JP6912823B2 - 細胞外小胞の回収方法 - Google Patents
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Description
〔1〕以下を含む、細胞外小胞の回収方法:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること;および
(2)キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
〔2〕キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シュウ酸、エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMP)、およびそれらの塩、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、〔1〕に記載の方法。
〔3〕細胞外小胞含有試料が、1〜200mMのキレート剤で処理される、〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕細胞外小胞含有試料が、20〜200mMのキレート剤で処理される、〔3〕に記載の方法。
〔5〕細胞外小胞がエクソソームである、〔1]〜〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法、又は細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕細胞外小胞膜結合物質がCD9に対する抗体である、〔6〕に記載の方法。
〔8〕細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または乳汁である、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕以下を含む、細胞外小胞の分析方法:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること;
(2)キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;および
(3)分離された細胞外小胞を分析すること。
〔11〕分離された細胞外小胞中のタンパク質が分析される、〔10〕に記載の方法。
〔12〕キレート剤および細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
〔13〕細胞外小胞と細胞外小胞吸着タンパク質との結合の抑制方法であって、
細胞外小胞吸着タンパク質が結合した細胞外小胞をキレート剤で処理して、細胞外小胞から細胞外小胞吸着タンパク質を解離させることを含み、
細胞外小胞吸着タンパク質が、アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質4、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質2ホモログ、トリプシン−2、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−1B−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖V−III領域WOL、ヘモペキシン、アンチトロンビン−III、プロトロンビン、ゲルソリン、補体C1サブ成分、補体因子B、補体成分C9、フィコリン−2、血清パラオキソナーゼ/アリレステラーゼ1、免疫グロブリンκ鎖V−I領域Daudi、および免疫グロブリン重鎖V−III領域TURからなる群より選ばれる1以上のタンパク質である、方法。
〔14〕アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質4、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質2ホモログ、トリプシン−2、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−1B−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖V−III領域WOL、ヘモペキシン、アンチトロンビン−III、プロトロンビン、ゲルソリン、補体C1サブ成分、補体因子B、補体成分C9、フィコリン−2、血清パラオキソナーゼ/アリレステラーゼ1、免疫グロブリンκ鎖V−I領域Daudi、および免疫グロブリン重鎖V−III領域TURからなる群より選ばれる1以上の細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、遊離した天然の細胞外小胞。
〔15〕前記群より選ばれる全ての細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、〔14〕に記載の細胞外小胞。
〔16〕前記細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度が50%以上である、〔14〕または〔15〕に記載の細胞外小胞。
〔17〕前記細胞外小胞が単離または精製されている、〔14〕〜〔16〕のいずれかに記載の細胞外小胞。
〔18〕前記細胞外小胞がエクソソームである、〔14〕〜〔17〕のいずれかに記載の細胞外小胞。
〔19〕前記細胞外小胞が、以下:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること;および
(2)キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;
を含む方法により得られるものである、〔14〕〜〔16〕のいずれかに記載の細胞外小胞。
〔20〕(A)アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質4、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質2ホモログ、トリプシン−2、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−1B−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖V−III領域WOL、ヘモペキシン、アンチトロンビン−III、プロトロンビン、ゲルソリン、補体C1サブ成分、補体因子B、補体成分C9、フィコリン−2、血清パラオキソナーゼ/アリレステラーゼ1、免疫グロブリンκ鎖V−I領域Daudi、および免疫グロブリン重鎖V−III領域TURからなる群より選ばれる1以上の細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、遊離した天然の細胞外小胞を含み、
(B)前記1以上の細胞外小胞吸着タンパク質を含まない、溶液。
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること;および
(2)キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること;
(2)キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;および
(3)分離された細胞外小胞を分析すること。
分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ(CLIA)〔例、化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)〕、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫測定法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、およびサンドイッチELISA)、放射イムノアッセイ(RIA)、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ(FIA)、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting、FACS)が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー(例、2、3、または4個のプライマー)を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
具体的には、以下のとおりである。まず、細胞外小胞のキレート剤処理後の細胞外小胞マーカー免疫染色強度がプラトーに到達するまでキレート剤濃度を増加させていき、プラトーに到達した免疫染色強度(a)を測定する。したがって、(a)は解離度100%のときの値となる。つぎに、対象となる濃度のキレート剤処理後の細胞外小胞マーカー免疫染色強度(b)を測定する。そして、(b)/(a)を算出することにより、上記比率値を間接的に算定することができる。
上記解離度について、図2AにおけるEDTA処理の免疫染色の結果を参照して、より具体的に説明する。10mM EDTA処理と50mM EDTA処理後の免疫染色強度はほぼ一致することから、細胞外小胞マーカー(CD9)に基づく免疫染色強度はプラトーに到達していることが理解できる。よって、10mM EDTA処理により、ほぼ全ての細胞外小胞中着タンパク質(細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞に天然に吸着している細胞外小胞吸着タンパク質の総量)が細胞外小胞から解離していると見積もることができる。そして、1mM EDTA処理後の免疫染色強度は10mMまたは50mM EDTA処理後の免疫染色強度の約30%であるから、1mM EDTA処理後では、細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度は、約30%であると評価することができる。
キレート剤の効果を確認するために免疫沈降法による細胞外小胞の一種であるエクソソームの沈降量への影響を検討した。
300μLの血清検体を、600μLのPBSまたはEDTAおよびEGTA含有PBS(EDTAおよびEGTAの終濃度はそれぞれ50mM)で希釈し、室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにエクソソームの表面マーカーであるCD9を認識するモノクローナル抗体(自社モノクローナル抗体および市販モノクローナル抗体(コスモバイオ社製))をそれぞれ2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads(ライフテクノロジーズ社製))を添加した。4℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをPBSで3回洗浄し、サンプルを磁性ビーズから溶出させ、SDSを含有するサンプルバッファー(BIO−RAD社製)で希釈してウェスタンブロッティング用サンプルとした。ウェスタンブロッティング用サンプルでは、エクソソームを含むサンプルがSDSで処理されることにより、エクソソームが破壊され、エクソソームのマーカータンパク質(例、CD9)がサンプル溶液中に放出されている。PBSで希釈した血清検体に由来するサンプルをcontrol、EDTA/EGTA/PBSで希釈した血清検体に由来するサンプルをEDTA/EGTAとし、両サンプルを自社製ビオチン化抗CD9抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、自社抗体および市販抗体において、キレート剤(EDTAおよびEGTA)添加条件でエクソソーム(CD9)の免疫沈降量が大幅に増加した(図1)。
この結果から、キレート剤が免疫沈降法によるエクソソーム回収の効率を向上させる効果を有することが示された。
キレート剤の種類および濃度とエクソソームの免疫沈降量との関係を検討した。
キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA・2Na)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シュウ酸二水和物、エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMP)(EDTA・2Na、EGTAは同仁化学研究所社製、HEDTA、HIDA、NTA、EDTMPは東京化成工業社製、シュウ酸二水和物は和光純薬工業社製)を使用した。各キレート剤のエクソソームの沈降量への影響を検討した。
300μLの血清検体または血漿検体を、600μLのPBSまたは各キレート剤添加PBSで希釈した。各キレート剤の濃度はそれぞれ終濃度で1、10および50mMとなるように使用した(ただし、EDTMPのみは1、10および30mM)。次いで、溶液を室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこに、CD9を認識する自社モノクローナル抗体を2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads)を添加した。4℃で一晩反応させた後に、磁性ビーズをPBSで3回洗浄し、サンプルをサンプルバッファー(SDS含有)で磁性ビーズから溶出し、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。これらのサンプルをビオチン化抗CD9抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、血清(図2A)および血漿(図2B)の両方において、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、濃度が高くなるにつれてエクソソームの免疫沈降量が増加した。特に、30mMのEDTMP、50mMのEDTA、EGTA、HEDTA、NTA、シュウ酸で、エクソソームの免疫沈降量が大幅に増加した(図2A、2B)。
これらの結果から、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、キレート剤の濃度が高くなるにつれて免疫沈降法によるエクソソーム回収の効率を向上させる効果を有することが示された。
超遠心法によるエクソソーム調製におけるキレート剤のエクソソーム回収効率に対する効果を検討した。
300μLの血漿検体(#1および#2の2種類)を、600μLのPBSまたはEDTAおよびEGTA含有PBS(EDTAおよびEGTAの終濃度はそれぞれ50mM)で希釈し、室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、その上清を、100,000×g、4℃で3時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁した後、150,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁してサンプルを得た。サンプルのタンパク質定量をBCA assay kit(サーモサイエンティフィック社製)により行った。サンプルをサンプルバッファー(SDS含有)で希釈してウェスタンブロッティング用サンプルとした、ウェスタンブロッティングには各サンプルをタンパク質の量として1.5μg使用した。サンプル中のCD9をビオチン化抗CD9抗体により、検出した。
その結果、キレート剤を用いた回収条件で、等量タンパク質中におけるCD9の量が増加した(表1および図3)。
この結果から、超遠心法においても、キレート剤での処理によって回収産物中のエクソソームの純度が増し、エクソソーム回収効率が向上したことが示された。このことは、キレート剤での処理によって、エクソソーム表面の夾雑物が減少したことによると考えられる。
超遠心法による培養細胞由来のエクソソームの回収において、キレート剤での処理によるエクソソーム回収効率に対する効果を検討した。
3日間無血清培地で培養したヒト結腸腺癌細胞LoVoの培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra−15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮したサンプルを20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、その上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、150,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させてサンプルを得た。サンプルの粒子数および分布の測定をNanoSight(Malvern Instruments社製)により行った。サンプル中のCD9およびエクソソームに存在すると報告されているCEA(Dai et al., Clin Cancer Res. 2005 Oct 15;11(20):7554―63)の検出を、ビオチン化抗CD9抗体および抗CEA抗体(アブカム社製)でのウェスタンブロッティングにて行った。
その結果、ウェスタンブロッティングの結果から、エクソソームマーカー(CD9およびCEA)のタンパク質の量が、キレート剤を用いた回収条件で増加した(図4A)。NanoSightの結果から、100〜200nmの粒子(エクソソームを示すと考えられる)が、キレート剤を用いた回収条件で顕著に増加した(表2、図4B)。
これらの結果から、超遠心法によるエクソソームの回収において、再懸濁時におけるキレート剤での処理がエクソソームの回収量を飛躍的に改善させたことが示された。これは、キレート剤での処理によって、夾雑物が減少し、エクソソームの再懸濁を促進したため、エクソソーム回収効率が増加したと考えられる。
免疫沈降法によるエクソソームの回収における、キレート剤による処理の効果および夾雑物混入の影響を検討した。
3日間無血清培地で培養したヒト膵臓腺癌細胞BxPC−3の培養上清と、その培養上清に20mg/mLアルブミン(ミリポア社製)を添加したサンプルを調製した。500μLのこれらのサンプルを、等量のPBSまたはEDTAおよびEGTA含有PBS(EDTAおよびEGTAの終濃度はそれぞれ50mM)で希釈し、室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにCD9を認識する自社モノクローナル抗体を2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads)を添加した。
4℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをPBSで3回洗浄し、BRUB(Britton & Robinson Universal Buffer)を40μL添加して粒子を磁性ビーズから溶出させた。室温で10分放置した後、磁性ビーズを集磁し、回収した上清をPBSで希釈し、NanoSight(Malvern Instruments社製)にて粒子数および分布の測定を行った。
その結果、アルブミン非存在下では、キレート剤非添加条件と比較してキレート剤添加条件で回収された粒子数が増加した(表3、図5aおよびb)。アルブミン存在下でも、キレート剤非添加条件と比較してキレート剤添加条件で回収された粒子数が増加した(表3、図5cおよびd)。キレート剤非添加条件では、アルブミン非存在下と比較してアルブミン存在下で回収された粒子数が約10%程度にまで減少した(表3、図5aおよびc)。しかし、キレート剤添加条件では、アルブミン非存在下と比較してのアルブミン存在下で回収された粒子数の減少が約40%程度であった(表3、図5bおよびd)。
これらの結果から、夾雑物としてのアルブミンの存在下または非存在下のいずれにおいても、キレート剤がエクソソーム回収効率を上昇させる効果を有することが示された。このことは、エクソソームの周囲のアルブミンはエクソソーム回収の妨げとなるが、キレート剤にはその妨げを抑制する効果があり、その結果エクソソームの回収効率が上昇したと考えられる。
キレート剤によるエクソソーム含有試料の処理によるエクソソームへの夾雑物の吸着の抑制を、プロテオミクス分析により確認した。
300μLの血清検体を600μLのPBSまたはEDTAおよびEGTA含有PBS(EDTAおよびEGTAの終濃度はそれぞれ50mM)で希釈し、室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにCD9を認識する自社抗体を2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads)または、抗体を固定化していない磁性ビーズ(Protein G Dynabeads)を添加した。4℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをPBSで3回洗浄し、溶出液を磁性ビーズから溶出させ、サンプルバッファー(SDS含有)を添加後SDS−PAGEを行った。
泳動後のゲルから11バンド/レーンを切り出した後、水で洗浄し、アセトニトリル(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)で脱水した。ゲルを遠心エバポレーター(東京理化器械株式会社製)で完全に乾燥させた後、50μLの0.01M DTT/100mM重炭酸アンモニウム(シグマアルドリッチ社製)で56℃、45分還元した。ゲルを室温に戻し、2μLの0.25Mヨードアセトアミド(和光純薬社製)/100mM重炭酸アンモニウムを添加し、暗所で15分室温で反応させた。上清を除去後、ゲルを50μLの100mM重炭酸アンモニウムで洗浄した。さらに50μLの50mM重炭酸アンモニウム/50%アセトニトリルで洗浄後、30μLの100%アセトニトリルで洗浄し、遠心エバポレーターで乾燥させた。
得られたゲルに20μLの0.1%Rapigest SF試薬(Waters社製)/50mM重炭酸アンモニウムを添加し、37℃、10分反応させた後、上清を除去し、遠心エバポレーターで乾燥させた。乾燥させたゲルに50mM重炭酸アンモニウムで希釈した20ng/μLのTrypsin/Lys−C Mix, Mass Spec Grade(プロメガ社製)を20μL加え、氷上で15分ゲルに浸透させた。ゲルが乾燥しないように50mM重炭酸アンモニウムを20μL加えた後、ゲルを37℃で18時間インキュベートした。反応後のゲルに50μLの50%アセトニトリル/1%TFA(サーモサイエンティフィック社製)を添加し、37℃10分間インキュベート後、抽出液を回収した。これを二度繰り返した。最後に80%アセトニトリル50μLを加え、ゲルを37℃2分インキュベートした後、抽出液を回収した。すべての抽出液を一つにまとめた後、遠心エバポレーターで濃縮乾固し、ペプチドを含むサンプルを得た。
得られたペプチドを含むサンプルに10μLの0.1%ギ酸水(サーモサイエンティフィック社製)を加えて溶解したのち、LC−MS(LC:eksigent社製、質量分析装置:Triple TOF 5600+、エービーサイエックス社製)で質量分析測定を行った。タンパク質の同定はProteinPilotVer4.5beta(エービーサイエックス社製)で行った。
質量分析測定の結果、PBS希釈かつCD9抗体結合ビーズ条件で同定されたタンパク質から、EDTA/EGTA希釈かつCD9抗体結合ビーズ条件で同定されたタンパク質およびPBS希釈かつ抗体非結合ビーズ条件で同定されたタンパク質を除いたタンパク質を表4に示す。表4に示される種々のタンパク質がキレート材処理によりエクソソームへの吸着が抑制されたことが示された。
この結果から、キレート剤での処理により種々のタンパク質のエクソソームへの吸着を抑制できることから、エクソソームのより高精度のプロテオミクスが可能になることが示された。また、かかる吸着の抑制により、より均一な品質のエクソソームの提供が可能になると期待される。
免疫沈降法による尿中エクソソームの回収における、キレート剤による処理の効果を検討した。
300μLの尿検体を、600μLのPBSまたはEDTAおよびEGTA含有PBS(EDTAおよびEGTAの終濃度はそれぞれ50mM)で希釈し、室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにエクソソームの表面マーカーであるCD9を認識する自社モノクローナル抗体を2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads(ライフテクノロジーズ社製))を添加した。4℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをPBS−Tで3回洗浄し、サンプルを磁性ビーズから溶出させ、SDSを含有するサンプルバッファー(BIO−RAD社製)で希釈してウエスタンブロッティングのサンプルとした。
PBSにて希釈したサンプルをcontrol、EDTA/EGTA/PBSで希釈したサンプルをEDTA/EGTAとし、ビオチン化した抗CD9抗体によるウエスタンブロッティングで分析した。
その結果、キレート剤(EDTAおよびEGTA)添加条件でエクソソーム(CD9)の免疫沈降量が増加した(図6)。
この結果から、尿検体においても、キレート剤が免疫沈降法によるエクソソーム回収の効率を向上させる効果を有し、本発明が尿検体にも利用可能であることが示された。
超遠心法による牛乳由来のエクソソームの回収において、キレート剤での処理によるエクソソーム回収効率に対する効果を検討した。
市販牛乳20mLに酢酸を1/10vol加え、転倒混和したのち、2,000×g、4℃で5分間遠心した。上清を0.45μmフィルター(ミリポア社製)、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で順に濾過した後、Amicon Ultra−15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮したサンプルを20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、その上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、150,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させてサンプルを得た。2.0M、1.5M、1.0M、0Mの各濃度のsucrose/PBSを調製し、2.0M、1.5M、1.0M、0Mの順に、1.4mL、1.0mL、1.4mL、0.8mLずつ超遠心用チューブに充填した。その上層に再懸濁したサンプルを200μLアプライし、150,000×g、4℃で16時間超遠心した。遠心後、回収したサンプルの粒子数および分布の測定をNanoSight(Malvern Instruments社製)により行った。NanoSightの結果から、100〜200nmの粒子(エクソソームを示すと考えられる)が、キレート剤を用いた回収条件で顕著に増加した(表5、図7)。
この結果から、超遠心法による牛乳中エクソソームの回収において、再懸濁時におけるキレート剤での処理がエクソソームの回収量を飛躍的に改善させたことが示された。これは、キレート剤での処理によって、夾雑物が減少し、エクソソームの再懸濁を促進したため、エクソソーム回収効率が増加したと考えられる。
Claims (9)
- 以下を含む、細胞外小胞の回収方法:
(1)細胞外小胞含有試料を20〜200mMの濃度のキレート剤で処理すること;および
(2)キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。 - キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シュウ酸、エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMP)、およびそれらの塩、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 細胞外小胞がエクソソームである、請求項1または2記載の方法。
- 分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法、又は細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞外小胞膜結合物質がCD9に対する抗体である、請求項4に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または乳汁である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む、細胞外小胞の分析方法:
(1)細胞外小胞含有試料を20〜200mMの濃度のキレート剤で処理すること;
(2)キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること;および
(3)分離された細胞外小胞を分析すること。 - 分離された細胞外小胞中のタンパク質が分析される、請求項8に記載の方法。
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