JPH03269362A - 免疫分析用試薬および分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野） 本発明は微生物、生体物質、抗原決定基を有する物質の
同定、定量あるいは診断に用いる免疫分析用試薬および
分析方法に関する。

（従来の技術） 従来、抗原−抗体反応利用して、微生物あるいは生体物
質の同定、定量を行なう場合においては、般に、抗原決
定基を有する物質の分離、抽出および検出等の複数の段
階に分かれて行なわれている。

例えば、特許昭６０−１８８８４７号公報には、ラッテ
クスイムノアッセイ　（ＬＩＡ　　）にて、ｒｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｙｏｇｅｎｅｓｇｒｏｕｐ　
　ＡＪの同定に関する開示がなされている。

その方法は、酵素含有抽出剤に、抗原を含む菌の試料を
測定する場合には、少なくとも３０分間の抽出により、
菌から抗原決定基を有する物質を遊離さす。次にこの抽
出液をサンプルプレートに移す。

次に、この抽出液に対して、担体であるラテックス上に
固定されているこの抗原決定基を有する物質に対する抗
体を加え、抗原抗体反応をおこさせることにより、ラッ
テクス凝集反応が引き起こされる。

これら煩雑な操作により菌の同定が行なわれる。

また、一般に生体試料の場合は、超音波処理等による機
械的分解処理、カオトロピックアニオンによる抽出処理
、加水分解酵素、有機溶媒および界面活性剤等による可
溶化処理、塩析、遠心分離およびフィルター等による分
離処理または濃縮処理、カラムクロマト、液体高速クロ
マトグラフィー、電気泳動、免疫学的および酵素化学的
等による各種リガンドによる同定、ガスクロ、マススペ
クトルおよび核磁気共鳴等の検出器による同定および定
量が行われている。

（発明が解決しようとする課題） 従来技術は、標的物質の抽出とその検出は、別々の過程
として煩雑な操作が最適化されている。そのため操作過
程で起こる抗原決定基を有する物質の消失、多段階であ
ることによる操作の煩雑さそれにともなう操作ξス等に
より検出が困難、煩雑、不可能となっていた。

〔発明の構成〕

（課題を解決するための手段） 本発明者は試料中の微量の抗原決定基を有する物質の検
出において、操作性の優れた。高感度の検出システムを
開発すべく鋭意研究を行なっていた。

その結果、同一担体上に溶菌酵素または分解酵素と抗原
決定基を有する物質に対する抗体を組み込むことにより
、抗原決定基を有する物質の抽出、分離、濃縮および検
出を一挙に行ない、従来方法の欠点を解決するに至った
ものである。

即ち、本発明は、溶菌酵素または分解酵素と抗原決定基
を有する物質に対する抗体含有指示剤が、同一担体上に
固定されていることを特徴とする免疫分析用試薬、およ
び溶菌酵素または分解酵素と抗原決定基を有する物質に
対する抗体含有指示剤が、同一担体上に固定されている
ことを特徴とする免疫分析用試薬を用い、抽出操作、分
離操作、濃縮操作および検出操作を同時に行うことを特
徴とする免疫分析方法である。

本発明においては、遊離の分解酵素または溶菌酵素液に
かえて、担体表面に固定化された溶菌酵素または分解酵
素により、抗原決定基を有する物質の抽出がなされる。

抽出されると同時に、同一担体表面に固定された抗原決
定基を有する物質に対する抗体が、抽出された抗原決定
基を有する物質との結合による抗原−抗体反応が起こさ
れ、抗原決定基を有する物質の分離、および濃縮がなさ
れる。それに伴い、指示剤による発色、担体がラッテク
スの場合は、ラッテクスの凝集等により、抗原の同定が
なされる。

本発明に用いられる好ましい試薬は、担体としてはラテ
ックスであり、抗原決定基を有する物質を含む試料は、
ラッテクス表面上に固定された溶菌酵素または分解酵素
により、溶菌または分解され、この同じラッテクス表面
に固定された抗原決定基を有する物質に対する抗体と、
前記の抽出された抗原決定基含有物質の間で抗原抗体反
応が起こる。異なったラッテクス粒子に結合した抗体に
対して′抗原決定基を有する物質が結合するとラッテク
ス粒子が架橋する結果になり、これらが凝集して懸濁液
から析出するようになる。この凝集は、内訳でも顕微鏡
でも認めることが出来る。あるいはマイクロタイタープ
レート上で上記反応を行いマイクロタイタープレートリ
ーダーで測定し可視領域の波長の吸光度の減少により同
定、定量がなされる。

溶菌酵素または分解酵素と抗原決定基を有する抗体含有
指示薬を有する試薬の一例としては、担体としてラテッ
クスを用いる方法が挙げられる。その方法としては、カ
ルボキシル化された粒径０．２−１．０ξクロンの範囲
のラテックス粒子表面に、溶菌酵素または分解酵素およ
び抗原決定基を有する物質に対する抗体の指示剤を含む
試薬は、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド（Ｅ　Ｄ　Ｃ）を用いカルボキシル化
ラテックスに共有結合させることによりえられる。

本発明に於てはこのように同一の担体上に抗原決定基を
有する物質の抽出のための酵素ばかりでなく、この抗原
決定基を有する物質に対する抗体を固定させることによ
り、抽出操作、分離操作、濃縮操作および同定を同時に
行うことにより、煩雑な操作を必要とせず検査の精度を
上げることが可能である。

以下、本発明を実施例により、更に具体的に説明するが
、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

例中、部および％は、それぞれ重量部および重量％を示
す。

（実　例　例） 実施例１ （免疫分析用試薬の製法） 固形分１０％含有カルボキシル化ラッテクス懸濁液（Ｉ
ＭＭＵＴＥＸ　　日本合成ゴム社製　商品名）１００μ
ｍを室温にて蒸留水１．　Ｑ　ｍ　Ｉで濾過、洗浄する
。

次に、０．１ｍｏｌのＭＥＳ緩衝液１ｍ１（ｐＨ６゜０
）にて、カルボキシル化ラッテクスを再懸濁させ、ＥＤ
Ｃの２％溶液１．０　ｍ　ｌを加え、４時間反応させる
。

カルボキシドラテックスを食塩水（０，９％ＮａＣ１）
で洗浄、遠心分離後し、同波１．　Ｑ　ｍ　１に再懸濁
させる。抗Ｅ、ｃｏｌｔ抗体（坑Ｅ、ｃｏｌｉ抗体生抗
体生化学工業品名）を含む血清１００μｍを上記再懸濁
液に加え、２００時間反応せる。続いて、リゾチーム（
Ｌｙ　ｓ　ｏ　ｚ　ｙｍｅ　　和光純薬製　商品名）１
０ｍｇ、食塩水（０，９重量％ＮａＣＩ）１．０ｍｌを
更に加え２００時間反応せる。抗体ともりゾチームとも
反応していない表面カルボキシル基を中和するため、５
ミリｍｏ＋エタノールアミン溶液を加え、続いて１０重
量％濃度のウシ血清アルブミンをブロッキングのため加
える。このラテックスをＮａＮ、＋　（０，２％）およ
び界面活性剤（ツイーン２０アトラス　パウダー社製商
品名）（０，０５％）含有ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗い、
同波１ｍｌ中（ｐＨ７゜２）に再懸濁し、４℃で貯蔵す
る。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の総画数を希釈法により決定し
Ｑ、１ｍｏｌｌ−リス−塩酸（ｐＨ８，３，４Ｃ）１ｍ
ｌに懸濁して１Ｘ１０９に調製する。２ｍ０１蔗糖溶液
０．３５　ｍ　ｌ、１％Ｎａ−ＥＤＴＡ　（ｐＨ７゜０
、）０．０７ｍ１で１時間処理後、これらの２倍希釈液
すなはち１Ｘ１０９．５Ｘ１０８．２．５Ｘ１０’、１
．２５Ｘ１０８．６．０Ｘ１０７、相当の液をトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）でつくる。これら０．０５ｍ
１をマイクロプレートに移し上記作製のラッテクス懸濁
液０．０１ｍ１をそれぞれに加え混合３０分後、マイク
ロプレートリーダー（４０５ｎｍ）にて吸光度を測定す
る。

以上の実験により、第１図の結果を得、菌数と吸光度の
関係は、−次回帰式で相関係数として０．９６９を得た
。

（発明の効果） 同−担体上に、抗原決定基を有する物質を抽出出来る酵
素と抗体を固定化すると、二つの異なる機能を持った分
子、つまりこの場合抗原決定基を有する物質の抽出とそ
の検出が連続的に起こる。つまり抗原決定基を有する物
質を含む微生物はラッテクス表面上に固定された溶菌酵
素により溶菌され、この同じラッテクス表面に固定され
た抗原決定基を有する物質に対する抗体と前記の抽出さ
れた抗原決定基を有する物質の間で抗原抗体反応が起こ
る。異なったラッテクス粒子に結合した抗体に対して抗
原決定基を有する物質が結合するとラッテクス粒子が架
橋する結果により、これらが凝集してラッテクス懸濁液
から析出するようになる。２つ以上の多段階操作が要求
される段階が一段階の操作に軽減されることは本発明に
ともなう直接的効果である。

また抗原決定基を有する物質を含む試料からの抽出を担
う酵素分子の近傍に検出機能をもつ抗体分子があるため
抗原決定基を有する物質の抽出にともなう希釈が最小限
に食い止められ局所的に抗原決定基を有する物質を検出
することができる。

また固相に固定化することにより抗原決定基を有する物
質を抽出出来る酵素と抗体の安定化、副反応つまり遊離
の前記酵素による抗原抗体反応と無関係な非特異的なラ
テックス凝集が抑えられる等が達成できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に基づき実施した、菌数と吸光度を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、溶菌酵素または分解酵素と抗原決定基を有する物質
   に対する抗体含有指示剤が、同一担体上に固定されてい
   ることを特徴とする免疫分析用試薬。 ２、抗体含有指示剤が、抗体が抗原と結合すると凝集す
   る懸濁ラッテクス粒子に結合した抗体を含有することを
   特徴とする請求項１記載の免疫分析用試薬。 ３、溶菌酵素または分解酵素と抗原決定基を有する物質
   に対する抗体含有指示剤が同一担体上に固定されている
   ことを特徴とする免疫分析用試薬を用い、抽出操作、分
   離操作、濃縮操作および検出操作を一段階にて行うこと
   を特徴とする免疫分析方法。 ４、抗体が抗原と結合すると凝集する懸濁ラッテクス粒
   子に結合した抗体を含有する抗体含有指示剤を用い、抗
   原抗体反応により前記懸濁粒子が凝集することを特徴と
   する請求項３記載の免疫分析方法。