CN111065730A - 利用疏水相互作用分离细胞外囊泡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离细胞外囊泡的方法，具体涉及一种利用细胞外囊泡的疏水性分离细胞外囊泡的方法，以及使用所述方法分离的细胞外囊泡。当使用所述方法时，本发明所述分离细胞外囊泡的方法能够从包括血液和尿液的各种动物体液或包括癌症组织在内的各种组织中分离出不含用常规方法难以消除的脂蛋白污染的细胞外囊泡。所述方法可以解决脂蛋白污染引起的常规问题，并且有望成为一项重要的技术，对使用从各种动物体液或组织中分离的细胞外囊泡的各种研究产生重大影响，如特征和功能研究、多组学研究、新型生物标志物的挖掘、诊断和治疗等。

Description

利用疏水相互作用分离细胞外囊泡的方法
技术领域
本发明涉及一种分离细胞外囊泡的方法，具体涉及一种利用细胞外囊泡的疏水性分离细胞外囊泡的方法，并且涉及一种通过所述方法分离的不含包括脂蛋白在内的杂质的细胞外囊泡。
背景技术
细胞外囊泡是纳米级的颗粒(20-100,000nm)，可从地球上的所有细胞中自然释放，并具有源于细胞的脂质双层膜结构。对于动物而言，细胞外囊泡被发现存在于体液(例如血液、唾液、泪液、鼻粘液、汗液、尿液、粪便、脑脊液(CSF)、腹水、羊水、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、精液、乳汁等)以及各种肿瘤或正常组织中。
细胞外囊泡含有来自分泌细胞(母细胞)的各种生理活性物质(例如蛋白质、脂质、氨基酸、RNA等)，故其可以体现母细胞的生理和病理特征。另外，已经发现细胞外囊泡可作为载体与其他细胞和组织结合，以将生理活性物质从母细胞转移至受体细胞和组织，从而执行各种生理和病理功能。因此，细胞外囊泡的成分和功能正在不断被研究，以期利用细胞外囊泡作为诊断和治疗各种疾病的新方法。
一般而言，已经有许多技术被用于分离细胞外囊泡，包括超速离心、密度梯度离心、超声裂解、分子筛、聚合物沉淀、盐沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换层析、亲和层析和双液相体系。其中，超速离心是应用最广泛的。该技术可有效地从相对较小的材料中分离出纳米颗粒，因此可用于从各种材料(包括样品中的可溶性蛋白质)中分离细胞外囊泡。
关于细胞外囊泡的利用，业界正在进行研究：分析从体外培养的细胞分离的细胞外囊泡的成分以挖掘新的生物标志物，以及对包括血液或各种组织(包括癌症组织)的动物体液中分离的细胞外囊泡的成分(例如蛋白质、核酸等)进行定量比较，从而在包括诊断、预后评估或疾病治疗在内的许多方面利用细胞外囊泡。
特别地，对利用源自包括血液(血清和血浆)和尿液的各种动物体液以及癌组织在内的各种组织的细胞外囊泡进行诊断和治疗的需求很大。然而，因为存在于动物体液或组织中的纳米颗粒包括各种形式的脂蛋白以及细胞外囊泡，所以难以通过常规的细胞外囊泡分离技术选择性地单独分离细胞外囊泡。
脂蛋白是运输胆固醇和甘油三酸酯的重要因子，胆固醇和甘油三酸酯是细胞构造必不可少的膜的基础。另外，已知脂蛋白可以用作在血液中运输细胞外核酸的载体(NatCell Biol,2011,Vicker et al.,ISSN:1476-4679)，这点非常类似于在血液内运输细胞外核酸的细胞外囊泡。根据大小(nm)和密度(g/mL)，脂蛋白分为以下纳米颗粒：高密度脂蛋白(HDL；5-15nm，1.063g/mL)，低密度脂蛋白(LDL；18-28)nm，1.019-1.063g/mL)，中密度脂蛋白(IDL；25-50nm，1.006-1.019g/mL)，极低密度脂蛋白(VLDL；30-80nm，0.950-1.006g/mL)和乳糜微粒(100-1000nm，约0.95g/mL)。
血液中的这种细胞外囊泡和脂蛋白除了转运细胞外核酸的功能外，在大小和密度等各个方面都彼此相似，因此难以选择性地分离两者(Biochem Biophys Res Commun,2009,Looze et al.,ISSN:1090-2104；J Extracell Vesicles,2014,Yuana et al.,ISSN:2001-3078；Sci Rep,2016,Sodar et al.,ISSN:2045-2322)。
因此，从各种动物体液(包括血液和尿液)和各种组织(包括癌组织)中分离的细胞外囊泡由于被脂蛋白污染，在进行基因组和蛋白质体分析、功能搜索以及用于诊断和治疗中时会引起各种问题。据报道，即使利用依靠细胞外囊泡和脂蛋白之间密度差异的密度梯度离心，也不能有效地除去脂蛋白。
因此，迫切需要开发一种在分离细胞外囊泡时能有效除去脂蛋白的技术，以便将源自各种动物体液或组织的细胞外囊泡应用于对其分析和功能的研究以及将其应用于诊断和治疗。在分离细胞外囊泡的同时，有效除去其中的脂蛋白将是本领域发展的最关键技术之一。
发明内容
技术问题
本发明的一个方面是提供一种分离细胞外囊泡的方法，该方法包括以下步骤：(a)将疏水性官能团固定在固定相上；(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相，使细胞外囊泡与疏水性官能团结合；(c)洗去固定相上未结合疏水性官能团的残留的剩余样品；和(d)从固定相洗脱结合至疏水性官能团的细胞外囊泡。
本发明的另一方面是提供一种分离细胞外囊泡的方法，该方法包括以下步骤：(a)将疏水性官能团固定在固定相上；(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相；和(c)从固定相中收集含有不与疏水性官能团结合的细胞外囊泡的样品级分。
本发明的另一方面是提供一种利用所述方法分离的细胞外囊泡。
本发明的另一方面是提供一种利用所述分离方法从含有细胞外囊泡的样品级分中除去脂蛋白的方法。
技术方案
为了克服上述问题而做出本发明，并且本发明的一方面提供一种利用细胞外囊泡的疏水相互作用性质，从疏水性比细胞外囊泡高或低的材料中特异性地分离细胞外囊泡的方法。在本发明中，当各种含有细胞外囊泡的样品在盐析离子的控制下通过结合了疏水性官能团的固定相时，利用其疏水性相互作用，细胞外囊泡可以快速、容易地被分离而不造成理化性质的变化。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”统指衍生自古细菌、原核生物或真核生物的细胞的生物纳米颗粒。细胞外囊泡的实例包括但不限于阿尔戈体(argosome)、树突状细胞源体、外泌体、核外颗粒体、囊泡、癌小体、prominosome、前列腺体、耐受体、微粒、微泡、纳米囊泡、起泡囊泡、出芽囊泡、外泌体状囊泡、基质囊泡、膜状泡、脱落囊泡、膜颗粒、脱落微泡、膜泡、附睾体、凸素体、肿瘤细胞源体和古细菌脂质体。另外，包含各种膜蛋白的各种细胞外囊泡模拟物也属于细胞外囊泡的范围。
具体地，根据本发明分离细胞外囊泡的第一种方法包括以下步骤：(a)将疏水性官能团固定在固定相上；(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相；(c)洗去固定相上未结合疏水性官能团的残留的剩余样品；和(d)从固定相洗脱结合至疏水性官能团的细胞外囊泡。
图1A示意性地说明了本发明分离细胞外囊泡的第一种方法。
根据本发明，分离细胞外囊泡的第二种方法包括以下步骤：(a)将疏水性官能团固定在固定相上；(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相；和(c)从固定相中收集含有不与疏水性官能团结合的细胞外囊泡的样品级分。
图1B示意性地说明了本发明所述的分离细胞外囊泡的第二种方法。
如本文所用，术语“固定相”是指在亲和层析中用于将展现物理、化学或生物亲和力的两种物质中的一种固定于其上的基质。具体地，本发明中的所述固定相可选自但不限于由琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、葡聚糖珠、二氧化硅珠、磁珠、金纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒、尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜、纸、塑料、玻璃和金属传感器芯片组成的群组。
如本文所用，术语“疏水性官能团”，也称为疏水性工作基团或非极性官能团，是指对水分子或其表面不溶于水或排斥水的官能团没有或几乎没有亲和力的分子，如烷基、苯基等。特别地，本发明所述的疏水性官能团可以选自但不限于由丁基、氰基丁基、辛基、苯基和二苯基组成的群组。
如本文所用，术语“样品”旨在涵盖含有本文所述细胞外囊泡的生物样品、细胞培养物或组织样品。样品的具体实例包括但不限于哺乳动物细胞培养物、细菌细胞培养物、酵母培养物、组织提取物、癌组织、血液(血清和血浆)、唾液、泪液、鼻粘液、汗液、尿液、粪便、脑脊液(CSF)、腹水、羊水、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、精液、乳汁、灰尘、淡水、海水、土壤和发酵食品。
如本文所用，术语“溶液”是指其中含有或不含有细胞外囊泡的液体。该液体可用于在上样之前或之后洗净固定相，或洗脱与固定相结合的样品。本发明所述的溶液可以选自但不限于由水、有机溶剂和缓冲剂组成的群组。
如本文所用，术语“盐析离子”是指用于稳定水的结构的离液序列低(kosmotropic)的盐，其是降低溶液中水的可利用性以增加疏水相互作用强度的离子。可以根据Hofmeister系列来确定此类离液序列低的盐的范畴，该系列按照影响溶液中可溶物质的溶解度的顺序排序。阴离子通常按以下顺序排序：SO4 2->HPO4 2->OH->F->HCOO->CH3COO->Cl->Br->NO3 ->I->SCN->ClO4 -。阳离子的顺序通常为：NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li+、Ca2+、Mg2+和Ba2+。根据Hofmeister系列，离液序列低的盐可作为疏水性颗粒的盐析离子。为稳定水的结构，本发明所述盐析离子可以是由Hofmeister系列中的阴离子和抗衡离子组成的离液序列低的盐。
样品中细胞外囊泡与固定相上疏水官能团的结合可以通过控制盐析离子的种类和浓度来确定。
具体地，当从疏水相互作用强度比样品中细胞外囊泡弱的材料中分离出细胞外囊泡时，具有疏水性官能团的固定相先用含有高浓度盐析离子的溶液洗涤，然后将添加了高浓度盐析离子的细胞外囊泡样品流过固定相。此时，细胞外囊泡被吸附到具有疏水性官能团的固定相上，而疏水相互作用强度相对较弱的颗粒则从层析柱中流出而不与之结合。随后，以含有盐析离子(浓度低于混合在固定相洗涤溶液中和样品中的盐析离子)的盐析离子溶液洗脱疏水相互作用弱于固定相中细胞外囊泡的物质。此后，可以使用水、不含盐析离子的溶液或仅含低浓度盐析离子的溶液，以常规方法将吸附在固定相上的细胞外囊泡洗脱分离。
相反，当从疏水相互作用强度比样品中的细胞外囊泡强的材料中分离细胞外囊泡时，用水或含有低盐析离子浓度的溶液洗涤具有疏水性官能团的固定相。此时，疏水性相互作用强度相对较强的物质被吸附到固定相上，而细胞外囊泡则从层析柱中流出而不与固定相结合。如果需要，含有细胞外囊泡的样品中较低的盐析离子浓度可以更有效地分离未被吸附到具有疏水性官能团的固定相的细胞外囊泡。
在本发明中，盐析离子可以选自由离液序列低的盐组成的群组。所述的离液序列低的盐的实例包括但不限于硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氟化物、甲酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、硝酸盐、碘化物、硫氰酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐及其抗衡阳离子。特别地，本发明的盐析离子可以选自但不限于由氯化钠、硫酸铵、硫酸钠和氯化铵组成的群组。
本发明提供了一种通过控制盐析离子浓度，从各种样品中分离细胞外囊泡的方法，其中1)细胞外囊泡结合到具有疏水性官能团的固定相，疏水相互作用强度低的物质被除去，然后洗脱结合的细胞外囊泡以从疏水相互作用强度不同的材料中分离细胞外囊泡；或2)具有高疏水相互作用强度的物质被吸附到具有疏水性官能团的固定相上，同时细胞外囊泡以未结合的状态洗脱。通过所述方法，可以快速且容易地从各种样品中分离细胞外囊泡，并且由此获得的细胞外囊泡可以应用于包括诊断和治疗以及多组学在内的各种领域中，以及对感兴趣的目标物质的表征和功能的研究中。
本发明提供了两种利用疏水相互作用分离细胞外囊泡的方法。
首先，本发明提供了一种从疏水相互作用强度小于细胞外囊泡的材料中分离细胞外囊泡的方法，该方法包括以下步骤：(a)将疏水性官能团固定在固定相上；(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相，使细胞外囊泡与疏水性官能团结合；(c)洗去固定相上未结合疏水性官能团的残留的剩余样品；和(d)从固定相洗脱结合至疏水性官能团的细胞外囊泡。
在本发明的一个实施方案中，该方法可以进一步包括在步骤(b)之前用含有盐析离子的溶液洗涤其上具有疏水性官能团的固定相的步骤。
在上述方面，固定相洗涤步骤中的盐析离子具有适于使固定相具有强疏水性的浓度，以使细胞外囊泡能够结合至固定相。盐析离子的浓度可以根据洗涤溶液中的盐析离子的种类和洗涤前的固定相的疏水性强度而变化。通过固定相洗涤步骤，将细胞外囊泡与固定相结合，同时因盐析离子浓度而疏水性低于细胞外囊泡的纳米颗粒可以直接通过固定相。特别地，可以将本发明中的盐析离子的浓度控制在0M至10M之内。
在本公开的一个实施方案中，该方法可以进一步包括以下步骤：在将含有细胞外囊泡上样至固定相的步骤(b)之前，将含有盐析离子的溶液添加到所述样品中，以改变所述样品中含有的盐析离子的种类或浓度。
通过向样品中添加含盐析离子的溶液，样品中所含盐析离子的浓度可以增加或降低，也可以改变或补充离子的种类。因此，通过调节样品中所含盐析离子的种类或浓度，便可以控制样品的疏水相互作用强度，从而控制细胞外囊泡与固定相之间的疏水相互作用。特别地，盐析离子的浓度可以控制在0M至10M的范围内。
在本发明的一个实施方案中，步骤(d)是将细胞外囊泡与吸附在具有疏水性官能团的固定相上的物质特异性分离，并且所述的方法可以进一步包括在洗脱细胞外囊泡的步骤(d)之前，控制盐析离子的种类或浓度以除去疏水相互作用强度小于细胞外囊泡的物质的步骤。
在上述方面，盐析离子的浓度处于仅洗脱疏水性比细胞外囊泡弱的物质而细胞外囊泡保持结合于固定相的水平。可以根据盐析离子的种类和溶液的pH或温度来控制盐析离子的浓度。特别地，盐析离子的浓度可以控制在0M至10M的范围内。
在本发明的一个实施方案中，步骤(d)是将细胞外囊泡与吸附到具有疏水性官能团的固定相的物质特异性分离。在该步骤中，可以控制盐析离子的种类或浓度，以便仅洗脱细胞外囊泡，而疏水性大于细胞外囊泡的物质保持与柱结合。
在上述方面，盐析离子的浓度处于仅洗脱细胞外囊泡的水平，而疏水性大于细胞外囊泡的物质保持与固定相结合。可以根据盐析离子的种类和溶液的pH或温度来控制盐析离子的浓度。特别地，盐析离子的浓度可以控制在0M至10M的范围内。
本发明所述的盐析离子用于控制固定相或含有细胞外囊泡的样品的疏水性。在本发明中，可以用本领域技术人员理解的各种条件，将细胞外囊泡结合到固定相或洗脱结合到固定相的细胞外囊泡。具体地，可以通过盐析离子的种类和浓度以及所用缓冲液的pH和温度来控制固定相的疏水性。特别地，溶液中包含的盐析离子是选自由硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氟化物、甲酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、硝酸盐、碘化物、硫氰酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的群组中的至少一种。合适的溶液条件包括但不限于浓度为0M-10M的盐析离子，pH3-12，4℃-50℃的温度，或以上条件的组合。
在本发明中，疏水性官能团或样品可以利用但不限于重力、泵送(液相层析系统)、注射、旋转或真空式等方式上样至固定相。
本发明所述的分离细胞外囊泡的方法可以进一步包括在将样品上样至固定相的步骤之前对含有细胞外囊泡的样品进行预处理的步骤。
本发明所述的预处理步骤是部分纯化未纯化样品的步骤，可以实施但不限于选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、聚合物沉淀、盐沉淀、有机溶剂沉淀和双液相体系中的一个技术。
另外，本发明所述的分离细胞外囊泡的方法可以进一步包括对从固定有疏水性官能团的固定相洗脱的细胞外囊泡进行后处理的步骤。
本发明所述的后处理步骤是纯化分离的细胞外囊泡的步骤，并且可以实施但不限于选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、盐沉淀、有机溶剂沉淀和双液相体系中的一个技术。
其次，本发明提供了一种从疏水相互作用强度大于细胞外囊泡的材料中分离细胞外囊泡的方法，所述的方法包括以下步骤：(a)将疏水性官能团固定在固定相上；(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相；和(c)从固定相中收集含有不与疏水性官能团结合的细胞外囊泡的样品级分。
在本发明的一个实施方案中，该方法可以进一步包括在步骤(b)之前用含有盐析离子的溶液洗涤其上具有疏水性官能团的固定相的步骤。
在上述方面，固定相洗涤步骤中的盐析离子具有适于使固定相疏水性减弱的浓度，从而仅允许疏水性比细胞外囊泡强的物质结合到固定相上，而细胞外囊泡无法与固定相结合。盐析离子的浓度可以根据洗涤溶液中的盐析离子的种类和洗涤前固定相的疏水性强度而变化。通过洗涤固定相的步骤，疏水性比细胞外囊泡强的物质结合到固定相，而细胞外囊泡和疏水性比细胞外囊泡弱的纳米颗粒可以通过固定相。特别地，可以将本发明中的盐析离子的浓度控制在0M至10M之内。
在本发明的一个实施方案中，所述的方法可以进一步包括以下步骤：在将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相的步骤(b)之前，将含有或不含有盐析离子的溶液添加至所述样品以改变样品中所含盐析离子的种类或浓度。
通过向样品中添加含有或不含有盐析离子的溶液，样品中所含盐析离子的浓度可以增加或降低，也可以改变或补充种类。因此，调节样品中所含盐分离子的种类或浓度以控制样品的疏水相互作用的强度，便可以控制细胞外囊泡与固定相之间的疏水相互作用。特别地，盐析离子的浓度可以控制在0M至10M的范围内。
本发明所述的含有或不含盐析离子的溶液用于控制固定相或含有细胞外囊泡的样品的疏水性。在本发明中，可以用本领域技术人员理解的各种条件，选择性地将疏水性比细胞外囊泡强的物质(例如脂蛋白)吸附到具有疏水性官能团的固定相上，同时疏水相互作用强度相对较弱的细胞外囊泡通过柱子，而没有被吸附到固定相。具体地，可以通过盐析离子的种类和浓度以及所用缓冲液的pH和温度来控制固定相的疏水性。特别地，溶液中包含的盐析离子是选自由硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氟化物、甲酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、硝酸盐、碘化物、硫氰酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的群组中的至少一种。合适的溶液条件包括但不限于浓度为0M-10M的盐析离子，pH3-12，4℃-50℃的温度，或以上条件的组合。
已知包括血液在内的生物样品中的脂蛋白具有高疏水相互作用强度，因此在低盐析离子浓度的环境下也能与疏水性官能团牢固结合。因此，本发明所述的方法可以有效地从生物样品中分离出这种脂蛋白和细胞外囊泡。
在本发明中，疏水性官能团或样品可以利用但不限于重力、泵送(液相层析系统)、注射、旋转或真空式等方式上样至固定相。
本发明所述的分离细胞外囊泡的方法可以进一步包括在将样品上样至固定相的步骤之前对含有细胞外囊泡的样品进行预处理的步骤。
本发明所述的预处理步骤是部分纯化未纯化样品的步骤，可以实施但不限于选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、聚合物沉淀、盐沉淀、有机溶剂沉淀和双液相体系中的一个技术。
另外，本发明所述的分离细胞外囊泡的方法可以进一步包括对从固定有疏水性官能团的固定相洗脱的细胞外囊泡进行后处理的步骤。
本发明所述的后处理步骤是纯化分离的细胞外囊泡的步骤，并且可以实施但不限于选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、盐沉淀、有机溶剂沉淀和双液相体系中的一个技术。
此外，本发明提供了一种通过所述分离方法分离的细胞外囊泡。
另外，本发明提供了一种方法，其通过使用所述的分离方法，可以从含有细胞外囊泡的样品中有效除去疏水相互作用的强度比细胞外囊泡强的脂蛋白或疏水相互作用强度比细胞外囊泡弱的物质。
积极效果
本发明所述的分离细胞外囊泡的方法既不需要昂贵的设备，如离心机，也不需要在分离过程中将样品暴露于极端环境中，因此具有有效分离细胞外囊泡而不改变其形态和特征的优点。另外，可以在进行常规分离方法之前或之后使用本发明所述的方法，从而使分离效率最大化。
此外，本发明所述的分离细胞外囊泡的方法不仅可以快速有效地分离细胞外囊泡，而且不受样品量的限制，在细胞外囊泡的批量生产中起着重要作用；而且可以通过应用于少量体液样本的前处理和/或后处理而在临床诊断中使用。
本发明所述的分离细胞外囊泡的方法的应用，能够从包括血液和尿液在内的各种动物体液或包括癌组织在内的各种组织中分离出不含脂蛋白污染的细胞外囊泡，这是常规方法难以实现的，从而解决了常见的脂蛋白污染问题。同样，本发明的方法有望成为对从各种动物体液或组织分离的细胞外囊泡的特征和功能的各种研究、多组学、新型生物标志物的挖掘、诊断和治疗等方面产生重大影响的基本技术。
附图说明
图1为示意图，其展示了依据本发明的一个实施方案分离细胞外囊泡的方法。
图2为概念图，其说明了依据本发明的一个实施方案从结肠癌细胞系SW480分离参考细胞外囊泡的方法的总体方案。
图3显示对根据本发明的一个实施方案分离的参考细胞外囊泡的鉴定，该鉴定通过尺寸排阻层析法(a)、透射电子显微镜(b)、DLS分析(c)和蛋白质印迹(d)进行分析。
图4显示了在本发明的一个实施方案中，参考细胞外囊泡与固定有疏水性官能团的固定相的结合行为，该行为通过纳米粒子浓度分析(a)和夹心ELISA分析(b)进行鉴定。
图5显示了在本发明的一个实施方案中，参考细胞外囊泡与固定有疏水性官能团的固定相在各种浓度的氯化钠环境中的结合行为，该行为通过纳米粒子浓度分析(a)和蛋白质印迹(b)进行鉴定。
图6显示了在本发明的一个实施方案中，利用其中所述的疏水相互作用的分离方法，除去脂蛋白以纯化从人血浆获得的细胞外囊泡，该纯化通过蛋白质印迹法(a)、胆固醇测定法(b)、纳米颗粒浓度分析(c)和蛋白质浓度分析(d)进行鉴定。
具体实施方式
实施本发明的最佳方式
实施发明的方式
在下文中，将结合实施例详细描述本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：参考细胞外囊泡的纯化和分析
将结肠癌细胞系SW480的新鲜培养物以500xg离心10分钟(共重复两次)。除去细胞碎片和沉淀物后，将上清液再次以2,000xg离心20分钟(总共重复两次)，除去沉淀物。
向上清液中加入沉淀诱导剂(8.4％聚乙二醇6000、250mM NaCl，20mM HEPES，pH7.4)，以第一次纯化和沉淀其中存在的细胞外囊泡。在冰箱中保存16小时后，将上清液以12,000xg的速度离心30分钟，得到沉淀形式的细胞外囊泡。将沉淀溶解在HEPES缓冲液(HEPES缓冲盐水，20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)中。
为了通过密度和浮力第二次纯化细胞外囊泡，将样品与OptiPrepTM(最终浓度为30％)混合，并将混合物上样至超离心器的底部，然后按顺序分层加入20％OptiPrepTM和5％OptiPrepTM。在200,000xg的浮力密度梯度超离心2小时(30％，20％和5％OptiPrepTM三层)后，得到细胞外囊泡和高密度(1.08-1.12g/ml)的区域。
为了对经上述步骤纯化的细胞外囊泡进行第三次纯化，先用HPLC装置将上述产物装入柱中，在Sephacryl S500填充柱(10x100mm)上进行尺寸排阻层析。结果，获得了最终纯化的细胞外囊泡的级分。样品细胞外囊泡的这种分离过程展示在图2中。
如上所述，使用尺寸排阻层析、电子显微镜和动态光散射(DLS)鉴定从结肠癌细胞系SW480最终纯化的细胞外囊泡。结果在图3中展示。如图3(a)所示，源自结肠癌细胞系的细胞外囊泡具有相当高的纯度。另外，如图3(b)，利用透射电子显微镜在形态学上观察源自结肠癌细胞系的细胞外囊泡。如图3(c)所示，经DLS分析，该细胞外囊泡的直径约为164nm。
此外，在图3(d)中，蛋白质印迹分析表明，与细胞系相比，在从结肠癌细胞系获得的纯化的细胞外囊泡中，选择性地高表达了作为细胞外囊泡标志物的Alix、CD63和CD9蛋白，但未检测到属于胞质蛋白的钙联蛋白和组蛋白H2B。
实施例2：参考细胞外囊泡对具有疏水性官能团的固定相的结合行为
通过检测以观察细胞外囊泡是否结合疏水性官能团。为达到上述目的，使用HPLC系统检测在实施例1中分离得到的参考细胞外囊泡的结合行为。
首先，用20柱体积的结合缓冲液(1M NaCl，20mM HEPES，pH7.2)在1ml/min的压力下洗涤填充了具有疏水性官能团固定相(苯基-Sepharose)的柱子(1ml)。将实施例1中分离得到的参考细胞外囊泡，按照4x1010个的量溶解在相同的结合缓冲液中。
使用相同的结合缓冲液，将参考细胞外囊泡溶液上样5分钟，到经洗涤的具有疏水性官能团的固定相上，后用相同的缓冲液洗5分钟，去除未结合的残基。然后，在用10个柱体积的0M NaCl缓冲液洗涤之前，先用20个柱体积按1M-0M NaCl浓度梯度洗脱。
将来自结合的细胞外囊泡、洗涤步骤、NaCl浓度梯度和最终洗涤步骤的洗脱物按1ml进行级分。对所有洗脱物级分进行纳米颗粒浓度分析，并基于抗细胞外囊泡标记物抗体(抗CD9和抗SW480EV抗体)进行夹心ELISA，以分析细胞外囊泡的结合行为。
结果如图4所示。在图4中，大多数参考细胞外囊泡结合到具有疏水性功能团的固定相上，因此在1M NaCl缓冲液的洗脱液中未检测到参考细胞外囊泡。当流动相中的NaCl浓度达到0M时，检测到了细胞外囊泡的洗脱。由此可以看出，细胞外囊泡在高浓度NaCl环境中与疏水性官能团结合，而在低浓度NaCl环境中与疏水性官能团分离。另外，以上结果表明，具有疏水性官能团的固定相可以有效消除存在于纯化参考细胞外囊泡或没有活性的细胞外囊泡中的杂质，或在储存过程中形成的大型残留杂质复合物。
实施例3：参考细胞外囊泡依据盐浓度对具有疏水性官能团的固定相的结合行为
为了检测参考细胞外囊泡依据NaCl浓度与具有疏水性官能团的固定相的结合行为，进行了以下实验。
用聚乙二醇沉淀纯化参考细胞外囊泡。将沉淀的参考细胞外囊泡添加到各种NaCl浓度(20mM HEPES，pH7.2和分别为0M，50mM，150mM，500mM的NaCl)的缓冲液中。
用0.4ml具有疏水性官能团的固定相(苯基-Sepharose)填充空柱子，然后用0.5ml水通过离心(700xg，1分钟)洗涤3次，以制备疏水性相互作用层析柱。每次0.5ml的相应缓冲液(20mM HEPES，pH7.2和分别为0M，50mM，150mM，500mM的NaCl)，洗涤四根上述的疏水相互作用层析柱三遍。向每个制备好的柱中上样0.2ml参考细胞外囊泡，然后反应10分钟。以700xg离心1分钟，排出未结合的囊泡。测量由此得到的溶液中纳米颗粒的浓度，以定量其中的参考细胞外囊泡，并进行针对细胞外囊泡标志物CD9的蛋白质印迹分析。结果如图5所示。
如图5中纳米颗粒分析结果(a)和蛋白质印迹(b)两者所示，在含0M NaCl的缓冲液中检测到最高的纳米颗粒浓度和最强的CD9信号，表明在高浓度NaCl的条件下，细胞外囊泡与疏水性官能团结合，而在低浓度的NaCl条件下细胞外囊泡不与疏水性官能团结合而流出层析柱。
实施例4：利用疏水相互作用层析法分离出不含脂蛋白的血液来源的细胞外囊泡
使用本发明所述的方法，从人血浆分离细胞外囊泡，并如下分析脂蛋白消除作用。
用2ml具有疏水性官能团的固定相(苯基-Sepharose)填充空柱，并用2ml水离心(700xg，1分钟)洗涤3次。随后，将1ml EDTA处理过的人血浆样品上样至固定相填充的层析柱中，然后将其以700xg再次离心1分钟，以获取未与层析柱结合的血浆样品。之后，将收集的血浆样品再次加载到相同的柱子上，并在相同的条件下离心。前述步骤总共进行三遍。
将通过固定相填充的疏水相互作用层析柱三遍的血浆样品，在HEPES缓冲液(150mM NaCl，HEPES，pH7.2)中稀释八倍，同时以未通过疏水相互作用层析的血浆样品用作对照。使用聚乙二醇沉淀样品中的细胞外囊泡，并进行离心分离(12,000xg，10分钟)。收集细胞外囊泡的沉淀并将其溶解在HEPES缓冲液中，然后使用HPLC系统通过S500尺寸排阻层析法进行进一步纯化。
通过蛋白质印迹，分析上述纯化的血液来源的细胞外囊泡中作为细胞外囊泡标志蛋白的CD81，和高密度脂蛋白与低密度脂蛋白各自的特异性蛋白ApoA1和ApoB。结果如图6(a)所示。从数据可以得出，在通过和未通过疏水相互作用层析柱的样品中均检测到相似的CD81信号，而从通过疏水相互作用层析柱的样品中未检测到脂蛋白标记物ApoB和ApoA1的信号。因此结果表明，使用疏水相互作用层析柱可以选择性地只去除脂蛋白，同时保留血液来源细胞外囊泡的产率。
另外，通过对上述纯化的血液来源的细胞外囊泡的胆固醇浓度进行检测(图6(b))，通过疏水相互作用层析柱的细胞外囊泡样品的胆固醇浓度显著降低；以及通过纳米颗粒测定法(图6(c))和蛋白质浓度测定法(图6(d)测得的G蛋白浓度显著降低，均说明了脂蛋白纳米颗粒被除去。
因此本实施例表明，疏水相互作用层析柱的使用可以有效地防止脂蛋白污染血液来源的细胞外囊泡，而脂蛋白用常规方法难以除去；同时保留了细胞外囊泡的产率。

Claims (36)

1.一种分离细胞外囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将疏水性官能团固定在固定相上；
(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相，使细胞外囊泡与疏水性官能团结合；
(c)洗去固定相上未结合疏水性官能团的残留的剩余样品；和
(d)从固定相洗脱结合至疏水性官能团的细胞外囊泡。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(b)之前用含有盐析离子的溶液洗涤其上具有疏水性官能团的固定相的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述盐析离子具有适于控制所述固定相的疏水性以使所述细胞外囊泡结合至所述固定相的浓度。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述盐析离子的浓度范围为0M至10M。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：在将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相的步骤(b)之前，将含有盐析离子的溶液添加到所述样品中，以改变所述样品中含有的盐析离子的种类或浓度。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在洗脱细胞外囊泡的步骤(d)之前，控制盐析离子的种类或浓度以除去疏水相互作用强度小于细胞外囊泡的物质的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，用于除去疏水相互作用强度小于细胞外囊泡的物质的所述盐析离子的浓度被控制在0M至10M的范围内。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐析离子选自硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氟化物、甲酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、硝酸盐、碘化物、硫氰酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的群组中的至少一种。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相选自由琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、葡聚糖珠、二氧化硅珠、磁珠、金纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒、尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜、纸、塑料、玻璃和金属传感器芯片组成的群组中的至少一种。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏水性官能团选自由丁基、氰基丁基、辛基、苯基和联苯组成的群组中的至少一种。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品选自由哺乳动物细胞培养物、细菌细胞培养物、酵母培养物、组织提取物、癌组织、血清、血浆、唾液、泪液、鼻粘液、汗液、尿液、粪便、脑脊液、腹水、羊水、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、精液、牛奶、灰尘、淡水、海水、土壤和发酵食品组成的群组中的至少一种。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相的步骤(b)之前，对所述含有细胞外囊泡的样品进行预处理的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述预处理的步骤为实施选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、沉淀和双液相体系中的一个技术。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对来自步骤(d)的洗脱液中的细胞外囊泡进行后处理的步骤。
15.权利要求14所述的方法，其特征在于，所述后处理的步骤为实施选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、沉淀和双液相体系中的一个技术。
16.利用权利要求1至15中任一项中所述的方法分离的细胞外囊泡。
17.一种分离细胞外囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将疏水性官能团固定在固定相上；
(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至所述固定相；和
(c)从所述固定相中收集含有不与所述疏水性官能团结合的细胞外囊泡的样品级分。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(b)之前用含有盐析离子的溶液洗涤其上具有疏水性官能团的固定相的步骤。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述盐析离子的浓度范围为0M至10M。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：在将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相的步骤(b)之前，将含有或不含有盐析离子的溶液添加至所述样品以改变样品中所含盐析离子的种类或浓度。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述盐析离子的浓度范围为0M至10M。
22.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述盐析离子选自由硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氟化物、甲酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、硝酸盐、碘化物、硫氰酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐组成的群组中的至少一种。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述固定相是选自由琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、交联葡聚糖珠、二氧化硅珠、磁珠、金纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒、尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜、纸、塑料、玻璃和金属传感器芯片组成的群组中的至少一种。
24.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述疏水性官能团选自由丁基、氰基丁基、辛基、苯基和联苯组成的群组中的至少一种。
25.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述样品是选自由哺乳动物细胞培养物、细菌细胞培养物、酵母培养物、组织提取物、癌组织、血清、血浆、唾液、泪液、鼻粘液、汗液、尿液、粪便、脑脊液、腹水、羊水、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、精液、牛奶、灰尘、淡水、海水、土壤和发酵食品组成的群组中的至少一种。
26.如权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括在将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相的步骤(b)之前，对所述含有细胞外囊泡的样品进行预处理的步骤。
27.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述预处理的步骤为实施选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、沉淀和双液相体系中的一个技术。
28.如权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括对从步骤(c)收集的样品级分中的细胞外囊泡进行后处理的步骤。
29.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述后处理的步骤为实施选自离心、超离心、过滤、超滤、透析、脱盐柱层析、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、沉淀和双液相体系中的一个技术。
30.利用权利要求17至29中任一项所述的方法分离的细胞外囊泡。
31.一种从含有细胞外囊泡的样品中除去疏水相互作用强度大于细胞外囊泡的物质的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将疏水性官能团固定在固定相上；
(b)将含有细胞外囊泡的样品上样至固定有疏水官能团的固定相；和
(c)从固定相中收集含有不与疏水性官能团结合的细胞外囊泡的样品级分。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，在步骤(b)之前，还包括用含有盐析离子的溶液洗涤固定有疏水性官能团的固定相的步骤。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述盐析离子的浓度为0M至10M。
34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：在将含有细胞外囊泡的样品上样至固定相的步骤(b)之前，将含有盐析离子的溶液添加到所述样品中，以改变所述样品中含有的盐析离子的种类或浓度。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述盐析离子的浓度为0M至10M。
36.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述疏水相互作用强度大于细胞外囊泡的物质是脂蛋白。
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