CN113840910A - 细胞外囊泡的清洗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于在操作细胞外囊泡的系统中降低杂质的混入的技术。更具体而言，本发明提供细胞外囊泡的清洗方法等，所述清洗方法包含用非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡，所述非离子性表面活性剂为包含‑O‑(‑CH2‑CH2‑O‑)x‑H表示的结构的链状化合物，式中，x为说明书中定义的值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡的清洗方法等。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles：EV)是由各种细胞分泌的、具有膜结构的微小囊泡，存在于血液等体液中或细胞培养液中。被分泌至细胞外的细胞外囊泡包含：外泌体(exosome)、核外粒体(ectosome)，凋亡小体(apoptotic bleb)。细胞外囊泡是包含承担细胞间的信息传达等功能的各种物质的多样化集团，因此为了诊断、制药等目的而正在被解析。因此，需要开发对这样的解析有用的细胞外囊泡的清洗方法。例如，专利文献1记载了一种EV的分离方法，其通过在免疫沉淀时和/或清洗时添加非离子性表面活性剂，而使固相载体彼此间的凝聚降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/068772号
发明内容
发明所解决的技术问题
在检测体液等检体中的EV内包含的物质的情况下，该物质可能也大量存在于检体中的EV之外。通常而言，EV中包含的对象物质的量与检体中的存在于EV外的相同物质的量相比，是微量的。因此在对从检体回收的EV中的对象物质进行检测或测定时，体液中的大量存在于EV外的该物质会作为杂质混入，成为背景，因此难以对EV中的对象物质进行检测或测定。例如，有报告称通过对作为EV中的癌症标志物的CEA进行测定，可提高诊断性能，但在对血液检体来源的EV中的CEA进行检测或测定的情况下，血液检体中包含的CEA显著比EV多，因此在EV外的CEA作为杂质吸附在EV表面、容器表面时，无法准确地检测或测定作为对象物质的EV内CEA。
因此，本发明的目的是开发能够在操作细胞外囊泡的系统中降低杂质混入的方法。
解决问题的技术手段
本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过使用包含给定的非离子性表面活性剂的清洗液清洗EV，能够降低EV外包含的相同对象物质等杂质(例如，与检测或测定的对象物质相同的物质)的混入量，完成了本发明。
即，本发明如下。
[1]一种细胞外囊泡的清洗方法，其包含：
用非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡，所述非离子性表面活性剂为包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H表示的结构的链状化合物，式中，x为1～300。
[2]根据项[1]的方法，其中，
所述非离子性表面活性剂为醇乙氧基化物。
[3]根据项[2]的方法，其中，
醇乙氧基化物为式(I)表示的化合物：
[化学式1]
式中，x为15～100；
y为0以上的整数；
z为0以上的整数；
y≥z；
y+z为5～30。
[4]根据项[2]或[3]的方法，其中，
醇乙氧基化物为HLB为15以上或碳链的碳原子数为16以下的醇乙氧基化物。
[5]根据项[1]的方法，其中，
所述非离子性表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物。
[6]根据项[5]的方法，其中，
聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物为式(III)表示的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物：
[化学式2]
HO-(-CH2-CH2-O-)x2-((-CH(-CH3))CH2-O-)y2-(-CH2-CH2-O-)z2-H (III)
式中，x2为1以上的整数；
y2为10～100；
z2为1以上的整数；
x2+z2为20～300。
[7]根据项[1]～[6]中的任一种方法，其用0.001～10.0w/v％的所述非离子性表面活性剂处理细胞外囊泡。
[8]根据项[1]～[7]中的任一种方法，其中，
细胞外囊泡为外泌体。
[9]根据项[1]～[8]中的任一种方法，其中，
用所述非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡是指：用所述非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体。
[10]根据项[1]～[9]中的任一种方法，其中，
细胞外囊泡膜结合物质是针对四跨膜蛋白的抗体。
[11]一种细胞外囊泡纯化物的制造方法，其包含：
(1)用非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡，所述非离子性表面活性剂为包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H表示的结构的链状化合物，式中，x为1～300；和
(2)分离清洗过的细胞外囊泡。
[12]根据项[11]的方法，其中，
所述非离子性表面活性剂为醇乙氧基化物或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
[13]根据项[11]或[12]的方法，其通过包含以下内容的步骤进行：
(1’)用细胞外囊泡膜结合物质对细胞外囊泡进行处理，形成细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体；
(2’)用所述非离子性表面活性剂清洗所述复合体；和
(3’)分离所述复合体。
[14]一种细胞外囊泡的分析方法，其包含：
对由[1]～[10]中的任一种方法清洗了的细胞外囊泡或由[11]～13]中的任一种方法制造得到的细胞外囊泡纯化物进行分析。
[15]根据项[14]的方法，其中，
通过检测细胞外囊泡内部标志物来进行分析。
[16]根据项[15]的方法，其中，
细胞外囊泡内部标志物为癌胚抗原(CEA)或CA125。
[17]根据项[14]～[16]中的任一种方法，其通过包含以下内容的步骤进行：
(1)破坏由[1]～[10]中的任一种方法清洗了的细胞外囊泡或由[11]～[13]中的任一种方法制造得到的细胞外囊泡纯化物；和
(2)对被破坏的细胞外囊泡的细胞外囊泡内部标志物进行检测。
[18]一种试剂盒，其包含：
(1)非离子性表面活性剂，其为包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H表示的结构的链状化合物，式中，x为1～300；和
(2)细胞外囊泡膜结合物质。
发明效果
根据本发明，可通过用给定的非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡，来降低杂质的混入。通过降低杂质混入，细胞外囊泡标志物的检测或测定中的背景等损害得到降低，检测或测定的精度提高。因此，本发明对以细胞外囊泡标志物作为指标时的高精度分析或诊断有用。此外，本发明对作为用于高精度分析或诊断的样品的细胞外囊泡的回收有用。
附图说明
[图1]图1是表示将实施例6中的残留总蛋白作为指标的Tergitol15-s-30和PluronicF68的EV回收中的清洗效果的浓度依赖性比较的图。
具体实施方式
1.表面活性剂的分类
在本发明中，可根据一个以上的目的(例如，EV的清洗、EV的破坏)而使用多个种类的表面活性剂。因此，作为选择适合各种目的的表面活性剂的前提，将表面活性剂基于化学特性(亲水性部分的离子特性)和功能特性(对EV的特性/用途)进行分类。
1-1.表面活性剂基于亲水性部分的离子特性的分类
基于亲水性部分的离子特性，可将表面活性剂归类为非离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂和两性表面活性剂。以下，将举例表示各表面活性剂。
1-1-1.非离子性表面活性剂
作为非离子性表面活性剂，例如可举出：含聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂(例如，醇乙氧基化物、聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如，TWEEN(注册商标)系列(例如，TWEEN20、TWEEN40、TWEEN80))、聚氧乙烯辛基苯基醚(例如，TRITON(注册商标)系列(例如，Triton X-100、Triton X-114、Triton X-305、Triton X-405、Triton X-705))、N-D-葡糖-N-甲基烷酰胺(例如，MEGA系列(例如，MEGA 8，ME GA 10)。
“含聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂”是包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H[式中，x为1以上的整数]表示的结构(以下，称为“聚氧乙烯醇结构”)的链状化合物(不含环状结构的化合物)。这样的化合物可以是直链状化合物或支链状化合物中的任一种。这样的化合物可以由单键构成或可以包含多键。这样的化合物可以包含1个或多个(例如，2、3、4个)聚氧乙烯醇结构。作为这样的化合物中的聚氧乙烯醇结构以外的结构，例如可举出：亚烷基结构(直链或支链)，聚氧化亚烷基结构(直链或支链)。这样的化合物可以包含碳原子、氢原子和氧原子。作为这样的化合物，例如可举出醇乙氧基化物和聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物(例如，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)。
“醇乙氧基化物”是指，下述式(I)表示的一群化合物。
[化学式3]
式中，x为1以上的整数；
y为0以上的整数；
z为0以上的整数；
y≥z。
在式(I)中，有时将“H-(-CH2-)y-CH-(-CH2-)z-H”表示的部分称为“疏水部侧链”、“碳链”或“烷基链”等。在式(I)中，疏水部侧链的碳原子数相当于y+z+1。在式(I)中，有时将“-(-CH2-CH2-O-)x-H”表示的部分称为“亲水部侧链”或“乙氧基链”等。
作为醇乙氧基化物，例如可举出支链醇乙氧基化物和直链醇乙氧基化物。
支链醇乙氧基化物相当于在所述的式(I)表示的化合物中y为1以上的整数且z为1以上的整数的化合物。作为支链醇乙氧基化物，例如可举出：聚氧乙烯(3)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(7)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(9)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(12)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(15)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(20)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(30)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(40)仲十三烷基醚。作为支链醇乙氧基化物，例如作为市售品可举出：Tergitol15-S-3、Tergitol15-S-5、Tergitol15-S-7、Tergitol15-S-9、Tergitol15-S-12、Tergitol15-S-15、Tergitol 15-S-20、Tergitol15-S-30、Tergitol15-S-40等TERGITOL(注册商标)系列的化合物。就TERGITOL15-S系列而言，烷基链的碳原子数(y+z+1)为11～15(平均13)，在该系列名称中“S”之后的数字表示乙氧基链的环氧乙烷的单元数(x)。
直链醇乙氧基化物相当于在所述的式(I)表示的化合物中，z为0的化合物。作为直链醇乙氧基化物，例如可举出：聚氧乙烯(4)月桂醚、聚氧乙烯(23)月桂醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡醚、聚氧乙烯(20)硬脂醚。作为直链醇乙氧基化物的市售品，例如可举出：Brij30、Brij35、Brij58、Brij78等BRIJ(注册商标)系列的化合物。直链醇乙氧基化物也可表示为下述式(II)。
[化学式4]
H-(-CH2-)n-O-(-CH2-CH2-O-)x-H (II)
式中，x为1以上的整数；
n为1以上的整数。
“聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物”是指包含聚氧乙烯嵌段和聚氧化亚烷基嵌段的嵌段共聚物。作为聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物，例如可举出聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
“聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物”是指下述式(III)表示的一群化合物。
[化学式5]
HO-(-CH2-CH2-O-)x2-((-CH(-CH3))CH2-O-)y2-(-CH2-CH2-O-)z2-H (III)
式中，x2、y2、z2为1以上的整数。
作为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如可举出：泊洛沙姆182、泊洛沙姆108、泊洛沙姆188、泊洛沙姆217、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆288、泊洛沙姆388、泊洛沙姆407等。作为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的市售品，例如可举出：Pluronic L62、Pluronic F38、Pluronic F68、Pl uronic F77、Pluronic F87、Pluronic F88、PluronicF98、Pluronic F108、Plur onic F127等PLURONIC(注册商标)系列的化合物。
1-1-2.阳离子性表面活性剂
作为阳离子性表面活性剂，例如可举出季铵盐。作为盐，例如可举出与卤素(例如，氟、氯、溴、碘)的盐。作为季铵盐，例如可举出Cn烷基三甲基溴化铵(CnTAB)、Cn烷基三甲基氯化铵(CnTAC)。作为CnTAB，例如可举出：辛基三甲基铵溴化物(C8TAB)、壬基三甲基铵溴化物(C9TAB)、十二烷基三甲基溴化铵(C12TAB)、十四烷基三甲基溴化铵(C14TAB)、十六烷基三甲基溴化铵(C16TAB)。作为CnTAC，例如可举出：十二烷基三甲基氯化铵(C12TAC)、十四烷基三甲基氯化铵(C14TAC)、十六烷基三甲基氯化铵(C16TAC)、十八烷基三甲基氯化铵(C18TAC)。
1-1-3.阴离子性表面活性剂
作为阴离子性表面活性剂，例如可举出：羧酸型表面活性剂(例如，N-癸酰基肌氨酸钠(NDS)、N-月桂酰基肌氨酸钠水合物(NLS))、磺酸型表面活性剂(例如，1-壬烷磺酸钠(NSS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS))、羧酸型-磺酸型表面活性剂(例如，硫酸软骨素钠(CSSS))、硫酸酯型表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))。
1-1-4.两性表面活性剂
作为两性表面活性剂，例如可举出季铵-磺酸型表面活性剂。作为季铵-磺酸型表面活性剂，例如可举出：3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐(CHAPSO)、3-(N,N-二甲基辛基氨基)丙磺酸内盐(C8APS)、3-(癸基二甲基氨基)丙磺酸内盐(C10APS)、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内盐(C12APS)、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基氨基)丙磺酸内盐(C14APS)、3-(N,N-二甲基棕榈基氨基)丙磺酸内盐(C16APS)、二甲基乙基铵丙磺酸内盐(NDSB-195)、3-[二甲基-(2-羟乙基)氨基]-1-丙磺酸内盐(NDSB-211)、3-(苯二甲基氨基)丙磺酸内盐(NDSB-256)。
1-1-5.表面活性剂的物理性质值
作为表示表面活性剂的亲水性和亲油性的物理性质值，可使用亲水亲油平衡值HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)值。HLB值越接近0表示亲油性越高。市售品化合物的HLB值可以使用制造商的数据表中记载的值。制造商的数据表中记载的HLB值可能超过20。此外，醇乙氧基化物的HLB值，例如可以简单地通过Griffin法求得。
1-1-6.表面活性剂基于离子特性的分类总结
在基于亲水性部分的离子特性对表面活性剂进行分类时，总结结果如下表所示。
[表1-1]
表1.表面活性剂基于亲水性部分的离子特性的分类
表[1-2]
表1(续)
*数字表示疏水部侧链为烷基链时的碳原子数。
**制造商的数据表中记载的值超过20。
1-2.表面活性剂基于对EV的特性和用途的分类
可基于破坏EV的性质的程度，将表面活性剂归类为“EV难破坏性表面活性剂”和“EV破坏性表面活性剂”。可进一步将“EV难破坏性表面活性剂”中具有清洗效果的表面活性剂归类为“EV清洗性表面活性剂”。通过从EV难破坏性表面活性剂中选择EV清洗性表面活性剂，能够在防止EV的破坏所导致的EV内部标志物向EV外的释放的同时，清洗EV和EV操作系统。将“EV清洗性表面活性剂”中相当于非离子性表面活性剂的称为“EV清洗性非离子性表面活性剂”。所述分类，例如可基于本说明书的实施例所述的方法进行。
2.细胞外囊泡的清洗方法
本发明提供细胞外囊泡的清洗方法。
细胞外囊泡是由各种细胞分泌的、具有膜结构的微小囊泡。作为细胞外囊泡，例如可举出：外泌体、核外粒体和凋亡小体。优选细胞外囊泡为外泌体。细胞外囊泡也可由其尺寸来规定。细胞外囊泡的尺寸，例如为30～1000nm，优选为50～300nm，更优选为80～200nm。细胞外囊泡的尺寸的测定可通过以下方法进行，例如基于细胞外囊泡的布朗运动的方法、光散射法和电阻法等。优选细胞外囊泡的尺寸的测定通过NanoSight(MalvernInstruments公司制)进行。
本发明的清洗方法包含用“EV清洗性非离子性表面活性剂”清洗细胞外囊泡。本发明的清洗方法中使用的“EV清洗性非离子性表面活性剂”是含聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂。
在本发明的清洗方法中用作EV清洗性非离子性表面活性剂的含聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂是包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H表示的结构(聚氧乙烯醇结构)的链状化合物(不含环状结构的化合物)。x为1以上的整数，例如可以为1～300。这样的化合物可以是直链状化合物或支链状化合物中的任一种。这样的化合物可以由单键构成或可以包含多键，优选由单键构成。这样的化合物可以包含1个或多个(例如，2、3、4个)聚氧乙烯醇结构。作为这样的化合物中的聚氧乙烯醇结构以外的结构，例如可举出烷基结构(直链或支链)、聚氧化亚烷基结构(直链或支链)。烷基结构，例如可以为C6～31烷基结构，优选为C6～31直链烷基结构。聚氧化亚烷基结构中的亚烷基，例如可以为C1～6亚烷基。作为C1～6亚烷基，例如可举出：C1亚烷基(亚甲基)、C2亚烷基(亚乙基(ethylene)、亚乙基(ethylidene))、C3亚烷基(亚丙基(propylidene)、亚丙基(propylene)、三亚甲基、异亚丙基(isopropylidene))、C4亚烷基(例如，四亚甲基)、C5亚烷基(例如，五亚甲基)、C6亚烷基(例如，六亚甲基)。这样的化合物可以包含碳原子、氢原子和氧原子。作为这样的化合物，例如可举出醇乙氧基化物和聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物(例如，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)。
“醇乙氧基化物”为下述式(I)表示的化合物。
[化学式6]
式中，x为1以上的整数；
y为0以上的整数；
z为0以上的整数；
y≥z。
在本发明的清洗方法中用作EV清洗性非离子性表面活性剂的醇乙氧基化物可以是支链醇乙氧基化物或直链醇乙氧基化物中的任一种。
这样的支链醇乙氧基化物相当于在所述的式(I)表示的化合物中y为1以上的整数且z为1以上的整数的化合物。作为这样的支链醇乙氧基化物，例如可举出：聚氧乙烯(7)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(9)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(15)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(20)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(30)仲十三烷基醚、聚氧乙烯(40)仲十三烷基醚。就这样的支链醇乙氧基化物而言，例如作为市售品可举出：Tergitol15-S-7、Tergitol15-S-9、Tergitol15-S-15、Tergitol15-S-20、Tergitol15-S-30、Tergitol15-S-40等TERGITOL(注册商标)系列的化合物。
这样的直链醇乙氧基化物相当于在所述的式(I)表示的化合物中z为0的化合物。就这样的直链醇乙氧基化物而言，例如作为市售品可举出：Brij35、Brij58、Brij78等BRIJ(注册商标)系列的化合物。直链醇乙氧基化物也可表示为下述式(II)。
[化学式7]
H-(-CH2-)n-O-(-CH2-CH2-O-)x-H (II)
式中，x为1以上的整数；
n为1以上的整数。
在本发明的清洗方法中用作EV清洗性非离子性表面活性剂的醇乙氧基化物优选满足以下条件的式(I)表示的化合物：
x为15～100；
y为0以上的整数；
z为0以上的整数；
y≥z；
y+z为5～30。
在本发明的清洗方法中用作EV清洗性非离子性表面活性剂的醇乙氧基化物更优选为HLB为15以上或碳链的碳原子数为16以下的醇乙氧基化物。本发明的清洗方法中使用的醇乙氧基化物进一步优选为HLB为15以上的醇乙氧基化物。作为本发明的清洗方法中使用的醇乙氧基化物的优选实例，可举出：Tergitol15-S-15、Tergitol15-S-20、Tergitol15-S-30、Tergitol15-S-40、Brij35、Brij58、Brij78。作为本发明的清洗方法中使用的醇乙氧基化物的更优选实例，可举出：Tergitol15-S-30、Tergitol15-S-40、Brij35、Brij58。
“聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物”是包含聚氧乙烯嵌段和聚氧化亚烷基嵌段的嵌段共聚物。聚氧化亚烷基嵌段中的亚烷基，例如可以为C1～6亚烷基，例如可举出：C1亚烷基(亚甲基)、C2亚烷基(亚乙基(ethylene)、亚乙基(ethylidene))、C3亚烷基(亚丙基(propylidene)、亚丙基、三亚甲基、异亚丙基(isopropylidene))、C4亚烷基(例如，四亚甲基)、C5亚烷基(例如，五亚甲基)、C6亚烷基(例如，六亚甲基)。作为聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物，例如可举出具有HO-[聚氧乙烯嵌段]-[聚氧化亚烷基嵌段]-[聚氧乙烯嵌段]-H的结构的嵌段共聚物。聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物可以优选为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
“聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物”为下述式(III)表示的一群化合物。
[化学式8]
HO-(-CH2-CH2-O-)x2-((-CH(-CH3))CH2-O-)y2-(-CH2-CH2-O-)z2-H (III)
式中，x2、y2、z2为1以上的整数。
作为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如可举出泊洛沙姆188、泊洛沙姆407等。作为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的市售品，例如可举出Pluronic F68、Pluronic F127等PLURONIC(注册商标)系列的化合物。
在本发明的清洗方法中用作EV清洗性非离子性表面活性剂的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物优选为满足以下条件的式(III)表示的化合物：
x2为1以上的整数；
y2为10～100；
z2为1以上的整数；
x2+z2为20～300。
在本发明的清洗方法中用作EV清洗性非离子性表面活性剂的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物更优选为HLB为15以上的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。作为本发明的清洗方法中使用的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的优选实例，可举出：泊洛沙姆188(例如，Pluronic F68)、泊洛沙姆108(例如，Pluro nic F38)、泊洛沙姆217(例如，Pluronic F77)、泊洛沙姆237(例如，PluronicF87)、泊洛沙姆238(例如，Pluronic F88)、泊洛沙姆288(例如，Pluronic F98)、泊洛沙姆388(例如，Pluronic F108)、泊洛沙姆407(例如，PluronicF127)。作为本发明的清洗方法中使用的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的更优选实例，可举出泊洛沙姆188(例如，Pluronic F68)、泊洛沙姆407(例如，Pluronic F127)。
在本发明的清洗方法中用作EV清洗性非离子性表面活性剂的非离子性表面活性剂优选为醇乙氧基化物。
细胞外囊泡的清洗中的EV清洗性非离子性表面活性剂的浓度只要是能够抑制杂质对细胞外囊泡和操作细胞外囊泡的系统的吸附，并且能够抑制细胞外囊泡的破坏的浓度，就没有特别限定。这样的浓度根据EV清洗性非离子性表面活性剂的种类而不同，例如为0.001～10.0w/v％。可以优选EV清洗性非离子性表面活性剂的浓度为0.002w/v％以上，0.005w/v％以上或0.01w/v％以上。并且这样的浓度根据EV清洗性非离子性表面活性剂的种类而不同，可以为7.5w/v％以下、5.0w/v％以下或2.0w/v％以下。可以更优选EV清洗性非离子性表面活性剂的浓度为0.002～7.5w/v％、0.005～5.0w/v％或0.01～2.0w/v％。
本发明的清洗方法中使用的EV清洗性非离子性表面活性剂可以是水溶液。作为水溶液，例如可举出水(例如，蒸馏水、灭菌水、灭菌蒸馏水和纯水)和缓冲液，优选缓冲液。作为缓冲液，例如可举出：磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、酒石酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸缓冲液、2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液、2-[4-(2-羟乙基)1-哌嗪基乙磺酸(HEPES)缓冲液。缓冲液的pH优选为中性的。更具体而言，这样的pH可以优选为5.0以上，更优选为5.5以上，进一步优选为6.0以上。并且pH可以优选为9.0以下，更优选为8.5以下，进一步优选为8.0以下。pH的测定可使用该领域中公知的方法进行。优选地，pH可采用使用具有玻璃电极的pH计在25℃下测定得到的值。
细胞外囊泡的清洗中的温度，例如可以为4～45℃，优选为15～40℃。清洗中的时间只要是足以抑制杂质对细胞外囊泡的吸附的时间，就没有特别限定，例如可以为1秒以上、5秒以上、10秒以上或20秒以上。并且这样时间可以为4分钟以下、2分钟以下或1分钟以下。在细胞外囊泡的清洗中，在将细胞外囊泡和EV清洗性非离子性表面活性剂混合后，可以放置混合液，可以通过旋涡混匀器等进行搅拌，也可以通过移液枪操作进一步混合。
在本发明中，“细胞外囊泡的清洗”是指，在细胞外囊泡的表面和操作细胞外囊泡的系统(例如，溶液、容器)中，使杂质的量降低。作为杂质，例如可举出：蛋白质、核酸(例如，RNA、DNA)、糖、脂质、氨基酸、维生素类、聚胺和肽。杂质特别是指干扰细胞外囊泡的分析的混入物质，例如可举出：使检测背景增强的杂质(例如，与检测对象相同或类似的物质)、使检测信号减弱的杂质(例如，阻碍检测对象的检测的物质)。细胞外囊泡的清洗优选使与检测对象相同或类似的物质的量降低，更优选使与检测对象属于相同类别的物质的总量(例如，在检测对象为蛋白质的情况下，是总蛋白量)降低。作为细胞外囊泡的操作，例如可举出：细胞外囊泡的清洗、细胞外囊泡纯化物的制造(即，细胞外囊泡的回收)、细胞外囊泡的分析。作为操作细胞外囊泡的容器，例如可举出：由塑料(例如，聚丙烯)、玻璃等材质构成的容器，优选由塑料构成的容器。
用本发明的清洗方法清洗过的细胞外囊泡可用于分析。细胞外囊泡的分析，例如可以是细胞外囊泡中包含的成分(EV标志物)的分析。作为EV标志物，例如可举出EV内部标志物和EV表面标志物。作为EV内部标志物，例如可举出：癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen，CEA)、CA125、CA15-3、肌动蛋白家族、TSG101、ALIX、Charged multivesicularbody protein(CHMP)家族、3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase，GAP DH)、聚(ADP―核糖)聚合酶(PARP)家族、AFP、CA19-9、Flotillin-I、Flotilli n-II、Rab蛋白、程序性细胞死亡(programmed cell death，PDCD)6、磷脂爬行酶(phospholipid scramblase，PLSCR)家族、细胞色素C氧化酶(COX)家族、核纤层蛋白家族、增殖细胞核抗原(PCNA)、微管蛋白家族、TATA结合蛋白(TBP)、电压依赖性阴离子通道蛋白(VDAC)、β淀粉样蛋白、tau蛋白。作为EV表面标志物，例如可举出：四跨膜蛋白(细胞外囊泡膜特异性4次穿膜蛋白，例如CD9、CD63、CD81)、细胞外基质金属蛋白酶诱导物质(例如，CD147)、热休克蛋白(HSP)70、HSP90、主要组织相容性复合体(MHC)I、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)1、细胞间粘附分子(ICAM)-1、整联蛋白、神经酰胺、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、膜联蛋白(Annexins)、Caveolin-I、EpCAM。
本发明的清洗方法可以与使用了细胞外囊泡膜结合物质的沉淀法(例如，免疫沉淀法)组合进行。该情况下，可以在通过沉淀法形成细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质(例如，抗体)的复合体(例如，免疫沉淀复合体)后，用EV清洗性非离子性表面活性剂清洗该复合体。即，用EV清洗性非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡可以是用EV清洗性非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体。
本发明中使用的细胞外囊泡膜结合物质是对所述EV表面标志物具有亲和性的物质。作为细胞外囊泡膜结合物质，例如可举出：针对所述EV表面标志物的抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体)及其抗原结合片段、适体、磷脂酰丝氨酸结合蛋白、神经酰胺结合蛋白。抗原结合片段是保持有针对作为对象的EV表面标志物的结合性的抗体片段即可，可举出Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv等。细胞外囊泡膜结合物质优选为抗体或其抗原结合片段，更优选为单克隆抗体或其抗原结合片段。此外，本发明中使用的细胞外囊泡膜结合物质可以单独使用或组合多个使用。
细胞外囊泡膜结合物质可以与固相结合以使得细胞外囊泡的分离易于进行。作为固相，例如可使用：琼脂糖凝胶珠、琼脂糖珠、磁性珠(磁性粒子)或塑料板。细胞外囊泡膜结合物质在固相上的固定化可通过本领域技术人员周知的常规方法进行。
3.细胞外囊泡纯化物的制造方法
本发明还提供细胞外囊泡纯化物的制造方法。
本发明的制造方法包含以下的步骤：
(1)用“EV清洗性非离子性表面活性剂”清洗细胞外囊泡；和
(2)分离清洗过的细胞外囊泡。
步骤(2)中的细胞外囊泡的分离，例如可通过使用了细胞外囊泡膜结合物质的沉淀法或超速离心法进行。通过沉淀法或超速离心法使细胞外囊泡沉淀，接着，可通过回收沉淀物或废弃上清，来回收细胞外囊泡。沉淀物的回收可通过该领域中公知的任意方法(例如，磁性粒子的集磁、琼脂糖凝胶珠的离心分离)进行。分离优选为提纯或纯化。
在通过沉淀法进行步骤(2)中的细胞外囊泡的分离的情况下，细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体的形成可以在步骤(2)之前进行。即，在这种情况下，本发明的制造方法可以通过包含以下内容的步骤进行：
(1’)用细胞外囊泡膜结合物质对细胞外囊泡进行处理，形成细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体；
(2’)用“EV清洗性非离子性表面活性剂”清洗细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体；和
(3’)分离细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体。
在本发明的制造方法中，细胞外囊泡纯化物可以以细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体的形态获得，也可以以游离的细胞外囊泡的形态获得。为了以游离的方式获得细胞外囊泡纯化物，本发明的制造方法可以包含使细胞外囊泡从复合体中解离的步骤。细胞外囊泡从复合体的解离可以通过该领域中公知的任意方法进行。
本发明的制造方法中使用的“EV清洗性非离子性表面活性剂”的种类、使用“EV清洗性非离子性表面活性剂”的处理中的各条件和细胞外囊泡膜结合物质如本发明的清洗方法中所定义的。
本发明的制造方法可用作细胞外囊泡的回收、提纯或纯化方法。
由本发明的制造方法制造得到的细胞外囊泡纯化物由于杂质的混入量降低，因此例如，可以作为分析对象而用于分析，也可以作为EV标准品使用。
4.细胞外囊泡的分析方法
本发明还提供细胞外囊泡的分析方法。
本发明的分析方法包含对由本发明的清洗方法清洗了的细胞外囊泡或由本发明的制造方法制造得到的细胞外囊泡纯化物(以下，将这些称为“本发明中得到的细胞外囊泡”)进行分析。
细胞外囊泡的分析可以是对细胞外囊泡中包含的成分(例如，EV内部标志物、EV表面标志物)的分析，也可以是对细胞外囊泡本身的粒子的分析。细胞外囊泡的分析优选为对细胞外囊泡中包含的成分的分析，更优选为对EV内部标志物的分析。本发明中得到的细胞外囊泡，由于杂质的混入量降低，因此能够适宜地用于对细胞外囊泡中包含的成分(例如，EV内部标志物)的分析。
在对细胞外囊泡中包含的成分进行分析的情况下，分析是对成分的检测或定量。并且这样的分析是单成分或多个成分的分析。作为待分析的成分，例如可举出：蛋白质、核酸(例如，RNA、DNA)、糖、脂质、氨基酸、维生素类、聚胺和肽。
成分的分析可通过该领域中公知的任意方法进行。
在待分析的成分为蛋白质的情况下，作为分析方法，例如可举出免疫测定、质谱法。作为免疫测定，例如可举出直接竞争法，间接竞争法和夹心法。此外，作为这样的免疫测定，可举出：化学发光免疫测定(CLIA)[例如，化学发光酶免疫测定法(CLEIA)]、免疫比浊法(TIA)、酶免疫测定法(EIA)(例如，直接竞争ELISA、间接竞争ELISA和夹心ELISA)、放射免疫测定(RIA)、乳胶凝聚反应法、荧光免疫测定(FIA)、免疫层析法、蛋白质印迹法、免疫染色和荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)。在对多个成分进行分析的情况下，可以进行蛋白质组学分析。
在待分析的成分为核酸的情况下，作为分析方法，例如可举出：使用探针的杂交法、使用逆转录酶的逆转录(RT)反应、使用引物(例如，2、3或4个引物)的核酸扩增法(例如，定量PCR、RT-PCR等PCR法)、测序、质谱法。
在待分析的成分为蛋白质和核酸以外的成分的情况下，作为分析方法，例如可举出免疫测定、质谱法。在对多个成分进行分析的情况下，可以进行代谢组学分析。
本发明的分析方法可用于对细胞外囊泡中包含的标志物的检测。作为细胞外囊泡中包含的标志物，可举出所述EV标志物(例如，EV内部标志物和EV表面标志物)。
细胞外囊泡本身(粒子)的分析，例如可通过粒子分析机器、电子显微镜、流式细胞仪(Flowcytometer)等机器进行。该情况下，可对细胞外囊泡的粒子数、粒子的尺寸和形状以及它们的分布进行分析。
就本发明的分析方法而言，例如在对EV内部标志物进行分析的情况下，可以进一步包含破坏本发明中得到的细胞外囊泡。在这样的情况下，本发明的分析方法通过包含以下内容的步骤进行：
(1)破坏本发明中得到的细胞外囊泡；和
(2)对被破坏的细胞外囊泡的细胞外囊泡内部标志物进行检测。
细胞外囊泡的破坏，例如可举出：化学物质的处理导致的破坏、物理动作的处理导致的破坏或这些的组合。作为化学物质，例如可举出细胞外囊泡破坏性物质。作为细胞外囊泡破坏性物质，例如可使用所述EV破坏性表面活性剂。作为细胞外囊泡的破坏中使用的EV破坏性表面活性剂，优选为所述EV清洗性非离子性表面活性剂(例如，醇乙氧基化物、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)以外的表面活性剂，更优选为HLB小于15的非离子性表面活性剂或碳链的碳原子数为11以上的离子性表面活性剂。作为物理动作，例如可举出加压。
5.试剂盒
本发明还提供试剂盒，其包含：
(1)EV清洗性非离子性表面活性剂；和
(2)细胞外囊泡膜结合物质。
本发明的试剂盒可以进一步包含(3)细胞外囊泡内部标志物结合物质。此外，本发明的试剂盒还可以进一步包含(4)EV破坏性表面活性剂。
本发明的试剂盒中包含的EV清洗性非离子性表面活性剂、细胞外囊泡膜结合物质、细胞外囊泡内部标志物结合物质和EV破坏性表面活性剂如上所述。就本发明的试剂盒而言，例如可用于简便地实施本发明的清洗方法、本发明的回收方法、本发明的制造方法和本发明的分析方法。
实施例
以下，参照实施例说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
(实施例1：固相抗体和标记抗体的制备和EV表面标志物的测定方法)
(1)抗体固相化粒子(固相抗体)的制备
向10mM MES缓冲液(pH5.0)中的磁性粒子0.01g/mL中，添加分别识别作为细胞外囊泡(EV)表面标志物的CD9、CD63和CD81的小鼠抗CD9单克隆抗体(FUJIREBIO公司)、小鼠抗CD63单克隆抗体(FUJIREBIO公司)或小鼠抗CD81单克隆抗体(FUJIREBIO公司)0.2mg/mL，在25℃下缓慢搅拌并孵化1小时。在反应后，使磁性粒子集磁，用清洗液(50mM Tris缓冲液，150mM NaCl2，2.0％BSA，pH7.2)清洗粒子，得到抗CD9抗体固相化粒子、抗CD63抗体固相化粒子和抗CD81抗体固相化粒子。将各抗体固相化粒子悬浮于粒子稀释液(50mM Tris缓冲液，1mM EDTA·2Na，0.1％NaN3，2.0％BSA，pH7.2)中，得到各抗体固相化粒子溶液。
(2)碱性磷酸酶标记抗体的制备
将脱盐的碱性磷酸酶(ALP)和N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)-琥珀酰亚胺(GMBS)(终浓度0.3mg/mL)混合，在30℃下静置1小时以进行马来酰亚胺化。接着，在偶联用反应液(100mM磷酸缓冲液，1mM EDTA·2Na，pH6.3)中，以1:1的摩尔比将Fab’化的小鼠抗CD9单克隆抗体、小鼠抗CD63单克隆抗体或小鼠抗CD81单克隆抗体与马来酰亚胺化ALP混合，在25℃下反应1小时。使用Superdex200柱层析(General Electric公司)纯化反应液，得到ALP标记抗CD9抗体、ALP标记抗CD63抗体和ALP标记抗CD81抗体。将各ALP标记抗体悬浮于标记体稀释液(50mM MES缓冲液，150mM NaCl2，0.3mM ZnCl2，1mM MgCl2，0.1％NaN3，2.0％BSA，pH6.8)中，得到各标记抗体溶液。
(3)EV表面标志物(CD9、CD63和CD81)的测定方法
以下实施例中的EV表面标志物(CD9、CD63和CD81)的测定方法如下。
将测定用样品20μL分装至反应槽中，并分装50μL抗CD9抗体固相化粒子溶液、抗CD63抗体固相化粒子溶液或抗CD81抗体固相化粒子溶液，进行搅拌。然后，在37℃下孵育8分钟，进行B/F分离·清洗。将与固相化抗体对应的ALP标记抗体50μL分装至反应槽中，在搅拌后，在37℃下孵育8分钟，进行B/F分离·清洗。然后，将包含作为化学发光基质的3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷·2钠盐(AMPPD)的LUMIPULSE(注册商标)基质液(FUJIREBIO公司)200μL分装至反应槽中，在搅拌后，在37℃下孵育4分钟，然后用光度计测定发光量。实际的测定通过全自动化学发光酶免疫测定系统(LUMIPULSE L2400(FUJIREBIO公司))进行。
在磁性粒子上固相化的抗体和ALP标记抗体使用识别相同表位的抗体。由于在一个细胞外囊泡上存在多个CD9、CD63或CD81，因此通过将识别与固相化抗体相同表位的抗体用作ALP标记抗体的夹心免疫测定，能够测定细胞外囊泡及其标志物。
(实施例2：基于EV表面标志物测定的EV难破坏性表面活性剂和EV破坏性表面活性剂的筛选)
将EV表面标志物作为指标，测定各种表面活性剂对细胞外囊泡的影响，进行EV难破坏性表面活性剂和EV破坏性表面活性剂的筛选。
向500μL的人血清检体中添加250μL的包含0.1w/v％的各表面活性剂的、含EDTA和EGTA的PBS(EDTA/EGTA/PBS)(与血清检体混合后的EDTA和EGTA的终浓度分别为50mM，pH7.4)。使混合液在37℃下旋转反应30分钟，用作测定用样品。然后，根据实施例1(3)的测定方法对测定用样品中的CD9、CD63或CD81的反应性(EV表面标志物测定量)进行测定。作为对照组，使用不包含表面活性剂的EDTA/EGTA/PBS。根据得到的计数值，求出添加了各表面活性剂时的计数值与对照组的计数值的比(影响率％)。
将结果示于表2。在与对照组相比，反应性降低20％以上(影响率低于80％)情况下，判断为细胞外囊泡破裂，判断使用的表面活性剂是EV破坏性表面活性剂。在反应性未降低20％以上的(影响率为80％以上)情况下，判断使用的表面活性剂是不影响细胞外囊泡的表面活性剂(EV难破坏性表面活性剂)。
[表2-1]
表2.基于将对EV表面标志物测定量的影响作为指标的EV破坏性，筛选EV破坏性表面活性剂和EV难破坏性表面活性剂
[表2-2]
表2.(续)
*数字表示疏水部侧链为烷基链时的碳原子数。
**制造商的数据表中记载的值超过20。
由该结果可知，HLB为15以上的非离子性表面活性剂和碳链的碳原子数为10以下的直链离子性表面活性剂存在成为不破坏细胞外囊泡的表面活性剂(EV难破坏性表面活性剂)的倾向。这些表面活性剂可成为细胞外囊泡清洗用表面活性剂的候补。另一方面发现，HLB小于15的非离子性表面活性剂、碳链的碳原子数为11以上的离子性表面活性剂存在成为效率良好地破坏EV的表面活性剂(EV破坏性表面活性剂)的倾向。这些表面活性剂可用于细胞外囊泡的破坏。
(实施例3：基于EV内部标志物测定的、表面活性剂的浓度依赖性EV破坏性和EV难破坏性的研究)
将EV内部标志物作为指标，测定对于EV的破坏性和难破坏性而言、各种表面活性剂的浓度依赖性影响。
将以无血清培养基培养3天的人结肠腺癌细胞DU-145的培养上清在2000×g、4℃下离心5分钟，通过0.22μm过滤器(MILLIPORE公司)过滤上清后，使用Amicon Ultra-15(MILLIPORE公司)浓缩。将浓缩的样品在20000×g、4℃下离心15分钟。接下来，将该上清在100000×g、4℃下离心1小时。弃去上清，添加PBS(pH7.4)或50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(含有50mM EDTA和50mM EGTA的PBS，pH7.4)，使沉淀物再悬浮。进行再悬浮后，在150000×g、4℃下离心1小时。弃去上清，新添加PBS或50mM EDTA/50mM EGTA/PBS，使沉淀物再悬浮，得到EV(DU-145)。EV(DU-145)的浓度通过Qu bit Protein Assay(Thermo Fisher Scientific公司)进行。将63μg/mL的EV(DU-145)10μL和表面活性剂溶液(浓度参见表中)10μL混合。在室温下反应30分钟后，添加LUMIPULSE检体稀释液(FUJIREBIO公司)190μL。根据附加协议，使用LUMIPULSE PRESTO CEA试剂(FUJIREBIO公司)和LUMIPULS E PRESTO CA125-II试剂(FUJIREBIO公司)，通过LUMIPULSE L2400(FUJ IREBIO公司)测定该样品中包含的EV内部标志物(CEA和CA125)。
将结果示于表3。与未添加表面活性剂比较，反应性(EV表面标志物测定量)提高20％以上时，判断为EV(DU-145)的膜被破坏、EV内部抗原(CEA、CA125)流出，判断使用的表面活性剂为EV破坏性表面活性剂。
[表3]
表3.表面活性剂的浓度依赖性EV破坏性和EV难破坏性的研究
由该结果可知，在HLB为15以上的非离子性表面活性剂中，Tergitol类和Pluronic类、碳链的碳原子数为10以下的直链离子性表面活性剂的C8TA B是不会破坏EV(DU-145)、EV中的抗原不会流出的表面活性剂(EV难破坏性表面活性剂)。另一方面，可以明确地看出，即使是HLB为15以上的非离子性表面活性剂，Tween(注册商标)20、Tween80也具有破坏EV(DU-145)的效果(EV破坏性)。
(实施例4：在EV操作系统中，非离子性表面活性剂对检体成分的容器吸附的抑制效果的研究)
将残留总蛋白量作为指标，研究在EV操作系统中，非离子性表面活性剂对检体成分的容器吸附的抑制效果。
在聚丙烯制1.5mL管(QSP制)(以下，称为“反应管”)中，向500μL的人血清检体中添加250μL的包含1.5w/v％的各非离子性表面活性剂的EDTA/EG TA/PBS。使用的表面活性剂为：Tween20、Triton-X100、Tergitol15-s-30、Brij35、Brij58、PluronicF68、C8TAB、NSS、C8APS、NDSB-195、NDSB-256。使反应液在反应管中在37℃下旋转反应30分钟，然后，从反应管中除去反应液。以PBS为清洗液将除去了反应液的反应管清洗5次。将各清洗后的清洗液分别转移至单独的新管中，将这些作为“清洗部分1～5”。将5次清洗后的空的反应管作为“反应后容器”。将反应后容器和清洗部分用于BCA测定(Thermo Fisher Scientific公司)。向反应后容器中添加BCA溶液1mL，在37℃下反应30分钟。就清洗部分1～5而言，在20μL中添加BCA溶液200μL，在37℃下反应30分钟。反应后，用酶标仪(TECAN公司制)测定562nm的吸光度，测定总蛋白量。
将结果示于表4。通过添加任何经过评价的非离子性表面活性剂，清洗部分中溶出的总蛋白量降低，容器中残留的总蛋白量减少。
[表4]
表4.基于各种表面活性剂的检体成分的容器吸附抑制效果的确认
从该结果表明，将非离子性表面活性剂添加至反应液中，能够降低取得的EV样品中的杂质的混入。
(实施例5：在通过免疫沉淀进行的EV回收中，非离子性表面活性剂对检体成分的容器吸附的抑制效果的研究)
将残留总蛋白量作为指标，研究在通过免疫沉淀进行的EV回收中，非离子性表面活性剂对检体成分的清洗效果。
在聚丙烯制1.5mL管(QSP制)(以下，称为“反应管”)中，向500μL的人血清检体中添加250μL的EDTA/EGTA/PBS，添加抗CD9抗体固相化粒子，并使得其浓度为0.15w/v％。使反应液在反应管中在37℃下旋转反应30分钟，然后，进行集磁，分离上清。以包含0.05w/v％的各表面活性剂的PBS作为清洗液将反应后的磁性粒子清洗5次。使用的表面活性剂与实施例4同样。将各清洗后的清洗液分别转移至单独的新管中，将这些作为“清洗部分1～5”。将清洗后的磁性粒子转移至另一个新管中。用各条件的清洗液清洗1次反应管，以此作为“免疫沉淀后容器”。将免疫沉淀后容器和清洗部分1～5用于BCA测定(Thermo Fisher Scientific公司)。在免疫沉淀后容器中添加BCA溶液1mL，在37℃下反应30分钟。就清洗部分而言，在20μL中添加BCA溶液200μL，在37℃下反应30分钟。反应后，用酶标仪(TECAN公司制)测定562nm的吸光度，测定总蛋白量。
将结果示于表5。通过向清洗液中添加任何经过评价的非离子性表面活性剂，清洗部分中溶出的总蛋白量存在上升倾向，容器中残留的总蛋白量减少。特别是，Tween20、TritonX-100、Tertitol15-S-30、Brij35、Brij58显示出较高的清洗效果。
[表5]
表5.各种表面活性剂在清洗时的作用的确认
从该结果发现，添加了非离子性表面活性剂的清洗使取得的EV样品中的杂质的混入降低。
(实施例6：在通过免疫沉淀进行的EV回收中，非离子性表面活性剂的清洗效果的浓度依赖性的研究)
将残留总蛋白量作为指标，对在通过免疫沉淀进行的EV回收中，非离子性表面活性剂的清洗效果的浓度依赖性进行评价。
在聚丙烯制1.5mL管(QSP制)(以下，称为“反应管”)中，向500μL的人血清检体中添加250μL的EDTA/EGTA/PBS，向其中添加抗CD9抗体固相化粒子，并使得其浓度为0.15w/v％。使反应液在反应管中在37℃下旋转反应30分钟，然后，集磁，将上清转移至另一个新管中。将以各浓度(0w/v％、0.01w/v％、0.05w/v％、0.1w/v％、0.25w/v％、0.5w/v％、1.0w/v％)包含Tergitol15-s-30或PluronicF68的PBS作为清洗液将反应后的磁性粒子清洗5次。将清洗后的磁性粒子转移至另一个新管中。用各条件的清洗液清洗1次反应管，以此作为“免疫沉淀后容器”。将免疫沉淀后容器用于BCA测定(Thermo Fis her Scientific公司)。在免疫沉淀后容器中添加BCA溶液1mL，在37℃下反应30分钟。反应后，用酶标仪(TECAN公司制)测定562nm的吸光度，测定总蛋白量。
将结果示于表6和图1。通过向清洗液中以0.01％以上添加Tergitol15-s-30或pluronicF68，吸附在容器上的检体成分(残留总蛋白)的量降低，显示出清洗效果。特别是，Tergitol15-s-30显示出较高的清洗效果。
[表6]
表6.Tergitol或pluronic的浓度依赖性清洗效果的比较
从该结果发现，添加了Tergitol15-s-30的清洗进一步使取得的EV样品中的杂质的混入降低。
(实施例7：从检体中回收EV时的清洗效果的研究)
进行从检体中回收EV时的清洗效果的研究。
在聚丙烯制1.5mL管(QSP制)(以下，称为“反应管”)中，向500μL的人血清检体中添加250μL的EDTA/EGTA/PBS，向其中添加抗CD9抗体固相化粒子，并使得其浓度为0.15w/v％。使反应液在反应管中在37℃下旋转反应30分钟，然后，集磁，将上清转移至另一个新管中。将得到的上清作为“SUP样品”。以PBS(pH7.4)或含Tergitol15-s-30的PBS(0.05w/v％Tergitol15-s-30，pH7.4)作为清洗液将反应后的磁性粒子清洗5次。将各清洗后的清洗液分别转移至单独的新管中，将这些作为“清洗部分1～5”。将清洗后的磁性粒子转移至另一个新管中，作为“免疫沉淀后粒子”。用各条件的清洗液清洗1次反应管，以此作为“免疫沉淀后容器”。将免疫沉淀后粒子、免疫沉淀后容器和清洗部分用于BCA测定(Thermo FisherScientific公司)。向免疫沉淀后粒子和免疫沉淀后容器中添加BCA溶液1mL，在37℃下反应30分钟。就清洗部分1～5而言，在20μL中添加BCA溶液200μL，在37℃下反应30分钟。反应后，用酶标仪(TECAN公司)测定562nm的吸光度，测定总蛋白量。对于SUP样品和清洗部分，使用LUMIPULSE PRESTO CEA试剂(FUJIREBIO公司)，通过LUMIPULSE L2400(FUJIREBIO公司)测定CEA量。
将基于BCA测定的总蛋白量测定的结果示于表7，将CEA量测定的结果示于表8。通过向清洗液中添加Tergitol15-s-30，与无添加的情况相比，清洗部分中溶出的总蛋白量上升，并且免疫后容器中残留的总蛋白量减少至62.3％。此外，通过向清洗液中添加Tergitol15-s-30，清洗部分中溶出的CEA量上升，容器中残留的CEA量减少。
[表7]
表7.基于总蛋白量测定的清洗效果的确认
[表8]
表8.基于CEA量测定的清洗效果的确认
从这些结果发现，添加了Tergitol15-s-30的清洗使取得的EV样品中的杂质的混入降低。
(实施例8：基于EV标志物测定的清洗效果的确认)
从检体中回收EV，使其破碎，测定EV中的标志物。
在聚丙烯制1.5mL管(QSP制)(以下，称为“反应管”)中，向500μL的人血清检体中添加250μL的EDTA/EGTA/PBS，将得到的溶液作为“原液样品”。向原液样品添加抗CD9抗体固定化粒子、抗CD63抗体固定化粒子、抗CD81抗体固定化粒子或这些的混合物，并使得其浓度为0.15w/v％。使反应液在反应管中在37℃下旋转反应30分钟，然后，集磁，将上清转移至另一个新管中。将这些作为“SUP样品”。以包含0.05％的Tergitol15-S-30的PBS作为清洗液将反应后的磁性粒子清洗5次。将各清洗后的清洗液分别转移至单独的新管中，将这些作为“清洗部分1～5”。向包含清洗后的磁性粒子的容器(反应管)中添加Lysis Buffer(D-PBS(-)，150mM NaCl，1.0％N-月桂酰基肌氨酸钠，2.0％N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内盐，pH7.4)20μL。在室温下反应5分钟，溶解细胞外囊泡。然后，集磁，将上清稀释在180μL的LUMIPULSE检体稀释液(FUJIREBIO公司)中，得到“Lysis样品”。
首先，为了确认通过使用了与EV表面标志物(CD9、CD63和CD81)特异性结合的抗体的免疫沉淀法而回收了原液样品中的细胞外囊泡，而通过实施例1的测定方法测定原液样品和SUP样品中的EV表面标志物。作为空白，以同样的方式测定LUMIPULSE检体稀释液(FUJIREBIO公司)。根据得到的计数值，求出EV回收率(＝(1-(SUP样品-空白)/(原液样品-空白))×100(％))。
将结果示于表9。其结果，通过分别使用了抗CD9抗体、抗CD63抗体和抗CD81抗体的免疫沉淀法而回收的EV的回收率均超过90％，由此出发，确认了可通过免疫沉淀回收血清检体中的EV。并且确认了可通过全自动化学发光酶免疫测定系统对EV的回收效率进行评价。
[表9]
表9.检体中的EV中的CEA检测
接下来，以与实施例3同样的方式测定原液样品、SUP样品和Lysis样品的CEA的反应性。在该测定中，将通过使用了抗CD9抗体固定化粒子、抗CD63抗体固定化粒子和抗CD81抗体固定化粒子的混合物的免疫沉淀法而得到的样品用作SUP样品和Lysis样品。此外，为了确认Lysis样品的CEA的反应性是CEA特异性的反应，而进行抑制试验。具体而言，将识别与LUMI PULSE PRESTO CEA试剂中使用的抗CEA抗体的表位区域相同区域的抗体添加至CEA试剂中，以与实施例3同样的方式测定CEA(抑制计数)。
将结果示于表10。测定CEA的结果，原液样品和SUP样品的发光强度为约2000000计数，由此出发，确认了血清检体中包含大量CEA。另一方面，Lysis样品的发光强度为2025计数，与血清检体中包含的CEA相比，EV来源的CEA量非常少，这显示了能够通过本发明的方法对EV来源的CEA进行测定。再次测定CEA，其结果，Lysis样品的计数值为1950计数，确认了再现性。
[表10]
表10.检体中的EV中的CEA检测
抑制试验的结果，Lysis样品的发光强度为890计数。抑制率(＝((1-(抑制计数-空白计数)/(Lysis样品的计数-空白计数))×100(％))为90％以上，由此出发，确认了Lysis样品的CEA的反应性是CEA特异性的反应。再次进行同样的实验，溶解的反应性为1589计数，在抑制试验中为837计数，抑制率为90％以上，确认了再现性。
此外，使用未结合抗体的磁性粒子(未感作粒子)，进行同样的试验，其结果，Lysis样品的发光强度为824计数，未显示对CEA的反应性。因此，发现通过将给定的非离子性表面活性剂添加至清洗液中，还能够抑制检体中包含的CEA对磁性粒子的非特异性的吸附。
从这些结果可知，通过将给定的非离子性表面活性剂添加至清洗液中，能够特异性地从人检体中提取细胞外囊泡，并且能够特异性地检测细胞外囊泡中的CEA。
Claims (18)
1.一种细胞外囊泡的清洗方法，其包含：
用非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡，所述非离子性表面活性剂为包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H表示的结构的链状化合物，式中，x为1～300。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述非离子性表面活性剂为醇乙氧基化物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，
醇乙氧基化物为式(I)表示的化合物：
[化学式1]
式中，x为15～100；
y为0以上的整数；
z为0以上的整数；
y≥z；
y+z为5～30。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，
醇乙氧基化物为HLB为15以上或碳链的碳原子数为16以下的醇乙氧基化物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述非离子性表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物为式(III)表示的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物：
[化学式2]
HO-(-CH2-CH2-O-)x2-((-CH(-CH3))CH2-O-)y2-(-CH2-CH2-O-)z2-H (III)
式中，x2为1以上的整数；
y2为10～100；
z2为1以上的整数；
x2+z2为20～300。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
用0.001～10.0w/v％的所述非离子性表面活性剂处理细胞外囊泡。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
细胞外囊泡为外泌体。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
用所述非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡是指：用所述非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
细胞外囊泡膜结合物质是针对四跨膜蛋白的抗体。
11.一种细胞外囊泡纯化物的制造方法，其包含：
(1)用非离子性表面活性剂清洗细胞外囊泡，所述非离子性表面活性剂为包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H表示的结构的链状化合物，式中，x为1～300；和
(2)分离清洗过的细胞外囊泡。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，
所述非离子性表面活性剂为醇乙氧基化物或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其通过包含以下内容的步骤进行：
(1’)用细胞外囊泡膜结合物质对细胞外囊泡进行处理，形成细胞外囊泡与细胞外囊泡膜结合物质的复合体；
(2’)用所述非离子性表面活性剂清洗所述复合体；和
(3’)分离所述复合体。
14.一种细胞外囊泡的分析方法，其包含：
对通过权利要求1～10中任一项所述的方法清洗了的细胞外囊泡或通过权利要求11～13中任一项所述的方法制造得到的细胞外囊泡纯化物进行分析。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，
通过检测细胞外囊泡内部标志物来进行分析。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，
细胞外囊泡内部标志物为癌胚抗原(CEA)或CA125。
17.根据权利要求14～16中任一项所述的方法，其通过包含以下内容的步骤进行：
(1)破坏通过权利要求1～10中任一项所述的方法清洗了的细胞外囊泡或通过权利要求11～13中任一项所述的方法制造得到的细胞外囊泡纯化物；和
(2)对被破坏的细胞外囊泡的细胞外囊泡内部标志物进行检测。
18.一种试剂盒，其包含：
(1)非离子性表面活性剂，其为包含-O-(-CH2-CH2-O-)x-H表示的结构的链状化合物，式中，x为1～300；和
(2)细胞外囊泡膜结合物质。
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