JPH0198968A - ヒス・インスリンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト・インスリンに対するモノクローナル抗体
を利用した、試料中のヒト・インスリンの測定方法に関
し、さらに詳しくは、ヒト・インスリンの濃度が１　ｐ
ｇ／ｍｌないし１　ｎ９／ｌｒｉであるときのヒト・イ
ンスリンの測定方法に関する。

〔従来の技術〕

インスリンは膵臓中に存在するランゲルハンス島β細胞
より分泌されるペプチドホルモンで、肝臓等の組織の糖
、脂肪、蛋白質代謝の調節を行っている。体内でのイン
スリン生成が不足すると、糖がグリコーゲンとして肝臓
に蓄積されにくくなる結果、血糖が急激に増加し、腎臓
のブドウ糖吸収がその増加忙追いつかなくなり、糖尿病
を引き起す。

したがって、インスリンの生体内含量の測定は糖尿病の
診断に重要な意義を有する。現在、ヒト・インスリンの
定量にはラジオイムノアッセイ法やエンザイムイムノ′
アッセイ法のような免疫測定法が用いられている。しか
し、それ等の免疫測定法に用いられるインスリン抗体は
、モルモット等の動物をウシインスリンまたはブタイン
スリンで免疫して得られる抗血清であるため、得られる
量が少量であり、また動物個体間でインスリンに対する
親和性や力価が変動し易い。そのため多数の動物から抗
血清を採取しこれを混合し一定品質にした後に免疫測定
用に使用されている。しかし、それでもなお、各ロット
間で親和性や力価に差がみられる。

近年この問題を解決するためにモノクローナル抗体を用
いてインスリンを検出することが報告されている（特開
昭６０−５７２５５号公報等）該発明で開示されている
インスリンの検出法は、ラジオイムノアッセイや二重結
合アッセイ法により、インスリンに対する親和力を測定
することからなっている。

またアール、コミッティー（Ｂ、ｃｏｎｍｉｔｔｉ）ら
はサンドイツチ法を用いる酵素免疫測定法により、イン
スリンを［１０８ないしＺ　５　ｎＦ／ｍの範囲で３な
いし４時間で測定できる方法を報告している（ジャーナ
ル　オプ　イムノロジカルメンラド第９９巻、２５〜３
７ページ）。該論文ではブタ・インスリンを抗原として
えたモノクローナル抗体のうち、ヒト・インスリンと交
叉反応するものを選択した。さらに、サンドイッチアッ
セイ系を（むにあたり、第１抗体な固相に固定化したの
ち、ヒト・インスリンを含む試料液とピオチンを結合さ
せた第２抗体とを加え、第１抗体−ヒト・インスリン−
第２抗体−ビオチン複合体をつくらせた。

このあと、アビジンを結合させたアルカリ・ホスファタ
ーゼを加え、第１抗体−ヒト・インスリン−第２抗体−
ビオチンーアビジンーアルカリ・ホスファターゼ複合体
を形成させ、アルカリ・ホスファターゼの基質を加えて
、酵素反応をおこさせた。該論文で用いられた７１対の
第１−第２抗体の対のいずれも、固相に結合させた、ヒ
ト・インスリンに対し同時に結合できないことが示され
ている。

該報告及び先行発明のもつ問題点はヒト・インスリンに
対してのみならず、ブタ、ウシ、ヒツジなどの動物のイ
ンスリンにも交叉反応を示す点である。多くの先行発明
はウシ、ブタなどのヒト以外の動物のインスリンをマウ
スやラットに免疫してモノクローナル抗体をえているた
め、えられたモノクローナル抗体は抗原として用いた動
物のインスリンと反応するのは自明である。これらのモ
ノクローナル抗体の中には特異性がゆるく、ヒト・イン
スリンとも交叉反応しうるものがみつゆられることがあ
り、先行発明の多（はブタ又はウシインスリンに対して
つくらせたヒト・インスリンと交叉性のモノクローナル
抗体を用い【いる。

特開昭６０−２５７５６２号公報にはサンドイッチアッ
セイによるインスリンの測定法が開示されているがカビ
バラやモルモット由来のポリクローナル抗体が用いられ
ている。ヒト・インスリンに特異的に結合し、かつ抗原
決定部位かへだたっており、ヒト・インスリンに同時に
、独立して、かつ、互いに競合することなく結合しうる
２個のモノクローナル抗体をみい出すこと、かつ、これ
らの１対のモノクローナル抗体が、ヒト・インスリンの
みを検出するのに用いることができ、ブタ。

ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウスなどの異種動物由来のイン
スリンと反応しないこと、さらに、ヒト・インスリンの
検出が１ｐｖ−のオーダーで可能なことが要求されてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、以上のような従来法の欠点を改善し、
ヒト・インスリンを感度よ（測定できる方法を提供する
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は測定しようとするヒト・インスリンに特異
的なモノクローナル抗体を作製し、これを用いて免疫学
的測定法の検討を行った。その結果、本発明に関るモノ
クローナル抗体はインスリン測定用試薬として極めて有
用であることを見出し本発明に到達した。

すなわち本発明はヒト・インスリンを認識するモノクロ
ーナル抗体でＡ：固定化されている第１抗体と、Ｂ：第
１抗体とは異なる抗原部位を認識し、かつ標識剤で標識
されている第２抗体を用いヒト・インスリンを１　ｐＦ
／ｍ／ないし１　ｎ９７ｍ１の濃度範囲において測定す
ることを特徴とするヒト・インスリンの測定方法である
。

本発明におけるモノクローナル抗体はヒト・イせること
によって、該インスリンを認識するモノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマを得、ついで該ハイブリドー
マを培養し、その培養物から得ることができる。

ヒト・インスリンを認識するモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマは、手法それ自体は公知である細胞
融合〔ジー・ケーラー（Ｇ、　ＫＯｈｌθｒ）とシー・
ミルスタイン（ｃ、ｎｔ１ｓｔθ１ｎ）、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｄ２５６巻、４９５頁、１９７５年〕Ｋよっ
て製造することができる。

一本発明においては、前述の如き方法によってヒト・イ
ンスリンを認識するモノクローナル抗体を得る。これら
は該インスリンの互いに異なる抗原部位を認識するモノ
クローナル抗体である。従って、２つのモノクローナル
抗体を使ったサンドイツチ法による固相酵素免疫測定法
が可能となった。

またこのとき、ヒト・インスリンのみと反応し、ウシ、
ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどの異種動物由
来のインスリンとは交叉反応しないものも得ることがで
きる。これを第１抗体、第２抗体の少なくとも一方に用
いることによって、異種動物由来のインスリンは検出せ
ず、ヒト・インスリンのみを検出することが可能となっ
た。本発明では、第１抗体としてインスリンを認識する
モノクローナル抗体を固定化するが、固定化の方法は、
公知の方法を採用でき、抗体を固定化するものとしては
、例えばポリスチレン、ポリエチレン。

ポリ塩化ビニル、ラテックス、アガロース、セルロース
、メタアクリレート、ガラス等を用いたビーズやマイク
ロプレートが好ましく使用される。

また、第２抗体の標識化の方法や手段、それの検出方法
や手段は同等限定されるものではな（、公知の方法や手
段により測定することができる。標識剤として酵素を用
いる方法（Ｅ工Ａ）では、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、又はアルカリ・フォスファターゼ等
の酵素が、放射性物質を用いる方法（Ｒ工Ａ）では、１
２５１　、３　Ｈ等が、螢光物質を用いる方法（Ｆ工Ａ
）ではフルオレッセイン・インチオシアネート等が通常
使用されるが、その他のものであってもよい。

標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するため
に基質が用いられる。例えば、西洋ワサビパーオキシダ
ーゼの基質としては、２．２′アジノジー〔３−エチル
ベンズ・チアゾリンスルホン酸〕ニアンモニウム塩（以
下ＡＢＴＳと記す）　−Ｈ，Ｏ□５−アミンサリチル酸
−Ｈ，Ｏ，、Ｏ−フェニレンジアミン−■、０１等を、
β−ガラクトシダーゼの基質としては、０−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを、アルカリフォス
ファターゼの基質として、Ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート等ヲ挙げることができる。

測定のためには、これ等の試薬以外にも溶解剤。

洗浄剤９反応停止剤等の公知の試薬が使用される。

〔発明の効果〕

本発明により極微量（１ｐ９／ｌｄ　）のヒト・インス
リンを高感度で再現性よく検出することが可能であり、
測定濃度範囲は１　ｐ９７ａｔないし１　ｎ９／ｄであ
る。また本発明により、異種動物由来のインスリンとは
反応せず、ヒト・インスリンのみを検出することもでき
る。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を詳述する。しかし、本発明
は、これら実施例のみに限定されるものではない。

■　抗ヒト・インスリンモノクローナル抗体の調製 抗ヒト・インスリンモノクローナル抗体の調製は、Ｇ、
ケーラーとＣ，ミルスタインの方法に準じて行った。１
００μりのヒト・インスリン（シグマ社製）をリン酸緩
衝生理食塩水に溶解した後、等量の７０インド完全アジ
ユバントと乳化させ、マウス腹腔に投与した。２０日経
過後、１００μりのヒト・インスリンをリン酸緩衝生理
食塩水に溶解した後、該マウスに投与した。その３日後
、肺臓細胞をマウスから取り出し、ポリエチレングリコ
ールな用いて、マウスミエローマ細胞と細胞融合を行っ
た。細胞は、９６ウエルプレートで培養し、公知のＨＡ
Ｔ選択を行った。ハイブリドーマのスクリーニングは９
６ウエルマイクロタイタープレートを用いる公知の方法
で行い、抗ヒト・インスリン抗体を産生ずるハイブリド
ーマについて限界希釈法によりり四−ニングを行った。

以上のようにして得られたハイブリドーマを、マウス腹
腔内で培養し、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。

これを硫安沈殿、ＤＥＡＲイオン交換カラムクロマトグ
ラフィにかけることにより抗ヒト・インスリンモノクロ
ーナル抗体を複数種得た。

■　抗インスリンモノクローナル抗体の固定化リン酸緩
衝生理食塩水に１００μｇ／ｍｌの濃度に溶解したヒト
・インスリンモノクローナル抗体（実施例■で調製した
モノクローナル抗体でヒト・インスリンと反応するが、
異種動物由来のインスリンとは反応しないもの、名称Ｕ
Ｍ工とする）６０μｔを９６ウエル・マイクロタイター
プレート（タンク・イムノプレート；インターメッド社
製）の各ウェルに加え３７℃で２時間放置した。次に各
ウェルの溶液を除き、１係のＢＳＡ（ウシ血清アルブミ
ン）を含むリン酸緩衝生理食塩水を２００μを加え３７
℃で１時間放置することにより非特異的吸着部位をブロ
ックした後、そのまま４℃で保存した。

■　西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ＴＩＲＰＯ１と
いう）標識抗体の調製 ０．５ｙ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨａｌ）に溶解し
たＨＲＰＯ溶液（５７９／／）Ｋ１＃１−フルオロ−２
，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液α１−を加え
、室温で１時間反応させた。

次に６０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム１．０　、ｄを加え
て３０分間反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウム
を０．１６Ｍエチレングリコール１．　Ｏｄを加えて除
去した後、１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
）に対して透析した。

次にマウス抗ヒト・インスリンモノクローナル抗体（実
施例■で調製したモノクローナル抗体でＵＭ工とは異な
る抗原部位を認識し、かつヒト・インスリンと反応する
が異種動物由来のインスリンとは反応しないもの、名称
ＤＥＷとする）５ダを加え６時間反応させた。水素化ホ
ウ素ナトリウム５■を加え、４℃で一晩放置した。

上記の方法で得られた反応物をＴＳＫゲルＧ−３０００
ＳＷ（東　ソ　−　■製、商品名〕を用いる高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製し、ＨＲＰＯ標識モノクロ
ーナル抗体を得た。

■　酵素免疫測定法によるヒト・インスリンの定量 実施例中の■で述べた方法で作製した抗ヒト・インスリ
ンモノクローナル抗体固定化マイクロタイタープレート
を室温に戻し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。次に
リン酸緩衝生理食塩水に溶解した１ｐり／１１１〜１　
ｎＧＩ／ν濃度のヒト・インスリン（シグマ社製）を各
ウェルに５０μを加えた。

次いで各ウェルに実施例中のＯで調製したＨＲＰＯ標識
抗体４．５１Ｒ９／ｄを１０１％ミオグロビン、α０７
５％精製白糖、α０５チ卵白アルブミンを含むリン酸緩
衝生理食塩水で１０００倍に希釈した溶液を５０μｔず
つ添加し、室温に５時間静置した後、溶液を除去しリン
酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。さらにｔ２％ＡＢＴ
Ｓ−（ＬＯＩ％Ｈ，Ｏ，を含有するα１Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ４，１）から成る基質溶液を各ウェルに５０μ
ｔずつ添加し、室温で３０分反応させた後、１Ｍクエン
酸液を５０μを加えて反応を停止した。反応停止後、各
ウェルについて波長４１５ｎｍ（対照波長４９２ｎｍ）
の吸収強度を自動マイクロタイタープレート・リーダー
〔東ンー■製　ＭＰＲ−Ａ４商品名〕で測定した。この
方法により表１の如き結果を得て検量線を作成した。

表１ 以上の結果から本発明は種々の試料中におけるヒト・イ
ンスリンの微量測定に適した方法であるといえる。

■　酵素免疫測定法によるウシ及びブタ・インスリンの
定量 実施例中の■と同様の方法で、但し、試料として１０ｐ
ｇ／ゴ及び１０００ｐ９／ゴのウシ・インスリン（シグ
マ社製）又はブタ・インスリン（シグマ社製）を用いて
酵素免疫測定法による定量を行った。結果を表２１表３
に示す。

表２ 表３ 以上の結果から、本実施例で用いたモノクローナル抗体
ＵＭ工及びＤＦｉＷは、ヒト拳インスリンとは反応する
が、異種動物のインスリンとは反応しないことが理解さ
れる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト・インスリンを認識するモノクローナル抗体
   で Ａ：固定化されている第１抗体と Ｂ：第１抗体とは異なる抗原部位を認識し、かつ標識剤
   で標識されている第２抗体 を用い、ヒト・インスリンを１ｐｇ／ｍｌないし１ｎｇ
   ／ｍｌの濃度範囲において測定することを特徴とするヒ
   ト・インスリンの測定方法。
2. （２）モノクローナル抗体がウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ
   、マウス、ラットのインスリンと反応しない特許請求の
   範囲第１項記載のヒト・インスリンの測定方法。