JP7225713B2 - 抗ストレプトリジンｏ測定用ラテックス粒子の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は抗ストレプトリジンＯ測定試薬（以下、「ＡＳＯ試薬」と表記することもある。）に用いられるラテックス粒子の製造方法に関する。より詳しくは、ストレプトリジンＯを使用したラテックス凝集比濁法を測定原理とした抗ストレプトリジンＯ測定ラテックス粒子の製造方法に関する。

ラテックス凝集比濁法を測定原理とした測定試薬を製造するためには、測定対象物質と結合する抗体もしくは抗原をラテックス粒子に感作する必要がある。例えば、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産するストレプトリジンＯ（以下、「ＳＬＯ」と表記することもある。）をラテックス粒子に感作すれば、ＳＬＯに対する抗体価（ＡＳＯ価）を測定することが可能であり、ＳＬＯは溶血性連鎖球菌の感染有無を診断するためのＡＳＯ測定試薬の原料として広く使用されている。

従来はラテックス粒子とＳＬＯとの疎水性相互作用による物理的吸着法が広く採られ、得られたラテックス粒子とＳＬＯとの複合体をＢＳＡなどの免疫学的に不活性なタンパク質を溶解した緩衝液に懸濁した試薬の状態で保存するのが一般的であった（特許文献１）。しかし、このようにして調製された試薬では試薬を調製する条件により、担体同士の自己凝集が起こったり、感作したＳＬＯの脱離などが起こったりして試薬の反応性が低下し、本来の測定性能が発揮できない場合があった。そこで、ラテックス粒子とＳＬＯとを共有結合させることにより、ＳＬＯの脱離を防止して試薬の安定性を向上させる方法が提案されている（特許文献２、３）。
しかしながら、特許文献２や特許文献３で使用されているホウ酸緩衝溶液に含まれるホウ酸化合物は、ヨーロッパのＲＥＡＣＨ規制の認可対象物質リストに収載されている高懸念物質であるため、ホウ酸化合物を使用しない製法を開発することが望まれていた。

一方で、物理吸着法とは異なり、共有結合によるラテックス試薬の調製においては、共有結合の種類、ラテックス粒子の種類、抗体もしくは抗原を感作させる条件、ブロッキング条件、洗浄条件、ラテックス粒子の最終保存緩衝液の種類など試薬性能に与えるファクターが多数存在し、それらの条件を体系的に評価し、最適な条件を見出すことは非常に困難であった。

特開平５－２０３６４２号公報 特開２００３－３４４４１０号公報 特許第４７０４６６２号公報

本発明は、かかる現状に鑑み創作されたものであり、その目的は少量のＳＬＯで、高い感度が得られるＡＳＯ試薬を提供することにある。

本発明者は測定試薬の安定性を高めるために鋭意探索した結果、ブロッキング後の洗浄バッファーに界面活性剤、特に好ましくはＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を添加すれば試薬の安定性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の列挙するものが例示される。
［項１］
カルボキシル基を表面に有するラテックス粒子を使用し、ストレプトリジンＯをラテックス粒子に共有結合させ、ブロッキング処理を行った後、界面活性剤を含む緩衝液での洗浄工程を含む抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項２］
Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＣＨＡＰＳ、ＳＤＳ及びデオキシコール酸からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を用いる項１に記載の抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項３］
界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０を用いる項２に記載の抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項４］
界面活性剤の緩衝液中における濃度が０．０１％から０．１％である項１から３のいずれかに記載の抗ストレプトリジンＯ測定試薬。

本発明のＡＳＯ試薬に用いるラテックス粒子の製造方法は、少量のＳＬＯを用いた場合であっても、感度の高い測定を可能とする点で有用である。

（ＳＬＯ）
本発明に用いるＳＬＯとしては、特に限定されず、例えば、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産するＳＬＯや組換え大腸菌などを用いて生産された遺伝子組換えのＳＬＯ、また、一部のアミノ酸配列を欠損させた改変型のＳＬＯ、さらにはＭＢＰなどを融合させた融合型ＳＬＯを使用しても良い。例えば、ＷＯ２０１７／２０４３２５に開示されているＳＬＯが具体的に例示される。

（ラテックス粒子）
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されないが、例えば、スチレンスルホン酸、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸エステルなどを共重合させたポリスチレン粒子にカルボキシル基を導入した共有結合法向けのラテックス粒子が挙げられる。また、物理吸着を抑制するため、つまり、親水度を高めるためにポリアクリルアミドを含んだラテックス粒子を使用することもできる。好ましくは、アクリル酸を共重合させたポリスチレン粒子が挙げられ、さらに好ましくはポリアクリルアミドにより親水度が高められたアクリル酸を共重合させたポリスチレン粒子が挙げられる。

カルボキシル基の導入効率は適宜選択されるが、好ましくは５０μｅｑ／ｇ～３００μｅｑ／ｇ、より好ましくは７０μｅｑ／ｇ～２５０μｅｑ／ｇ、さらに好ましくは９０μｅｑ／ｇ～２００μｅｑ／ｇの割合でカルボキシル基が導入されたラテックス粒子である。

使用するラテックス粒子の平均粒径は、目的・用途に応じて適宜選択されるが、本発明においては、自動分析機向けであれば、好ましくは５０ｎｍ～２５０ｎｍ、より好ましくは６０ｎｍ～２００ｎｍ、さらに好ましくは７０ｎｍ～１５０ｎｍの粒径のラテックス粒子であることが好ましい。また、目視判断用の試薬向けであれば、好ましくは１００ｎｍ～５００ｎｍ、よりこのましくは２００ｎｍ～４００ｎｍのラテックス粒子であることが好ましい。

（ＳＬＯをラテックス粒子へ感作する方法）
ラテックス粒子の表面に有するカルボキシル基にＳＬＯのアミノ基を結合させる方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミドが使用できる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドを併用して、不安定なアシルイソ尿素中間体を、アミンと反応しやすいより安定したスクシンイミジルエステルに変換させてもよい。

（ブロッキング）
また、本発明の免疫測定試薬においては、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、例えば、アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質、これら蛋白質の分解物、アミノ酸、界面活性剤等の１種類もしくは２種類以上を前記不溶性担体に更に担持させても良い。ブロッキング剤の濃度は適宜決められるが、好ましくは０．１％～５％、さらに好ましくは１％～３％である。処理温度についても適宜決められるが、好ましくは４℃～３０℃、さらに好ましくは４℃～２０℃である。処理時間についても適宜決められるが、好ましくは０．５時間～２４時間、さらに好ましくは１時間～１６時間である。

（洗浄）
ブロッキング反応後の洗浄工程においては、各種界面活性剤を含む緩衝液での洗浄を実施することが望ましい。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、デオキシコール酸などが挙げられる。これらの界面活性剤は単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。使用濃度は適宜決められるが、例えば、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などが好適である。

（測定試薬）
本発明において、ＡＳＯ試薬は、２つの試薬から構成されてなり、緩衝溶液を第１試薬、ストレプトリジンＯを感作したラテックス粒子を含むラテックス試液を第２試薬とする構成からなるものである。そして、第１試薬の緩衝溶液中にポリビニルピロリドンを含有することを、好ましい構成とする。

本発明の免疫測定法としては、本発明のＡＳＯ試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を、光学的に観察または目視により観察する。抗原抗体反応のｐＨの好ましい下限は５、上限は１０であり、より好ましい下限は６、上限は９である。反応の温度の好ましい下限は４℃、上限は５０℃であり、より好ましい下限は２０℃、上限は４０℃である。反応時間は適宜決められるが、第２試薬と混合後、１～１０分間程度反応させることが望ましい。目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを、判定板上にて室温で混合し、１～５分間揺り動かしたあと、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる

上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。係る緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、各種グッド緩衝液等の緩衝液が好適に挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記媒体は、反応の感度を高めるために、水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ－，Ｉ－，ＳＣＮ－等）、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。

特に好ましい態様の一例を挙げると、特に第１試薬においてポリビニルピロリドンを使用することが望ましい。第１試薬に添加するポリビニルピロリドンの濃度としては、第１試薬溶液の最終濃度として、０．０５％～０．４％、より好ましくは０．０７％～０．３６％、さらに好ましくは０．０９％～０．３３％、特に好ましくは０．１％～０．３％が望ましい。

（ＡＳＯ試薬の評価方法）
ＡＳＯ試薬の性能としては、検出感度、測定範囲、測定精度、再現性、安定性などの項目が挙げられる。本発明によれば、ラテックス粒子をブロッキングした際の洗浄バッファーにＴｗｅｅｎ２０を添加すれば、長期間、試薬が安定となる。当該安定性は加速試験により、評価することができる。一般的にラテックス試薬は、通常２～１０℃で保存される。このような試薬の長期間の保存安定性を評価するために、２０～４０℃で短期間保存後の性能評価を行う加速試験が実施される。使用される温度としては３７℃で行う加速試験が好ましい。尚、測定に用いたＡＳＯ試薬の単位（ＩＵ／ｍｌ）は、世界保健機関（ＷＨＯ）が定めた抗ストレプトリジンＯ抗体の国際単位に基づいたものである。

以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は、実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ＡＳＯラテックス試薬（第２試薬）の調製
メルク社製カルボキシル基導入ラテックス粒子（製品番号：ＰＳＩ９０－２１）０．１４ｍＬを遠心分離し、上清を抜き取った。次に５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を１ｍＬ添加し、十分に懸濁した。その後、再び遠心分離を行い、上清を抜き取った。さらに、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を０．７ｍＬ添加した。これに４％カルボジイミド（ＥＤＣ）０．３５ｍＬ及び２．４％Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．３５ｍＬを加えて、ラテックス粒子の１％濃度とした状態で、２５℃で１５分撹拌し、カルボキシル基を活性化した後、遠心分離を行い、上清を抜き取った。これに５０ｍＭ カリウムリン酸緩衝液（以下、「ＫＰＢ」と示す。）（ｐＨ６．５）を０．７ｍＬ添加し、再び、遠心分離を行い、上清を抜き取った。これに５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．５）を０．７ｍＬ添加し、超音波にて分散させることで、活性化ラテックス粒子とした。ＷＯ／２０１７／２０４３２５の実施例２に記載の方法で調製したストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を３．０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるよう５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．５）で溶解した。次に、活性化ラテックス粒子０．７ｍＬとＳＬＯ溶液０．７ｍＬを混合し、２５℃にて２時間撹拌混合することで、ＳＬＯをラテックス粒子に共有結合させた。

次に、遠心分離を行い、上清を除去した後、ブロッキンング溶液（２％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））で２ｍＬに再懸濁した。再び、遠心分離により、上清を除去し、１．４ｍＬのブロッキング溶液を添加し、超音波にて分散させた後、４℃で一晩、撹拌した。その後、遠心分離を行い、上清を除去し、最終緩衝液（０．５％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））１．４ｍＬに再懸濁した。ここで、上記最終緩衝液中でのＴｗｅｅｎ２０の影響を確認するため、Ｔｗｅｅｎ２０を終濃度０．０１％となるよう添加した水準、Ｔｗｅｅｎ２０を終濃度０．１％となるよう添加した水準、合計３つの水準で試薬を調製した。続いて、超音波にて分散させた後、４℃で１時間、撹拌した。再び、遠心分離により、上清を除去し、２ｍＬの最終緩衝液を添加し、超音波にて十分に分散させた後、２．６７ｍＬの最終緩衝液を添加して、第２試薬とした。

［実施例２］ＡＳＯラテックス試薬（第２試薬）の安定性評価
本発明のＡＳＯラテックス試薬における第１試薬としては、０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を調製した。次に、自動分析装置日立７１８０（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、実施例１で調製した各第２試薬の試薬調製直後の感度を測定した。まず、第１試薬１２０μｌに各濃度（０、１２５、２５０ＩＵ／ｍｌ）のＡＳＯ標準液１．５μｌを添加撹拌し、３７℃で適時保持した後、第２試薬３０μｌを添加撹拌し、この後、３００秒後から６００秒後間の波長５４６ｎｍでの吸光度変化（ΔｍＡｂｓ）を評価した。続いて、実施例１で作製した第２試薬をボトルに入れ密栓し、３７℃のインキュベーターに入れて加速試験を行った。保存後７日後にインキュベーターより取り出し、再び、感度を測定し、測定値の変化を評価した。その結果、表１に示した通り、洗浄バッファーに含むＴｗｅｅｎ２０の濃度依存的に試薬の安定性が向上することを見出した。

本発明は、測定感度に優れた診断薬として、特に医療分野において有用な技術を提供するである。

Claims (5)

1. ５０μｅｑ／ｇ～３００μｅｑ／ｇのカルボキシル基を表面に有するラテックス粒子を使用し、ストレプトリジンＯをラテックス粒子に共有結合させ、ブロッキング処理を行った後、界面活性剤を含む緩衝液での洗浄工程を含む抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
2. ポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、およびエルシナンからなる群より選択される少なくとも１種の水溶性高分子を共存する、請求項１に記載の抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
3. Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＣＨＡＰＳ、ＳＤＳ及びデオキシコール酸からなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を用いる請求項１または２に記載の抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
4. 界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０を用いる、請求項３に記載の抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
5. 界面活性剤の緩衝液中における濃度が０．０１％から０．１％である、請求項１または２に記載の抗ストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。