KR102100152B1

KR102100152B1 - Pivka-ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트

Info

Publication number: KR102100152B1
Application number: KR1020157001025A
Authority: KR
Inventors: 켄타로 야마구치; 카츠미 아오야기; 아즈사 테라오
Original assignee: 후지레비오 가부시키가이샤; 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2013-08-06
Publication date: 2020-04-13
Also published as: TWI589876B; CN104520710A; JP6032470B2; US20150219638A1; TW201411128A; KR20150041620A; CN104520710B; RU2015107740A; US10539559B2; EP2884277A1; WO2014024853A1; EP2884277A4; JP2014035278A; US20200088722A1; EP2884277B1

Abstract

종래법보다 혈청·혈장 상관이 양호한 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법 및 그것을 위한 시약 및 키트가 개시되어 있다. 본 발명의 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법은 프로토롬빈 프래그먼트 F1에 특이적으로 결합하는 항F1 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 프로트롬빈 프래그먼트 F2에 특이적으로 결합하는 항F2 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물 및 PIVKA-Ⅱ에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-Ⅱ 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용한 면역 측정에 의해 검체 중의 PIVKA-Ⅱ를 측정하는 것을 포함한다.

Description

PIVKA-Ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트{PIVKA-Ⅱ MEASUREMENT METHOD, MEASUREMENT REAGENT, AND MEASUREMENT KIT}

본 발명은 혈청·혈장 상관이 양호한 PIVKA-Ⅱ 측정 방법, 및 PIVKA-Ⅱ 면역 측정 시약 및 키트에 관한 것이다.

PIVKA-Ⅱ(Protein induced by vitamin K absence-Ⅱ)는 혈액 응고에 관련되는 프로트롬빈에 유사한 구조를 갖는 당 단백질이다. 프로트롬빈은 622 잔기의 단백질이며, N말단의 근방에 있는 10개의 글루탐산(Glu) 잔기가 γ-카르복실화를 받아서 γ-카르복시글루탐산(Gla) 잔기가 되어 있다. 이 프로트롬빈이 생체 내에서 산생될 때에 비타민K의 결핍, 간기능 부전, 비타민K 길항제의 투여, 간세포 장해 등에 기인하여 γ-카르복실화가 불완전해지고, 10개의 잔기 중 전부 또는 일부가 Glu 잔기가 되어 있는 당 단백질이 혈액 중에 발견되는 것이 알려져 있다. 이 단백질이 이상(異常) 프로트롬빈이라고도 불리는 PIVKA-Ⅱ이다. 최근, 간세포암 환자에 있어서 혈장 중에 PIVKA-Ⅱ가 고농도로 검출되는 것이 보고되어 간세포암의 마커로서 진단의 모니터에 이용되게 되었다.

검체 중의 PIVKA-Ⅱ를 특이적으로 검출하는 방법으로서 PIVKA-Ⅱ를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체와 프로트롬빈에 대한 폴리클로날 항체의 양자를 사용하여 그 한쪽을 고정화 항체로하고, 다른 쪽을 표식 항체로 해서 측정하는 면역 측정법이 보고되어 있다(특허문헌 1).

혈액 유래의 샘플 중의 피검 물질을 측정할 경우, 혈청이나 혈장이 주로 사용된다. 피검 물질의 성질이나 측정계 등에 따라서는 동일 피험자로부터 얻어진 혈청·혈장 페어 검체에 있어서 혈청 검체와 혈장 검체 중의 피검 물질의 측정값이 다른, 즉 혈청·혈장 상관이 낮고, 혈청 및 혈장 샘플 중 어느 한쪽에서밖에 측정할 수 없는 경우가 있다. 이것은 2개의 피검 물질을 동시에 측정할 경우에 특히 문제가 될 수 있다. 예를 들면, 2개의 피검 물질을 동시에 측정할 때에 한쪽의 피검 물질을 혈청에서밖에 측정할 수 없을 경우, 다른 쪽의 피검 물질을 혈청에서도 측정할 수 있으면 환자로부터 채취하는 샘플은 혈청 샘플만으로 좋은 것이 된다. 그러나, 다른 쪽의 피검 물질을 혈장 샘플에서밖에 측정할 수 없을 경우에는 환자로부터 혈청과 혈장의 양쪽 샘플을 채취하지 않으면 안되어 샘플 취득이나 처리에 수고를 필요로 하고, 또한 환자의 부담도 증가한다. 따라서, 혈청·혈장 상관이 높은 측정계의 확립이 요망되고 있다.

ELISA법에 의한 PIVKA-Ⅱ의 측정에 있어서도 PIVKA-Ⅱ를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 고상 항체로 하고, 프로트롬빈에 대한 폴리클로날 항체를 2차 항체로서 사용했을 경우에 트롬빈과 반응성을 나타내는 항체가 2차 항체에 포함됨으로써 혈청 검체의 측정계에 악영향을 주어 안정된 측정값이 얻어지지 않는 것이 알려져 있다(특허문헌 2). 특허문헌 2에서는 이것을 해결하기 위해서 인간 트롬빈과는 반응하지 않고, 인간 프로트롬빈과 특이적으로 반응하는 항체를 2차 항체로서 사용함으로써 혈청 검체에서도 안정되게 PIVKA-Ⅱ를 측정할 수 있는 것이 보고되어 있다. 그러나, 특허문헌 2에 기재된 방법에서는 인간 프로트롬빈에 대한 폴리클로날 항체로부터 트롬빈에 대한 항체를 제외하기 때문에 인간 프로트롬빈 어피니티 컬럼을 사용해서 프로트롬빈과 반응하는 항체를 취득한 후에 투석하고, 또한 인간 트롬빈 어피니티 컬럼을 사용해서 트롬빈과 반응하지 않는 항체를 취득해서 투석할 필요가 있으며, 항체의 정제 공정이 매우 번잡하다. 또한, 특허문헌 2의 방법에서도 혈청·혈장 상관은 개선되지만, 추가적인 개선이 요망되고 있다. 또한, 폴리클로날 항체는 로트 차에 의한 편차가 생기기 때문에 엄밀하게 특이성을 담보하기 위해서는 일반적으로 폴리클로날 항체보다 모노클로날 항체인 편이 바람직하다. 특허문헌 2에는 ELISA법에 의한 PIVKA-Ⅱ 측정법에 있어서 인간 트롬빈과는 반응하지 않고 인간 프로트롬빈과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 사용하는 것도 기재되어 있지만, 이와 같은 모노클로날 항체를 사용했을 경우에 있어서의 혈청·혈장 상관으로의 영향이나 문제점에 대해서 조금도 기재가 없다.

특허문헌 3에는 PIVKA-Ⅱ를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체와 프로트롬빈에 대한 모노클로날 항체의 양자를 사용하여 그 한쪽을 고정화 항체로 하고, 다른 쪽을 표식 항체로 해서 측정하는 면역 측정법이 기재되어 있다. PIVKA-Ⅱ 특이적 모노클로날 항체를 혼합해서 사용하는 것에 대해서도 기재되어 있다. 그러나, 특허문헌 3에서는 처음부터 면역 측정계에 있어서의 혈청·혈장 상관의 문제가 전혀 기재되어 있지 않고, 특허문헌 3에 기재된 방법이 혈청·혈장 상관에 어떻게 영향을 끼칠지는 불분명하다.

일본 특허 공개 소 60-60557 공보 일본 특허 공개 평 5-249108 공보 일본 특허 공개 평 9-43237 공보

본 발명의 목적은 종래법보다 혈청·혈장 상관이 양호한 PIVKA-Ⅱ의 측정 수단을 제공하는 것이다.

본원발명자들은 PIVKA-Ⅱ의 측정에 관한 연구를 예의 거듭한 결과, 인간 프로트롬빈 프래그먼트 1에 특이적으로 결합하는 항체와, 인간 프로트롬빈 프래그먼트 2에 특이적으로 결합하는 항체를 혼합한 혼합 항체를 면역 측정에 있어서의 항체로서 사용함으로써 종래법보다 혈청·혈장 상관이 대폭으로 개선되는 것을 발견하여 본 발명을 완성시키는 것에 도달했다.

즉, 본 발명은 프로트롬빈 프래그먼트 F1에 특이적으로 결합하는 항F1 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 프로트롬빈 프래그먼트 F2에 특이적으로 결합하는 항F2 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물 및 PIVKA-Ⅱ에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-Ⅱ 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용한 면역 측정에 의해 검체 중의 PIVKA-Ⅱ를 측정하는 것을 포함하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 PIVKA-Ⅱ에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-Ⅱ 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 프로트롬빈 프래그먼트 F1에 특이적으로 결합하는 항F1 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 프로트롬빈 프래그먼트 F2에 특이적으로 결합하는 항F2 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 포함하는 검체 중의 PIVKA-Ⅱ의 면역 측정 시약을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 면역 측정 시약을 포함하는 검체 중의 PIVKA-Ⅱ의 면역 측정 키트를 제공한다.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면 혈청·혈장 상관이 양호한 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법 및 그것을 위한 시약 및 키트를 제공할 수 있다. 본 발명의 방법은 종래법보다 대폭으로 혈청·혈장 상관이 더 개선되어 있고, PIVKA-Ⅱ 측정 방법으로서 보다 실용성이 높다.

도 1은 실시예 1에 있어서 작출한 모노클로날 항체의 전장 인간 프로트롬빈(1), F1 영역(2) 및 F2 영역(3)으로의 반응성을 나타내는 그래프이다.

프로트롬빈은 프로트롬빈 프래그먼트 1(F1) 영역과 프로트롬빈 프래그먼트 2(F2) 영역과 트롬빈 영역을 포함한다. PIVKA-Ⅱ는 N말단 근방의 10개의 Glu 잔기에 있어서의 γ-카르복실화가 불완전하기 때문에 10개의 잔기의 전부 또는 일부가 Gla가 되지 않고 Glu인 채로 되어 있는 당 단백질이며, PIVKA-Ⅱ도 또한 프로트롬빈 프래그먼트 1(F1) 영역과 프로트롬빈 프래그먼트 2(F2) 영역과 트롬빈 영역을 포함하고 있다.

서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열은 PIVKA-Ⅱ의 아미노산 서열이며, 44번~198번 아미노산의 영역이 프로트롬빈 F1 영역, 199번~314번 아미노산의 영역이 프로트롬빈 F2 영역이다. F1 영역 내의 일부를 포함하는 25번~88번 아미노산의 영역은 Gla 영역이라고 불린다. 프로트롬빈에서는 서열번호 1 중의 10개의 「Xaa」 전부가 γ-카르복시글루탐산(Gla) 잔기가 되어 있다. 이 프로트롬빈 서열은 GenBank에 액세션 번호 NP_000497로 등록되어 있다. 서열번호 2에 나타내는 염기 서열은 서열번호 1의 PIVKA-Ⅱ 및 NP_000497의 프로트롬빈을 코딩하는 서열이며, GenBank에 액세션 번호 NM_000506으로 등록되어 있다. 서열번호 2 중의 44번~1912번 염기의 영역이 코딩 영역이다.

본 발명의 측정 방법에서는 항F1 항체 및 항F2 항체의 혼합물과, PIVKA-Ⅱ에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-Ⅱ 항체를 사용해서 샌드위치 면역 측정을 행한다. 샌드위치법에 있어서의 항체의 한쪽으로서 항F1 항체 및 항F2 항체의 혼합물을 사용함으로써 PIVKA-Ⅱ 측정값에 있어서의 혈청·혈장 상관을 바람직하게 개선할 수 있다.

항F1 항체는 프로트롬빈 F1에 특이적으로 결합하는 항체이다. 즉, PIVKA-Ⅱ의 프로트롬빈 F1 영역 내에 에피토프를 갖고, 상기 에피토프를 인식해서 PIVKA-Ⅱ와 결합하는 항체이다. 예를 들면, 프로트롬빈 또는 PIVKA-Ⅱ의 F1 영역 단편과만 결합하고, F2 영역 단편 및 트롬빈 영역 단편 중 어느 것에도 실질적으로 결합하지 않는 항체는 F1 영역 내에 에피토프를 갖는 「프로트롬빈 F1에 특이적으로 결합하는 항체」이다. 여기에서 말하는 「실질적으로 결합하지 않는다」란 F2 영역 단편 및 트롬빈 영역 단편 중 어느 것과도 검출 가능한 레벨에서 결합하지 않거나(즉, F2 영역 단편 및 트롬빈 영역 단편과의 결합이 백 그라운드 이하이다) 또는 검출할 수 있는 레벨에서 결합해도 그들과의 결합의 정도가 F1 영역 단편과의 결합보다 명백히 적고, F2 영역 단편이나 트롬빈 영역 단편과 결합하고 있는 것은 아닌 것이 당업자에게 있어서 명료한 정도로밖에 결합하지 않는 것을 의미한다. 항F1 항체는 PIVKA-Ⅱ의 F1 영역에도 프로트롬빈의 F1 영역에도 결합할 수 있는 항체이어도 좋고, PIVKA-Ⅱ 분자로의 특이성(즉, 프로트롬빈에는 결합하지 않고, PIVKA-Ⅱ에만 결합한다는 결합성)은 갖고 있지 않아도 좋다.

항F2 항체는 프로트롬빈 F2에 특이적으로 결합하는 항체이다. 즉, PIVKA-Ⅱ의 프로트롬빈 F2 영역 내에 에피토프를 갖고, 상기 에피토프를 인식해서 PIVKA-Ⅱ와 결합하는 항체이다. 예를 들면, 프로트롬빈 또는 PIVKA-Ⅱ의 F2 영역 단편과만 결합하고, F1 영역 단편 및 트롬빈 영역 단편 중 어느 것에도 실질적으로 결합하지 않는 항체는 「프로트롬빈 F2에 특이적으로 결합하는 항체」이다. 여기에서 말하는 「실질적으로 결합하지 않는다」란 F1 영역 단편 및 트롬빈 영역 단편 중 어느 것과도 검출 가능한 레벨에서 결합하지 않거나(즉, F1 영역 단편 및 트롬빈 영역 단편과의 결합이 백 그라운드 이하이다) 또는 검출할 수 있는 레벨에서 결합해도 그들과의 결합의 정도가 F2 영역 단편과의 결합보다 명백히 적고, F1 영역 단편이나 트롬빈 영역 단편과 결합하고 있는 것은 아닌 것이 당업자에게 있어서 명료한 정도로밖에 결합하지 않는 것을 의미한다. F2 영역의 아미노산 서열은 PIVKA-Ⅱ이어도 프로트롬빈이어도 동일하며, 따라서 항F2 항체는 통상 PIVKA-Ⅱ의 F2 영역에도 프로트롬빈의 F2 영역에도 결합할 수 있는 항체이다.

항PIVKA-Ⅱ 항체는 PIVKA-Ⅱ와만 결합하고, 프로트롬빈에는 실질적으로 결합하지 않는 항체이다.

항F1 항체, 항F2 항체 및 항PIVKA-Ⅱ 항체는 모두 모노클로날 항체이어도 폴리클로날 항체이어도 좋다. 면역 측정의 재현성 등의 관점으로부터는 모노클로날 항체를 바람직하게 사용 가능하다. 또한, 이들 항체는 대응 항원과의 결합성을 유지한 항체 단편(항원 결합성 단편)의 형태로 사용할 수도 있다.

폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항원 결합성 단편의 제작 방법 자체는 주지의 상법이며, 항F1 항체, 항F2 항체, 항PIVKA-Ⅱ 항체 및 이들의 항원 결합성 단편은 상법에 따라서 제작할 수 있다. 또한, 이들 항체는 시판품도 존재하기 때문에 시판의 항체를 사용해도 좋다.

항F1 폴리클로날 항체는, 예를 들면 F1 폴리펩티드 또는 그 부분 단편을 적당히 아쥬반트와 함께 동물(인간을 제외한다)에게 면역하고, 상기 동물로부터 채취한 혈액으로부터 항혈청을 얻어 상기 항혈청 중의 폴리클로날 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다. 면역은 피면역 동물 중에서의 항체값을 상승시키기 때문에 통상 수주간 걸쳐서 복수회 행한다. 항혈청 중의 항체의 정제는, 예를 들면 황산 암모늄 침전이나 음이온 크로마토그래피에 의한 분획, 어피니티 컬럼 정제 등에 의해 행할 수 있다. 항F2 폴리클로날 항체도 F2 폴리펩티드 또는 그 부분 단편을 면역원으로 해서 마찬가지로 제작할 수 있다.

항F1 모노클로날 항체는, 예를 들면 주지의 하이브리도마법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로는 F1 폴리펩티드(F1 영역 단편), 프로트롬빈, PIVKA-Ⅱ 또는 이들의 부분 단편을 적당히 아쥬반트와 함께 동물(인간을 제외한다)에게 면역하고, 상기 동물로부터 비장 세포나 림프구와 같은 항체 산생 세포를 채취하고, 이것을 미엘로마 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 조제하고, F1 폴리펩티드와 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하고, 이것을 증식시켜서 배양상청으로부터 항F1 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 항F2 모노클로날 항체도 마찬가지로 F2 폴리펩티드, 프로트롬빈, PIVKA-Ⅱ 또는 그 부분 단편을 면역원으로 하고, F2 폴리펩티드와 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택함으로써 제작할 수 있다.

항PIVKA-Ⅱ 항체에 대해서는 폴리클로날 항체는 카르복실화가 불완전한 Gla 영역 부분 단편을 면역원으로서 사용해서 제작할 수 있지만 본 발명에 있어서는 PIVKA-Ⅱ로의 충분한 특이성을 가질 필요가 있는 점에서 통상은 모노클로날 항체가 사용된다. PIVKA-Ⅱ 모노클로날 항체는 PIVKA-Ⅱ 또는 그 부분 단편(카르복실화를 받는 Gla 영역의 10 잔기 중 적어도 일부를 포함하는 부분 단편)을 면역원으로서 사용하고, 하이브리도마를 조제 후, PIVKA-Ⅱ에는 결합하지만 프로트롬빈에는 결합하지 않는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하여 항체를 회수하면 좋다. 항PIVKA-Ⅱ 항체의 제조 방법의 구체예로서 일본 특허 공개 소 60-60557 공보, 일본 특허 공개 평 9-249699 공보에 기재된 방법을 들 수 있다.

「항원 결합성 단편」은 원래의 항체의 대응 항원에 대한 결합성(항원 항체 반응성)을 유지하고 있는 한 어떠한 항체 단편이어도 좋다. 구체예로서는 Fab, F(ab')₂, scFv 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. Fab나 F(ab')₂는 주지와 같이 모노클로날 항체를 파파인이나 펩신과 같은 단백 분해 효소로 처리함으로써 얻을 수 있다. scFv(single chain fragment of variable region, 단쇄 항체)의 제작 방법도 주지이며, 예를 들면 상기와 같이 제작한 하이브리도마의 mRNA를 추출하여 1본쇄 cDNA를 조제하고, 면역 글로불린 H쇄 및 L쇄에 특이적인 프라이머를 사용해서 PCR를 행해서 면역 글로불린 H쇄 유전자 및 L쇄 유전자를 증폭하고, 이들을 링커로 연결하고, 적절한 제한 효소 부위를 부여해서 플라스미드 벡터에 도입하고, 상기 벡터에서 대장균을 형질 전환해서 scFv를 발현시키고, 이것을 대장균으로부터 회수함으로써 scFv를 얻을 수 있다.

면역원으로서 사용하는 폴리펩티드 또는 그 부분 단편은 화학 합성, 유전자 공학적 방법 등의 상법에 의해 제작할 수 있다. 또는, 신선 인간 혈장 등으로부터 프로트롬빈이나 PIVKA-Ⅱ를 추출·정제해서 얻을 수도 있다 (Thromb.Diath.Haemorph. 1966; 16:469-90 등 참조).

화학 합성법의 구체예로서는, 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등을 들 수 있다. 또한, 각종 시판된 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 화학 합성의 경우에는 아미노산 서열에만 의거하여 소망의 폴리펩티드를 합성할 수 있다.

유전자 공학적 방법에 의한 폴리펩티드의 제작 방법도 주지이다. 구체적으로는, 예를 들면 다음과 같은 방법으로 제작할 수 있다. 우선, 인간 유래 배양 세포 등으로부터 RNA를 추출하고, 역전사 반응에 의해 mRNA로부터 cDNA를 합성한다. 이 cDNA를 주형으로 하고, 인간 프로트롬빈의 mRNA 서열 정보에 의거하여 설계한 프라이머를 사용해서 PCR을 행하고, 프로트롬빈의 전장 또는 소망의 일부(F1 영역이나 F2 영역 등)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제한다. PCR에 사용하는 프라이머는 서열번호 2에 나타낸 염기 서열이나 GenBank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 프로트롬빈 서열 정보 등에 의거하여 적당히 설계할 수 있다. 또는, 소망의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 시판된 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 조제할 수도 있다. 각 아미노산을 코딩하는 코돈이 공지이기 때문에 아미노산 서열만 특정할 수 있으면 그 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열도 결정할 수 있다. 이어서, 조제한 폴리뉴클레오티드를 적당한 벡터에 장착하고, 적당한 발현계로 폴리펩티드를 발현시켜 이 폴리펩티드를 회수함으로써 소망의 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 사용하는 벡터나 각종 발현계(세균 발현계, 효모 세포 발현계, 포유 동물 세포 발현계, 곤충 세포 발현계, 무세포 발현계 등)도 주지이며, 여러 가지의 벡터나 숙주 세포, 시약류, 키트가 시판되어 있기 때문에 당업자이면 적당히 선택해서 사용할 수 있다. 인간 유래 배양 세포도 시판·분양되어 있어 입수는 용이하다.

항F1 항체와 항F2 항체의 혼합 비율은 PIVKA-Ⅱ 측정값에 있어서의 양호한 혈청·혈장 상관이 얻어지는 범위 내이면 좋고, 특별히 한정되지 않지만 항F1 항체:항F2 항체=1:0.2~2, 바람직하게는 1:0.3~1.5, 보다 바람직하게는 1:0.5~1.0의 혼합 비율로 특히 양호한 혈청·혈장 상관을 얻을 수 있다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 항F2 항체만을 사용했을 경우에는 혈장 샘플의 PIVKA-Ⅱ 측정값이 혈청 샘플의 측정값에 비해 높아 양호한 혈청·혈장 상관이 얻어지지 않는다. 또한, 항F1 항체만을 사용했을 경우에는 혈청 샘플의 PIVKA-Ⅱ 측정값이 혈장 샘플의 측정값에 비해 높아 양호한 혈청·혈장 상관이 얻어지지 않는다. 한편, 항F1 항체와 항F2 항체를 혼합해서 사용함으로써 혈청·혈장 상관을 개선할 수 있다.

샌드위치 면역 측정 자체는 주지의 상법이다. 구체예를 들면 화학 발광 효소 면역 측정법(chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA), 효소 결합 면역 흡착법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA), 래디오이뮤노어세이, 전기 화학 발광 면역 측정법 등의 각종 방법이 있고, 본 발명에 있어서는 어느 방법을 사용해도 좋다.

샌드위치 측정계에 있어서는 통상 2종류의 항체 중 한쪽을 고상으로 고정화한 고상 항체로 하고, 다른 쪽을 표식 항체로서 사용한다. 본 발명에 있어서는 항F1 항체/항F2 항체 혼합물을 1종류의 항체로 하고, 항PIVKA-Ⅱ 항체를 다른 1종류의 항체로서 사용하지만, 어느 것을 고상 항체로서 사용해도 좋다. 하기 실시예에서는 항PIVKA-Ⅱ 항체를 고상 항체로 하고, 항체 혼합물을 표식 항체로 해서 사용하고 있지만 이것에 한정되지 않는다.

항F1 항체/항F2 항체 혼합물을 표식 항체로서 사용할 경우를 예로 본 발명의 PIVKA-Ⅱ 측정 방법을 구체적으로 설명한다. 우선, PIVKA-Ⅱ 항체(고상 항체)를 담체로 고상화한다. 고상화된 PIVKA-Ⅱ 항체와 검체 중에 포함되는 PIVKA-Ⅱ를 접촉시킴으로써 고상 항체와 PIVKA-Ⅱ를 특이적으로 결합시킨다. 이어서, 결합되지 않은 검체 중의 성분을, 예를 들면 담체를 적당한 완충액으로 세정함으로써 제거한 후, 표식 물질로 표식된 항F1 항체/항F2 항체 혼합물(즉, 표식 항F1 항체와 표식 항F2 항체의 혼합물)을 고상 항체에 결합한 PIVKA-Ⅱ에 결합시킨다. 반응 종료 후, 미반응의 성분을 제거하기 위해서, 예를 들면 담체를 적당한 완충액으로 세정한 후, 표식 물질로부터의 시그널을 적당한 방법으로 검출함으로써 검체 중에 포함되는 PIVKA-Ⅱ를 측정하는 것이 가능해진다.

고상은 특별히 한정되지 않고, 공지의 샌드위치 면역 측정계에서 사용되어 있는 고상과 마찬가지이면 좋다. 고상의 재질의 구체예로서는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 세파로오스 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 고상의 물리적 형상은 본질적으로 중요하지 않다. 사용하는 고상은 그 표면으로의 항체의 고정화가 용이하며, 측정 중에 형성되는 면역 복합체와 미반응의 성분을 용이하게 분리할 수 있는 것이 바람직하다. 특히, 통상의 면역 측정법에 사용되는 플라스틱 플레이트나 자성 입자가 바람직하다. 취급, 보존 및 분리의 용이성 등의 관점으로부터 상술과 같은 재질의 자성 입자를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이들 고상으로의 항체의 결합은 당업자에게 주지의 상법에 의해 행해질 수 있다.

표식 물질도 특별히 한정되지 않고, 공지의 면역 측정계에서 사용되어 있는 표식 물질과 마찬가지의 것을 사용할 수 있다. 구체예로서는 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 염색 물질, 방사성 물질 등을 들 수 있다. 효소로서는 알칼리포스파타아제(ALP), 페록시다아제, β갈락토시다아제 등 공지의 것을 사용할 수 있지만 이것에 한정되는 것은 아니다. 높은 검출 감도의 측정계를 제공하기 위해서는 ALP를 사용하는 것이 바람직하다.

표식 물질로서 효소를 사용할 경우, 상기 효소에 대응한 발색 기질, 형광 기질 또는 발광 기질 등의 기질을 상기 효소와 반응시키고, 그 결과 발생하는 시그널을 측정함으로써 효소 활성을 구해서 측정 대상물을 측정할 수 있다. 예를 들면, 표식 물질로서 ALP를 사용할 경우, 3-(4-메톡시스피로(1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸)-4-일)페닐포스페이트 2나트륨(예를 들면, 상품명 AMPPD) 등의 발광 기질을 사용할 수 있다.

표식 물질로서 비오틴 또는 합텐이 사용되는 경우에는 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 염색 물질 또는 방사성 물질 등을 결합한 스트렙타아비딘 또는 합텐 항체 등을 사용해서 측정할 수 있다.

시그널의 검출은 표식 물질의 종류에 따라서 적당히 선택된다. 예를 들면, 시그널이 발색이면 비색계나 흡광 광도계를, 형광이면 형광 광도계를, 발광이면 포톤 카운터를, 방사선이면 방사선 측정 장치를 각각 사용하면 좋다. PIVKA-Ⅱ를 여러 가지의 농도로 포함하는 농도 기지의 표준 시료에 대해서 본 발명의 방법에 의해 PIVKA-Ⅱ를 측정하고, 표식으로부터의 시그널의 양과 표준 시료 중의 PIVKA-Ⅱ 농도의 상관 관계를 플롯팅해서 검량선을 작성해 두고, PIVKA-Ⅱ 농도가 미지인 검체에 대해서 같은 측정 조작을 행해서 표식으로부터의 시그널량을 측정하고, 측정값을 이 검량선에 적용시킴으로써 검체 중의 PIVKA-Ⅱ를 정량할 수 있다.

본 발명의 방법이 적용되는 검체는 피검자로부터 분리된 검체이며, 혈액 검체가 바람직하고, 특히 혈장 또는 혈청이 바람직하다. 본 발명의 측정 방법에 의하면 혈장 검체에서도 혈청 검체에서도 안정되게 PIVKA-Ⅱ를 측정할 수 있다. 검체는 필요에 따라 적당히 희석해서 사용해도 좋다.

본 발명은 또한 항PIVKA-Ⅱ 항체 또는 그 항원 결합성 단편(항PIVKA-Ⅱ 항체 등)과, 항F1 항체 또는 그 항원 결합성 단편(항F1 항체 등)과, 항F2 항체 또는 그 항원 결합성 단편(항F2 항체 등)을 포함하는 검체 중의 PIVKA-Ⅱ의 면역 측정 시약을 제공한다. 상기 면역 측정 시약에 있어서 항F1 항체 등 및 항F2 항체 등은 따로따로 용기에 봉입되어 있어도 좋고, 또는 미리 혼합되어서 용기에 봉입되어 있어도 좋다. 이들 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 안정화 등에 유용한 다른 성분을 더 포함하고 있어도 좋다. 또한, 이들 항체 또는 그 항원 결합성 단편은 표식 물질로 표식된 형태나 플레이트, 입자 등의 고상으로 고정화된 형태이어도 좋다.

상기 면역 측정 시약은 다른 시약류 등과 적당히 조합시켜서 검체 중의 PIVKA-Ⅱ의 면역 측정 키트로서 제공할 수 있다. 면역 측정에 필요한 기타 시약류는 주지이다. 예를 들면, 본 발명의 키트에는 상기한 면역 측정 시약 외에 검체 희석액, 세정액 및 표식 항체에 사용되어 있는 표식 물질이 효소인 경우에는 상기 효소의 기질액 등이 더 포함될 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명에 대해서 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 표식 항체의 제작

(A) 하이브리도마의 제작

정제 프로트롬빈(Shapiro S. et al., The purification of human prothrombin. Thromb.Diath.Haemorph. 1966; 16:469-90에 기재된 방법에 의해 신선 인간 혈장으로부터 정제한 것)을 0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH7.3)에 최종 농도가 0.2~1.0㎎/㎖가 되도록 희석하고, 등량의 프로인트 컴플리트 아쥬반트와 혼화해서 워터 인 오일형 에멀션으로 했다. 상기 에멀션을 7주령의 BALB/c계 마우스에 복강 내 투여하고, 이후 2주간마다 프로인트 컴플리트 아쥬반트를 프로인트 인컴플리트 아쥬반트로 변경해서 마찬가지의 면역을 2~3회 행했다. 또한, 약 2주간 후, 생리 식염수에 용해한 0.2~1.0㎎/㎖의 정제 프로트롬빈을 100㎕ 복강 내에 투여했다(최종 추가 면역).

최종 추가 면역 후 3일째에 이 면역 동물로부터 무균적으로 비장을 적출하고, 가위로 절편으로서 메시를 사용해서 비장을 각각의 세포에 더 풀고, RPMI-1640 배지로 3회 세정하여 세포 수를 계측했다. 대수 증식기의 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8-U1을 상기와 마찬가지로 세정 후, 계측한 비장 세포 수의 1~1/10의 세포 수로 조정하고, 50㎖ 용기의 원심관에 넣어 혼합했다. 200×g, 5분간 원심 분리를 행하여 상청을 제거하고, 폴리에틸렌글리콜(PEG)1500(Merck KGaA제) 1㎖를 첨가해서 세포 융합을 행했다. 그 후, RPMI-1640 배지 15㎖를 첨가해서 폴리에틸렌글리콜의 희석을 행했다.

융합 세포는 원심 분리(200×g, 5분간)에 의해 PEG을 제거한 후, 96 웰 플레이트를 사용하여 10% 소 태아 혈청, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)을 포함하는 RPMI-1640 배지 중에서 약 10일간 배양해서 하이브리도마만을 증식시켰다. 그 후, 배양 상청의 일부를 취하여 정제 프로트롬빈을 고상화 항원으로 사용한 ELISA법에 의해 프로트롬빈 항체를 각각 산생하는 웰을 스크리닝하고, 프로트롬빈에 대한 반응성을 갖는 모노클로날 항체를 산생하는 복수의 하이브리도마를 얻었다. 얻어진 하이브리도마에 대해서 상법의 한계 희석법에 따라 단일 클론화를 행했다.

(B) 모노클로날 항체의 제작

(A)에 기재된 방법에 의해 얻어진 하이브리도마를 미리 프리스탄 0.5㎖를 복강에 투여한 마우스 복강에 1마리당 약 1×10⁷개 이식하고, 복수 중에 산생되는 모노클로날 항체를 취득했다. 상기 모노클로날 항체의 정제는 프로틴A를 결합시킨 세파로오스 컬럼(Bio-Rad Laboratories, Inc.제)에 의해 IgG 프랙션을 분리함으로써 행했다.

이어서, 프로트롬빈폴리펩티트, F1 폴리펩티드 및 F2 폴리펩티드를 각각 마이크로티터 플레이트에 고상화하고, 얻어진 모노클로날 항체 각각에 대해서 각 폴리펩티드에 대한 반응성을 조사했다. 즉, 전장 프로트롬빈(TERMO사), 프로트롬빈-프래그먼트 1(Haematologic Technologies Inc.), 프로트롬빈-프래그먼트 2(Haematologic Technologies Inc.)를 각각 0.1M 인산 완충액(pH7.0)으로 5㎍/㎖의 용액으로 조제했다. 이들 항원 용액 100㎕를 마이크로 플레이트(Nunc사, Maxisorp)의 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 12~18시간 반응시킨 후, 항원 용액을 제거하고, 1% BSA, 0.1% 아지드화 나트륨을 포함하는 50mM Tris-HCl 완충액(pH7.2) 300㎕를 각 웰에 첨가했다. 실온에서 2시간 정치한 후, 마이크로 플레이트의 미반응 부위를 블록킹하고, 0.01% TritonX-100, 0.03M NaCl을 포함하는 10mM Tris-HCl(pH7.2)(이하, 세정액이라고 기재한다)로 3회 세정함으로써 각종 폴리펩티드 고상화 플레이트를 얻었다. 모노클로날 항체 hPTN7-2, PT5-23 및 20B8의 5㎍/㎖ 항체 용액을 제작하고, 이 용액 100㎕를 상기 3종류의 폴리펩티드(전장 프로트롬빈, 프로트롬빈-프래그먼트 1, 프로트롬빈-프래그먼트 2)를 고상화한 마이크로 플레이트의 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후, 항체 용액을 버리고, 세정액으로 3회 세정했다. 일정 농도로 희석한 알칼리포스파타아제 표식 항마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Inc.제) 100㎕를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후, 표식 항체 용액을 버리고, 세정액으로 3회 세정하고, 발색 기질인 10mM 4-니트로페닐인산, 1mM 염화 마그네슘을 포함하는 1M 디에탄올아민-염산 완충액(pH10.5)을 100㎕ 첨가해서 발색 반응을 행했다. 차광 하 실온에서 15분간 정치한 후, 50mM EDTA를 포함하는 0.1M 인산 완충액(pH7.0)을 100㎕ 첨가해서 반응을 정지한 후, 마이크로 플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, Inc.)로 450㎚/630㎚의 흡광도를 측정했다.

측정 결과를 도 1에 나타낸다. 모노클로날 항체 hPTN7-2 및 PT5-23은 프로트롬빈폴리펩티드 및 F1 폴리펩티드에 반응하고, F2 폴리펩티드에는 반응하지 않는 점에서 F1을 특이적으로 인식하는 항F1 모노클로날 항체인 것이 확인되었다. 한편, 모노클로날 항체 20B8은 프로트롬빈폴리펩티드 및 F2 폴리펩티드에 반응하고, F1 폴리펩티드에는 반응하지 않는 점에서 F2를 특이적으로 인식하는 항F2 모노클로날 항체인 것이 확인되었다.

(C) 표식 항체의 제작

이어서, 3㎎/㎖의 hPTN7-2 항체 용액을 6㎖ 취하고, 0.1M 시트르산 완충액(pH3.5)으로 평형화한 G-25 컬럼(Pharmacia사제)에 첨가하고, 항체 용액의 완충액 치환을 행했다. 이것에 1㎎/㎖ 펩신 용액을 약 100㎕ 첨가하고, 37℃, 1시간 방치하고, 트리스 완충액으로 pH를 중성 부근으로 한 후 슈퍼 덱스 200 컬럼(Pharmacia사제)에 첨가하고, 항체의 겔 여과 정제를 행했다. 얻어진 분획의 흡광도 280㎚에서의 싱글 피크를 풀링하여 hPTN7-2 항체 F(ab')₂프래그먼트로 했다. 이 F(ab')₂ 프래그먼트 용액 4㎖에 0.2M 2-메르캅토에틸아민(이하, 2-MEA로 기재한다) 용액을 200㎕ 첨가하고, 37℃ 2시간 방치하고, 환원 처리를 행했다. 이것을 G-25 컬럼에 첨가해서 2-MEA를 제거하고, hPTN7-2 항체 Fab' 프래그먼트로 했다.

10㎎/㎖의 고비활성 ALP 용액 1.5㎖를 0.1M 인산 완충액(pH7.0)으로 평형화한 G-25에 첨가하고, ALP 용액의 완충액 치환을 행했다. 이것에 10㎎/㎖ N-(4-말레이미드부틸옥시)-숙신이미드(이하, GMBS라고 기재한다)의 디메틸포름아미드 용액을 70㎕ 첨가하고, 30℃, 1시간 방치하여 반응을 행했다. 이 용액을 0.1M 인산 완충액(pH6.3)으로 평형화한 G-25 컬럼에 첨가하고, 과잉의 GMBS를 제거하고, 말레이미드화 ALP를 제작했다. 앞서 제작한 hPTN7-2 항체 Fab' 프래그먼트 용액 4㎖와 말레이미드화 ALP 용액 3㎖와 0.1M 인산 완충액(pH6.3) 13㎖를 혼합하고, 실온에서 1시간 방치함으로써 ALP 표식 항체를 제작했다. 이것에 2M 2-MEA 용액을 1㎖ 첨가하여 실온에서 30분간 방치하고, 여분의 말레이미드기를 블록킹한 후, 슈퍼 덱스 200 컬럼에 첨가하고, 정제를 행했다. 흡광도 280㎚의 몇 개의 피크 중, Fab'와 ALP가 1:1이 되는 분자량의 피크를 풀링하여 정제 ALP 표식 hPTN7-2 항체(ALP 표식 항F1 항체)로 했다. PT5-23 항체 및 20B8 항체에 대해서도 마찬가지로 해서 정제 ALP 표식 PT5-23 항체(ALP 표식 F1 항체) 및 정제 ALP 표식 20B8 항체(ALP 표식 항F2 항체)를 제작했다.

실시예 2. 측정 데이터

(D) PIVKA-Ⅱ의 측정

검체는 동일 건상 피검자로부터 얻어진 인간 혈청·혈장(헤파린나트륨 및 EDTA-2나트륨) 페어 검체이다. 측정에는 효소 표식 항체 이외에는 루미 펄스 프레스토 PIVKA-Ⅱ 에자이(FUJIREBIO Inc.제)에 부속된 시약(항체 결합 입자, 세정액)을 사용했다.

우선, PIVKA-Ⅱ와 특이적으로 결합하는 항PIVKA-Ⅱ 모노클로날 항체(마우스)가 결합된 항체 결합 입자(항PIVKA-Ⅱ 모노클로날 항체(마우스) 결합 페라이트 입자) 50㎕에 검체 20㎕를 첨가하여 교반한 후 37℃, 8분간 반응시켰다. 자력에 의해 자성 입자로부터 반응 잔액을 분리 제거하고, 세정액으로 세정했다. 세정 후의 입자에 (C)에서 제작한 ALP 표식 항F1 항체(hPTN7-2 항체 또는 PT5-23 항체)(최종 농도 0.4㎍/㎖)와 ALP 표식 항F2 항체(최종 농도 0.2㎍/㎖)를 첨가하여 교반 후 37℃, 8분간 반응시켰다. 또한, 비교예로서 효소 표식 항체에 ALP 표식 항프로트롬빈폴리클로날 항체를 사용했다.

그 후, 다시 자력에 의해 자성 입자와 반응 잔액을 분리 제거하고, 세정액으로 세정했다. 이 입자에 알칼리포스파타아제의 화학 발광 기질인 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3''-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄·2나트륨염(AMPPD)을 포함하는 기질액 200㎕를 첨가하고, 37℃에서 4분간 효소 반응시켰다. 반응 후의 화학 발광량을 루미노미터로 측정했다. 측정 기기로는 전자동 화학 발광 면역 측정 장치 루미 펄스 프레스토Ⅱ(FUJIREBIO Inc.제)를 사용했다.

표 1에 효소 표식 항체로서 ALP 표식 항프로트롬빈폴리클로날 항체를 사용하여 9개의 혈청·혈장 페어 검체를 측정한 결과를 나타낸다. 또한, 표 2에 효소 표식 항체로서 ALP 표식 항F1 항체(hPTN7-2항체)와 ALP 표식 항F2 항체(20B8 항체)의 혼합물을 사용하여 9개의 혈청·혈장 페어 검체를 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이 ALP 표식 항프로트롬빈폴리클로날 항체를 사용했을 경우, 헤파린 혈장에 있어서의 혈장/혈청 비율은 평균 약 79%이며, 혈청·혈장 상관이 낮은 것이 확인되었다. 한편, ALP 표식 항체로서 항F1 항체와 항F2 항체를 중량비 2:1로 혼합했을 경우에는 표 2에 나타내는 바와 같이 헤파린 혈장에 있어서의 혈장/혈청 비율은 약 102%, EDTA 혈장에 있어서의 혈장/혈청 비율은 약 105%로 어떠한 경우에도 혈청·혈장 상관이 개선되었다.

표 3에는 항F1 항체로서 hPTN7-2 항체 대신에 PT5-23 항체를 사용하고, 효소 표식 항체로서 ALP 표식 항F1 항체(PT5-23항체)와 ALP 표식 항F2 항체(20B8 항체)의 2:1 혼합물을 사용하고, 10개의 혈청·혈장 페어 검체에 있어서의 PIVKA-Ⅱ를 측정한 결과를 나타낸다. ALP 표식 항F1 항체로서 PT5-23 항체를 사용했을 경우에도 ALP 표식 항F2 항체와 혼합해서 사용함으로써 헤파린 혈장에 있어서의 혈장/혈청 비율은 약 106%, EDTA 혈장에 있어서의 혈장/혈청 비율은 약 107%로 어떠한 경우에도 양호한 혈청·혈장 상관이 얻어지는 것이 확인되었다.

(E) 혼합비의 검토

ALP 표식 항F1 항체와 ALP 표식 항F2 항체의 혼합 비율을 검토했다. 표 4에 나타내는 바와 같이 표식 항체로서 항F2 항체 1.5㎍/㎖을 단독으로 첨가했을 경우, 혈장/혈청 비율은 약 118%, 항F2 항체 0.5㎍/㎖를 단독으로 첨가했을 경우, 혈장/혈청 비율은 약 127%로 매우 높았다. 표식 항체로서 항F1 항체 1.5㎍/㎖를 단독으로 첨가했을 경우에는 혈장/혈청 비율은 약 68%로 매우 낮은 결과가 되었다. 이와 같이 항F1 항체 또는 항F2 항체 단독으로는 혈청·혈장 상관이 낮은 것을 알 수 있었다. 한편, 항F1 항체와 항F2 항체를 혼합했을 경우, 검토한 비율 2:1~1:2의 전부에 있어서 혈장/혈청 비율이 약 98%~약 110%로 양호한 혈청·혈장 상관을 나타내는 것이 확인되었다.

SEQUENCE LISTING <110> FUJIREBIO Inc. EIDIA Co., Ltd. <120> Method, reagent and kit for measurement of PIVKA-II <130> PF489-PCT <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 622 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(57) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (62)..(62) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (69)..(69) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> Gla or Glu <400> 1 Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln 20 25 30 Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu 35 40 45 Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa Cys Val Xaa Xaa Thr 50 55 60 Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa Ser Ser Thr Ala Thr 65 70 75 80 Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro 85 90 95 Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu 100 105 110 Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu 115 120 125 Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu Ile Asn Ser 130 135 140 Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val 165 170 175 Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr 180 185 190 Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro 195 200 205 Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg 210 215 220 Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala 225 230 235 240 Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln 245 250 255 Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val 260 265 270 Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu 275 280 285 Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp 290 295 300 Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr 305 310 315 320 Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys 325 330 335 Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu 340 345 350 Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser 355 360 365 Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys 370 375 380 Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp 385 390 395 400 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn 405 410 415 Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr 420 425 430 Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr 435 440 445 Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala 450 455 460 Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro 465 470 475 480 Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly 485 490 495 Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr 500 505 510 Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu 515 520 525 Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile 530 535 540 Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg 545 550 555 560 Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser 565 570 575 Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu 580 585 590 Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg 595 600 605 Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu 610 615 620 <210> 2 <211> 2018 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtcaggacag acaattcctc agtgacccag gagctgacac actatggcgc acgtccgagg 60 cttgcagctg cctggctgcc tggccctggc tgccctgtgt agccttgtgc acagccagca 120 tgtgttcctg gctcctcagc aagcacggtc gctgctccag cgggtccggc gagccaacac 180 cttcttggag gaggtgcgca agggcaacct ggagcgagag tgcgtggagg agacgtgcag 240 ctacgaggag gccttcgagg ctctggagtc ctccacggct acggatgtgt tctgggccaa 300 gtacacagct tgtgagacag cgaggacgcc tcgagataag cttgctgcat gtctggaagg 360 taactgtgct gagggtctgg gtacgaacta ccgagggcat gtgaacatca cccggtcagg 420 cattgagtgc cagctatgga ggagtcgcta cccacataag cctgaaatca actccactac 480 ccatcctggg gccgacctac aggagaattt ctgccgcaac cccgacagca gcaccacggg 540 accctggtgc tacactacag accccaccgt gaggaggcag gaatgcagca tccctgtctg 600 tggccaggat caagtcactg tagcgatgac tccacgctcc gaaggctcca gtgtgaatct 660 gtcacctcca ttggagcagt gtgtccctga tcgggggcag cagtaccagg ggcgcctggc 720 ggtgaccaca catgggctcc cctgcctggc ctgggccagc gcacaggcca aggccctgag 780 caagcaccag gacttcaact cagctgtgca gctggtggag aacttctgcc gcaacccaga 840 cggggatgag gagggcgtgt ggtgctatgt ggccgggaag cctggcgact ttgggtactg 900 cgacctcaac tattgtgagg aggccgtgga ggaggagaca ggagatgggc tggatgagga 960 ctcagacagg gccatcgaag ggcgtaccgc caccagtgag taccagactt tcttcaatcc 1020 gaggaccttt ggctcgggag aggcagactg tgggctgcga cctctgttcg agaagaagtc 1080 gctggaggac aaaaccgaaa gagagctcct ggaatcctac atcgacgggc gcattgtgga 1140 gggctcggat gcagagatcg gcatgtcacc ttggcaggtg atgcttttcc ggaagagtcc 1200 ccaggagctg ctgtgtgggg ccagcctcat cagtgaccgc tgggtcctca ccgccgccca 1260 ctgcctcctg tacccgccct gggacaagaa cttcaccgag aatgaccttc tggtgcgcat 1320 tggcaagcac tcccgcacca ggtacgagcg aaacattgaa aagatatcca tgttggaaaa 1380 gatctacatc caccccaggt acaactggcg ggagaacctg gaccgggaca ttgccctgat 1440 gaagctgaag aagcctgttg ccttcagtga ctacattcac cctgtgtgtc tgcccgacag 1500 ggagacggca gccagcttgc tccaggctgg atacaagggg cgggtgacag gctggggcaa 1560 cctgaaggag acgtggacag ccaacgttgg taaggggcag cccagtgtcc tgcaggtggt 1620 gaacctgccc attgtggagc ggccggtctg caaggactcc acccggatcc gcatcactga 1680 caacatgttc tgtgctggtt acaagcctga tgaagggaaa cgaggggatg cctgtgaagg 1740 tgacagtggg ggaccctttg tcatgaagag cccctttaac aaccgctggt atcaaatggg 1800 catcgtctca tggggtgaag gctgtgaccg ggatgggaaa tatggcttct acacacatgt 1860 gttccgcctg aagaagtgga tacagaaggt cattgatcag tttggagagt 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Claims

프로트롬빈 프래그먼트 1에 특이적으로 결합하는 항F1 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 프로트롬빈 프래그먼트 2에 특이적으로 결합하는 항F2 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물 및 PIVKA-Ⅱ에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-Ⅱ 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용한 면역 측정에 의해 검체 중의 PIVKA-Ⅱ를 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 항F1 모노클로날 항체는 F1 영역 내의 에피토프를 인식해서 PIVKA-Ⅱ에 결합하는 항체이며, 상기 항F2 모노클로날 항체는 F2 영역 내의 에피토프를 인식해서 PIVKA-Ⅱ에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 면역 측정은 상기 혼합물을 표식 항체로 하고, 상기 항PIVKA-Ⅱ 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 고상화 항체로서 사용한 샌드위치법에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 혼합물은 항F1 모노클로날 항체와 항F2 모노클로날 항체를 1:0.2~2의 비율로 포함하는 혼합물인 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 검체는 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.
PIVKA-Ⅱ에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-Ⅱ 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 프로트롬빈 프래그먼트 F1에 특이적으로 결합하는 항F1 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 프로트롬빈 프래그먼트 F2에 특이적으로 결합하는 항F2 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 PIVKA-Ⅱ의 면역 측정 시약.
제 7 항에 기재된 검체 중의 PIVKA-Ⅱ의 면역 측정 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 PIVKA-Ⅱ의 면역 측정 키트.
제 4 항에 있어서,
상기 혼합물은 항F1 모노클로날 항체와 항F2 모노클로날 항체를 1:0.2~2의 비율로 포함하는 혼합물인 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 검체는 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 검체는 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 PIVKA-Ⅱ의 측정 방법.