JPS6060557A - Ｐｉｖｋａ−２の測定方法および試薬 - Google Patents

Ｐｉｖｋａ−２の測定方法および試薬

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JPS6060557A
JPS6060557A JP58167458A JP16745883A JPS6060557A JP S6060557 A JPS6060557 A JP S6060557A JP 58167458 A JP58167458 A JP 58167458A JP 16745883 A JP16745883 A JP 16745883A JP S6060557 A JPS6060557 A JP S6060557A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＰＩＶＫＡ−Ｈの測定方法および測定試薬に関
する。さらに詳しくは、ＰＩＶＫＡ−［を二抗体サンド
イツチ法を利用する酵素免疫測定法によって測定する測
定方法および測定試薬に関する。
ＰＩＶＫＡ、　■とはプロトロンビン前駆物質およびプ
ロトロンビン前駆物質のグルタミン酸残基についてのカ
ルボキシル化体であって、当該カルボキシル化の程度が
不完全なものを言う。これに対し。
プロトロンビン前駆物質のグルタミン酸残基についての
ガルボキシル化体であって、当該カルボキシル化の程度
が完全なものを正常プロトロンビンと言う。従って、　
ＰＩＶＫＡ−Ｉ［とは正常プロトロンビンのγ−カルボ
キシルグルタミン酸残基についての脱カルボキシル化体
であるということもできる。ところで実際には２例えば
血液中においては上記定義に属しながらカルボキシル化
の程度の異なる複数の物質が混在した状態で存在してお
り。
当該混在物質群についてこれを包括的にＰＩＶＫＡ　−
■と呼ぶことがある。本発明は主として血液中に存する
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定を目的としているので。
本発明におけるＰＩＶＫＡ−［とは、特にことわらない
限り、包括的な意味におけるＰＩＶＫＩ−ｆｉを言う。
他方、　ＰＩＶＫＡ−ｎは生理的、臨床的にはビタミン
にの不足する状態あるいはビタミンに拮抗剤の投与によ
ってビタミンに作用の抑制された状態の場合に出現する
ことがわかっている。すなわちプロトロンビン前駆物質
はそのグルタミン酸残基がビタミンにおよびカルボキシ
ラーゼの存在下においてカルボキシル化され活性体正常
プロトロンビンとなるのであるが、ビタミンにの不足状
態あるいは抑制状態においては当該カルボキシル化が不
完全となり、その結果ＰＩＶＫＡ−ｎが血液中に出現す
るのである。ＰＩＶＫＡ−ｎとはＰｒｏｔｅｉｎ　１ｎ
ｄｕｃｅａ　ｂｙｖｉｔａｍｉｎ　Ｋ　ａｂｓｅｎｃｅ
−■の略称であり、これは上記生理的観点に基づいて命
名されたものである。
ＰＩＶＫＡ−ｎおよびＰＩＶ臥−■とビタミンにとの関
連について参考のために下記文献１）〜３）を列挙する
。
１）　５ｔｅｎｆｌｏ　Ｊ、　Ｆｅｒｎｌｕｎｄ　Ｐ、
　Ｅｇａｎ　Ｗ、　Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ　Ｐ−８ｃｉ
、　ＵＳＡ、　（１９７４）　７１．２７３０３２）　
Ｎｅ１ｓｅｓｔｕｅｎ　ＧＬ、　Ｚｙｔｋｏｖｉｃｚ　
ＴＨ，Ｈｏｗａｒｄ　ＪＢ。
Ｔｈｅ　ｍｏｄｅ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｔ
ａｍｉｎ　Ｋ　：　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＯｆ
γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓ
　ａ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉ
ｎ。
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９７４　；　２４９
　：　６３４７５０３）　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　Ｓ、　
５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　Ｌ、　Ｐｅｔｅｒｓｅ
ｎ　ＴＥ。
Ｍｏｒｒｉｓ　ＨＲ，Ｄｅｌｌ　Ａ、　Ｐｒｉｍａｒｙ
　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅｖｉｔａｍｉｎ　
Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐａｒｔ　ｏｆ　ｐｒｏｔｈ
ｒｏｍｂｉｎ。
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１９７４　；　４４　：　１８
９−９３さて、血液中のビタミンＫを測定することによ
ってビタミンに欠乏症、とりわけ乳児の頭蓋内出血など
乳児のビタミンに欠乏性出血症を早期に発見することは
臨床上重要な作業である。
かかる予知予防の評価のために現在はヘパブラスチンテ
ス）　（ＨＰＴ）が頻用されているのであるが。
特に乳児期においては凝固蛋白による生理的低値が認め
られるためにヘパプラスチンテストは必ずしもビタミン
にの欠乏状態を反映するものではないのが実情である。
そこで、より適格な、かつ正確な予知予防法を確立する
ためにはＰＩＶＫＡ−ＩＩを直接に定量する必要があり
、この目的のために二次元交叉免疫電気泳動法（ＣＩＥ
Ｐ）の実施が推奨されるのである。しかしながらこの方
法は操作が繁雑であり、多くの検体数がある場合には、
それを同時に処理することは困難であり、臨床検査の場
において実用的ではない。従ってより簡便な方法を確立
するためには放射免疫測定法、酵素免疫測定法の実施が
好まれるのである。例えば下記文献４）に示される例は
放射免疫測定法を実施する方法である。
４）　Ｒｉｔａ　Ａ、　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｋ　−ｄｅ
ｐｅｎｄｅｎｔ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ　ｄｅｆ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｉｎ　１ｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ　
： Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ、　ｖｏｌ、　３０５　Ｎｏ、　５（１９８１）　
２４２−２４８ しかしこの方法は競合ラジオイムノアッセイを利用する
方法であり、いまだ実用的なものとは言えない。またこ
の方法ではＰＩＶＫＡ−［特異抗体の精製が繁雑であり
、かつ得られても量的制限がある。
かかる実情にかんがみ本発明者はＰＩＶＫＡ−Ｉｆを正
確に、かつ簡便に測定することができ、とりわけ臨床検
査の場において、多数の検体数を同時に処理することの
できる実用的な方法をめて検討をおこなった。特に臨床
検査の場においては２例えば小児科領域におけるとと（
測定に先立ち採取血漿をあらかじめ１紙により乾燥する
前処理が通常におこなわれており、従ってめられている
方法は当該前処理を実施した場合であってもＰＩＶＫＡ
　−■を正確に、かつ簡便に測定できる方法でなければ
ならないという特別の事情がある。本発明者はかかる事
情を考慮しつつ検討をおこない、その結果、二抗体サン
ドイツチ法を利用する酵素免疫側べ゛ 定法を採用すそきこと、並びに当該二抗体サンドインチ
法における固相化抗体としてモノクロナール抗ＰＩＶＫ
Ａ−ｎ抗体を使用すべきこと見出し２本発明を完成する
に至った。
すなわち１本発明の目的はたとえ検体数が多（。
また乾燥前処理をおこなった場合においても、それら検
体中のＰＩＶＫＡ−ｎを正確に、かつ簡便に測定するこ
とを可能にすることであり２本発明は該目的の達成のた
めに二抗体サンドイツチ法を利用する酵素免疫測定法で
あって、固相化抗体としてモノクロナール抗ＰＩＶＫＡ
−ＩＩｎ抗体使用する構成を提示する。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明に係るモノクロナール抗ＰＩＶＫＡ−Ｉｔ抗体は
例えば次のように製造される。
まずＰＩＶＫＡ−ＩＩを用意する。このためにはワーフ
ァリン服用者血漿をＢａＳＯ４，ＢａＣＯ３処理してプ
ロトロンビンを吸着除去し２次にＤＥ−５２ｃｅｎｕｌ
ｏｓｅによるイオン交換をおこない、最後に正常プロト
ロンビンおよびＰＩＶＫＡ−ＩＩの両者に対する共通部
分のモノクロナール抗体を用いたアフィニティヵラムに
吸着せしめ、４Ｍ塩酸グアニジンにて溶出し、透析し、
濃縮すれば得られる。
用意したＰＩＶＫＡ−ｎ　５０μｇを同容量のフロイン
ト完全アジュバントと共にＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内
に投与し、さらに２週後にＰＩＶＫＡ−ＩＩ　１５μｇ
を尾静脈内へ投与し、３日後に牌細胞を摘出する。
直ちに腫瘍細胞株Ｐ３Ｕ１と渡辺等の方法（下記文献５
）参照）によりポリエチレングリコール４０００をもっ
て細胞融合し、限界希釈法によりクローニングを３回お
こなえばよい。ここでクローニングは例えばｍｏｎｏ−
ＡＢ−８ｃｒｅｅｎ　Ｇキット（Ｚｙｍｅｄ）を用い。
正常プロトロンビンとは反応を呈さす、かつ脱カルボキ
シル化したプロトロンビンとのみ反応を呈するウェルを
選択し、さらにこのウェルがネーティブな異常プロトロ
ンビンと反応を呈することを確認することによってモノ
クロナール抗ＰＭ（Ａ−■抗体産生セルラインとして確
立される。なお。
ここで使用される正常プロトロンビンおよび脱カルボキ
シル化したプロトロンビンはそれぞれ下記文献６）の５
ｈａｐｉｒｏ等の方法および７）のＴｕｈ￥等の方法に
よって製造すればよい。正常プロトロンビンは例えば以
下のごとく製造される。
新鮮凍結血漿にＤＥ−５２ｃｅｕｕｌｏｓｅおよびクエ
ン酸緩衝液を加え、撹拌後沈渣を洗浄し、クエン酸緩衝
液で溶出し、　ＢａＣ１，を加えてこれを吸着せしめ。
クエン酸緩衝液で溶出し、飽和硫酸アンモニウムを加え
て塩析せしめる。塩析物をクエン酸緩衝液にサスペンシ
ョンし、透析し、　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００カラ
ムでゲル涙過して所定のピークに相当するフラクション
を集める。ＤＥ−５２ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムにかけ
ＮａＣ１の濃度勾配をもったクエン酸緩衝液で溶出せし
めれば目的の正常プロトロンビンが得られる。
５）渡辺、海津：リンパ球の細胞融合法Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｖｏｌ、　１．　Ｎｏ、　
１．４６−５１　（１９８０）５）　５ｈａｐｉｒｏ　
Ｓ、　Ｓ、　Ｄ、Ｅ、　Ｗａｕｇｈ　：　Ｔｈｅ　ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｔｈｒ
ｏｍｂｉｎ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔｈ　ｚＨａｅ
ｍｏｒｐｈ、、　１６．４６９−４９０　（１９６６）
７　）　Ｔｕｈｙ　ＰＭ、、　Ｂｌｏｏｍ　ＪＷ、　Ｍ
ａｎｎ　ＫＧ　：１） １８、５８４２−８ 次に本発明における二抗体サンドイツチ法を利用する酵
素免疫測定法は例えば次のように実施される。
測定系全体の構成要素は固相、固相コート用のモノクロ
ナール抗ＰＩＶＫＡ−ｎ抗体（第一抗体）。
標準抗原または被検血漿、標識用抗体（第二抗体）。
酵素および基質である。固相としてはエンザイムイムノ
アッセイ用のマイクロタイタープレートのウェルを用い
ればよい。測定に先立ちモノクロナ−ル抗ＰＩＶＫＡ−
ＩＩ抗体ヲ炭酸緩衝液（ｐＨ８，５）　ＩＣ溶解し１例
えばポリスチロール製エンザイムイムノアッセイ用ウェ
ルに入れ、４°Ｃで一夜放置すれば固相表面はコートさ
れる。しかしモノクロナール抗体によってコートされて
いない表面部分もあるので、この部分に対しては牛血清
アルブミンをリン酸緩衝液に溶解してウェルに加え同様
に放置して牛血清アルブミンによってコートする。
標準抗原としては温度既知の患者血漿を使用する。標準
抗原を牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）に溶解し、コートされたウェルに加えて反応せしめて
から洗浄すればよい。
標識用抗体（第二抗体）としては適当なる抗ヒトプロト
ロンビン抗体を選択すればよ（９例えば抗ヒトプロトロ
ンビンウサギＩｇＧを使用すればよい。抗ヒトプロトロ
ンビンウサギＩｇＧは次のように製造すればよい。
まず、新鮮凍結血漿より前記５ｈａｐｉｒｏ等の方法に
よりヒトプロトロンビンを得る。次にこのヒトプロトロ
ンビンでウサギを免疫し、採血し、血清に硫酸アンモニ
ウムを加えて塩析し、透析後、　ＤＢ・５２　ｃｅｕｕ
ｌｏｓｅでイオン交換する。これをヒトプロトロンビン
アフィニティーカラムにかけ、４Ｍ塩ンビンアフィニテ
ィー力ラムは０Ｎ−Ｂｒを常法により活性化し、これに
ヒトプロトロンビンをリン酸緩衝液に溶解して加えて吸
着せしめれば調製される。
酵素としてはアルカリホスファターゼ、グルコースオキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、ベータオキシダーゼ等を
使用することができる。測定に先立ちゲルタールアルデ
ヒドのごとき結合剤をもって標識用抗体に酵素を結合せ
しめてコンジュゲートとし１本発明測定方法の実施のた
めの試薬の一部としてあらかじめ準備しておくことがで
きる。
例えば下記文献８）のＮａｋａｎｅ等の方法により標識
すればよい。
８）　ＰＫ、　Ｎａｋａｎｅ、　ＲＭ、　Ｎａｋａｍｕ
ｒａ、　ＷＲ，Ｄｉｔｏ、　ＥＳ。
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　（３ｅｄ）Ｐ８１　
Ａｌａｎ　ＲＬｉ５ｓ　Ｉｎｃ、　ＮＹ基質は選択した
酵素に応じて適宜使用すればよい。例えば酵素としてア
ルカリホスファターゼを選択した場合においてはｐ−ニ
トロフェニルホスフェートを、またペルオキシダーゼを
選択した場合においてはＡＢＴＳ　（２，２’−アジノ
ービ（３′−エチルベンツチアゾリンスルホン酸））を
使用すればよい。
測定は二抗体サンドインチ法を利用する酵素免疫測定法
における通常の手順に従っておこなえばよい。従って後
記実施例において示されるごとくコートしたウェルに標
準抗原または被検血漿を加えてインキュベートし、続い
て酵素標識抗体を加えてインキュベートシア最後に基質
を加えてインキュベー）シ、””　−’　” トー反応を停止せしめてから、基質の分解量を分光光度
計を用いて測定すればよい。
次に本発明測定試薬は本発明測定方法の実施に直接使用
する試薬であり、測定方法におけると同一の目的を達成
するものである。従って本発明測定試薬の具体的態様を
示せば次のごとくなる。
すなわち２本発明測定試薬はモノクロナール抗ＰＩＶＫ
Ａ−ｍ抗体を必須の構成成分とし、当該抗体単独または
当該抗体に固相、標準抗原、標識用抗ヒトプロトロンビ
ン抗体、酵素部よび基質よりなる群から任意に選択した
−乃至五を組合せたもののセットである。ここにおいて
、セット中に固相が含まれる場合に当該固相がモノクロ
ナール抗ＰＩＶＫＡ−ＴＩ抗体によってコートされた状
態で提供されること、あるいはセット中に標識用抗ヒト
プロトロンビン抗体と酵素とが含まれる場合に２両者が
コンジュゲートした状態で提供されることは自由であり
、これらも同様に本発明測定試薬の態様に含まれる。ま
た測定の実施の便益のために適当なる抗原希釈液９反応
希釈液、基質溶解液９反本発明の効果は次のごとく要約
される。
まず本発明は二抗体サンドイツチ法を利用する酵素免疫
測定法を実施するものであるから、操作が単純簡明であ
り、従って多数の検体を同時に処理することを可能とし
ており、臨床検査の場に対して実用性が高い。
次に、ＰＩＶＫＡ−ｎと正常プロトロンビンとは分。
子構造が酷似しているので、　ＰＩＶＫＡ−ｍで免疫し
て得られる通常の抗体は正常プロトロンビンと交叉して
しまうのであるが９本発明においては固相化抗体として
モノクロナール抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体を使用するので
、かくのごとき交叉はなく、従って後記実験例において
示されるごと（ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する検量性が非常
によ（、従来よりＰＩＶＫＡ−［の陽性または陰性につ
いての正確な判定をする方法として推奨されてきた二次
元交叉免疫電気泳動法（ａｍｐ）との間によい相関性が
ある。
とりわけ本発明の優れた点は、測定に先立ち被検血漿を
あらかじめ例えば先天代謝異常スクリーニング用乾燥１
紙を用いて乾燥する前処理をおこなった場合においても
検量性を失うことがなく。
被検血漿をそのまま直接に測定する場合におけると同様
の測定結果をもたらすことができる点である。
以下に記載する実験例をもって本発明の詳細な説明する
。
実験例１ 試料および方法 三種類の試料を用意した。すなわちまず正常血漿１ｍＬ
当りＢａＳＯ４およびＢａＣ０，を各１１００Ｔｎずつ
加えて１２０分間撹拌し、正常プロトロンビンをあらか
じめ吸着除去したプロトロンビンフリー血漿（試料ａ）
を用意した。次に試料ａに後記実施例１において得られ
た正常プロトロンビンを添加した試料（試料ｂ）および
ｐｒｖＫＡ−ｎを添加した試料（試料Ｃ）を用意した。
各試料をモノクロナール抗ＰＩＶＫＡ−Ｉ［抗体をコー
トしたウェルにウェル当りの蛋白量を変えて注入し。
以下後記実施例４におけると同じ手順に従って測定をお
こなった。
結果を図１に示す。図１の積軸はウェル当りのＰＩＶＫ
Ａ−ＩＩまたはプロトロンビン蛋白量（ＪＬｇ）を表わ
し、縦軸はＯＤ、、ｎｍ値を表わす。また図中Ｘ印線は
試料ａ、・印線は試料す、　Ｑ印線は試料Ｃについての
測定結果を示す。図１より本発明はＰＩＶＫＡ−Ｉ［に
対して特異性が高く、かつ検量性がよいことが判明する
。
実験例２ 試料および方法 ワーファリン服用患者血漿３２例、ビタミンＩく欠乏性
出血症意見血漿３例を用意して試料とした。各試料につ
き二次元交叉免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）による陰性ま
たは陽性の判定並びに後記実施例４におけると同じ手順
に従う本発明方法による測定をおこなった。また健康成
人血漿２５例について同じ（実施例４におけると同じ手
順に従う本発明方法による測定をおこなった。なりａＳ
ＯｚおよびＢａＣＯ３による前記処理をおこなって正常
プロトロンビンを除去し、標準抗原としてのＰＩＶＫＡ
−Ｉ［を用意し２次いでローレル法で当該ＰＩＶＫＡ−
ｎを定量し、正常プロトロンビン１μｇに相当する抗原
量をｌ　Ａ、　Ｕ、と定め、　Ａ、、Ｕ、／乳り値と本
発明方法によるＯＤ４２０ｍｇ値との間の検量線をあら
かじめ作成して、算出した。ここでこの検量線における
測定範囲内でのＣｖは０．０１５〜０．０６であった。
結果 結果を図２に示す。図２の左欄は健康成人血漿について
、また右欄はワーファリン服用患者血漿およびビタミン
に欠乏性出血意見血漿についての結果を示す。右欄中◆
印はビタミンに欠乏性出血症意見血漿についての結果を
表わし。
・印はワーファリン服用患者血漿であって。
ＣＴＲＰ　１７″セいて臣什に則１宇六れた面野例の枯
巣をまたＱ印はワーファリン服用患者血漿であって７Ｃ
ＩＥＰにおいて陰性と判定された血漿例の結果を表わす
。図２より本発明が正確な判定方法として推奨されるＣ
ＩＥＰとの間によい相関性があり。
それに代わり得ることが判明する。
実験例３ 試料および方法 実験例２の試料および方法の項に記載される正常プロト
ロンビンを除去した後の血漿ζこＯ型赤血球を５５　：
　４５の比で添加し、先天代謝異常スクリーニング用乾
燥１紙に浸透し、室温で６時間乾燥後、直径５咽にパン
チアウトし、その８枚につき牛血清アルブミン含有リン
酸緩衝液０．３ｍＬを加えて溶出したものを標準抗原と
しての試料とした。標準抗原をウェルに各種の濃度にお
いて注入し、後記実施例４におけると同様の手順によっ
て本発明方法の測定をおこなうた。
結果 結果を図３に示す。図３は検量線であり、６３〜６３　
Ｘ　１Ｏ−３Ａ、Ｕ、／１１ｔ／、　（７）範囲ニオケ
ア）　ＣＶ　ｌ；！　０．０６３〜０．０９２であった
。図３より乾燥用沢紙による前処理をおこなった場合に
おいても２本発明測定方法の検量性は失われることがな
いことが判明する。
実験例４ 試料および方法 ワーファリン服用患者血漿２１例、ビタミンに欠乏性出
血症意見血漿３例を試料として用意した。各試料につい
てそのまま直接に実施例４におけると同様の手順による
測定および実験例３の試料および方法の項に記載の要領
に従ってあらかじめ乾燥用１紙による前処理をおこなっ
てから実施例４におけると同様の手順による測定の両方
をおこなった。
結果 結果を図４に示す。図４の横軸は直接に測定をおこなっ
た場合の測定値を表わし、縦軸は乾燥用沢紙による前処
理をおこなってから測定した場合の測定値を表わす。ま
た図中＊印を付した例はビタミンに欠乏性出血症意見血
漿につぃての結果を示す。図中の回帰直線の式はＹ−０
，５７Ｘ＋３．６７であり、その相関係数中は０．９５
４（Ｐ＜０．００５）である。図４より両淘１定値の間
にはよい相関性があり、従って血漿採取が困難であり、
乾燥のための前処理をおこなう場合においても９本発明
は被検血漿をそのまま直接に測定する場合におけると同
様の測定結果をもたらすことができることが判明する。
以下に記載する実施例をもって本発明をさらに具体的に
説明する。
実施例Ｉ Ａ、新鮮凍結血漿４００　ｍｌにＤＥ−５２ｃｅｌｌｕ
ｌｏｓｅおよび１９ｍＭクエン酸ナトリウム液（ｐＨ７
，０）　２００ｍｊを加え、５分間撹拌し、　１５００
　ｒｐｍにて遠心分離した。沈渣を１００ｍＭクエン酸
三ナトリウム液（ｐＩ−１７，０）で１回につき４００
ｍＬずつ３回洗浄した。次に５ＱＱｍＭクエン酸三ナト
リウム液（ｐＨ７，０）４００ｍｌを加えて溶出せしめ
、溶出液に２ＱｍＭクエン酸三ナトリウム液（ｐＨ７，
０）　２０００　ｍｌ添加し、さらにＢａＣｌ２２０　
ｉｔを加え、１５分間撹拌し、　５ＱＯＱｒｐｍにて１
５分間遠心分離した。沈渣をとり、脱イオン水で３回洗
浄し、１７０ｍＭクエン酸三ナトリウム液（ｐ）（７，
０）　４０　ｍｌを加えて溶出せしめた。溶出液に飽和
硫酸アンモニウム２０　ｍｌを加え＋　３５０Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心分離し、さらにその上清に飽和硫酸アン
モニウム６０　ｒｎＬを加え＋　９００Ｏｒｐｍで２０
分間遠心分離した。沈渣をｌＱｍＭクエン酸三ナトリウ
ム液（ｐＨ７，０，２５０ｍＭ　ＮａＣ１含有）にサス
、ヘンドし、透析し、　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００
カラムテゲ／ｌ／濾過し、ピーク部分のフラクションを
集めた。これをＤＢ−５２ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムに
かけ、２０ｍＭクエン酸三ナトリウム液（１００ｍＭ　
Ｍａｉｌ含有）から２０ｍＭクエン酸三ナトリウム液（
５００ｍＭ　ＮａＣ１會有）に至る濃度勾配によって溶
出せしめ、ピーク部分のフラクションを集めた。ここに
精製された正常ヒトプロトロンビンが得られ、その最終
回収率は２５〜３５％であった。
ここに得られた正常ヒトプ「トロンビンでウサキヲ免疫
し、その抗血清に３５％硫酸アンモニウムを加えて沈渣
となし、透析し、Ｄ瞭Ｖ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムに
かけ、１７ｍＭ＋）ン酸緩衝液（ｐＨ６，８）でＩｇＧ
分割をとった。別に正常プロトロンビンをｌＱ　ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２，１３０ｍＭ　ＮａＣ１含有）
に３ｍｇ１ＣＣとなるように溶解し、あらかじめ常法に
より活性化したＣＮ−Ｂｒに吸着させて、プロトロンビ
ンアフィニティーカラムを用意した。前記Ｉｇ（４１１
Ｊをこのプロトロンビンアフィニティーカラムにかけ、
４Ｍ塩酸グアニジンで溶出させて抗ヒトプロトロンビン
ウサギＩｇＧを得た。
また正常ヒトプロトロンビンをＴｕｈｙの方法で脱カル
ボキシル化し、脱カルボキシル化ヒトプロトロンビンを
得た。
Ｂ、ワーファリン服用者血漿にＢａＳＯ４およびＢａＣ
０，をそれぞれ１００■／ＴＩＬＬの割合で加え、１２
０分間撹拌し正常プロトロンビンを吸着除去し９次にＤ
Ｅ−５２ｃｅｌｌｕｌｏｓｅに加えてイオン交換をおこ
ない、正常プロトロンビンおよびＰＩＶＫＡ−ｎの両者
に対する共通部分のモノクロナール抗体を用いたアフィ
ニティーカラムにかけ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出させ
て、透析し、濃縮してＰＩＶＫＡ−ｎを精製ウサギＩｇ
ＧにＮａｋａｎｅ等の方法によりペルオキシダーゼをコ
ンジュゲートし、酵素標識抗体を用意した。
コート化固相および酵素標識抗体を組合せてセットとし
２本発明測定試薬とした。
実施例３ 実施例２記載の試薬にさらにスクリーニング用乾燥１紙
を添付して本発明測定試薬とした。
実施例４ 実施例２におけるコート化固相に１ウェル当り被検血漿
１００μｔを注入し、４℃で２４時間イン（ キュベートする。１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液４ｐＨ７，４
゜牛血清アルブミン０．２％、　Ｎａ１ｌ　０．１５Ｍ
含有）テ三回洗浄し、実施例２における酵素標識抗体５
０μｌを加えて、３７°Ｃで６０分間インキュベートす
る。
次に前記緩衝液で三回洗浄し、　ＡＢＴＳ溶液１００μ
Ｌを加えて、３０分間放置し、２ｍＭアジ化ナトリウム
５０μｌを加えて反応を停止させる。ここでＯＤ４２０
ｎｍ　ヲ測定ｔ　ル。
【図面の簡単な説明】
図１は実験例１結果の項に記載の図１に相当し。 本発明測定方法の一態様において示される蛋白量と測定
値との間の関係を表わすグラフである。 図２は実験例２結果の項に記載の図２に相当し。 本発明測定方法と二次元交叉免疫電気泳動法との相関を
示すグラフである。 図３は実験例３結果の項に記載の図３に相当し。 被検血漿を乾燥用ｆ紙によって前処理した場合における
検量線を示すグラフである。 図４は実験例４結果の項に記載の図４に相当し。 被検血漿を直接測定した場合における測定値と乾燥処理
後に測定した場合における測定値との相関を示すグラフ
である。 特許出願人 工−ザイ株式金社 図１ ！と−−。 ｏｖｏｏ　０　０ｃ；　ｃｉ　ｃ；　ｃ：　６図２ 図　３ 図　４

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　ＰＩＶＫＡ−ＩＩを二抗体サンドインチ法を利
    用する酵素免疫測定法によって測定するにあたり、当該
    測定に係る固相化抗体としてモノクロナール抗ＰＩＶＫ
    Ａ−ＩＩ抗体を使用することを特徴とするＰＩＶＫＡ−
    ＩＩの測定方法（２１ＰＩＶＫＡ−ＩＩを二抗体サンド
    インチ法を利用する酵素免疫測定法によって測定する試
    薬であって、当該測定に係る固相化抗体としてモノクロ
    ナール抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体を必須の構成成分とする
    ＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定試薬
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