JPS63273472A

JPS63273472A - 新規抗体とそれを用いたヒトヘモグロビンの検出

Info

Publication number: JPS63273472A
Application number: JP62107049A
Authority: JP
Inventors: Noboru Iijima; 昇飯島; Hatsuo Yamamura; 初雄山村; Katsuaki Kitahata; 北畠　克顕
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 1987-04-30
Filing date: 1987-04-30
Publication date: 1988-11-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（技術的背景）潰瘍、癌腫、結核、赤痢、チフス等のような消化管の潰
瘍性機転を引き起こす疾患の診断、治療上には、糞便中
への血液の混在をみる糞便の潜血反応を検することが極
めて重要である（金井泉、金井正光、臨床検査提要）、
とくに、消化管の潰瘍では５０〜７７％、癌腫では８７
％において潜血反応陽性を呈しく同上参考）、大腸から
の出血ではその約４０％が大腸癌であるという報告から
も便潜血検査は、臨床的に非常に重要な試験である。し
かしながら、従来の潜血反応検査は厳しい食事制限を必
要とすることが集団検診の普及の妨げになっていた。ま
た、血尿は、尿路の炎症（急性腎炎、腎結核、賢う炎、
膀胱炎、尿道炎、前立腺炎等）、結石、腫瘍（癌腫、乳
頭腫、副腎腫等）ならびに、出血性素因（発血病、紫斑
病、血友病等）　、Ｆｉｌａｒｉａ等あるいは特発性腎
出血等の場合に起こる。血色素尿は。

発作性血色素板の場合、その他語種中毒、伝染病、連鎖
球菌性敗血症、マラリア（黒水熱）。

火傷、輸血（異型）等の場合にみられる。排尿初期血尿
は尿道疾患に、排尿終末血尿は膀胱頚部疾患に特有であ
る。尿の潜血反応を見ることは、血色素尿の場合はもち
ろん、血尿の場合にも重要である。血尿患者の５〜８％
は無症候性（２６％は尿たんばく陰性）といわれている
から、これらの潜在性疾患の早期発見上にも簡便な潜血
反応検査が重要視されている。

（先行技術）現在一般に利用されている潜血検出法の原理には、赤血
球に含まれるヘモグロビン（Ｈｂ）のペルオキシダーゼ
様触媒作用が、過酸化物を分解し、この時発生する酸素
により色原体を酸化呈色することに基ずいている。これ
らの方法としては、０−トリジン法、ベンジジン法、グ
アヤツク法等がある。しかし、上記の方法にょる潜血検
出には、以下の注意を要する。すなわち、１）検査３日ぐらい前から新鮮な動物性食品（生又は半
焼きの獣魚肉類）および生野菜を禁じ、その後２〜３回
排便した後の糞便を用いること２）検査前には、鉄、銅、ビスマス、獣炭、ヨウ化カリ
ウム、ビタミンＣ等の投与を中止すること等である。さもないと、動物食品中に含まれるＨｂが糞
便中に排出されて、見かけ上層血中のＨｂと誤って検出
されたり、投与された薬剤がＨｂとペルオキシダーゼ活
性を促進したり、逆に阻害したりするので、正確な検査
結果を得ることができないという問題がある。

免疫学的方法によるＨ　ｂの検出方法としては、ヒトＨ
ｂをヒト以外の動物に免疫して得られる抗ヒトＨｂ抗血
清を用いた一次元拡散法、二重免疫拡散法、免疫電気泳
動法が知られている。

しかしながら、これらの方法では、測定に長時間を要し
たり、感度が悪いため多量のＨｂが試料中に存在する場
合でないと測定できないという問題がある。さらに、上
記問題を解決するために別の免疫学的方法として、放射
性同位元素や酵素を標識したラジオイムノアッセイ、エ
ンザイムイムノアッセイの検討も行われているが、ラジ
オアイソトープという危険物質を扱ったり、測定操作が
複雑であり、かつ測定に長時間を要する等実用化には難
点がある。また、ラジオイムノアッセイやエンザイムイ
ムノアッセイと同等の感度で、簡易判定量できる方法と
して逆受身凝集反応を用いて測定する方法もある。この
方法は、担体に動物の血球を用いるために使用した血球
に対する抗体に起因する非特異反応が生ずるため信頼性
に乏しく、常に使用した血球による吸収処理及び抗体を
結合していない血球を用いた対照試験が必要である。ま
た、逆受身凝集反応は、使用する抗体感作血球を調整す
るときに血球同定化のための前処理が必要なことや、測
定に数時間以上必要とする問題もある。

また、ラテックス粒子に抗体を感作させる方法も、抗血
清を用いるため、試薬のロット間の均一性を保証する事
はできない。

また、特開昭６１−６２８６５号、昭６１−１２６４７
０号。

昭６１−１２６４７１号には、ウサキ抗Ｈｂ抗血清を用
いてヒトＨｂの検出を行っているが、これらは、０−ト
リジン等の発色試薬を用事調製するために、操作は煩雑
となり、さらに、調製した指示薬は、非常に不安定であ
り、何の添加剤もなしに溶液のまま安定に保存すること
は極めて難しい。そのため非常に不経済である。また、
抗血清は、安定的に力価の高い物を得ることが困難であ
り、試薬としてのロット間の均−性及び安定供給という
点で問題が残る。

（本発明の目的）本発明は、前述の先行技術の改良であって、とくに食事
制限の必要がなく、かつ操作の簡単な潜血反応検査法及
びその試薬の開発を目的としたものである。

又１本発明は前述の試薬として有用な新規な抗ヒトヘモ
グロビンモノクローナル抗体（抗ヒトＨｂｍＡｂ）およ
びそれを産生ずる新規なハイブリドーマセルラインを提
供することを目的とするものである。

（構成の説明）（１）抗ヒトＨｂ　ｍ　Ａ　ｂの作製本発明に使用する抗体の免疫に用いるヒトＨｂは、通常
市販されている物をそのまま用いることもできるが、そ
の試薬は夾雑物があるので、できるだけ単一の蛋白標品
であることが望ましい。例えば、市販ヒトＨｂを抗原と
してマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ等ヒト
以外の動物に免疫し、十分に免疫されていることを確認
した後に、その牌臓から牌細胞を調製し、免疫動物由来
のミエローマ細胞と細胞融合する。生成したハイブリド
ーマは、選択培地により培養し、常法に従ってスクリー
ニングとクローニングを繰り返し、ヒトＨｂとのみ特異
的に反応する抗ヒトＨｂ抗体産生ハイブリドーマを得た
。抗体は、得られたハイブリドーマを免疫動物の腹腔内
で増殖させて得られる腹水又は、ハイブリドーマの大量
培養によって得られる培養上清を、塩析処理し、得られ
たグロブリン分画を不溶化ヒトＨｂを用いた吸着分離（
すなわちヒトＷｂをリガンドとするアフィニティクロマ
トグラフィー）を繰り返すことにより、精製・調製した
。

（２）膜の調整潜血検査用膜は本発明の抗ヒトＨｂｍＡｂを含有させて
おけばよいが、検査処理過程で膜から脱落しないように
処理する必要がある。一つの方法は抗ヒトＨｂｍＡｂと
膜とを化学的に結合しておくことである。それを具体的
に説明する。

本発明中の抗ヒトＨｂｍＡｂ結合膜を調製するために用
いる膜は、種々のポリマー（セルロース、ポリビニルア
ルコール、塩化ビニル、ポリスチレン等）に、たとえば
エポキシ基のような活性基を導入したものであり、室温
で各種タンパク質を失活させることなく結合させる機能
を有する膜である。これらの膜に抗ヒトＨｂｍＡｂを担
持させるには、ＰＨ５〜１０好ましくはｐＨ６、５〜８
の緩衝液中、０．０１〜１　ｍｇ／　ｍ　Ｑの抗体液を
調製し、膜に滴下または接触、もしくは抗体液中に膜を
浸漬し、１〜２４時間攪拌等を行い膜に抗体を結合させ
る。次ぎに、抗体によらないタンパク質の吸着を防ぐた
め抗体結合膜をｏ、ｏｏｓ〜５％カゼイン・脱脂粉乳、
または０．１〜１０％の牛血清アルブミンのアンモニア
緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ジェタノール
アミン緩衝液（各緩衝液ともｐＨ４〜１０好ましくはＰ
１１７〜９）に３０分〜２４時間浸漬する。そして、上
記緩衝液によって洗浄し、完了する。

（３）指示薬含有膜の調製（ａ）Ｈｂのもつペルオキシダーゼ様活性により、酸化
呈色する指示薬（濃度は０．０１〜１００　ｇ　／　Ｑ
好ましくは３０〜６０ｇ／Ｑ）を溶媒に溶解し、含浸用
の膜をこの試薬に浸漬するか、試薬を含浸用の膜に噴霧
又は滴下することにより、含浸用の膜に発色剤を含浸さ
せる。その後、乾燥させて試験に用いる。

（ｂ）　　上記含浸用の膜として前項（２）で得られた
抗ヒトＨｂｍＡｂ結合膜（以下抗体結合膜という）を使
用して（ａ）と同様の方法で指示薬含有膜を製造しても
よい。

（ｃ）　　指示薬について本発明の検査シートに含有されるヘモグロビン検出用指示薬すなわちペルオキシダーゼ活性に
よって発色しろる試薬としては、例えばグアヤク脂、及
びその個々の成分（α−２β−グアヤコン酸、グアヤレ
チン酸、グアヤシン等）とそれの混合物、アニリン及び
その誘導体、０−トリジン、０−、ρ−トルイジン、ベ
ンジジン、テトラメチルベンジジン、ジ−アニシジン、
ｏ−、ｍ−クレゾール、α−９β−ナフトール。

カテコール、グアヤコール、ピロガロール及びこれらの
２種又はそれ以上の物の混合物等があけられる。

（ｄ）指示薬溶解時には、０．００１■／Ｑ〜１０ｇ／
Ｑの酸化防止剤を含有させてもよい。

酸化防止剤としては、フェニル−β−ナフチルアミン及
びフェニル−α−ナフチルアミンそしてその他の芳香族
アミン類、ヒドロキノン、アルデヒドアミン縮金物。

ビタミンＥ、ジブチルオキシトルエン（ＢＨＡ）プチルヒドロキシアニンール（ＢＨＴ）　、
グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレチック酸、没食子酸
イソアミル、没食子酸プロピル、Ｎ−フェニルナフチル
アミン、β−トコフェロール、セザモール、ビタミンＣ
、クエルセチン、プロトカテチュ酸エチル、フェノール
類、β−ナフトール、テトラメチルジアミノジフェニル
メタン等及びこれらの２種以上の混合物があげられる。

（ｅ）　　呈色反応用溶液呈色反応を行なうための酸化剤溶液は過酸化水素の水溶液や水、エタノール混合溶液を用いる
が、通常酢酸酸性にして使用する。検査シートへの適用
方法はスプレーや点滴などの方法がある。

（４）ｍ定法抗体結合膜と指示薬含有膜を組み合わせた、または発色
剤を含む抗体結合膜を有する測定キットを作製する。

測定する場合は、測定試料に抗体の結合している膜を接
触又は挿入すると、試料中のヒトＨｂのみが膜中の抗ヒ
トＨｂｍＡｂと結合する。そして、ヒトＨｂ以外の試料
成分を洗浄液によって排除する０次ぎに、指示薬含有膜
または抗体結合膜中の指示薬と呈色反応用溶液によって
抗体結合膜中で抗体と結合しているヒトＨｂを呈色反応
により視覚的に検出する。

（本発明の効果） ■）ヒトＨｂとのみ反応するモノクローナル抗体を用い
ているので、他の動植物のＨｂが混在していてもヒトＨ
ｂの検出精度に影響を与えず、従来の潜血検査で必要と
されていた３日間位の食事制限は必要としない。

２）他の動植物、薬物の影響をほとんど受けないので、
偽陽性を小さくできる。

３）操作が従来のものに比べて簡便である。

４）結果を特別な装置を用いることなしに、視覚ですぐ
に判定できる。

５）モノクローナル抗体を用いているので、抗体のロッ
ト間のバラつきは非常に小さく、試薬を安定的に作製、
提供することができる。

（実施例）実施例１ヒトＨｂをリン酸緩衝性生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｉｌｉ
ｎａ；以下ＰＢＳと略記する）に溶解し１〜２　ｍ　ｇ
　／　ｍ　Ｑに調製した。

そして、同容量のフロイント完全アジュバントまたは、
フロインド不完全アジュバントと良く懸濁し、初回のみ
１００μｇＨｂ／マウスで、２回目以降は５０μｇ／マ
ウスとなるように、オス４週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスにｉｐ投与した。

免疫は、２週間から２力月の間隔で５〜６回行った。な
お、細胞融合３日前に行う最終免疫は、ＰＢＳに溶解し
たヒトＨｂ　（１ｍｇ／ｍｕ）をアジュバントを持ちい
ずに５０μｇ　／　ｍ　Ｑでｉｐ投与した。

最終免疫３日後にヒトＨｂ免疫マウスから摘出・ｉｌｉ
製した牌細胞と、骨髄腫細胞（Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ
４−１；以下ミエローマと略記する）を５：１に混合し
、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００）により
細胞融合を行った。ポリエチレングリコールを除去し、
融合した細胞を１０％牛脂児血清（以下ＦＣ３と略記す
る）を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地（１万Ｕ／１ペ
ニシリン、５０＋ａｇ／ｌストレプトマイシンを含む）
で培養した。融合翌日、ＨＡＴ培地（１００μＭヒポキ
サンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジ
ンを含む１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ培地）で培養を行った
。次ぎに、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行い、限
界希釈法によるクローニングを行った。その結果。

５株の融合細胞（ハイブリドーマ）を樹立した（表１）
。

クローニングを行ったハイブリドーマをＢＡＬ　Ｂ　／
　ｃマウスにｉｐ投与して、抗体の腹水化を行った。得
られた腹水は、３０００ｒｐ＠、５分間室温で遠心分離
した上清を、５０％硫安沈澱処理し、ヒトＨｂをリガン
ドとしたアフイニテイクロマトグラフイにより抗体を精
製した。

精製したモノクローナル抗体の種類・構造を示すクラス
及びサブクラスを、マウス　モノクローナル　タイピン
グ　キット（Ｍｉｌｅｓ社）により調べた。また、各抗
体の等電点を等電点電気泳動によって決定した。結果を
表１に示す。

表１４Ａ１１　　　　　　ＩｇＧ２ａ　　　　７．４４Ｄ１
０　　　ＩｇＭ　　　５・９４Ｅ６　　　　　　　ＩｇＧ２．　　　　７．６４Ｅ１
２　　　ＩｇＭ　　　６．３５Ｃ１０ＩｇＧ１　　７．０つきに通常広く行われている化学的検出法では偽陽性を
示す各動物種のＨｂとヒトＨｂとの反応性の比較を行う
ことにより、前記抗体の特異性の検討を行った。得られ
た５つのモノクローナル抗体の各種Ｈｂとの反応性は、
エンザイム　リンクドイムノソルベント　アッセイ（以
下ＥＬＩＳＡと略記する）により調べた。ＥＬＩＳＡプ
レートに、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウ
サギのＨｂを０．５ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ濃度で５０μＱ
／ｗｅｌｌ添加し、２時間物理的吸着させた後に、１％
牛血清アルブミンによるブロッキングを行い、抗体と反
応させた。Ｈｂと抗体との結合は、ビオチン−アビジン
系によるアルカリフォスファターゼ活性により確認した
。

各抗体のヒトＨｂに対する反応性を１００％とした時の
各種Ｈｂとの相対反応性を表２に示した。

４Ｄ１０，４Ｅ１２抗体は、ヒト以外のＨｂとも交差反
応してしまうため、フン便中の他種Ｈｂとも反応するこ
とから、不適当である。一方、４Ａｌｌ、４Ｅ６，５Ｃ
１０抗体は、ウサギＨｂと弱い反応を示すものの、ヒト
Ｈｂに対して高い特異性を示すことがわかった。よって
、これら３つのＩｇＧクラスの抗体を潜血検出に用いれ
ば、他種Ｈｂとの反応性が殆どないことから、抗体によ
る偽陽性の発生は、ないものと考えられる。

よって、フン便中に他種動物のＨｂが混入していても、
抗体はヒトＨｂとのみ特異的に反応するので、食事制限
を不要とすることができる。

実施例２２００〜３００μｇ　／　ｍ　Ｑに調製した抗体液に活
性化膜を室温で１時間インキュベートし、膜に抗体を結
合させ、０．５％脱脂粉乳溶液によるブロッキングを行
い抗体膜を調製した。そして、指示薬のｏ−トリジンお
よびビタミンＥ又はヒドロキノンをエタノールに溶解し
た溶液を抗体結合膜に含浸させた。この膜を乾燥させた
後、プラスティック等の焼却可能なスティックの先にｏ
−トリジンを含浸させた抗体膜を結合させた。

そして、ヒトＨｂ溶液（０，１〜１０００　ｔｔ　ｇ　
／　ｍ　Ｑ　）との反応を検討した。Ｈｂ液に前記指示
薬含浸抗体結合膜を５分間浸漬させた後に、膜を洗浄し
、３％過酸化水素溶液を滴下し発色させた。

１〜１０μｇ　／　ｍ　１２以上で陽性反応を認めた。

また、ウシＨｂについても同様の試験を行ったが。

１０μｇ　／　ｍ　Ｑでも全く反応はみられなかった。

そして、３価の鉄イオンについても１ｍＭ付近において
も全く影響を受けながった。よって、この測定試薬・測
定法を用いることにより、ヒトＨｂのみを測定できるこ
とが明らかとなった。

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトヘモグロビンに対して選択的に結合しうる抗ヒ
トヘモグロビンモノクローナル抗体およびそれを産生す
るハイブリドーマセルライン２、ヒトヘモグロビンに対して選択的に結合しうる抗ヒ
トヘモグロビンモノクローナル抗体よりなる潜血検出用
試薬３、ヒトヘモグロビンに対して選択的に結合しうる抗ヒ
トヘモグロビンモノクローナル抗体を含有する潜血検出
用検査膜４、ヒトヘモグロビンに対して選択的に結合しうる抗ヒ
トヘモグロビンモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを培地中で培養するかまたはマウス腹腔に移植し
て腹水化することにより、培養液もしくは腹水から抗ヒ
トヘモグロビンモノクローナル抗体を単離調製すること
を特徴とする抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の
製法５、ヒトヘモグロビンを抗原として人を除く動物に免疫
して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融
合し、生成したハイブリドーマを培地中で培養するかあ
るいはマウス腹腔に移植して腹水化し、必要に応じて常
法によりスクリーニングとクローニングを繰り返してヒ
トヘモグロビンに対して選択的に結合しうる抗ヒトヘモ
グロビンモノクローナル抗体を産生することを特徴とす
るハイブリドーマセルラインの製法