CN115521894A - 用于提取细胞外囊泡的试剂盒与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒和方法。所述方法包括以下步骤:I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000 cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分,孵育至少1分钟;II)将样本分离并去除上清液;和III)洗涤步骤II)后的高比表面积材料并收集附着在高比表面积材料的细胞外囊泡。本发明的方法借助常规设备就可以实现细胞外囊泡的自动化、高通量全提取,适用于所有的样本类型,可以选择性地实现样本中的细胞外囊泡的提取和/或细胞外囊泡以及游离核酸的提取。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地,本发明涉及用于提取细胞外囊泡的试剂盒与方法。
背景技术
活细胞会持续分泌细胞外囊泡(EV)。细胞外囊泡基于其生物发生、大小和生物物理性质可以进一步分类的主要类型包括外泌体(起源于内吞途径,直径约为30-150nm)、微粒/微囊泡(从质膜释放,直径约为100-1000nm)、凋亡小体(由细胞凋亡产生,直径约为50nm-2μm)、肿瘤小泡(由肿瘤细胞释放产生,直径约为1-10μm)以及其它各种细胞外囊泡亚群。
细胞外囊泡被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后相关生物标志物的重要载体。细胞外囊泡的分离方法主要有超速离心法、沉淀法、色谱法、超滤法、微流控技术以及磁珠免疫亲和法等。
微流控技术、色谱法以及磁珠免疫亲和法有望实现细胞外囊泡的自动化提取。但是色谱法提取的细胞外囊泡纯度低且不可避免的会对细胞外囊泡进行稀释,只能实现细胞外囊泡的分离,不能实现细胞外囊泡的充分富集;微流控技术本质上是对微小流体的操控技术,无法实现对临床上毫升乃至数十毫升级别的样本处理需求。
磁珠免疫亲和法是磁珠法提取细胞外囊泡中最常用的方法。该方法通过在磁珠上修饰细胞外囊泡特异性的抗体(比如CD9、CD63、CD81等抗体),针对细胞外囊泡上的CD9、CD63、CD81等抗原,利用抗原-抗体反应进行细胞外囊泡的特异性提取。但是一方面,由于抗体高昂的价格,磁珠免疫亲和法的成本非常高,不适用于大体积样本的细胞外囊泡的提取,而且磁珠免疫亲和法高昂的成本限制了它在临床和工业上的大规模使用。另一方面,目前还没有发现任何一种抗体是细胞外囊泡独有的,这使得磁珠免疫亲和法提取的不一定是细胞外囊泡,也可能是细胞碎片或者一些细胞器,影响了提取纯度。此外也不是每一个细胞外囊泡表面都有CD9、CD63、CD81等抗体,这使得很大一部分细胞外囊泡会被遗漏,影响了提取效率。
CN107254430B、US10808240B2等公开了一种针对细胞外囊泡带负电的特性、利用带正电荷的材料通过静电吸附的方法对细胞外囊泡进行提取的方法。该方法不需要特异性的抗体即可对细胞外囊泡进行非特异性提取。但是这种方法需要特殊修饰的带正电的材料才能对细胞外囊泡进行有效提取,这增加了电荷吸附法提取细胞外囊泡的成本。此外,除了细胞外囊泡,样本中还有很多的蛋白质、脂质、游离核酸等成分都是带负电的,这使得通过电荷吸附法提取的细胞外囊泡是含有很多杂质的混合物。
CN112322583A公开了一种基于凝血的细胞外囊泡提取方法,该方法利用亲水或带负电的磁珠会在血浆中激起凝血的特性,以及利用细胞外囊泡磷脂双分子分子层会参与凝血过程的特性,实现磁珠对于血浆中细胞外囊泡的提取。该方法不需要特异性的抗体即可对细胞外囊泡进行非特异性提取,降低了磁珠法提取细胞外囊泡的成本,且重复性好,提取效率高。但是该方法只能适应于血浆样本或含有凝血成分的样本。
目前细胞外囊泡大多依赖手动提取,到目前为止世界上仅有一款新西兰Izon公司研发的qEV色谱柱搭配自动馏分收集器(AFC)可以实现细胞外囊泡的自动化提取。该设备对于细胞外囊泡的提取通量低、纯度低,提取的细胞外囊泡无法进行有效浓缩,且需要专门的配套仪器,成本高。
因此,尽管细胞外囊泡极具临床应用价值,但目前缺乏对其进行有效、廉价且工业上可行的自动化分离和富集的技术,因此细胞外囊泡在临床转化上仍有障碍。从而,本领域中对将细胞外囊泡分离与富集的方法还存在需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于提取细胞外囊泡的方法,其成本低廉、提取效率高、可以配合常见设备,实现各种细胞外囊泡的自动化分离和提取。
本发明的另一个目的是提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒,其可以用于上述方法。
因此,根据第一方面,本发明提供一种用于提取细胞外囊泡的试剂盒,其特征在于,包含:
i)一种比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料;和
ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。
根据第二方面,本发明提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的方法,其特征在于,包括以下步骤:
I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分,孵育至少1分钟;
II)将样本分离并去除上清液;和
III)洗涤步骤II)后的高比表面积材料并收集附着在高比表面积材料的细胞外囊泡。
本发明提出一种新的细胞外囊泡捕获方法,其利用盐析和盐桥的作用,以高比表面积材料作为“种子”,在高比表面积材料上完成细胞外囊泡的吸附。本发明的方法不要求对高比表面积材料进行改性或修饰,使用常规材料就可以进行细胞外囊泡的提取,成本低廉、适用性广。本发明的方法借助常规设备就可以实现细胞外囊泡的自动化全提取,适用于所有的样本类型,可以实现工业上的高通量自动化提取或满足临床需求。本发明的方法可以选择性地实现样本中细胞外囊泡的提取或细胞外囊泡及游离核酸的捕获。
附图说明
下面结合附图对本发明进行更详细地说明和解释,其中:
图1显示了本发明的方法提取细胞外囊泡的原理示意图。
图2显示了本发明的方法与超高速离心法提取细胞外囊泡的效率以及重复性对比。
图3显示了不同磁珠对本发明的方法提取细胞外囊泡的影响。
图4显示了本发明的方法通过调节提取试剂、洗涤液的浓度从而实现对细胞外囊泡及游离核酸、细胞外囊泡、除细胞外囊泡外的游离核酸进行选择性提取。
图5显示了本发明的方法通过调节提取试剂、洗涤液的浓度从而实现对细胞外囊泡及游离核酸、细胞外囊泡、除细胞外囊泡外的游离核酸进行选择性的提取后提取到的游离核酸与细胞外囊泡数量的比例。
图6显示了对利用本发明的方法提取的细胞外囊泡的标志性蛋白进行化学发光检测的结果。
图7显示了利用本发明的方法自动化提取的细胞外囊泡及其核酸的qPCR结果。
具体实施方式
现以说明的目的而非限制地描述本发明的一些具体实施方式。
用于提取细胞外囊泡的试剂盒
根据第一方面,本发明提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒,其特征在于,包含:
i)一种比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料;和
ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。
所述高比表面积材料与所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分可以放置在一起,也可以分开放置。
优选地,所述试剂盒还包括iii)用于降低杂质浓度的组分。
优选地,所述试剂盒还包含iv)用于洗涤杂质的组分。
优选地,所述试剂盒包括至少两个隔室以分别容纳i)高比表面积材料、ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分、任选的iii)用于降低杂质浓度的组分和任选的iv)用于洗涤杂质的组分。
高比表面积材料
优选地,所述高比表面积材料的比表面积在1000-1000000cm2/g范围内。
所述高比表面积材料可以为球状材料、类球状材料、形状不规则的颗粒或多孔膜。
任选地,所述球状材料、类球状材料、形状不规则的颗粒可以为多孔材料或无孔材料。
所述多孔材料可以为大孔材料、介孔材料或小孔材料。
本申请中所述的大孔、介孔和小孔具有本领域中公知的孔径。
任选地,所述高比表面积材料的表面具有凸出或凹陷纹理。
优选地,所述高比表面积材料为球状材料或类球状材料。
所述高比表面积材料可以为磁性材料或非磁性材料,优选磁性材料。
所述高比表面积材料可以带正电、带负电或不带电。
本申请所述的带正电、带负电是指所述高比表面积材料表面含有带电荷的基团或表面存在带电荷的物质。
例如,所述高比表面积材料可选自带正电、带负电或不带电的磁珠,例如选自未进行表面基团修饰的裸珠、羧基磁珠、氨基磁珠、巯基磁珠、聚合物包覆的磁珠和蛋白质包覆的磁珠。
所述高比表面积材料在细胞外囊泡提取过程中作为细胞外囊泡的载体。
能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分
在本申请中,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分溶解于或分散于含水载体后形成的溶液或悬浮液称为提取试剂。
所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分选自亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的组合。
在本申请中,亲水性高分子聚合物是指在水中的溶解度不低于5g的聚合物。
所述亲水性高分子聚合物为能够破坏和/或竞争性掠夺细胞外囊泡表面的水分子层而导致细胞外囊泡水分子层失去和/或被破坏的聚合物。由于细胞外囊泡水分子层失去和/或被破坏,细胞外囊泡的磷酸基团裸露出来,最终导致细胞外囊泡由于发生聚集和/或溶解度降低而以高比表面积材料作为“种子”析出,吸附在高比表面积材料的表面。
优选地,所述高分子聚合物选自聚乙二醇(PEG)、甲基纤维素、聚乙烯亚胺及其组合。
例如,所述聚乙二醇的聚合度在200-20000之间,例如可以为PEG200、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000或PEG20000。
优选地,所述盐在水中的溶解度不低于1g。
所述盐可以在水中或含有水的溶液中发生解离,解离出的离子可以部分中和细胞外囊泡的电性,使分子间排斥作用减弱。
优选地,所述盐解离出的离子在水中可以发生水化作用,从而使细胞外囊泡脱去水分子层,暴露出疏水区域。
优选地,所述盐是由选自Al3+、H+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Cs2+、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+的一种或多种阳离子与选自PO43-、SO42-、CH3COO-、Cl-、NO3 -、ClO4 -、I-、SCN-的一种或多种阴离子形成的盐。
优选地,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分以在含水载体中的悬浮液或者溶液的形式存在。
当所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分以在含水载体中的悬浮液或者溶液的形式存在时,所述含水载体可为纯水或者含有水的缓冲液,例如PBS缓冲液、HEPES缓冲液、TRIZMA缓冲液、Tris缓冲液和TE缓冲液等。
优选地,在所述悬浮液或溶液中,所述高分子聚合物的质量分数为3%-60%,所述水溶性盐的浓度为0-6M,都以所述悬浮液或溶液为基准。
更优选地,在所述悬浮液或溶液中,所述亲水性高分子聚合物的质量分数为10%-40%,所述水溶性盐的浓度为0.5-4M,都以所述悬浮液或溶液为基准。
用于降低杂质浓度的组分
在本申请中,所述用于降低杂质浓度的组分也称为稀释液。
所述杂质为细胞外囊泡提取过程中除了细胞外囊泡以及吸附细胞外囊泡的材料以外的其它物质。
在本申请中所述的杂质为样本中本身含有的杂质,如样本中的蛋白质、脂质、盐、小分子化合物、细胞碎片以及细胞器。
当待提取的目标仅为细胞外囊泡时,杂质还包括游离核酸。
所述用于降低杂质浓度的组分通过稀释降低样本中的杂质来降低样本中杂质的浓度。
所述用于降低杂质浓度的组分可选自纯水和包含能够调节渗透压的组分的溶液。
例如,所述用于降低杂质浓度的组分为纯水或水溶液,如磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化钠溶液、Tris缓冲液或TE缓冲液。
用于洗涤杂质的组分
在本申请中,所述用于洗涤杂质的组分也称为洗涤液。
所述用于洗涤杂质的组分为能够调节渗透压的组分在含水载体中的悬浮液或者溶液。
优选地,所述能够调节渗透压的组分为前面所述的能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分,选自亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的组合。
优选地,所述含水载体可为纯水或者含有水的缓冲液,例如PBS缓冲液、HEPES缓冲液、TRIZMA缓冲液、Tris缓冲液、TE缓冲液等。
任选地,所述用于洗涤杂质的组分中还包含表面活性剂,例如吐温-20、吐温-60、吐温-80。
优选地,在所述用于洗涤杂质的组分中,所述高分子聚合物的质量分数为1%-30%,所述盐的浓度为0-3M,都以所述用于洗涤杂质的组分为基准。
在一些实施方式中,在所述用于洗涤杂质的组分中,高分子聚合物的质量分数为1%-5%;水溶性盐的浓度为0M-3M,都以用于洗涤杂质的组分为基准。
在一些实施方式中,在所述用于洗涤杂质的组分中,高分子聚合物的质量分数为5%-30%;水溶性盐的浓度为0.3M-3M,都以用于洗涤杂质的组分为基准。
例如,在一些实施方式中,所述用于洗涤杂质的组分为包含能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分、表面活性剂的磷酸盐缓冲液(PBS)。
可以通过能够调节渗透压的组分的浓度来选择性地洗脱游离核酸。
当用于洗涤杂质的组分中能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分的浓度较低时,可以选择性地洗脱游离核酸并保留细胞外囊泡。
当用于洗涤杂质的组分中能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分的浓度较高时,可以选择性地洗脱样本残余并保留游离核酸和细胞外囊泡。
在一些实施方式中,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分以在含水载体中的悬浮液或者溶液的形式存在,且所述用于洗涤杂质的组分与所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分相同。在这种情况下,所述用于洗涤杂质的组分作为所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分存在于所述试剂盒中。
在一些实施方式中,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分以在含水载体中的悬浮液或者溶液的形式存在,且所述用于洗涤杂质的组分为所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分进一步稀释后的悬浮液或者溶液。在这种情况下,所述用于洗涤杂质的组分与所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分分开存在于所述试剂盒中,或者就在使用前,将所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分的一部分进一步稀释成所述用于洗涤杂质的组分。
用于提取细胞外囊泡的方法
根据第二方面,本发明提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的方法,其特征在于,包括以下步骤:
I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分,孵育至少1分钟;
II)将样本分离并去除上清液;和
III)洗涤步骤II)后的高比表面积材料并收集附着在高比表面积材料的细胞外囊泡。所述生物样本可选自血浆、血清、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、淋巴、组织液、细胞上清等生物来源的样本以及细胞外囊泡的重悬液。
在一些实施方式中,所述方法用于提取胞外总核酸,即细胞外囊泡与游离核酸。
在一些实施方式中,所述方法用于提取细胞外囊泡。
优选地,所述高比表面积材料如以上针对用于提取细胞外囊泡的试剂盒中所定义。
优选地,所述高比表面积材料的加入量使得所述高比表面积材料的总表面积不低于10cm2/每毫升样本。优选地,相对于每毫升样本,加入的所述高比表面积材料的总表面积在1000-1000000cm2范围内。
优选地,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分如以上针对用于提取细胞外囊泡的试剂盒中所定义。
本发明的方法以磁珠作为“种子”、利用盐析和盐桥的作用在磁珠上完成细胞外囊泡的吸附。因此,在本申请中,本发明的方法也可以称为“种子生长法”。
图1显示了本发明的方法提取细胞外囊泡的原理示意图。
如图1中所示,一方面,利用一定浓度的亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的组合,破坏了细胞外囊泡表面的水分子层,和细胞外囊泡争夺水分子,从而降低了细胞外囊泡在样本中的溶解度,使得细胞外囊泡团聚、吸附在加入的高比表面积材料表面(盐析);另一方面,利用一定浓度的亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的组合,破坏了细胞外囊泡表面的水分子层,使得细胞外囊泡磷脂双分子层上的磷酸基团裸露出来,通过样本中解离出来的盐离子与高比表面积材料表面形成盐桥,实现细胞外囊泡的提取(盐桥)。
优选地,在步骤I)中,孵育1-120分钟。
优选地,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分选自亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的组合,在步骤I)中,以样本为基准,样本中的亲水性高分子聚合物的质量分数为3-20%,水溶性盐在样本中的终浓度为0-1M。
可以通过控制亲水性高分子聚合物和/或水溶性盐的浓度来选择性地实现细胞外囊泡及游离核酸的提取和/或细胞外囊泡的提取。当亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的浓度较高时,可以实现细胞外囊泡及游离核酸的提取。当亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的浓度较低时,可以实现细胞外囊泡的提取。
例如,在一些实施方式中,在步骤I)中,在样本中,高分子聚合物的质量分数为3%-15%;水溶性盐的浓度为0M-0.8M,都以样本为基准,以实现细胞外囊泡的提取。
例如,在一些实施方式中,在步骤I)中,在样本中,高分子聚合物的质量分数为15%-20%;水溶性盐的浓度为0.8M-1M,都以样本为基准,以实现细胞外囊泡及游离核酸的提取。
在一些实施方式中,在步骤I)中,在向生物样本中加入比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分之前,通过降低样本中杂质的量或稀释样本中杂质的浓度来降低样本中杂质的浓度。
优选地,通过酶消化、等电点沉淀、离心、过滤或色谱来降低样本中杂质的量。
可以通过用于稀释杂质浓度的组分来稀释样本中杂质的浓度。
所述用于稀释杂质浓度的组分如以上针对用于提取细胞外囊泡的试剂盒中所定义。
优选地,经所述用于稀释杂质浓度的组分调节后生物样本的渗透压大于200mOsm/L。
优选地,所述高比表面积材料为磁珠,在步骤II)中,进行磁分离至少1分钟。
在步骤III)中,可以通过用于洗涤杂质的组分来洗涤所述高比表面积材料。
所述用于洗涤杂质的组分如以上针对用于提取细胞外囊泡的试剂盒中所定义。
在一些实施方式中,在步骤III)中,在用于洗涤杂质的组分中,高分子聚合物的质量分数为1%-30%;水溶性盐的浓度为0M-3M,都以用于洗涤杂质的组分为基准。
在一些实施方式中,通过控制用于洗涤杂质的组分中的能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分的浓度来选择性地洗脱游离核酸,以从高比表面积材料上得到细胞外囊泡。在这些实施方式中,任选地,从洗涤液中得到游离核酸。
例如,在一些实施方式中,在用于洗涤杂质的组分中,高分子聚合物的质量分数为1%-5%;水溶性盐的浓度为0M-3M,都以用于洗涤杂质的组分为基准。
在一些实施方式中,通过控制用于洗涤杂质的组分中能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分的浓度来选择性地洗脱样本残余,以从高比表面积材料上得到细胞外囊泡与游离核酸。
例如,在一些实施方式中,在用于洗涤杂质的组分中,高分子聚合物的质量分数为5%-30%;水溶性盐的浓度为0.3M-3M,都以用于洗涤杂质的组分为基准。
优选地,所述高比表面积材料为磁珠,在洗涤后,再次进行磁分离。
在一些实施方式中,本发明提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的方法,其包括以下步骤:
I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000cm2/g的磁珠和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分,孵育1-120分钟;
II)将生物样本磁分离1-15分钟,去除上清液;和
III)使用用于洗涤杂质的组分洗涤步骤II)后的磁珠并收集附着在磁珠上的细胞外囊泡,
其中任选在加入磁珠和提取试剂之前加入用于稀释杂质浓度的组分或通过酶消化、等电点沉淀、离心、过滤或色谱来降低样本中杂质的浓度。
本发明的方法借助于常规的核酸提取试剂以及核酸提取仪可以实现细胞外囊泡及其核酸的自动化提取。
本申请中针对各个特征的描述在相互不矛盾的情况下可以相互结合,都落入本申请请求保护的范围。
本申请中所述的“包含”和“包括”涵盖还包含或包括未明确提及的其它要素的情形以及由所提及的要素组成的情形。
除非另外限定,本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。当本说明书中术语的定义与本发明所属领域技术人员通常理解的意义有矛盾时,以本文中所述的定义为准。
除非另有说明,否则在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量等的所有数值被理解为在被术语“约”修饰。因此,除非有相反指示,否则在这里阐述的数值参数是能够根据需要获得的所需性能来变化的近似值。
实施例
以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以让本领域技术人员充分地了解本发明的目的、特征和效果。本领域技术人员会理解,此处的实施例仅仅用于示例目的,本发明的范围并不局限于此。
除非明确说明,实施例中所用的材料可市购获得或自行制备。
除非明确说明,实施例中所用的条件可由本领域技术人员根据本领域的常规知识确定。
实施例1:试剂准备
高比表面积材料:
裸珠:粒径约1μm,比表面积约为1100cm2/g,以商品名BMQ1000来自百迈格生物科技有限公司。
羧基磁珠:粒径约1μm,比表面积约为1100cm2/g,以商品名BMS1000来自百迈格生物科技有限公司。
氨基磁珠:粒径约1μm,比表面积约为1100cm2/g,以商品名BMA1000来自百迈格生物科技有限公司。
巯基磁珠:粒径约1μm,比表面积约为1100cm2/g,以商品名巯基磁珠来自上海联迈生物工程有限公司。
JSR磁珠:粒径约1.5μm,比表面积约为2500cm2/g,以商品名MS160/Carboxyl来自JSRLife Sciences公司。
Dynabeads磁珠:粒径约1μm,比表面积约为4000cm2/g,以商品名DynabeadsTMMyOneTM Carboxylic Acid来自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
安捷伦磁珠:粒径约2.7μm,比表面积约为1400cm2/g,以商品名LodeStarsCarboxyl来自Agilent公司。
去除细胞外囊泡的胎牛血清:以商品名Exo-FBS来自System Biosciences公司。
能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分(简称为“提取试剂”)
将PEG 20000溶于PBS中,并加入(NH4)2SO4,使得PEG 20000的质量分数为30%,(NH4)2SO4的浓度为1.6M,以所得提取试剂为基准。
用于降低杂质浓度的组分(简称为“稀释液”)
PBS:以商品名PBS来自Gibco公司。
用于洗涤杂质的组分(简称为“洗涤液”)
将PEG 20000、LiCl、吐温-20、葡萄糖溶于PBS中,使得PEG 20000的质量分数为3%、葡萄糖的质量分数为5%、吐温-20的质量分数为0.1%、LiCl的终浓度为0.5M,以所得洗涤液为基准。
内参
用去除细胞外囊泡的牛血清培养22Rv1细胞(人前列腺癌细胞),收集该细胞的培养上清液,培养上清液经过离心后用0.22μm的滤膜过滤,将过滤液用超高速离心机离心得到22Rv1细胞的细胞外囊泡,该细胞外囊泡的基因含有AR-V7突变,该突变是前列腺癌患者特有,而正常人没有的。
以下实施例中用掺入的22Rv1细胞的细胞外囊泡(简称22Rv1细胞外囊泡)中的AR-V7的有无以及含量高低来判断提取的成功与否以及提取效率的高低。在使用前,22Rv1细胞外囊泡中的AR-V7先用ddPCR(微滴式数字PCR)定量,并将22Rv1细胞外囊泡中AR-V7的浓度定量为50Copies/μL的浓度,即所述内参为AR-V7的浓度为50Copies/μL的22Rv1细胞外囊泡。
实施例2:用种子生长法和超速离心法提取细胞外囊泡
收集10位正常人的尿液,每位正常人的尿液平均分成两份,每份30mL。向每份尿液中添加10μL的内参(细胞外囊泡中AR-V7的总浓度为500Copies/份)。10位正常人的尿液各一份组成1组,共2组。第一组10份尿液用通用的超高速离心法进行细胞外囊泡提取,第二组10份尿液用本发明的种子生长法进行细胞外囊泡的提取。
利用种子生长法提取细胞外囊泡的过程如下:
I)在30mL尿液中加入5mg磁珠、6mL提取试剂滚动混匀并室温孵育10min;
II)将样本磁分离10min,去除上清液;和
III)用洗涤液磁珠洗涤后重新磁分离,去除上清液,并且收集附着在磁珠上的细胞外囊泡。
将超高速离心和种子生长法提取的细胞外囊泡提取核酸后用ddPCR对AR-V7进行定量,定量结果显示于图2中。
从图2中可以看出:①种子生长法对于细胞外囊泡的提取效率优于超高速离心法,种子生长法对细胞外囊泡的提取效率能达到86.2%,而超高速离心法的提取效率能达到68%;②种子生长法对于细胞外囊泡的提取重复性也优于细胞外囊泡超高速离心法,种子生长法对细胞外囊泡的提取变异系数(CV)为2.8%,而超高速离心法的CV为11.2%。
实施例3:用不同磁珠提取细胞外囊泡
向正常人血清中加入一定量的内参细胞外囊泡使得血清中AR-V7的浓度为500Copies/μL,将血清平均分成70份,每份1mL,按照以下程序,其中35份按照以下程序进行细胞外囊泡的提取(种子生长法):
1)在每份1mL血清中各加入1mL稀释液,混匀;
2)每份样本中分别加入2mg未进行表面基团修饰的裸珠、羧基磁珠、氨基磁珠、巯基磁珠、JSR磁珠、Dynabeads磁珠或安捷伦磁珠中的一种,混匀,每种磁珠5个重复;
3)每份样本中加入300μL提取试剂,混匀后,室温下滚动孵育10min;
4)将样本磁分离10min,去除上清液;
5)用洗涤液洗涤后重新磁分离,去除上清液。
另外35份血清不采取种子生长法(即不加入提取试剂,其它操作和种子生长法一致)。
将不同磁珠利用和不利用种子生长法提取的细胞外囊泡分别提取核酸,并用ddPCR对AR-V7进行定量,定量结果显示于图3中。
从图3中可以看出:①利用种子生长法,加入提取试剂和磁珠可以有效提取样本中的细胞外囊泡,不加入提取试剂无法有效地用磁珠提取样本中的细胞外囊泡;②不同磁珠利用种子生长法都可以有效提取样本中的细胞外囊泡,磁珠表面具有正电荷(氨基磁珠、巯基磁珠)还是负电荷(羧基磁珠)或者不带电荷(裸珠)对种子生长法细胞外囊泡的提取没有影响;③无论是氧化铁磁珠或者硅包覆的氧化铁磁珠(裸珠、羧基磁珠、氨基磁珠、巯基磁珠)还是聚合物包覆的磁珠(JSR磁珠、Dynabeads磁珠和安捷伦磁珠)利用种子生长法都能有效的提取细胞外囊泡;④种子生长法可以摆脱对高比表面积材料表面性状的依赖,适用于任意电荷、任意材质的高比表面积材料。
实施例4:种子生长法对细胞外囊泡及游离核酸、细胞外囊泡、除细胞外囊泡以外
的游离核酸的选择性提取
收集5位正常人的尿液,每位正常人的尿液平均分成三份,每份30mL。向每份尿液中添加10μL的内参(AR-V7的总浓度为500Copies/份)以及500Copies的N基因质粒(N基因为新冠病毒检测的常用基因,该质粒常用于新冠病毒提取和检测的质控品)。内参为细胞外囊泡,质粒为游离核酸。
种子生长法可以通过控制提取试剂以及洗涤液的浓度选择性地对样本中的细胞外囊泡及游离核酸、细胞外囊泡、除细胞外囊泡以外的游离核酸进行选择性的提取。
种子生长法提取试剂和洗涤液的浓度如下表中所示:
注:1X表示浓度不变(与实施例1中提取试剂和洗涤液的浓度相同);2X表示除了PBS缓冲液,其它组分的浓度翻倍;0.5X表示除了PBS缓冲液,其它组分的浓度降低为原来的50%。
利用种子生长法对细胞外囊泡进行提取的过程如下(与实施例2中相同):
1)在30mL尿液中加入5mg磁珠、6mL提取试剂滚动混匀室温孵育10min;
2)将样本磁分离10min,去除上清液;
3)用1X洗涤液洗涤后重新磁分离,去除上清液。(注:细胞外囊泡提取完成,细胞外囊泡吸附在磁珠上,取磁珠进行细胞外囊泡的核酸提取)。
利用种子生长法对细胞外囊泡及游离核酸进行提取的过程如下:
1)在30mL尿液中加入5mg磁珠、35mL提取试剂,滚动混匀室温孵育10min;
2)将样本磁分离10min,去除上清液;
3)用2X洗涤液洗涤后重新磁分离,去除上清液。(注:细胞外囊泡及游离核酸提取完成,细胞外囊泡以及游离核酸均吸附在磁珠上,取磁珠进行细胞外囊泡及游离核酸的总核酸提取)。
利用种子生长法对除细胞外囊泡外的游离核酸进行提取的过程如下:
1)在30mL尿液中加入5mg磁珠、35mL提取试剂滚动混匀室温孵育10min;
2)将样本磁分离10min,去除上清液;
3)用0.5X洗涤液洗涤后重新磁分离,去除上清液。(注:细胞外囊泡提取完成,细胞外囊泡吸附在磁珠上,游离核酸在洗涤液中,取洗涤液进行核酸提取)。
将上述处理后的磁珠或者洗涤液进行核酸提取后用ddPCR进行定量,定量结果显示于图4和图5中。
从图4和图5可以看出:通过控制种子生长法的提取试剂和洗涤液的浓度以及加入量可以选择性的对细胞外囊泡(22Rv1细胞外囊泡)+游离核酸(质粒)、细胞外囊泡(22Rv1细胞外囊泡)、除细胞外囊泡以外的游离核酸(质粒)进行选择性的捕获。
实施例5:细胞外囊泡的化学发光检测
收集10例正常人血清,每例血清平均分成两份。10位正常人血清各一份组成1组,共2组。第一组用种子生长法进行细胞外囊泡的提取,提取方式如下:
1)在每份1mL血清中各加入1mL稀释液,混匀;
2)每份样本中加入2mg磁珠;
3)每份样本中加入300μL提取试剂,混匀后,滚动孵育10min;
4)将样本磁分离10min,去除上清液;
5)用洗涤液洗涤后重新磁分离,去除上清液;
6)将提取完细胞外囊泡的磁珠用RIPA裂解;
7)磁分离,用化学发光检测CD9、CD63、CD81指标。
第二组血清不采取种子生长法(即不加入提取试剂,其它操作和种子生长法一致),并采用化学发光进行检测。
采用化学发光检测蛋白质的含量。化学发光的检测结果显示于图6中。
从图6中可以看出:利用种子生长法提取后可以检测到CD9、CD63、CD81等标志性蛋白,但是没有加入提取试剂的发光值很低,这证明了种子生长法可以有效提取到细胞外囊泡。
实施例6:种子生长法对细胞外囊泡以及其核酸的自动化提取
用种子生长法结合上海思路迪公司开发的用于细胞外囊泡的核酸提取试剂(沪闵械备20210008号、沪闵械备20200069号)以及全自动核酸提取仪(ANDiS 350沪闵械备20200080号)进行细胞外囊泡及其核酸的自动化提取:
1)在核酸提取试剂(沪闵械备20200069号)的第4、10列预分装400μL稀释液、150μL提取试剂、1.5mg磁珠;第5、11列预分装800μL洗涤液;
2)在核酸提取试剂的第4、10列每个孔加入400μL掺入了500Copies AR-V7细胞外囊泡的血清,共16个孔;
3)按照下面的程序进行细胞外囊泡及其核酸的自动化提取:
4)提取完成后吸取第6、12列洗脱液中的核酸即为细胞外囊泡的核酸,20分钟以内完成细胞外囊泡及其核酸的自动化提取。
将得到的核酸进行qPCR检测,检测结果显示于图7中。
从图7可以看出:种子生长法结合常规的核酸提取仪器即可实现细胞外囊泡及其核酸的自动化提取,且提取结果稳定可靠,CV<3%。整个细胞外囊泡及其核酸的提取过程可以控制在20分钟内完成,配合一台常规的32通道核酸提取仪,一天(按12小时算)可以完成1152个样本的细胞外囊泡及其核酸的提取,相对于超速离心法(大约4小时提取6个细胞外囊泡,再花费1小时提取核酸)以及沉淀法(2小时至过夜提取几个样本的细胞外囊泡并再花费1小时提取核酸),其效率提升几十到上百倍,且可以实现自动化操作,误差小。
以上仅描述了本发明的示例性实施方式或实施例,并不旨在限制本发明。对于本领域技术人员来说,本发明可以由各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本申请权利要求范围内。
Claims (29)
1.一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒,其特征在于,包含:
i)一种比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料;和
ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括iii)用于降低杂质浓度的组分和/或iv)用于洗涤杂质的组分。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括至少两个隔室以分别容纳i)高比表面积材料、ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分、任选的iii)用于降低杂质浓度的组分和任选的iv)用于洗涤杂质的组分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述高比表面积材料选自球状材料、类球状材料、形状不规则的颗粒或多孔膜。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述高比表面积材料选自带正电、带负电或不带电的磁珠。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分选自亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的组合,优选地,亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇(PEG)、甲基纤维素、聚乙烯亚胺及其组合,所述水溶性盐选自Al3+、H+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Cs2+、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+的一种或多种阳离子与选自PO43-、SO42-、CH3COO-、Cl-、NO3 -、ClO4 -、I-、SCN-的一种或多种阴离子形成的盐。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分以在含水载体中的悬浮液或者溶液的形式存在。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述含水载体选自纯水或者含有水的缓冲液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述含水载体选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、TRIZMA缓冲液、Tris缓冲液和TE缓冲液。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的试剂盒,其特征在于,在所述悬浮液或溶液中,亲水性高分子聚合物的质量分数为3%-60%,盐的浓度为0-6M,都以所述悬浮液或溶液为基准;优选地,在所述悬浮液或溶液中,所述亲水性高分子聚合物的质量分数为10%-40%,所述水溶性盐的浓度为0.5-4M,都以所述悬浮液或溶液为基准。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述用于降低杂质浓度的组分选自纯水和水溶液,优选地选自磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化钠溶液Tris缓冲液、TE缓冲液和纯水。
12.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述用于洗涤杂质的组分为能够调节渗透压的组分在含水载体中的悬浮液或者溶液,优选地,所述能够调节渗透压的组分为权利要求6中定义的能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述含水载体选自纯水或者含有水的缓冲液。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其特征在于,所述含水载体选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、TRIZMA缓冲液、Tris缓冲液和TE缓冲液。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述用于洗涤杂质的组分中还包含表面活性剂。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的试剂盒,其特征在于,在所述用于洗涤杂质的组分中,所述高分子聚合物的质量分数为1%-30%,所述盐的浓度为0-3M,都以所述用于洗涤杂质的组分为基准。
17.根据权利要求12-15中任一项所述的试剂盒,其特征在于,在所述用于洗涤杂质的组分中,高分子聚合物的质量分数为1%-5%;水溶性盐的浓度为0M-3M,都以用于洗涤杂质的组分为基准。
18.根据权利要求12-15中任一项所述的试剂盒,其特征在于,在所述用于洗涤杂质的组分中,高分子聚合物的质量分数为5%-30%;水溶性盐的浓度为0.3M-3M,都以用于洗涤杂质的组分为基准。
19.一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的方法,其特征在于,包括以下步骤:
I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分,孵育至少1分钟;
II)将样本磁分离并去除上清液;和
III)洗涤步骤II)后的高比表面积材料并收集附着在高比表面积材料的细胞外囊泡。
20.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,所述生物样本选自血浆、血清、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、淋巴、组织液、细胞上清以及细胞外囊泡的重悬液。
21.根据权利要求19或20所述的方法,其特征在于,所述高比表面积材料如权利要求4或5中所定义,所述高比表面积材料的加入量使得所述高比表面积材料的总表面积不低于10cm2/每毫升样本,优选地,相对于每毫升样本,加入的所述高比表面积材料的总表面积在1000-1000000cm2范围内。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法,其特征在于,所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分如权利要求6-10中任一项所定义,在步骤I)中,以样本为基准,样本中的亲水性高分子聚合物的质量分数为3-20%,水溶性盐在样本中的终浓度为0-1M。
23.根据权利要求22所述的方法,其特征在于,在步骤I)中,在样本中,高分子聚合物的质量分数为3%-15%;水溶性盐的浓度为0M-0.8M,都以样本为基准。
24.根据权利要求22所述的方法,其特征在于,在步骤I)中,在样本中,高分子聚合物的质量分数为15%-20%;水溶性盐的浓度为0.8M-1M,都以样本为基准。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤I)中,在向生物样本中加入比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分之前,通过降低样本中杂质的量或稀释样本中杂质浓度来降低样本中杂质的浓度。
26.根据权利要求25所述的方法,其特征在于,通过酶消化、等电点沉淀、离心、过滤或色谱来降低样本中杂质的量。
27.根据权利要求25所述的方法,其特征在于,通过用于稀释杂质浓度的组分来稀释样本中杂质的浓度,所述用于稀释杂质浓度的组分如权利要求11中所定义。
28.根据权利要求19-27中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤III)中,通过用于洗涤杂质的组分来洗涤高比表面积材料,所述用于洗涤杂质的组分如权利要求12至18中任一项中所定义。
29.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,其包括以下步骤:
I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000cm2/g的磁珠和如权利要求6-10中任一项所定义的能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分,孵育1-120分钟;
II)将生物样本磁分离1-15分钟,去除上清液;和
III)用如权利要求12至18中任一项中所定义的用于洗涤杂质的组分洗涤步骤II)后的磁珠并收集附着在磁珠上的细胞外囊泡,
其中任选在加入磁珠和提取试剂之前加入如权利要求11中所定义的用于降低杂质浓度的组分或通过酶消化、等电点沉淀、离心、过滤或色谱来降低样本中杂质的浓度。
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