JP2001503861A

JP2001503861A - 固相イムノアッセイ

Info

Publication number: JP2001503861A
Application number: JP52051098A
Authority: JP
Inventors: フェイシュワルツ，シェリル
Original assignee: テンプルユニバーシティ―オブザコモンウェルスシステムオブハイヤーエデュケーション
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-14
Publication date: 2001-03-21
Also published as: EP0963553A1; CA2270287A1; US5789261A; WO1998019161A1; AU5238298A

Abstract

(57)【要約】固相イムノアッセイのための固体支持体は、ポリエチレンイミンをコートされた負に帯電した重合材料を含む。負に帯電した重合支持体とポリエチレンイミンコーティングとの組み合わせは、固体表面に親和性を持ち、イムノアッセイを妨害する高分子量キニノーゲン等の生物学的分子の非特異的吸着をなくすために役立つ。ポリエチレンイミンコーティングが設けられた、負に帯電した重合支持体は、好適には、カルボキシレート改質スチレンミクロ粒子等を含む。抗原類又は抗体類が共有結合剤によってポリエチレンイミンコーティングに結合されて、固相免疫試薬類を形成する。高分子量又は低分子量キニノーゲン等の生物学的分子のイムノアッセイが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】固相イムノアッセイ発明の分野本発明は、生物学的液中のタンパク質濃度を測定するための改質ラテックス表面を用いる高速免疫化学的方法に関するものである。政府助成金関係ここに記載する本発明は、国立衛生研究所基金（National Ｉnstitute of Hea lth Grant）ＨＬ４５４８６による援助を一部受けた。米国政府は本発明に若干の権利を有する。略語本明細書では下記の略語が用いられる：ＢＳＡウシ血清アルブミンＣＭＬカルボキシレート改質ラテックスＥＤＣ１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸ＥＬＩＳＡ酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbent assay）ＦＣＡ蛍光濃度分析器（fluorescence concentration analyzer）ＦＩＴＣフルオレセインイソチオシアネートＨＫ高分子量キニノーゲンＨＫａ活性化高分子量キニノーゲンＨＲＰホースラディッシュ（セイヨウワサビ）ペルオキシダーゼＬＫ低分子量キニノーゲンｋＤａキロダルトンＭＡｂモノクローナル抗体ＰＢＳリン酸緩衝塩溶液ＰＣＦＩＡ粒子濃度蛍光イムノアッセイ（particle concentration fluorescence immunoassay）ＲＦＵ相対的蛍光単位ＴｏｔＫ総キニノーゲン発明の背景現在、イムノアッセイは、生物学的液中の種々の物質濃度を測定するために用いられている。固定化免疫試薬類を用いるイムノアッセイは、サンプル中の生物学的分子の検出及び定量のために広く用いられている。まず、抗体又は抗原を含み得る免疫試薬を、試験管、ミクロプレート、ビーズ等の固体表面に固定する。次に、固定された試薬を、相補的免疫試薬を含む分析物溶液に接触させ、それによって免疫試薬と相補的免疫試薬との間で固定化免疫複合体が形成される。その固定化免疫複合体を、好適には固定化免疫複合体の反復洗浄によって、未反応の分析物溶液から分離することができる。分離した免疫複合体は、免疫複合体の量を定量するために更なる処理に供し得る。例えば定量的方法は、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)(吸着された免疫複合体の量を放射性崩壊の計数によって測定する)；酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)(吸着された、酵素が結合された免疫複合体を、この酵素の基質に接触させて、検出可能な生成物を生成する)；免疫蛍光測定法(免疫複合体に結合した蛍光物質の蛍光強度を測定する)；及び化学ルミネセント分析法(化学発光剤の化学発光を測定する)等を含む。大部分のイムノアッセイは労力、及び／又は時間を要する。免疫蛍光測定法の一形態である粒子濃度蛍光イムノアッセイ(ＰＣＦＩＡ)の開発により(ジョリー( Jolley ME.Baxter)、Pandex Division Research Report Number 1、１９８３)、イムノアッセイが高速かつ容易に行えるようになった。しかし、ＰＣＦＩＡのために現在使用できるミクロスフェア（微小球）は、或る生物学的分子、特に高分子量キニノーゲン(ＨＫ)の存在下における低分子量キニノーゲン(ＬＫ)のための免疫化学測定法の開発には適さないことが判明している。ＬＫはヒト血漿に見いだされる２種類のキニノーゲンのうちの一つであり(マーゴリス(Margolis)及びビショップ(Bishop)、Austral.J.Exp.Biol ．４１巻：２９３−３０６ページ、１９６３)、好中球等の細胞に付着する(フィガロ(Figuero a)ら、Blood ７９巻：９５４−９５９ページ、１９９２)。ＬＫはヒト血漿中に９３μｇ／ｍｌの濃度で存在し、分子量６４ｋＤａを示す。ＬＫは大きい重鎖( ５９ｋＤａ)と小さい軽鎖(５ｋＤａ)とからなる。この２本の鎖がノナペプチドであるブラジキン(ヒトにおける最も強力な血管拡張物質である)をはさんでいる。重鎖は強力なチオールプロテイナーゼ阻害剤である(スエヨシ(Sueyoshi)ら、F EBS.Lett ．１８２巻：１９３−１９５ページ、１９８５)。ＬＫの軽鎖の機能は現在のところ不明である。血漿及び組織カリクレイン、並びにその他の酵素類は、ＬＫ及びＨＫからブラジキンを遊離することができる。多量のブラジキンの循環への放出はショックを引き起こし、死に至ることがある。ＨＫ及びＬＫの重鎖は同一である。そのため、重鎖の免疫決定基に対する抗体類は、ＨＫ及びＬＫの両方と交差反応する。ＨＫ及びＬＫの軽鎖(これらの大きさ及び機能は非常に異なる)は、共通ドメインＤ４から誘導されるそれらのアミノ末端にある１２アミノ酸残基部分（セグメント）を共有し、ドメインＤ５_H及びＤ６_H(ＨＫ)又はＤ５_L(ＬＫ)によって表されるそれらのカルボキシ末端部分が異なる。そのため、共通のアミノ末端部分を含む完全な軽鎖に対する抗体類は、２種類のキニノーゲンと部分的に交差反応することもある。一方、ＨＫ及びＬＫの特異的軽鎖部分に対する抗体類は、２種類のキニノーゲンを区別できる。カリクレイン−キニン系は幾つかの炎症性疾患、例えば全身性炎症性反応症候群(Systemic Inflammatory Response Syndrome；ＳＩＲＳ)(ナカジマ(Nakajima) ら、“ヒト及びヒヒの敗血病性ショックにおけるカリクレイン−キニン系反応” ：健康及び疾患におけるカリクレイン−キニン系の化学及び生物学、ピサノ(Pis ano J.)及びオーステン(Austen K.)編集、DHEW Pub．No.７６−７９１、５４１ −５４４ページ、１９６７)、歯周病(サカモト(Sakamoto)ら、J.Dent.Res ．６０巻：６−９ページ、１９８１)、遺伝性血管浮腫(シャピラ(Schapira)ら、N.Engl .J.Med ．３０８巻、１０５０−１０５３ページ、１９８３)、腸チフス熱(コルマン(Colman)ら、J.Clin.Invest ．６１巻：２８７−２９６ページ、１９７８)、アレルギー性鼻炎(プラウド(Proud)ら、J.Clin.Invest ．７２巻、１６７８−１６８５ページ、１９８３；バウムガートナー(Baumgartner )ら、J.Clin.Invest ．７６巻：１９１−１９７ページ、１９８５)、喘息(ブレナー(Brenner)ら、Allergol.Immunopathol ．１０巻：４５３−４６２ページ、１９８２；アベ(Abe)ら、Experientia ２３巻：６２６−６２７ページ、１９６７)、及びリウマチ様関節炎(ワーシー(Worthy)ら、Int.J.Exp.Pathol ．７１巻：５８７−６０１ページ、１９９０)に関係があるとされた。しかし、その成分類を定量するための高速、簡単かつ信頼できる分析法がないため、これら疾患の発生機序に対するカリクレイン−キニン系の関与について深く分析することができなかった。その上、生理学的状態における正常なヒトのカリクレイン−キニン系のバリエーションについてもほとんど知られていない。そのため、低分子量及び高分子量キニノーゲンを区別する特異的アッセイ系を開発する必要があった。これまでに、生物学的液中のＬＫを高速で直接定量する方法がなかったために、健康及び疾患におけるＬＫの役割はほとんど知られていない。伝統的に、ＬＫは、生物学的液において、ＨＫ及びＬＫ(総キニノーゲン)の濃度をそれらの共通の重鎖に対する抗体類を用いて測定し(キタムラ(Kitamura)ら、J.Biol.Chem ．２６０巻：８６１０−８６１７ページ、１９８５)、次にＨＫ濃度(その特異的軽鎖に対する抗体によって測定された)を総キニノーゲン濃度の値から差し引いて(シヴァネン(Syvanen)ら、FEBS Letters １２９巻：２４１−２４５ページ、１９８１：カビリオウ−ナビアス(Kerbiriou-Nabias)ら、Br.J.Haematol.５６巻：２７３−２８６ページ、１９８４；レグリス(Legris)ら、J.Immunol.Meth.１６８巻：１１１−１２１、１９９４)、間接的に測定されてきた。これらの測定は、サンプル中のＨＫが活性化されてＨＫａになるか(スコット(Scott)ら、J.Clin.Inv est. ７３巻：９５４−９６２ページ、１９８４)、又は開裂してその不活性型ＨＫａになった場合(スコットら、J.Biol.Chem.２６０巻：１０８５６−１０８６３ページ、１９８５)、ＬＫについて間違った概算値を与える可能性がある。そのようなＬＫアッセイ法の一つは、酸性にした血漿をトリプシンと共にインキュベートして、ブラジキニンを遊離させることを含み、先ず、血漿にキニナーゼ阻害剤を加えて、放出された後のブラジキニンの分解を阻害し(総キニノーゲン)、次に血漿の第二部分をキニナーゼ阻害剤及びガラス粉末とともにインキュベートして接触系を活性化し、それによってブラジキニンをＨＫから放出させ、最後に第三の血漿サンプルをガラス粉末と共にインキュベートしてキニナーゼ阻害剤の非存在下でＨＫを消耗させ(ＬＫ)、その後にバイオアッセイによってブラジキニンを測定する(ウチダ(Uchida)及びカトリ(Katori)、Thromb.Res.１５巻１２７-１３４ページ、１９７９)。ガラス粉末は、ＨＫからブラジキニンを順次放出する血漿カリクレインのみを活性化すると考えらる。しかし、血漿カリクレインは潜在的に、血漿中でＬＫからブラジキニンを放出させ得る。ヘンダーソン(H enderson)ら(Blood ８４巻：４７４−４８２ページ、１９９４)は、精製した血漿カリクレインと共にインキュベートした好中球のＬＫ及びＨＫ両方からブラジキニンが急速に消失することを観察した。もう一つのＬＫアッセイ法は免疫化学的方法、ラジオイムノアッセイを用い、ＬＫを間接的に測定するものである。このアッセイでは、ＨＫは、ＨＫ軽鎖に特異的な抗体類、及びＬＫ＋ＨＫ重鎖の合計(総キニノーゲン)を検出する別の抗体を用いて検出される。総キニノーゲンの値とＨＫ値との差が、サンプル中のＬＫ濃度を表すと推定される(カビリオウーナビアスら、Br.J.Haematol.５６巻：２７３−２８６ページ、１９８４)。しかし、この方法は、ＨＫが活性化されてその補因子型であるＨＫａになる場合、間違った値を与える可能性がある。なぜならばＨＫは、免疫化学的に測定した場合、その活性化されていない片方より高い値を与えるからである(クレニウスキー(Kleniewski)ら、J.Lab.Clin.Med.１１１巻：９３−１０３ページ、１９８８；スコットら、J.Biol.Chem.２６８巻：７９３５−７９４２ページ、１９９３)。他のＬＫ免疫化学的アッセイは、ＨＫと部分的交差反応性を有する、ＬＫ及びＨＫ共通の重鎖に対するモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法である(ジェラベク(Jerabek)ら、Agents Action付録３８巻：２５７−２６６ページ、１９９２)。しかし、このアッセイが特異的にＬＫを測定するということは不確かである。ＨＫは、その５６ｋＤａ軽鎖が、負に帯電した表面に確実に吸着する能力を有するために、血漿タンパク質分解の接触系補因子である。ＨＫは接触因子チモーゲン類の２つ、即ちプレカリクレイン及びＸＩ因子と複合体を形成する能力を有するため、ＨＫはこれらのチモーゲンを活性表面に運搬できる。この接触系補因子活性は、凝固活性によって（コールマンら、J.Clin.Invest.５６巻：１６５０ −１６６２ページ、１９７５)、並びに、ＸＩ因子からその活性型であるＸＩａ因子への変換を測定する酵素的アッセイ(このアッセイでは補因子であるＨＫの濃度が速度制限決定要因である)(スコットら、Thromb Res.４８巻：６８５−７００ページ、１９８７)によってＨＫを測定するのを可能とする。大きいＨＫ軽鎖には抗体が容易に生成するため、ＨＫは、放射免疫拡散法(スコット及びコールマン、J.Clin.Invest.６５巻：４１３−４２１ページ、１９８０)、ラジオイムノアッセイ(プラウドら、J.Lab.Clin.Med.９５巻：５６３−５７４ページ、１９８０)、ロケット電気泳動法(バウマ(Bouma)ら、J.Lab.Clin.Med.９６巻：６９３−７０９ページ、１９８０)、そして赤血球凝集抑制試験(クレニウスキー及びドナルドソン(Donaldson)、Proc.Soc.Biol.Med.１５６巻：１１３−１１７ページ、１９７７)を含む数種の方法によっても免疫化学的に測定することができる。一方、ＬＫは負に帯電した表面に吸着せず、その機能は現在のところ不明である５ｋＤａの小さい軽鎖を有する。そのため、特異的ＬＫ軽鎖、又はその中に含まれるペプチドに対して生成した抗体のみがＬＫを特異的に捕獲することができる。固相を用いる大部分のイムノアッセイにおいて、抗体又は抗原である固定化された免疫反応体は、固体表面に受動的に吸着される。粒子アッセイの場合、一般的に固体表面は、例えばミクロ粒子（微小粒子）又はミクロスフェア（微小球）を含み、或は、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)の場合はポリスチレンミクロプレートのウェル（井戸状窪み）を含む。大部分の抗体類がこれらのアッセイに用いられるプラスチック表面にしっかりと吸着するが、受動的に吸着された抗体類は、フィブリノーゲン(ヴロマン(Vroman)及びアダムス(Adams)、J.Biomed. Mater.Res. ３巻：４３−６７ページ、１９６９)、及びＨＫ(シュマイエル (Schmaier)ら、Thromb Res.３３巻：５１−６７ページ、１９８４)によって、これらの物質のどちらか又は両方が試験サンプル(例えば血漿)中に存在する場合、置き換えられる危険性がある。ＨＫの活性補因子型であるＨＫａ(スコットら、J .Clin.Invest. ７３巻：９５４−９６２ページ、１９８４)は、最も容易にフィブリノーゲン、ＩｇＧ及びアルブミンを表面から置き換えるＨＫ型であることが判明した(ブラッシュ(Brash)ら、Blood ７１巻：９３２−９３９ページ、１９８８ )。フィブリノーゲン及び／又はＨＫが受動的に吸着された抗体を固体マトリクスから置き換える能力は、これらのアッセイ、特にフィブリノーゲン及びＨＫを測定するアッセイでは、高い変動係数を与え得る。しかし、一次抗体がその表面に共有結合される場合は、そのアッセイの再現性は高まる(スコット及びコルーマン、J.Lab.Clin.Med.１１９巻：７７−８６ページ、１９９２)。残念なことに、一次抗体が固体支持体に共有結合される場合でさえ、生物学的液中の低分子量キニノーゲン(ＬＫ)の直接測定は、主として同じサンプル中のＨＫによる妨害のために、問題がある。主な二つの理由がこの問題を説明する。第一に、ＨＫ及びＬＫは免疫学的に同一の重鎖を有し、ＬＫの特異的軽鎖のための抗体はこれまで存在しなかった。第二に、ＨＫは、実験室的アッセイに用いられる種々の一般的な表面に強く吸着し、その表面に存在する場合、それはディテクター抗体と反応するだろう。最近、特異的ＬＫ軽鎖に特異的な抗体、例えばカウフマン(Kaufmann)ら（J.Bi ol.Chem. ２６８巻：９０７９−９０９１ページ、１９９３)のＬＫＬ−１モノクローナル抗体が入手可能になったため、ＬＫをＨＫから免疫学的に区別することができるようになった。しかし、ＨＫの強い表面吸着傾向は依然としてＬＫ固相イムノアッセイにおける妨害源である。必要なものは、固体表面に親和性を有する例えばＨＫ等の分子の非特異的付着を回避するイムノアッセイ用固体支持体材料である。単位表面積あたり高濃度の免疫試薬を付着できるイムノアッセイ用固体支持体もまた必要である。従って、本発明の目的は、固体表面に親和性を有するＨＫ及びその他の生物学的分子の非特異的吸着を回避する、イムノアッセイ及びその他の種類のアッセイを行うために有用な固体支持体を提供することである。本発明の目的は、高水準の免疫反応体付着を可能とする固体支持体を提供することである。本発明の目的は、上記の支持体を用いるイムノアッセイを提供することである。本発明の目的はＨＫの妨害を最小にするＬＫアッセイを提供することである。本発明の他の目的は、ＬＫの直接的分析（アッセイ）法、並びにＨＫ及びＬＫを同時に測定するための方法を提供することである。本発明の他の目的は、ＨＫ及びＬＫを分析するためのキット、及びキニノーゲンプロファイリングを実施するためのキットを提供することである。本発明の目的は、抗原又は抗体のイムノアッセイを発達させるための簡易で正確な方法を提供することである。本発明の目的は、固体表面を処理して、この表面の、血漿における接触系を活性化する能力を阻害する方法を提供することである。これらの、及びその他の目的は下記の開示から明らかになるはずである。発明の概要本発明によると、イムノアッセイのための固体支持体は、(ａ)負に帯電した重合材料を含むミクロプレート、及び(ｂ)このミクロプレート上のポリエチレンイミンコーティングを含む。他の実施態様によると、イムノアッセイのための固相担体は、(ａ)カルボキシレート改質ラテックスを含むミクロ粒子と；(ｂ)このミクロ粒子上のポリエチレンイミンコーティングとを含む。更に他の実施態様において、本発明は、(ａ)固体支持体と；(ｂ)固体支持体上にコートされる、負に帯電した重合材料によって形成されたミクロ粒子の層と；及び(ｃ)このミクロ粒子上のポリエチレンイミンコーティングと、を含むイムノアッセイのための固相担体に向けられる。本発明は又、イムノアッセイにおける使用のための固相免疫試薬を提供する。一実施態様において、固相免疫試薬は、(ａ)負に帯電した重合材料を含むミクロプレートと；(ｂ)このミクロプレート上のポリエチレンイミンコーティングと；及び(ｃ)このポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって上記のミクロプレート上に固定化された免疫試薬と、を含む。他の実施態様によると、固相免疫試薬は、(ａ)カルボキシ改質ラテックスを含むミクロ粒子と；(ｂ)このミクロ粒子上のポリエチレンイミンコーティングと；及び(ｃ)このポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって上記のミクロ粒子に固定化された免疫試薬と、を含む。他の実施態様では、イムノアッセイのための固相免疫試薬は、(ａ)固体支持体と；(ｂ)この固体支持体にコーティングされる、負に帯電した重合材料によって形成されたミクロ粒子の層と；(ｃ)このミクロ粒子上のポリエチレンイミンコーティングと；及び(ｄ)このポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって上記のミクロ粒子に固定化された免疫試薬と、を含む。更に他の実施態様では、負に帯電した重合体表面を処理して、この表面による血漿の接触活性化を阻害する方法が提供される。その表面をポリエチレンイミンでコーティングし、この表面との接触によって起きる血漿の接触活性化を阻害する。上記各実施態様において、コーティングを構成するポリエチレンイミンの量は、例えばミクロプレート又はミクロ粒子等の負に帯電した重合支持体を含む重合材料の負電荷を遮蔽するのに十分な量であるべきであり、又、そのような負電荷の遮蔽によって、生物学的分子の支持体への非特異的吸着を減らし、又は本質的に完全に除去するのに十分な量であるべきである。上記の固相免疫試薬は、固相イムノアッセイを行うのに有用である。本発明による第一の固相免疫試薬を、相補的免疫試薬を含む、又は含むと思われる液体と接触させ、それによって固定化された免疫複合体を形成し、この形成された固定化免疫複合体を定量する。固定化された免疫複合体は、相補的免疫試薬と免疫反応する、検出可能に標識された第二の免疫試薬で検出し得る。第二の免疫試薬は典型的には抗体を含む。固定化された免疫複合体を洗浄して非結合免疫試薬を除去することができる。固定化された免疫複合体に合体された標識の量をその後測定する。検出可能に標識化された第二の免疫試薬の検出可能な標識は、例えば蛍光標識、放射性標識又は酵素標識等を含む。本発明の他の実施態様において、アッセイは競合的固相イムノアッセイの形をとる。本発明に従う固相免疫試薬を、相補的免疫試薬を含む又は含むと思われる液体、及び標識化された相補的免疫試薬の既知量と接触させ、それによって標識化された及び標識化されていない相補的免疫試薬の部分が固相免疫試薬に結合する。固相免疫試薬に結合した標識化された相補的免疫試薬の量を定量する。免疫試薬及び相補的免疫試薬は、共に抗原／抗体の対を構成する。免疫試薬が抗原である場合には、相補的免疫試薬はその抗原に結合親和性を有する抗体である。免疫試薬が抗体である場合には、相補的免疫試薬は、その抗体に結合親和性を有する抗原である。サンプル中の抗原の存在を検出するアッセイにおいて、免疫試薬は抗体を含むだろう。抗体の存在を検出するように設計されたアッセイの場合は、免疫試薬は本発明の抗原を含むだろうし、高分子量キニノーゲンアッセイのための固体支持体はミクロプレート、そのミクロプレート上の負に帯電した重合材料のコーティングを含む。ミクロプレート上のそのコーティングは、好適には負に帯電した重合材料から形成されるミクロ粒子の層を含み、最も好適にはカルボキシレート改質ラテックスを含むミクロ粒予を含む。他の実施態様によると、本発明は： (ａ)高分子量キニノーゲンを含む又は含むと思われる液体サンプルを、負に帯電した固体支持体と接触させ、サンプル中の高分子量キニノーゲンを固体支持体に固定化し； (ｂ)固定化されたサンプル高分子量キニノーゲンから非結合物質を洗浄し； (ｃ)固定化されたサンプル高分子量キニノーゲンを、検出可能な標識を直接的又は間接的に結合して含む、高分子量キニノーゲンに結合するディテクター抗体と接触させ； (ｄ)ディテクター抗体と固定化されたサンプル高分子量キニノーゲンとの結合を分析する、ことを含む高分子量キニノーゲンアッセのためのアッセイ方法を提供する。好ましくは、負に帯電した支持体はミクロプレートを含み、このミクロプレートはカルボキシレート改質ラテックスを含み、或は、例えば９６ウェル組織培養プレートにおいて典型的であるように、照射によって与えられた負電荷を有する。更に他の実施態様によると、本発明は： (ａ)高分子量キニノーゲンを捕獲するための負に帯電した表面を含む第一の固体支持体と； (ｂ)第二の固体支持体であって、その上のポリエチレンイミンコーティングと、及びこのポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって上記の第二の個体支持体上に固定化される、低分子量キニノーゲンに対して特異的な捕獲抗体と、を含む第二の固体支持体と； (ｃ)第三の固体支持体であって、その上のポリエチレンイミンコーティングと、及びこのポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって上記の第三の個体支持体上に固定化される、キニノーゲン重鎖に対して特異的な捕獲抗体と、を含む第三の固体支持体と； (ｄ)高分子量キニノーゲンの重鎖及び軽鎖両方を認識するディテクター抗体の供給物と、を含むキニノーゲンアッセイのためのキットが提供される。好ましくは、固体支持体は、ミクロプレート又はミクロ粒子の形をとる。上記のキニノーゲンアッセイ法及びキットにおいて、ディテクター抗体は検出可能な標識を担持することができる。或は、検出可能な標識は、ディテクター抗体に結合する二次ディテクター抗体に担持される。検出可能な標識は、例えば蛍光標識、放射性標識又は酵素標識を含む。このような二次ディテクター抗体の供給物は、キニノーゲンアッセイキットに供給され得る。検出可能な標識が酵素標識である場合、キットは更にその酵素の基質の供給物及びその加水分解を停止する試薬を含むことができる。更に、キニノーゲンアッセイキットにおける任意の構成成分としては、採取中の血液サンプルの凝固を防ぐことができる１つ以上の抗凝固剤の供給物と；サンプル採取後のキニノーゲンのタンパク質分解を阻害することができる１つ以上のプロテイナーゼ阻害剤の供給物と；及び１つ以上の緩衝剤の２９供給物を含む。一実施態様によると、これらの任意の構成成分は、一連の容器に含まれてもよい。例えば、キットは： (ａ)１つ以上の抗凝固剤と１つ以上のプロテイナーゼ阻害剤との混合物を含む第一の容器と； (ｂ)サンプルを希釈するための緩衝組成物を含む第二の容器と； (ｃ)キニノーゲン捕獲後にミクロプレートを洗浄するための洗浄緩衝組成物を含む第三の容器とを含むことができる。容器の内容物は乾燥粉末又は液体でよい。好ましくは、少なくとも第一のバイアルに含まれる抗凝固剤とプロテイナーゼ阻害剤との混合物、及び第二のバイアルに含まれる緩衝組成物は粉末型である。 “ミクロプレート”とは、分析のためのサンプル類を適切に保持できる複数のウェルを含む、典型的には、光透過性プラスチック材料にて作製されるプレートを意味する。 “非特異的吸着”とは、抗体とその同系(cognate)抗原との間の反応以外のメカニズムによる結合を意味する。“生物学的分子”とは、分析すべき生物学的サンプル中に存在し得る任意の分子を意味する。好ましくは、非特異的吸着のレベルは、そのアッセイの検出限界レベルにまで減少される。つまり、本発明の実施により、固体支持体への分子の非特異的吸着によって表される“バックグラウンド ”は、実質上ゼロにまで、或はノイズに対するシグナルの比が５０：１より大きくなる値まで減少される。図の説明図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、それぞれ正常な血漿のＨＫ、ＬＫ及びＴｏｔＫ血漿アッセイのための標準曲線である。最初にＰＣＦＩＡ希釈液で１：５０に希釈した正常のプールした血漿を、ＰＣＦＩＡ希釈液で連続希釈して標準曲線を作成した。縦軸の値はＲＦＵ(相対的蛍光単位)を表し、各点は３回測定値の平均値±標準偏差を表わす。図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、それぞれ、正常ドナー３８名の血漿中のＨＫ、ＬＫ及びＴｏｔＫのＰＣＦＩＡ測定値である。対象線は各々の平均値、＋及び-の２標準偏差を表わす。図３は、図１Ｂからのデータに対して図１Ｃからのデータをプロットしたものである。キニノーゲン欠損血漿＝０。図３は、正常ドナーの血漿中のＨＫ及びＬＫ濃度の相関を示す。図４は、正常ドナー血漿中のＴｏｔＫ(重鎖)値に対するＨＫ値(各々の軽鎖)の合計プロットである。図４は、ＴｏｔＫに対するＬＫ＋ＨＫの合計の相関を示す。図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ及び５Ｄは、ポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェア(図５Ａ)及び従来の正に帯電したアミノ改質ミクロスフェア(図５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ)を用い、正常のプールした血漿から作成した、ＬＫ血漿アッセイのための標準曲線である。図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃ及び６Ｄは、ポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェア(図６Ａ)及び従来のアミノ改質ラテックスミクロスフェア(図６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ)を用い、正常のプールした血漿から作成した、ＴｏｔＫ血漿アッセイのための標準曲線である。図７は、６つの血漿サンプルの総キニノーゲンアッセイから、ＥＬＩＳＡ総キニノーゲンアッセイの結果に対してＰＣＦＩＡ総キニノーゲンアッセイの結果をプロットしたものである。ｒ値０.９８が得られた。図８は、７つの血漿サンプルのＬＫアッセイから、ＥＬＩＳＡＬＫアッセイの結果に対してＰＣＦＩＡＬＫアッセイの結果をプロットしたものである。ｒ値０ .９８が得られた。図９は、９６ウェルミクロプレートで行われた既知の総キニノーゲン濃度のサンプルの、総キニノーゲンＥＬＩＳＡのプロットである。ここで、総キニノーゲンモノクローナル抗体の付着前に、ウェルに下記コーティングを行った：ポリエチレンイミンの受動的コーティング(黒丸)；ＥＤＣ．ＨＣｌを介してウェルに共有結合したポリエチレンイミンコーティング(白丸)；ポリエチレンイミンが受動的に吸着された上に設けられるカルボキシ改質ラテックス粒子のコーティング( 黒三角)；ポリエチレンイミンをＥＤＣ．ＨＣ１を介して共有結合させた上に設けられるカルボキシ改質ラテックス粒子のコーティング(白三角)。図１０は、精製したヤギ血清の連続希釈物から形成されたヤギＩｇＧのＰＣＦＩＡ測定のプロットである。図１１は、ＨＫ捕獲のための固体支持体としてカルボキシレート改質ラテックスでコートしたミクロプレートを用いて正常のプールした血漿から作成した、ＨＫ血漿ＥＬＩＳＡのための標準曲線である。発明の詳細な説明本発明によると、固相イムノアッセイ、及びその他の種類のアッセイに有用なポリエチレンイミンでコートされた固体支持体が提供される。“固相イムノアッセイ”とは、固体支持体に結合している免疫試薬を使用し、相補的免疫試薬を捕獲して検出するアッセイ(分析)を意味する。“免疫試薬”及び“相補的免疫試薬 ”とは、抗体−抗原結合反応によって互いに結合する１対の試薬を意味する。免疫試薬が抗体である場合は、相補的免疫試薬はその抗体に結合する抗原を含むということを理解されたい。免疫試薬が抗原である場合は、相補的免疫試薬はその抗原に結合する抗体を含むことを理解されたい。抗体は、標的抗原に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体を含み得る。抗体は、無損傷(intact)抗体、又は抗原に結合できるそのフラグメント類(Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)₂を含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない)を含んでもよい。従って、ここで用いられる用語“抗体”は、無損傷抗体分子、及び抗原結合力を保有するそのフラグメント類を含む。抗原は一般にはタンパク質又はペプチド抗原であるが、非タンパク質抗原、例えば炭水化物類、脂質類、細胞壁成分等も適した抗体が使用できるならば検出できる。患者のサンプルから抗原を捕獲するために用いられる、固体支持体に固定された抗体は、以後“捕獲抗体”と表わす。捕獲抗体は抗原の決定基に結合する。捕獲された抗原の存在を知らせる検出可能な標識を、直接又は間接的に担持する、固体支持体に固定されていない抗体は、以後“ディテクター抗体”と表わす。ディテクター抗体は、捕獲された抗原の別の決定基と結合し、その決定基は抗原が捕獲抗体と結合した後に抗原分子上に露出したままになっている。検出可能な標識は、ディテクター抗体に直接付加していてもよいし(一次ディテクター抗体)、又はディテクター抗体上の抗原性決定基に結合する第三の抗体(二次ディテクター抗体)に固定していてもよいことを理解されたい。例えば、非標識ディテクター抗体がヒツジ抗ヒトＨＫである場合、標識はロバ抗ヒツジＩｇＧによって供給され得る。ＥＬＩＳＡの場合は、二次ディテクター抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)に結合したロバ抗ヒツジＩｇＧ結合物(ロバ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ)を含むことができる。一実施例によると、固体支持体上のコーティング材料はポリエチレンイミンを含む。“ポリエチレンイミン”とは、約８５％以上のエチレンイミン(アジリジンとしても知られている)モノマーからなる任意のポリマーを意味する。エチレンイミンモノマーは(ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ)構造を有する。用語“ポリエチレンイミン ”は、エチレンイミンのホモポリマーのみならず、少なくとも約８５％がエチレンイミン単位であるコポリマー類も含む。好ましくは、そのポリマーはエチレンイミンのホモポリマーである。好適なポリエチレンイミンは、平均分子量約５０，０００を有する。捕獲する免疫試薬、或は捕獲された相補的免疫試薬のどちらか構成する抗原は、検出又は定量が所望される注目する生物学的サンプル、例えば血液、唾液、尿、糞便等に存在すると思われるあらゆる物質、又は物質の抗原性決定基を含んでもよい。好適な一実施例によると、相補的免疫試薬は、総キニノーゲン(ＨＫ＋ＬＫ)又はＬＫ単独である。ここに記載される、ポリエチレンイミン処理によって改質された固体支持体は、負に帯電した重合材料を含む。その支持体全体が負に帯電した重合材料から形成されてもよいし、負に帯電したポリマーのコーティングのみを含んでもよい。支持体の表面負電荷は、生物学的分子の、下地の固体支持体に対する非特異的吸着レベルを劇的に減らすことが明らかとされたポリエチレンイミン層の結合を高めることができる。上記支持体は、あらゆる便利な物理的形、例えば膜、格子(grid)、スライド、フィルム、棒、管又は粒子等の形をとることができる。本発明の粒子イムノアッセイ実施例によると、カルボキシレート改質ラテックス粒子が好適な固体支持体である。本発明のＥＬＩＳＡ実施例において、その支持体は、カルボキシレート改質粒子を担持するミクロプレートの形をとり得る。ガラス等の非官能化(non-f unctionalized)支持体の場合は、その表面を官能化(functionalized)ポリマーにて、最も好ましくはカルボキシレート改質ラテックスポリマーにてコートすることができる。支持体そのものが負に帯電した重合材料を含まない場合は、このような帯電した物質のコーティングを設けなければならない。そのようなコーティングが設けられるなら、下地の支持体は、固相イムノアッセイにおける免疫試薬の担体として使用できるいかなる材料も含むことができる。そのような材料は、負に帯電した重合材料の付加コーティングによって必要な負電荷が供給される場合は、負電荷の必要に関係なく、ガラス、金属、及び例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリコン樹脂等の種々のプラスチックを含む。必要な負電荷を担うコーティングは、例えばラテックス粒子の懸濁液、例えばＳＥＲＡＣＯＡＴ(セラジン(Seradyn)インコーポレイテッド、インディアナポリス、ＩＮ)等のカルボキシレート改質ラテックス粒子の懸濁液として設けることができる。尚、様々な生物学的アッセイに用いられるポリスチレンミクロプレートは、一般には基本的には帯電していないバージンポリスチレンから作られる。つまり、このような標準的なミクロプレートは、適切に負に帯電した重合材料のコーティングによってコートされない限り、本発明の実施のためには満足できる支持体にはならない。一方、負電荷を与えるように改質されたある種の改質ポリスチレンの場合には、負に帯電したポリマーの付加的コーティングは不必要である。一般的に、組織培養プレートは、負に帯電された、照射されたポリスチレンから作られる。この負電荷はプレートへの細胞付着を促進する。カルボキシル基の挿入によってポリスチレンを改質することも知られている。カルボキシレート改質スチレンミクロ粒子は、セラジンインコーポレイテッド（インディアナポリス、ＩＮ）から市販されている。これらのカルボキシレート改質ポリスチレンプレートの負電荷は、ポリマー鎖の末端をなす硫酸基、ミクロ粒子の調製過程で使用されて吸着した界面活性剤、及びカルボキシレート含有モノマーのカルボキシレート基から生ずる。次に、負に帯電した重合材料によって形成されるか、又は少なくとも負に帯電した重合材料の表面コーティングを担持した固体支持体は、少なくともポリエチレンイミンの表面コーティングを得るように処理される。このようなコーティングとしては、下地である支持体の表面への受動的な物理的付着によって形成されるポリエチレンイミン層だけでなく、適当な結合剤或は複数種類の結合剤との反応により支持体表面に化学的に結合されるポリエチレンイミンのコーティングも含まれる。従って、ポリエチレンイミンで“コートされた”又は“処理された”支持体とは、受動的吸着によりポリエチレンイミンを付けることのみならず、結合剤によるポリエチレンイミンの支持体表面への能動的化学的結合も意味する。結合の好ましい形としては、支持体表面とポリエチレンイミンコーティングとの間の共有結合形成を含む。例えば顕微鏡的(microscopic)な粒子等の粒子へポリエチレンイミンを設けること、及びこのような粒子を例えばスライド又はミクロプレート等のような肉眼的(macroscopic)な支持体の表面に堆積させることも本発明の範囲内と考えられる。驚くべきことに、固体支持体のポリエチレンイミン改質は、負電荷を有する下地表面に適用したとき、それがなければ固体表面に付着するＨＫ等の分子の非特異的吸着をほとんど回避する。更に、抗体又はタンパク質抗原等のタンパク質類がポリエチレンイミン改質表面に容易に結合し、免疫試薬として役立つ。更に、非常に高度に免疫試薬を担持でき、従ってより感度の高いイムノアッセイが得られる。本発明の他の実施例によると、ポリエチレンイミンを、負に帯電した重合材料のためのコーティングとして用い、その材料が接触活性化を引き起こす能力を阻害する。血漿中のＸＩＩ因子は、負に帯電した表面と接触するとき、固有の(intri nsic)血液凝固経路を創始する。このため、負に帯電した重合材料は、血漿が存在するアッセイを実施するための支持体又は容器として用いることはできない。本発明によると、このような重合材料の接触活性化機能は、ポリエチレンイミンのコーティングの適用によって実質上減少し、又はほとんど排除される。従ってその重合材料は、血漿が存在する生物学的アッセイにおける容器又は支持体として、接触活性化系の誘発による誤った結果を心配することなく使用できる。好ましい一実施例によると、負に帯電した重合表面としては、ミクロプレート表面が含まれる。また他の好ましい実施例において、負に帯電した重合表面は、血漿又はその他の血液調整物を集め、処理し、保存し、分析するために用いられるフィルター又は膜の表面を含む。他の好ましい実施例において、負に帯電した重合表面は、血漿又はその他の血液調整物を集め、保存し、分析し、処理するために用いる試験管、バクテイナ管(vacutainer tube)、又はその他のベセル管(vessel t ube)の表面を含む。負電荷遮蔽の必要程度、従って接触活性化の防止程度は、その容器又は固体支持体を用いるアッセイ又はその他の操作の時間に依存する。例えば、その支持体を、１時間以内に完了すべき血漿分析のために用いる場合は、中程度のポリエチレンイのミンコーティングで十分であろう。その支持体を数時間に亙る血漿分析に用いる場合は、表面負電荷の実質上全ての適切な遮蔽を確実にするために、より多量のポリエチレンイミンコーティングが必要となるだろう。支持体の負の表面電荷をブロックする段階を取り入れない限り、アッセイのインキュベーション時間が長くなる程、血漿サンプルの接触活性化がより起きやすくなる。血漿サンプルの接触活性化の存在はカリクレインの出現によって好都合にモニターでき、このカリクレインは、ＸＩＩａ因子の作用によって、チモーゲンであるプレカリクレインから遊離される。カリクレインの生成は、例えば基質Ｓ−２３０２(クロマゲニックスインコーポレイテッド(Chromagenix，Inc.))によってモニターできる。本発明の好適な一実施例によると、固体支持体は負電荷を有するポリマーのミクロ粒子を含む。このような粒子は、一般にポリマーラテックスの形で調製され、ミクロ粒子又はミクロスフェアの形をとる。用語“ラテックス”は、その通常の意味を有するものとし、即ち、実質上水性媒体中の重合物質の安定分散系である。一般に、合成ラテックスは、例えばスチレン−ブタジエンのコポリマー、アクリレート樹脂、ポリビニルアセテート、及び同様の物質から、エマルジョン重合法によって形成される。最も好適には、ポリエチレンイミン処理を適用する重合支持体材料は、カルボキシレート改質ポリマーミクロ粒子を含み、その調整法は、例えばチーグ(Ziege) らの米国特許第５,１００,８０５号に記載されており、その全ての開示を本明細書に引用して援用する。このようなポリマー粒子の主要成分は、ビニル芳香族モノマー、及びビニルアクリレートエステルモノマー等であってよい。ビニル芳香族モノマーは、スチレン、ビニルトルエン、ｔ−ブチルスチレン又はそれらの混合物であってもよい。好ましくは、スチレンである。ビニルアクリレートエステルモノマーは、例えば、１から６個の炭素原子からなる張り出したアルキルエステル基を有するモノマーであってもよい。そのビニルアクリレートエステルモノマーは、アクリレートモノマーのメチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓ− ブチル又はその他の変型、又は例えばメチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート等のメタクリレートビニル単位の変型であってよい。粒子は特許第５,１００,８０５号に記載されている従来のエマルジョン重合法によって調整される。カルボキシレート改質のためには、例えばアクリル酸等のカルボキシレート含有モノマーが、重合粒子を構成するコポリマーに含まれる。好ましくはアクリル酸である。カルボキシレート改質ミクロ粒子及びラテックスコーティング組成物は、例えばセラジンインコーポレイテッド（インディアナポリス、ＩＮ）から商品名ＣＭＬ(カルボキシレート改質ラテックスミクロスフェア)及びＳＥＲＡＣＯＡＴ(登録商標)(カルボキシ改質ラテックスコーティング材料)として市販されている。ＣＭＬ材料の代表的ロットは、カルボン酸(COOH酸)０.０２３ｍｅｑ／ｇ（ミリイクイバレント／グラム）を含む直径０.８μｍ（ミクロン）を有するミクロスフェアからなる。イムノアッセイ固体支持体表面のポリエチレンイミンコーティングは、適当な結合剤で最も好都合に行われる。適用されるポリエチレンイミンの量は、下地の重合支持体の負電荷を完全に遮蔽するのに十分な量でなければならない。又、適用されるポリエチレンイミンの量は、負に帯電した重合支持体への生物学的分子の非特異的吸着を減らし、好適には除去するのに有効な量でなければならない。結合剤は、ポリエチレンイミンの支持体への付着、例えばラテックス粒子への付着を効果的に促進する任意の化学的作用物質を含むことができる。好ましくは、結合剤が作用してポリエチレンイミンコーティングを支持体に共有結合させる。カルボキシレート改質ラテックスの場合、ポリエチレンイミンコーティングを固定する好適な結合剤は、カルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＤＣ)；１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド( ＥＤＣ)又はＥＤＣ塩酸塩；又は１−シクロヘキシル−３−(２−モルホリノエチル)カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート(ＣＭＣ)である。好ましくはＥＤＣ塩酸塩である。カルボジイミドはカルボキシレート改質ラテックスのカルボン酸基と反応してカルボキシル基を活性化し、それをポリエチレンイミンのアミノ基に結合させる。ポリエチレンイミンコーティング改質は、ラテックス粒子とポリエチレンイミンとを一緒にし、その後、室温で撹拌しながら結合剤を添加することによって行うことができる。混合物に加えるポリエチレンイミンの量は、ラテックス粒子上に均一なコーティングを得るのに十分な量でなければならない。結合剤の量は、堆積したポリエチレンイミンをラテックス粒子表面へ付着させる任意の量である。好適には、カルボジイミドの量は、当量ベースで、粒子カルボキシレート含有量を超えているべきで、少なくとも約２倍の量であることが好ましい。本発明の好ましい実施例によると、直径約０.８μｍのカルボキシ改質ラテックスミクロスフェア(“ＣＭＬ”、セラジンインコーポレイテッド)(１００ｍｌ中、１０％固体)を一定の撹拌下で１％ポリエチレンイミンに加える。この混合物に、水に溶かしたＥＤＣ塩酸塩を加え、容量を水で調節する。混合物を撹拌し、ミクロスフェアを遠心分離し、水で洗浄する。その後、改質ミクロスフェアを４℃で０.０２％アジ化ナトリウム(NaN₃)中に保存し得る。抗体又はタンパク質抗原等のタンパク質免疫試薬は、ミクロスフェア等のポリエチレンイミン改質支持体に容易に共有結合される。ポリエチレンイミン処理はタンパク質とミクロスフェアとの結合を妨害しない。その結合がタンパク質の相補的免疫試薬への結合能力を実質的に妨害しない場合、所望のタンパク質免疫試薬を、改質及びタンパク質を固体支持体材料に結合するのに適した任意の既知の結合剤を用いて、ポリエチレンイミン改質ミクロスフェアに結合することができる。ポリエチレンイミンの反応性アミノ又はイミノ基に付着できる第一の反応基と、タンパク質分子上の基と反応し、共有結合を形成し得る第二の反応基を有するいかなる結合剤も使用できる。結合剤は、ラテックスミクロスフェアの改質を行い、その粒子表面にポリエチレンイミンコーティングを付加するために用いる結合剤と同じ物を含むことができる。本発明の好ましい実施例によると、ポリエチレンイミンをカルボキシレート改質ラテックス粒子に結合するための作用物質、及び免疫試薬をポリエチレンイミン改質粒子に結合するための作用物質は、両方共カルボジイミドを含み、最も好適にはＥＤＣ又はＥＤＣ塩酸塩を含む。免疫試薬の固体支持体への結合後、固定化免疫試薬を注目する生物学的試験サンプルからなる、又はそれを含む液体と接触させる。その試験サンプルは、生のまま(raw)の生物学的液体でよい。より一般的には、その生のサンプルをアッセイを行う前に、イムノアッセイ技術の当業者には公知の伝統的方法を用いて希釈、又は部分的に精製する。サンプル及び固定化免疫試薬を、免疫試薬とその相補的免疫試薬との免疫複合体が形成するのに十分な時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡ法のための時間は、抗体と抗原との各インキュベーションステップ（工程）が約１.５時間未満であってはならない。さらに長い時間とし得る。ＰＣＦＩＡのための時間は、１５分未満であってはならず、さらに長い時間とし得る。インキュベーションステップの温度及びｐＨは変化してもよいが、室温(２３℃)、及びｐＨは６.０から８.０の間が好ましい。固定化免疫複合体の形成後、間に洗浄段階を含む場合も含まない場合も、これを、検出可能な標識を担持する第二の免疫試薬と接触させる。第二の免疫試薬は抗原又は抗体を含み得るが、一般的には抗体を含む。第二の免疫試薬は検出可能な標識で直接標識されるか、又は検出可能な標識を担持する別の分子への結合を通して間接的に標識化される。その標識は、例えばラジオイムノアッセイの場合は放射性核種；免疫蛍光測定の場合は蛍光部分；化学ルミネセント分析の場合は化学ルミネセント部分；及び酵素結合免疫吸着測定法の場合は発色性又は蛍光発生性の基質を開裂する酵素を含むのが好都合である。１以上の洗浄ステップによって、酵素イムノアッセイにおけるいかなる非結合物質をも除去した後、酵素と反応して色の変化をおこす指示薬、例えば発色性基質を加える。その色の変化を目で、又はより好適には機器で観察してサンプル中の抗体又は抗原の有無を明らかにすることができる。定量のためには機器が必要である。固相蛍光イムノアッセイの場合は、蛍光標識化部分を適切な波長における励起を用いてモニターでき、化学ルミネセント標識化抗原又は抗体は、反応後、化学ルミネセント標識を化学的に活性化させ、光度測定手段によって検出できる光を生成させることによって追跡できる。イムノアッセイの基礎的原理は、抗原−抗体複合体濃度がアッセイ媒体中の遊離抗原及び遊離抗体の濃度に比例することである。従って、抗原(又は抗体)の測定のための検量曲線は、変化する既知量の抗原(又は抗体)を一定の既知量の抗体 (又は抗原)を含む溶液に添加したときに生成する抗原−抗体複合体の量を測定することによって作成することができる。イムノアッセイは、競合的イムノアッセイの形でもよい。競合的ＥＬＩＳＡ又はＰＣＦＩＡによると、免疫試薬(例えば捕獲抗体)を固体支持体に固定させて本発明に従う固相免疫試薬を形成する。標識化された相補的免疫試薬(例えば標識化された抗原)をサンプルと混合し、それを次に固相免疫試薬と接触させる。標識化された及び標識されていない抗原が抗体への結合を競合する。抗体に結合した標識化抗原の量の値が高い程、サンプル中の抗原濃度は低い。ＨＫは、ポリエチレンイミン改質固体支持体に吸着しない。つまり、そのような支持体は、ＨＫも存在するかも知れないヒトの生物学的液体(例えば血漿)中の諸物質を直接測定するためのイムノアッセイに特に有用である。特に、ポリエチレンイミン改質支持体材料は、生物学的液体中のＬＫの直接測定に有用である。例えば、ラテックスミクロスフェアは、ＬＫ軽鎖に特異的な精製抗体の共有結合後に、粒子濃度蛍光免疫測定法(ＰＣＦＩＡ)に用いることができる。しかし、酵素結合免疫吸着測定(ＥＬＩＳＡ)技術において、ＥＬＩＳＡプレートをミクロスフェアと同様方法にて改質し、適切な抗体又は抗原類がそのミクロプレート表面に共有結合する場合には、ＥＬＩＳＡ法も用いることができる。ＬＫ測定のためのＰＣＦＩＡによると、ＬＫ軽鎖に特異的な第一の(捕獲)抗体が共有結合しているポリエチレンイミン改質ミクロスフェアを、０.４５μｍ膜を備えた９６ウェルアッセイプレート(イデックスコーポレーション(Idexx Corp oration)、ウエストブルック、ＭＥ)の各ウェルに入れる。アッセイプレートのウェルは、標準曲線を誘導するための対照サンプルの適切な希釈液を含む。その他のウェルは希釈された未知サンプルを含む。サンプルをミクロスフェアと共に、サンプル中の全ての抗原(ＬＫ)がミクロスフェア上の抗体によって捕獲されるまで、室温でインキュベートする(通常１５から２０分間)。その後、更に洗浄することなく、フルオロホア(fluorophore)が付着している第二の(ディテクター) 抗体を加え、その混合物を、そのディテクター抗体がサンプル中の全ての抗原に結合するまでインキュベートする(通常１から２０分間)。プレートをその後蛍光濃度分析器(ＦＣＡ)(イデックスコーポレーション)に入れ、そこでウェルの可溶性内容物は抜かれ(evacuated)(２０ｍｍＨｇ)、その後、保持されたミクロスフェアを真空下で２回洗浄する。この操作は、ミクロスフェアに捕獲されなかった全てのタンパク質を完全に除去する。ＨＫは捕獲抗体によって捕獲されず、抗体結合化ミクロスフェアに吸着することができないので、これは洗浄工程で完全に除去される。値は“相対的蛍光単位”(ＲＦＵ)として表される。未知サンプルからのＬＫ濃度は、サンプルの蛍光値と対照サンプル希釈物によって作成した標準曲線蛍光値との比較によって測定される。この方法を用いて、１時間以内に２４サンプルを３回づつ、又は４０サンプルを２回づつ、既知の７つの標準及び緩衝液対照と共に測定することができる。ポリエチレンイミン改質ミクロスフェアを用いるＬＫアッセイは、その軽鎖を依然として含むＬＫの特異的測定法を提供する。一方、ポリエチレンイミン改質をしない従来のミクロスフェアを固体マトリクスとして用いる場合は、ＨＫがその表面に強く吸着する。サンプルを希釈するための希釈液は、好適には、例えば１５０ｍＭＮａＣｌ、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０、２％ウシ血清アルブミン、及び一組のプロテイナーゼ阻害剤(以下により詳しく述べる)を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.４ )を含む。捕獲抗体及び／又はディテクター抗体は、ＬＫ軽鎖に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体、例えばカウフマンら(J.Biol.Chem.２６８巻：９０７９−９０９１ページ、１９９３)の記載によるモノクローナル抗体“ＬＫＬ−１ ”などを含むことができる。捕獲抗体及び／又はディテクター抗体は、無損傷抗体、又、限定されるものではないがＦａｂ及びＦ(ａｂ’)₂等を含む、抗原に結合できるそのフラグメントを含むことができる。モノクローナルＬＫ抗体は、従来の抗体精製法に従って、適切なＬＫ抗体産生ハイブリドーマの腹水から精製され得る。例えば、抗体は市販の精製キット、例えばＩＭＭＵＮＯＰＵＲＥ(登録商標)タンパク質Ａ／Ｇカラム(ピアスケミカルカンパニー(Pierce Chemical Company)、ロックフォード、ＩＬ)を用い、そのキットに含まれる緩衝剤及び使用指示書を用いて腹水液から精製することができる。精製後、抗体を濃縮し、透析し、緩衝液中に保存する。ＬＫ軽鎖に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、カウフマンらの方法(上述)に従って調製することができる。カウフマンらの全開示は、本明細書に引用して援用する。簡単に言うと、ＭＡｂＬＫ１−１の特異性を有するモノクローナル抗体は、まず、担体としてのスカシガイ(keyhole limpet)ヘモシアニン又はウシ血清アルブミンのどちらかに結合したペプチド、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇ１ｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（(配列番号：1 )SEQ ID NO:1）からなる結合物を免疫原として生成することによって調製される。ペプチド(配列番号：１)はヒトＬＫのアミノ酸残基３８９から４０９に対応する。配列番号：１の担体への結合は、ペプチド結合の前に、まず担体タンパク質をマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理することによって、ジスルフィド結合の形成により行うことができる(リウ(Liu)ら、Bi ochemistry １８巻、６９０−６９７ページ、１９７９)。次に、そのペプチド結合物に対するネズミ(murine)モノクローナル抗体が、標準方法(ケーラー１９７５)に対してホック(Hock)ら(J.Biol.Chem.２６５巻、１２００５−１２０１１ページ、１９９０)により記載される若干の変更を加えた方法によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスにて生成される。集めた免疫脾細胞との融合のためには、Ｘ６３／Ａｇ８.６５３骨髄腫細胞が用いられる。所望の特異性を有する抗体を産生するコロニーを、制限希釈法によって３回サブクローンする。腹水生成を誘起するために、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン(Pristane(登録商標)、アルドリッチケムカンパニー(Aldrich Chem.Co. ))０.５ｍｌを腹腔内注射し、その１０日後に、ＲＰＭＩ１６４０培地０.５ｍｌ中の５×１０⁶ハイブリドーマ細胞を同じ経路から投与することができる。腹水を集め、これを抗体精製に使用する。本発明は、血漿及びその他の生物学的液中のＬＫ測定のための簡単な測定方法、並びにＨＫ及びＬＫ両方の同時測定のための方法を提供する。本発明によるキニノーゲンアッセイは、少なくとも３０倍の範囲にわたって直線性である(図１) 。血漿中ＬＫ測定のこれまでの報告は、大部分が間接的測定法であった。或いは、ＨＫとＬＫが共通の重鎖を共有するという問題のために、アッセイ前にＨＫをＬＫから分離することを行わなければならなかった。一方、本発明の方法は、ＬＫＬ−１等のモノクローナル抗体を用いるＬＫの直接的、高速、定量し得る測定法を始めて提供する。本発明によると、同一のディテクター抗体及び同一の希釈した患者サンプルを、ＨＫ、ＬＫ及び総キニノーゲン(ＴｏｔＫ)の測定に用いることができる。この特徴のために、キニノーゲン類の絶対濃度のみならず、キニノーゲン類の比濃度 (specific concentration)、並びにキニノーゲン開裂程度を評価する、“キニノーゲンプロファイリング”研究を行うことができる。ＨＫは、負に帯電した固体表面へのその付着能力によってミクロスフェアに捕獲されるため、ＨＫを測定するためには、固体支持体は、捕獲抗体が結合する必要のない従来の負に帯電したミクロスフェアを含む。好ましくは、ミクロスフェアはカルボキシレート改質ラテックスを含む。サンプルをミクロスフェアと接触させ、ＨＫは負に帯電した表面に結合する。ミクロスフェアの洗浄は、非結合物質を除去し、固定化されたＨＫをその粒子表面に残す。ＴｏｔＫアッセイのためには、固体支持体は、ＨＫ及びＬＫ両方の重鎖を認識する抗体が付着したポリエチレンイミン改質ミクロスフェアを含む。例えば、その抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ＃ＨＢ−８９６３から得られるモノクローナル抗体２Ｂ５を含んでよく、その調製法は米国特許第４,９０８,４３１号に記載されている。特許第４,９０８,４３１号の全開示は本明細書に引用して援用する。ＬＫを測定するためには、支持体は、ＬＫ−１ＭＡｂ等のＬＫ軽鎖に特異的でＨＫは認識しない抗体が付着したポリエチレンイミン改質ミクロスフェアを含む。同じ原理に基づくＥＬＩＳＡ法によると、より小さい粒子サイズのカルボキシレート改質ラテックス、直径０.１μｍ(ＳＥＲＡＣＯＡＴ(登録商標)ＴＣ３Ｘ、セラジンインコーポレイテッド)を用いて９６ウェルミクロプレートのウェルをコートする。そのプレートを乾かす。ＬＫ及びＴｏｔＫアッセイのためには、１０ｍＭのＮａ₂Ｐ０₄（pＨ６.０）＋０.５ｍＭのＥＤＴＡ中の１％ポリエチレンイミン溶液を調製する。ＥＤＣ．ＨＣｌ(９.６ｍｇ／ｍｌ)を加え、その後直ちにその混合物をラテックスコートされたミクロプレートに加える。ウェルをその溶液で完全に満たし、静置してポリエチレンイミンコーティングをカルボキシレート改質ラテックス粒子に固定させる。そのプレートを脱イオン水で洗浄し、乾燥する。ＴｏｔＫＥＬＩＳＡのためには、ラテックス／ポリエチレンイミンコートされたプレートに結合させる免疫試薬は、ＨＫ及びＬＫ両方の重鎖を認識するＭＡｂ２Ｂ５等のＭＡｂを含む。ＬＫＥＬＩＳＡのためには、免疫試薬は、ＬＫ軽鎖に特異的なＭＡｂＬＫＬ−１等のＭＡｂを含む。その抗体を、結合剤としてＥＤＣ．ＨＣｌを含む溶液に、５μｇ／ウェルの濃度で各ウェルに加え、その後少なくとも約２時間インキュベートする。アッセイプレートのウェルを、標準曲線を作成するための対照サンプルの適切な希釈物で満たす。その他のウェルは希釈した未知サンプルを含む。室温で１.５時間インキュベートした後、プレートを空にし、洗浄緩衝液で洗浄する。洗浄緩衝液は例えば、０.５ＭＮａＣｌ、０.２％アジ化ナトリウム(NaN₃)及び０.１％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ２０)を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)を含む。一次ディテクター抗体として、緩衝液で希釈したヒツジ抗ヒトＨＫ(緩衝液で１：１５００に希釈したもの、２００μｌ)を各ウェルに入れ、プレートを１.５時間インキュベートし、その後洗浄する。二次ディテクター抗体として、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合されたロバ抗ヒツジＩｇＧ(抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ)を緩衝液で希釈し、各ウェルに加える。ヒト血漿には基質を加水分解し、バックグラウンドを生ずるホスファターゼ類が存在するため、アルカリホスファターゼは使用できない。室温で２時間インキュベートした後プレートを洗浄し、その後酵素基質を各ウェルに加える。加水分解物の光学密度を標準に対して測定し、未知サンプル中のＴｏｔＫ又はＬＫの濃度を得る。生物学的液のＨＫは、捕獲抗体を必要とせず、負に帯電した表面に吸着できる。つまり、ＨＫＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡミクロプレート上の固定化捕獲抗体、又はポリエチレンイミンコーティングを必要とせずに行うことができる。より小さい粒子サイズのカルボキシレート改質ラテックス、例えば直径０.１μｍのＳＥＲＡＣＯＡＴ(登録商標)ＴＣ３Ｘ粒子を、ここにおいても９６ウェルミクロプレートのウェルをコートするために用いることができる。カルボキシレート改質ラテックスはＨＫと結合する表面負電荷を提供する。ミクロプレートは、バージンポリスチレン等の非帯電材料、又は負電荷を与えるように改質された改質ポリスチレン等を含むことができる。ミクロプレートが負に帯電した物質を含む場合、カルボキシレート改質ラテックスの表面コーティングは省くことができる。しかし、ミクロプレート表面がＨＫ捕獲のために十分な表面負電荷を取得するのを確実とするために、ミクロプレートがすでに負に帯電した材料を含む場合でも、そのプレートをラテックスでコーティングすることが好ましい。ＨＫＥＬＩＳＡのためには、ミクロプレートのウェルを、標準曲線を作成するための適当な対照標準希釈液で満たす。その他のウェルは、希釈した未知サンプルを含む。室温で１.５時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、上記のような、一次ディテクター抗体としてヒツジ抗ヒトＨＫ、二次ディテクター抗体としてのロバ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ、そして酵素基質と接触させる。ＥＬＩＳＡは、酵素加水分解物の光学密度の測定、及びその値と標準の値との比較によって完了し、未知サンプル中のＨＫ濃度が得られる。本発明のキニノーゲンアッセイ実施例は、キット形式で実施できる。ＨＫ、ＬＫ及びＴｏｔＫアッセイに適したそのようなキットは、固体支持体、好ましくは、ミクロプレート(ＥＬＩＳＡ用)又はミクロスフェア(ＰＣＦＩＡ用)の形の支持体を含む。ＨＫアッセイを行うためのミクロプレート又はミクロスフェアは、ＨＫ捕獲のための負に帯電した表面を有する。ＬＫアッセイのためのミクロプレート又はミクロスフェアは、ポリエチレンイのミンコーティング及びＬＫに特異的な捕獲抗体を担持する。ＴｏｔＫアッセイのためのミクロプレート又はミクロスフェアは、ポリエチレンイミンコーティング及びキニノーゲン重鎖に特異的な捕獲抗体を担持する。捕獲抗体は、ミクロプレート又はミクロスフェア上のポリエチレンイミンコーティングに共有結合されている。キニノーゲンアッセイキットは更にＨＫの重鎖及び軽鎖両方を認識するディテクター抗体の供給物（サプライ）を含む。こうしてディテクター抗体は、ＨＫ、ＬＫ又はＴｏｔＫアッセイの３つのキニノーゲンアッセイのいずれにおいても捕獲されたキニノーゲンを定量するのに用いることができる。ＨＫの重鎖及び軽鎖両方、及びＬＫの軽鎖を認識する、全ＨＫに対する適切なポリクローナル抗血清が市販されている(バインディングサイトリミテッド(The Binding Site,Ltd.) 、サンディエゴ、ＣＡ)。検出可能な標識はディテクター抗体が支持する。ＰＣＦＩＡでは、ディテクター抗体は、例えば抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを含む。或いは、検出可能な標識は、一次ディテクター抗体に結合する二次ディテクター抗体が支持する。そのため、二次ディテクター抗体(例えばヤギ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ)の供給物がＥＬＩＳＡ用キットに任意に含まれる。ＥＬＩＳＡキットは更にＨＲＰ等の酵素の基質の供給物、及びその酵素による基質加水分解を停止する試薬、例えばクエン酸又はＨ₂ＳＯ₄等を含むことができる。キニノーゲンアッセイキットは更に、患者サンプルを集め、保存し、分析するための適当な補助的試薬を任意に含む。これらの試薬類は、患者サンプルを安定化し、凝固を防ぎ、試験サンプル中のプロテイナーゼによるキニノーゲンの開裂を阻止するように処方されている。このような補助的試薬の一つは、例えば下の例２Ａに記載されるような、プロテイナーゼ阻害剤と抗凝固剤との混合物である。好適カクテルは、酸−シトレート−デキストロース(ＡＣＤ)を抗凝固剤として含むが、その他の適した抗凝固剤としては、ヘパリン又はシュウ酸を含む。患者の血液サンプルを、好ましくはサンプル中の凝固及びキニノーゲン開裂を防ぐのに十分な量のプロテイナーゼ阻害剤カクテルを含むプラスチック注射器に吸入する。十分量とは、吸入する血液サンプルの容量の約１／１０の量である。プロテイナーゼ阻害剤カクテルはここでは液体として記されているが、そのカクテルは乾燥粉末型に処方し、それを使用前に適当量の滅菌水で希釈して液体に戻せることが理解されよう。キニノーゲンアッセイキットのための他の補助的試薬としては、患者サンプルを希釈するための希釈緩衝液を含む。希釈緩衝液は、好適にはリン酸緩衝塩溶液をベースにし、ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ２０)、ウシ血清アルブミン等の安定化剤を含み、そして好ましくは、患者サンプル中のプロテイナーゼが、希釈緩衝液による希釈において活性化しないことを確実にするための少量のプロテイナーゼ阻害剤カクテルを含む。代表的希釈緩衝液(“ＰＢＳ−ＴＢＩ”)の調製は、下の例１Ｃに示される。希釈緩衝液は、ここでは液体として記されているが、その緩衝液を乾燥粉末型に処方し、それを使用前に適量の滅菌水で希釈して液体に戻せることが理解されよう。キニノーゲンアッセイキットのための別の補助試薬は、キニノーゲン捕獲後、ミクロプレート又はミクロスフェアから非結合物質を洗浄するための洗浄緩衝液を含む。代表的洗浄緩衝液は、０.５ＭＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム及び０.１％ポリソルベート２０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)からなる。洗浄緩衝液は、１０Ｘ濃縮物としてキットに好適に保存され、使用前にそれを滅菌水で１：１０に希釈する。或いは、洗浄緩衝液を乾燥状態で保存し、使用前に適量の滅菌水で希釈して液体に戻してもよい。キニノーゲンアッセイのための患者血液サンプル(約５ｍｌ)は、プロテイナーゼ阻害剤カクテル(０.５ｍｌ)を含むプラスチック注射器に吸入することができる。その血液を直ちに遠心分離し、細胞を除去しなければならない。細胞フリー血漿は−７０℃で凍結して保存し得る。下記の非限定的な例は本発明のアッセイを説明するためのものである。例１ポリエチレンイミン改質カルボキシ改質ラテックスミクロスフェアの調製スチレン及びアクリル酸のコポリマーから形成される０．８μｍのカルボキシ改質ラテックスミクロスフェア(ＣＭＬ、セラジンインコーポレイテッド)(１００ｍｌ中１０％固体)の１０ｇを、ガラス容器中の１％ポリエチレンイミン(シグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical Co.))６０ｍｌに一定撹拌下で加えた。次に、水に溶解した１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)塩酸塩１６８ｍｇを加えた。水にて容量を２００ｍｌにし、混合物を２時間撹拌した。ミクロスフェアを遠心分離し、水で２回洗浄した。改質された粒子を４℃で０.０２％アジ化ナトリウム(NaN₃)中に保存した。例２低分子量キニノーゲン抗体の、ポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェアへの結合下記のように、ＬＫ軽鎖に対するモノクローナル抗体ＬＫＬ−１を捕獲抗体として用いて、ＬＫを直接測定するためのミクロスフェアを調製した。Ａ．ＬＫＬ−１モノクローナル抗体の精製モノクローナル抗体ＬＫＬ−１(カウフマンら、J.Biol.Chem.２６８巻：９０７９−９０９１ページ、１９９３)を腹水から、ＩＭＭＵＮＯＰＵＲＥ(登録商標 )タンパク質Ａ／Ｇカラム(ピアスケミカルカンパニー、ロックフォード、ＩＬ) で、そのキットに含まれている緩衝液及び使用指示書を用いて精製した。ＬＫＬ −１はヒトＬＫ軽鎖に特異的なマウス抗体である。精製後、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ３０コンセントレーター(アミコンコーポレーション(Amicon Corp.)、デンバー、ＭＡ)にて、抗体を濃縮し、透析した。緩衝液を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）＋０.５ｍＭのＥＤＴＡに交換した。精製抗体の一部(１.５ｍｌ) づつを必要になるまで凍結した。アジ化ナトリウムは、その後の共有結合を妨害するため、タンパク質を保存する緩衝液からは、いかなる微量のアジ化ナトリウム(NaN₃)も完全に除去する必要があった。Ｂ．プロテイナーゼ阻害剤カクテルの調製１００ｍＭベンズアミジン、４００μｇ／ｍｌのヘキサジメトリンブロミド、２ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２６３μＭロイペプチン(全てシグマケミカルカンパニーより入手)、１ｍＭのＰｈｅ−Ｐｈｅ− Ａｒｇ−クロロメチルケトン(ＰＰＡＣＫＩＩ)及び２０ｍＭの４−(２−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオリド．ＨＣｌ(ＡＥＢＳＦ)(両方共、カルビオケム(Calbiochem)(ラジョーラ、ＣＡ)より入手)を抗凝固剤である酸−シトレート−デキストロース(ＡＣＤ)に溶解して採血用のプロテイナーゼ阻害剤カクテルを調製した。Ｃ．ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡ及びＰＢＳ−ＴＢＩの調製Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝塩溶液(“ＰＢＳ−Ｔｗｅｅn”)は、１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０.０２％アジ化ナトリウム(NaN₃)及び０.１％Ｔｗｅｅｎ２０(シグマケミカルカンパニー)からなる。“ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡ”は、１０％ウシ血清アルブミン５ｍｌをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎの４５ｍｌに加えることによって調製した。希釈剤“ＰＢＳ− ＴＢＩ”は、１％ＢＳＡと１％プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎからなるように調製した。Ｄ．ＬＫＬ−１モノクローナル抗体の、ポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェアへの結合マウス抗ヒトＬＫモノクローナル抗体ＬＫＬ−１の、ポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェアへの共有結合を次のように行った。５０ｍｌの円錐スクリューキャップつきポリプロピレン遠心管に、３２.６ｍｌのＨ₂Ｏ、２ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）＋５ｍＭＥＤＴＡ、及び例１に従って調製された８％(ｗ／ｖｏｌ)ポリエチレンイミン改質ミクロスフェア２ｍｌを入れた。１.２ｍｌのモノクローナル抗体ＬＫＬ−１(１０ｍＭリン酸ナトリウム (ｐＨ６.０)＋０.５ｍＭＥＤＴＡ中、２.７１ｍｇ／ｍｌ)を加える前に、内容物を簡単に混合した。管をニューテイター(nutator:振動器)に３０分間置いた。粒子が大きい凝集物を形成し始めた場合、その混合物を数回超音波粉砕した。次に１ＭＥＤＣ塩酸塩２００μｌを加え、直ちに管を閉じて混合し、一晩ニューテイター上に置いた。最終抗体濃度は約８５μｇ／ｍｌであった。翌日、管を遠心分離し、上澄液を除去した。上記のリン酸緩衝液中１０％ウシ血清アルブミン２０ｍｌを、ミクロスフェアに加えて未反応部位をブロックするとともに、粒子を安定化した。管を激しく混合して、コートされた粒子を完全に再懸濁させ、ニューテイターに３０分間置いた。次に、ミクロスフェアを遠心分離し、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０(シグマケミカルカンパニー、セントルイス、ＭＯ)を含むリン酸緩衝塩溶液で２回洗浄した。コートされたミクロスフェアを０.０２％アジ化ナトリウム(NaN₃)を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡで最終容量６０ｍｌにし、４℃で保存した。コートされたミクロスフェアは、少なくとも１２カ月は安定であった。そのミクロスフェア６０ｍｌは、３,０００回のＬＫ測定を行うのに十分である。Ｅ．ＬＫＬ−１抗体のポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェアに対する結合効率の測定抗体をポリエチレンイミン改質ミクロスフェアに結合させた後、上澄液及びミクロスフェア両方について、マウスＩｇＧをＰＣＦＩＡによって分析し(スコット及びコールマン、J.Lab.Clin.Med ．１１９巻：７７−８６ページ、１９９２) 、ＬＫＬ−１のミクロスフェアへの結合効率を決定した。マウスＩｇＧでコートされたミクロスフェアを用いて、上澄液のＩｇＧを捕獲した。フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)(シグマケミカルカンパニー)で標識された抗マウスＩｇＧＦ(ａｂ’)₂をディテクターとして用いた。標準は、正常マウスＩｇＧ（ピアスケミカルカンパニー）から調製された。ＬＫＬ−１含有ミクロスフェアを１：３０に希釈し、それらをアッセイプレートに加えた。結合効率は、調製した粒子の各バッチで同様であった。最終的ミクロスフェア懸濁液中のＬＫＬ− １の濃度は、１２.１２±１.４９μｇ／ｍｌミクロスフェア懸濁液、であった。Ｆ．低分子量キニノーゲンに対するミクロスフェアの結合能力ＭＡｂＬＫＬ−１の２４３ｎｇを含むミクロスフェア懸濁液２０μｌは、少なくとも４２ｎｇのＬＫをその軽鎖を介して結合することができ、直線性標準曲線を生成することができた(図１Ｂ)。標準曲線の頂上では、抗体の２０％が抗原 (ＬＫ)によって占められた。サンプル中の抗原に対してミクロスフェア上の抗体が５倍モル(molar)過剰にあれば、全抗原が固体マトリクスに結合することが保証される。例３総キニノーゲン抗体の、ポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェアへの結合ＨＫ及びＬＫを同時に直接測定するためのミクロスフェアを、ＨＫ及びＬＫの共通の重鎖に対するモノクローナル抗体(２Ｂ５)を用いて、次のように調製した。Ａ．２Ｂ５モノクローナル抗体の精製とミクロスフェアへの結合ハイブリドーマＡＴＣＣ＃ＨＢ−８９６３から得られたモノクローナル抗体２Ｂ５(米国特許第４,９０８,４３１号)は、腹水から例２Ａの方法に従って精製した。ＭＡｂ２Ｂ５は、ヒトＨＫ及びＬＫの共通の重鎖に対するマウスモノクローナル抗体である。ＭＡｂ２Ｂ５を例１に従って調製されたポリエチレンイミン改質ミクロスフェアに例２Ｄと同様にして共有結合させた。但し結合後の最終容量は４０ｍｌにした。この抗体のミクロスフェアへの結合効率を、例２Ｅのようにして測定した。ＭＡｂ２Ｂ５の濃度は７.９９±３.６９(μｇ／ｍｌ)であった。これらのミクロスフェア４０ｍｌで、約２,０００回の総キニノーゲン測定を行うことができた。Ｂ．総キニノーゲンに対するミクロスフェアの結合能力ＭＡｂ２Ｂ５の１６０ｎｇを含むミクロスフェア懸濁液２０μｌは、少なくとも５８ｎｇのＬＫ及びＨＫをそれらの重鎖によって結合することができ、直線性標準曲線を得ることができた(図１Ｃ)。標準曲線の頂上では、抗体の３７％が抗原(ＬＫ又はＨＫ)によって占められた。サンプル中の抗原に対してミクロスフェア上の抗体が２.７５倍モル(molar)過剰にあれば、全抗原が固体マトリクスに結合することが保証される。例４ポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェアを用いる正常血漿のキニノーゲンの粒子濃度蛍光イムノアッセイＡ．ＰＣＦＩＡのための対照血漿の調製２０名の各健康ドナーから血液(４.５ｍｌ)を、プロテイナーゼ阻害剤カクテル０.５ｍｌを含むプラスチック注射器に直接集めた。血液を直ちに混合し、２０℃、２０００×ｇで５分間遠心分離した。赤血球を除去した後、血漿を１２，０００×ｇで１０分間再遠心分離した。細胞フリー血漿のアリコート群を−７０ ℃で凍結した。各ドナーからの血漿１００μｌをプールし、対照血漿として使用した。対照血漿をＰＢＳ−ＴＢＩで１：５０に希釈した。ＰＢＳ−ＴＢＩを用いてその血漿の連続希釈物を調製した。市販の基準血漿は開裂し、そのため標準としての使用に適さないことが判明したので、対照血漿は阻害剤カクテルに採取した血液から作ることが必須であった。Ｂ．ＰＣＦＩＡのためのトレーサー抗血清の調製ＦＩＴＣで標識された、全ＨＫに対するポリクローナル抗体(ＨＫの重鎖及び軽鎖両方とＬＫの重鎖とを認識する)をバインディングサイトリミテッド（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。標識化されていない同じ抗体も用い、ＦＩＴＣ標識化された抗体(１０ｍｇ／ｍｌ)の２０μｌ、標識化されていない抗体(１４ｍｇ／ｍｌ)の１００μｌ、及びＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡの７８２０μｌをガラス製バイアルに加えることで、ＦＩＴＣ標識化された抗体と一緒にした。そのトレーサー抗血清は４℃で２週間まで保存することができた。Ｃ．３８名の正常ドナーの血漿中のＬＫの直接ＰＣＦＩＡ測定ＰＣＦＩＡは０.４５μｍ膜を備えた９６ウェルアッセイプレート(イデックスコーポレーション)中で、以下のようにして３回行われた。例２に従って調製されたＬＫＬ−１コートされたミクロスフェア２０μｌを各ウェルに入れ、ＰＢＳ −ＴＢＩ中に希釈した対照血漿(１：５０から１：３２００までの範囲)の１０μ ｌ、又は３８名の正常ドナーからの未知の血漿サンプルをＰＢＳ−ＴＢＩで１：１００に希釈したもの１０μｌを加えた。９３μｇ／ｍｌのＬＫを含む正常のプールした血漿を用いて、１：５０に希釈された対照血漿では１８６μｇ／ｍｌの値を選択した。ＰＢＳ−ＴＢＩをブランクとして用いた。２０分後、トレーサー抗血清２０μｌを加え、その混合物を更に２０分間インキュベートした。そのプレートを蛍光濃度分析器(ＦＣＡ)(イデックスコーポレーション)に置き、そこでウェルを排気した(２０ｍｍＨｇ)。ミクロスフェアを真空下で、０.５ＭＮａＣｌ及び０.０２％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７)(洗浄緩衝液)で２回洗浄した。ＦＣＡでプレートを読み、Windows for Workgroups ３.１１又はWindows ９５ソフトウェアを備えたＩＢＭ互換３８６ＤＸ−４０コンピューター(マイクロソフトコーポレーション(Microsoft Corp.)、レドモンド、ＷＡ)を用い、Winplateソフトウェア(ver.1.1)(イデックスコーポレーション)によりデータを分析した。曲線をWinplate(ver.1.1)ソフトウェアによってフィットさせ、３回又は２回の測定の平均値を標準曲線から自動的に計算した。Si gma Plot for Windows(ver.1.1、2.0及び3.0)、並びにSigma Stat for Windows( ver.1.0)(ジャンデルコーポレーション(Jandel Corporation))を用いてデータを分析し、グラフ化した。正常のプールした血漿で生成したＬＫ標準曲線は、図１Ｂのようである。ＰＣＦＩＡではＬＫは、未知サンプル中で５０から１９００ｎｇ／ｍｌの範囲が検出できた。このアッセイはこの範囲では直線性であった。３８名の正常ドナーのＬＫ濃度は、６１から１５６μｇ／ｍｌの範囲に亙り、平均は９３μｇ／ｍｌであった(図２Ｂ)。Ｄ．３８名の正常ドナーの血漿中の総キニノーゲン(ＨＫ及びＬＫ重鎖)の直接ＰＣＦＩＡ測定ＨＫ及びＬＫが共通の重鎖を共有し、ＭＡｂ２Ｂ５は重鎖に向かうため(シュマイエル(Schmaier)ら、J.Biol.Chem ．２６２巻：１４０５−１４１１ページ、１９８７)、捕獲抗体として２Ｂ５を用いると、ＨＫ及びＬＫ両方(又は総血漿キニノーゲン)の同時測定が行われる。簡単にするために、この測定を“ＴｏｔＫ ”(総血漿キニノーゲンに対して)と呼ぶ。ＴｏｔＫ−ＰＣＦＩＡをＬＫ−ＰＣＦＩＡに対して上記したように行った。但しＬＫ−ＰＣＦＩＡにて用いたＬＫＬ− １ＭＡｂコートされたミクロスフェアの代わりに、２Ｂ５ＭＡｂコートされたミクロスフェアの２０μｌ(例３)を用いた。１７３μｇ／ｍｌのＴｏｔＫを含む正常血漿のプールを標準として用いた。１：５０に希釈された対照血漿では３４６μｇ／ｍｌの値を選択した。正常のプールした血漿にて形成されたＴｏｔＫの標準曲線は、図１Ｃのように表される。ＴｏｔＫは、未知サンプル中でＰＣＦＩＡによって、１００から３５００ｎｇ／ｍｌの間で検出できた。アッセイはこの範囲では直線性であった。３８名の正常ドナーのＴｏｔＫは、１２９から２７４μｇ／ｍｌまでの範囲に亙り、平均は１７６μｇ／ｍｌであった(図２Ｃ)。Ｅ．３８名の正常ドナーの血漿中のＨＫの直接ＰＣＦＩＡ測定ＨＫ−ＰＣＦＩＡ(図１Ａ)を、既報(スコット及びコールマン、J.Lab.Clin.Me d. １１９巻、７７−８６ページ、１９９２)を下記のように修飾して行った。ＨＫは、捕獲抗体コーティングがなくても、カルボキシレート改質ラテックスに付着する。ＬＫは、ＬＫに特異的な抗体コーティングがなければそのようなミクロスフェアには付着しない。そのため、ＨＫ−ＰＣＦＩＡアッセイのためには、スコット及びコールマン(上述)のＣ１１Ｃ１ＭＡｂコートされたミクロスフェアの代わりに、コートされていないカルボキシレート改質ラテックスミクロスフェア(ＣＭＬ、セラジンインコーポレイテッド)を固体支持体として用い、ＨＫを捕獲した。ＨＫ−ＰＣＦＩＡをコートされていないＣＭＬミクロスフェア(０.２５％)の２０μｌ、及び希釈された対照血漿又はドナー血漿の２０μｌを用いて行った。８０μｇ／ｍｌのＨＫを含む正常のプールした血漿を用い、１：５０に希釈された対照血漿のためには１６０μｇ／ｍｌの値を選択した。正常のプールした血漿にて作成したＨＫの標準曲線は、図１Ａのように表わされる。ＨＫは、未知サンプル中で、ＰＣＦＩＡによって５０から１６００ｎｇ／ｍｌの間で検出できた。アッセイはこの範囲では直線性であった。３８名の正常ドナーにおけるＨＫは、５９から１１４μｇ／ｍｌの範囲に亙り、平均は８２μｇ／ｍｌであった(図２Ａ)。これらの値はこれまでに報告されたＨＫレベル(プラウド(Proud)ら、J.Lab .Clin.Med. ９５巻：５６３−５７４ページ、１９８０；シヴアネン(Syvanen)ら、FEBS Letters １２９巻：２４１−２４５ページ、１９８１；バウマ(Bauma)ら、J.Lab.Clin.Med.９６巻：６９３−７０９ページ、１９８０；カビリオウーナビアス(Kerbiriou-Nabias)ら、Br.J.Haematol.５６巻：２７３−２８６ページ、１９８４)に類似する。図２Ａからのデータ(ＨＫ)を図２Ｂからのデータ(ＬＫ) に対してプロットすると、ｒ＝０.８４、ｐ＜０.０００１の相関性が認められた。２つの値が９５％信頼限界の外にあった(図３)。ＬＫ＋ＨＫの値をＴｏｔＫの値に対してプロットすると(図４)、優れた相関関係(ｒ＝０.９８)が認められ、これはＨＫ及びＬＫを個々に測定した濃度の合計が、非区別アッセイによって表される総キニノーゲン濃度(ＴｏｔＫ)に等しかったことを示す。この結果は、全てのキニノーゲン類のアッセイが有効であり、正常キニノーゲンは大部分が無損傷であることを示す。Ｆ．キニノーゲン測定の変動係数ＨＫ、ＬＫ、及びＴｏｔＫのためのアッセイ間変動係数は(C.V.)、１単位／ｍｌキニノーゲンを含むサンプルでは(ここで１単位は正常のプールした血漿１ｍｌ中の量と定義する)、それぞれ３.３４、５.４５、及び３.４７％で、０.１単位／ｍｌを含むサンプルでは、それぞれ５.２３、６.５９、及び７.４８％であった。アッセイ内変動係数は、１単位／ｍｌキニノーゲンを含むサンプルではＨＫ、ＬＫ及びＴｏｔＫでそれぞれ４.７９、５.４９、及び４.１８％で、０.７単位／ｍｌを含むサンプルではそれぞれ３.７６、１.６９、及び３.２３％であった。Ｇ．開裂キニノーゲン指数(ＣＫＩ)の測定開裂キニノーゲン指数(ＣＫＩ)は、ＨＫの測定値を測定総キニノーゲン値と測定ＬＫ値との差で割った値：ＨＫ／(ＴｏｔＫ−ＬＫ)として計算した。ＨＫ及びＬＫの重鎖はドメイン１と２の間、又は２と３の間で開裂され得ることが知られている。しかしこれらの開裂は、抗原性には影響を与えない。従って、重鎖の測定は、総キニノーゲン濃度の測定のための“内部標準”となり得る。しかし、ＨＫが、無損傷のその片方よりも強い免疫活性分子であるＨＫａに活性化された場合、ＣＫＩは１.０より大きくなり得る。ＨＫ軽鎖の表面結合領域が開裂され、破壊された場合、及び／又はＬＫのＬＫＬ−１エピトープが開裂された場合、ＣＫＩは１.０よりも小さくなり得る。上記アッセイでは、１.０のＣＫＩが算出され、従ってキニノーゲン類はアッセイ操作中無損傷のままであったことが確認される。Ｈ．比キニノーゲンレベルの測定全てのドナーにおいて、総タンパク質をクーマシー(Coomassie)プラスタンパク質試薬(ピアスケミカルカンパニー)で測定し、“比キニノーゲンレベル”(ＨＫ、ＬＫ、又はＴｏｔＫを総タンパク質で割った値)を計算した。比ＨＫは１.１１から２.１９μｇ／ｍｇ総タンパク質の範囲に亙り、平均値は１.４６μｇ／ｍｇであった。比ＬＫは１.１２から３.０６μｇ／ｍｇの範囲に亙り、平均値は１ .６４μｇ／ｍｇであった。比ＴｏｔＫは２.２３から５.３５μｇ／ｍｇの範囲に亙り、平均値は３.１２μｇ／ｍｇであった(表１)。例５低分子量及び総キニノーゲンの粒子濃度蛍光イムノアッセイ：ポリエチレンイミン改質対アミノ改質ミクロスフェア例４のＬＫ及びＴｏｔＫ濃度測定法を行った。但し本発明のポリエチレンイミン改質ラテックスミクロスフェアの代わりに、２つの供給元から市販されているアミノ改質ラテックスミクロスフェアを用いてＭＡｂコートされたミクロスフェアを調製した：ＳＰＨＥＲＯＴＥＣＡＰＳ及びＳＰＨＥＲＯＴＥＣＤＭＳ(スフェロテックインコーポレイテッド(Spherotech,Inc.)、リバティーヴィル、ＩＬ)；及びＢＡＮＧＳＡＰＳ(バングスラボラトリーズインコーポレイテッド(Bangs Laboratories,Inc.)、カーメル、ＩＮ)。例４のように、ミクロスフェアを、ＬＫ軽鎖に特異的なＭＡｂＬＫＬ−１でコートした。その他のミクロスフェアは、ＨＫ及びＬＫの共通重鎖に向かうＭＡｂ２Ｂ５でコートした。本発明によるカルボキシレート改質ラテックスミクロスフェアのポリエチレンイミン改質によって生成した本発明のポリエチレンイミン改質ミクロスフェア(ＰＥＩ −ＭＬ)もまた、ＬＫＬ−１又は２Ｂ５でコートし、比較のために用いた。標準曲線を、例４に記載のように、正常のプールしたヒト血漿で作成した。ＬＫ(図５Ａ)及びＴｏｔＫ(図６Ａ)の両方の標準曲線は、本発明のＰＥＩ−ＭＬミクロスフェアでは直線性で、バックグラウンドはほとんどなく、これはフルオレセインで標識化された(fuluoresceinated)抗体トレーサーの非特異的結合がないことを示す。ＳＰＨＥＲＯＴＥＣＡＰＳミクロスフェアは、ＴｏｔＫでは直線性アッセイをもたらしたが(図６Ｂ)、結合力はＰＥＩ−ＭＬの結合力(図６Ａ)の半分より小さかった。しかし、ＬＫアッセイにおいて、ＳＰＨＥＲＯＴＥＣＡＰＳミクロスフェアは、高いバックグラウンド及びシグナルのノイズに対する比が２ .０未満（＜２．０）を示し、ＬＫアッセイにおけるシグナルの大部分がＨＫ及び／又はディテクター抗体のミクロスフェアへの非特異的吸着によるものであることを示す(図５Ｂ)。ＳＰＨＥＲＯＴＥＣＤＭＳミクロスフェアは、ＬＫ及びＴｏｔＫアッセイ両方において(図５Ｃ、６Ｃ)非常に高いバックグラウンドを生じるため、全く適さなかった。この結果は、このトレーサーがミクロスフェアに非特異的に吸着することを示唆する。ＢＡＮＧＳＡＰＳミクロスフェアは、ＬＫ(図５Ｄ)及びＴｏｔＫ(図６Ｄ)アッセイにおいて高いバックグラウンドを示し、シグナルのノイズに対する比は４.０未満であった。ＢＡＮＧＳＡＰＳ曲線は両アッセイで同様であり、トレーサーの非特異的結合に加えて、ＨＫ及びＬＫの両方が共に結合したことを示唆する。ＨＫ及び／又はトレーサーのミクロスフェアへの非特異的吸着を確認するために、同じミクロスフェアを高濃度の精製ＨＫ(５２７μｇ／ｍｇ)と共にインキュベートし、ブランク値(ゼロＨＫ)を各々から差し引いた。ＰＥＩ-ＭＬは、ＨＫの２％未満に結合した。ＳＰＨＥＲＯＴＥＣＡＰＳ及びＳＰＨＥＲＯＴＥＣＤＭＳは両方共、ＨＫ及び／又はトレーサーに結合した。精製ＨＫの場合の値は、高いトレーサーバックグラウンドを差し引いた後でさえ、それぞれの標準曲線の最高値より高かった。ＢＡＮＧＳＡＰＳは、かなりの量のトレーサーに加えて、ＨＫの３０％に結合した。試験した４種類のミクロスフェアのなかで、本発明のＰＥＩ−ＭＬミクロスフェアのみが無視し得るバックグラウンドを有し、直線的アッセイをもたらし、無視し得る量のＨＫに結合した。例６歯肉溝液中の低分子量キニノーゲンの測定Ａ．歯周病患者の歯肉溝液の採取テンプル大学歯科医学部((Temple University School Of Dental Medicine)フィラデルフィア、Ｐ)で通常の治療を受けている患者から、文書によるインフォームドコンセントを得た後、歯肉溝液(１０μｌ)を採取した。液は、活性歯周病患者、及び歯周病を処置されて炎症がもはや見られない患者から、ＰＥＲＩＯＴＲＯＮＳＴＲＩＰ(プロフロー(Pro Flow)、アミチヴィル、ＮＹ)で採取した。直ちにＰＥＲＩＯＴＲＯＮＳＴＲＩＰを、１０％プロテアーゼ阻害剤カクテル５０μｌを含む微小遠心分離管に入れ、−７０℃で凍結した。ＰＣＦＩＡを行うためにこれらのサンプルを１：２に希釈し、最終希釈は１：１２となった。Ｂ．歯肉溝液中のＨＫ及びＬＫの検出８名の活性歯周病患者からの歯肉溝液を、ＨＫ及びＬＫについて測定した。３つのサンプル中にはＨＫ及びＬＫを見いだしたが、その他の５サンプル中には検出可能なキニノーゲンは存在しなかった(表２)。２つのサンプル中ではＨＫ及びＬＫは少し開裂していると思われ、１つのサンプルではＨＫ及びＬＫは広範に開裂していた(ＣＫＩ＝０.５９)(表２)。治療が終了し、炎症が認められなかった歯周病患者６名は、検出可能なキニノーゲンを有さなかった(データは示さず)。例７総キニノーゲンのＥＬＩＳＡＡ．ポリエチレンイミン改質ミクロプレートの調製エタノール中の直径０.１μカルボキシ改質ラテックス粒子(ＳＥＲＡＣＯＡＴ (登録商標)ＴＣ３、セラジンインコーポレイテッド)の１ｗｔ％溶液を、バージンポリスチレンミクロプレートの各ウェルに加え、完全に充填した(或いは、９６−ウェル組織培養プレート、例えばＭＩＣＲＯＴＥＳＴ III(ファルコンプラスチックス(Falcon Plastics)をバージンポリスチレンミクロプレートの代わりに用いてもよい。)。１０分後、ＴＣ３の非吸着粒子を廃棄し、プレートを脱イオン水ですすいだ。プレートをペーパータオル上に逆さにし、温気オーヴンにて３７℃で３０分間乾燥した。ポリエチレンイミン(５０％、シグマケミカルカンパニー)を脱イオン水で１０％(ｖ／ｖ)の濃度まで希釈し、表３に示される量の各成分と一緒にした：諸成分を合一し、全てのウェルを上記溶液で完全に満たした。２時間後、プレートを脱イオン水で１０回洗浄し、３７℃で３０分間乾燥した。Ｂ．総キニノーゲンモノクローナル抗体の付着２００μｌのモノクローナル抗体２Ｂ５(５μｇ／ウェルの濃度)を、下記の表４の更なる成分の各指示量と共に９６ウェルの各々に入れた：抗体を２時間から一晩までの任意の時間インキュベートした。結合時間が短いか長いかによる差は認められなかった。Ｃ．ＥＬＩＳＡの手順正常のプールしたヒト血漿をＰＢＳ−ＴＢＩで１：１０００に希釈した。標準曲線を作成するために、ＰＢＳ−ＴＢＩでの連続希釈物を作成した。ＰＢＳ−ＴＢＩをブランクとして用いた。測定すべき未知サンプルをＰＢＳ−ＴＢＩで１：２０００に希釈した。全測定は３回づつ行われた。標準及びサンプル(各々２００μｌづつ)をＭＡＢ２Ｂ５を結合したウェルに入れた。室温で１.５時間インキュベートした後、プレートを空にし、０.５ＭＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム及び０.１％ポリソルベート２０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７)からなる洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳ−ＢＳＡで１：１５００に希釈した抗ヒトＨＫ(バインディングサイト)の２００μｌを各ウェルに入れた。１. ５時間後、プレートを上記のように洗浄した。抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ(バインディングサイト)を１：２００に希釈し、２００μlを各ウェルに加えた。室温で２時間インキュベートした後、プレートを上記のように洗浄した。プレートを正確なｐＨ及びイオン強度に平衡化するために、プレートを基質とともに使用したものと同じ緩衝液で１回すすいだ。３，３'，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩基質(ピアスケミカルカンパニー)を５秒間隔でそのウェル群に加え、室温でインキュベートした。最高標準の光学密度が０.６から０.９になったとき、停止溶液(１ＭＨ₂ＳＯ₄)を加えて基質の加水分解を停止させた。ＢＩＯＴＥＫＥＬＩＳＡリーダーにて４５０ｎｍでプレートを読んだ。Ｄ．結果７つの未知サンプルの総キニノーゲンを上記ＥＬＩＳＡの手順に従って試験した。これらのサンプルは５つの正常血漿サンプル、総キニノーゲン欠損（ウィリアムズ(Williams)）血漿、及びフィッツジェラルドトライト(Fitzgerald Trait) 血漿からなる。フィッツジェラルド血漿は、ＨＫを痕跡量のみ含むが、ＬＫは正常レベルの約５０％含む。同じ７サンプルを、例４ＤのＰＣＦＩＡＴｏｔＫ法に従って試験した。ＴｏｔＫに対するＰＣＦＩＡ及びＥＬＩＳＡの結果は図７にプロットした。０.９８のｒ値が得られた。この値は、ＴｏｔＫの測定においてＰＣＦＩＡとＥＬＩＳＡ分析との間に優れた相関性があることを示す。ウィリアムズ血漿はこのアッセイでは反応しなかった。例８低分子量キニノーゲンのＥＬＩＳＡＡ．ＬＫモノクローナル抗体のミクロプレートへの付着２００μｌのモノクローナル抗体ＬＫＬ−１（５μｇ／ウェルの濃度）を例７Ａの方法に従って調製したミクロプレートの９６ウェルの各々に入れた。抗体溶液の調製に用いた処方は表５に示される：抗体を２時間から一晩までの任意の時間インキュベートさせた。結合時間が短いか長いかによる差は認められなかった。Ｂ．ＥＬＩＳＡの手順及び結果例７Ｃの方法と同様のＥＬＩＳＡ法を行い、例７のＴｏｔＫ分析に用いた７サンプルのＬＫ含量を測定した。上記調製したＬＫＬ−１ＭＡＢコートされたプレートを、例７の２Ｂ５ＭＡＢコートされたプレートの代わりに用いた。同じ７サンプル(即ち５つの正常サンプル、ウィリアムズ血漿サンプル及びフィッツジェラルド血漿サンプル)を例４ＣのＬＫＰＣＦＩＡを用いて試験した。ＬＫに対するＰＣＦＩＡ及びＥＬＩＳＡの結果を図８にプロットする。０.９８のｒ値が得られた。この値は、ＬＫ測定においてＰＣＦＩＡとＥＬＩＳＡとの間に優れた相関性があることを示す。ウィリアムズ血漿はこのアッセイでは反応しなかった。例９総キニノーゲンのＥＬＩＳＡ、及び支持体表面の改質の比較Ａ．ポリエチレンイミン改質ミクロプレートの調製９６−ウェルバージンポリスチレンプレート(８×１２ウェル列、アッセイプレート、コーニング２５８８０−９６)を次のように処理した。１／４のウェル( ３×８＝２４ウェル)を１％ポリエチレンイミンで満たした。第２の１／４のウェル(３×８＝２４ウェル)には、０.５２ｍＭＥＤＣ．ＨＣｌを加えた１％ポリエチレンイミンを満たした。第三の１／４のウェル(３×８＝２４ウェル)には、エタノール中の１％ＳＥＲＡＣＯＡＴ(登録商標)ＴＣ３カルボキシ改質ラテックス粒子を加えた後、１％ポリエチレンイミンを加えた。第四の１／４のウェル( ３×８＝２４ウェル)には、エタノール中１％ＳＥＲＡＣＯＡＴ(登録商標)ＴＣ３カルボキシ改質ラテックス粒子を加えた後、０.５２ｍＭＥＤＣ．ＨＣｌを加えた１％ポリエチレンイミンを入れた。こうして、４つの１／４づつのウェルは (１)ポリエチレンイミンの、受動的に吸着されたコーティングと、(２)ＥＤＣ．ＨＣｌの処理によってプレート表面に共有結合したポリエチレンイミンのコーティングと、(３)ポリエチレンイミンのコーティングが受動的に吸着されたカルボキシ改質ラテックス粒子のコーティング、又は(４)ポリエチレンイミンコーティングがＥＤＣ．ＨＣｌ処理によって共有結合されたカルボキシ改質ラテックス粒子のコーティングを含んでいた。このように処理したプレートを２時間放置した。過剰の液体を外に出し、このようにコートされたウェルを脱イオン水で１０回洗浄した。次にプレートをペーパータオル上に逆さにし、３７℃気流オーヴン中に入れて残留液体を全て蒸発させた。Ｂ．総キニノーゲンモノクローナル抗体の付着例７Ｂの方法を行い、総キニノーゲンモノクローナル抗体２Ｂ５をミクロプレートの全てのウェルに付着させた。Ｃ．ＥＬＩＳＡの手順例７Ｃの方法を行い、ＰＢＳ−ＴＢＩで希釈した正常のプールしたヒト血漿の連続希釈物の添加によって、各１／４に対するプレートの総キニノーゲン標準曲線を作成した。ＰＢＳ−ＴＢＩをブランクとして用いた。全ての測定は３回づつ行われた。得られた標準曲線を図９に示す：ポリエチレンイミンで受動的にコートされたウェル(黒丸)；ポリエチレンイミンがＥＤＣ．ＨＣｌにより共有結合しているウェル(白丸)；ポリエチレンイミンが受動的に吸着しているカルボキシ改質ラテックス粒子のコーティングを含むウェル(黒三角)；及びポリエチレンイミンがＥＤＣ．ＨＣｌによって共有結合しているカルボキシ改質ラテックス粒子を含むウェル(白三角)。結果は、元は中性であるポリスチレン表面を、負に帯電されたカルボキシ改質ラテックス粒子のコーティングにて帯電させると、ポリエチレンイミンの結合が増加し、同様に更に多くの抗体をウェルに結合させることを示す。カルボキシレート改質ラテックスの負に帯電した層と、ポリエチレンイミンコーティングを含む正に帯電した層とがＥＤＣ等の共有結合剤によって共有結合する場合、抗体結合の増加が最も顕著である。例１０カルボキシ改質ラテックスでコートしたミクロプレートを用いる高分子量キニノーゲンのＥＬＩＳＡＡ．ポリエチレンイミン改質ミクロプレートの調製エタノール中、直径０.１μのカルボキシ改質ラテックス粒子(ＳＥＲＡＣＯＡＴ(登録商標)ＴＣ３、セラジンインコーポレイテッド)の１ｗｔ％溶液を、ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ III９６−ウェル組織培養プレート(ファルコンプラスチックス)の各ウェルに加え、完全に満たした。１０分後、ＴＣ３の非吸着粒子を廃棄し、プレートを脱イオン水ですすいだ。プレートをペーパータオル上に逆さにし、温気オーヴン中にて３7℃で３０分間乾燥した。Ｂ．ＥＬＩＳＡの手順正常のプールしたヒト血漿をＰＢＳ−ＴＢＩで１：１０００に希釈した。標準曲線を作成するために、ＰＢＳ−ＴＢＩにて連続希釈物(１：２)を作成した。ＰＢＳ−ＴＢＩをブランクとして用いた。測定すべき未知サンプル(ウィリアムズ血漿及フィッツジェラルド血漿)をＰＢＳ−ＴＢＩで１：２０００に希釈した。標準及びサンプル(各々２００μｌづつ)をミクロプレートウェル群中に入れた。室温で１.５時間インキュベートした後、プレートを空にし、０.５ＭＮａＣｌ、０.０２％アジ化ナトリウム及び０.１％ポリソルベート２０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７)からなる洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳ−ＢＳＡで１：１５００に希釈したヒツジ抗ヒトＨＫ(バインディングサイト)の２００μｌを各ウェルに入れた。１.５時間後、プレートを上記のように洗浄した。ロバ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ(バインディングサイト)を１：２００に希釈し、２００μ ｌを各ウェルに加えた。室温で１.５時間インキュベートした後、プレートを上記のように洗浄した。プレートを正確なｐＨ及びイオン強度に平衡化するために、プレートを基質とともに用いたものと同じ緩衝液(２００μl)で１回すすいだ。３，３'，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩基質(ピアスケミカルカンパニー)を５秒間隔でそのウェル群に加え、室温でインキュベートした。最高標準の光学密度が０.６から０.９になったとき、停止溶液(１ＭＨ₂ＳＯ₄)１００μｌを加えて基質の加水分解を停止させた。ＢＩＯＴＥＫＥＬＩＳＡリーダーにて４５０ｎｍでプレートを読んだ。Ｃ．結果正常のプールした血漿の連続希釈からのデータを図１１にプロットする。これは血漿中のＨＫ濃度の標準曲線を形成する。ウィリアムズ血漿。標準曲線を用いてウィリアムズ血漿及びフィッツジェラルド血漿サンプルのＨＫ値を測定した。ウィリアムズ血漿のＨＫの値はゼロであり、フィッツジェラルド血漿ＨＫの値は約７μｇ／ｍｌであった。これらの値はＰＣＦＩＡによって測定したウィリアムズ及びフィッツジェラルドＨＫ値と一致する。例１１ポリエチレンイミン改質ミクロプレートの調製：血漿接触活性化に与える支持体表面改質の影響Ａ．ミクロプレートコーティング６枚のファルコンＭＩＣＲＯＴＥＳＴ III組織培養プレートを次のように処理した。２枚のプレートは組成物Ａでコートした。２枚のプレートは組成物Ｂでコートした。組成物Ａ及び組成物Ｂを表６に示す。２枚のプレートは未処理のままとした。プレートを週末中、室温でインキュベートした。プレートをその後脱イオン水で１０回洗浄し、３５℃で３０分間乾燥した。Ｂ．コーティング効率の試験各プレートのウェルＧ１１及び１２に正常のプールした血漿５μｌを入れ、各プレートのウェルＨ２２及び１２に緩衝液(１５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.４))の５μｌを入れた。サンプルを室温で正確に１５分間インキュベートし、緩衝液１５０μｌを加えた。最後に、カリクレイン合成基質Ｓ−２３０２(４ｍＭ)(クロモゲニックスインコーポレイテッド(Chromoge nix,Inc.))の５０μｌを加え、カリクレイン生成を試験した。ＩＭＭＵＬＯＮ２ＥＬＩＳＡプレートに血漿及びＳ−２３０２を同様にして入れた。４０分後、４％クエン酸１００μｌを加えて反応を抑えた。全ミクロプレートをＢｉｏ− Ｔｅｋ４１１型ＥＬＩＳＡリーダーにてＡ₄₀₅ｎｍで読んだ。結果を表７に示す。多量のカリクレイン生成から明らかなように、コーとされていないファルコン (Falcon)ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ III培養プレートのウェルでは、プレートの負の表面電荷のために、血漿の接触活性化が進む。カリクレイン生成はポリエチレンイミンコートされたプレートでは無視できるものであり、ポリエチレンイミンが負の表面電荷を十分に遮蔽することを示している。これは、血液が長時間表面と接触する血液分析及び処理に用いるためには、そのままでは表面負電荷があるために不適当である或る種のミクロプレート及び容器でも、第１にポリエチレンイミンでコートし、より好適にはＥＤＣ等の共有結合剤にて設けられるポリエチレンイミンコーティングでコートする場合、血液アッセイ及びその他の方法に使用できることを示す。例１２ヤギのＰＣＦＩＡＡ．ヤギＩｇＧコートしたミクロスフェアの調製例１に従って調製されたポリエチレン改質ミクロスフェアに、表８の混合物を室温で回転ミキサーで一晩インキュベートすることによって、抗ヤギＩｇＧ(シグマケミカルカンパニー)を０.１ｍｇ／ｍｌの抗体の濃度でコートした。：次に、処理したミクロスフェアを３０分間、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡでブロックし、遠心分離し、水で洗浄し、そして最終容量４ｍｌのＰＢＣ−Ｔｗｅｅｎ中に再懸濁した。Ｂ．ヤギＩｇＧのＰＣＦＩＡ精製ヤギＩｇＧの連続希釈物を用いたＰＣＦＩＡ標準曲線を０から１０００ｎｇ／ｍｌまでのＩｇＧ濃度で作成した。標準曲線作成のためのサンプル調製用の希釈剤は、０.２μｍの注射器フィルターで濾過したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡであった。ミクロスフェア２０μｌを９６ウェルミクロプレートの各ウェルに加え、２０μｌの希釈したサンプル又は対照標準を加えた。室温で２０分後、市販の抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣを２０％ロバ血清を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡ中で１：１００に希釈することによって調製したＦＩＴＣ標識化ロバ抗ヤギＩｇＧ(抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ)溶液２０μｌをトレーサーとしてウェルに加えた。混合物を２０分間インキュベートした。プレートを例１のようにＦＣＡで、計器ゲイン５にて読んだ。データを図１０に示す。例１３ポリエチレンイミン改質ミクロスフェアによる抗体スクリーニングＡ．マウス血清のＰＣＦＩＡスクリーニングコモンウェルスバイオテクノロジーインコーポレイテッド（(Commonwealth Biotechnologies,Inc.)(リッチモンド、ＶＡ)）によってが合成されたペプチドＡｃ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇ１ｙ−Ａｌａ−Ｇ１ｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−ＮＨ₂.４ＴＦＡをスカシガイ (keyhole limpet)ヘモシアニンに結合し、マウスに抗血清を生成するための免疫原として用いた。結合剤ＩＭＪＥＣＴ(登録商標)−マレイミド活性化担体タンパク質(ピアスケミカルカンパニー、ロックフォード、ＩＬ)を用いてオボアルブミンに結合させたサンプルペプチドを用いて固相抗原を作り、ＰＣＦＩＡによって抗体類をスクリーニングした。オボアルブミン−ペプチド結合物を例２の結合法に従ってポリエチレンイミン改質ＣＭＬミクロスフェアに共有結合させた。その後ペプチド結合ポリエチレンイミン改質ミクロスフェアを用いてオボアルブミン−ペプチド結合物で免疫した５匹のマウスの血清を、例４に従う粒子濃度蛍光イムノアッセイ(ＰＣＦＩＡ)を用いてスクリーニングした。そのスクリーニングは免疫前血清、最初の免疫後に集めた血清、及び免疫原の第１回の追加免疫後に集めた血清で行われた。ペプチドコートされたミクロスフェア(２０μｌ中０.２５％)を各ＰＣＦＩＡプレートに入れた。マウス血清を、上記例４に従ってＰＣＦＩＡ希釈剤で１：１０００に希釈し、２０μｌをミクロスフェアを含むウェルに入れた。１５分後、プレートを洗浄し、１：５０に希釈した抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ(シグマケミカルカンパニー)２０μｌを加え、１５分間インキュベートした。プレートを洗浄し、蛍光濃度分析器で例４のように読んだ。そのデータを表９に示す。総マウスＩｇＧも、全サンプルで例２のように市販試薬を用いて測定し、従って“比(specific)抗ＬＫＩｇＧ”(ＲＦＵ(relative fluorescence units)を総マウスＩｇＧで割ったもの)を算出することができた。免疫後のマウス血清では、６３１８から４４６２２までの比抗ＬＫＩｇＧがあった。これは、ＭＡｂＬＫＬ−１を産生するハイブリドーマからの、腹水に対して測定された値、８３３０４と比較される。Ｂ．マウスハイブリドーマ培養上澄液のＰＣＦＩＡスクリーニング１匹以上の免疫マウスを犠牲にし、脾臓を摘出し、脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、従来のハイブリドーマ手順に従いハイブリドーマを調製した。そのハイブリドーマ組織培養上澄液について、ペプチド結合ポリエチレンイミン改質ミクロスフェアとの抗体の反応性をＰＣＦＩＡを用いてスクリーニングした。免疫前サンプルには測定可能な蛍光はなかった。スクリーニングした５００のハイブリドーマの大部分は蛍光を生じなかった。数サンプルが低いＲＦＵ(＜１０,０００)を示した。１０のサンプルのみが１０,０００から６０,０００の間の相対的蛍光単位(ＲＦＵ)を与えた。陽性ハイブリドーマを陰性ハイブリドーマから速やかに、明白に区別できる能力が、モノクローナル抗体産生における次のステップのためのハイブリドーマの選択を容易にした。完了するまでに数日かかる、ハイブリドーマ上澄液をスクリーニングするために現在用いられている従来のＥＬＩＳＡ法とは異なり、本発明のペプチド結合ポリエチレンイミン改質ミクロスフェアを用いるＰＣＦＩＡ法では、５００を超えるサンプルをたった数時間でスクリーニングすることができる。合成、調製及び分析法に関して引用した全ての参考文献は、本明細書に参照して援用する。本発明は、本発明の精神又は本質的特徴から逸脱することなく、その他の特殊な形でも行われ得る。よって、本発明の範囲を示すには、上記の説明よりはむしろ、添付の請求の範囲を参照されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１． (ａ)負に帯電した重合材料を含むミクロプレートと； (ｂ)前記ミクロプレート上のポリエチレンイミンのコーティングと、を含むイムノアッセイのための固体支持体。２．前記ポリエチレンイミンコーティングは、前記ポリエチレンイミンを前記ミクロプレートに共有結合させる結合剤と共に前記ミクロプレートに設けられる請求項１記載の支持体。３．前記結合剤はカルボジイミドである請求項２記載の支持体。４．前記結合剤は１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、又はその塩である請求項３記載の支持体。５．前記負に帯電した重合材料は改質ポリスチレンを含む請求項４記載の支持体。６． (ａ)固体支持体と； (ｂ)前記固体支持体上にコートされる、負に帯電した重合材料によって形成されたミクロ粒子の層と； (ｃ)前記ミクロ粒子上のポリエチレンイミンのコーティングと、を含むイムノアッセイのための担体。７．前記ミクロ粒子はカルボキシレート改質を含む請求項６記載の担体。８．前記ポリエチレンイミンコーティングは、前記ポリエチレンイミンを前記ミクロ粒子に共有結合させる結合剤と共に前記ミクロ粒子に設けられる請求項６記載の担体。９．前記結合剤はカルボジイミドである請求項８記載の担体。１０．前記結合剤は１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、又はその塩である請求項９記載の担体。１１．前記固体支持体はミクロプレートを含む請求項６記載の担体。１２． (ａ)負に帯電した重合材料を含むミクロプレートと； (ｂ)前記ミクロプレート上のポリエチレンイミンのコーティングと； (ｃ)前記ポリエチレンイミンに共有結合することによって前記担体に固定化された免疫試薬と、を含むイムノアッセイのための固相免疫試薬。１３．前記固定化された免疫試薬は抗原である請求項１２記載の固相免疫試薬。１４．前記固定化された免疫試薬は抗体である請求項１２記載の固相免疫試薬。１５．前記抗体はキニノーゲンに対して特異的である請求項１４記載の固相免疫試薬。１６．前記抗体は低分子量キニノーゲンに対して特異的である請求項１５に記載の固相免疫試薬。１７． (ａ)カルボキシレート改質ラテックスを含むミクロ粒子と； (ｂ)前記ミクロ粒子上のポリエチレンイミンのコーティングと； (ｃ)前記ポリエチレンイミンに共有結合することによって前記担体に固定化される免疫試薬と、を含むイムノアッセイのための固相免疫試薬。１８．前記固定化された免疫試薬は抗原である請求項１７記載の固相免疫試薬。１９．前記固定化された免疫試薬は抗体である請求項１７記載の固相免疫試薬。２０．前記抗体はキニノーゲンに対して特異的である請求項１９記載の固相免疫試薬。２１．前記抗体は低分子量キニノーゲンに対して特異的である請求項２０記載の固相免疫試薬。２２． (ａ)固体支持体と； (ｂ)前記固体支持体上にコートされる、負に帯電した重合材料によって形成されたミクロ粒子の層と； (ｃ)前記ミクロ粒子上のポリエチレンイミンのコーティングと； (ｄ)前記ポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって前記ミクロ粒子上に固定化された免疫試薬と、を含むイムノアッセイのための固相免疫試薬。２３．前記ミクロ粒子はカルボキシレート改質ラテックスを含む請求項２２記載の固相免疫試薬。２４．前記固定化された免疫試薬は抗原である請求項２３記載の固相免疫試薬。２５．前記固定化された免疫試薬は抗体である請求項２３記載の固相免疫試薬。２６．前記抗体はキニノーゲンに対して特異的である請求項２５記載の固相免疫試薬。２７．前記抗体は低分子量キニノーゲンに対して特異的である請求項２６記載の固相免疫試薬。２８． (ａ)請求項１７、２２又は２７のいずれかの項に記載の固相免疫試薬を、相補的免疫試薬を含む、又は含むと考えられる液体と接触させて、それによって固定化された免疫複合体を生成させ； (ｃ)前記固定化された免疫複合体を定量する、各工程を含む固相イムノアッセイ。２９．前記固相免疫試薬は低分子量キニノーゲンに対して特異的な抗体を含む請求項２８記載の固相イムノアッセイ。３０．前記固定された免疫複合体を、前記第一の免疫試薬又は前記相補的免疫試薬のどちらかと免疫反応する、検出可能に標識化された第二の免疫試薬と接触させ；前記固定された免疫複合体を洗浄して非結合免疫試薬を除去し；前記固定化された免疫複合体に合体された標識の量を測定する、各工程を含む請求項２８記載の固相イムノアッセイ。３１．前記検出可能に標識化された第二の免疫試薬の前記検出可能な標識は蛍光標識、放射性標識又は酵素標識を含む請求項３０記載のアッセイ。３２． (ａ)請求項１７、２２又は２７のいずれかの項に記載の固相免疫試薬を、相補的免疫試薬を含む、又は含むと考えられる液体、及び標識化された相補的免疫試薬の既知量と接触させ、それによって前記標識化された及び標識化されていない相補的免疫試薬の部分が前記固相免疫試薬に結合し； (ｃ)前記固相免疫試薬に結合した標識化された相補的免疫試薬の量を定量する、各工程を含む固相イムノアッセイ。３３．前記固相免疫試薬は抗体を含む請求項３２記載の固相イムノアッセイ。３４．前記抗体は低分子量キニノーゲン又は高分子量キニノーゲンに対して特異的である請求項３３記載の固相イムノアッセイ。３５．負に帯電した重合表面を処理して、前記表面による血漿の接触活性化を阻害する方法であって、前記表面をポリエチレンイミンでコーティングすることを含む方法。３６．前記表面はミクロプレートの表面を含む請求項３５記載の方法。３７．前記ポリエチレンイミンコーティングは、前記ポリエチレンイミンを前記ミクロプレートに共有結合させる結合剤と共に前記ミクロプレートに設けられる請求項３６記載の方法。３８．前記結合剤はカルボジイミドである請求項３７記載の方法。３９．前記結合剤は１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、又はその塩である請求項３８記載の方法。４０． (ａ)ミクロプレートと； (ｂ)前記ミクロプレート上の、負に帯電した重合材料のコーティングと、を含む高分子量キニノーゲンアッセイのための固体支持体。４１．前記ミクロプレート上の前記コーティングは、負に帯電した重合材料にて形成されるミクロ粒子の層を含む請求項４０記載の固体支持体。４２．前記ミクロ粒子はカルボキシレート改質ラテックスを含む請求項４１記載の固体支持体。４３． (ａ)高分子量キニノーゲンを含む又は含むと考えられる液体サンプルを、負に帯電した固体支持体と接触させ、前記サンプル中の高分子量キニノーゲンを前記固体支持体上に固定化し； (ｂ)前記固定化されたサンプル高分子量キニノーゲンから非結合物質を洗浄し； (ｃ)前記固定化されたサンプル高分子量キニノーゲンを、検出可能な標識を直接又は間接的に結合して含む、高分子量キニノーゲンに結合するディテクター抗体と接触させ； (ｄ)前記ディテクター抗体と前記固定化されたサンプル高分子量キニノーゲンとの結合を分析する、ことを含む高分子量キニノーゲンアッセイ方法。４４．前記検出可能な標識は蛍光標識、放射性標識又は酵素標識を含む請求項４３記載の方法。４５．前記負に帯電した支持体はミクロプレートを含む請求項４４記載の方法。４６．前記ミクロプレートはカルボキシレート改質ラテックスのコーティングを含む請求項４５記載の方法。４７． (ａ)高分予量キニノーゲンを捕獲するための負に帯電された表面を含む第一の固体支持体と； (ｂ)第二の固体支持体であって、その上のポリエチレンイミンコーティングと、及び前記ポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって前記第二の固体支持体上に固定化される、低分子量キニノーゲンに対して特異的な捕獲抗体と、を含む第二の固体支持体と； (ｃ)第三の固体支持体であって、その上のポリエチレンイミンコーティングと、及び前記ポリエチレンイミンコーティングに共有結合することによって前記第三の固体支持体上に固定化される、キニノーゲン重鎖に対して特異的な捕獲抗体と、を含む第三の固体支持体と； (ｄ)高分子量キニノーゲンの前記重鎖及び軽鎖両方を認識するディテクター抗体の供給物と、を含むキニノーゲンアッセイのためのキット。４８．前記固体支持体は、ミクロプレート又はミクロ粒子を含む請求項４７記載のキット。４９．前記ディテクター抗体は検出可能な標識を担持する請求項４８記載のキット。５０．前記固体支持体はミクロ粒子を含み、前記検出可能な標識は蛍光標識である請求項４９記載のキット。５１．前記ディテクター抗体に結合し、検出可能な標識を担持する二次ディテクター抗体の供給物を更に含む請求項４８記載のキット。５２．前記検出可能な標識は蛍光標識、放射性標識又は酵素標識を含む請求項５１記載のキット。５３．前記検出可能な標識は酵素標識であり、前記キットは更に前記酵素の基質の供給物を含む請求項５２記載のキット。５４．採取中の血液サンプルの凝固を防ぐことができる１つ以上の抗凝固剤の供給物と、サンプル採取後のキニノーゲンのタンパク質分解を阻害することができる１つ以上のプロテイナーゼ阻害剤の供給物と、及び１つ以上の緩衝剤の供給物を更に含む請求項４８記載のキット。５５． (ａ)１つ以上の抗凝固剤と１つ以上のプロテイナーゼ阻害剤との混合物を含む第一の容器と； (ｂ)サンプルを希釈するための緩衝組成物を含む第二の容器と； (ｃ)キニノーゲン捕獲後に前記ミクロプレートを洗浄するための洗浄緩衝組成物を含む第三の容器と、を更に含む請求項４８記載のキット。５６．前記第一のバイアルに含まれる抗凝固剤とプロテイナーゼ阻害剤との前記混合物、及び前記第二のバイアルに含まれる前記緩衝組成物は粉末形である請求項５５記載のキット。５７．前記ミクロプレート表面と前記ポリエチレンイミンコーティングとの間に、負に帯電した重合材料のコーティングを更に含む請求項４８記載のキット。５８．前記負に帯電した重合材料のコーティングは、カルボキシレート改質ラテックスを含む請求項５７記載のキット。５９．前記ミクロ粒子は約０.１μｍまでの直径を有する請求項７記載の担体。６０．前記ミクロ粒子は約０.１μｍまでの直径を有する請求項４１記載の支持体。６１．前記ポリエチレンイミンコーティングは、前記ポリエチレンイミンを前記表面に共有結合させる結合剤と共に前記表面に設けられる請求項３５記載の方法。６２．前記結合剤はカルボジイミドである請求項６１記載の方法。６３．前記結合剤は１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、又はその塩である請求項６２記載の方法。６４．本質的にポリエチレンイミンで前記表面をコーティングすることからなる請求項３５記載の方法。６５．前記表面はフィルター又は膜の表面を含む請求項３５記載の方法。６６．前記表面は容器の表面を含む請求項３５記載の方法。