WO2020235566A1 - 細胞外小胞の洗浄方法 - Google Patents

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WO2020235566A1
WO2020235566A1 PCT/JP2020/019808 JP2020019808W WO2020235566A1 WO 2020235566 A1 WO2020235566 A1 WO 2020235566A1 JP 2020019808 W JP2020019808 W JP 2020019808W WO 2020235566 A1 WO2020235566 A1 WO 2020235566A1
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extracellular
extracellular vesicles
nonionic surfactant
extracellular vesicle
polyoxyethylene
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然 顧
芙美 淺井
達俊 犬塚
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合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所
富士レビオ株式会社
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    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA

Definitions

  • the present invention relates to a method for cleaning extracellular vesicles and the like.
  • Extracellular vesicles are minute vesicles having a membrane structure secreted from various types of cells, and are present in body fluids such as blood or in cell culture fluids. Extracellular vesicles secreted extracellularly include exosomes, exosomes, and apoptotic blebs. Since extracellular vesicles are a diverse population containing various substances responsible for functions such as signal transduction between cells, they have been analyzed for purposes such as diagnosis and drug discovery. Therefore, there is a need to develop a method for cleaning extracellular vesicles that is useful for such analysis. For example, Patent Document 1 describes a method for separating EVs, which reduces aggregation between solid phase carriers by adding a nonionic surfactant during immunoprecipitation and / or washing.
  • the substance When detecting a substance contained in EV in a sample such as body fluid, the substance may be present in large amounts outside the EV in the sample. Generally, the amount of the target substance contained in the EV is very small compared to the amount of the same substance present outside the EV in the sample. Therefore, when detecting or measuring the target substance in the EV recovered from the sample, the substance that is abundant outside the EV in the body fluid is mixed as a contaminant and becomes a background, so that the target substance in the EV Is difficult to detect or measure. For example, it has been reported that measuring CEA, which is a cancer marker in EV, improves diagnostic performance, but when detecting or measuring CEA in EV derived from a blood sample, CEA becomes EV in the blood sample.
  • CEA which is a cancer marker in EV
  • CEA outside the EV is adsorbed on the surface of the EV or the surface of the container as a contaminant, it is not possible to accurately detect or measure the CEA inside the EV, which is the target substance, because it is contained in a very large amount.
  • an object of the present invention is to develop a method capable of reducing contamination with impurities in a system for manipulating extracellular vesicles.
  • the present inventors have conducted cleaning of the EV with a cleaning solution containing a predetermined nonionic surfactant, thereby contaminating substances such as the same target substance contained outside the EV (eg, detection or measurement). We have found that it is possible to reduce the amount of the same substance as the target substance), and have completed the present invention.
  • the extracellular vesicle is a chain compound containing a structure represented by -O- (-CH 2- CH 2- O-) x- H [where x is 1 to 300 in the formula].
  • a method of cleaning extracellular vesicles which comprises washing with a nonionic surfactant.
  • Washing the extracellular vesicles with the nonionic surfactant can be achieved by washing the complex of the extracellular vesicles and the extracellular vesicle membrane-binding substance with the nonionic surfactant.
  • a method for producing an extracellular vesicle purified product which comprises the following: (1) The extracellular vesicle is a chain compound containing a structure represented by -O- (-CH 2- CH 2- O-) x- H [where x is 1 to 300 in the formula]. Washing with some nonionic surfactant; and (2) separating the washed extracellular vesicles. [12] The method of [11], wherein the nonionic surfactant is alcohol ethoxylate or a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer.
  • [13] The method of [11] or [12], which is carried out by a step including the following: (1') Treatment of extracellular vesicles with an extracellular vesicle membrane-binding substance to form a complex of extracellular vesicles and extracellular vesicle membrane-binding substance; (2') Washing the complex with the nonionic surfactant; and (3') Separating the complex. [14] Analyzing extracellular vesicles washed by any of the methods [1] to [10] or extracellular vesicle purified products produced by any of the methods [11] to 13]. A method for analyzing extracellular vesicles, including.
  • the extracellular vesicle internal marker is carcinoembryonic antigen (CEA) or CA125.
  • a kit that includes: (1) -O- (-CH 2- CH 2- O-) x- H [in the formula, x is 1 to 300] is a chain compound containing a structure represented by a nonionic interface. Activator; and (2) extracellular vesicle membrane-binding substance.
  • the present invention by washing the extracellular vesicles with a predetermined nonionic surfactant, contamination with impurities can be reduced.
  • contamination obstacles such as background in the detection or measurement of extracellular vesicle markers are reduced, and the accuracy of detection or measurement is improved. Therefore, the present invention is useful for highly accurate analysis or diagnosis when using an extracellular vesicle marker as an index.
  • the present invention is also useful for collecting extracellular vesicles as samples for highly accurate analysis or diagnosis.
  • FIG. 1 is a graph showing a concentration-dependent comparison of the cleaning effect of Tergitol 15-s-30 and Pluronic F68 in EV recovery using the residual total protein as an index in Example 6.
  • a plurality of types of surfactants can be used according to one or more purposes (eg, cleaning of EV, destruction of EV). Therefore, in order to presuppose the selection of a surfactant suitable for each purpose, the surfactants are classified based on chemical properties (ionic properties of hydrophilic portions) and functional properties (characteristics / applications for EV). ..
  • surfactants are nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and based on the ionic properties of the hydrophilic moiety. It can be classified as an amphoteric surfactant. Hereinafter, each surfactant will be illustrated.
  • Nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alcohol structure-containing nonionic surfactant (eg, alcohol ethoxylate, polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer), and poly.
  • Oxyethylene sorbitan fatty acid esters eg, TWEEN® series (eg, TWEEN20, TWEEN40, TWEEN80)
  • polyoxyethylene octylphenyl ethers eg, TRITON® series (eg, Triton X-100, Triton X)).
  • TRITON® series eg, Triton X-100, Triton X
  • ND-gluco-N-methylalcanamides eg, MEGA series (eg, MEGA 8, MEGA 10)).
  • Polyoxyethylene alcohols structure-containing nonionic surfactant -O - (- CH 2 -CH 2 -O-) wherein, x is from one or more of an integer] x -H expressed in It is a chain compound (compound not containing a cyclic structure) containing a structure (hereinafter referred to as “polyoxyethylene alcohol structure”).
  • a compound may be either a linear compound or a branched chain compound.
  • Such compounds may consist of single bonds or may contain multiple bonds.
  • Such compounds may contain one or more polyoxyethylene alcohol structures (eg, 2, 3, 4).
  • Examples of the structure other than the polyoxyethylene alcohol structure in such a compound include an alkylene structure (straight chain or branched chain) and a polyoxyalkylene structure (straight chain or branched chain). Such compounds may consist of carbon atoms, hydrogen atoms, and oxygen atoms. Examples of such compounds include alcohol ethoxylates and polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymers (eg, polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers).
  • Alchol ethoxylate refers to a group of compounds represented by the following formula (I).
  • the portion represented by "H- (-CH 2- ) y- CH- (-CH 2- ) z- H” is referred to as "hydrophobic side chain", "carbon chain”, or “alkyl”. Sometimes called “chain” or the like.
  • the number of carbon atoms in the side chain of the hydrophobic portion corresponds to y + z + 1.
  • the portion represented by "-(-CH 2- CH 2- O-) x- H” may be referred to as "hydrophilic side chain” or "ethoxylate chain”.
  • alcohol ethoxylates examples include branched-chain alcohol ethoxylates and straight-chain alcohol ethoxylates.
  • the branched-chain alcohol ethoxylate corresponds to a compound represented by the above formula (I) in which y is an integer of 1 or more and z is an integer of 1 or more.
  • Examples of the branched alcohol ethoxylate include polyoxyethylene (3) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (7) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (9) sec-tridecyl ether, and polyoxyethylene (). 12) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (15) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (20) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (30) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (40) Examples include sec-tridecyl ether.
  • the branched-chain alcohol ethoxylates include, for example, commercially available products, Trademark15-S-3, Trademark15-S-5, Trademark15-S-7, Trademark15-S-9, Trademark15-S-12, Trademark15-S-15, Examples thereof include compounds of the TERGITOR® series such as Tergitol15-S-20, Tergitol15-S-30, and Tergitol15-S-40.
  • the number of carbon atoms (y + z + 1) of the alkyl chain is 11 to 15 (average 13), and the number after "S" in the system name is the number of ethylene oxide units of the ethoxylate chain (x). Represents.
  • the linear alcohol ethoxylate corresponds to the compound represented by the above formula (I) in which z is 0.
  • Examples of the linear alcohol ethoxylate include polyoxyethylene (4) lauryl ether, polyoxyethylene (23) lauryl ether, polyoxyethylene (20) cetyl ether, and polyoxyethylene (20) stearyl ether.
  • Examples of commercially available products of linear alcohol ethoxylates include BRIJ® series compounds such as Brij30, Brij35, Brij58, and Brij78.
  • the linear alcohol ethoxylate can also be expressed as the following formula (II).
  • Polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer refers to a block copolymer containing a polyoxyethylene block and a polyoxyalkylene block.
  • Examples of the polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer include a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer.
  • Polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer refers to a group of compounds represented by the following formula (III).
  • x2, y2, and z2 are integers of 1 or more.
  • polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer examples include poloxamer 182, poloxamer 108, poloxamer 188, poloxamer 217, poloxamer 237, poloxamer 238, poloxamer 288, poloxamer 388, and poloxamer 407.
  • Commercially available products of polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers include, for example, Pluronic L62, Pluronic F38, Pluronic F68, Pluronic F77, Pluronic F87, Pluronic F88, Pluronic F98, Pluronic F98, Pluronic F108, Pluronic F108, Pluronic F108 ) Series of compounds.
  • Cationic Surfactant examples include a quaternary ammonium salt.
  • the salt examples include salts with halogens (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine).
  • Examples of the quaternary ammonium salt include Cnalkyltrimethylammonium bromide (CnTAB) and Cnalkyltrimethylammonium chloride (CnTAC).
  • CnTAB examples include octyltrimethylammonium bromide (C8TAB), nonyltrimethylammonium bromide (C9TAB), dodecyltrimethylammonium bromide (C12TAB), tetradecyltrimethylammonium bromide (C14TAB), and hexadecyltrimethylammonium bromide (C16TAB). ..
  • CnTAC examples include dodecyltrimethylammonium chloride (C12TAC), tetradecyltrimethylammonium chloride (C14TAC), hexadecyltrimethylammonium chloride (C16TAC), and octadecyltrimethylammonium chloride (C18TAC).
  • anionic surfactants examples include carboxylic acid-type surfactants (eg, N-decanoyl sarcosin sodium (NDS), N-lauroyl sarcosin sodium hydrate (NLS)), and sulfone.
  • Acid-type surfactants eg, sodium 1-nonane sulfonate (NSS), sodium dodecylbenzene sulfonate (SDBS)
  • carboxylic acid-type-sulfonic acid type surfactants eg, sodium chondroitin sulfate (CSSS)
  • sulfuric acid examples include ester-type surfactants (eg, sodium dodecyl sulfate (SDS)).
  • Zwitterionic Surfactants examples include quaternary ammonium-sulfonic acid type surfactants. Examples of the quaternary ammonium-sulfonic acid type surfactant include 3-[(3-cholamidepropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) and 3-[(3-cholamidepropyl).
  • quaternary ammonium-sulfonic acid type surfactant examples include 3-[(3-cholamidepropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) and 3-[(3-cholamidepropyl).
  • HLB Hydrophilicity and lipophilicity of the surfactant
  • HLB Hydrophilicity and lipophilicity of the surfactant
  • HLB value of the commercially available compound the value described in the manufacturer's data sheet may be used.
  • the HLB value described in the manufacturer's data sheet may exceed 20.
  • the HLB value of alcohol ethoxylate may be simply obtained by the Griffin method, for example.
  • Surfactants Based on Properties for EV and Uses Surfactants should be classified into “EV Refractory Surfactants” and “EV Destructive Surfactants” based on the degree of EV-destroying properties. Can be done. Among the “EV refractory surfactants”, those having a detergency effect can be further classified as “EV detergency surfactants”. By selecting the EV detergency surfactant from the EV refractory surfactants, it is possible to clean the EV and the EV operating system while preventing the EV internal markers from being released to the outside of the EV due to the destruction of the EV.
  • EV detergency nonionic surfactants those corresponding to nonionic surfactants are referred to as “EV detergency nonionic surfactants”.
  • the classification can be performed, for example, based on the methods described in the examples herein.
  • the present invention provides a method for cleaning extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles are tiny vesicles with a membrane structure that are secreted by various types of cells.
  • Extracellular vesicles include, for example, exosomes, ectosomes, and apoptotic vesicles.
  • the extracellular vesicle is an exosome.
  • Extracellular vesicles can also be defined by their size. The size of the extracellular vesicle is, for example, 30 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm, and more preferably 80 to 200 nm.
  • the size of the extracellular vesicle can be measured, for example, by a method based on Brownian motion of the extracellular vesicle, a light scattering method, an electric resistance method, or the like.
  • the size of the extracellular vesicle is measured by NanoSight (manufactured by Malvern Instruments).
  • the washing method of the present invention includes washing extracellular vesicles with an "EV detergency nonionic surfactant".
  • the "EV detergency nonionic surfactant" used in the cleaning method of the present invention is a polyoxyethylene alcohol structure-containing nonionic surfactant.
  • Polyoxyethylene alcohols structure-containing nonionic surfactant used as the EV detergency nonionic surfactant in the cleaning method of the present invention -O - Table with - (CH 2 -CH 2 -O-) x -H It is a chain compound (compound not containing a cyclic structure) containing a structure (polyoxyethylene alcohol structure).
  • x is an integer of 1 or more, and may be, for example, 1 to 300.
  • Such a compound may be either a linear compound or a branched chain compound.
  • Such compounds may consist of single bonds or may contain multiple bonds, but are preferably single bonds.
  • Such compounds may contain one or more polyoxyethylene alcohol structures (eg, 2, 3, 4).
  • Examples of the structure other than the polyoxyethylene alcohol structure in such a compound include an alkyl structure (straight chain or branched chain) and a polyoxyalkylene structure (straight chain or branched chain).
  • the alkyl structure may be, for example, a C 6 to 31 alkyl structure, preferably a C 6 to 31 linear alkyl structure.
  • the alkylene in the polyoxyalkylene structure may be, for example, a C 1 to 6 alkylene group.
  • Examples of the C 1 to 6 alkylene group include a C 1 alkylene group (methylene group), a C 2 alkylene group (ethylene group and ethylidene group), and a C 3 alkylene group (propyridene group, propylene group, trimethylene group and isopropylidene group). , C 4 alkylene group (eg, tetramethylene group), C 5 alkylene group (eg, pentamethylene group), C 6 alkylene group (eg, hexamethylene group).
  • Such compounds may consist of carbon atoms, hydrogen atoms, and oxygen atoms. Examples of such compounds include alcohol ethoxylates and polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymers (eg, polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers).
  • Alchol ethoxylate is a compound represented by the following formula (I).
  • the alcohol ethoxylate used as the EV detergency nonionic surfactant in the cleaning method of the present invention may be either branched-chain alcohol ethoxylate or linear alcohol ethoxylate.
  • Such a branched-chain alcohol ethoxylate corresponds to a compound represented by the above formula (I) in which y is an integer of 1 or more and z is an integer of 1 or more.
  • branched chain alcohol ethoxylates include polyoxyethylene (7) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (9) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (15) sec-tridecyl ether, and poly. Examples thereof include oxyethylene (20) sec-tridecyl ether, polyoxyethylene (30) sec-tridecyl ether, and polyoxyethylene (40) sec-tridecyl ether.
  • Examples of such branched-chain alcohol ethoxylates include, as commercially available products, Tergitol15-S-7, Tergitol15-S-9, Tergitol15-S-15, Tergitol15-S-20, Tergitol15-S-30, and Tergitol15-S. Examples thereof include TERGITOR® series compounds such as -40.
  • Such a linear alcohol ethoxylate corresponds to the compound represented by the above formula (I) in which z is 0.
  • linear alcohol ethoxylates include commercially available compounds of the BRIJ (registered trademark) series such as Brij35, Brij58, and Brij78.
  • the linear alcohol ethoxylate can also be expressed as the following formula (II).
  • the alcohol ethoxylate used as the EV detergency nonionic surfactant in the cleaning method of the present invention is a compound represented by the formula (I).
  • x is 15-100; y is an integer greater than or equal to 0; z is an integer greater than or equal to 0; y ⁇ z; Compounds having y + z of 5 to 30 are preferable.
  • the alcohol ethoxylate used as the EV detergency nonionic surfactant in the cleaning method of the present invention is more preferably an alcohol ethoxylate having an HLB of 15 or more or a carbon chain having 16 or less carbon atoms.
  • the alcohol ethoxylate used in the washing method of the present invention is even more preferably an alcohol ethoxylate of HLB 15 or higher.
  • Preferred examples of the alcohol ethoxylate used in the washing method of the present invention include Tergitol15-S-15, Tergitol15-S-20, Tergitol15-S-30, Tergitol15-S-40, Brij35, Brij58 and Brij78. More preferable examples of the alcohol ethoxylate used in the washing method of the present invention include Tergitol15-S-30, Tergitol15-S-40, Brij35, and Brij58.
  • Polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer is a block copolymer containing a polyoxyethylene block and a polyoxyalkylene block.
  • the alkylene in the polyoxyalkylene block may be, for example, a C 1 to 6 alkylene group, for example, a C 1 alkylene group (methylene group), a C 2 alkylene group (ethylene group, an ethylidene group), a C 3 alkylene group ( Propyridene group, propylene group, trimethylene group, isopropylidene group), C 4 alkylene group (eg tetramethylene group), C 5 alkylene group (eg pentamethylene group), C 6 alkylene group (eg hexamethylene group) Can be mentioned.
  • polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer examples include block copolymers having a structure of HO- [polyoxyethylene block]-[polyoxyalkylene block]-[polyoxyethylene block] -H. Be done.
  • the polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer may preferably be a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer.
  • Polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer is a group of compounds represented by the following formula (III).
  • x2, y2, and z2 are integers of 1 or more.
  • polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer examples include poloxamer 188 and poloxamer 407.
  • Commercially available products of the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer include, for example, PLURONIC® series compounds such as Pluronic F68 and Pluronic F127.
  • the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer used as an EV detergency nonionic surfactant in the cleaning method of the present invention is a compound represented by the formula (III).
  • x2 is an integer greater than or equal to 1;
  • y2 is 10-100;
  • z2 is an integer greater than or equal to 1;
  • Compounds having x2 + z2 of 20 to 300 are preferable.
  • the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer used as an EV detergency nonionic surfactant in the cleaning method of the present invention is more preferably a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer having an HLB of 15 or more.
  • Preferred examples of the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer used in the washing method of the present invention include poloxamer 188 (eg, Pluronic F68), poloxamer 108 (eg, Pluronic F38), poloxamer 217 (eg, Pluronic F77).
  • Poloxamer 237 eg, Pluronic F87
  • poloxamer 238 eg, Pluronic F88
  • poloxamer 288 eg, Pluronic F98
  • poloxamer 388 eg, Pluronic F108
  • poloxamer 407 eg, Pluronic F127.
  • More preferable examples of the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer used in the washing method of the present invention include poroxamer 188 (eg, Pluronic F68) and poroxamer 407 (eg, Pluronic F127).
  • the nonionic surfactant used as the EV detergency nonionic surfactant in the cleaning method of the present invention is preferably alcohol ethoxylate.
  • the concentration of EV cleansing nonionic surfactant in the washing of extracellular vesicles can suppress the adsorption of contaminants on the extracellular vesicles and the system that manipulates the extracellular vesicles, and destroys the extracellular vesicles.
  • the concentration is not particularly limited as long as the concentration can suppress. Such a concentration varies depending on the type of EV detergency nonionic surfactant, but is, for example, 0.001 to 10.0 w / v%.
  • the concentration of the EV detergency nonionic surfactant may be 0.002 w / v% or more, 0.005 w / v% or more, or 0.01 w / v% or more.
  • Such concentrations may also be 7.5 w / v% or less, 5.0 w / v% or less, or 2.0 w / v% or less, depending on the type of EV detergency nonionic surfactant. May be good. More preferably, the concentration of the EV detergency nonionic surfactant is 0.002-7.5 w / v%, 0.005-5.0 w / v%, or 0.01-2.0 w / v%. It may be.
  • the EV detergency nonionic surfactant used in the cleaning method of the present invention may be an aqueous solution.
  • aqueous solution examples include water (eg, distilled water, sterilized water, sterilized distilled water, and pure water), and a buffer solution, but a buffer solution is preferable.
  • buffer solution examples include phosphate buffer solution, phosphate buffered physiological saline (PBS), tartrate buffer solution, citric acid buffer solution, acetate buffer solution, glycine buffer solution, carbon dioxide buffer solution, and 2-morpholinoetan sulfonic acid (MES) buffer, Trishydroxymethylaminomethane (Tris) buffer, borate buffer, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) buffer, N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine) buffer , Bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris) buffer, 2- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazinyl ethanesulfonic acid (HEEPS) buffer.
  • PBS phosphate buffered physiological saline
  • Tris Trishydroxymethylaminomethane
  • MOPS 3-morpholinopropanesulfonic acid
  • Na N-bis (2-hydroxyethyl)
  • the pH of the buffer solution is preferably neutral. More specifically, such a pH may be preferably 5.0 or higher, more preferably 5.5 or higher, and even more preferably 6.0 or higher. The pH may also be preferably 9.0 or less, more preferably 8.5 or less, and even more preferably 8.0 or less.
  • the pH can be measured using a method known in the art. Preferably, the pH can be a value measured at 25 ° C. using a pH meter having a glass electrode.
  • the temperature for washing the extracellular vesicles is, for example, 4 to 45 ° C, preferably 15 to 40 ° C.
  • the time for washing is not particularly limited as long as it is sufficient to suppress the adsorption of contaminants on the extracellular vesicles, and is, for example, 1 second or more, 5 seconds or more, 10 seconds or more, or 20 seconds or more. There may be. Such time may also be 4 minutes or less, 2 minutes or less, or 1 minute or less.
  • the mixed solution may be left as it is, or it may be stirred by a vortex mixer or the like, or a pipetting operation. May be further mixed by.
  • washing of extracellular vesicles means reducing the amount of impurities in the surface of extracellular vesicles and in the system for manipulating extracellular vesicles (eg, solution, container).
  • Contaminants include, for example, proteins, nucleic acids (eg, RNA, DNA), sugars, lipids, amino acids, vitamins, polyamines, and peptides.
  • Contaminating substances specifically refer to contaminants that interfere with the analysis of extracellular vesicles, such as impurities that enhance the detection background (eg, substances that are the same as or similar to the detection target), and impurities that attenuate the detection signal. Examples include substances (eg, substances that interfere with the detection of the detection target).
  • Cleaning of extracellular vesicles preferably reduces the amount of substances that are the same as or similar to the detection target, and the total amount of substances that belong to the same category as the detection target (for example, if the detection target is a protein, the total protein). It is more preferable that the amount) is reduced.
  • Manipulation of extracellular vesicles includes, for example, cleaning of extracellular vesicles, production of extracellular vesicle purified products (ie, recovery of extracellular vesicles), and analysis of extracellular vesicles.
  • the container for manipulating extracellular vesicles include a container made of a material such as plastic (eg polypropylene) and glass, and a container made of plastic is preferable.
  • the extracellular vesicles washed by the washing method of the present invention can be used for analysis.
  • the analysis of extracellular vesicles may be, for example, analysis of components (EV markers) contained in extracellular vesicles.
  • the EV marker include an EV internal marker and an EV surface marker.
  • the EV internal marker include carcinoembryonic antigen (CEA), CA125, CA15-3, actin family, TSG101, ALIX, Charged multiprotein body protein (CHMP) family, and Glycareprotein (CHMP) family.
  • PARP poly (ADP-ribose) polymerase
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • TBP TATA binding protein
  • VDAC potential-dependent anion channel protein
  • amyloid beta amyloid beta
  • EV surface markers include, for example, tetraspanine membrane proteins (extracellular vesicular membrane-specific quadruple membrane proteins, eg, CD9, CD63, CD81), extracellular matrix metalloprotease inducers (eg, CD147), heat shock proteins.
  • HSP tetraspanine membrane proteins
  • MHC Major Tissue Compatibility Complex
  • LAMP Lysosome-Related Membrane Protein
  • IAM Intercellular Adhesion Molecular
  • Integrin Integrin
  • Ceramide Cholesterol
  • Phosphatidylserine Annexins
  • Caveolin- Examples include I and EpCAM.
  • the washing method of the present invention may be carried out in combination with a precipitation method using an extracellular vesicle membrane binding substance (eg, immunoprecipitation method).
  • an extracellular vesicle membrane binding substance eg, immunoprecipitation method
  • the complex after forming a complex (eg, immunoprecipitation complex) of extracellular vesicles and extracellular vesicle membrane-binding substance (eg, antibody) by the precipitation method, the complex is not EV-washable. It may be washed with an ionic surfactant. That is, washing the extracellular vesicles with an EV-cleaning nonionic surfactant means washing the complex of the extracellular vesicles and the extracellular vesicle membrane-binding substance with an EV-cleaning nonionic detergent. It may be to do.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance used in the present invention is a substance having an affinity for the above-mentioned EV surface marker.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance include antibodies against the above-mentioned EV surface markers (eg, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies) and antigen-binding fragments thereof, aptamers, phosphatidylserine-binding proteins, and ceramide-binding proteins.
  • the antigen-binding fragment may be any antibody fragment that maintains the binding property to the target EV surface marker, and examples thereof include Fab, Fab', F (ab') 2 , scFv and the like.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance is preferably an antibody or an antigen-binding fragment thereof, and more preferably a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance used in the present invention may be one or a combination of two or more.
  • the extracellular vesicle membrane-binding substance may be bound to a solid phase for facilitating the separation of extracellular vesicles.
  • a solid phase for example, sepharose beads, agarose beads, magnetic beads (magnetic particles), or a plastic plate can be used. Immobilization of the extracellular vesicle membrane-binding substance on the solid phase can be performed by a conventional method well known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides a method for producing an extracellular vesicle purified product.
  • the production method of the present invention includes the following steps: (1) Washing the extracellular vesicles with "EV-washing nonionic surfactant"; and (2) Separating the washed extracellular vesicles.
  • Separation of extracellular vesicles in step (2) can be performed, for example, by a sedimentation method using an extracellular vesicle membrane-binding substance or an ultracentrifugation method.
  • the extracellular vesicles can be recovered by precipitating the extracellular vesicles by a precipitation method or an ultracentrifugation method, and then collecting the precipitate or discarding the supernatant.
  • the recovery of the precipitate can be carried out by any method known in the art (eg, collection of magnetic particles, centrifugation of Sepharose beads). Separation is preferably isolation or purification.
  • the production method of the present invention in this case may be carried out by a step including the following: (1') Treatment of extracellular vesicles with an extracellular vesicle membrane-binding substance to form a complex of extracellular vesicles and extracellular vesicle membrane-binding substance; (2') Washing the complex of extracellular vesicles and extracellular vesicle membrane-binding material with an "EV-washing nonionic surfactant"; and (3') extracellular vesicles and extracellular small Separation of the complex with the vesicle-binding substance.
  • the extracellular vesicle purified product may be obtained in the form of a complex of extracellular vesicles and extracellular vesicle membrane-binding substance, or may be obtained in the form of free extracellular vesicles. May be good.
  • the production method of the present invention may include a step of dissociating the extracellular vesicle from the complex. Dissociation of extracellular vesicles from the complex may be performed by any method known in the art.
  • the type of "EV detergency nonionic surfactant" used in the production method of the present invention, each condition in the treatment with “EV detergency nonionic surfactant”, and the extracellular vesicle membrane binding substance are: As defined in the cleaning method of the present invention.
  • the production method of the present invention can be used as a method for collecting, isolating, or purifying extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicle purified product produced by the production method of the present invention has a reduced amount of contaminants, it may be used for analysis as an analysis target or as an EV standard, for example.
  • the present invention also provides a method for analyzing extracellular vesicles.
  • the analysis method of the present invention is an extracellular vesicle washed by the washing method of the present invention, or an extracellular vesicle purified product produced by the production method of the present invention (hereinafter, these are referred to as "cells obtained by the present invention”. Includes the analysis of "extravesicles”).
  • the analysis of the extracellular vesicle may be an analysis of components contained in the extracellular vesicle (eg, EV internal marker, EV surface marker), or an analysis of the particles of the extracellular vesicle itself. ..
  • analysis of extracellular vesicles analysis of components contained in extracellular vesicles is preferable, and analysis of EV internal markers is more preferable. Since the extracellular vesicles obtained in the present invention have a reduced amount of contaminants, they can be suitably used for analysis of components (eg, EV internal markers) contained in the extracellular vesicles.
  • the analysis is the detection or quantification of the components.
  • Such an analysis is also a one-component or multi-component analysis.
  • Ingredients to be analyzed include, for example, proteins, nucleic acids (eg, RNA, DNA), sugars, lipids, amino acids, vitamins, polyamines, and peptides.
  • the analysis of the components can be performed by any method known in the art.
  • the component to be analyzed is a protein
  • examples of the analysis method include immunoassay and mass spectrometry.
  • Immunoassays include, for example, direct competition, indirect competition, and sandwich methods.
  • immunoassays include chemoluminescence immunoassay (CLIA) [eg, chemoluminescent enzyme immunoassay (CLEIA)], immunoturbidimetric method (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competitor ELISA).
  • CLIA chemoluminescence immunoassay
  • TIA immunoturbidimetric method
  • EIA enzyme immunoassay
  • the analysis method includes, for example, a hybridization method using a probe, a reverse transcription (RT) reaction using reverse transcriptase, and primers (eg, 2, 3, or 4 primers).
  • Nucleic acid amplification method eg, PCR method such as quantitative PCR, RT-PCR, etc.
  • sequencing and mass analysis method using
  • the analysis method includes, for example, immunoassay and mass spectrometry. If multiple components are analyzed, a metabolome analysis may be performed.
  • the analytical method of the present invention can be used to detect markers contained in extracellular vesicles.
  • markers contained in the extracellular vesicle include the above-mentioned EV markers (eg, EV internal marker and EV surface marker).
  • the extracellular vesicle itself can be analyzed by, for example, an instrument such as a particle analyzer, an electron microscope, or a flow cytometer. In this case, the number of extracellular vesicle particles, the size and shape of the particles, and their distribution can be analyzed.
  • the analytical method of the present invention may further include disrupting the extracellular vesicles obtained in the present invention, for example when analyzing an EV internal marker.
  • the analytical method of the present invention is carried out by a step including: (1) To destroy the extracellular vesicles obtained in the present invention; and (2) to detect the extracellular vesicle internal marker of the destroyed extracellular vesicles.
  • Destruction of extracellular vesicles includes, for example, destruction by treatment with a chemical substance, destruction by treatment with a physical action, or a combination of these.
  • chemical substances include extracellular vesicle-destroying substances.
  • the extracellular vesicle destructive substance for example, the above-mentioned EV destructive surfactant can be used.
  • the EV-destructive surfactant used for disrupting extracellular vesicles include interfaces other than the above-mentioned EV-washing nonionic surfactant (eg, alcohol ethoxylate, polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer).
  • An activator is preferable, and a nonionic surfactant having an HLB of less than 15 or an ionic surfactant having 11 or more carbon atoms in the carbon chain is more preferable.
  • the physical operation include pressurization.
  • kits that include: (1) EV detergency nonionic surfactant; and (2) extracellular vesicle membrane-binding substance.
  • the kit of the present invention may further contain (3) an extracellular vesicle internal marker-binding substance.
  • the kit of the present invention may further contain (4) an EV-destructive surfactant.
  • the EV detergency nonionic surfactant, extracellular vesicle membrane-binding substance, extracellular vesicle internal marker-binding substance, and EV-destroying surfactant included in the kit of the present invention are as described above.
  • the kit of the present invention is useful, for example, for simple implementation of the cleaning method of the present invention, the recovery method of the present invention, the production method of the present invention, and the analysis method of the present invention.
  • Example 1 Preparation of solid phase antibody and labeled antibody, and method for measuring EV surface marker
  • Preparation of antibody-immobilized particles (monoclonal antibody) CD9, CD63 and extracellular vesicle (EV) surface markers were added to 0.01 g / mL of magnetic particles in a 10 mM MES buffer (pH 5.0).
  • the magnetic particles are focused, and the particles are washed with a washing solution (50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl 2 , 2.0% BSA, pH 7.2), and the anti-CD9 antibody-immobilized particles and anti-CD63 antibody solidified. Phased particles and anti-CD81 antibody immobilized particles were obtained. Each antibody-immobilized particle is suspended in a particle diluent (50 mM Tris buffer, 1 mM EDTA ⁇ 2Na, 0.1% NaN 3 , 2.0% BSA, pH 7.2), and each antibody-immobilized particle solution is prepared. Obtained.
  • a washing solution 50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl 2 , 2.0% BSA, pH 7.2
  • Phased particles and anti-CD81 antibody immobilized particles were obtained.
  • Each antibody-immobilized particle is suspended in a particle diluent (50 mM Tris buffer, 1 mM EDTA ⁇ 2Na, 0.1% NaN 3 , 2.0
  • the converted ALP was mixed at a molar ratio of 1: 1 and reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • the reaction mixture was purified using Superdex 200 column chromatography (General Electric) to obtain ALP-labeled anti-CD9 antibody, ALP-labeled anti-CD63 antibody, and ALP-labeled anti-CD81 antibody.
  • Each ALP-labeled antibody was suspended in a labeled diluent (50 mM MES buffer, 150 mM NaCl 2 , 0.3 mM ZnCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 0.1% NaN 3 , 2.0% BSA, pH 6.8). Each labeled antibody solution was obtained.
  • the measurement method of EV surface markers (CD9, CD63 and CD81) in the following examples is as follows. 20 ⁇ L of the measurement sample was dispensed into the reaction vessel, and 50 ⁇ L of the anti-CD9 antibody-immobilized particle solution, the anti-CD63 antibody-immobilized particle solution, or the anti-CD81 antibody-immobilized particle solution was dispensed and stirred. Then, it was incubated at 37 degreeC for 8 minutes, and B / F separation and washing were performed. 50 ⁇ L of ALP-labeled antibody corresponding to the immobilized antibody was dispensed into a reaction vessel, stirred, and then incubated at 37 ° C.
  • Lumipulse (registered) containing the chemiluminescent substrate 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 "-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane / 2-sodium salt (AMPPD).
  • AMPPD 2-sodium salt
  • 200 ⁇ L of a substrate solution (Fujirebio) was dispensed into a reaction vessel, stirred, incubated at 37 ° C. for 4 minutes, and then the amount of luminescence was measured with a luminometer. The actual measurement was performed by a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay system (Lumipulse L2400 (Fujirebio)).
  • an antibody that recognizes the same epitope was used for the antibody immobilized on the magnetic particles and the ALP-labeled antibody. Since a plurality of CD9, CD63 or CD81 are present on one extracellular vesicle, the extracellular vesicle and its thereof are subjected to a sandwich immunoassay using an antibody that recognizes the same epitope as the immobilized antibody as an ALP-labeled antibody. It is possible to measure the marker.
  • Example 2 Screening of EV refractory surfactant and EV destructive surfactant based on EV surface marker measurement
  • the effects of various surfactants on extracellular vesicles using the EV surface marker as an index were measured, and the EV refractory surfactant and the EV destructive surfactant were screened.
  • EDTA and EGTA-containing PBS EDTA / EGTA / PBS
  • each detergent 0.1 w / v%
  • the reactivity (EV surface marker measurement amount) of CD9, CD63 or CD81 in the measurement sample was measured according to the measurement method of Example 1 (3).
  • EDTA / EGTA / PBS containing no surfactant was used as a control. From the obtained count value, the ratio of the count value (influence rate%) when each surfactant was added to the control count value was obtained.
  • nonionic surfactant having an HLB of 15 or more and a linear ionic surfactant having a carbon chain having 10 or less carbon atoms do not destroy extracellular vesicles (EV refractory surfactant). )
  • These surfactants can be candidates for extracellular vesicle cleaning surfactants.
  • nonionic surfactants having an HLB of less than 15 and ionic surfactants having 11 or more carbon atoms in a carbon chain tend to be EV-destroying surfactants (EV-destructive surfactants). I found out.
  • EV-destructive surfactants EV-destructive surfactants
  • Example 3 Examination of concentration-dependent EV destructiveness and EV refractory property of surfactant based on EV internal marker measurement
  • concentration-dependent effects of various surfactants on the destructiveness and refractory property to EV using the EV internal marker as an index were measured.
  • the culture supernatant of human colon adenocarcinoma cell DU-145 cultured in serum-free medium for 3 days was centrifuged at 2,000 ⁇ g at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter (Millipore).
  • the cells were then concentrated using Amicon Ultra-15 (Millipore). The concentrated sample was centrifuged at 20,000 xg, 4 ° C. for 15 minutes.
  • the supernatant was then centrifuged at 100,000 xg, 4 ° C. for 1 hour. The supernatant was discarded and PBS (pH 7.4) or 50 mM EDTA / 50 mM EGTA / PBS (PBS containing 50 mM EDTA and 50 mM EGTA, pH 7.4) was added to resuspend the precipitate. After resuspension, it was centrifuged at 150,000 xg at 4 ° C. for 1 hour. The supernatant was discarded, PBS or 50 mM EDTA / 50 mM EGTA / PBS was newly added, and the precipitate was resuspended to obtain EV (DU-145).
  • the concentration of EV was determined by Qubit Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). 10 ⁇ L of 63 ⁇ g / mL EV (DU-145) and 10 ⁇ L of surfactant solution (see table for concentration) were mixed. After reacting at room temperature for 30 minutes, 190 ⁇ L of Lumipulse sample diluent (Fujirebio) was added. The EV internal markers (CEA and CA125) contained in this sample were used with Lumipulse Presto CEA reagent (Fujirebio) and Lumipulse Presto CA125-II reagent (Fujirebio) according to the attached protocol, and Lumipulse L2400 (Fujirebio). ).
  • Example 4 Examination of the effect of the nonionic surfactant on the container adsorption suppression effect of the sample component in the EV operation system
  • QSP polypropylene 1.5 mL tube
  • the surfactants used were Tween20, Triton-X100, Tergitol15-s-30, Brij35, Brij58, PluronicF68, C8TAB, NSS, C8APS, NDSB-195, NDSB-256.
  • the reaction solution was rotated in a reaction tube at 37 ° C. for 30 minutes, and then the reaction solution was removed from the reaction tube.
  • the reaction tube from which the reaction solution had been removed was washed 5 times using PBS as a washing solution.
  • the cleaning liquids after each cleaning were transferred to individual new tubes, and these were designated as "cleaning fractions 1 to 5".
  • the empty reaction tube after washing 5 times was designated as a "post-reaction container".
  • the post-reaction vessel and wash fraction were used in the BCA assay (Thermo Fisher Scientific). After the reaction, 1 mL of BCA solution was added to the vessel, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. For the washing fractions 1 to 5, 200 ⁇ L of BCA solution was added to 20 ⁇ L, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the absorbance at 562 nm was measured with a microplate reader (manufactured by TECAN) to measure the total amount of protein.
  • Example 5 Examination of container adsorption inhibitory effect of nonionic surfactant on EV recovery by immunoprecipitation
  • the cleaning effect of the sample component by the nonionic surfactant in EV recovery by immunoprecipitation was examined.
  • a polypropylene 1.5 mL tube (QSP) (hereinafter referred to as "reaction tube")
  • reaction tube 250 ⁇ L of EDTA / EGTA / PBS is added to 500 ⁇ L of human serum sample, and anti-CD9 antibody-immobilized particles are eliminated. It was added so as to be .15 w / v%.
  • the reaction solution was rotated in a reaction tube at 37 ° C.
  • the magnetic particles after the reaction were washed 5 times with PBS containing 0.05 w / v% of each surfactant as a washing solution.
  • the surfactant used was the same as in Example 4.
  • the cleaning liquids after each cleaning were transferred to individual new tubes, and these were designated as "cleaning fractions 1 to 5".
  • the washed magnetic particles were transferred to another new tube.
  • the reaction tube was washed once with a washing solution under each condition to obtain a "container after sedimentation”.
  • Post-implantation containers and wash fractions 1-5 were used in the BCA assay (Thermo Fisher Scientific). After immobilization, 1 mL of BCA solution was added to the container, and the mixture was reacted at 37 ° C.
  • Example 6 Examination of concentration dependence of cleaning effect by nonionic surfactant in EV recovery by immunoprecipitation
  • concentration dependence of the cleaning effect of the nonionic surfactant in EV recovery by immunoprecipitation was evaluated.
  • 250 ⁇ L of EDTA / EGTA / PBS was added to 500 ⁇ L of human serum sample in a polypropylene 1.5 mL tube (manufactured by QSP) (hereinafter referred to as “reaction tube”), and anti-CD9 antibody-immobilized particles were added thereto.
  • the reaction solution was rotated in a reaction tube at 37 ° C.
  • the magnetic particles after the reaction were subjected to each concentration (0 w / v%, 0.01 w / v%, 0.05 w / v%, 0.1 w / v%, 0.25 w / v%, 0.5 w / v%, PBS containing Tergitol 15-s-30 or Pluronic F68 was washed 5 times as a washing solution at 1.0 w / v%).
  • the washed magnetic particles were transferred to another new tube.
  • the reaction tube was washed once with a washing solution under each condition to obtain a "container after sedimentation".
  • the post-immobilization vessel was used for the BCA assay (Thermo Fisher Scientific). After immobilization, 1 mL of BCA solution was added to the container, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the absorbance at 562 nm was measured with a microplate reader (manufactured by TECAN) to measure the total amount of protein.
  • Example 7 Examination of cleaning effect in recovery of EV from sample
  • the cleaning effect in the recovery of EV from the sample was examined.
  • 250 ⁇ L of EDTA / EGTA / PBS was added to 500 ⁇ L of human serum sample in a polypropylene 1.5 mL tube (manufactured by QSP) (hereinafter referred to as “reaction tube”), and anti-CD9 antibody-immobilized particles were added thereto.
  • the reaction solution was rotated in a reaction tube at 37 ° C. for 30 minutes, then magnetized and the supernatant was transferred to another new tube.
  • the obtained supernatant was designated as a "SUP sample”.
  • the magnetic particles after the reaction were washed 5 times with PBS (pH 7.4) or PBS containing Tergitol 15-s-30 (0.05 w / v% Tergitol 15-s-30, pH 7.4) as a washing solution.
  • the cleaning liquids after each cleaning were transferred to individual new tubes, and these were designated as "cleaning fractions 1 to 5".
  • the washed magnetic particles were transferred to another new tube and designated as "post-sedimentation particles”.
  • the reaction tube was washed once with a washing solution under each condition to obtain a "container after sedimentation”. Post-settlement particles, post-settlement containers and wash fractions were used in the BCA assay (Thermo Fisher Scientific).
  • Table 7 shows the results of total protein amount measurement by the BCA assay
  • Table 8 shows the results of CEA amount measurement.
  • Example 8 Confirmation of cleaning effect by EV marker measurement
  • the EV was collected from the sample, crushed, and the marker in the EV was measured.
  • a sample obtained by adding 250 ⁇ L of EDTA / EGTA / PBS to a 500 ⁇ L human serum sample was designated as a “stock solution sample”.
  • Anti-CD9 antibody-immobilized particles, anti-CD63 antibody-immobilized particles, anti-CD81 antibody-immobilized particles, or a mixture thereof were added to the stock solution sample at a concentration of 0.15 w / v%.
  • the reaction solution was rotated in a reaction tube at 37 ° C. for 30 minutes, then magnetized and the supernatant was transferred to another new tube. These were designated as "SUP samples”.
  • the magnetic particles after the reaction were washed 5 times with PBS containing 0.05% Tergitol 15-S-30 as a washing solution.
  • the cleaning liquids after each cleaning were transferred to individual new tubes, and these were designated as "cleaning fractions 1 to 5".
  • the stock solution sample and The EV surface marker in the SUP sample was measured by the measuring method of Example 1.
  • Example 3 the reactivity of CEA of the stock solution sample, the SUP sample and the Lysis sample was measured in the same manner as in Example 3.
  • samples obtained by immunoprecipitation using a mixture of anti-CD9 antibody-immobilized particles, anti-CD63 antibody-immobilized particles and anti-CD81 antibody-immobilized particles were used as SUP samples and Lysis samples.
  • a suppression test was conducted to confirm that the reactivity of CEA in the Lysis sample was a reaction specific to CEA.
  • Example 3 an antibody that recognizes the same region as the epitope region of the anti-CEA antibody used in the Lumipulse Presto CEA reagent was added to the CEA reagent, and CEA was measured in the same manner as in Example 3 (suppression count). ..
  • the luminescence intensity of the Lysis sample was 824 counts, showing no reactivity with CEA. Therefore, it was found that by adding a predetermined nonionic surfactant to the cleaning liquid, non-specific adsorption of CEA contained in the sample to the magnetic particles can also be suppressed.

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Abstract

本発明は、細胞外小胞を操作する系において夾雑物の混入を低減するための技術を提供する。より具体的には、本発明は、細胞外小胞を、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘは、明細書中で定義される値である〕で表される構造を含む鎖状化合物である、非イオン性界面活性剤で洗浄することを含む、細胞外小胞の洗浄方法などを提供する。

Description

細胞外小胞の洗浄方法
　本発明は、細胞外小胞の洗浄方法などに関する。
　細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶ）は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中あるいは細胞培養液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｂｌｅｂ）が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含む多様な集団であることから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の洗浄方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、免疫沈降時および／または洗浄時に非イオン性界面活性剤を添加することで、固相担体同士の凝集を低減させる、ＥＶの分離方法が記載されている。
国際公開第２０１５／０６８７７２号
　体液などの検体中のＥＶ内に含まれる物質を検出する場合、当該物質が検体中のＥＶ外にも多く存在することがある。一般的に、ＥＶ中に含まれる対象物質の量は、検体中のＥＶ外に存在する同じ物質の量に比べて微量である。そのため検体から回収されたＥＶ中の対象物質を検出または測定する際に、体液中のＥＶ外に多く存在する当該物質が夾雑物として混入してしまい、バックグラウンドとなるため、ＥＶ中の対象物質を検出または測定することが難しい。例えば、ＥＶ中の癌マーカーであるＣＥＡを測定することで診断性能が上がることが報告されているが、血液検体由来のＥＶ中のＣＥＡを検出または測定する場合、ＣＥＡは血液検体中にＥＶに比べて非常に多く含まれるので、ＥＶ外のＣＥＡが夾雑物としてＥＶ表面や容器表面に吸着していると、対象物質であるＥＶ内ＣＥＡを正確に検出または測定することができない。
　したがって、本発明の目的は、細胞外小胞を操作する系において夾雑物の混入を低減できる方法を開発することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、ＥＶを所定の非イオン性界面活性剤を含む洗浄液を用いて洗浄することにより、ＥＶ外に含まれる同じ対象物質等の夾雑物（例、検出または測定の対象物質と同じ物質）の混入量を低減することができること等を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕細胞外小胞を、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘが、１～３００である〕で表される構造を含む鎖状化合物である、非イオン性界面活性剤で洗浄することを含む、細胞外小胞の洗浄方法。
〔２〕前記非イオン性界面活性剤が、アルコールエトキシレートである、〔１〕の方法。
〔３〕アルコールエトキシレートが、式（Ｉ）で表される化合物である、〔２〕の方法:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　式中、ｘが、１５～１００であり；
　ｙが、０以上の整数であり；
　ｚが、０以上の整数であり；
　ｙ≧ｚであり；
　ｙ＋ｚが、５～３０である。
〔４〕アルコールエトキシレートが、ＨＬＢ１５以上または炭素鎖の炭素原子数が１６以下のアルコールエトキシレートである、〔２〕または〔３〕の方法。
〔５〕前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体である、〔１〕の方法。
〔６〕ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体が、式（ＩＩＩ）で表されるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体である、〔５〕の方法:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　式中、ｘ２が１以上の整数であり；
　ｙ２が、１０～１００であり；
　ｚ２が、１以上の整数であり；
　ｘ２＋ｚ２が、２０～３００である。
〔７〕細胞外小胞が、０．００１～１０．０ｗ／ｖ％の前記非イオン性界面活性剤で処理される、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕細胞外小胞が、エクソソームである、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕細胞外小胞を前記非イオン性界面活性剤で洗浄することが、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体を前記非イオン性界面活性剤で洗浄することである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体である、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕以下を含む、細胞外小胞精製物の製造方法：
（１）細胞外小胞を、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘが、１～３００である〕で表される構造を含む鎖状化合物である、非イオン性界面活性剤で洗浄すること；および
（２）洗浄された細胞外小胞を分離すること。
〔１２〕前記非イオン性界面活性剤がアルコールエトキシレートまたはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体である、〔１１〕の方法。
〔１３〕以下を含む工程により行なわれる、〔１１〕または〔１２〕の方法：
（１’）細胞外小胞を細胞外小胞膜結合物質で処理して、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体を形成させること；
（２’）前記複合体を前記非イオン性界面活性剤で洗浄すること；および
（３’）前記複合体を分離すること。
〔１４〕〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法により洗浄された細胞外小胞、または〔１１〕～１３〕のいずれかの方法により製造された細胞外小胞精製物を分析することを含む、細胞外小胞の分析方法。
〔１５〕分析が、細胞外小胞内部マーカーの検出により行われる、〔１４〕の方法。
〔１６〕細胞外小胞内部マーカーが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）またはＣＡ１２５である、〔１５〕の方法。
〔１７〕以下を含む工程により行われる、〔１４〕～〔１６〕のいずれかの方法：
（１）〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法により洗浄された細胞外小胞、または〔１１〕～〔１３〕のいずれかの方法により製造された細胞外小胞精製物を、破壊すること；および
（２）破壊された細胞外小胞の細胞外小胞内部マーカーを検出すること。
〔１８〕以下を含む、キット：
（１）－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘが、１～３００である〕で表される構造を含む鎖状化合物である、非イオン性界面活性剤；および
（２）細胞外小胞膜結合物質。
　本発明によれば、細胞外小胞を所定の非イオン性界面活性剤で洗浄することにより、夾雑物の混入を低減することができる。夾雑物混入の低減により、細胞外小胞マーカーの検出または測定におけるバックグラウンド等の障害が低減され、検出または測定の精度が向上する。したがって、本発明は、細胞外小胞マーカーを指標とした際の高精度な分析または診断に有用である。また、本発明は、高精度な分析または診断のための試料となる細胞外小胞の回収に有用である。
図１は、実施例６における残留総タンパク質を指標としたＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０とＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８のＥＶ回収における洗浄効果の濃度依存的比較を示す図である。
１．界面活性剤の分類
　本発明では、１以上の目的（例、ＥＶの洗浄、ＥＶの破壊）に応じて、複数種類の界面活性剤が用いられ得る。そこで、各目的に適した界面活性剤の選択の前提とするため、界面活性剤を、化学的特性（親水性部分のイオン特性）および機能的特性（ＥＶに対する特性／用途）に基づいて分類する。
１－１．親水性部分のイオン特性に基づく界面活性剤の分類
　界面活性剤は、親水性部分のイオン特性に基づいて、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、および両イオン性界面活性剤に分類することができる。以下、各界面活性剤を例示する。
１－１－１．非イオン性界面活性剤
　非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルコール構造含有非イオン性界面活性剤（例、アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ（例、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ８０））、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）シリーズ（例、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－３０５、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－４０５、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－７０５））、Ｎ－Ｄ－グルコ－Ｎ－メチルアルカンアミド（例えば、ＭＥＧＡシリーズ（例、ＭＥＧＡ　８、ＭＥＧＡ　１０）が挙げられる。
　「ポリオキシエチレンアルコール構造含有非イオン性界面活性剤」は、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘが、１以上の整数である〕で表される構造（以下、「ポリオキシエチレンアルコール構造」と呼ぶ）を含む鎖状化合物（環状構造を含まない化合物）である。このような化合物は、直鎖状化合物または分岐鎖状化合物のいずれであってもよい。このような化合物は、単結合からなってもよく、または多重結合を含んでもよい。このような化合物は、ポリオキシエチレンアルコール構造を１個または複数個（例、２、３、４個）含んでもよい。このような化合物におけるポリオキシエチレンアルコール構造以外の構造としては、例えば、アルキレン構造（直鎖または分岐鎖）、ポリオキシアルキレン構造（直鎖または分岐鎖）が挙げられる。このような化合物は、炭素原子、水素原子、および酸素原子からなっていてもよい。このような化合物としては、例えば、アルコールエトキシレートおよびポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体（例、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体）が挙げられる。
　「アルコールエトキシレート」とは、下記の式（Ｉ）で表される一群の化合物をいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式中、ｘが、１以上の整数であり；
　ｙが、０以上の整数であり；
　ｚが、０以上の整数であり；
　ｙ≧ｚである。
　式（Ｉ）において、「Ｈ－（－ＣＨ２－）ｙ－ＣＨ－（－ＣＨ２－）ｚ－Ｈ」で表される部分を「疎水部側鎖」、「炭素鎖」、または「アルキル鎖」等と呼ぶことがある。式（Ｉ）において、疎水部側鎖の炭素原子数は、ｙ＋ｚ＋１に該当する。式（Ｉ）において、「－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ」で表される部分を「親水部側鎖」または「エトキシレート鎖」等と呼ぶことがある。
　アルコールエトキシレートとしては、例えば、分岐鎖アルコールエトキシレートおよび直鎖アルコールエトキシレートが挙げられる。
　分岐鎖アルコールエトキシレートは、上記の式（Ｉ）で表される化合物において、ｙが１以上の整数であり、ｚが１以上の整数である化合物に該当する。分岐鎖アルコールエトキシレートとしては、例えば、ポリオキシエチレン（３）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（７）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（１２）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（４０）ｓｅｃ－トリデシルエーテルが挙げられる。分岐鎖アルコールエトキシレートとしては、例えば、市販品として、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－７、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－９、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－１２、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－１５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－２０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－４０等のＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。ＴＥＲＧＩＴＯＬ１５－Ｓシリーズは、アルキル鎖の炭素原子数（ｙ＋ｚ＋１）が１１～１５（平均１３）であり、その系統名において「Ｓ」の後の数字はエトキシレート鎖のエチレンオキサイドのユニット数（ｘ）を表わす。
　直鎖アルコールエトキシレートは、上記の式（Ｉ）で表される化合物において、ｚが０である化合物に該当する。直鎖アルコールエトキシレートとしては、例えば、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテルが挙げられる。直鎖アルコールエトキシレートの市販品として、例えば、Ｂｒｉｊ３０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７８等のＢＲＩＪ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。直鎖アルコールエトキシレートは、下記の式（ＩＩ）としても表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式中、ｘが、１以上の整数であり；
　ｎが、１以上の整数である。
　「ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体」とは、ポリオキシエチレンブロックおよびポリオキシアルキレンブロックを含むブロック共重合体をいう。ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体としては、例えば、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体が挙げられる。
　「ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体」とは、下記の式（ＩＩＩ）で表される一群の化合物をいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式中、ｘ２、ｙ２、ｚ２が、１以上の整数である。
　ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体としては、例えば、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３８８、ポロキサマー４０７等が挙げられる。ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体の市販品として、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ６２、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ３８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ７７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ８７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ９８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７等のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。
１－１－２．陽イオン性界面活性剤
　陽イオン性界面活性剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩が挙げられる。塩としては、例えばハロゲン（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）との塩が挙げられる。第四級アンモニウム塩としては、例えば、Ｃｎアルキルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣｎＴＡＢ）、Ｃｎアルキルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣｎＴＡＣ）が挙げられる。ＣｎＴＡＢとしては、例えば、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ８ＴＡＢ）、ノニルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ９ＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１２ＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１４ＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１６ＴＡＢ）が挙げられる。ＣｎＴＡＣとしては、例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１２ＴＡＣ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１４ＴＡＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１６ＴＡＣ）、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１８ＴＡＣ）が挙げられる。
１－１－３．陰イオン性界面活性剤
　陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸型界面活性剤（例、Ｎ－デカノイルサルコシンナトリウム（ＮＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム水和物（ＮＬＳ））、スルホン酸型界面活性剤（例、１－ノナンスルホン酸ナトリウム（ＮＳＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ））、カルボン酸型－スルホン酸型界面活性剤（例、コンドロイチン硫酸ナトリウム（ＣＳＳＳ））、硫酸エステル型界面活性剤（例、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））が挙げられる。
１－１－４．両イオン性界面活性剤
　両イオン性界面活性剤としては、例えば、第四級アンモニウム－スルホン酸型界面活性剤が挙げられる。第四級アンモニウム－スルホン酸型界面活性剤としては、例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ８ＡＰＳ）、３－（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１０ＡＰＳ）、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｃ１２ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１４ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１６ＡＰＳ）、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホナート（ＮＤＳＢ－１９５）、３－［ジメチル－（２－ヒドロキシエチル）アンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＮＤＳＢ－２１１）、３－（ベンゼンジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート（ＮＤＳＢ－２５６）が挙げられる。
１－１－５．界面活性剤の物性値
　界面活性剤の親水性および親油性を表す物性値として、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｌａｎｃｅ）値を用いることができる。ＨＬＢ値は、０に近いほど親油性が高いことを示す。市販品化合物のＨＬＢ値は、製造元のデータシートに記載の値を用いてもよい。製造元のデータシートに記載のＨＬＢ値は、２０を超えることがある。また、アルコールエトキシレートのＨＬＢ値は、例えば、簡易的に、グリフィン法により求めてもよい。
１－１－６．イオン特性に基づく界面活性剤の分類のまとめ
　親水性部分のイオン特性に基づく界面活性剤の分類をまとめると、下記の表のとおりとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
１－２．ＥＶに対する特性および用途に基づく界面活性剤の分類
　界面活性剤は、ＥＶを破壊する性質の程度に基づいて、「ＥＶ難破壊性界面活性剤」および「ＥＶ破壊性界面活性剤」に分類することができる。「ＥＶ難破壊性界面活性剤」のうち洗浄効果を有するものを、「ＥＶ洗浄性界面活性剤」としてさらに分類することができる。ＥＶ洗浄性界面活性剤をＥＶ難破壊性界面活性剤から選択することで、ＥＶの破壊によるＥＶ内部マーカーのＥＶ外への放出を防止しつつＥＶおよびＥＶ操作系を洗浄することができる。「ＥＶ洗浄性界面活性剤」のうち非イオン性界面活性剤に該当するものを、「ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤」と呼ぶ。上記分類は、例えば、本明細書の実施例に記載の方法に基づいて行なうことができる。
２．細胞外小胞の洗浄方法
　本発明は、細胞外小胞の洗浄方法を提供する。
　細胞外小胞は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～３００ｎｍ、より好ましくは８０～２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。
　本発明の洗浄方法は、細胞外小胞を、「ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤」で洗浄することを含む。本発明の洗浄方法で用いる「ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤」は、ポリオキシエチレンアルコール構造含有非イオン性界面活性剤である。
　本発明の洗浄方法でＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤として用いるポリオキシエチレンアルコール構造含有非イオン性界面活性剤は、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈで表される構造（ポリオキシエチレンアルコール構造）を含む鎖状化合物（環状構造を含まない化合物）である。ｘは、１以上の整数であり、例えば、１～３００であってもよい。このような化合物は、直鎖状化合物または分岐鎖状化合物のいずれであってもよい。このような化合物は、単結合からなってもよく、または多重結合を含んでもよいが、単結合からなることが好ましい。このような化合物は、ポリオキシエチレンアルコール構造を１個または複数個（例、２、３、４個）含んでもよい。このような化合物におけるポリオキシエチレンアルコール構造以外の構造としては、例えば、アルキル構造（直鎖または分岐鎖）、ポリオキシアルキレン構造（直鎖または分岐鎖）が挙げられる。アルキル構造は、例えば、Ｃ６～３１アルキル構造であってもよく、Ｃ６～３１直鎖アルキル構造が好ましい。ポリオキシアルキレン構造におけるアルキレンは、例えば、Ｃ１～６アルキレン基であってもよい。Ｃ１～６アルキレン基としては、例えば、Ｃ１アルキレン基（メチレン基）、Ｃ２アルキレン基（エチレン基、エチリデン基）、Ｃ３アルキレン基（プロピリデン基、プロピレン基、トリメチレン基、イソプロピリデン基）、Ｃ４アルキレン基（例、テトラメチレン基）、Ｃ５アルキレン基（例、ペンタメチレン基）、Ｃ６アルキレン基（例、ヘキサメチレン基）が挙げられる。このような化合物は、炭素原子、水素原子、および酸素原子からなっていてもよい。このような化合物としては、例えば、アルコールエトキシレートおよびポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体（例、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体）が挙げられる。
　「アルコールエトキシレート」は、下記の式（Ｉ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　式中、ｘが、１以上の整数であり；
　ｙが、０以上の整数であり；
　ｚが、０以上の整数であり；
　ｙ≧ｚである。
　本発明の洗浄方法でＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤として用いるアルコールエトキシレートは、分岐鎖アルコールエトキシレートまたは直鎖アルコールエトキシレートのいずれであってもよい。
　このような分岐鎖アルコールエトキシレートは、上記の式（Ｉ）で表される化合物において、ｙが１以上の整数であり、ｚが１以上の整数である化合物に該当する。このような分岐鎖アルコールエトキシレートとしては、例えば、ポリオキシエチレン（７）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）ｓｅｃ－トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（４０）ｓｅｃ－トリデシルエーテルが挙げられる。このような分岐鎖アルコールエトキシレートとしては、例えば、市販品として、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－７、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－９、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－１５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－２０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－４０等のＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。
　このような直鎖アルコールエトキシレートは、上記の式（Ｉ）で表される化合物において、ｚが０である化合物に該当する。このような直鎖アルコールエトキシレートとしては、例えば、市販品として、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７８等のＢＲＩＪ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。直鎖アルコールエトキシレートは、下記の式（ＩＩ）としても表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式中、ｘが、１以上の整数であり；
　ｎが、１以上の整数である。
　本発明の洗浄方法でＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤として用いるアルコールエトキシレートは、式（Ｉ）で表される化合物であって、
　ｘが、１５～１００であり；
　ｙが、０以上の整数であり；
　ｚが、０以上の整数であり；
　ｙ≧ｚであり；
　ｙ＋ｚが、５～３０である
　化合物が好ましい。
　本発明の洗浄方法でＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤として用いるアルコールエトキシレートは、ＨＬＢ１５以上または炭素鎖の炭素原子数が１６以下のアルコールエトキシレートがより好ましい。本発明の洗浄方法で用いるアルコールエトキシレートは、ＨＬＢ１５以上のアルコールエトキシレートがさらにより好ましい。本発明の洗浄方法で用いるアルコールエトキシレートの好ましい例としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－１５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－２０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７８、が挙げられる。本発明の洗浄方法で用いるアルコールエトキシレートのより好ましい例としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８が挙げられる。
　「ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体」は、ポリオキシエチレンブロックおよびポリオキシアルキレンブロックを含むブロック共重合体である。ポリオキシアルキレンブロックにおけるアルキレンは、例えば、Ｃ１～６アルキレン基であってもよく、例えば、Ｃ１アルキレン基（メチレン基）、Ｃ２アルキレン基（エチレン基、エチリデン基）、Ｃ３アルキレン基（プロピリデン基、プロピレン基、トリメチレン基、イソプロピリデン基）、Ｃ４アルキレン基（例、テトラメチレン基）、Ｃ５アルキレン基（例、ペンタメチレン基）、Ｃ６アルキレン基（例、ヘキサメチレン基）が挙げられる。ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体としては、例えば、ＨＯ－［ポリオキシエチレンブロック］－［ポリオキシアルキレンブロック］－［ポリオキシエチレンブロック］－Ｈの構造を有するブロック共重合体が挙げられる。ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体は、好ましくは、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体であってもよい。
　「ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体」は、下記の式（ＩＩＩ）で表される一群の化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　式中、ｘ２、ｙ２、ｚ２が、１以上の整数である。
　ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体としては、例えば、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７等が挙げられる。ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体の市販品として、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７等のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。
　本発明の洗浄方法でＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤として用いるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体は、式（ＩＩＩ）で表される化合物であって、
　ｘ２が、１以上の整数であり；
　ｙ２が、１０～１００であり；
　ｚ２が、１以上の整数であり；
　ｘ２＋ｚ２が、２０～３００である
　化合物が好ましい。
　本発明の洗浄方法でＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤として用いるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体は、ＨＬＢ１５以上のポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体がより好ましい。本発明の洗浄方法で用いるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体の好ましい例としては、ポロキサマー１８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８）、ポロキサマー１０８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ３８）、ポロキサマー２１７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ７７）、ポロキサマー２３７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ８７）、ポロキサマー２３８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ８８）、ポロキサマー２８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ９８）、ポロキサマー３８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１０８）、ポロキサマー４０７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７）が挙げられる。本発明の洗浄方法で用いるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体のより好ましい例としては、ポロキサマー１８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８）、ポロキサマー４０７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７）が挙げられる。
　本発明の洗浄方法でＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤として用いる非イオン性界面活性剤は、好ましくはアルコールエトキシレートである。
　細胞外小胞の洗浄におけるＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤の濃度は、細胞外小胞および細胞外小胞を操作する系への夾雑物の吸着を抑制でき、かつ細胞外小胞の破壊を抑制できる濃度である限り特に限定されない。このような濃度は、ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤の種類によっても異なるが、例えば、０．００１～１０．０ｗ／ｖ％である。好ましくは、ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤の濃度は、０．００２ｗ／ｖ％以上、０．００５ｗ／ｖ％以上、または０．０１ｗ／ｖ％以上であってもよい。このような濃度はまた、ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤の種類によっても異なるが、７．５ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、または２．０ｗ／ｖ％以下であってもよい。より好ましくは、ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤の濃度は、０．００２～７．５ｗ／ｖ％、０．００５～５．０ｗ／ｖ％、または０．０１～２．０ｗ／ｖ％であってもよい。
　本発明の洗浄方法で用いるＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤は、水溶液であってもよい。水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、および純水）、ならびに緩衝液が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、ホウ酸緩衝液、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）１－ピペラジニルエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは中性が好ましい。より具体的には、このようなｐＨは、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、さらにより好ましくは６．０以上であってもよい。ｐＨはまた、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．５以下、さらにより好ましくは８．０以下であってもよい。ｐＨの測定は、当該分野における公知の方法を用いて行うことができる。好ましくは、ｐＨは、ガラス電極を有するｐＨ計を用いて２５℃で測定された値を採用することができる。
　細胞外小胞の洗浄における温度は、例えば、４～４５℃であり、好ましくは、１５～４０℃であってもよい。洗浄における時間は、細胞外小胞への夾雑物の吸着を抑制するために十分な時間である限り特に限定されず、例えば、１秒以上、５秒以上、１０秒以上、または２０秒以上であってもよい。このような時間はまた、４分以下、２分以下、または１分以下であってもよい。細胞外小胞の洗浄では、細胞外小胞とＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤との混合後に、混合液が放置されてもよし、ボルテックスミキサー等により撹拌されてもよいし、ピペッティング操作によりさらに混合されてもよい。
　本発明において、「細胞外小胞の洗浄」とは、細胞外小胞の表面および細胞外小胞を操作する系（例、溶液、容器）において、夾雑物の量を低減させることをいう。夾雑物としては、例えば、タンパク質、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖、脂質、アミノ酸、ビタミン類、ポリアミン、およびペプチドが挙げられる。夾雑物とは、特に、細胞外小胞の分析を妨害する混入物質をいい、例えば、検出バックグラウンドを増強させる夾雑物（例、検出対象と同一または類似の物質）、検出シグナルを減弱させる夾雑物（例、検出対象の検出を阻害する物質）が挙げられる。細胞外小胞の洗浄は、検出対象と同一または類似の物質の量が低減されることが好ましく、検出対象と同一のカテゴリーに属する物質の総量（例えば、検出対象がタンパク質である場合、総タンパク質量）が低減されることがより好ましい。細胞外小胞の操作としては、例えば、細胞外小胞の洗浄、細胞外小胞精製物の製造（すなわち、細胞外小胞の回収）、細胞外小胞の分析が挙げられる。細胞外小胞を操作する容器としては、例えばプラスチック（例、ポリプロピレン）、ガラス等の材質から構成される容器が挙げられ、プラスチックから構成される容器が好ましい。
　本発明の洗浄方法で洗浄された細胞外小胞は、分析に用いることができる。細胞外小胞の分析は、例えば、細胞外小胞中に含まれる成分（ＥＶマーカー）の分析であってもよい。ＥＶマーカーとしては、例えば、ＥＶ内部マーカーおよびＥＶ表面マーカーが挙げられる。ＥＶ内部マーカーとしては、例えば、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、アクチンファミリー、ＴＳＧ１０１、ＡＬＩＸ、Ｃｈａｒｇｅｄ　ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＨＭＰ）ファミリー、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ―ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）ファミリー、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－ＩＩ、Ｒａｂタンパク質、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ（ＰＤＣＤ）６、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｃｒａｍｂｌａｓｅ（ＰＬＳＣＲ）ファミリー、シトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）ファミリー、ラミンファミリー、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、チューブリンファミリー、ＴＡＴＡ　結合タンパク質（ＴＢＰ）、電位依存性アニオンチャネルタンパク質（ＶＤＡＣ）、アミロイドベータ、タウタンパク質が挙げられる。ＥＶ表面マーカーとしては、例えば、テトラスパニン膜タンパク質（細胞外小胞膜特異的４回貫通膜タンパク質、例、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（例、ＣＤ１４７）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－Ｉ、ＥｐＣＡＭが挙げられる。
　本発明の洗浄方法は、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法（例、免疫沈降法）と組み合わせて行なってもよい。この場合、沈降法により細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質（例、抗体）との複合体（例、免疫沈降複合体）を形成させた後で、その複合体をＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤で洗浄してもよい。すなわち、細胞外小胞をＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤で洗浄することは、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体をＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤で洗浄することであってもよい。
　本発明で用いられる細胞外小胞膜結合物質は、上述したＥＶ表面マーカーに親和性を有する物質である。細胞外小胞膜結合物質としては、例えば、上述したＥＶ表面マーカーに対する抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその抗原結合性断片、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。抗原結合性断片は、対象とするＥＶ表面マーカーに対する結合性を維持している抗体断片であればよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。細胞外小胞膜結合物質は、好ましくは抗体またはその抗原結合性断片であり、より好ましくはモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。また、本発明で用いられる細胞外小胞膜結合物質は、一つでも複数を組み合わせてもよい。
　細胞外小胞膜結合物質は、細胞外小胞の分離を容易にするための固相と結合していてもよい。固相としては、例えば、セファロースビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ（磁性粒子）、またはプラスチックプレートを用いることができる。固相への細胞外小胞膜結合物質の固定化は当業者に周知の常法によって行うことができる。
３．細胞外小胞精製物の製造方法
　本発明はまた、細胞外小胞精製物の製造方法を提供する。
　本発明の製造方法は、以下の工程を含む：
（１）細胞外小胞を「ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤」で洗浄すること；および
（２）洗浄された細胞外小胞を分離すること。
　工程（２）における細胞外小胞の分離は、例えば、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法、または超遠心法により行なうことができる。沈降法または超遠心法により細胞外小胞を沈殿させ、次いで、沈殿物を回収することにより、または上清を廃棄することにより、細胞外小胞を回収することができる。沈殿物の回収は、当該分野において公知である任意の方法（例、磁性粒子の集磁、セファロースビーズの遠心分離）により行なうことができる。分離は、好ましくは、単離または精製である。
　工程（２）における細胞外小胞の分離を沈降法により行なう場合、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体の形成は、工程（２）の前に行なってもよい。すなわち、この場合における本発明の製造方法は、以下を含む工程により行なわれてもよい：
（１’）細胞外小胞を細胞外小胞膜結合物質で処理して、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体を形成させること；
（２’）細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体を「ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤」で洗浄すること；および
（３’）細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体を分離すること。
　本発明の製造方法において、細胞外小胞精製物は、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体の形態で得てもよく、遊離の細胞外小胞の形態で得てもよい。細胞外小胞精製物を遊離の形態で得るために、本発明の製造方法は、細胞外小胞を複合体から解離させる工程を含んでもよい。細胞外小胞の複合体からの解離は、当該分野において公知である任意の方法により行なってもよい。
　本発明の製造方法に用いられる「ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤」の種類、「ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤」での処理における各条件、および細胞外小胞膜結合物質は、本発明の洗浄方法で定義したとおりである。
　本発明の製造方法は、細胞外小胞の回収、単離、または精製方法として利用することができる。
　本発明の製造方法により製造された細胞外小胞精製物は、夾雑物の混入量が低減されているので、例えば、分析対象として分析に用いてもよく、ＥＶ標品として用いてもよい。
４．細胞外小胞の分析方法
　本発明はまた、細胞外小胞の分析方法を提供する。
　本発明の分析方法は、本発明の洗浄方法により洗浄された細胞外小胞、または本発明の製造方法により製造された細胞外小胞精製物（以下、これらを「本発明で得られた細胞外小胞」と呼ぶ）を分析することを含む。
　細胞外小胞の分析は、細胞外小胞中に含まれる成分（例、ＥＶ内部マーカー、ＥＶ表面マーカー）の分析であってもよく、細胞外小胞自体の粒子の分析であってもよい。細胞外小胞の分析は、細胞外小胞中に含まれる成分の分析が好ましく、ＥＶ内部マーカーの分析がより好ましい。本発明で得られた細胞外小胞は、夾雑物の混入量が低減されているので、細胞外小胞中に含まれる成分（例、ＥＶ内部マーカー）の分析に好適に用いることができる。
　細胞外小胞中に含まれる成分が分析される場合、分析は、成分の検出または定量である。このような分析はまた、一成分または複数成分の分析である。分析される成分としては、例えば、タンパク質、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖、脂質、アミノ酸、ビタミン類、ポリアミン、およびペプチドが挙げられる。
　成分の分析は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
　分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング、免疫染色、および蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
　分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、逆転写酵素を用いる逆転写（ＲＴ）反応、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる核酸増幅法（例、定量ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ等のＰＣＲ法）、シークエンシング、質量分析法が挙げられる。
　分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
　本発明の分析方法は、細胞外小胞に含まれるマーカーの検出に用いることができる。細胞外小胞に含まれるマーカーとしては、上述したＥＶマーカー（例、ＥＶ内部マーカーおよびＥＶ表面マーカー）が挙げられる。
　細胞外小胞自体（粒子）の分析は、例えば、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。この場合、細胞外小胞の粒子数、粒子の大きさおよび形状、並びにそれらの分布を分析することができる。
　本発明の分析方法は、例えばＥＶ内部マーカーを分析する場合、本発明で得られた細胞外小胞を破壊することをさらに含んでもよい。このような場合、本発明の分析方法は、以下を含む工程により行われる：
（１）本発明で得られた細胞外小胞を破壊すること；および
（２）破壊された細胞外小胞の細胞外小胞内部マーカーを検出すること。
　細胞外小胞の破壊は、例えば、化学物質での処理による破壊、物理的動作での処理による破壊、またはこれらの併用が挙げられる。化学物質としては、例えば、細胞外小胞破壊性物質が挙げられる。細胞外小胞破壊性物質としては、例えば、上述したＥＶ破壊性界面活性剤を用いることができる。細胞外小胞の破壊に用いるＥＶ破壊性界面活性剤としては、上述したＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤（例、アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体）以外の界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ１５未満の非イオン性界面活性剤または炭素鎖の炭素原子数１１以上のイオン性界面活性剤がより好ましい。物理的動作としては、例えば、加圧が挙げられる。
５．キット
　本発明はまた、以下を含むキットを提供する：
（１）ＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤；および
（２）細胞外小胞膜結合物質。
　本発明のキットは、（３）細胞外小胞内部マーカー結合物質をさらに含んでもよい。また、本発明のキットは、（４）ＥＶ破壊性界面活性剤をさらに含んでもよい。
　本発明のキットに含まれるＥＶ洗浄性非イオン性界面活性剤、細胞外小胞膜結合物質、細胞外小胞内部マーカー結合物質、およびＥＶ破壊性界面活性剤は上述したとおりである。本発明のキットは、例えば、本発明の洗浄方法、本発明の回収方法、本発明の製造方法、および本発明の分析方法の簡便な実施に有用である。
　以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１：固相抗体および標識抗体の調製、ならびにＥＶ表面マーカーの測定方法）
（１）抗体固相化粒子（固相抗体）の調製
　１０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で磁性粒子０．０１ｇ／ｍＬに、細胞外小胞（ＥＶ）表面マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１をそれぞれ認識するマウス抗ＣＤ９モノクローナル抗体（富士レビオ社）、マウス抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（富士レビオ社）またはマウス抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（富士レビオ社）０．２ｍｇ／ｍＬを添加し、２５℃で１時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、磁性粒子を集磁し、粒子を洗浄液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）にて洗浄し、抗ＣＤ９抗体固相化粒子、抗ＣＤ６３抗体固相化粒子および抗ＣＤ８１抗体固相化粒子を得た。各抗体固相化粒子を粒子希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液、１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１％ＮａＮ３、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）に懸濁し、各抗体固相化粒子溶液を得た。
（２）アルカリホスファターゼ標識抗体の調製
　脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）（終濃度０．３ｍｇ／ｍＬ）を混合し、３０℃で１時間静置してマレイミド化を行った。次いで、カップリング用反応液（１００ｍＭ　リン酸緩衝液、１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ６．３）中で、Ｆａｂ’化したマウス抗ＣＤ９モノクローナル抗体、マウス抗ＣＤ６３モノクローナル抗体またはマウス抗ＣＤ８１モノクローナル抗体と、マレイミド化ＡＬＰを１：１のモル比で混合し、２５℃で１時間反応させた。反応液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムクロマトグラフィー（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社）を用いて精製し、ＡＬＰ標識抗ＣＤ９抗体、ＡＬＰ標識抗ＣＤ６３抗体およびＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体を得た。各ＡＬＰ標識抗体を標識体希釈液（５０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２、０．３ｍＭ　ＺｎＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％ＮａＮ３、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）に懸濁し、各標識抗体溶液を得た。
（３）ＥＶ表面マーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１）の測定方法
　以下の実施例におけるＥＶ表面マーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１）の測定方法は、次のとおりである。
　測定用サンプル２０μＬを反応槽に分注し、抗ＣＤ９抗体固相化粒子溶液、抗ＣＤ６３抗体固相化粒子溶液、または抗ＣＤ８１抗体固相化粒子溶液５０μＬを分注し、攪拌した。その後、３７℃で８分間インキュベーションし、Ｂ／Ｆ分離・洗浄を行った。固相化抗体に対応するＡＬＰ標識抗体５０μＬを反応槽に分注し、攪拌後３７℃で８分間インキュベーションし、Ｂ／Ｆ分離・洗浄を行った。その後、化学発光基質である３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社）２００μＬを反応槽に分注し、攪拌後３７℃で４分間インキュベーションした後、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社））にて行った。
　磁性粒子に固相化した抗体とＡＬＰ標識抗体は、同一エピトープを認識する抗体を使用した。一つの細胞外小胞上には、複数のＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１が存在するため、固相化抗体と同一エピトープを認識する抗体をＡＬＰ標識抗体として用いたサンドイッチイムノアッセイにより、細胞外小胞およびそのマーカーを測定することが可能である。
（実施例２：ＥＶ表面マーカー測定に基づくＥＶ難破壊性界面活性剤およびＥＶ破壊性界面活性剤のスクリーニング）
　ＥＶ表面マーカーを指標とした細胞外小胞に対する各種界面活性剤の影響を測定して、ＥＶ難破壊性界面活性剤およびＥＶ破壊性界面活性剤のスクリーニングを行った。
　５００μＬのヒト血清検体に、２５０μＬの０．１ｗ／ｖ％の各界面活性剤を含む、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ含有ＰＢＳ（ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ）を添加した（血清検体と混合後のＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの終濃度はそれぞれ５０ｍＭ，ｐＨ７．４）。混合液を、３７℃で３０分、回転反応させて、測定用サンプルとして用いた。その後、測定用サンプルにおけるＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１の反応性（ＥＶ表面マーカー測定量）を実施例１（３）の測定方法に従って測定した。コントロールとして、界面活性剤を含まないＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳを用いた。得られたカウント値から、コントロールのカウント値に対する、各界面活性剤を添加した場合のカウント値の比率（影響率％）を求めた。
　結果を表２に示す。コントロールと比較して、反応性が２０％以上低下している（影響率が８０％より低い）場合は、細胞外小胞が壊れていると判断し、用いた界面活性剤がＥＶ破壊性界面活性剤であると判断した。反応性が２０％以上低下しない（影響率が８０％以上である）場合は、用いた界面活性剤が細胞外小胞に影響を与えない界面活性剤（ＥＶ難破壊性界面活性剤）であると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　この結果より、ＨＬＢ１５以上の非イオン性界面活性剤および炭素鎖の炭素原子数が１０以下の直鎖イオン性界面活性剤は細胞外小胞を破壊しない界面活性剤（ＥＶ難破壊性界面活性剤）となる傾向があることが分かった。これらの界面活性剤は、細胞外小胞洗浄用界面活性剤の候補となり得る。一方、ＨＬＢ１５未満の非イオン性界面活性剤や炭素鎖の炭素原子数１１以上のイオン性界面活性剤は効率よくＥＶを破壊する界面活性剤（ＥＶ破壊性界面活性剤）となる傾向があることが分かった。これらの界面活性剤は、細胞外小胞の破壊に使用可能である。
（実施例３：ＥＶ内部マーカー測定に基づく界面活性剤の濃度依存的ＥＶ破壊性およびＥＶ難破壊性の検討）
　ＥＶ内部マーカーを指標としたＥＶに対する破壊性および難破壊性についての各種界面活性剤の濃度依存的影響を測定した。
　３日間無血清培地で培養したヒト結腸腺癌細胞ＤＵ－１４５の培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を０．２２μｍフィルター（ミリポア社）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社）を用いて濃縮した。濃縮したサンプルを２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、その上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）または５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（５０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ　ＥＧＴＡを含有するＰＢＳ，ｐＨ７．４）を加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１５０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳまたは５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させてＥＶ（ＤＵ－１４５）を得た。ＥＶ（ＤＵ－１４５）の濃度は、Ｑｕｂｉｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により行った。６３μｇ／ｍＬのＥＶ（ＤＵ－１４５）１０μＬと界面活性剤溶液（濃度は表中参照）１０μＬを混合した。室温で３０分、反応させた後に、ルミパルス検体希釈液（富士レビオ社）を１９０μＬ添加した。このサンプルに含まれるＥＶ内部マーカー（ＣＥＡおよびＣＡ１２５）をルミパルスプレストＣＥＡ試薬（富士レビオ社）およびルミパルスプレストＣＡ１２５－ＩＩ試薬（富士レビオ社）を用いて、添付のプロトコルに従い、ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社）にて測定した。
　結果を表３に示す。界面活性剤未添加と比較して、反応性（ＥＶ表面マーカー測定量）が２０％以上上昇しているものは、ＥＶ（ＤＵ－１４５）の膜が破壊されて、ＥＶ内部抗原（ＣＥＡ、ＣＡ１２５）が流出していると判断し、用いた界面活性剤がＥＶ破壊性界面活性剤であると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　この結果より、ＨＬＢ１５以上の非イオン性界面活性剤のうち、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ類およびＰｌｕｒｏｎｉｃ類、炭素鎖の炭素原子数が１０以下の直鎖イオン性界面活性剤であるＣ８ＴＡＢは、ＥＶ（ＤＵ－１４５）を破壊せず、ＥＶ中の抗原が流出しない界面活性剤（ＥＶ難破壊性界面活性剤）であることが分かった。一方、ＨＬＢ１５以上の非イオン性界面活性剤でもＴｗｅｅｎ（登録商標）２０やＴｗｅｅｎ８０はＥＶ（ＤＵ－１４５）を破壊する効果（ＥＶ破壊性）があることが明らかとなった。
（実施例４：ＥＶ操作系における非イオン性界面活性剤による検体成分の容器吸着抑制効果の検討）
　残留総タンパク質量を指標として、ＥＶ操作系における非イオン性界面活性剤による検体成分の容器吸着抑制効果を検討した。
　ポリプロピレン製１．５ｍＬチューブ（ＱＳＰ製）（以下、「反応チューブ」と呼ぶ）中で、５００μＬのヒト血清検体に、２５０μＬの１．５ｗ／ｖ％の各非イオン性界面活性剤を含むＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳを添加した。使用した界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０　、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、Ｃ８ＴＡＢ、ＮＳＳ、Ｃ８ＡＰＳ、ＮＤＳＢ-１９５、ＮＤＳＢ－２５６であった。反応液を、反応チューブ中で３７℃で３０分、回転反応させた後に、反応液を反応チューブから除去した。反応液を除去した反応チューブを、ＰＢＳを洗浄液として５回洗浄した。各洗浄後の洗浄液をそれぞれ個別の新しいチューブに移し、これらを「洗浄フラクション１～５」とした。５回洗浄後の空の反応チューブを、「反応後容器」とした。反応後容器および洗浄フラクションはＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に用いた。反応後容器にはＢＣＡ溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。洗浄フラクション１～５は、２０μＬにＢＣＡ溶液を２００μＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、５６２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で測定して総タンパク質量を測定した。
　結果を表４に示す。評価した非イオン性界面活性剤は何れも、添加することで、洗浄フラクション中に溶出される総タンパク質量が低下し、容器に残っている総タンパク質量は減少した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　この結果から、非イオン性界面活性剤を反応液中に添加することは取得ＥＶサンプル中への夾雑物の混入を低減できることが示された。
（実施例５：免疫沈降によるＥＶ回収における非イオン性界面活性剤による検体成分の容器吸着抑制効果の検討）
　残留総タンパク質量を指標として、免疫沈降によるＥＶ回収における非イオン性界面活性剤による検体成分の洗浄効果を検討した。
　ポリプロピレン製１．５ｍＬチューブ（ＱＳＰ製）（以下、「反応チューブ」と呼ぶ）中で、５００μＬのヒト血清検体に、２５０μＬのＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳを添加し、抗ＣＤ９抗体固相化粒子を０．１５ｗ／ｖ％となるように添加した。反応液を、反応チューブ中で３７℃で３０分、回転反応させた後に、集磁し、上清した。反応後の磁性粒子を、０．０５ｗ／ｖ％の各界面活性剤を含むＰＢＳを洗浄液として５回洗浄した。使用した界面活性剤は実施例４と同様であった。各洗浄後の洗浄液をそれぞれ個別の新しいチューブに移し、これらを「洗浄フラクション１～５」とした。洗浄後の磁性粒子を別の新しいチューブに移した。反応チューブを各条件の洗浄液で１回洗浄し、「免沈後容器」とした。免沈後容器および洗浄フラクション１～５はＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に用いた。免沈後容器にはＢＣＡ溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で３０分で反応させた。洗浄フラクションには、２０μＬにＢＣＡ溶液を２００μＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、５６２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で測定して総タンパク質量を測定した。
　結果を表５に示す。評価した非イオン性界面活性剤はいずれも洗浄液に添加することで、洗浄フラクション中に溶出される総タンパク質量が上昇する傾向があり、容器に残っている総タンパク質量は減少した。特に、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｅｒｔｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８が高い洗浄効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　この結果から、非イオン性界面活性剤を添加した洗浄は取得ＥＶサンプル中への夾雑物の混入を低減させることを見出した。
（実施例６：免疫沈降によるＥＶ回収における非イオン性界面活性剤による洗浄効果の濃度依存性の検討）
　残留総タンパク質量を指標として、免疫沈降によるＥＶ回収における非イオン性界面活性剤による洗浄効果の濃度依存性の評価をした。
　ポリプロピレン製１．５ｍＬチューブ（ＱＳＰ製）（以下、「反応チューブ」と呼ぶ）中で、５００μＬのヒト血清検体に、２５０μＬのＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳを添加し、そこに抗ＣＤ９抗体固相化粒子を０．１５ｗ／ｖ％となるように添加した。反応液を、反応チューブ中で３７℃で３０分、回転反応させた後に、集磁し、上清を別の新しいチューブに移した。反応後の磁性粒子を、各濃度（０ｗ／ｖ％、０．０１ｗ／ｖ％、０．０５ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．２５ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％）でＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０またはＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を含むＰＢＳを洗浄液として５回洗浄した。洗浄後の磁性粒子を別の新しいチューブに移した。反応チューブを各条件の洗浄液で１回洗浄し、「免沈後容器」とした。免沈後容器はＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に用いた。免沈後容器にＢＣＡ溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、５６２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で測定して総タンパク質量を測定した。
　結果を表６および図１に示す。洗浄液中にＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０またはｐｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を０．０１％以上で添加することで、容器に吸着している検体成分（残留総タンパク質）の量が低下し、洗浄効果を示した。特に、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０の方が高い洗浄効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　この結果から、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０を添加した洗浄は、取得ＥＶサンプル中への夾雑物の混入をより低減させることを見出した。
（実施例７：検体からのＥＶの回収における洗浄効果の検討）
　検体からのＥＶの回収における洗浄効果の検討をした。
　ポリプロピレン製１．５ｍＬチューブ（ＱＳＰ製）（以下、「反応チューブ」と呼ぶ）中で、５００μＬのヒト血清検体に、２５０μＬのＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳを添加し、そこに抗ＣＤ９抗体固相化粒子を０．１５ｗ／ｖ％となるように添加した。反応液を、反応チューブ中で３７℃で３０分、回転反応させた後に、集磁し、上清を別の新しいチューブに移した。得られた上清を「ＳＵＰサンプル」とした。反応後の磁性粒子を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）またはＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０含有ＰＢＳ（０．０５ｗ／ｖ％　Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０、ｐＨ７．４）を洗浄液として５回洗浄した。各洗浄後の洗浄液をそれぞれ個別の新しいチューブに移し、これらを「洗浄フラクション１～５」とした。洗浄後の磁性粒子を別の新しいチューブに移し、「免沈後粒子」とした。反応チューブを各条件の洗浄液で１回洗浄し、「免沈後容器」とした。免沈後粒子、免沈後容器および洗浄フラクションはＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に用いた。免沈後粒子および免沈後容器にはＢＣＡ溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。洗浄フラクション１～５には、２０μＬにＢＣＡ溶液を２００μＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、５６２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）で測定して総タンパク質量を測定した。ＳＵＰサンプルおよび洗浄フラクションについては、ルミパルスプレスト　ＣＥＡ試薬（富士レビオ社）を用いて、ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社）にてＣＥＡ量を測定した。
　ＢＣＡアッセイによる総タンパク質量測定の結果を表７に、ＣＥＡ量測定の結果を表８に示す。洗浄液中にＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０を添加することで、無添加の場合と比べて、洗浄フラクション中に溶出される総タンパク質量が上昇し、さらに免疫後容器に残っている総タンパク質量は６２．３％にまで減少した。また、洗浄液中にＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０を添加することで、洗浄フラクション中に溶出されるＣＥＡ量が上昇し、容器に残っているＣＥＡ量は減少した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　これらの結果から、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－ｓ－３０を添加した洗浄は取得ＥＶサンプル中への夾雑物の混入を低減させることを見出した。
（実施例８：ＥＶマーカー測定による洗浄効果の確認）
　検体からＥＶを回収し、破砕してＥＶ中のマーカーを測定した。
　ポリプロピレン製１．５ｍＬチューブ（ＱＳＰ製）（以下、「反応チューブ」と呼ぶ）中で、５００μＬのヒト血清検体に、２５０μＬのＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳを添加したものを「原液サンプル」とした。原液サンプルに、抗ＣＤ９抗体固定化粒子、抗ＣＤ６３抗体固定化粒子、抗ＣＤ８１抗体固定化粒子、またはこれらの混合物を０．１５ｗ／ｖ％となるように添加した。反応液を、反応チューブ中で３７℃で３０分、回転反応させた後に、集磁し、上清を別の新しいチューブに移した。これらを「ＳＵＰサンプル」とした。反応後の磁性粒子を０．０５％のＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０を含むＰＢＳを洗浄液として５回洗浄した。各洗浄後の洗浄液をそれぞれ個別の新しいチューブに移し、これらを「洗浄フラクション１～５」とした。洗浄後の磁性粒子を含む容器（反応チューブ）にＬｙｓｉｓバッファー（Ｄ－ＰＢＳ（－）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１．０％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、２．０％　Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート、ｐＨ７．４）を２０μＬ添加した。室温で５分、反応させて、細胞外小胞を溶解した。その後、集磁し、上清を１８０μＬのルミパルス検体希釈液（富士レビオ社）に希釈し「Ｌｙｓｉｓサンプル」を得た。
　まず、ＥＶ表面マーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１）に特異的に結合する抗体を用いた免疫沈降法によって、原液サンプル中の細胞外小胞が回収されていることを確認するために、原液サンプル及びＳＵＰサンプル中のＥＶ表面マーカーを実施例１の測定方法で測定した。ブランクとして、ルミパルス検体希釈液（富士レビオ社）を同様に測定した。得られたカウント値から、ＥＶ回収率（＝（１－（ＳＵＰサンプル－ブランク）／（原液サンプル－ブランク））×１００（％））を求めた。
　結果を表９に示す。その結果、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体をそれぞれ用いた免疫沈降法によって回収されたＥＶの回収率が、いずれも９０％を超えていることから、血清検体中のＥＶを免疫沈降により回収できることが確認された。また全自動化学発光酵素免疫測定システムによってＥＶの回収効率を評価できることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　次に、原液サンプル、ＳＵＰサンプルおよびＬｙｓｉｓサンプルのＣＥＡの反応性を実施例３と同様に測定した。この測定では、抗ＣＤ９抗体固定化粒子、抗ＣＤ６３抗体固定化粒子および抗ＣＤ８１抗体固定化粒子の混合物を用いた免疫沈降法によって得られたサンプルを、ＳＵＰサンプル及びＬｙｓｉｓサンプルとして用いた。またＬｙｓｉｓサンプルのＣＥＡの反応性がＣＥＡに特異的な反応であることを確認するため、抑制試験を行った。具体的には、ルミパルスプレストＣＥＡ試薬で用いられている抗ＣＥＡ抗体のエピトープ領域と同じ領域を認識する抗体をＣＥＡ試薬に添加して、実施例３と同様にしてＣＥＡを測定した（抑制カウント）。
　結果を表１０に示す。ＣＥＡを測定した結果、原液サンプルおよびＳＵＰサンプルの発光強度は、２００００００カウント前後であったことから、血清検体中には多くのＣＥＡが含まれることが分かった。一方でＬｙｓｉｓサンプルの発光強度は、２０２５カウントであり、血清検体中に含まれるＣＥＡに比べて、ＥＶ由来のＣＥＡ量は非常に少ないこと、本発明の方法によって、ＥＶ由来のＣＥＡを測定することが可能であることが示された。再度ＣＥＡを測定したところ、Ｌｙｓｉｓサンプルのカウント値は１９５０カウントとなり再現性が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　抑制試験の結果、Ｌｙｓｉｓサンプルの発光強度は８９０カウントとなった。抑制率（＝（（１－（抑制カウント－ブランクカウント）／（Ｌｙｓｉｓサンプルのカウント－ブランクカウント））×１００（％））が９０％以上であることから、ＬｙｓｉｓサンプルのＣＥＡの反応性がＣＥＡに特異的な反応であることが確認された。再度同様の実験を行い、Ｌｙｓｉｓの反応性は１５８９カウントとなり、抑制試験では８３７カウントとなり、抑制率が９０％以上となり再現性が確認された。
　さらに、抗体が結合していない磁性粒子（未感作粒子）を用いて、同様の試験を行ったところ、Ｌｙｓｉｓサンプルの発光強度は８２４カウントとなり、ＣＥＡに対する反応性を示さなかった。従って、所定の非イオン性界面活性剤を洗浄液に添加することによって、検体中に含まれるＣＥＡの磁性粒子への非特異的な吸着も抑制できることが分かった。
　これらの結果から、所定の非イオン性界面活性剤を洗浄液に添加することによって、ヒト検体から細胞外小胞を特異的に抽出し、細胞外小胞中のＣＥＡを特異的に検出できることが明らかとなった。

Claims (18)

  1. 　細胞外小胞を、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘが、１～３００である〕で表される構造を含む鎖状化合物である、非イオン性界面活性剤で洗浄することを含む、細胞外小胞の洗浄方法。
  2. 　前記非イオン性界面活性剤が、アルコールエトキシレートである、請求項１に記載の方法。
  3. 　アルコールエトキシレートが、式（Ｉ）で表される化合物である、請求項２に記載の方法:
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式中、ｘが、１５～１００であり；
    　ｙが、０以上の整数であり；
    　ｚが、０以上の整数であり；
    　ｙ≧ｚであり；
    　ｙ＋ｚが、５～３０である。
  4. 　アルコールエトキシレートが、ＨＬＢ１５以上または炭素鎖の炭素原子数が１６以下のアルコールエトキシレートである、請求項２または３に記載の方法。
  5. 　前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体である、請求項１に記載の方法。
  6. 　ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体が、式（ＩＩＩ）で表されるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体である、請求項５に記載の方法:
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　式中、ｘ２が１以上の整数であり；
    　ｙ２が、１０～１００であり；
    　ｚ２が、１以上の整数であり；
    　ｘ２＋ｚ２が、２０～３００である。
  7. 　細胞外小胞が、０．００１～１０．０ｗ／ｖ％の前記非イオン性界面活性剤で処理される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　細胞外小胞が、エクソソームである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　細胞外小胞を前記非イオン性界面活性剤で洗浄することが、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体を前記非イオン性界面活性剤で洗浄することである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　以下を含む、細胞外小胞精製物の製造方法：
    （１）細胞外小胞を、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘが、１～３００である〕で表される構造を含む鎖状化合物である、非イオン性界面活性剤で洗浄すること；および
    （２）洗浄された細胞外小胞を分離すること。
  12. 　前記非イオン性界面活性剤がアルコールエトキシレートまたはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　以下を含む工程により行なわれる、請求項１１または１２に記載の方法：
    （１’）細胞外小胞を細胞外小胞膜結合物質で処理して、細胞外小胞と細胞外小胞膜結合物質との複合体を形成させること；
    （２’）前記複合体を前記非イオン性界面活性剤で洗浄すること；および
    （３’）前記複合体を分離すること。
  14. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により洗浄された細胞外小胞、または請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞外小胞精製物を分析することを含む、細胞外小胞の分析方法。
  15. 　分析が、細胞外小胞内部マーカーの検出により行われる、請求項１４に記載の方法。
  16. 　細胞外小胞内部マーカーが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）またはＣＡ１２５である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　以下を含む工程により行われる、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法：
    （１）請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により洗浄された細胞外小胞、または請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞外小胞精製物を、破壊すること；および
    （２）破壊された細胞外小胞の細胞外小胞内部マーカーを検出すること。
  18. 　以下を含む、キット：
    （１）－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈ〔式中、ｘが、１～３００である〕で表される構造を含む鎖状化合物である、非イオン性界面活性剤；および
    （２）細胞外小胞膜結合物質。
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