ、固相化したＡＴIII 、固相
化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴIII 、及び抗
ＡＴIII モノクローナル抗体が反応したＡＴIII と反応
するモノクローナル抗体である。
応せず；遊離及び固相化したＴＡＴと反応し；セリンプ
ロテアーゼと反応したＡＴIII 、固相化したＡＴIII 、
及び抗ＡＴIII モノクローナル抗体が反応したＡＴIII
に共通して生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノク
ローナル抗体。このモノクローナル抗体には、後記モノ
クローナル抗体Ｎｏ．２６２０５、２６２０８、２６２
０９、２６２１４、２６２１６、２６２１８及び２６２
１９が含まれる。より具体的には、遊離のＡＴIII 、遊
離のトロンビン、遊離のプロトロンビン、固相化したト
ロンビン及び固相化したプロトロンビンと反応せず；遊
離のＴＡＴ、固相化したＴＡＴ、抗ＡＴIII モノクロー
ナル抗体と反応したＴＡＴ、固相化したＡＴIII 、固相
化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴIII 、及び抗
ＡＴIII モノクローナル抗体が反応したＡＴIII と反応
するモノクローナル抗体である。
【００２２】（３）遊離のＡＴIII とは反応せず、固相
化したＴＡＴとの反応性が遊離のＴＡＴの反応性より強
いモノクローナル抗体。このモノクローナル抗体には、
後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６２０６、２６２１０
及び２６２１３が含まれる。より具体的には、遊離のＴ
ＡＴ、遊離のＡＴIII 、遊離のトロンビン、遊離のプロ
トロンビン、固相化したＡＴIII 、固相化したトロンビ
ン、固相化したプロトロンビン及び抗ＡＴIIIモノクロ
ーナル抗体が反応したＡＴIII と反応せず；固相化した
ＴＡＴ、固相化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴ
III 及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が反応したＴＡ
Ｔと反応するモノクローナル抗体である。
化したＴＡＴとの反応性が遊離のＴＡＴの反応性より強
いモノクローナル抗体。このモノクローナル抗体には、
後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６２０６、２６２１０
及び２６２１３が含まれる。より具体的には、遊離のＴ
ＡＴ、遊離のＡＴIII 、遊離のトロンビン、遊離のプロ
トロンビン、固相化したＡＴIII 、固相化したトロンビ
ン、固相化したプロトロンビン及び抗ＡＴIIIモノクロ
ーナル抗体が反応したＡＴIII と反応せず；固相化した
ＴＡＴ、固相化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴ
III 及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が反応したＴＡ
Ｔと反応するモノクローナル抗体である。
【００２３】本発明のモノクローナル抗体の１種又は２
種以上を組合わせて用い、通常の免疫学的測定法を実施
すれば、検体中のＴＡＴを精度良く定量することができ
る。
種以上を組合わせて用い、通常の免疫学的測定法を実施
すれば、検体中のＴＡＴを精度良く定量することができ
る。
【００２４】本発明のＴＡＴ測定法は、前記本発明モノ
クローナル抗体の２種以上を組合わせ、被検体と接触さ
せて免疫測定すればよいが、抗体とＡＴIII 、プロトロ
ンビン等との反応による誤差をなくし、正確にＴＡＴを
測定するには、異なる反応性を有するモノクローナル抗
体を組合わせるのが好ましい。すなわち、前記（１）、
（２）及び（３）のモノクローナル抗体並びに遊離のＡ
ＴIII と反応せず、セリンプロテアーゼと反応したＡＴ
III に生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクロー
ナル抗体から選ばれるモノクローナル抗体の２種以上を
任意に組合わせて用いるのが好ましい。このうち、特に
前記（１）のモノクローナル抗体と、前記（２）及び
（３）のモノクローナル抗体並びに遊離のＡＴIII と反
応せず、セリンプロテアーゼと反応したＡＴIII に生じ
るＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクローナル抗体か
ら選ばれた１種以上とを組合わせて用いるのが好まし
い。ここで、遊離のＡＴIII と反応せず、セリンプロテ
アーゼと反応したＡＴIII に生じるＡＴIII のネオ抗原
と反応するモノクローナル抗体としては、後記モノクロ
ーナル抗体Ｎｏ．２６２１１、２６２１２、２６２１７
及び２６２２０が含まれる。より具体的には、遊離のＡ
ＴIII 、遊離のトロンビン、遊離のプロトロンビン、固
相化したＡＴIII 、固相化したトロンビン、固相化した
プロトロンビン及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体と反
応したＡＴIII と反応せず；遊離のＴＡＴ、固相化した
ＴＡＴ、固相化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴ
III 及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が反応したＴＡ
Ｔと強く反応するモノクローナル抗体である。
クローナル抗体の２種以上を組合わせ、被検体と接触さ
せて免疫測定すればよいが、抗体とＡＴIII 、プロトロ
ンビン等との反応による誤差をなくし、正確にＴＡＴを
測定するには、異なる反応性を有するモノクローナル抗
体を組合わせるのが好ましい。すなわち、前記（１）、
（２）及び（３）のモノクローナル抗体並びに遊離のＡ
ＴIII と反応せず、セリンプロテアーゼと反応したＡＴ
III に生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクロー
ナル抗体から選ばれるモノクローナル抗体の２種以上を
任意に組合わせて用いるのが好ましい。このうち、特に
前記（１）のモノクローナル抗体と、前記（２）及び
（３）のモノクローナル抗体並びに遊離のＡＴIII と反
応せず、セリンプロテアーゼと反応したＡＴIII に生じ
るＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクローナル抗体か
ら選ばれた１種以上とを組合わせて用いるのが好まし
い。ここで、遊離のＡＴIII と反応せず、セリンプロテ
アーゼと反応したＡＴIII に生じるＡＴIII のネオ抗原
と反応するモノクローナル抗体としては、後記モノクロ
ーナル抗体Ｎｏ．２６２１１、２６２１２、２６２１７
及び２６２２０が含まれる。より具体的には、遊離のＡ
ＴIII 、遊離のトロンビン、遊離のプロトロンビン、固
相化したＡＴIII 、固相化したトロンビン、固相化した
プロトロンビン及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体と反
応したＡＴIII と反応せず；遊離のＴＡＴ、固相化した
ＴＡＴ、固相化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴ
III 及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が反応したＴＡ
Ｔと強く反応するモノクローナル抗体である。
【００２５】免疫学的測定法としては特に制限されず、
例えばオクタロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁
法、酵素免疫測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイ
ムノアッセイ、フロロイムノアッセイなどを利用するこ
とができる。これらのうち、酵素免疫測定法を使用する
場合には、例えば抗ＴＡＴモノクローナル抗体のいずれ
かを適当な緩衝液中で不溶性担体に固定化して不溶化抗
体とし、別の抗ＴＡＴモノクローナル抗体を酵素で標識
し、これらを被検体と反応させ、第二の抗体に結合させ
た酵素の活性を測ることにより、検体中のＴＡＴを測定
することができる。上記で使用する不溶性担体として
は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなど
の各種合成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架
橋デキストラン、ポリサッカライド）などが好ましく、
これらの担体は球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは
試験管、マイクロプレートなどの形態で用いることがで
きる。なお、不溶化抗体作成の条件としては、球状、棒
状、試験管、マイクロプレートの形態の場合及び微粒子
の形態の場合、抗体濃度は各々１〜１０μg ／ml及び１
〜１０mg／ml、緩衝溶液はリン酸緩衝液、グリシン緩衝
液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などのpH７〜１０の中性
からアルカリ性、室温又は４℃で１時間〜７２時間で調
製することが好ましい。
例えばオクタロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁
法、酵素免疫測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイ
ムノアッセイ、フロロイムノアッセイなどを利用するこ
とができる。これらのうち、酵素免疫測定法を使用する
場合には、例えば抗ＴＡＴモノクローナル抗体のいずれ
かを適当な緩衝液中で不溶性担体に固定化して不溶化抗
体とし、別の抗ＴＡＴモノクローナル抗体を酵素で標識
し、これらを被検体と反応させ、第二の抗体に結合させ
た酵素の活性を測ることにより、検体中のＴＡＴを測定
することができる。上記で使用する不溶性担体として
は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなど
の各種合成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架
橋デキストラン、ポリサッカライド）などが好ましく、
これらの担体は球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは
試験管、マイクロプレートなどの形態で用いることがで
きる。なお、不溶化抗体作成の条件としては、球状、棒
状、試験管、マイクロプレートの形態の場合及び微粒子
の形態の場合、抗体濃度は各々１〜１０μg ／ml及び１
〜１０mg／ml、緩衝溶液はリン酸緩衝液、グリシン緩衝
液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などのpH７〜１０の中性
からアルカリ性、室温又は４℃で１時間〜７２時間で調
製することが好ましい。
【００２６】また、使用する酵素標識抗体は公知の方法
によって作成することができ、例えば中根らの方法（Ｎ
ａｋａｎｅ Ｐ．Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ，２２，１０８４−１０８９，１
９７４）あるいは石川らの方法（マレイミド法：「酵素
免疫測定法 第３版」医学書院）などに従い、断片化し
ていない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは必
要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してＦ
（ａｂ’）2 、又はＦａｂ’とした後、酵素で標識する
ことができる。標識に使用する酵素としては、ペルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。
によって作成することができ、例えば中根らの方法（Ｎ
ａｋａｎｅ Ｐ．Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ，２２，１０８４−１０８９，１
９７４）あるいは石川らの方法（マレイミド法：「酵素
免疫測定法 第３版」医学書院）などに従い、断片化し
ていない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは必
要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してＦ
（ａｂ’）2 、又はＦａｂ’とした後、酵素で標識する
ことができる。標識に使用する酵素としては、ペルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。
【００２７】標識物質が酵素である場合には、その活性
を測定するために基質、及び必要により発色剤が用いら
れる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、
基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニ
レンジアミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベン
チジン、２，２′−アジノジ−〔３−エチルベンズチア
ゾリンスルホン酸〕アンモニウム塩等；酵素としてアル
カリフォスファターゼを用いる場合には、基質として、
ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、３−（４−メトキ
シスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシク
ロ−〔３．３．１．１3,7〕デカン｝−４−イル）フェ
ニルフォスフェート：ＡＭＰＰＤ等；酵素としてβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼを用いる場合には、基質として、β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等；酵素としてグルコ
ースオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼ
の共存下で基質として、β−Ｄ−グルコース、発色剤と
してペルオキシダーゼの発色剤を用いることができる。
を測定するために基質、及び必要により発色剤が用いら
れる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、
基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニ
レンジアミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベン
チジン、２，２′−アジノジ−〔３−エチルベンズチア
ゾリンスルホン酸〕アンモニウム塩等；酵素としてアル
カリフォスファターゼを用いる場合には、基質として、
ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、３−（４−メトキ
シスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシク
ロ−〔３．３．１．１3,7〕デカン｝−４−イル）フェ
ニルフォスフェート：ＡＭＰＰＤ等；酵素としてβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼを用いる場合には、基質として、β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等；酵素としてグルコ
ースオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼ
の共存下で基質として、β−Ｄ−グルコース、発色剤と
してペルオキシダーゼの発色剤を用いることができる。
【００２８】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴ
を特異的に認識し、かつこれと高い親和性を有するもの
である。従って、このモノクローナル抗体を用いること
により、検体中の交差反応物の影響を受けず、ＴＡＴ濃
度を精度良く測定することができ、特に血液凝固傾向の
診断等に有用である。
を特異的に認識し、かつこれと高い親和性を有するもの
である。従って、このモノクローナル抗体を用いること
により、検体中の交差反応物の影響を受けず、ＴＡＴ濃
度を精度良く測定することができ、特に血液凝固傾向の
診断等に有用である。
【００２９】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】実施例１ （１）ＴＡＴの調製：市販のトロンビン製剤（ミドリ十
字社製）には安定化剤としてのタンパク質が多く含まれ
るため、これを精製した。すなわち、α−トロンビン５
００００ｕｎｉｔｓを５０mlの５０mMリン酸緩衝液（pH
７．０）（以下、リン酸緩衝液と略す）に溶かしたもの
をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×１１cm）に
アプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含むリン
酸緩衝液の直線濃度勾配（０−０．４Ｍ ＮａＣｌ）で
溶出した。α−トロンビン活性は、合成基質Ｓ−２２３
８（第一化学薬品社製）を用い、４０５nmの吸光度の増
加で確認し、活性ピークをプールした。これをＢｅｎｚ
ａｍｉｄｉｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラム（２
×６cm）にアプライし、吸着したタンパク質を０−０．
１Ｍ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含
有リン酸緩衝液を用いた直線濃度勾配にて溶出した。そ
して、得られたα−トロンビンは０．１Ｍ ＮａＣｌを
含む２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）に対して透析
した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度検定を行い、−８０℃
で保存した。α−トロンビンは、−８０℃で保存するこ
とにより自己分解が防げる。こうして得たα−トロンビ
ンと市販のＡＴIII 製剤（ヘキスト社製）をpH７．４の
条件でモル比１：１．５で混合し、３７℃で１０分間保
温した。反応生成物中にはＴＡＴ、α−トロンビン及び
ＴＡＴ分解物が残存するので、これをＨｅｐａｒｉｎ−
ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２×６cm）にアプライし
た。吸着したタンパク質を０．１−２Ｍ ＮａＣｌを含
む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）で溶出し、Ｔ
ＡＴ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、回収した。
こうして得られた精製ＴＡＴは、モノクローナル抗体作
成の免疫原及びスクリーニングに使用するのに充分な純
度を有していた。なお、精製ＴＡＴは、自己分解を防ぐ
ため、−８０℃で保存した。精製したＴＡＴ濃度は、バ
イオ−ラッド社から市販されているブラッドフォード法
に基づく比色定量法（プロテインアッセイ）により、Ｂ
ＳＡを標準品として定量した。その結果、ＴＡＴ濃度は
３５μg ／mlであり、この値をＥＬＩＳＡ、ＬＴＩＡの
測定に利用した。
字社製）には安定化剤としてのタンパク質が多く含まれ
るため、これを精製した。すなわち、α−トロンビン５
００００ｕｎｉｔｓを５０mlの５０mMリン酸緩衝液（pH
７．０）（以下、リン酸緩衝液と略す）に溶かしたもの
をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×１１cm）に
アプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含むリン
酸緩衝液の直線濃度勾配（０−０．４Ｍ ＮａＣｌ）で
溶出した。α−トロンビン活性は、合成基質Ｓ−２２３
８（第一化学薬品社製）を用い、４０５nmの吸光度の増
加で確認し、活性ピークをプールした。これをＢｅｎｚ
ａｍｉｄｉｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラム（２
×６cm）にアプライし、吸着したタンパク質を０−０．
１Ｍ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ及び０．５Ｍ ＮａＣｌ含
有リン酸緩衝液を用いた直線濃度勾配にて溶出した。そ
して、得られたα−トロンビンは０．１Ｍ ＮａＣｌを
含む２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）に対して透析
した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度検定を行い、−８０℃
で保存した。α−トロンビンは、−８０℃で保存するこ
とにより自己分解が防げる。こうして得たα−トロンビ
ンと市販のＡＴIII 製剤（ヘキスト社製）をpH７．４の
条件でモル比１：１．５で混合し、３７℃で１０分間保
温した。反応生成物中にはＴＡＴ、α−トロンビン及び
ＴＡＴ分解物が残存するので、これをＨｅｐａｒｉｎ−
ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２×６cm）にアプライし
た。吸着したタンパク質を０．１−２Ｍ ＮａＣｌを含
む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）で溶出し、Ｔ
ＡＴ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、回収した。
こうして得られた精製ＴＡＴは、モノクローナル抗体作
成の免疫原及びスクリーニングに使用するのに充分な純
度を有していた。なお、精製ＴＡＴは、自己分解を防ぐ
ため、−８０℃で保存した。精製したＴＡＴ濃度は、バ
イオ−ラッド社から市販されているブラッドフォード法
に基づく比色定量法（プロテインアッセイ）により、Ｂ
ＳＡを標準品として定量した。その結果、ＴＡＴ濃度は
３５μg ／mlであり、この値をＥＬＩＳＡ、ＬＴＩＡの
測定に利用した。
【００３１】（２）免疫：上記方法により精製したＴＡ
Ｔについて、２８０nmの吸光度における１００mOD 量を
１回の免疫に使用した。初回免疫はフロインドの完全ア
ジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全ア
ジュバントを使用した。ＴＡＴ１００μlとフロインド
のアジュバント１００μl を混合し、得られたエマルジ
ョン２００μl を１回の免疫につき、１匹のＢＡＬＢ／
ｃ♂マウスの腹腔に注射を行い、４回免疫を２週間間隔
で繰り返した。また、フロインドのアジュバントの他、
フナコシより市販されているリビ−アジュバントシステ
ムの変法により免疫を行った。この免疫エマルジョンの
作成は次の操作により行った。すなわち、ポッターホモ
ジナイザーを使用し、グラインダーチューブに精製ＴＡ
Ｔ１００mOD 量を加え、窒素を吹き付けて乾固させ、更
に、クロロホルム：メタノール＝４：１の混合液に溶解
しているトレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及びモノ
リン酸リピッドＡ（ＭＰＬ）を加え、窒素を吹き付け乾
固させた。本チューブにスクアレン４μl を加え、スリ
ーワンモーターにセットしたテフロン棒にて抗原、アジ
ュバント及びスクアレンを１２００rpm で３分間混合し
た。その後、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０及び０．７２
％ ＮａＣｌを含む１３mMリン酸緩衝液（pH７．２）を
２００μl 加え、１２００rpm で４分間混合し、免疫エ
マルジョンを作成した。得られたエマルジョン２００μ
l を１回の免疫につき１匹のＢＡＬＢ／ｃ♂マウス腹腔
に注射し、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。なお、
初回免疫ではＴＤＭ５０μg 及びＭＰＬ５０μg を、追
加免疫ではＴＤＭを５０μg 及びＭＰＬ５μg を使用し
た。これらの２方法により免疫したマウスの眼底静脈か
ら採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗体価の高
いマウスを選んで細胞融合に使用した。
Ｔについて、２８０nmの吸光度における１００mOD 量を
１回の免疫に使用した。初回免疫はフロインドの完全ア
ジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全ア
ジュバントを使用した。ＴＡＴ１００μlとフロインド
のアジュバント１００μl を混合し、得られたエマルジ
ョン２００μl を１回の免疫につき、１匹のＢＡＬＢ／
ｃ♂マウスの腹腔に注射を行い、４回免疫を２週間間隔
で繰り返した。また、フロインドのアジュバントの他、
フナコシより市販されているリビ−アジュバントシステ
ムの変法により免疫を行った。この免疫エマルジョンの
作成は次の操作により行った。すなわち、ポッターホモ
ジナイザーを使用し、グラインダーチューブに精製ＴＡ
Ｔ１００mOD 量を加え、窒素を吹き付けて乾固させ、更
に、クロロホルム：メタノール＝４：１の混合液に溶解
しているトレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及びモノ
リン酸リピッドＡ（ＭＰＬ）を加え、窒素を吹き付け乾
固させた。本チューブにスクアレン４μl を加え、スリ
ーワンモーターにセットしたテフロン棒にて抗原、アジ
ュバント及びスクアレンを１２００rpm で３分間混合し
た。その後、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０及び０．７２
％ ＮａＣｌを含む１３mMリン酸緩衝液（pH７．２）を
２００μl 加え、１２００rpm で４分間混合し、免疫エ
マルジョンを作成した。得られたエマルジョン２００μ
l を１回の免疫につき１匹のＢＡＬＢ／ｃ♂マウス腹腔
に注射し、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。なお、
初回免疫ではＴＤＭ５０μg 及びＭＰＬ５０μg を、追
加免疫ではＴＤＭを５０μg 及びＭＰＬ５μg を使用し
た。これらの２方法により免疫したマウスの眼底静脈か
ら採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗体価の高
いマウスを選んで細胞融合に使用した。
【００３２】（３）細胞融合：４回目の免疫から４週間
後、生理食塩水２００μl に希釈した精製ＴＡＴ１００
mOD 量をマウス腹腔に注射し、その３日後にマウスから
脾臓を摘出した。摘出した脾臓をＲＰＭＩ １６４０培
地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよ
くほぐし、脾細胞を回収した。これを１５００rpm で５
分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心し
た。最終的に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む同培地
２mlを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数
は、アクリジンオレンジ／臭化エチジュウム溶液（各
０．１mgをＰＢＳ１mlに溶解）と懸濁液を１：１で混
ぜ、蛍光顕微鏡下で数えた。生きた脾細胞１０8個と予
め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミエ
ローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４の１０7個を混合し
た後、１５００rpm で５分遠心した。上清を除去後、細
胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８
ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇ
を精製水１ｌに溶解）にて懸濁させ、１５００rpm で５
分間遠心を行い、細胞の洗浄を行った。同洗浄を繰り返
した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１
５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mlを徐々に加え、静かに
１分間攪拌した。これに、ＧＫＮ溶液１０mlを徐々に静
かに加えて反応を停止させ、１５００rpm で５分間遠心
した。得られた細胞を、３０mlの１５％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ１６４０に浮遊させ、ＨＡＴ培地（１０-4Ｍヒポ
キサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、１．５×１
０-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４
０培地）及びフィーダー細胞が含まれる（１ウエル当り
２００μl ）９６穴マイクロカルチャープレート３枚に
１ウエル当り０．１mlづつ分注し、３７℃、５％炭酸ガ
ス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエルで融合
細胞の増殖を確認した。
後、生理食塩水２００μl に希釈した精製ＴＡＴ１００
mOD 量をマウス腹腔に注射し、その３日後にマウスから
脾臓を摘出した。摘出した脾臓をＲＰＭＩ １６４０培
地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよ
くほぐし、脾細胞を回収した。これを１５００rpm で５
分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心し
た。最終的に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む同培地
２mlを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数
は、アクリジンオレンジ／臭化エチジュウム溶液（各
０．１mgをＰＢＳ１mlに溶解）と懸濁液を１：１で混
ぜ、蛍光顕微鏡下で数えた。生きた脾細胞１０8個と予
め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミエ
ローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４の１０7個を混合し
た後、１５００rpm で５分遠心した。上清を除去後、細
胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８
ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇ
を精製水１ｌに溶解）にて懸濁させ、１５００rpm で５
分間遠心を行い、細胞の洗浄を行った。同洗浄を繰り返
した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１
５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mlを徐々に加え、静かに
１分間攪拌した。これに、ＧＫＮ溶液１０mlを徐々に静
かに加えて反応を停止させ、１５００rpm で５分間遠心
した。得られた細胞を、３０mlの１５％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ１６４０に浮遊させ、ＨＡＴ培地（１０-4Ｍヒポ
キサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、１．５×１
０-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４
０培地）及びフィーダー細胞が含まれる（１ウエル当り
２００μl ）９６穴マイクロカルチャープレート３枚に
１ウエル当り０．１mlづつ分注し、３７℃、５％炭酸ガ
ス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエルで融合
細胞の増殖を確認した。
【００３３】（４）抗ＴＡＴ抗体産生ハイブリドーマの
選択とクローン化：培養上清中の抗ＴＡＴ抗体の存在の
有無をＥＬＩＳＡ法で測定した。すなわち、精製ＴＡＴ
（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）、α−トロン
ビン（２μg ／ml）、プロトロンビン（２μg ／ml）を
固相化した９６穴マイクロプレート、更に、抗ＡＴIII
モノクローナル抗体（Ｆ（ａｂ’）２：５mOD ）を固相
化した９６穴マイクロプレートにＴＡＴ（０．５mOD
）、ＡＴIII （２μg ／ml）を結合させた９６穴マイ
クロプレート、すなわち６種類のプレートを使用してス
クリーニングを行った。
選択とクローン化：培養上清中の抗ＴＡＴ抗体の存在の
有無をＥＬＩＳＡ法で測定した。すなわち、精製ＴＡＴ
（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）、α−トロン
ビン（２μg ／ml）、プロトロンビン（２μg ／ml）を
固相化した９６穴マイクロプレート、更に、抗ＡＴIII
モノクローナル抗体（Ｆ（ａｂ’）２：５mOD ）を固相
化した９６穴マイクロプレートにＴＡＴ（０．５mOD
）、ＡＴIII （２μg ／ml）を結合させた９６穴マイ
クロプレート、すなわち６種類のプレートを使用してス
クリーニングを行った。
【００３４】具体的には、ＴＡＴ又はモノクローナル抗
体の各濃度を、０．７２％ ＮａＣｌを含む１３mMリン
酸緩衝液（pH７．２：ＰＢＳ）で希釈し、５０μl ／ウ
エルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で
一夜放置した。これを、１％牛血清アルブミン及び０．
０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（pH７．２：ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。更に、各抗原を結合した
９６穴マイクロプレートは、ＢＳＡ−ＰＢＳで各抗原を
希釈し、５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレ
ートに分注し、４℃で一夜放置し、スクリーニング用の
各プレートを調製した。各プレートの各ウエルに培養上
清５０μl を加え、３７℃で１時間保温した。次いでＰ
ＢＳで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に
希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆ
ｃ部位に特異的，ヤギ由来）を５０μl 加え、３７℃で
１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄した後、０．
２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水
素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）を５０
μl ／ウエル加え、室温で３０分反応させた後、４．５
Ｍ硫酸を５０μl ／ウエル加えて反応を停止させた。こ
の反応で、５５０nmにおける吸光度が高い結果を出した
上清を得たウエルを選択した。なお、固相化したモノク
ローナル抗体は、ＥＬＩＳＡに用いたペルオキシダーゼ
標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由
来）が反応しない様にペプシン処理によりＦ（ａｂ’）
２とし、未反応のＩｇＧ画分を除くため、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌ（陰イオン交換樹脂）にて精製した。
体の各濃度を、０．７２％ ＮａＣｌを含む１３mMリン
酸緩衝液（pH７．２：ＰＢＳ）で希釈し、５０μl ／ウ
エルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で
一夜放置した。これを、１％牛血清アルブミン及び０．
０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（pH７．２：ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。更に、各抗原を結合した
９６穴マイクロプレートは、ＢＳＡ−ＰＢＳで各抗原を
希釈し、５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレ
ートに分注し、４℃で一夜放置し、スクリーニング用の
各プレートを調製した。各プレートの各ウエルに培養上
清５０μl を加え、３７℃で１時間保温した。次いでＰ
ＢＳで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に
希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆ
ｃ部位に特異的，ヤギ由来）を５０μl 加え、３７℃で
１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄した後、０．
２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水
素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）を５０
μl ／ウエル加え、室温で３０分反応させた後、４．５
Ｍ硫酸を５０μl ／ウエル加えて反応を停止させた。こ
の反応で、５５０nmにおける吸光度が高い結果を出した
上清を得たウエルを選択した。なお、固相化したモノク
ローナル抗体は、ＥＬＩＳＡに用いたペルオキシダーゼ
標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由
来）が反応しない様にペプシン処理によりＦ（ａｂ’）
２とし、未反応のＩｇＧ画分を除くため、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌ（陰イオン交換樹脂）にて精製した。
【００３５】単クローン化は限界希釈法で行った。すな
わち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺
細胞を１ウエル当たり１０6個／０．２mlづつ分注した
９６穴マイクロカルチャープレートに特異抗体陽性ウエ
ル中のハイブリドーマを１０個／mlとなるように希釈し
たものを０．１mlづつ分注した。培地は、初回はＨＡＴ
培地を、２回目はＨＴ培地を、３回目以降は１５％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ １６４０を用い、３７℃、５％炭酸
ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による
特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クロ
ーン化操作を各３回繰り返した。スクリーニング２回目
以降は、ＴＡＴ固相化プレートのみで行った。その結
果、抗ＴＡＴモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ１７株を確立した。得られた１７株のハイブリドー
マは、それぞれ２６２０２、２６２０３、２６２０５、
２６２０６、２６２０７、２６２０８、２６２０９、２
６２１０、２６２１１、２６２１２、２６２１３、２６
２１４、２６２１６、２６２１７、２６２１８、２６２
１９、２６２２０と命名し、そのうち７株について、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。当該株名
と受託番号を表１に示す。
わち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺
細胞を１ウエル当たり１０6個／０．２mlづつ分注した
９６穴マイクロカルチャープレートに特異抗体陽性ウエ
ル中のハイブリドーマを１０個／mlとなるように希釈し
たものを０．１mlづつ分注した。培地は、初回はＨＡＴ
培地を、２回目はＨＴ培地を、３回目以降は１５％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ １６４０を用い、３７℃、５％炭酸
ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬＩＳＡ法による
特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クロ
ーン化操作を各３回繰り返した。スクリーニング２回目
以降は、ＴＡＴ固相化プレートのみで行った。その結
果、抗ＴＡＴモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ１７株を確立した。得られた１７株のハイブリドー
マは、それぞれ２６２０２、２６２０３、２６２０５、
２６２０６、２６２０７、２６２０８、２６２０９、２
６２１０、２６２１１、２６２１２、２６２１３、２６
２１４、２６２１６、２６２１７、２６２１８、２６２
１９、２６２２０と命名し、そのうち７株について、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。当該株名
と受託番号を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】また、各モノクローナル抗体のクラス・サ
ブクラスはＺｙｍｅｄ社のＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ ＥＩＡ
ｋｉｔを用いて決定し、表２に示した。
ブクラスはＺｙｍｅｄ社のＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ ＥＩＡ
ｋｉｔを用いて決定し、表２に示した。
【００３８】
【表２】
【００３９】（５）モノクローナル抗体の分離及び精
製：前項の方法によって得られた抗ＴＡＴモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養し、モ
ノクローナル抗体を作らせた。前処理として、８週齢の
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に０．５mlのブリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を
投与した。８日後、０．５mlのＲＰＭＩ １６４０培地
に浮遊したハイブリドーマ４〜１５×１０5個をこのマ
ウスの腹腔内に投与した。投与後９日目から腹水を繰り
返し採取してプールした。集めた腹水は３０００rpm で
１０分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。
上清部分に等容の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しな
がら加え、一夜、４℃に放置して得られた沈澱を遠心分
離によって回収した。沈澱を２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（pH８．０）に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに透析内容物を
吸着させた後、同緩衝液中のＮａＣｌ ０−０．３Ｍの
直線濃度勾配で溶出させ、精製抗体を得た。
製：前項の方法によって得られた抗ＴＡＴモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養し、モ
ノクローナル抗体を作らせた。前処理として、８週齢の
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に０．５mlのブリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を
投与した。８日後、０．５mlのＲＰＭＩ １６４０培地
に浮遊したハイブリドーマ４〜１５×１０5個をこのマ
ウスの腹腔内に投与した。投与後９日目から腹水を繰り
返し採取してプールした。集めた腹水は３０００rpm で
１０分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。
上清部分に等容の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しな
がら加え、一夜、４℃に放置して得られた沈澱を遠心分
離によって回収した。沈澱を２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（pH８．０）に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに透析内容物を
吸着させた後、同緩衝液中のＮａＣｌ ０−０．３Ｍの
直線濃度勾配で溶出させ、精製抗体を得た。
【００４０】実施例２ モノクローナル抗体の反応特異
性 （１）ウエスタンブロッティング：上記で得られた１７
種類のモノクローナル抗体の反応特異性をウエスタンブ
ロッティングにより確認した。すなわち、４−２０％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１ウエル当り、α−トロンビ
ン（１μg ）とＡＴIII （２．６μg ）の３７℃、５分
間の反応物にα−トロンビン（１μg ）を添加した物を
アプライした。また、ＦＸ（１μg ）にラッセルバイパ
ーベノム（ＲＶＶ；２０ng）を加え、３７℃で５分間反
応させた後、更に、ＡＴIII （２μg ）を加え、３７℃
で５分間反応させた物に、ＦＸ、ＦＸａ（各０．５μg
）を添加した物をアプライした。これらサンプルを電
気泳動後、２５mM Ｔｒｉｓ、１９２mM グリシン、２
０％メタノールの転写緩衝液を用い、４０Ｖ／５cm、４
時間の条件でニトロセルロース膜に転写した。ニトロセ
ルロース膜は、ＢＳＡ−ＰＢＳにて４℃で一晩ブロッキ
ング後、今回得た各モノクローナル抗体を反応させた。
転写膜を短冊状に切り、短冊当り各ハイブリドーマの培
養上清５００μl を室温で１時間反応させた後、０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３
回洗浄し、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペル
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異
的）５００μl を室温で１時間反応させた。更に、ＰＢ
ＳＴで３回洗浄後、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
６）１００mlにジアミノベンチジン２５mg、過酸化水素
２０μl を含む基質液を加え酵素反応を行った。バンド
が確認でき次第、水洗にて反応停止を行った。その結果
を表３に示す。１７種類のモノクローナル抗体は、ＴＡ
Ｔ、α−トロンビン及びＦＸａ・ＡＴと反応するもの
の、他の物とは反応が認められなかった。このことか
ら、２０種類のモノクローナル抗体はα−トロンビンと
ＡＴIII のネオ抗原に対するものであることが明らかと
なった。
性 （１）ウエスタンブロッティング：上記で得られた１７
種類のモノクローナル抗体の反応特異性をウエスタンブ
ロッティングにより確認した。すなわち、４−２０％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１ウエル当り、α−トロンビ
ン（１μg ）とＡＴIII （２．６μg ）の３７℃、５分
間の反応物にα−トロンビン（１μg ）を添加した物を
アプライした。また、ＦＸ（１μg ）にラッセルバイパ
ーベノム（ＲＶＶ；２０ng）を加え、３７℃で５分間反
応させた後、更に、ＡＴIII （２μg ）を加え、３７℃
で５分間反応させた物に、ＦＸ、ＦＸａ（各０．５μg
）を添加した物をアプライした。これらサンプルを電
気泳動後、２５mM Ｔｒｉｓ、１９２mM グリシン、２
０％メタノールの転写緩衝液を用い、４０Ｖ／５cm、４
時間の条件でニトロセルロース膜に転写した。ニトロセ
ルロース膜は、ＢＳＡ−ＰＢＳにて４℃で一晩ブロッキ
ング後、今回得た各モノクローナル抗体を反応させた。
転写膜を短冊状に切り、短冊当り各ハイブリドーマの培
養上清５００μl を室温で１時間反応させた後、０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３
回洗浄し、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペル
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異
的）５００μl を室温で１時間反応させた。更に、ＰＢ
ＳＴで３回洗浄後、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
６）１００mlにジアミノベンチジン２５mg、過酸化水素
２０μl を含む基質液を加え酵素反応を行った。バンド
が確認でき次第、水洗にて反応停止を行った。その結果
を表３に示す。１７種類のモノクローナル抗体は、ＴＡ
Ｔ、α−トロンビン及びＦＸａ・ＡＴと反応するもの
の、他の物とは反応が認められなかった。このことか
ら、２０種類のモノクローナル抗体はα−トロンビンと
ＡＴIII のネオ抗原に対するものであることが明らかと
なった。
【００４１】
【表３】
【００４２】表３の結果から、Ｎｏ．２６２０２、２６
２０３及び２６２０７はＴＡＴ及びα−トロンビンと反
応し、他の抗原とは反応しなかったことから、これらは
ＴＡＴ及びα−トロンビンに対する抗体であることが明
らかとなった。また他の抗体はＴＡＴ及びＦＸａ・ＡＴ
と反応し、他の抗原とは反応しなかったことから、これ
らはＴＡＴ及びＡＴIII のネオ抗原に対する抗体に対す
る抗体であることが明らかとなった。
２０３及び２６２０７はＴＡＴ及びα−トロンビンと反
応し、他の抗原とは反応しなかったことから、これらは
ＴＡＴ及びα−トロンビンに対する抗体であることが明
らかとなった。また他の抗体はＴＡＴ及びＦＸａ・ＡＴ
と反応し、他の抗原とは反応しなかったことから、これ
らはＴＡＴ及びＡＴIII のネオ抗原に対する抗体に対す
る抗体であることが明らかとなった。
【００４３】（２）ＥＬＩＳＡ（固相化抗原）：上記で
得られた１７種類のモノクローナル抗体の反応特異性を
ＥＬＩＳＡにより確認した。すなわち、ＴＡＴ（０．５
mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）、α−トロンビン（２
μg ／ml）、プロトロンビン（２μg ／ml）、ＦＸａ
（ＦＸとして０．５μg ／ml：ＦＸ１０μg にＲＶＶ
０．２μg を加え、３７℃で１５分間反応させた物）、
ＦＸａ・ＡＴ（ＦＸとして０．５μg ／ml：ＦＸａ５．
５μgにＡＴIII ５μg を加え、３７℃で５分間反応さ
せた物で、遊離のＡＴIII はほとんど含まない）の各濃
度をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴
マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置し、ＢＳＡ
−ＰＢＳで３回洗浄したプレートを固相化抗原との反応
特異性の試験に使用した。モノクローナル抗体を反応さ
せる操作以降は、実施例１（４）のハイブリドーマの選
択に従って行った。その結果を表４に示す。
得られた１７種類のモノクローナル抗体の反応特異性を
ＥＬＩＳＡにより確認した。すなわち、ＴＡＴ（０．５
mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）、α−トロンビン（２
μg ／ml）、プロトロンビン（２μg ／ml）、ＦＸａ
（ＦＸとして０．５μg ／ml：ＦＸ１０μg にＲＶＶ
０．２μg を加え、３７℃で１５分間反応させた物）、
ＦＸａ・ＡＴ（ＦＸとして０．５μg ／ml：ＦＸａ５．
５μgにＡＴIII ５μg を加え、３７℃で５分間反応さ
せた物で、遊離のＡＴIII はほとんど含まない）の各濃
度をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴
マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置し、ＢＳＡ
−ＰＢＳで３回洗浄したプレートを固相化抗原との反応
特異性の試験に使用した。モノクローナル抗体を反応さ
せる操作以降は、実施例１（４）のハイブリドーマの選
択に従って行った。その結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
【００４５】（３）ＥＬＩＳＡ（抗体結合抗原）：Ｆ
（ａｂ’）２にした２種類の抗ＡＴIII モノクローナル
抗体（５mOD ）をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの
割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放
置した。これをＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＡＴ
（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）をＢＳＡ−Ｐ
ＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイク
ロプレートに分注した。これを、４℃で一晩放置し、抗
体に結合させた抗原プレートを作成し、抗体結合抗原と
の反応特異性の試験に使用した。モノクローナル抗体を
反応させる操作以降は、実施例１（４）のハイブリドー
マの選択に従って行った。その結果を表５に示す。
（ａｂ’）２にした２種類の抗ＡＴIII モノクローナル
抗体（５mOD ）をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの
割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放
置した。これをＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＡＴ
（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）をＢＳＡ−Ｐ
ＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイク
ロプレートに分注した。これを、４℃で一晩放置し、抗
体に結合させた抗原プレートを作成し、抗体結合抗原と
の反応特異性の試験に使用した。モノクローナル抗体を
反応させる操作以降は、実施例１（４）のハイブリドー
マの選択に従って行った。その結果を表５に示す。
【００４６】
【表５】
【００４７】（４）ＥＬＩＳＡ（遊離の抗原）：ＴＡＴ
（０．２mOD ）をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの
割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放
置した。これをＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＡＴ
（１００mOD ）、ＡＴIII （１００μg ／ml）、α−ト
ロンビン（１００μg ／ml）又はプロトロンビン（１０
０μg ／ml）をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈して５０μl ／ウ
エルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、更に各
モノクローナル抗体の培養上清を５０μl ／ウエルの割
合で９６穴マイクロプレートに分注した後、３７℃で１
時間反応させた。ペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ
る操作以降は、実施例１（４）のハイブリドーマの選択
に従って行った。その結果を表６に示す。
（０．２mOD ）をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの
割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放
置した。これをＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＡＴ
（１００mOD ）、ＡＴIII （１００μg ／ml）、α−ト
ロンビン（１００μg ／ml）又はプロトロンビン（１０
０μg ／ml）をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈して５０μl ／ウ
エルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、更に各
モノクローナル抗体の培養上清を５０μl ／ウエルの割
合で９６穴マイクロプレートに分注した後、３７℃で１
時間反応させた。ペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ
る操作以降は、実施例１（４）のハイブリドーマの選択
に従って行った。その結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】表４、５及び６より、本発明の１７種類の
モノクローナル抗体は、前記の（１）、（２）及び
（３）のグループに大別できることがわかる。
モノクローナル抗体は、前記の（１）、（２）及び
（３）のグループに大別できることがわかる。
【００５０】実施例３ 酵素免疫測定法 （１）ペルオキシダーゼ標識抗体調製：抗体を標識する
酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用
い、中根らの方法（Ｎａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．２２：１０８４，１９７４）に従っ
て標識した。すなわち、断片化していない１７種類のＩ
ｇＧ分子各５OD相当を、０．２Ｍ 炭酸緩衝液（pH９．
５）で透析してＴｒｉｓを除き、コロジオンバッグで約
５００μl にまで濃縮した。各抗体当たりＨＲＰ５mgを
使用した。ＨＲＰ（東洋紡社製）５mgを１mlの精製水に
溶かし、０．１ＭＮａＩＯ4 ７５μl を加え、室温で
２０分攪拌し、これを１mM酢酸緩衝液（pH４．０）に対
して透析してpHを４程度に下げた。０．２Ｍ 炭酸緩衝
液（pH９．５）を１００μl 加えてpHを９付近にし、前
記のＩｇＧ溶液と混合して室温で２時間攪拌し、ＩｇＧ
とＨＲＰの標識を行った。反応停止は４mg／ml ＮａＢ
Ｈ 4 １００μl を加えることで行い、ＰＢＳで透析し
た後、４℃で保存した。
酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用
い、中根らの方法（Ｎａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．２２：１０８４，１９７４）に従っ
て標識した。すなわち、断片化していない１７種類のＩ
ｇＧ分子各５OD相当を、０．２Ｍ 炭酸緩衝液（pH９．
５）で透析してＴｒｉｓを除き、コロジオンバッグで約
５００μl にまで濃縮した。各抗体当たりＨＲＰ５mgを
使用した。ＨＲＰ（東洋紡社製）５mgを１mlの精製水に
溶かし、０．１ＭＮａＩＯ4 ７５μl を加え、室温で
２０分攪拌し、これを１mM酢酸緩衝液（pH４．０）に対
して透析してpHを４程度に下げた。０．２Ｍ 炭酸緩衝
液（pH９．５）を１００μl 加えてpHを９付近にし、前
記のＩｇＧ溶液と混合して室温で２時間攪拌し、ＩｇＧ
とＨＲＰの標識を行った。反応停止は４mg／ml ＮａＢ
Ｈ 4 １００μl を加えることで行い、ＰＢＳで透析し
た後、４℃で保存した。
【００５１】（２）ＴＡＴの測定：まず、抗体（Ｉｇ
Ｇ）を４mOD となるようにＰＢＳで希釈し、９６穴マイ
クロプレートに１００μl ／ウエルづつ分注し、４℃に
て一晩静置して固定化した。これを吸引除去後、ＢＳＡ
−ＰＢＳを３００μl ／ウエル分注して室温で１時間放
置した。ＢＳＡ−ＰＢＳを吸引除去後、精製ＴＡＴをＢ
ＳＡ−ＰＢＳでそれぞれ０．３ng／ml〜６０ng／mlまで
６段階希釈したものを各々１００μl ／ウエルづつ加
え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、上
記で作成したＨＲＰ−標識モノクローナル抗体を８mOD
の濃度にＢＳＡ−ＰＢＳで希釈後、１００μl ／ウエル
づつ加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄
後、Ｈ2Ｏ2を基質にオルトフェニレンジアミンを発色剤
として酵素反応を行い、４９２／６９０nmの吸光度で活
性を測定した。なお、基質溶液は実施例１（４）のハイ
ブリドーマの選択に従って調製した。酵素免疫測定法に
おいて、ＴＡＴ（１０ng／ml）、ＡＴIII （３００μg
／ml）及びプロトロンビン（１７０μg ／ml）を測定し
た時のそれぞれの吸光度を表７に示した。
Ｇ）を４mOD となるようにＰＢＳで希釈し、９６穴マイ
クロプレートに１００μl ／ウエルづつ分注し、４℃に
て一晩静置して固定化した。これを吸引除去後、ＢＳＡ
−ＰＢＳを３００μl ／ウエル分注して室温で１時間放
置した。ＢＳＡ−ＰＢＳを吸引除去後、精製ＴＡＴをＢ
ＳＡ−ＰＢＳでそれぞれ０．３ng／ml〜６０ng／mlまで
６段階希釈したものを各々１００μl ／ウエルづつ加
え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、上
記で作成したＨＲＰ−標識モノクローナル抗体を８mOD
の濃度にＢＳＡ−ＰＢＳで希釈後、１００μl ／ウエル
づつ加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄
後、Ｈ2Ｏ2を基質にオルトフェニレンジアミンを発色剤
として酵素反応を行い、４９２／６９０nmの吸光度で活
性を測定した。なお、基質溶液は実施例１（４）のハイ
ブリドーマの選択に従って調製した。酵素免疫測定法に
おいて、ＴＡＴ（１０ng／ml）、ＡＴIII （３００μg
／ml）及びプロトロンビン（１７０μg ／ml）を測定し
た時のそれぞれの吸光度を表７に示した。
【００５２】
【表７】
【００５３】実施例４ ラテックス免疫比濁法 （１）モノクローナル抗体感作ラテックスの調製：５mM
ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１５０mM ＮａＣｌを含む５０
mM グリシン緩衝液（pH９．６）で各抗体を１ OD（２
８０nmにおける吸光度）の濃度に希釈した溶液と、同緩
衝液で１％の濃度に希釈したラテックス（φ０．１２μ
m ）を各１容量混合し、４℃、３時間ウエイブローター
で混和した。本混合液（２容量）と等容量の０．５％牛
血清アルブミンを含む同緩衝液を加え、４℃、２時間ウ
エイブローターで混和した。２５０００×ｇ、１時間の
遠心にてラテックスを回収し、上清を吸引除去し、沈渣
に０．１％牛血清アルブミン及び０．００５％ Ｔｗｅ
ｅｎ ８０を含む同緩衝液を２容量加え、４℃、１７時
間程度ウエイブローターで混和した。更に、２５０００
×ｇ、１時間の遠心にてラテックスを回収し、上清を吸
引除去し、沈渣に０．１％牛血清アルブミン及び１０％
グリセロールを含む同緩衝液を２容量加え、４℃、一晩
ウエイブローターで混和・懸濁した。本懸濁液を抗体感
作ラテックスとして測定に使用した。
ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１５０mM ＮａＣｌを含む５０
mM グリシン緩衝液（pH９．６）で各抗体を１ OD（２
８０nmにおける吸光度）の濃度に希釈した溶液と、同緩
衝液で１％の濃度に希釈したラテックス（φ０．１２μ
m ）を各１容量混合し、４℃、３時間ウエイブローター
で混和した。本混合液（２容量）と等容量の０．５％牛
血清アルブミンを含む同緩衝液を加え、４℃、２時間ウ
エイブローターで混和した。２５０００×ｇ、１時間の
遠心にてラテックスを回収し、上清を吸引除去し、沈渣
に０．１％牛血清アルブミン及び０．００５％ Ｔｗｅ
ｅｎ ８０を含む同緩衝液を２容量加え、４℃、１７時
間程度ウエイブローターで混和した。更に、２５０００
×ｇ、１時間の遠心にてラテックスを回収し、上清を吸
引除去し、沈渣に０．１％牛血清アルブミン及び１０％
グリセロールを含む同緩衝液を２容量加え、４℃、一晩
ウエイブローターで混和・懸濁した。本懸濁液を抗体感
作ラテックスとして測定に使用した。
【００５４】（２）ＴＡＴの測定：１％牛血清アルブミ
ン、５mM ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１５０mM ＮａＣｌを
含む１００mMリン酸緩衝液（pH７．２）３００μl と、
上記抗体感作ラテックス２種類、各５０μl づつを混合
した。これに、１％ＢＳＡを含む１００mMリン酸緩衝液
（pH７．２）で所定の濃度に希釈したＴＡＴ溶液１００
μl を加えて混合し、５分後に波長６００nmの吸光度を
測定した。試薬ブランクはサンプルの代わりにＴＡＴを
含まない同リン酸緩衝液を用いた。本ラテックス免疫比
濁法において、ＴＡＴ（１μg ／ml）、ＡＴIII （３０
０μg ／ml）及びプロトロンビン（１７０μg ／ml）を
測定した時の吸光度を表８に示した。
ン、５mM ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１５０mM ＮａＣｌを
含む１００mMリン酸緩衝液（pH７．２）３００μl と、
上記抗体感作ラテックス２種類、各５０μl づつを混合
した。これに、１％ＢＳＡを含む１００mMリン酸緩衝液
（pH７．２）で所定の濃度に希釈したＴＡＴ溶液１００
μl を加えて混合し、５分後に波長６００nmの吸光度を
測定した。試薬ブランクはサンプルの代わりにＴＡＴを
含まない同リン酸緩衝液を用いた。本ラテックス免疫比
濁法において、ＴＡＴ（１μg ／ml）、ＡＴIII （３０
０μg ／ml）及びプロトロンビン（１７０μg ／ml）を
測定した時の吸光度を表８に示した。
【００５５】
【表８】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成７年２月２０日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１４０９４
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５００３
【書類名】 受託番号変更届
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１４０９８
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５００４
【書類名】 受託番号変更届
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１４０９９
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５００５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 33/564 Ｚ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 牛澤 幸司 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一化 学薬品株式会社東京研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 遊離のプロトロンビンとは反応せず；遊
離及び固相化したトロンビン・アンチトロンビンIII複
合体、遊離のトロンビン並びに固相化したプロトロンビ
ンの三者と反応する抗トロンビン・アンチトロンビンII
I複合体モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せ
ず；遊離及び固相化したトロンビン・アンチトロンビン
III複合体と反応し；セリンプロテアーゼと反応したア
ンチトロンビンIII、固相化したアンチトロンビンIII、
及び抗アンチトロンビンIIIモノクローナル抗体が反応
したアンチトロンビンIIIに共通して生じるアンチトロ
ンビンIIIのネオ抗原と反応する抗トロンビン・アンチ
トロンビンIII複合体モノクローナル抗体。 - 【請求項３】 遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せ
ず；固相化したトロンビン・アンチトロンビンIII複合
体との反応性が、遊離のトロンビン・アンチトロンビン
III複合体との反応性より強い抗トロンビン・アンチト
ロンビンIII複合体モノクローナル抗体。 - 【請求項４】 遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せ
ず；セリンプロテアーゼと反応したアンチトロンビンII
Iに生じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応する抗
トロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナ
ル抗体。 - 【請求項５】 トロンビン・アンチトロンビンIII複合
体で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨
髄腫細胞とを融合させて得られた、請求項１〜４のいず
れかの項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ。 - 【請求項６】 請求項１、２及び３記載のモノクローナ
ル抗体並びに遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せ
ず、トロンビン、セリンプロテアーゼと反応したアンチ
トロンビンIIIに生じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原
と反応するモノクローナル抗体から選ばれるモノクロー
ナル抗体の２種以上を組合わせ、被検体と接触させて免
疫測定を行うことを特徴とするトロンビン・アンチトロ
ンビンIII複合体の測定法。 - 【請求項７】 請求項１記載のモノクローナル抗体と、
請求項２及び３記載のモノクローナル抗体並びに遊離の
アンチトロンビンIIIとは反応せず、セリンプロテアー
ゼと反応したアンチトロンビンIIIに生じるアンチトロ
ンビンIIIのネオ抗原と反応するモノクローナル抗体か
ら選ばれるモノクローナル抗体の１種以上とを組合わ
せ、被検体と接触させて免疫測定を行うことを特徴とす
るトロンビン・アンチトロンビンIII複合体の測定法。
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|---|---|---|---|
| JP6028169A JPH07238099A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法 |
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| EP00116186A EP1074562B1 (en) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoclonal antibody directed against the thrombin-antithrombin III complex and its use in immunoassays |
| AT95102569T ATE203999T1 (de) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoklonaler antikörper und seine verwendung in einem immunoassay |
| AT00116187T ATE237640T1 (de) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoklonaler antikörper gegen den thrombin- antithrombin komplex-iii und dessen verwendung in immunoassays |
| AT00116186T ATE229037T1 (de) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoklonaler antikörper gegen denthrombin- antithrombin iii-komplex und dessen verwendung in immunoassays |
| DE69530432T DE69530432T2 (de) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoklonaler Antikörper gegen den Thrombin-Antithrombin Komplex-III und dessen Verwendung in immunoassays |
| DE69522021T DE69522021T2 (de) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoklonaler Antikörper und seine Verwendung in einem Immunoassay |
| EP00116187A EP1072611B1 (en) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoclonal antibody directed against the thrombin-antithrombin III complex and its use in immunoassays |
| DE69529106T DE69529106T2 (de) | 1994-02-25 | 1995-02-23 | Monoklonaler Antikörper gegen denThrombin-Antithrombin III-Komplex und dessen Verwendung in Immunoassays |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6028169A JPH07238099A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法 |
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|---|---|---|---|
| JP2004309724A Division JP2005120096A (ja) | 2004-10-25 | 2004-10-25 | モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| WO2016159015A1 (ja) * | 2015-03-31 | 2016-10-06 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
| JP2016194445A (ja) * | 2015-03-31 | 2016-11-17 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
| JP2016194444A (ja) * | 2015-03-31 | 2016-11-17 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
| WO2017073795A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
| JP2017083410A (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-18 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
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-
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