JPH0712811A - ビタミンｂ１２を決定するためのイムノアッセイ、ならびにそのための試薬およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】抗内因子抗体（特にモノクローナル抗体）を使
用したビタミンＢ₁₂検出のための迅速で高感度のイムノ
アッセイの提供。 【構成】ビタミンＢ₁₂の不在下でのみ内因子に特異的に
結合し得、そしてビタミンＢ₁₂の存在下、およびビタミ
ンＢ₁₂の内因子への結合の際に結合が解除される抗体
（例，ハイブリドーマＡＴＣＣ−ＨＢ１０７１１により
産生されるアロステリック競合的モノクローナル抗体）
を含む、試料中のビタミンＢ₁₂の存在を決定するための
組成物、内因子と標識された前記抗体とからなるビタミ
ンＢ₁₂決定用キット、前記抗体を用いるビタミンＢ₁₂の
診断アッセイ法、およびモノクローナルである前記抗体
の製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は試料中のビタミンＢ₁₂レ
ベルを決定するためのイムノアッセイに関し、そして特
に抗内因子抗体を利用するイムノアッセイに関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】ヒトにおけるビタミンＢ₁₂レベルを決定
するためのアッセイは悪性貧血のような疾病の診断およ
び治療の際の重要な手段であると長い間みなされてき
た。ビタミンＢ₁₂は恒常性の維持に必要とされる。ビタ
ミンＢ₁₂は１９４８年に初めて精製された。その全体の
分子構造は続いて解明された。それは安定化された中心
コバルトイオンを有する有機金属コリン核を持つ。その
ようなコリン化合物の生物学的活性は側鎖の組成により
決定され、それらの中でコバルト残基を安定化する
「Ａ」環複合ヌクレオチドα−リバゾール側鎖を有する
分子だけが活性である。

【０００３】内因子は１９２９年に最初に記載された。
内因子の欠如は悪性貧血の発症をもたらすことが見出さ
れた。ポリペプチドは胃分泌液中に存在し、そしてビタ
ミンＢ₁₂の生理学的な取込みを促進する。内因子は単一
のビタミンＢ₁₂結合部位に配置される単一の連続ペプチ
ド鎖からなる分子量が５５−６０ｋのものである。該物
質はＢ₁₂の生物学的活性体のみに対する高い特異性の故
に識別される。Ｂ₁₂を結合すると、内因子は内因子受容
体への結合に適合するコンホメーションの変化を起こ
す。このコンホメーションの変化は内因子受容体への親
和性の増加と関連がある。

【０００４】胃分泌液中に見出された第２のＢ₁₂結合タ
ンパク質はＲタンパク質である。Ｒタンパク質は内因子
の厳密な特異性を欠いている。特に、Ｒタンパク質はコ
バミド、コビナミドおよびコブリナミドを包含する全て
のコリン環構造体を結合する。Ｒタンパク質は内因子調
製物の混入物として同定され、そしてそのようなものと
して該調製物の明瞭な特異性に悪影響を及ぼし得る。

【０００５】ビタミンＢ₁₂アッセイは最初は微生物学的
であった。その後で、内因子の特異性、親和性および安
定性が認識された後に、内因子への結合に対する放射標
識ビタミンＢ₁₂と試料中のビタミンＢ₁₂との間の競合反
応からなるラジオアッセイが開発された。

【０００６】ある種の患者の自己抗体が内因子へのビタ
ミンＢ₁₂の結合を直接阻害することを研究は示した。自
己抗体の画分は同定されている。Ｉ型自己抗体はビタミ
ンＢ₁₂の結合を阻害し、それにより内因子の機能を妨害
する。従って、そのような自己免疫抗体が内因子調製物
中のビタミンＢ₁₂活性の特異性を確認するために使用さ
れることが示唆された。 P. A. Villanova, National C
ommittee For Laboratory Standards, "Guidelines For
Evaluating a B12 (Cobalamin) Assay" (1980) 。

【０００７】モノクローナル抗体は内因子に対する特異
性に関して最近記載されているが、診断目的ではない。
Smolka および Donaldson, Gastroenterology 98: 60
7-614 (1990)。ヒト内因子を用いて Smolka および Don
aldsonは、固定化内因子に対するドットブロット分析に
より同定されるマウスハイブリドーマを生起させ、その
後、内因子−ビタミンＢ₁₂複合体の免疫沈降を促進する
能力の再選択が行われた。彼らは次に陽性クローンを再
びクローン化した。陽性クローンのいくつかは内因子−
Ｂ₁₂複合体に結合する抗体を分泌した。

【０００８】Poufarzaneh 等（ＷＯ９１／００５１９）
は内因子：ビタミンＢ₁₂複合体に特異的であり、そして
内因子上のビタミンＢ₁₂結合部位に特異的であるといわ
れるモノクローナル抗体を包含するビタミンＢ₁₂のイム
ノアッセイを記載している。内因子のＢ₁₂結合部位に特
異的な抗体を用いるイムノアッセイ、例えば彼らの出願
に記載されたアッセイは、十分な感度のアッセイを得る
ために、Ｂ₁₂結合部位に対する抗体の親和性および動力
学がＢ₁₂自身の結合の親和性および動力学と精密に均整
のとれたものであることが要求される。Ｂ₁₂と内因子と
の相互作用の動力学は、Ｂ₁₂がその内因子分子に結合し
得る前に、特定の抗体−内因子複合体を分離する必要性
により減速され、そしてこの種の競合アッセイは緩慢で
あり、かつ感度が低下する。

【０００９】Poufarzaneh 等はまた、内因子とビタミン
Ｂ₁₂との複合体に特異的である抗体を記載している。そ
のような抗体はＢ₁₂結合の際に内因子に生じるコンホメ
ーションの変化により利用可能とされるエピトープにお
そらく特異的である。 Pfund等, Molec. Immunol., 27:
495-502 (1990)に例示されるようなその他の研究者はタ
ンパク質におけるコンホメーションの変化を検出するた
めにコンホメーション感受性抗体を使用すること、およ
びコンホメーション感受性抗体を検出することを記載し
ている。しかしながら、抗体を分析物に結合させるイム
ノアッセイおよび決定された分析物における後のコンホ
メーションの変化により引続き放出される程度は記載さ
れていなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】ビタミンＢ₁₂に対する
鋭敏で迅速なアッセイが望ましい。現在用いられている
イムノアッセイのほとんどは放射性同位体の使用が必要
であり、そしてＲ因子のない内因子の使用またはＲ因子
に結合してアッセイの感度および特異性を高めるビタミ
ンＢ₁₂類似体の使用が必要である。そのようなラジオア
ッセイは米国特許第４１８８１８９号および同第４４２
６４５５号の実施例として記載されている。本発明は、
これまで報告されたことのない、ビタミンＢ₁₂のイムノ
アッセイならびにそれに用いる試薬およびキットの提供
を課題とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明はビタミンＢ₁₂の
検出のための迅速で感度のよいイムノアッセイにおける
抗内因子抗体の適用を包含する。明らかに、コバラミン
の活性体に対するアッセイの特異性は内因子に完全に限
定されたままである。従って、本発明において使用され
る試薬は試料中のビタミンＢ₁₂レベルを決定するための
極めて順応性があり、かつ特異的な手段を提供する。

【００１２】内因子に対する抗体の２つのクラスが記載
される。１つのクラスの抗体はビタミンＢ₁₂と競合的に
内因子に結合する。本明細書で使用されているように、
「競合的に，競合的，および競合する」という用語は、
このクラスの抗体および／またはビタミンＢ₁₂が内因子
への別の物質の結合を妨げる能力を意味する。第２のク
ラスの抗体は内因子とビタミンＢ₁₂との複合体にのみ結
合する。各々のクラスは、Ｂ₁₂がないか、またはＢ₁₂と
複合したいずれかの内因子の１つのコンホメーションに
特有のエピトープを認識する。

【００１３】本発明の一態様において、ビタミンＢ₁₂に
対するアッセイはビタミンＢ₁₂の内因子および既知量の
競合的クラスの抗内因子抗体の相対的結合を測定する段
階を包含し得る。そのような抗体はビタミンＢ₁₂と直接
競合的であるものおよび下記のようにビタミンＢ₁₂と間
接競合的であるものを包含する。「直接競合的」と本明
細書に記載される上記抗体は内因子のビタミンＢ₁₂結合
部位に対して特異的であり、それ故に該部位に結合する
Ｂ₁₂と直接競合する。液体試料中で、内因子に結合した
ビタミンＢ₁₂と抗体の量は、それぞれの濃度および内因
子に対する各々の親和性に大きく依存して結果的に平衡
に達するであろう。

【００１４】その他の、そして特に好ましい競合的抗体
は「アロステリック」という意味で、「その他の部位」
でビタミンＢ₁₂と競合的であると見なされ得るものを包
含する。これらの抗体はまた、「間接」競合的であると
見なされ得、抗体およびＢ₁₂は同じ部位に結合しないけ
れども、同時に内因子に強固に結合され得ない。「アロ
ステリック競合的」または「アロステリック競合」は、
ビタミンＢ₁₂が内因子に結合される同じ時に内因子に強
固に結合され得ず、ビタミンＢ₁₂結合部位に結合しない
競合的抗内因子抗体を表すために本明細書において使用
されるであろう。

【００１５】これらの好ましいアロステリック競合的抗
体はビタミンＢ₁₂の不在下でのみ内因子に結合するが、
ビタミンＢ₁₂結合部位とは異なる部位に結合するであろ
う。そのような抗体は試料中のビタミンＢ₁₂を検出する
アッセイに使用され得る。アロステリック競合的抗体は
ビタミンＢ₁₂の不在下で内因子に結合し得る。試料を添
加した際に、その中に含まれていたビタミンＢ₁₂はその
Ｂ₁₂結合部位で内因子に自由に結合するであろう。ビタ
ミンＢ₁₂の結合は、ビタミンＢ₁₂の結合の際に起こる内
因子におけるコンホメーションの変化におそらく起因し
て、既に結合していた抗体の即時の解放を導くであろ
う。また、アロステリック競合的抗体と試料は予備保温
せずに内因子に添加されてもよい。抗体から内因子を予
め分離することは不要であるので、試料中に含まれてい
たビタミンＢ₁₂は、直接競合的抗体の場合に比べ、より
容易に抗体を置換し得るであろう。

【００１６】予め結合されたアロステリック競合的抗体
がビタミンＢ₁₂の存在下で内因子から解放される動力
学、例えば量および速度は、試料中のビタミンＢ₁₂の量
を決定するために、様々な方法のいずれかで順に決定お
よび使用され得る。いくつかの方法は酵素イムノアッセ
イ、ラジオイムノアッセイまたは化学発光アッセイを包
含する。

【００１７】ビタミンＢ₁₂と内因子の結合に対するそれ
らの適用に加えて、本発明において記載された種類のア
ロステリック競合的抗体は、第１の結合相手が第２の結
合相手に結合して結合対を形成し、一方、１つの結合相
手がその結合相手に結合した時、コンホメーション変化
を起こすことを包含するあらゆるイムノアッセイに特有
の解決法を提供すると考えられる。そのようなアロステ
リック競合的抗体は、第１の結合相手のコンホメーショ
ン決定基をその非結合体で認識し、その場合に結合アロ
ステリック競合的抗体の解放を引き起こすように前記コ
ンホメーション決定基が第２の結合相手の結合に際して
変更される抗体が調製され得るあらゆる状態で使用され
得る。

【００１８】本発明のもう一つの態様において、アッセ
イは、ビタミンＢ₁₂／内因子複合体形成を化学量論的に
測定するために行われ得る。本明細書に記載される特有
のハイブリドーマ選択方法は内因子分子中の構造、機能
およびコンホメーションのエピトープを認識するモノク
ローナル抗体の同定および識別を可能にする。

【００１９】基本的に、本発明の方法は、ビタミンＢ₁₂
を含むことが予測される試料が内因子およびビタミンＢ
₁₂と競合的に内因子に特異的に結合するか（その場合に
は抗体は予め決められた量で存在する）、またはビタミ
ンＢ₁₂／内因子複合体に特異的に結合する抗体と複合さ
れ、内因子または内因子に対する抗体の一方が標識さ
れ、そして他方が固体支持体に固定化されている、ビタ
ミンＢ₁₂のアッセイに関する。イムノアッセイの一般的
段階はこの分野では十分に公知であり、そして本発明に
適用可能である。

【００２０】本発明はまた、予め決められた量の内因子
と、試料中のビタミンＢ₁₂の存在または量に直接関連す
る量で内因子に特異的に結合する予め決められた量の抗
体とからなり、内因子または抗体のいずれかが信号生成
化合物で直接または間接に標識されている、試料中のビ
タミンＢ₁₂をアッセイするための診断キットに関する。
該キットはまた、好ましくは、内因子または抗体が直接
または間接にそれに結合された固体支持体を包含する。

【００２１】本発明はまた、本発明のアッセイ方法に有
用なモノクローナル抗体を得る方法およびモノクローナ
ル抗体試薬に関する。

【００２２】本発明のより詳細な説明 本発明はビタミンＢ₁₂のイムノアッセイ、そして特に、
内因子および／または内因子／ビタミンＢ₁₂複合体に対
するモノクローナル抗体を利用するイムノアッセイを提
供する。

【００２３】内因子に対する単一特異的抗体もまた、本
発明のアッセイにおいて使用され得る。そのような抗体
は慣用技術を用いて実験動物、例えばマウスまたはウサ
ギに精製内因子（例えばブタ由来）を接種することによ
り生成され得る。全体の内因子に対する明らかな抗体を
有する動物は採血され、そして血清免疫グロブリンがそ
れから精製される。抗体は固定化内因子に対する１次イ
ムノアフィニティクロマトグラフィーに供される。内因
子に特異的な結合した抗体は適当なカオトロープを用い
てカラムから溶出され、そして該カオトロープを除去す
るための適当な緩衝液に対して透析される。抗体は次に
ビタミンＢ₁₂飽和内因子カラムに注入される。カラムか
ら溶出する抗体は固相への複合体または付着体の調製に
使用するために集められる。

【００２４】本発明のアッセイに有用なモノクローナル
抗体はそれを分泌するハイブリドーマを調製することに
より得られる。ハイブリドーマは、参照により本明細書
に編入される技術である、Nature, 256: 495-497 (917
5) にMilsteinおよびKohlerにより記載された十分に公
知の方法に一般的に従って調製される。

【００２５】内因子のビタミンＢ₁₂結合部位に結合する
（または引き続く内因子−ビタミンＢ₁₂複合化を妨げる
ように内因子に結合されるようになる）モノクローナル
抗体は以下の方法を用いて得られ、そして同定される。
マウスは精製内因子で免疫感作され、そして殺傷される
２ないし５日前に、内因子の一回の静脈内ブースター注
射が行われる。殺傷の後、脾臓を無菌的に取り出し、そ
して慣用技術を用いて脾臓細胞を無菌的に集める。形質
細胞腫細胞系との細胞融合は次いで十分に公知な方法を
用いて行われる。適当な細胞系はこの分野で公知であ
る。望ましくは、本発明の方法で使用される細胞系は断
片よりむしろ完全な抗体を分泌するであろう。

【００２６】平板培養および数日間の培養体中での増殖
に続き、細胞上清は無Ｂ₁₂内因子で感作された適当なア
ッセイ容器（例えば９６ウエルプレート）を用いてスク
リーニングされる。容器の半分が１０μｇ／ｍｌＢ₁₂溶
液で処理され、そして洗浄される。培養上清の試料を二
重に準備し、Ｂ₁₂の無い容器とＢ₁₂飽和容器とに注入す
る。Ｂ₁₂の不在下で結合し、かつＢ₁₂の存在下で結合し
ない抗体を示すウエルは、内因子上の結合部位に対して
試料中のビタミンＢ₁₂と競合する競合アッセイに使用す
るために保存される。

【００２７】好ましい態様において、そして特にアロス
テリック競合的抗体の同定のために、抗体を含む細胞上
清がスクリーニングされる前に、遊離ビタミンＢ₁₂は、
遊離ビタミンＢ₁₂および試料からのモノクローナル抗体
以外のその他の小分子量化合物を抽出するであろう物質
と各上清を接触させることにより、該上清から抽出され
る。遊離ビタミンＢ₁₂を除去する重要性は当業者には明
らかであろう。ビタミンＢ₁₂の存在下で内因子を結合し
得ないか、または結合から解放されるであろう定義によ
る抗体は、ビタミンＢ₁₂の痕跡量でさえも存在すれば検
出が特に困難であろう。デキストランを被覆した木炭が
この方法において特に好ましい。

【００２８】内因子／Ｂ₁₂複合体を認識するモノクロー
ナル抗体は変形スクリーニング法と同様の免疫感作技術
を用いて得られてもよい。細胞は無ビタミンＢ₁₂内因子
で感作された適当なアッセイ容器を用いて再びスクリー
ニングされる。容器の半分がＢ₁₂で飽和され、そして洗
浄される。培養上清の試料を二重に準備し、Ｂ₁₂の無い
容器とＢ₁₂飽和容器とに注入してもよい。Ｂ₁₂の存在下
で高められた抗体結合性を示し、かつＢ₁₂の不在下でよ
り低い結合性を示すウエルは内因子／ビタミンＢ₁₂複合
体に直接結合する本発明のアッセイにおける使用のため
の候補として保存されるべきである。

【００２９】特に好ましいアロステリック競合的モノク
ローナル抗体は本発明の方法を用いて得られる。対象ハ
イブリドーマの試料は米国メリーランド州，ロックビ
レ，パークロウン・ドライブ１２３０１のアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９
９１年３月２９日寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＡＴＣ
Ｃ−ＨＢ１０７１１が付与された。このハイブリドーマ
により産生される抗体は本明細書で５８５．３Ａ３Ａ８
と記載される。

【００３０】本発明に関して有用な内因子は、あらゆる
供給源から得られる内因子が使用され得るけれども、十
分に公知の方法により得られるブタ内因子であることが
好ましい。

【００３１】本発明の一態様において、直接アッセイ法
が使用されてもよい。そのようなアッセイにおいて、内
因子は固相支持体に共有結合で、または非共有結合で結
合されてもよい。次いで、内因子が結合されている固体
支持体は、ビタミンＢ₁₂を含有する試料と十分な時間保
温され、試料中に存在するビタミンＢ₁₂を内因子に結合
させ、次に洗浄される。内因子／ビタミンＢ₁₂複合体に
特異的に結合し、そして公知技術を用いて検出可能な標
識で標識された既知（過剰）量の単一特異的抗体または
好ましくはモノクローナル抗体が固体支持体と十分な時
間保温され、標識抗体を結合された内因子／Ｂ₁₂複合体
に結合させる。固体支持体は次に洗浄され、そして複合
体に結合されている標識抗体の量が決定される。結合さ
れた抗体の量は試料中のビタミンＢ₁₂の量に正比例す
る。

【００３２】本発明の好ましい態様において、ビタミン
Ｂ₁₂結合部位で内因子に特異的に結合する（または引き
続く内因子−ビタミンＢ₁₂複合化を妨げるように内因子
に結合されるようになる）単一特異的またはモノクロー
ナル抗体は固相支持体に共有結合または非共有結合で結
合される。次いで、ビタミンＢ₁₂を含有する試料は既知
量の標識された内因子と一緒にされ、そして十分な期
間、固体支持体と保温され、ビタミンＢ₁₂と複合されて
いないあらゆる内因子の固定化抗体に結合させる。結合
または遊離標識内因子の量は次いで慣用手段を用いて決
定される。また、内因子は固体支持体に結合されてもよ
く、そして単一特異的またはモノクローナル抗体が標識
され、そして試料と混合されてもよい。このアッセイに
おいて、抗体とビタミンＢ₁₂は内因子結合部位に対して
競合する。競合反応を用いる免疫分析のための公知プロ
トコルが使用される。

【００３３】本発明のもう一つの好ましい態様におい
て、アロステリック競合的抗体の使用を包含し、ビタミ
ンＢ₁₂の不在下で内因子に特異的に結合し、かつビタミ
ンＢ₁₂の導入および結合に際して結合から解放される単
一特異的またはモノクローナル抗体が使用される。解放
される抗体の量は、当業者には適当ないずれかの方法
で、測定され、そして試料中に存在するビタミンＢ₁₂の
量と関係づけられる。

【００３４】本発明の方法を用いて得られるモノクロー
ナル抗体は広範囲のイムノアッセイ形態、例えばサンド
イッチアッセイ形態で内因子と関連させて使用され得、
そして本発明は何らかの特定の形態またはプロトコルに
限定されない。

【００３５】本明細書内で使用されるような「固相支持
体」はアッセイの１成分が結合され得る不溶性材料を意
味する。このタイプの公知材料は炭化水素ポリマー、例
えばポリスチレンおよびポリプロピレン、ガラス、金属
およびゲルを包含する。そのような支持体はビーズ、チ
ューブ、棒、円板等の形態であってよい。磁気粒子が本
発明のアッセイでの使用のために特に好ましい。

【００３６】「標識された」、「標識複合された」等は
内因子、抗体またはその他の結合試薬と化学標識例えば
酵素、蛍光化合物、放射性同位体、発色団、またはあら
ゆるその他の検出可能な化学種との複合体であって、結
合相手に特異的に結合する能力を保持する複合体を意味
する。「検出剤」、「標識検出剤」、「検出系」等は以
下に例示されるように、特異的酵素またはその他の標識
と接触した時に知覚可能な色変化、蛍光、化学発光等を
導く、知覚可能な信号、通常は電磁波またはその吸収を
提示する化学系を意味する。酵素標識が使用される場
合、検出系は好ましくは基質と色素原を用いる。種々の
慣用の公知色素原は、その特異的酵素と基質に添加され
た時に目に見える色を発生するものが利用され得る。例
えば、ｐ−ニトロフェノールホスフェートがアルカリホ
スファターゼを検出するために使用されている。

【００３７】

【実施例】本発明は以下の非限定的な実施例を参照する
ことにより、より良く理解され得るものである。 実施例１：抗体の調製 ８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスを２週間毎に不完全
フロイントアジュバント中のブタ内因子１０μｇ／投与
で腹腔内経路により免疫感作した。マウスを断頭により
殺し、そして脾臓を外科的に切除した。この脾臓をゲン
タマイシン１００μｇ／ｍｌ含有のダルベッコ変形培地
（ＤＭＥ）５ｍｌを含むペトリ皿に移した。組織を梳い
て分離することにより脾臓細胞を解放する。脾臓細胞を
ＤＭＥで１回洗浄し、そして市販のものが入手され得る
形質腫細胞系からの洗浄したＳＰ２／Ｏ細胞と５：１の
比率で混ぜた。

【００３８】細胞をペレット状にし、過剰の上清を除去
し、そして細胞を緩衝化５０％ポリエチレングリコール
溶液（ベーリンガー・マンハイム）１ｍｌ中に再び懸濁
させた。細胞を室温で１２０秒間保温した後、約４００
×ｇで６分間遠心分離を行った。融合細胞を次に遠心分
離し、ＤＭＥで穏やかにすすぎ、ＳＰ２／０調整培地を
有するイスコーブ変形ＤＭＥ中に再び懸濁させ、そして
７５ｃｍ² フラスコに穏やかに移した。

【００３９】ＣＯ₂ 中３７℃で一晩保温した後、細胞を
調整培地中に２×１０⁶ 細胞／ｍｌまで希釈し、そして
９６ウエルプレート中に播種した（２５０μｌ／ウエ
ル）。７−１０日後、上清に対し以下のようにスクリー
ニングを行った。９６ウエル平底ポリスチレンプレート
（ダイナテックからのイムロンＩ）はブタ内因子〔バイ
オスパシフィック・インコーポレーテッドから入手，５
０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ），ｐＨ７．２中で１μｇ
／ｍｌ〕１００μｌ／ウエルで一晩予備感作された。プ
レートを洗浄し、次に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロック
を行った。過剰のＢＳＡを除去するために洗浄後、ウエ
ルの半分の内因子を１００μｇ／ｍｌＢ₁₂溶液１０μｌ
との予備保温により複合させた。

【００４０】各培養上清２００μｌを微量滴定プレート
に移した。各ウエルを次にデキストラン被覆木炭スラリ
ー（１５０ｍＭ ＰＢＳ１００ｍｌ中のデキストラン１
５０ｍｇとノリットＡ１．５ｇ）５０μｌとｐＨ７．４
で混合し、そして４℃で一晩攪拌した。５分間の保温に
続き、遠心分離により木炭を沈殿させた。

【００４１】次いで、内因子および内因子−Ｂ₁₂複合体
を含むウエルに平行に培養上清を移した。ポリクローナ
ルマウス抗内因子および正常マウス血清はそれぞれ陽性
および陰性対照として利用された。３０分間の保温の
後、プレートを洗浄し、そしてパーオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗マウス抗体（カルビオケム・インコーポレーテッド
から市販されているものが利用可能）がプレートの全て
のウエルに添加された。プレートを十分にすすぎ、そし
てＡＢＴＳ基質（カーケガード・アンド・ペリー・ラボ
ラトリーズ・インコーポレーテッドからのパーオキシダ
ーゼ・サブストレート）が添加された。ウエル中の細胞
の反応性は４１０ｎｍと４５０ｎｍでの吸光度の比とし
て分光光度法で測定された。いくつかのウエルはＢ₁₂の
不在下で反応性を有し、Ｂ₁₂との反応性を検出し得ない
細胞であると上記の木炭スクリーニング法を用いて同定
された。これらの細胞はこれらの細胞はその他の実験の
ために継代培養された（例えば０．０２／０．２の＋Ｂ
₁₂／−Ｂ₁₂吸光度比）。その他のウエルにおいて、Ｂ₁₂
の存在下で結合の増加を示すハイブリドーマ細胞が同定
された（例えば０．７／０．１５の＋Ｂ₁₂／−Ｂ₁₂吸光
度比）。

【００４２】実施例２：酵素標識抗体の調製 ０．２Ｍイミダゾール（ｐＨ９．０）中の３０倍モル過
剰のスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートとの反応に
よりマレイミド基がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
上に導入され、過剰な試薬がＰＢＳ中のセファデックス
Ｇ−５０の１×２８ｃｍカラムでのゲル濾過により除去
された。０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中の４０ｍＭ
Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトンでチオール
が抗体（実施例１に記載の方法により得られる）に導入
され、過剰の試薬がＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中の第２
のゲル濾過カラムで除去された。複合は変性酵素と変性
抗体とを、ＡＬＰ：抗体＝２：１のモル比で、室温で２
時間保温することにより行われた。複合体はトリス緩衝
液（ｐＨ８．０）中のセファクリルＳ−３００（１．５
×１２０ｃｍ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーに
より精製された。

【００４３】実施例３：酵素標識内因子の調製 マレイミド基が上記のようにアルカリホスファターゼ上
に導入された。精製内因子（スクリップス・ラボラトリ
ーズ・インコーポレーテッドから入手）を０．０８Ｍ炭
酸水素ナトリウム、０．１２Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）中の４０ｍＭ Ｎ−アセチルホモ
システインチオラクトンと反応させ、過剰の試薬が上記
のようにＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中の第２のゲル濾過
カラムで除去された。複合は変性内因子を２ないし３倍
モル過剰の変性酵素と室温で２時間保温することにより
行われた。これらの条件下で、内因子中に導入されたよ
うなチオールは変性酵素上にあるような、マレイミドと
化学量論的に反応し、化学的に安定な結合を形成するこ
とが知られている。複合体はトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）中のセファクリルＳ−３００（１．５×１２０ｃ
ｍ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製さ
れた。

【００４４】実施例４：ビタミンＢ₁₂複合体の調製 シアノコバラミン−ｄ−カルボン酸をイソブチルクロロ
ホルメートとの混合無水物を介してアルカリホスファタ
ーゼに結合させた。コバラミン誘導体１ｍｇをジメチル
ホルムアミド２５０μｌ中に溶解させ、そしてトリエチ
ルアミン２μｌおよびイソブチルクロロホルメート１μ
ｌと氷上で３０分間保温した。この反応混合物１００μ
ｌを０．０５Ｍ炭酸水素塩、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ （ｐＨ９．０）９００μｌ中のアルカ
リホスファターゼ２ｍｇに添加し、室温で２時間保温し
た。過剰な試薬は５０ｍＭトリス、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ₂ （ｐ
Ｈ７．４）中に懸濁した木炭に対する透析および同様の
緩衝液中でのセファデックスＧ−５０（１．５×２８ｃ
ｍ）のカラム上でのゲル濾過により除去された。生成す
る複合体は酵素１モルあたりコバラミン７．３モルを含
んでいた。

【００４５】実施例５：固相の調製 精製モノクローナルアロステリック競合抗体５８５．３
Ａ３Ａ８はヤギ抗マウス抗体（市販の供給源から入手）
感作磁気粒子（アドバンスト・マグネティクス・インコ
ーポレーテッド，カタログ番号４３４０Ｄ）に１０μｇ
／１００μｌ（１ｍｇ／ｍｌ粒子懸濁貯蔵液）のレベル
で結合された。抗体は懸濁液中で１時間吸収された。そ
の後、粒子は磁界中で沈殿され、１０ｍＭトリス含有５
μＭ ＫＣＮ（ｐＨ８．０）で２回洗浄され、そして１
０ｍＭトリス含有５μＭ ＫＣＮ（ｐＨ８．０）中に再
び懸濁された。

【００４６】実施例６：ビタミンＢ₁₂に対する競合アッ
セイ アッセイの開始の際に、１０ｍＭトリス含有５μＭ Ｋ
ＣＮ（ｐＨ８．０）中のＢ₁₂含有試料または標準２００
μｌを１０×６０ｍｍのボロシリケートガラス試験管に
移した。各々の反応管に１：１モル比の内因子−アルカ
リホスファターゼ複合体１００μｌ（０．１μｇ）を添
加した。反応体を約６０ｒｐｍで揺動する震盪水浴中３
７℃で１５分間保温した。粒子５０μｌ（実施例５に記
載したように調製した結合されたアロステリック競合抗
体を有する）を反応混合物に添加し、そしてさらに３０
分間震盪しながら３７℃で保温した。磁界中での２分間
の沈殿により反応を停止させた。管を５０ｍＭトリス、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００
（ｐＨ７．４）１ｍｌで２回すすいだ。ルミフォーゼ５
３０（米国ミシガン州デトロイトにあるルミゲン・イン
コーポレーテッドの登録商標）２００μｌを各管に添加
し、そして３７℃で５分間の静止保温により反応を開始
させた。次いで管を２分間室温まで冷却し、そして５分
以内にチバ−コーニング・バーソルド・ルミノメーター
で分析した。得られる信号の阻害は図１に示されるよう
にＢ₁₂濃度の算術関数としてプロットされた。

【００４７】未知量のビタミンＢ₁₂を含有する血清また
は血漿が例えばＫＣＮの存在下高ｐＨで保温してビタミ
ンを安定化することにより予備処理されて、内因性Ｂ₁₂
結合タンパク質からＢ₁₂を解放する。これらの予備処理
試料からの上澄み液は上記の標準的なものと同様のプロ
トコルによりアッセイされ、そして図１のような標準曲
線とルミノメーター信号を比較することによりビタミン
Ｂ₁₂の濃度が決定される。

【００４８】試料中のビタミンＢ₁₂レベルの増加につれ
て、相対的ルミネッセンス単位（ＲＬＵ）が低下するこ
とが図１に見出され得る。この事実は、試料中のビタミ
ンＢ₁₂が内因子へのアロステリック競合抗体の結合を阻
むという結論を支持する。

【００４９】実施例７：ビタミンＢ₁₂に対する直接アッ
セイ 試料中のビタミンＢ₁₂は内因子：Ｂ₁₂複合体に結合する
抗体、例えば５８７．５Ａ３と表されるモノクローナル
抗体を用いる直接アッセイにおいて決定され得る。実施
例５の方法に従ってこの抗体で感作された粒子は、より
高レベルの内因子−アルカリホスファターゼ複合体が使
用される（例えば１０μｇ）ことを除いて５８５．３Ａ
３Ａ８に対して記載されたようなＢ₁₂−内因子反応混合
物に添加されてもよい。引き続く反応段階は実施例６に
記載されるように行われる。得られる信号の増加がＢ₁₂
レベルの関数としてプロットされる。

【００５０】実施例８：Ｂ₁₂による抗体から内因子の分
離 本発明のアロステリック競合抗体から内因子の分離はバ
イオセンサー装置（「バイアコア」，ファルマシア）を
用いる表面プラズモン共鳴により調べられた。表面プラ
ズモン共鳴はイムノアッセイ結合反応の結果として試験
基質の表面に起こる質量の変化を測定するのに有用であ
る。質量のそのような変化はバイオセンサーを用いて検
知され、そして電子的に読み取られ得る光学的特性の変
化と相関関係にある。

【００５１】特に、内因子、ビタミンＢ₁₂および抗内因
子モノクローナル抗体５８５．３Ａ３Ａ８の相互作用の
分析はバイアコア装置（スウェーデン国ウプサラのファ
ルマシア・バイオセンサーＡＢ）上で行われた。この装
置を用いてナノグラム量のタンパク質間の相互作用は、
該相互作用が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）として知ら
れる上記の現象において引き起こす変化により測定され
得る。ＳＰＲ信号における変化は同時にモニターされ
得、そしてその同時データに基づいた計算により、相互
作用する分子に関連した動力学および親和性パラメータ
ーの決定がなされる。

【００５２】ＳＰＲにおいて、タンパク質相互作用は、
水性緩衝液中、スライドガラスの表面の金箔に付着され
ている層厚１００ｎｍの線状デキストランとで起こる。
近赤外線は金−ガラス境界面に対して小さい角度でスラ
イドガラスの長さ未満に焦点が集められる。光は金−ガ
ラス界面に当り、そして反射される。金属内の自由電子
（プラズモン）の集団の存在のために、光が反射される
際に、そのエネルギーのいくらかは界面を通過し、そし
て吸収される。吸収されたエネルギーの量および最大吸
収が起こる正確な角度は界面の他方の（水性の）側にあ
る材料の屈折率に依存する。その屈折率はまた、界面の
その側の最初の数百ナノメーターにある物質の質量に依
存する。蓄積された質量が変化するにつれ（例えば表面
へのタンパク質の結合を介して）、ＳＰＲ信号は変化
し、そして装置は信号を蓄積された質量に定量的に比例
するデータに変換する。データは任意の（しかし固定さ
れた、前に規定した）「共鳴単位」または「ＲＵ」に定
量化される。

【００５３】ＭＡＢ５８５．３Ａ３Ａ８と内因子との間
の相互作用の研究のために、マウスＩｇＧに対するウサ
ギ抗体がデキストラン表面に共有結合（固定化）され
た。モノクローナル抗体はウサギ抗体により表面に捕獲
され、次に内因子（スクリップス１１０２４）は抗体に
より捕獲された。Ｂ₁₂（シグマ・ケミカル・カンパニー
・カタログ番号Ｖ２８７６）の存在下および不在下で表
面からの内因子の分離速度が決定された。特に以下の方
法が使用され、そして全ての方法は２５℃で行われた。

【００５４】Ａ．バイオセンサー表面の取付け システム緩衝液であるＨＥＰＥＳ緩衝液（「ＨＢＳ」）
を１０ｍＭ「ＨＥＰＥＳ」（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチ
ル〕ピペラジン−Ｎ’−〔２−エタンスルホン酸〕，シ
グマカタログ番号Ｈ３３７５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，
３．４ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％界面活性剤
（「Ｐ２０」，ファルマシア・バイオセンサー・カタロ
グ番号ＢＲ−１０００−５４）として調製し、そして５
Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．４とし、濾過し、そして脱気し
た。バイオセンサーチップ「ＣＭ５」（ファルマシア・
バイオセンサー・カタログ番号ＢＲ−１０００−１２，
デキストラン／金／ガラス表面）が装置内に取付けら
れ、そしてシステムにＨＢＳを流した。新たに取りつけ
られたチップに対する信号は装置操作マニュアルに記載
されるように４０％グリセロールで標準化された。４つ
のフローセルの各々における共鳴の低下はピクセル (pi
xel)１３と１４の間の８０００ＲＵ近傍で底をついた。

【００５５】Ｂ．ウサギ抗マウスＩｇＧの固定化 アミンカップリングキット（ファルマシア・バイオセン
サー・カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）中の試薬を
製造業者の指示に従って調製し、そして使用時まで冷凍
保存した。チップＣＭ５のデキストラン表面のカルボン
酸基は「ＥＤＣ」および「ＮＨＳ」の溶液で活性化され
た。活性化の直後、ウサギ−抗マウスＩｇＧ１（「Ｒｘ
Ｍ」，ファルマシア・バイオセンサー・カタログ番号Ｂ
Ｒ−１０００−５５）の溶液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．０）中で１００マイクログラム／ｍｌで６分
間注入した。タンパク質と反応しない活性化された基は
エタノーマアミンの注入でキャップされた。新たに固定
化されたＲｘＭ表面はＨＢＳ中５０マイクログラム／ｍ
ｌのマウスＩｇＧ１（シグマ・ケミカル・カンパニー・
カタログ番号Ｍ７８９４）の６分間注入を３回繰り返す
ことにより調整され、次に１．０Ｍギ酸の２分間注入で
表面が再生された。ＲｘＭ固定化は約１００００ＲＵま
でベースライン信号を高め、そしてこの量のＲｘＭは調
整サイクルの条件下での約３０００ＲＵのマウスＩｇＧ
１を捕獲した。

【００５６】Ｃ．ＲｘＭ表面での実験 ＲｘＭ表面での実験のために、ＨＢＳ中で希釈されたモ
ノクローナル抗体が注入され、ＲｘＭにより捕獲され
た。ほとんどの実験に対して約１５００ＲＵの抗体が捕
獲された。ＨＢＳ中で希釈された内因子は次に注入さ
れ、モノクローナル抗体により捕獲された。通常約６０
０ＲＵの内因子が捕獲された。内因子信号の減衰が次い
で追跡され、そして一次指数減衰のモデルに基づいて速
度定数が計算された。オフ速度（分離速度，off rate）
が緩衝液ＨＢＳ、５マイクロモルのＫＣＮを含有するＨ
ＢＳ（「ＨＢＳ／ＫＣＮ」）、および５、１０、２０お
よび５０マイクロモルのＢ₁₂を含有するＨＢＳ／ＫＣＮ
中で観察された。各サイクルの終了時に、表面は１．０
Ｍギ酸で再生された。

【００５７】図２は抗体からの内因子（ＩＦ）の分離の
同時プロットを示す。最初の１００秒を示すプロットの
部分は緩衝液中でのＩＦの自然分離を表す。約１００秒
で現れているプロット中の山形に折れた部分は対照およ
びＢ₁₂含有ＫＣＮ緩衝液の添加により生じた分離条件の
開始と関係する。二重の試料に関連するプロットの線は
対で現れる。上から下へ向けて、各対はそれぞれ緩衝液
中０、５、１０、２０および５０マイクロモルのＢ₁₂の
添加を表す。

【００５８】図２に示された結果は、抗体−内因子複合
体の一次分離速度を示す。該速度はＢ₁₂の濃度に直接依
存した度合いでビタミンＢ₁₂の添加により上昇した。分
離速度におけるこの上昇は、抗体自身が内因子のＢ₁₂結
合部位に結合するのであれば、抗体−内因子複合体がＢ
₁₂結合に先立ちその自然分離速度で最初に分離しなけれ
ばならないであろうから、不可能であろう。Ｂ₁₂が予め
結合した抗体−内因子の分離に影響を及ぼし得るという
事実は、Ｂ₁₂が抗体に複合される内因子に結合し得るこ
とを意味するとむしろ理解される。抗体およびＢ₁₂はそ
れ故に同一部位に結合せず、Ｂ₁₂の添加は前に結合した
抗体の分離を引き起こす。

【００５９】本発明の好ましい態様がこれまで記載され
てきたが、種々の変更、付加および変形が本発明の精神
および特許請求の範囲の範囲を逸脱せずにその中でなさ
れ得ると理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に有用な、ルミノメーター信号の
阻害に対する既知Ｂ₁₂濃度のグラフ、いわゆるＢ₁₂イム
ノアッセイ標準曲線である。内因子−アルカリホスファ
ターゼ複合体と結合したクローン５８５．３Ａ３Ａ８の
分離と添加ビタミンＢ₁₂濃度との関係を示す。

【図２】表面プラズモン共鳴により調べられるような予
め複合された抗体と内因子へのビタミンＢ₁₂の影響を示
す置換曲線を表すグラフであり、相対的な応答と時間と
の関係で示す。

【手続補正書】

【提出日】平成６年８月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】図２に示された結果は、抗体−内因子複合
体の一次分離速度を示す。該速度はＢ_１２の濃度に直接
依存した度合いでビタミンＢ_１２の添加により上昇し
た。分離速度におけるこの上昇は、抗体自身が内因子の
Ｂ_１２結合部位に結合するのであれば、抗体−内因子複
合体がＢ_１２結合に先立ちその自然分離速度で最初に分
離しなければならないであろうから、不可能であろう。
Ｂ_１２が予め結合した抗体−内因子の分離に影響を及ぼ
し得るという事実は、Ｂ_１２が抗体に複合される内因子
に結合し得ることを意味するとむしろ理解される。抗体
およびＢ_１２はそれ故に同一部位に結合せず、Ｂ_１２の
添加は前に結合した抗体の分離を引き起こす。上記のよ
うに、図２はＩＦ−アロステリック抗体複合体の分離速
度を示す。図２のデータは、ＩＦ−アロステリック競合
的抗体複合体が最初に形成され、そしてビタミンＢ_１２
が異なる濃度で添加された場合の結果を示す。ビタミン
Ｂ_１２が実際に前もって存在している抗体−ＩＦ複合体
に結合し得ることがわかる。一時的な抗体−ＩＦ−ビタ
ミンＢ_１２三重複合体がほぼ形成され、次いで一次的動
力学で分離し、遊離抗体とＩＦ−ビタミンＢ_１２複合体
が得られる。ビタミンＢ_１２−ＩＦ−抗体複合体が安定
ではなく、例えばイムノアッセイにより直接検出され得
ないから、抗体とビタミンＢ_１２のＩＦへの結合は競合
的であると考えられるのみである。それ故に、図２に示
されたデータは、ビタミンＢ_１２の濃度がＩＦとアロス
テリック競合的抗体との予め形成された複合体の分離速
度に影響を及ぼし得ることを示す。これに対し、もし直
接競合的抗体とビタミンＢ_１２がＩＦの同一部位に結合
するのであれば、ビタミンＢ_１２の増加する濃度は予め
結合した抗体の分離速度にほとんど、または全く影響を
与えないだろう。ＩＦの抗体結合部位は、直接競合的抗
体−ＩＦ複合体が分離した後にだけ、ビタミンＢ_１２結
合のために利用可能になるであろう。そして、分離速度
はビタミンＢ_１２の濃度により大きくは影響されないで
あろう。上記のバイオコアによる方法論のより十分な説
明により、図２に示されたデータはさらに理解され得
る。明細書に記載されたバイオコア実験は、バイオセン
サーチップの表面に結合したタンパク質の光学的影響を
計測する。ＦＷ１３５５を有するビタミンＢ_１２はそれ
自身あまりにも小さく、バイオコア実験で生成されるＳ
ＰＲ信号に影響を与えない。信号は結合したタンパク質
の質量に比例するので、ビタミンＢ_１２はその信号に直
接影響を及ぼさず、抗体とＩＦだけが検出に十分な大き
さで残っている。従って、各測定は異なる濃度のビタミ
ンＢ_１２で行われたけれども、ビタミンＢ_１２の濃度は
いずれの特定の計測の間には変化しなかった。このよう
に、図２は異なるビタミンＢ_１２濃度でのＩＦ−抗体複
合体に生じた一連の一次分離を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジェーン シュミット アメリカ合衆国 ミネソタ 55105 セン トポールサラトガ ストリート サウス 430 (72)発明者 ポール ウェグファールト アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19935 ダウニングトン トーマス ロード 93

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ビタミンＢ₁₂の不在下でのみ内因子に特
   異的に結合し得、そしてビタミンＢ₁₂の存在下、および
   ビタミンＢ₁₂の内因子への結合の際に結合が解除される
   抗体を含む、試料中のビタミンＢ₁₂の存在を決定するの
   に有用である組成物。
2. 【請求項２】 内因子と、試料中に存在するビタミンＢ
   ₁₂の量に関連した量で前記内因子に特異的に結合する標
   識された抗体とからなり、該抗体はビタミンＢ₁₂の不在
   下でのみ内因子に結合し得、そしてビタミンＢ₁₂の存在
   下、およびビタミンＢ₁₂の内因子への結合の際に結合が
   解除される、試料中のビタミンＢ₁₂の存在を決定するた
   めのキット。
3. 【請求項３】 ビタミンＢ₁₂の存在または不在にかかわ
   らず内因子に特異的に結合する第２の抗体をさらに含む
   請求項２記載のキット。
4. 【請求項４】 第２の抗体が固相支持体に結合されてい
   る請求項３記載のキット。
5. 【請求項５】 （ａ）ビタミンＢ₁₂の不在下でのみ内因
   子に特異的に結合し得、そしてビタミンＢ₁₂の存在下、
   およびビタミンＢ₁₂の内因子への結合の際に結合が解除
   される予め決められた量の抗体が結合されている固相支
   持体、および（ｂ）予め決められた量の標識された内因
   子、からなる試料中のビタミンＢ₁₂に対してアッセイを
   行うためのキット。
6. 【請求項６】 標識がアルカリホスファターゼであり、
   そして該標識の存在または量を検出するための基質をさ
   らに含む請求項５記載のキット。
7. 【請求項７】 以下の段階： ａ）実質的に精製された内因子で動物を免疫感作し、 ｂ）免疫感作された動物から脾臓リンパ球を単離し、 ｃ）単離された脾臓リンパ球を形質細胞腫細胞系と融合
   させて、抗体を分泌する多数のハイブリドーマクローン
   を得、 ｄ）各々のハイブリドーマクローンからの抗体を含む予
   め決められた量の培養上清から遊離ビタミンＢ₁₂を抽出
   し、 ｅ）各々の抽出された抗体含有上清の第１の試料をビタ
   ミンＢ₁₂の存在下で内因子と接触させ、 ｆ）各々の抽出された抗体含有上清の第２の試料をビタ
   ミンＢ₁₂の不在下で内因子と接触させ、 ｇ）免疫グロブリンに特異的に結合する酵素標識抗体を
   第１および第２の試料の各々と接触させ、 ｈ）第１および第２の試料の各々に存在する標識抗体の
   存在を検出し、そして ｉ）ビタミンＢ₁₂の不在下でのみ内因子に結合した抗体
   を分泌するハイブリドーマを単離するからなるビタミン
   Ｂ₁₂の不在下でのみ内因子に結合し得、そしてビタミン
   Ｂ₁₂の存在下、およびビタミンＢ₁₂の内因子への結合の
   際に結合が解除されるモノクローナル抗体を得る方法。
8. 【請求項８】 抽出段階（ｄ）がデキストランを被覆し
   た木炭を用いて行われる請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】（ａ）既知量の標識内因子および試料中の
   ビタミンＢ₁₂の存在または量に関連した量で内因子に特
   異的に結合する固相に結合した既知量の抗体に試料を接
   触させ、前記抗体はビタミンＢ₁₂が結合する内因子の部
   位とは異なる内因子の部位に結合し得、ビタミンＢ₁₂の
   不在下でのみ内因子に特異的に結合し、そしてビタミン
   Ｂ₁₂の存在下で結合が解除され、前記内因子は試料中の
   ビタミンＢ₁₂に特異的に結合してビタミンＢ₁₂−内因子
   複合体を形成し、（ｂ）ビタミンＢ₁₂−内因子複合体を
   分離し、そして（ｃ）ビタミンＢ₁₂−内因子複合体と結
   合した標識の量または固相上の抗体に結合した標識量を
   測定することにより、ビタミンＢ₁₂の量を決定すること
   からなる液体試料中のビタミンＢ₁₂に対する診断アッセ
   イ方法。
10. 【請求項１０】 抗体がモノクローナル抗体である請求
    項９記載の方法。