CN112322583B

CN112322583B - 基于凝血的细胞外囊泡捕获技术

Info

Publication number: CN112322583B
Application number: CN202011040301.9A
Authority: CN
Inventors: 盛滔; 张亚楠
Original assignee: Shanghai 3D Medicines Co Ltd
Current assignee: Shanghai 3D Medicines Co Ltd
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2040-09-28
Also published as: CN112322583A

Abstract

本发明涉及基于凝血的细胞外囊泡捕获技术。具体而言，本发明涉及一种基于凝血的用于捕获细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含带负电荷或亲水的材料；以及任选地，足以允许发生凝血级联的组分。另外，本发明还涉及一种基于凝血的用于捕获细胞外囊泡的方法，其特征在于所述方法包括将带负电荷或亲水的材料与含细胞外囊泡的样品一起孵育。

Description

基于凝血的细胞外囊泡捕获技术

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及细胞外囊泡的捕获。

背景技术

细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称。根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150 nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19 g/mL；微粒/微囊泡（microparticle/microvesicle）直接从质膜释放，直径约100-1000 nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50 nm-2 μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（largeoncosome）直径约1-10 μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。目前研究热点是外泌体这个亚群。

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主/病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾病、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能。已有文章报道细胞外囊泡在机体的生长发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态、治疗反应、疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

目前细胞外囊泡的提取方法主要包括差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法、基于微流控的细胞外囊泡捕获技术以及免疫亲和磁珠法等。这些方法中，差速离心法分离细胞外囊泡需要的时间较长，大概需要140-600 min，且有着对设备要求高、设备昂贵、再现性差、会对细胞外囊泡造成损害、提取效率受不同的设备、转子、样本黏度等影响因素大、通量小等缺点；密度梯度离心法分离细胞外囊泡需要的时间较长，大概需要250 min-2天，且有着对设备要求高、操作复杂、样本损失大、不能有效区分病毒颗粒等缺点；超滤法需要的时间较长，大概需要130 min，且有着滤膜容易堵塞、样本损失大、杂蛋白多、破坏细胞外囊泡形貌等缺点；尺寸排阻色谱法分离细胞外囊泡的纯度受限于样品体积，且有着需要特殊的设备、操纵相对复杂、提取过程中不可避免会混入大的蛋白质聚集体和脂蛋白聚集体、在每个过程中只能处理一个样本等缺点。市面上的细胞外囊泡提取试剂大多数是基于聚合物沉淀法，但是聚合物沉淀法需要的时间相对较长：对于血清、血浆等约65 min，对于尿液等可能需要过夜孵育，且提取的细胞外囊泡中含有非常多的杂蛋白等杂质，还会有聚合物的残留，影响下游的分析。上述提及的差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法等方法以现有的技术无法实现自动化，难以实现临床应用。

基于微流控的细胞外囊泡捕获技术有望实现细胞外囊泡的自动化提取，但是微流控适用于处理微量样本，处理速度大约为1-14 μL/min，过慢的样本处理速度制约了微流控技术对于浓度非常低、含量非常少的基因或蛋白质的检测，因而也难以满足临床需求。

磁珠法是细胞外囊泡自动化提取的主要方向，目前磁珠法提取细胞外囊泡主要依靠的是抗原抗体之间发生的免疫亲和反应。例如专利申请CN107893051A“一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法”利用特异性抗体CD5L与细胞外囊泡（外泌体中最被关注的一个亚型）进行免疫亲和反应，从而实现对CD5L+的外泌体的一个亚型实现了捕获。但是目前为止，还没有发现一种标志物是细胞外囊泡所特有的（CD63、CD9、CD81、CD5L等常用的用于捕获细胞外囊泡的抗原并不是细胞外囊泡所特有的，只是在细胞外囊泡上表达量相对较多），因此基于免疫应答的磁珠法的特异性不是很好；此外，不是每一个细胞外囊泡都具有上述抗原，这就使得基于免疫应答的磁珠法只能捕获一部分细胞外囊泡，捕获效率相对较低；而且，抗体昂贵的价格限制了基于免疫应答的磁珠法的发展。目前市售的磁珠法细胞外囊泡捕获试剂盒绝大多数是基于免疫应答，但是由于抗体昂贵的价格，这些试剂盒都只能用于科研，尚没有磁珠法细胞外囊泡试剂盒通过药监局的注册审批，尚没有磁珠法细胞外囊泡捕获试剂盒可用于临床。而且，磁珠法细胞外囊泡捕获试剂盒的价格都在数千乃至上万元。

此外，基于免疫应答的细胞外囊泡捕获方法需要很长的时间，以专利申请CN107893051A“一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法”为例，为了捕获细胞外囊泡，该方法需要孵育12 h以上。然而，已有相当多的文献报道过长时间的孵育会导致细胞外囊泡的破裂。

因此，亟需开发出基于另一种机理的稳定、可靠、低成本、高效、快速的磁珠法细胞外囊泡捕获试剂盒。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种新的基于凝血的细胞外囊泡捕获机理，并利用该机理开发出一种新的细胞外囊泡捕获技术解决现有的细胞外囊泡捕获技术消耗时间长、捕获效果不稳定、捕获效果差、价格昂贵、难以实现自动化等问题。相对于现有技术需要数小时乃至一天的繁琐手动操作才能提取到细胞外囊泡，本发明在2分钟之内就可以实现细胞外囊泡的高效捕获。

本发明第一方面涉及基于凝血的用于捕获细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含带负电荷或亲水的材料；以及任选地，足以允许发生凝血级联的组分。

在一些实施方案中，所述带负电荷的材料或亲水材料为可以促进凝血的带负电荷的材料或亲水材料；任选地，所述带负电荷的材料或亲水材料为在血浆的生理条件下带负电荷或亲水的材料，例如在表面带负电或亲水的固体支持体，例如带负电荷或亲水的磁珠、SiO₂珠、乳胶珠等球状材料，带负电荷或亲水的玻璃纤维膜、硅胶模、硝酸纤维素膜等多孔膜结构，带负电荷或亲水的微流控通道或采用蚀刻或微纳加工等工艺制备的高比表面积材料以及色谱柱、过滤柱等高比表面积材料。在一些实施方案中，所述材料含有在生理条件下带负电或亲水的基团，比如羟基、羧基、磺酸基、亚硫酸基、酰胺基、醚基等。在一些实施方案中，所述材料在表面上含有等电点<7.4的蛋白质，例如血清白蛋白、胶原蛋白、酪蛋白等蛋白；或蛋白质的组合，所述蛋白质的组合在生理条件下带负电，例如在生理条件下带负电的等电点<7.4的蛋白质与任意其他蛋白质的组合，例如在生理条件下带负电的等电点<7.4的蛋白质与等电点＞7.4的蛋白质的组合，比如在生理条件下带负电的血清白蛋白和等电点＞7.4的亲和素的组合、在生理条件下带负电的血清白蛋白和等电点＞7.4的免疫球蛋白的组合等。

在一些实施方案中，所述材料为在表面上含有蛋白质的磁珠。在一些实施方案中，所述蛋白质与磁珠的质量比为1：10000至1：10例如1:5000-1:100、1:1000-1:500、1:100-1:10、1:2000-1:500、1:3000-1:400、1:80-1:20等或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。在一些实施方案中，所述磁珠为胶原蛋白磁珠、血清白蛋白磁珠或免疫球蛋白磁珠。在一些实施方案中，所述磁珠用血清白蛋白进行封闭。在一些实施方案中，所述用于封闭的血清白蛋白的质量体积分数为1-20 g/100 mL，例如0.01 g/mL-0.1 g/mL、0.1 g/mL-0.5 g/mL或0.05 g/mL-0.15 g/mL或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。

在一些实施方案中，所述组分为或来源于血浆或含血浆的液体。在一些实施方案中，所述血浆为用EDTA、枸橼酸钠、柠檬酸钠、草酸钾/氟化钠等抗凝剂采集的血浆。在一些实施方案中，所述血浆为人血浆、其他动物血浆或合成血浆。在一些实施方案中，所述试剂盒还含有促进凝血发生或促进细胞外囊泡与上述材料结合的其他组分，例如所述其他组分为Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K中的一种或多种。在一些实施方案中，所述试剂盒通过促进凝血发生使得所述细胞外囊泡与所述带负电荷或亲水的材料之间经由凝血因子和/或其活化后的形式例如凝血因子FI、FII、FIII、FIV、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII等和/或其活化后的形式结合在一起，而实现细胞外囊泡的捕获。

本发明第二方面涉及一种基于凝血的用于捕获细胞外囊泡的方法，其特征在于所述方法包括将第一方面所定义的带负电荷或亲水的材料与含细胞外囊泡的样品一起孵育，其中如果所述样品不含足以允许发生凝血级联的物质，则在存在第一方面所定义的足以允许发生凝血级联的组分的情况下进行孵育，以及其中如果所述样品含足以允许发生凝血级联的物质，则可在额外加入或不加入所述组分的情况下进行孵育。在一些实施方案中，所述方法通过促进凝血发生使得所述细胞外囊泡与所述带负电荷或亲水的材料之间经由凝血因子和/或其活化后的形式例如凝血因子FI、FII、FIII、FIV、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII等和/或其活化后的形式结合在一起，而实现细胞外囊泡的捕获。

在一些实施方案中，所述组分为或来源于血浆或含血浆的液体。在一些实施方案中，所述方法还包括向孵育溶液中加入促进凝血发生或促进细胞外囊泡与上述材料结合的其他组分的步骤，例如所述其他组分为Ca²⁺、Zn²⁺和维生素K中的一种或多种。在一些实施方案中，所述Ca²⁺和Zn²⁺来自氯化钙、氯化锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等含有Ca²⁺和Zn²⁺的盐。在一些实施方案中，所述Ca²⁺和Zn²⁺在孵育溶液中的终浓度为0-6 mM例如0-3 mM、0-2 mM、0-1 mM或2-5 mM或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。在一些实施方案中，所述维生素K在孵育溶液中的终浓度为0-10 nM例如0-5 nM、4-8 nM、7-10 nM或1-4 nM或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。在一些实施方案中，所述带负电荷或亲水的材料与Ca²⁺、Zn²⁺和维生素K同时或依次加入。在一些实施方案中，所述依次加入间隔不足以发生显著凝血的时间，例如在5 min、4 min、3 min、2 min、1 min、50 s、40 s、30 s、20 s、10 s、5 s、4s、3 s、2 s或1 s内依次加入。

在一些实施方案中，所述带负电荷或亲水的材料的加入量为每毫升孵育溶液加入0.1-10 mg例如0.1-1 mg、2-5 mg、3-8 mg、0.5-4 mg、0.2-7 mg或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。在一些实施方案中，所述带负电荷或亲水的材料的加入量为每毫升孵育溶液加入0.5-2 mg例如1-1.5 mg、0.8-1.8 mg、1.2-1.9 mg或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。在一些实施方案中，所述孵育时间为45 s-60 min，优选2 min -30 min例如3-10 min、4-20 min、5-25 min、15-28 min或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。在一些实施方案中，所述孵育在0-56℃的温度，例如25℃-37℃下进行。在一些实施方案中，所述血浆或含血浆的液体与含细胞外囊泡的样品的混合比例大于1:10，例如3:10至10:3例如4:10至5:5之间。

在一些实施方案中，所述含细胞外囊泡的样品为血浆样品、血清、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、淋巴、细胞上清、细胞外囊泡的重悬液或它们的任何混合物(例如血浆与血清、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、淋巴、细胞上清或细胞外囊泡的重悬液的混合样品)，并且所述方法可包括在加入或不加入所述足以允许发生凝血级联的组分的情况下，例如在不加入额外的血浆或含血浆的液体的情况下，使所述带负电荷或亲水的材料与所述含细胞外囊泡的样品一起孵育。在一些实施方案中，所述血浆样品为人血浆或其他动物的血浆。在一些实施方案中，所述血浆样品含有抗凝剂例如EDTA、枸橼酸钠、柠檬酸钠或草酸钾/氟化钠，优选EDTA以及枸橼酸钠。在一些实施方案中，如果所述血浆样品不具有足以允许发生凝血级联的组分，则在存在所述足以允许发生凝血级联的组分的情况下，使所述带负电荷或亲水的材料与所述含细胞外囊泡的样品一起孵育。

在一些实施方案中，在孵育之前，对所述样品和/或所述组分进行除去细胞、细胞碎片和/或细胞器的步骤。在一些实施方案中，除细胞外囊泡外，所述血浆或血浆样品基本上不含其他具有磷脂双分子层膜结构的物质。在一些实施方案中，所述其他具有磷脂双分子层膜结构的物质为细胞、细胞碎片或细胞器。

在一些实施方案中，在孵育后，对所述材料进行洗涤。在一些实施方案中，洗涤液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或其他可以维持一定渗透压和pH的缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液中含有一定量的血清白蛋白或吐温-20。在一些实施方案中，所述血清白蛋白在所述缓冲液中的质量体积分数为0.01-1 g/100 mL例如0.1-1 g/100 mL、0.02-0.5 g/100 mL、0.08-0.8 g/100 mL、0.2-0.9 g/100 mL或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。在一些实施方案中，吐温-20的体积百分数为0.01%-0.5%例如0.1%-0.5%、0.02%-0.4%、0.05%-0.1%、0.2%-0.3%或在任何两个前述值之间限定的任何范围内。

在一些实施方案中，在洗涤后，进行回收所述细胞外囊泡的步骤。例如，在洗涤后，将所述细胞外囊泡从捕获了细胞外囊泡的带负电荷或亲水的材料中分离出来，例如通过酶例如可以溶解凝血蛋白的纤溶酶或蛋白酶K处理所述捕获了细胞外囊泡的带负电荷或亲水的材料而进行。

本发明第三方面涉及如第一方面所定义的足以允许发生凝血级联的组分和如第一方面所定义的带负电荷或亲水的材料用于捕获细胞外囊泡的用途，所述捕获包括通过促进凝血发生使得所述细胞外囊泡与所述带负电荷或亲水的材料之间经由凝血因子和/或其活化后的形式例如凝血因子FI、FII、FIII、FIV、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII等和/或其活化后的形式结合在一起。

附图说明

图1为基于凝血的细胞外囊泡捕获机理示意图。

图2显示捕获完细胞外囊泡的凝血磁珠的SEM表征（图中箭头所指为纤维蛋白）。

图3显示用纤溶酶从凝血磁珠上消化下来的细胞外囊泡的TEM表征（图中箭头所指为细胞外囊泡）。

图4显示本发明凝血磁珠与ExoCap对血浆中内源性细胞外囊泡的捕获效率（检测指标B2M）。

图5显示本发明凝血磁珠与ExoCap对血浆中掺入的外源性细胞外囊泡的捕获效率（检测指标AR-V7）。

图6显示利用本发明凝血磁珠使用血浆混合的方法实现对非血浆样本的捕获（检测指标为人的特异性管家基因Homo B2M）。

图7显示利用本发明凝血磁珠使用血浆混合的方法实现对非血浆样本的捕获（检测指标为掺入的外源性细胞外囊泡的AR-V7基因）。

图8显示通过不同方法抑制凝血后，用凝血磁珠对血浆细胞外囊泡进行捕获。

图9显示磁珠包被不同等电点的蛋白对利用凝血原理的细胞外囊泡的捕获效率的影响。

图10显示羧基活化前后对利用凝血原理的细胞外囊泡的捕获效率的影响。

图11显示亲水性对利用凝血机理捕获细胞外囊泡的影响。

具体实施方式

参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来实施本发明。

本发明提出了一种新的基于凝血的细胞外囊泡捕获机理，并应用该技术成功分离了样本中的细胞外囊泡。本发明针对现有技术的缺陷，提供一种新的基于凝血的细胞外囊泡捕获机理，并利用该机理开发出一种新的细胞外囊泡捕获技术来解决现有的细胞外囊泡捕获技术消耗时间长、捕获效果不稳定、捕获效果差、价格昂贵、难以实现自动化等问题。相对于现有技术需要数小时乃至一天的繁琐手动操作才能提取到细胞外囊泡，本发明在2分钟之内就可以实现细胞外囊泡的高效捕获，提取速度最多提升了720倍，同时提取效率提高了120%。

本发明具有如下优点：

1）低成本，不需要特异性抗体，只需可以激起凝血反应的带负电的材料或亲水材料：区别于现有磁珠法利用特异性抗体捕获细胞外囊泡的方法，本发明不需要昂贵的特异性抗体，只需低成本的可以激起凝血反应的带负电的材料或亲水材料就可以；

2）本发明捕获细胞外囊泡的方法具有与现有磁珠法不同的靶标：区别于现有磁珠法利用特异性抗体捕获细胞外囊泡的方法——捕获过程依赖抗原抗体之间的特异性反应，本发明捕获针对的不是特定的抗体或蛋白质，而是细胞外囊泡都具备的磷脂双分子层。本发明利用带负电的材料或亲水材料激活内源性凝血，并在细胞外囊泡的磷脂的参与下完成整个凝血过程，从而将带负电的材料或亲水材料和细胞外囊泡连接在一起，从而实现细胞外囊泡的捕获；

3）本发明利用凝血机理，比现有的细胞外囊泡捕获速度更快：区别于现有磁珠法利用特异性抗体捕获细胞外囊泡的方法——捕获过程依赖抗原抗体之间的反应，捕获时间需要30 min乃至一天；本发明利用凝血反应捕获血浆细胞外囊泡，捕获细胞外囊泡所需的时间少于2 min（凝血反应一般只需要25 s-45 s）；和

4）捕获效率高：本发明针对的不是特定的抗体或蛋白质，而是细胞外囊泡都具备的磷脂双分子层，因此本发明可以捕获更多种类的细胞外囊泡，相对于现有的磁珠法细胞外囊泡捕获技术，本发明具有更高的捕获效率。

本文所用的术语仅以描述具体的实施方案为目的而不意图限制本发明。除非上下文另有明确指示，否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”也意图包括复数形式。此外，开放式的表述“包括”和“包含”解释为还可以含有没有述及的结构组成部分或方法步骤，但需要注意的是，该开放式的表述也涵盖仅由所述的组分和方法步骤组成的情形(即涵盖了封闭式表述“由……组成”的情形)。

如全文所用，范围用作描述该范围内的每个数值和所有数值的简写形式。范围内的任何数值例如整数值、以十分之一递增的值(当范围的端值为小数点后一位时)或以百分之一递增的值(当范围的端值为小数点后二位时)都可选做该范围的终点。例如，范围1：10000至1：10用作描述该范围内的所有数值，例如1:10000、1:9999、1:9998、1:9997、1:9996、1:9995、1:9994、1:9993……1:15、1:14、1:13、1:12、1:11和1:10(所有整数值)，并且包括所有子范围，例如1:5000-1:100、1:1000-1:500、1:100-1:10、1:2000-1:500、1:3000-1:400、1:80-1:20等。

在本文中，术语“样品”和“样本”可互换使用，意指含有细胞外囊泡的材料。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或包括细胞(例如肿瘤细胞)、细胞裂解物在内的细胞培养物和生物或生理流体，例如全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗、尿液、乳汁、腹膜液等。获自来源的样品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆、稀释黏液等)后的样品可直接使用。在本发明的某些方面，样品是人生理流体，例如人血清或人血浆。

如本文所用的短语“在任何两个前述值之间限定的任何范围内”字面上意指可从这样的短语之前所列的任何两个值选择任何范围，而不管该值是在列表的较低部分中还是在列表的较高部分中。例如，可以从两个较低值、两个较高值、或一个较低值和一个较高值中选择一对值。

如本文所用的短语“生理条件”指的是血液尤其是血浆生理条件，例如pH 7.35-7.45，优选pH 7.4。

在本发明中，带负电荷的材料或亲水材料指的是在生理条件下带负电荷或亲水的材料。本发明中使用的材料只要满足带负电荷和亲水中的一个条件即可，因此在亲水的材料的情况下，所述材料可带正电荷或负电荷。在一些实施方案中，本发明中可使用的材料可选自带负电荷的材料、亲水的材料、带负电荷且亲水的材料以及带正电荷且亲水的材料。

血浆凝血因子包括因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII等。这些凝血因子被激活，引起所谓“凝血级联”或链反应中的凝血[Handin，R.I. “出血与止血”(Bleeding and Thrombosis).Wilson，J.等编《Harrison氏内科学原理》(Harrison’sPrinciples of Internal Medicine).第12版，New York，McGraw-Hill Book Co.，1991，p.350]。凝血的发生有两种方式，二者的途径是不同的。内源性或接触途径是接触带负电荷或亲水的材料引起从XII到XIIa到XIa到IXa以及X到Xa的转化。Xa与Va因子将凝血酶原(II)转化为凝血酶(IIa)，引起纤维蛋白原向纤维蛋白的转化。纤维蛋白的聚合作用引起纤维蛋白凝块。外源性途径是由凝血因子Xa将VII转化为VIIa而引发的。在钙离子和磷脂的存在下，组织因子和VIIa的存在加速Xa的生成。Xa的生成引起凝血酶、纤维蛋白和纤维蛋白凝块。

如本文所用的短语凝血因子的“活化后的形式”是指凝血因子活化后的FIa、FIIa、FIIIa、FVa、FVIIa、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、FXIIIa等。

在本发明中，“足以允许发生凝血级联的组分”指的是发生凝血级联、尤其是内源性凝血级联从而导致血液凝固所需的各种凝血因子(例如因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII等)和/或其活化后的形式（例如FIa、FIIa、FIIIa、FVa、FVIIa、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、FXIIIa等）、酶(例如前激肽释放酶(PK)、激肽释放酶(KLK)等)、辅因子(例如锌离子、钙离子、维生素K等)和蛋白(例如高分子激肽原、血管性血友病因子、纤连蛋白等)，并且本领域技术人员在本发明的教导下可以常规地确定所述组分。

在一些实施方案中，所述组分可包括对发生凝血级联从而导致血液凝固所需的全部成分(例如各种凝血因子(例如因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII等)和/或其活化后的形式（例如FIa, FIIa、FIIIa、FVa、FVIIa、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、FXIIIa等）、酶(例如前激肽释放酶(PK)、激肽释放酶(KLK)等)、辅因子(例如锌离子、钙离子、维生素K等)和蛋白(例如高分子激肽原、血管性血友病因子、纤连蛋白等))或由对发生凝血级联从而导致血液凝固所需的全部成分组成。在一些实施方案中，本发明的带负电荷的材料或亲水材料通过接触所述组分而加快或促进凝血反应，从而导致血液凝固和/或促进细胞外囊泡与上述材料结合。在一些实施方案中，所述接触在加入额外的Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K中的一种或多种的情况下进行。所述组分可以储存在一个或多个容器中，并且如果储存在一个容器中时，所述容器优选存在抗凝剂例如EDTA、枸橼酸钠、柠檬酸钠、草酸钾/氟化钠等，以防止在未接触本发明的带负电荷的材料或亲水材料之前发生凝血，因而此时需要加入额外的Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K中的一种或多种以促进细胞外囊泡与上述材料结合。在一些实施方案中，所述组分可为或来源于血浆或含血浆的液体。在一些实施方案中，所述血浆可为人血浆、其他动物血浆或合成血浆。所述其他动物包括哺乳动物，例如啮齿目(大鼠、小鼠、豪猪、海狸、水豚等)、翼手目(蝙蝠等)、食虫目(鼩鼱、鼹鼠、刺猬等)、偶蹄目(猪、牛、羊、马等)、奇蹄目(如马、驴等)、灵长目(如猿猴、狐猴、猩猩等)、长鼻目(如象等)、鲸目(如海豚等)和食肉目(狮、虎、狐、豹、猫等)等。在一些实施方案中，所述血浆来源于具有正常凝血功能或健康的人或其他动物。

本发明提供了一种新的基于凝血的细胞外囊泡捕获机理，基于凝血的细胞外囊泡捕获技术的过程如图1所示，具体而言：

i.在血浆或含有血浆的基质中加入在生理条件下会带负电荷或亲水的磁珠等材料；

ii.凝血因子与负电荷的磁珠或亲水的磁珠等材料相结合：

a)在锌离子的作用下，介导凝血因子FXII（哈格曼因子）和高分子激肽原（HMWK，有时也简写为HK）（菲茨杰拉德因子）结合在负电荷或亲水的磁珠等材料的表面；

b)在锌离子的作用下，引起凝血因子FXII和HMWK的构象改变；

c)在锌离子的作用下，介导结合在负电荷表面的FXII和HMWK与前激肽释放酶（PK）相结合；

d)凝血因子FXII在带负电荷或亲水的磁珠等材料的表面被激活为FXIIa；

iii. 带负电荷或亲水的磁珠等材料激活凝血级联反应

a)在带负电荷或亲水的磁珠等材料表面形成的凝血因子FⅫa可激活前激肽释放酶（PK）使之成为激肽释放酶(KLK)，激肽释放酶(KLK)反过来又能激活凝血因子FⅫ，这一正反馈作用可使FⅫa大量生成，从而激活内源性凝血、发生凝血级联反应；以及

iv. 带负电荷或亲水的磁珠等材料表面或附近的磷脂(由细胞外囊泡的磷脂双分子层膜提供)作为凝血发生的必要物质参与凝血过程，从而实现细胞外囊泡和带负电荷或亲水的磁珠等材料的结合；

a) 带负电荷或亲水的磁珠等材料表面的凝血因子FⅫa生成后，转而催化带负电荷或亲水的磁珠等材料表面的凝血因子FⅪ（抗血友病球蛋白C，通过HMWK等结合在带负电荷或亲水的磁珠等材料表面）活化为FⅪa。形成的FⅪa在凝血因子FⅣ（Ca²⁺）参与下，将带负电荷或亲水的磁珠等材料表面或附近的凝血因子FⅨ（抗血友病球蛋白B）活化为FⅨa，从而实现带负电荷或亲水的磁珠等材料与凝血因子FⅨa的结合；

b)带负电荷或亲水的磁珠等材料表面的凝血因子FⅨa与凝血因子FVIII（抗血友病球蛋白A）结合形成复合物；

c)在钙离子、血管性血友病因子（vWF）以及维生素K的介导下，带负电荷或亲水的磁珠等材料表面的FIXa协同FVIII和/或FVIIIa与细胞外囊泡相结合（通过这个步骤实现带负电荷或亲水的磁珠等材料与细胞外囊泡相结合（结合途径一））；

d)在钙离子以及维生素K的介导下，凝血因子FX（Stuart-Prower因子）与细胞外囊泡相结合；

e) 细胞外囊泡和带负电荷或亲水的磁珠等材料表面及附近的FⅨa、FVIII和/或FVIIIa以及FX结合形成的复合物（酶辅因子底物FIXa-FVIIIa-FX复合物）使细胞外囊泡上的凝血因子FⅩ发生有限水解而激活为FⅩa；和/或

f)在细胞外囊泡表面或附近，凝血因子FIV将凝血因子FⅦ（促凝血酶原激酶原）、凝血因子FⅢ（组织因子）和细胞外囊泡表面的凝血因子FⅩ结合在一起，以便凝血因子FⅦ催化凝血因子FⅩ，使其激活为FⅩa（结合在细胞外囊泡表面的凝血因子FX连通内源性凝血以及外源性凝血，使后续凝血反应发生在细胞外囊泡表面和/或附近，又因为细胞外囊泡和带负电荷或亲水的磁珠等材料因为结合途径一靠在一起，使得后续凝血反应在带负电荷或亲水的磁珠等材料和细胞外囊泡之间发生，从而进一步实现带负电荷或亲水的磁珠等材料和细胞外囊泡的结合（结合途径二））；以及

v. 在后续凝血反应的作用下，进一步稳固细胞外囊泡和带负电荷或亲水的磁珠等材料的结合；

a) 带负电荷或亲水的磁珠等材料和细胞外囊泡表面或附近的凝血因子FⅩa在凝血因子FⅣ和细胞外囊泡共同存在的条件下，与凝血因子FⅤ结合，形成凝血酶原激活物；

b) 带负电荷或亲水的磁珠等材料和细胞外囊泡表面或附近形成的凝血酶原激活物激活细胞外囊泡和带负电荷或亲水的磁珠等材料之间的凝血因子FⅡ（凝血酶原）变为FⅡa（凝血酶）；和

c) FⅡa使细胞外囊泡和带负电荷或亲水的磁珠等材料之间的凝血因子FⅠ（纤维蛋白原）变为FIa（纤维蛋白），从而使带负电荷或亲水的磁珠等材料结合的细胞外囊泡通过纤维蛋白更稳固地结合起来，实现细胞外囊泡的捕获过程。

根据上述原理，本发明提供了一种基于凝血的细胞外囊泡捕获方法，所述细胞外囊泡捕获方法可包括以下步骤：

1)提供带负电荷或亲水的磁珠等材料；

在一些实施方案中，所述带负电荷或亲水的磁珠等材料为在血浆的生理条件(pH7.35-7.45)下带负电荷或亲水的材料，包括但不限于在表面带负电或亲水的固体支持体，例如磁珠、SiO₂珠、乳胶珠等球状材料，玻璃纤维膜、硅胶模、硝酸纤维素膜等多孔膜结构，微流控通道或采用蚀刻或微纳加工等工艺制备的高比表面积材料以及色谱柱、过滤柱等高比表面积材料等。在一些实施方案中，所述带负电荷或亲水的材料可在表面上包含例如但不限于在生理条件下带负电或亲水的基团，比如羟基、羧基、磺酸基、亚硫酸基、酰胺基、醚基等。在一些实施方案中，所述带负电荷或亲水的材料可在表面上含有但不限于等电点<7.4的蛋白质，例如血清白蛋白、胶原蛋白、酪蛋白等蛋白；或蛋白质的组合，前提是所述蛋白质的组合在生理条件下带负电，例如在生理条件下带负电的等电点<7.4的蛋白质与任意其他蛋白质的组合，例如在生理条件下带负电的等电点<7.4的蛋白质与等电点＞7.4的蛋白质的组合，比如在生理条件下带负电的血清白蛋白和等电点＞7.4的亲和素的组合、在生理条件下带负电的血清白蛋白和等电点＞7.4的免疫球蛋白的组合等。在一些实施方案中，所述蛋白质与磁珠的质量比为1：10000-1：10；优选地，所述磁珠为胶原蛋白磁珠、血清白蛋白磁珠或免疫球蛋白磁珠。可选地，所述磁珠用血清白蛋白进行封闭。在一些实施方案中，所述用于封闭的血清白蛋白的质量体积分数浓度为1-20 g/100 mL。

2)含细胞外囊泡的血浆样本的采集；

在一些实施方案中，所述血浆包括人类的血浆或其他生物的血浆。在一些实施方案中，所述血浆来源于具有正常凝血或健康的人或其他动物。在一些实施方案中，所述采集用的采血管的抗凝剂是EDTA、枸橼酸钠、柠檬酸钠、草酸钾/氟化钠等；优选地，采集用的采血管的抗凝剂是EDTA以及枸橼酸钠；优选地，所用采血管中含有的抗凝剂的量为市售采血管本身含有的抗凝剂的量；更优选地，以EDTA采血管为例，每6毫升血液含有的EDTA·2K抗凝剂的量为10.8 mg。在一些实施方案中，将收集的血液通过离心取上清；优选地，上述离心过程的离心条件为：815 g、4℃离心10 min。在一些实施方案中，对所述血浆进行处理以除去细胞、细胞碎片和/或细胞器。在一些实施方案中，通过离心、过滤等步骤得到不含细胞、细胞碎片、线粒体等含有较大(例如大于0.45 μm)磷脂双分子层膜结构的血浆。在一些实施方案中，所述离心指的是通过低速离心去掉细胞，更高速度的离心去除细胞碎片，更高的速度去除凋亡小体、线粒体或其他含有膜结构的细胞器；优选地，通过300 g离心10 min去除细胞，取上清2000 g离心10 min去除细胞碎片，取上清10000 g离心30 min去除凋亡小体、线粒体或其他含有膜结构的细胞器。在一些实施方案中，所述离心也可以通过16000 g、4℃离心10 min取上清得到待捕获的血浆。在一些实施方案中，所述过滤指的是先后用0.45 μm和0.22 μm的膜对血浆进行过滤，得到待捕获的血浆。在一些实施方案中，若所述血浆来源于不具有正常凝血功能或具有凝血障碍的人或其他动物，则可另外加入如上文所定义的足以允许发生凝血级联的组分，例如来源于具有正常凝血功能的人或其他动物的血浆；优选地，所述来源于具有正常凝血功能的人或其他动物的血浆可如上所述进行预处理，例如通过离心、过滤等步骤得到不含细胞、细胞碎片、线粒体等含有较大(例如大于0.45 μm)磷脂双分子层膜结构的血浆；更优选地，所述血浆中的细胞外囊泡所携带的核酸或蛋白信息不能对待捕获的样本造成干扰。

3)用带负电荷或亲水的磁珠等材料对血浆细胞外囊泡进行捕获；

在一些实施方案中，在血浆中加入Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K。在一些实施方案中，所述Ca²⁺以及Zn²⁺来自与氯化钙、氯化锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等含有Ca²⁺以及Zn²⁺的盐。在一些实施方案中，所述Ca²⁺以及Zn²⁺在样本中的终浓度为0-6 mM。在一些实施方案中，所述维生素K在样本中的终浓度为0-10 nM。在一些实施方案中，将带负电荷或亲水的磁珠等材料与Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K的同时或依次加入到血浆中进行孵育。在一些实施方案中，所述依次加入间隔不足以发生显著凝血的时间，例如在5 min、4 min、3 min、2 min、1 min、50s、40 s、30 s、20 s、10 s、5 s、4 s、3 s、2 s或1 s内依次加入。在一些实施方案中，所述加入的磁珠或其他材料的量为每毫升待捕获血浆加入0.1-10 mg；优选地，加入的磁珠或其他材料的量为每毫升待捕获血浆加入0.5-2 mg。在一些实施方案中，所述孵育时间为45 s-60min；优选地，孵育时间为2 min-30 min。在一些实施方案中，所述孵育温度为0-56℃；优选地，孵育温度为约25℃-37℃；更优选地，孵育温度为37℃。

在一些实施方案中，本发明的方法还可包括将上述捕获了细胞外囊泡的材料用洗涤液洗涤的步骤；优选地，洗涤液为磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液或其他可以维持一定渗透压和pH的缓冲液；优选地，缓冲液中加入一定量的血清白蛋白或吐温-20；更优选地，血清白蛋白在缓冲液中的质量体积分数为0.01-1 g每100 mL；更优选地，吐温-20的体积百分数为0.01%-0.5%。

在一些实施方案中，本发明的方法还可包括在洗涤后，回收所述细胞外囊泡的步骤。例如，在洗涤后，将捕获了细胞外囊泡的带负电荷或亲水的磁珠等材料用可以溶解凝血蛋白的纤溶酶或蛋白酶K处理。在一些实施方案中，在使用磁珠的情况下，可以进一步进行磁分离，然后取上清，从而获得分离的细胞外囊泡。

在另一方面，本发明提供了一种基于凝血的细胞外囊泡捕获方法，所述细胞外囊泡捕获方法可包括以下步骤：

1）提供带负电荷或亲水的磁珠等材料；所述材料可如上文所限定。

2)将待捕获的含细胞外囊泡的样本与如上文所定义的足以允许发生凝血级联的组分例如血浆进行混合，形成混合后的样本；

在一些实施方案中，所述血浆为人血浆或其他动物血浆。优选地，所述血浆为用EDTA、枸橼酸钠、柠檬酸钠、草酸钾/氟化钠等抗凝剂采集的血浆。优选地，所述血浆为用EDTA管、枸橼酸钠管采集的血浆。优选地，所述血浆为新鲜血浆或在冷冻保存不超过1年的血浆。优选地，所述血浆中的细胞外囊泡所携带的核酸或蛋白信息不能对待捕获的样本造成干扰。在一些实施方案中，将血浆与待捕获的样本进行混合，利用血浆中参与凝血的物质对所述样本中的细胞外囊泡利用凝血进行捕获。在一些实施方案中，所述血浆与待捕获的样本的混合比例大于1:10（体积比）。优选地，所述血浆与待捕获的样本的混合比例在（3:10）-（10:3）（体积比）之间。

在一些实施方案中，待捕获的样本包括血清、血浆(例如正常健康血浆或具有凝血障碍的血浆)、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、淋巴等体液样本；或细胞上清等体外培养样本；或细胞外囊泡的重悬液等样本。

3)用带负电荷或亲水的磁珠等材料对细胞外囊泡进行捕获；

在一些实施方案中，在混合后的样本中加入Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K。在一些实施方案中，所述Ca²⁺以及Zn²⁺来自与氯化钙、氯化锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等含有Ca²⁺以及Zn²⁺的盐。在一些实施方案中，将带负电荷或亲水的磁珠等材料与Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K的同时或依次加入到混合后的样本中进行孵育。在一些实施方案中，所述依次加入间隔不足以发生显著凝血的时间，例如在5 min、4 min、3 min、2 min、1 min、50 s、40 s、30 s、20 s、10s、5 s、4 s、3 s、2 s或1 s内依次加入。在一些实施方案中，所述Ca²⁺以及Zn²⁺在孵育溶液中的终浓度为0-6 mM。在一些实施方案中，所述维生素K在孵育溶液中的终浓度为0-10 nM。在一些实施方案中，所述加入的磁珠或其他材料的量为每毫升混合后的样本中加入0.1-10mg；优选地，加入的磁珠或其他材料的量为每毫升混合后的样本中加入0.5-2 mg。在一些实施方案中，所述孵育时间为45 s-60 min；优选地，孵育时间为2 min-30 min。在一些实施方案中，所述孵育温度为0-56℃；优选地，孵育温度为约25℃-37℃；更优选地，孵育温度为37℃。

在一些实施方案中，将上述捕获了细胞外囊泡的材料用洗涤液洗涤；优选地，洗涤液为磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液或其他可以维持一定渗透压和pH的缓冲液；优选地，缓冲液中加入一定量的血清白蛋白或吐温-20；更优选地，血清白蛋白在缓冲液中的质量体积分数为0.01-1 g每100 mL；更优选地，吐温-20的体积百分数为0.01%-0.5%。

在一些实施方案中，本发明的方法、用途和试剂盒用于自动化分离，例如高通量的自动化分离，优选高通量的自动化磁珠分离。

本发明的试剂盒可以通过本领域常规方法制备。试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括带负电荷或亲水的磁珠等材料以及各种凝血因子(例如因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII等)和/或其活化后的形式（例如FIa、FIIa、FIIIa、FVa、FVIIa、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、FXIIIa等）、酶(例如前激肽释放酶(PK)、激肽释放酶(KLK)等)、辅因子(例如锌离子、钙离子、维生素K等)和蛋白(例如高分子激肽原、血管性血友病因子、纤连蛋白等))。试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的凝血因子、酶、离子等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施捕获的说明书等)。例如，试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器。试剂盒还可含有用于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样品制备核酸例如RNA的试剂。以上实例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。

除非另有说明，否则本文所用的所有份数和百分比均为重量百分比。除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。

虽然上文已描述了本发明的各种实施方案，但是应理解的是，其仅以实例的方式提供，而并非限制。对公开的实施方案的许多改变可依照本文的公开内容来进行，而不会背离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。

实施例

除非另外说明，否则本文实施例所用的材料均市购获得，用于进行实验的各种具体实验方法均为本领域常规的实验方法或者按照制造商所建议的步骤和条件，并能由本领域技术人员根据需要常规地确定。如无另外说明，实施例中的羧基磁珠均为市售的羧基磁珠，如Dynabeads™ M-270 Carboxylic Acid等。如无另外说明，实施例中的羟基磁珠为市售的羟基磁珠，如Dynabeads™ MyOne™ Silane等。如无另外说明，实施例中的新鲜的EDTA人血浆均为由专业的人士应用EDTA采血管新鲜采集的健康志愿者的血浆。以下对某些材料和方法进行了详述。

实施例1.凝血磁珠的表征以及本发明凝血磁珠利用凝血机理捕获细胞外囊泡的例证

1)以胶原蛋白为例，将质量比为1：50的胶原蛋白与羧基磁珠通过NHS/EDC反应交联在一起，并用10%的血清白蛋白封闭过夜，制备成基于凝血的细胞外囊泡捕获磁珠(简称凝血磁珠，如无另外说明，本发明所有实施例中使用的磁珠均为上述凝血磁珠)；

2)将新鲜的EDTA人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到待捕获的血浆；

3)在上述血浆中加入终浓度为2 mM的葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌以及终浓度为1 μg/L的维生素K；

4)同时在每毫升血浆中加入1 mg凝血磁珠，孵育2 min；

5)将凝血磁珠用1X PBS(pH 7.4)洗涤1 min；

6)利用凝血机理的细胞外囊泡捕获完成，对捕获完细胞外囊泡的凝血磁珠进行扫描电镜表征，结果如图2所示；

7)将捕获完细胞外囊泡的凝血磁珠用可以溶解凝血蛋白的纤溶酶处理，磁分离，取上清，将上清进行透射电镜表征，结果如图3所示；

8)结果显示，在凝血磁珠之间有明显的纤维蛋白交联，这些纤维蛋白可以将细胞外囊泡交联在磁珠上；经过纤溶酶将磁珠上的纤维蛋白消化后，细胞外囊泡脱落，进一步证明了细胞外囊泡与本发明的凝血磁珠通过凝血因子和/或其活化后的形式（比如纤维蛋白（FIa），凝血因子FI活化后的形式）实现了细胞外囊泡的捕获，证明了本发明通过凝血机理捕获细胞外囊泡。

实施例2.本发明方法与市售磁珠法细胞外囊泡效率对比

1)将新鲜的EDTA人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到待捕获的血浆；

2)将自己培养的22Rv1细胞收集上清，1600 g离心10 min，取上清，然后再5000 g离心10 min取上清；将所述上清用0.45 μm膜过滤，然后120000 g离心2h，去上清；将沉淀用1X PBS(pH 7.4)重悬得到22Rv1细胞外囊泡，并用1X PBS(pH 7.4)将细胞外囊泡定量稀释至1 x 10⁹个/mL（如无另外说明，本发明所有实施例中使用的细胞外囊泡均为通过这种方法制备的细胞外囊泡）；

3)在每毫升血浆中掺入1 μL外源的22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡(22Rv1细胞外囊泡浓度为1 x 10⁹个/mL)；

4)在上述血浆中加入终浓度为2 mM的葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌以及终浓度为1 μg/L的维生素K；

5)同时在每毫升血浆中加入1 mg实施例1中所制备的凝血磁珠，做3个平行对照，分别孵育2 min、8 min和30 min；

6)将凝血磁珠用1X PBS（pH 7.4）洗涤1 min；

7)利用凝血机理的细胞外囊泡捕获完成。

8)按照产品说明书用进口的MBL公司的ExoCap^TM细胞外囊泡捕获试剂对上述经过同样处理的等量血浆（1 mL）进行细胞外囊泡的捕获；

9)将捕获完成细胞外囊泡的ExoCap^TM磁珠与本发明的凝血磁珠提取核酸后，对外源掺入的22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡的AR-V7基因以及内源的B2M基因进行ddPCR对比。

10) 结果如图4、图5所示，本发明凝血磁珠在2 min内就可以实现血浆内细胞外囊泡的捕获，且捕获效率比进口的细胞外囊泡捕获试剂盒捕获了1440 min（24 h）还高了120%。（细胞外囊泡捕获速度提升了720倍，同时捕获效率提升了120%）。

实施例3.利用本发明方法捕获非血浆样本中的细胞外囊泡

1)将新鲜的EDTA猴血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到待使用的猴血浆（所述动物血浆为市售科研用血浆）；

2)在每毫升人的尿液、人的乳汁、人的血清或人的唾液中加入1 μL外源的22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡(22Rv1细胞外囊泡浓度为1 x 10⁹个/mL，所述人的尿液、人的乳汁、人的血清或人的唾液采集自健康志愿者)；

3)在上述猴血浆中按照1：1的比例加入上述掺入了细胞外囊泡的人的尿液、人的乳汁、人的血清或人的唾液，均匀混合，形成混合液（500 μL猴血浆+500 μL非血浆样本）；

4)将等体积（1 mL）的上述掺入了细胞外囊泡的人的尿液、人的乳汁、人的血清或人的唾液作为对照组；

5)在上述混合液和对照组中分别加入终浓度为2 mM的葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌以及终浓度为1 μg/L的维生素K；

6)在每毫升混合液和对照组中分别加入1 mg实施例1中制备的凝血磁珠，孵育2min；

7)将凝血磁珠用1X PBS（pH 7.4）洗涤1 min；

8)利用凝血机理的细胞外囊泡捕获完成；

9)用核酸提取试剂对提取的细胞外囊泡进行核酸的提取；

10) 并对外源掺入的22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡的AR-V7基因以及内源的B2M基因进行ddPCR对比；

11) 结果如图6、图7所示，通过血浆的混合方法，可以利用本发明的凝血磁珠对非血浆样本中的细胞外囊泡进行捕获，极大地扩大了本发明的应用范围。

实施例4.本发明凝血磁珠利用凝血机理捕获细胞外囊泡的另一例证

1)将新鲜的EDTA人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到待捕获的血浆1，称为“原始血浆”；

2)将新鲜的EDTA人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清，再加入肝素，得到待捕获的血浆2，称为“肝素血浆”（肝素可与抗凝血酶III（AT-III）结合，从而破坏凝血因子XIIa、凝血因子XIa、凝血因子Xa、凝血因子II和凝血因子IX，进而使血浆无法恢复凝血功能）；

3)将口服过华法林的患者的EDTA人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到待捕获的血浆3，称为“华法林血浆”（华法林抑制凝血因子II、凝血因子VII、凝血因子IX、凝血因子X的合成）；

4)将新鲜的EDTA人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到血浆，并将该血浆37℃孵育24 h，得到血浆4，称为“老化血浆”（血浆37℃孵育24 h会破坏凝血因子V和凝血因子VIII）；

5)将新鲜的草酸钠抗凝人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到血浆，再用硫酸钡进行吸附，得到血浆5，称为“吸附血浆”（因为硫酸钡的吸附作用而缺少凝血因子II、凝血因子VII、凝血因子IX和凝血因子X）；

6)在每毫升上述血浆1-5中分别加入1 μL 22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡(22Rv1细胞外囊泡浓度为1 x 10⁹个/mL)；

7)在上述血浆1-5中分别加入终浓度为2 mM的葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌以及终浓度为1 μg/L的维生素K；

8)同时在每毫升血浆中加入1 mg实施例1中制备的凝血磁珠，孵育2 min；

9)将凝血磁珠用1X PBS（pH 7.4）洗涤1 min；

10) 利用凝血机理的细胞外囊泡捕获完成；

11) 用核酸提取试剂对提取的细胞外囊泡进行核酸的提取；

12) 并对外源掺入的22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡的AR-V7基因以及内源的B2M基因进行ddPCR对比；

13) 结果如图8所示，通过不同方式使各种凝血因子失活，抑制凝血后，凝血磁珠对于血浆中细胞外囊泡的捕获能力随之降低，这表明本发明是利用带负电荷或亲水的磁珠等材料激起凝血级联反应，从而在带负电荷或亲水的磁珠等材料、细胞外囊泡、凝血因子和/或其活化后的形式的共同参与下完成了凝血过程，最终实现了细胞外囊泡的捕获。

实施例5.带负电荷的材料能用于凝血捕获细胞外囊泡的例证

1)以血清白蛋白、亲和素、胶原蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白为例，将血清白蛋白、亲和素、胶原蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白分别以质量比为1：50与羧基磁珠通过NHS/EDC反应交联在一起(其中亲和素和免疫球蛋白包被的磁珠进一步用10%的血清白蛋白封闭过夜)，制备成基于凝血的细胞外囊泡捕获磁珠(其中血清白蛋白、胶原蛋白、酪蛋白的PI＜7.4，而亲和素或免疫球蛋白与血清白蛋白组合中血清白蛋白的PI＜7.4)；

2)将等电点＞7.4的蛋白质（精蛋白和血红蛋白）分别以质量比为1：50与羧基磁珠通过NHS/EDC反应交联在一起，制备成对照磁珠；

3)将新鲜的EDTA人血浆16000 g、4℃离心10 min，并依次滤过0.45 μm和0.22 μm的滤膜取上清得到待捕获的血浆；

4)在每毫升血浆中加入1 μL 22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡(22Rv1细胞外囊泡浓度为1 x 10⁹个/mL)；

5)在上述血浆中加入终浓度为2 mM的葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌以及终浓度为1 μg/L的维生素K；

6)同时在每毫升上述血浆中分别加入1 mg各种磁珠，孵育2 min；

7)将磁珠用1X PBS（pH 7.4）洗涤1 min；

8)用核酸提取试剂对提取的细胞外囊泡进行核酸的提取；

9)并对外源掺入的22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡的AR-V7基因以及内源的B2M基因进行ddPCR对比；

10) 结果如图9所示，血清白蛋白、胶原蛋白和酪蛋白的PI＜7.4，用血清白蛋白、胶原蛋白和酪蛋白包被的磁珠能有效捕获血浆中的细胞外囊泡；亲和素和免疫球蛋白包被的磁珠由于使用PI＜7.4的血清白蛋白进行封闭，因此也能对血浆中的细胞外囊泡进行有效捕获；对于等电点＞7.4的蛋白质（精蛋白和血红蛋白）包被的磁珠由于等电点过高，不易于凝血的发生，因此无法对血浆中的细胞外囊泡进行有效捕获。

实施例6.带负电荷的材料能用于凝血捕获细胞外囊泡的另一例证

2)在每毫升血浆中加入1 μL 22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡(22Rv1细胞外囊泡浓度为1 x 10⁹个/mL)；

4)同时在每毫升上述血浆中加入1 mg羧基磁珠（带负电荷）或羧基被活化的磁珠（羧基通过NHS/EDC活化后生成胺基，带正电荷），孵育2 min；

5)将磁珠用1X PBS（pH 7.4）洗涤1 min；

6)用AE标记的CD63对捕获的细胞外囊泡进行化学发光检测；

7)结果如图10所示，羧基磁珠活化前带负电荷，对血浆细胞外囊泡能进行有效捕获，羧基活化后生成胺基带正电荷，对血浆细胞外囊泡的捕获效率大大降低。因此，带负电荷的材料有利于凝血捕获细胞外囊泡。

实施例7.亲水的材料能用于凝血捕获细胞外囊泡的例证

4)同时在上述每毫升血浆中加入1 mg羟基磁珠（亲水）或1 mg油酸修饰的磁珠（疏水，所述油酸修饰的磁珠为阿拉丁上购买的油酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒（共沉淀法）），孵育2 min；

5)将磁珠用1X PBS（pH 7.4）洗涤1 min；

6)用核酸提取试剂对提取的细胞外囊泡进行核酸的提取；

7)并对外源掺入的22Rv1细胞分泌的细胞外囊泡的AR-V7基因以及内源的B2M基因进行ddPCR对比；

8)结果如图11所示，亲水性有利于对利用凝血机理的细胞外囊泡的捕获。

Claims

1.一种基于凝血的用于捕获细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含带负电荷或亲水的材料；以及足以允许发生凝血级联的组分；

其中，所述材料含有在生理条件下带负电或亲水的基团；或者所述材料在表面上含有等电点<7.4的蛋白质、或蛋白质的组合，所述组合在生理条件下带负电；

其中，所述试剂盒通过促进凝血发生使得所述细胞外囊泡与所述带负电荷或亲水的材料之间经由凝血因子FI、FII、FIII、FIV、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII等和/或其活化后的形式结合在一起，而实现细胞外囊泡的捕获；以及

其中，足以允许发生凝血级联的组分指的是发生凝血级联从而导致血液凝固所需的各种凝血因子和/或其活化后的形式，酶、辅因子和蛋白，并且为或来源于血浆或含血浆的液体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述带负电荷的材料或亲水材料为可以促进凝血的带负电荷的材料或亲水材料。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述带负电荷的材料或亲水材料为在血浆的生理条件下带负电荷或亲水的材料。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述材料为在表面带负电或亲水的固体支持体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述材料为带负电荷或亲水的球状材料，带负电荷或亲水的多孔膜结构，或者带负电荷或亲水的微流控通道或高比表面积材料。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述球状材料为磁珠、SiO₂珠或乳胶珠。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述多孔膜结构为玻璃纤维膜、硅胶膜或硝酸纤维素膜。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述高比表面积材料采用蚀刻或微纳加工而制备。

9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述高比表面积材料为色谱柱或过滤柱。

10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述基团为羟基、羧基、磺酸基、亚硫酸基、酰胺基或醚基。

11.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述等电点<7.4的蛋白质为血清白蛋白、胶原蛋白或酪蛋白。

12.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述组合为在生理条件下带负电的等电点<7.4的蛋白质与任意其他蛋白质的组合。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于所述组合为在生理条件下带负电的等电点<7.4的蛋白质与等电点＞7.4的蛋白质的组合。

14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于所述组合为在生理条件下带负电的血清白蛋白和等电点＞7.4的亲和素的组合或在生理条件下带负电的血清白蛋白和等电点＞7.4的免疫球蛋白的组合。

15.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述材料为在表面上含有蛋白质的磁珠。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于所述蛋白质与磁珠的质量比为1：10000至1：10。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于所述磁珠为胶原蛋白磁珠、血清白蛋白磁珠或免疫球蛋白磁珠。

18.如权利要求15-17中任一项所述的试剂盒，其特征在于所述磁珠用血清白蛋白进行封闭。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于所述用于封闭的血清白蛋白的质量体积分数为1-20 g/100 mL。

20.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述血浆为用抗凝剂采集的血浆。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于所述抗凝剂为EDTA、枸橼酸钠、柠檬酸钠或草酸钾/氟化钠。

22.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述血浆为人血浆、其他动物血浆或合成血浆。

23.如权利要求1-2、4-17和19中任一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有促进凝血发生或促进细胞外囊泡与所述材料结合的其他组分。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于所述其他组分为Ca²⁺、Zn²⁺以及维生素K中的一种或多种。

25.一种基于凝血的用于捕获细胞外囊泡的方法，其特征在于所述方法包括将如权利要求1-24中任一项所定义的带负电荷或亲水的材料和足以允许发生凝血级联的组分与含细胞外囊泡的样品一起孵育，并且所述足以允许发生凝血级联的组分指的是发生凝血级联从而导致血液凝固所需的各种凝血因子和/或其活化后的形式，酶、辅因子和蛋白，并且为或来源于血浆或含血浆的液体。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于所述方法还包括向孵育溶液中加入促进凝血发生或促进细胞外囊泡与所述材料结合的其他组分的步骤。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于所述其他组分为Ca²⁺、Zn²⁺和维生素K中的一种或多种。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于所述Ca²⁺和Zn²⁺来自含有Ca²⁺和Zn²⁺的盐。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于所述含有Ca²⁺和Zn²⁺的盐为氯化钙、氯化锌、葡萄糖酸钙或葡萄糖酸锌。

30.如权利要求27所述的方法，其特征在于所述Ca²⁺和Zn²⁺在孵育溶液中的终浓度为0-6mM。

31.如权利要求27所述的方法，其特征在于所述维生素K在孵育溶液中的终浓度为0-10nM。

32.如权利要求27所述的方法，其特征在于所述带负电荷或亲水的材料与Ca²⁺、Zn²⁺和维生素K同时或依次加入。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于所述依次加入间隔不足以发生显著凝血的时间。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于所述带负电荷或亲水的材料与Ca²⁺、Zn²⁺和维生素K在5 min、4 min、3 min、2 min、1 min、50 s、40 s、30 s、20 s、10 s、5 s、4 s、3 s、2 s或1 s内依次加入。

35.如权利要求25所述的方法，其特征在于所述带负电荷或亲水的材料的加入量为每毫升孵育溶液加入0.1-10 mg。

36.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述带负电荷或亲水的材料的加入量为每毫升孵育溶液加入0.5-2 mg。

37.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述孵育时间为45 s-60 min。

38.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述孵育时间为2 min -30 min。

39.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述孵育在25℃-37℃的温度下进行。

40.如权利要求25所述的方法，其特征在于所述血浆或含血浆的液体与含细胞外囊泡的样品的混合体积比大于1:10。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于所述血浆或含血浆的液体与含细胞外囊泡的样品的混合体积比在3:10至10:3之间。

42.如权利要求25-41中任一项所述的方法，其特征在于所述含细胞外囊泡的样品为血浆样品、血清、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、淋巴、细胞上清、细胞外囊泡的重悬液或者它们的任意混合物。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于所述血浆样品为人血浆或其他动物的血浆。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于所述血浆样品含有抗凝剂。

45.如权利要求44所述的方法，其特征在于所述抗凝剂为EDTA、枸橼酸钠、柠檬酸钠或草酸钾/氟化钠。

46.如权利要求44所述的方法，其特征在于所述抗凝剂为EDTA或枸橼酸钠。

47.如权利要求25-41和43-46中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括在孵育之前，对所述样品和/或所述组分进行除去细胞、细胞碎片和/或细胞器的步骤。

48.如权利要求47所述的方法，其特征在于除细胞外囊泡外，所述样品和/或所述组分不含其他具有磷脂双分子层膜结构的物质。

49.如权利要求48所述的方法，其特征在于所述其他具有磷脂双分子层膜结构的物质为细胞、细胞碎片或细胞器。

50.如权利要求25-41、43-46、48和49中任一项所述的方法，其特征在于在孵育后，对所述材料进行洗涤。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于洗涤液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或其他可以维持渗透压和pH的缓冲液。

52.如权利要求51所述的方法，其特征在于所述缓冲液中含有血清白蛋白或吐温-20，其中所述血清白蛋白在所述缓冲液中的质量体积分数为0.01-1 g/100 mL，或吐温-20的体积百分数为0.01%-0.5%。

53.如权利要求50所述的方法，其特征在于在洗涤后，进行回收所述细胞外囊泡的步骤。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于在洗涤后，将所述细胞外囊泡从捕获了细胞外囊泡的带负电荷或亲水的材料中分离出来。

55.如权利要求54所述的方法，其特征在于所述分离通过酶处理所述捕获了细胞外囊泡的带负电荷或亲水的材料而进行。

56.如权利要求55所述的方法，其特征在于所述酶为可以溶解凝血蛋白的纤溶酶或蛋白酶K。

57.如权利要求1-24中任一项所定义的足以允许发生凝血级联的组分和如权利要求1-24中任一项所定义的带负电荷或亲水的材料用于捕获细胞外囊泡的用途，所述捕获包括通过促进凝血发生使得所述细胞外囊泡与所述带负电荷或亲水的材料之间经由凝血因子和/或其活化后的形式结合在一起。