CN118103495A - 使用盐分级沉淀分离细胞外囊泡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用分级沉淀从生物样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法和试剂盒。根据该方法和试剂盒，可以快速分离，并且可以有效地从各种类型的生物样品中分离EV，而不管样品来源如何。与基于现有沉淀方法分离EV的方法不同，本发明可以通过洗涤容易地去除盐，因此具有能够以高产率分离高纯度EV的优点，并且可以应用于研究和诊断领域中的小规模EV分离和工业应用中的大规模EV分离两者。

Description

使用盐分级沉淀分离细胞外囊泡的方法
技术领域
本发明涉及一种从生物样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法，更具体地，涉及一种包括向生物样品中加入盐的步骤的分离细胞外囊泡的方法，以及用于分离细胞外囊泡的试剂盒。
背景技术
细胞外囊泡(EV)是由磷脂双分子层围成的细小颗粒，其能够转运分子，包括蛋白质、脂质和核酸，并由几乎所有类型的细胞(真核细胞和原核细胞两者)释放。它们参与多种生物物理过程，包括细胞间通信和信号转导。最初，它们被认为是细胞死亡或细胞凋亡过程中释放的细胞尘。然而，最近的研究报道了它们是细胞间信号传导的重要信使，并与癌细胞转移、免疫功能、组织再生等有关。此外，还已知它们用作与某些疾病诸如癌症的诊断相关的生物标志物。细胞外囊泡可以分为外泌体和微泡，外泌体大小为几十纳米，微泡大小为几百纳米。由于从复杂生物样品中分离细胞外囊泡可用于医学中的各种目的，诸如疾病诊断、治疗监测和通过基因或药物递送的靶向治疗，因此需要用于从生物流体中有效分离这些细胞外囊泡的技术。
现有若干种分离细胞外囊泡的方法。所使用的最广泛的方法是超速离心(UC)，但是这种方法需要昂贵的设备和长时间的处理，并且产量低。因此，已经开发了基于细胞外囊泡的物理化学性质的其他分离方法和试剂盒。例如，若干种基于聚合物(聚乙二醇，体积排除聚合物诸如聚乙二醇)的试剂已经被开发并商业化以用于从各种生物样品中分离细胞外囊泡(US 9,005,888B、US 9,671,321 B以及US2020/0179827 A)。然而，缺点是分离后残留在细胞外囊泡样品中的聚合物试剂可能干扰后续步骤中进行的各种分析反应。
此外，基于细胞外囊泡的表面生物化学特性的基于亲和力的分离方法也已得到发展(肝素：US 9,829,483 B；Balaj et al.,Sci Rep.2015；5:10266；SiC：US2019/0078078A；Tim4：Nakai et al.,Sci Rep.2016；6:33935；mag capture；Qiagen；Tim4,Nakai etal.,Sci Rep.2016；mag capture，Ghosh et al.,PLoS One,2014)。这些方法具有局限性，诸如具有表面亲和性质的分子与细胞外囊泡一起被分离的事实，对细胞外囊泡特异的某些抗体被需要的事实，以及细胞外囊泡的分离产量不可再现的事实。
作为使用盐来分离细胞外囊泡的方法，已经尝试通过使用0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.75)对EV表面上的磷脂酰丝氨酸进行电荷中和来沉淀细胞外囊泡(J ImmunolMethods.2014,407,120-6,US 9,835,626 B)。在这项研究中，在低pH下获得了更高产量的细胞外囊泡，这种pH依赖性实际上对于从中性生物样品中分离细胞外囊泡的过程来说并不理想。在对从血浆和尿液样品中分离细胞外囊泡的效率进行比较的研究中也发现了这一点(Ana Gamez-Valero et al.,Front.Immunol.,2015；6:6)，并且与其他测试方法相比，使用乙酸钠的沉淀方法具有明显较低的细胞外囊泡回收率。因此，非常需要开发一种更好的方法来有效地从生物样品中分离细胞外囊泡。
因此，本发明人进行了大量的努力来开发一种快速、有效和用户友好的方法，该方法可用于从生物样品中分离EV，而无需考虑样品体积、类型或样品来源，该方法是可扩展的，并且能够以高产率来分离EV。结果，本发明人发现使用盐诸如硫酸铵(AS)的细胞外囊泡分离方法是一种用户友好的细胞外囊泡分离方法，其能够从各种生物样品诸如血浆、血清、尿液、营养培养基等中快速且高产率地分离细胞外囊泡，而无需考虑样品体积、类型、来源等，并且，特别地，已经发现，当使用基于添加浓度逐渐增加的盐的多步盐沉淀方法时，能够通过沉淀杂质而高效地去除各种蛋白质杂质，从而完成了本发明。
在该背景技术部分中公开的信息仅仅是为了增强对本发明的背景的理解而提供的，因此它可能不包括形成对本领域技术人员来说已经显而易见的现有技术的信息。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种从生物样品诸如生物流体样品或生物组织样品中有效分离细胞外囊泡(EV)的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于分离细胞外囊泡(EV)的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供了一种从生物流体样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法，该方法包括：(a)向生物流体样品中加入盐至范围为0.1M至饱和浓度的浓度；(b)从已经加入盐的样品中分离出聚集或沉淀的细胞外囊泡级分和上清液；以及(c)通过将步骤(b)中所分离出的细胞外囊泡级分脱盐来分离细胞外囊泡。
本发明还提供了一种从生物组织样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法，该方法包括：(a)裂解或研磨并澄清生物组织样品；(b)向经澄清的样品中加入盐至范围为0.1M至饱和浓度的浓度；(c)从已经加入盐的样品中分离出聚集或沉淀的细胞外囊泡级分和上清液；以及(d)通过将步骤(c)中分离出的细胞外囊泡级分脱盐来分离细胞外囊泡。
本发明还提供了用于分离细胞外囊泡(EV)的试剂盒，其包括盐和缓冲液。
附图说明
图1是示出用于从生物流体中分离细胞外囊泡(EV)的多步盐分级沉淀(SP)的示意图。
图2是示出通过六步SP从血浆中分离EV的示意图。
图3描绘了示出通过六步SP从血浆中分离的级分的总蛋白质含量和EV含量的分析结果的图表。图3A示出了总蛋白质含量的比较(BCA分析)；图3B示出了EV回收率的比较；以及图3C示出了EV标志物CD9-CD81(膜表面)和Alix(内部)的ELISA结果。可以看出，在F3和F4级分中EV含量最高。
图4描绘了示出白蛋白和脂蛋白的ELISA结果的图表，白蛋白和脂蛋白是存在于通过六步SP从血浆中分离出的级分中的蛋白质杂质。图4A示出了白蛋白；图4B示出了Apo-AI；图4C示出了Apo-B；以及图4D示出了Apo-E。可以看出，F5和F6级分中存在的杂质蛋白质的量最大。
图5描绘了示出在通过三步SP形成的级分中EV标志物(CD9-CD81(膜表面)和Alix(内部))的比较ELISA结果的图表，并且示出了使用相同浓度的固体AS(图5A)和液体AS(图5B)的比较结果。
图6描绘了示出使用0.4mL血浆(图6A)和4mL血浆(图6B)通过三步SP形成的级分中EV标志物(CD9-CD81和Alix)的ELISA结果的图表。可以看出，SP是可扩展的，并且可用于小样品和大样品两者。
图7示出了通过两步SP从新鲜或冻融的血浆或血清中分离的EV的特征。图7A示出了总蛋白质定量的结果(BCA)；图7B示出了EV回收率；图7C示出了EV标志物的ELISA结果；以及图7D示出了NTA分析的结果。
图8示出了通过两步SP从血浆中分离的EV和使用其他分离试剂盒诸如ExoQuick和exoEasy分离的EV的产率和总蛋白质含量的分析结果。具体而言，图8描绘了示出通过BCA对总蛋白质定量(图8A)和EV回收率百分比(图8B)方面分析EV的结果的图表。结果表明，与其他方法分离的EV相比，SP分离的EV具有更高的EV产率和更低的蛋白质杂质含量。
图9描绘了示出通过两步SP从血浆中分离的EV和使用其他分离试剂盒诸如ExoQuick和exoEasy分离的EV的NTA分析结果的图表，并示出了通过每种方法分离的EV的浓度(图9A)和大小分布(图9B)。
图10示出了通过SP、ExoQuick试剂盒和exoEasy试剂盒分离的EV的透射电子显微镜(TEM)图像。
图11描绘了通过两步SP从掺有LNCaP来源的EV的猪血浆中分离的EV的总蛋白质定量和ELISA分析的结果。图11A示出了总蛋白质定量的结果，并且图11B示出了EV标志物的ELISA的结果。
图12是示出通过单步SP从生物流体中分离EV的示意图。
图13示出了用于确定从具有各种胎牛血清(FBS)浓度的LNCaP营养培养基中分离EV的最佳硫酸铵(AS)浓度的CD9/CD81夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果。图13A示出了使用无血清的高级RPMI培养基(advanced RPMI medium)获得的结果；图13B示出了使用具有5％ FBS的RPMI培养基获得的结果；图13C示出了使用具有5％无外泌体(EF)-FBS的RPMI培养基获得的结果；以及图13D示出了使用具有0.1％无外泌体-FBS的高级RPMI培养基获得的结果。
图14描绘了示出通过盐沉淀(SP)从具有各种FBS浓度的LNCaP营养培养基中分离的EV的分析结果的图表。图14A示出了总蛋白质定量的结果，并且图14B是示出了EV回收率的结果。
图15描绘了示出通过盐沉淀(SP)从LNCaP营养培养基中分离的EV的NTA分析结果的图表。具体而言，图15示出了从无血清的营养培养基(图15B)和含有5％无外泌体(EF)-FBS的营养培养基(图15C)获得的EV的浓度(图15A)和大小分布(图15B和图15C)。
图16示出了通过SP从LNCaP营养培养基中分离的EV的TEM图像。图16A示出了使用无血清营养培养基获得的结果，并且图16B示出了使用含有5％ EF-FBS的营养培养基获得的结果。
图17示出了比较分别使用硫酸铵和乙酸钠通过沉淀方法分离的EV的图表。图17A示出了通过总蛋白质定量对EV的分析；图17B示出了EV回收率；并且图17C示出了NTA分析的结果。
图18示出了通过SP从尿液中分离的EV的特征。图18A是示出总蛋白质定量结果的图表，并且图18B是示出EV回收率结果的图表。
图19示出了通过SP从同一供体的血浆和血清中分离的EV的特征。图19A是示出总蛋白质定量结果的图表，并且图18B是示出EV回收率结果的图表。
图20示出了使用通过SP和UC从MDA-MB231营养培养基中分离的EV的划痕伤口愈合测定的结果。图20A示出了在用EV处理0和20小时时拍摄的伤口闭合的代表性图像，并且图20B描绘了示出在5μg/mL EV(i)、10μg/mL EV(ii)和(iii)20μg/mL EV下的伤口闭合百分比对EV剂量的图表。
图21描述了标准EV标志物(图21A)和癌症EV标志物(图21B)的PCR分析结果，并示出了在未经蛋白酶-K处理(i)和经蛋白酶-K处理(ii)时SP和其他EV分离方法(超速离心(UC)、Qiagen和Norgen)之间的比较结果。
图22示出了使用具有不同步骤的SP方法从血浆中分离的EV的回收率和纯度的比较结果。
图23示出了霍夫迈斯特系列(Hofmeister series)。该系列左侧上的离子稳定蛋白质，以及由阳离子和阴离子(NH4 +、K+、Na+、Mg2+、SO4 2-、HPO4 2-、CH3COO-、柠檬酸根-、Cl-)的组合组成的盐(在该系列左侧上以红色示出)用于EV沉淀。
图24描绘了示出使用各种盐从前列腺癌细胞(LNCaP，图24A)和乳腺癌细胞(MDA-MB231，图24B)的条件培养基中分离的EV的回收率(％)的图表。
具体实施方式
除非另有定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。一般来说，本说明书中使用的术语是公知的，并且在本领域中普遍使用。
在本说明书中，盐沉淀、分级盐沉淀和盐分级沉淀都具有相同的含义，并缩写为“SP”。盐沉淀是指通过向生物样品中加入盐来分离出聚集或沉淀的级分和上清液的方法。
在本说明书中，“细胞外囊泡(EV)”是指可以包含核酸、蛋白质或其他生物分子的小分泌囊泡(通常约30至800nm)，并且包括外泌体和微泡。它们可以作为细胞信使而将生物分子运送到活生物体或生物系统中的各种位置。
如本文所用，术语“生物样品”包括生物流体样品和生物组织样品。
在本发明的一个实例中，发现包括盐添加和脱盐步骤的细胞外囊泡分离方法比常规技术更加简单，并具有非常高的分离效率和纯度，并且可以在短时间内非常有效地分离细胞外囊泡，即使不包括超速离心步骤。
特别地，发现了尽管常规的基于沉淀的细胞外囊泡分离方法的缺点在于，为细胞外囊泡分离而添加的添加剂与细胞外囊泡混合存在，而根据本发明的盐具有在脱盐的洗涤过程中容易去除的优点，这使得可以以更高的纯度分离细胞外囊泡，并且可以应用于各种生物样品诸如血浆、血清、尿液、唾液、组织和细胞营养培养基，并且也可以适用于制备用于工业应用的大体积细胞外囊泡样品和制备诊断和治疗应用所需的小体积细胞外囊泡样品。
因此，在一个方面，本发明涉及一种从生物流体样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法，该方法包括：(a)向生物流体样品中加入盐至范围为0.1M至饱和浓度的浓度；(b)从已经加入盐的样品中分离出聚集或沉淀的细胞外囊泡级分和上清液；以及(c)通过将步骤(b)中所分离出的细胞外囊泡级分脱盐来分离细胞外囊泡。
在本发明中，术语“饱和浓度”是指盐加入到样品中达到溶解平衡状态时的浓度。对于本领域的技术人员来说，显而易见的是，饱和浓度可以根据盐的类型、样品的类型、温度或压力而变化。
在本发明中，例如，当生物样品处于类水状态时，在其中的硫酸铵的饱和浓度在25℃下可以是4.1M，并且在其中的磷酸铵的饱和浓度在25℃下可以是3.9M，在其中的磷酸钾的饱和浓度在25℃下可以是0.8M，在其中的硫酸钠的饱和浓度在25℃下可以是2.0M，并且柠檬酸三钠的饱和浓度在25℃下可以是3.6M，但不限于此。
在本发明中，所加入的盐在生物流体样品中的浓度可以为0.1M至饱和浓度的范围，优选地0.1M至4M，更优选地1M至3M，甚至更优选地1.4M至2.25M，但不限于此。
在本发明中，步骤(a)可以通过加入1至15次盐至范围为0.1M至饱和浓度的最终浓度来进行。
也就是说，根据本发明的细胞外囊泡分离方法在盐添加步骤为一次时对应于单步盐沉淀方法，并且在盐添加步骤进行一次以上时对应于多步盐沉淀方法。
在本发明中，在多步盐沉淀方法的情况下，加入盐的步骤可以重复两次或更多次，优选地2至15次，更优选地2至10次，最优选地2至6次，但不限于此。当添加盐的步骤重复时，添加的盐的类型可以与前一步骤中所添加的盐的类型相同或不同。此外，每个盐添加步骤中的盐浓度可以根据重复次数而变化。然而，随着盐添加步骤的重复，盐添加后样品的盐浓度可能增加。多步盐沉淀可以产生一种或多种独立的沉淀，每种沉淀都可以经单独地处理以产生相同或不同的细胞外囊泡。
在本发明的一个实例中，用于EV分离的最佳盐浓度对于单步盐沉淀方法是1.75至2M，对于多步盐沉淀方法中的两步盐沉淀是1.8至2M，对于三步盐沉淀是1.5至2.25M，以及对于六步盐沉淀是1.4至1.9M。
因此，在本发明中，步骤(c)可以包括从已经加入有1.4M至2.25M的浓度的盐的样品中分离出的细胞外囊泡级分中分离细胞外囊泡，但不限于此。
在本发明的一个实例中，可以通过向生物样品中加入盐来获得含有沉淀物和上清液的溶液。该溶液被分离成第一级分(本文定义为级分-1(F1))和第一上清液。在多步盐沉淀的情况下，将盐加入到第一上清液中进行第二次沉淀，并且从所得溶液中分离出第二级分(级分-2(F2))和第二上清液。因为盐被加入到第一上清液中，所以第二溶液的盐浓度将高于第一溶液的盐浓度。重复加入盐并分离出沉淀物和上清液的过程，直到所有级分都被分离出来。盐沉淀也可以在重悬的沉淀物上进行。
在本发明中，盐可以包括亲液剂(kosmotrope)(亲液离子(kosmotropic ion))或离液剂(chaotrope)(离液离子(chaotropic ion))。亲液剂是指稳定蛋白质结构的盐，而离液剂是指使蛋白质结构不稳定的盐(Wiggins,P.M.(2001).Cellular and MolecularBiology,47,735-744)。
在本发明中，盐可以含有多价阴离子和一价阳离子。
如本文所用，术语“多价阴离子”是指化合价为1或更高的阴离子，而术语“一价阳离子”是指化合价为1的阳离子。
具体地，多价阴离子可以是硫酸根、磷酸根或柠檬酸根，而一价阳离子可以是铵离子、钾离子或钠离子，但不限于此。
在本发明的一种实施方式中，盐可以是硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、硫酸钠或柠檬酸三钠，但不限于此。
在本发明中，盐可以是固体或液体形式。在本发明中，液体形式的盐可以具有与术语“盐溶液”相同的含义。
在本发明中，盐可以是水溶性盐或非水溶性盐，优选水溶性盐，但不限于此。也可以将非水溶性盐(例如，柠檬酸钙和/或其他在水中溶解度低的盐)与能够提高不溶性盐的溶解度的螯合剂(例如，EDTA)一起使用。当样品中细胞外囊泡的浓度低时，高浓度的盐是有用的。
在本发明的一种实施方式中，通常用于生物样品的多种缓冲液可以用于处理已经加入盐的细胞外囊泡样品，并且包括磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和TRIS缓冲液。缓冲液的pH值可以是与样品相容的任何pH值，并且为从4至10，但不限于此。
在本发明中，步骤(b)可以通过沉降、过滤或离心来进行。
在本发明中，离心可以在2,000xg至15,000xg下进行5至30分钟，但不限于此。
在本发明中，可以在-5至40℃的温度下处理生物流体样品，但不限于此，并且可以无限制地应用任何温度条件，只要它们不导致细胞外囊泡的破裂。
在本发明的一个实例中，将血浆保持于室温(RT)下，并在室温下向其中加入盐溶液以获得第一沉淀物和上清液。通过在室温下过滤或在室温或4℃下以>10,000xg离心来分离出第一沉淀物和上清液。
在本发明中，脱盐可以使用过滤、离心、透析、反渗透或脱盐柱来进行，但不限于此。
在本发明的一种实施方式中，当向生物样品中加入盐并进行沉降、过滤或离心时，样品被分离成聚集的或沉淀的级分和上清液。由于包含在沉淀级分中的细胞外囊泡是通过根据本发明的方法要分离的最终目标，因此它们被称为聚集的或沉淀的细胞外囊泡级分。
可以使用离心、过滤或其他方法来分离出沉淀的细胞外囊泡。对于小规模来说，离心是优选的，而对于大规模来说，过滤是优选的。当使用离心时，沉淀物形成团块(pellet)，可以通过吸液从团块中去除上清液。当使用过滤时，沉淀物在滤纸上形成滤饼，并且滤液即为上清液。
可以将沉淀物溶解在缓冲液中，并进行额外的处理，包括脱盐、进一步分馏、层析等或其组合来纯化分离的细胞外囊泡。该方法可以进一步包括使用配备有孔径大小为10至100nm的过滤器或MWCO为100kD至300kD的基于聚合物的过滤器的超滤仪器来去除盐、小蛋白和脂蛋白的离心切向流过滤或超滤步骤。
离心过滤和/或超滤能够去除盐、低分子量物质和/或加工剂。离心过滤或超滤可以在多个盐沉淀步骤和/或多个层析步骤之间进行，和/或在一个盐沉淀步骤和一个层析步骤之间进行。
在本发明中，超滤步骤、亲和层析步骤或密度梯度超速离心步骤可以进一步在细胞外囊泡级分上进行，但不限于此。
在本发明中，尽管不是必需的，但是如果在盐沉淀之前澄清生物流体样品以从样品中去除任何碎片，则可以获得高纯度的细胞外囊泡。澄清方法包括但不限于离心、超速离心、过滤或超滤。
在本发明中，为了获得高纯度的细胞外囊泡，通过盐沉淀分离的细胞外囊泡可以基于它们的大小、密度或暴露在细胞外囊泡表面上的蛋白质而被进一步纯化。
可以使用常规方法(诸如使用或不使用密度梯度的层析法或超速离心)进一步分级细胞外囊泡。从使用盐获得的级分中纯化细胞外囊泡可能需要包括层析在内的纯化步骤，或者可能需要除层析以外的纯化步骤。细胞外囊泡的亚群也可以通过利用细胞外囊泡的其他特性来分离，诸如表面标志物的存在。可用于细胞外囊泡分级的表面标志物包括但不限于肿瘤标志物和MHC II类标志物。与细胞外囊泡相关的其他表面标志物包括CD9、CD81、CD63和CD82(Thery et al.Nat.Rev.Immunol.2(2002)569-579；Valadi etal.Nat.Cell.Biol.9(2007)654-659)。
为了获得纯的细胞外囊泡，可以进行层析，包括但不限于尺寸排阻、阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用或亲和层析。可以进行单个层析过程(例如，亲和层析或尺寸排阻层析)。可以依次进行一系列相同的层析过程或不同的层析过程(例如，依次进行两次离子交换层析运行，或者在进行亲和层析运行后进行尺寸排阻层析运行)。可以进行一系列过程(例如，盐沉淀，随后是亲和层析运行，接着是疏水相互作用层析运行)。可以依次进行一系列不同的层析过程(例如，亲和层析运行，随后是离子交换层析运行)，并且可以进行具有中间过程的一系列不同的层析过程(例如，亲和层析运行，随后是盐沉淀，接着是疏水相互作用层析运行)。可选地，可以进行这些方案的任意组合。
使用表面分子获得纯细胞外囊泡的方法的实例包括其中使用抗体包被的磁性颗粒分离在细胞外囊泡表面上具有四次穿膜蛋白标志物(CD9、CD63和CD81)的细胞外囊泡的方法。例如，Dynabeads(直径为1至4.5μm的超顺磁珠)可以与抗人CD9抗体、抗人CD63抗体和抗人CD81抗体的混合物(cocktail)缀合，或者直接或经由二级接头(例如，抗小鼠IgG)缀合到珠子表面。可以将抗体包被的Dynabeads加入到用盐制备的细胞外囊泡样品中，并在2至8℃下或室温下温育0分钟至过夜。然后可以使用磁铁收集结合有细胞外囊泡的Dynabeads。然后可以将分离的与珠结合的细胞外囊泡重悬在合适的缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中，并用于下游分析(逆转录实时聚合酶链反应(RT-qPCR)、测序、蛋白质印迹、流式细胞术等)。类似的方案可用于抗体或其他特异性配体可用的任何其他表面标志物。也可以使用间接结合方法，诸如那些使用生物素-抗生物素蛋白的方法。
一旦从样品中分离细胞外囊泡，就可以提取细胞外囊泡的内容物用于研究和表征。可以从细胞外囊泡提取的生物材料包括蛋白质、肽、RNA、DNA、脂质等。例如，miRNeasy试剂盒(217004，Qiagen)可用于从细胞外囊泡回收DNA和RNA。此外，miRNeasy试剂盒(217004，Qiagen)可用于从细胞外囊泡回收总RNA。同样地，mirVanaTM PARIS试剂盒(AM1556，生命科技公司(Life Technologies))可用于从细胞外囊泡中回收天然蛋白质和RNA种类，包括小RNA诸如miRNA、snRNA和snoRNA。
如本文所用，术语“生物流体”指从生物体(包括原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物、鱼类、昆虫、植物以及动物)分离或衍生的任何流体，包括但不限于血清、血浆、全血、尿液、唾液、母乳、泪液、汗液、关节液、脑脊液、精液、阴道液、痰、胸膜液、淋巴液、腹水和羊水。支气管灌洗液和取自经培养细胞的培养基(例如，细胞培养上清液、条件培养基、细胞培养基或细胞营养培养基)也可以是生物流体。
在本发明中，细胞外囊泡可以通过盐沉淀法直接从生物样品中分离。或者，可以通过盐沉淀法从含有细胞外囊泡的溶液中分离或富集细胞外囊泡，所述含有细胞外囊泡的溶液通过其他方法制备，诸如超速离心、密度梯度超速离心、尺寸排阻层析(SEC)、切向流过滤(TFF)或沉淀。
在另一方面，本发明涉及一种从生物组织样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法，该方法包括：(a)裂解或研磨并澄清生物组织样品；(b)向经澄清的样品中加入盐至范围为0.1M至饱和浓度的浓度；(c)从已经加入盐的样品中分离出聚集或沉淀的细胞外囊泡级分和上清液；以及(d)通过将步骤(c)中分离出的细胞外囊泡级分脱盐来分离细胞外囊泡。
在本发明中，所加入的盐在样品中的浓度可以为0.1M至饱和浓度的范围，优选地0.1M至4M，更优选地1M至3M，甚至更优选地1.4M至2.25M，但不限于此。
在本发明中，步骤(b)可以通过加入1至15次盐至范围为0.1M至饱和浓度的最终浓度来进行。
在本发明中，步骤(d)可以包括从已经加入有1.4M至2.25M的浓度的盐的样品中分离出的细胞外囊泡级分中分离细胞外囊泡，但不限于此。
在本发明中，盐可以含有多价阴离子和一价阳离子。
具体地，多价阴离子可以是硫酸根、磷酸根或柠檬酸根，而一价阳离子可以是铵离子、钾离子或钠离子，但不限于此。在本发明的一种实施方式中，盐可以是硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、硫酸钠或柠檬酸三钠，但不限于此。
盐可以是固体或液体形式。
在本发明中，步骤(c)可以通过沉降、过滤或离心来进行。
在本发明中，脱盐可以使用过滤、离心、透析、反渗透或脱盐柱进行。
在本发明中，超滤步骤、亲和层析步骤或密度梯度超速离心步骤可以进一步在细胞外囊泡级分上进行。
在本发明中，从生物组织样品中分离细胞外囊泡的方法包括与从生物流体样品中分离细胞外囊泡的方法那些步骤相同的步骤，除了样品是生物组织而不是生物流体，因此从生物组织样品中分离细胞外囊泡的方法进一步包括溶解或研磨并澄清生物组织样品以及温育样品的步骤。在从生物组织样品中分离细胞外囊泡的方法中，将省略与从生物流体样品中分离细胞外囊泡的方法重叠的内容的描述，诸如盐的类型、盐浓度和盐添加步骤的重复。
如本文所用，术语“生物组织”是指来自原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物、鱼类、昆虫、植物或动物的细胞的集合。此外，经培养的细胞可以是生物组织。生物组织样品的非限制性实例包括手术样品、活检样品、组织、粪便、植物组织、昆虫组织和经培养的细胞。
当从组织来源分离细胞外囊泡时，该方法可以进一步包括以下步骤：匀浆组织以获得单细胞悬浮液，随后裂解或研磨细胞以释放细胞外囊泡。在这种情况下，重要的是选择不会导致细胞外囊泡破裂的匀浆和裂解/研磨程序。
在本发明中，可以在任何时间范围内进行温育已经加入有盐的样品，通常为1秒至24小时，更通常为5分钟至12小时。温育时间尤其受盐浓度、温育温度、细胞外囊泡和样品其他成分的影响。
在又一方面，本发明涉及一种用于分离细胞外囊泡(EV)的试剂盒，其包括盐和缓冲液。
在本发明中，盐可以含有多价阴离子和一价阳离子。具体地，多价阴离子可以是硫酸根、磷酸根或柠檬酸根，而一价阳离子可以是铵离子、钾离子或钠离子，但不限于此。在本发明的一种实施方式中，盐可以是硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、硫酸钠或柠檬酸三钠，但不限于此。
盐可以是固体或液体形式，但不限于此。
在本发明中，试剂盒可用于从生物流体或生物组织中分离细胞外囊泡。因此，将省略与上述关于分离细胞外囊泡的方法的内容重叠的内容的描述。
在本发明中，试剂盒可以进一步包括，但不限于：(i)含有抗体或配体的容器，所述抗体或配体与暴露于细胞外囊泡表面上的表面标志物或与细胞外囊泡内存在的蛋白质结合；(ii)至少一种固体载体，其直接或间接与暴露于细胞外囊泡表面上的表面标志物或与细胞外囊泡内存在的蛋白质结合；和/或(iii)含有至少一种盐和至少一种缓冲液的容器，用于进行细胞外囊泡的密度梯度离心。
在本发明中，表面标志物可以选自由以下组成的组：HLA DP单倍型、HLA DQ单倍型、HLA DR单倍型、CD9、CD81、CD63和CD82，但不限于此。
在本发明中，固体载体可以是树脂或珠子，但不限于此。
在本发明中，珠子可以是二氧化硅、磁性颗粒、聚苯乙烯或琼脂糖。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，对于本领域技术人员来说，显然本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。
实施例1：材料和方法
实施例1-1：盐储备溶液的制备
例如，100mL的在DI水中的含有2M硫酸铵(AS)的储备溶液可以通过在50mL的DI水中溶解30.9g的AS来制备。将pH调节至期望值后，可使用额外的DI水将溶液体积调至100mL。为了制备100mL的在DI水中的含有4M AS的储备溶液，将75g的AS加入到40mL的DI水中，调节溶液的pH，然后加入水使最终体积为100mL。具有或不具有PBS或其他缓冲液或NaCl的情况下，含有1至4M AS的溶液可以用类似的方式制备。AS储备溶液可以在室温下储存很长时间。
实施例1-2：生物流体样品的制备
将样品从储存库中取出并置于冰上。如果生物流体处于冷冻状态，可以在室温下或微温水中缓慢解冻，直到样品完全变成液体。需要使用之前可以将样品保存在冰上。样品可以以2,000xg离心30分钟以去除细胞碎片。接下来，可以将含有无细胞/无碎片样品的上清液转移到新的容器中，并置于冰上直至沉淀。对于细胞外囊泡沉淀，可将100μL至1mL(或其他优选体积)的无细胞样品转移至新试管中，并与所需体积的盐沉淀试剂混合。
例如，为了实现1M最终盐浓度，可以将33μL的4M储备液加入到100μL的血清中。然后，可以通过涡旋或上下吸取来充分混合血清/试剂混合物，直到形成均匀的溶液(溶液可能有浑浊的外观)。然后可以将样品在室温下温育5分钟至2小时。温育后，样品可在室温或4℃下以2,000xg至10,000xg离心5至30分钟。将上清液吸出并弃去。细胞外囊泡将包含在试管底部的团块(pellet)中。可以将团块重悬在适当体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，例如，对于100μL血清输入来说为50μL。团块可能难以重悬，在这种情况下，可以使用移液管尖端将团块完全重新悬浮在溶液中。或者，可以将团块在37℃下温育30分钟，然后涡旋。一旦团块已经重悬，可以将其在4℃(短期)或-20℃(长期)下进行储存。具有或不具有PBS缓冲液或NaCl的情况下，含有终浓度为1至4M的AS的溶液(当与血清样品混合时)都可以以类似的方式使用，其中血清输入通常在几微升至几毫升的范围内。
实施例1-3：细胞培养以及培养上清液的制备
将购自ATCC的LNCaP细胞培养在以下中：(1)补充有1％抗生素/抗真菌剂的Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI，Gibco，赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific))，(2)补充有5％胎牛血清(FBS)和1％抗生素/抗真菌剂的RPMI，(3)补充有5％无外泌体(Exo-Free)FBS(ef-FBS，Systems Biosciences Inc.，CA，USA)和1％抗生素/抗真菌剂的RPMI，或(4)补充有0.1％ef-FBS和1％抗生素/抗真菌剂的高级RPMI(Gibco，赛默飞世尔科技)。将细胞在37℃和5％ CO2下培养。培养48小时后收集细胞营养培养基，在4℃下以300g离心10分钟以去除死细胞，然后以2,000g离心15分钟以完全去除死细胞和细胞碎片。将上清液储存在-80℃下直到使用。
实施例1-4：CD9-CD81夹心ELISA
所有样品都是为了在所有比较分析中保持相同的输入体积而制备。用50μL的包被抗体(在PBS缓冲液中的10μg/mL抗CD9；MEM 61；Abcam，剑桥，UK)包被96孔板(康宁公司(Corning Inc.)，NY，USA，产品目录号3590)，并在4℃温育过夜。第二天早上，用1％牛血清白蛋白(BSA)-PBS缓冲液在37℃下封闭平板1小时。在将平板用0.1％ BSA-PBS缓冲液(洗涤缓冲液)洗涤后，将平板与在PBS缓冲液(50μL)中的细胞外囊泡溶液在室温下进一步温育2小时。去除溶液后，用洗涤缓冲液洗涤平板两次，然后与在PBS缓冲液(50μL；500ng/mL)中的生物素缀和的二级抗体(抗CD81；寿命生物科学公司(LifeSpan Biosciences,Inc.)，西雅图，WA；USA)一起在室温下温育1小时。在将平板用洗涤缓冲液洗涤三次后，将平板与PBS缓冲液(50μL；1:500)中的HRP-缀合的链霉亲和素溶液一起在室温下温育30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。然后，加入TMB溶液(50μL)，将平板在室温下温育15分钟，然后向每个孔中加入50μL的终止液。使用平板读数分光光度计(TECAN，莫里斯维尔(Morrisville)，NC，USA)在450nm处测量溶液吸光度。使用初始样品制备CD9-CD81 ELISA的标准曲线，并计算相对于初始样品的EV回收率(％)。
实施例1-5：白蛋白和脂蛋白标志物的夹心ELISA
根据制造商的说明，将从R&D系统公司获得的商业duo set，人血清白蛋白DuoSetELISA(DY1455)和人载脂蛋白A-I/ApoA1 DuoSet(DY3664-05)分别用于白蛋白和apo AI分析。
实施例1-6：用于ALIX检测的直接ELISA
使用含1％蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液在冰上裂解细胞外囊泡(EV)30分钟，并且每隔10分钟进行轻轻涡旋。用50μL体积的EV裂解物(用PBS以1:50稀释)包被96孔板(康宁公司(Corning Inc.)，NY，USA，产品目录号3590)的每个孔，并在4℃下温育过夜。第二天早上，用1％牛血清白蛋白(BSA)-PBS缓冲液在室温下封闭平板1小时。在将平板用0.1％ BSA-PBS缓冲液(洗涤缓冲液)洗涤后，将在PBS缓冲液(50μL；500ng/mL)中的抗ALIX抗体(Abcam，剑桥，UK)加载到平板上并在室温下温育1小时。在将平板用洗涤缓冲液洗涤三次后，将平板与PBS缓冲液(50μL)中的HRP-缀合的检测抗体溶液一起在室温下温育20分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。加入TMB溶液(50μL)，并且将平板再次在室温下温育15分钟。然后，向每个孔中加入50μL的终止液。使用平板读数分光光度计在450nm处测量溶液吸光度。
实施例1-7：使用NanoSight NS500仪器对细胞外囊泡进行定量和大小测定
根据制造商的方案，使用NS500仪器(NanoSight，UK)对通过盐沉淀从流体样品中纯化的细胞外囊泡进行定量和大小测定。图像分析NTA软件允许用户自动跟踪单个纳米颗粒并测量单个纳米颗粒的大小。将分离的细胞外囊泡样品涡旋，并用通过200-nm过滤器过滤的PBS稀释，以获得NTA系统推荐的25至100个颗粒/帧。所有测量都在相同的设置下进行，以确保结果一致。每个样品分析三次，并绘制平均值。
实施例1-8：透射电子显微镜(TEM)
在室温下，用0.1％聚-L-赖氨酸(西格玛-奥尔德里奇(Sigma-Aldrich))包被300目方华膜(formvar)和碳包被的铜载网(电子显微镜科学(Electron MicroscopyScience)，PA)30分钟，然后与细胞外囊泡样品(用PBS缓冲液适当稀释的细胞)一起在室温下温育30分钟。接下来，用4％多聚甲醛溶液在室温下固定载网上的细胞外囊泡10分钟，然后依次用PBS和DI水洗涤。载网用无铀染料染色，并用JEM-2100透射电子显微镜(JEOL，日本)成像。
实施例1-9：RNA提取和逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)
为了分析基因表达，使用miRNeasy试剂盒(Qiagen)从通过各种方法从掺有LNEV的血浆中分离的EV(从LNCaP营养培养基中获得的EV)中提取总RNA。使用SuperScript VILOcDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科技)制备cDNA。实时PCR通过使用gene-expression mastermix试剂盒(赛默飞世尔科技)和Taqman探针QuantStudio 6实时PCR仪器(赛默飞世尔科技)进行，使用以下条件：50℃进行2min，95℃进行10min，然后是40个循环，每个循环由95℃进行15sec和60℃进行30sec组成。所有样品以一式三份进行分析，并且数据以平均值±标准差(SD)表示。
实施例2：多步盐分级沉淀方法分离细胞外囊泡(EV)
图1示出了从生物流体样品中分离细胞外囊泡的多步盐分离和沉淀方法的示意图。
在该实施例中，将1mL的新鲜冷冻血浆用作生物流体样品。将血浆样品与增加量的硫酸铵(AS)一起温育，并收集F1至F6级分，如图2所示。分析每个级分以确定EV和蛋白质含量。多步盐分级沉淀(SP)方法包括以下步骤：
步骤(1)向生物流体中加入固体AS以产生第一沉淀物(级分-1，F1)，其中溶液的AS浓度为0.45M；步骤(2)通过在室温下以>10000xg离心分离出第一沉淀物以产生第一上清液；步骤(3)向第一上清液中加入AS以产生第二沉淀物(级分-2，F2)，其中溶液中AS的浓度为0.95M；以及步骤(4)分离出第二沉淀物以产生第二上清液，并重复加入AS的步骤，使得在F3、F4、F5和F6中AS的浓度分别为1.4、1.9、2.35和2.8M，并离心沉淀物直到收集到所有期望的级分。这些步骤的组合被称为“SP”。将沉淀物F1至F6重悬于缓冲液中，并使用离心过滤装置进行脱盐(图2)。
这些级分，连同最终上清液，通过二辛可宁酸测定(bicinchoninic acid assay)(BCA)进行总蛋白质定量分析。使用EV标准标志物和非EV标志物两者进行用于EV定性分析的酶联免疫吸附测定(ELISA)(图3)。脂蛋白、Apo B、Apo E和Apo AI的标志物在所有级分中以不同水平表达(图4)。
作为通过ELISA对EV和非EV标记物的级分含量进行评估的结果，大多数CD9-CD81阳性EV在F3和F4中被发现，并且大多数含ALIX的EV在F3中被发现(图3)。白蛋白的ELISA示出了，大多数白蛋白沉淀物存在于后面的级分F5和F6中。脂蛋白的标记物，Apo B、Apo E和Apo AI，在所有级分中表现出不同的水平，但在F5和F6中最高(图4)。
实施例3：三步盐分级沉淀方法从血浆中分离细胞外囊泡(EV)
通过收集在实施例2中描述的六步盐分级方法中的F3和F4中回收的EV作为一个级分，并且将级分的数量减少到三个以尽可能多地去除蛋白质杂质来进行实验。使用1mL的生物流体样品(新鲜冷冻血浆)用固体或液体AS进行SP。将血浆与液体AS或固体AS的饱和溶液混合，以确保所得溶液在F1、F2和F3中分别含有0.75、1.5和2.25M的AS。通过离心分离出沉淀物和上清液。加入AS的步骤和通过离心从上清液中分离出沉淀物的步骤持续进行，直到收集到三种沉淀物级分(F1至F3)和上清液。使用EV标志物通过ELISA分析EV含量。大多数CD9-CD81和ALIX阳性EV在固体和液体SP方法的F2和F3中被发现(图5)。因此，可以看出，可以在SP中使用固体或液体形式的AS，其在性能上没有任何差异。
实施例4：可扩展性评估
进行三步盐分级沉淀以从不同体积的血浆(特别是0.4mL和4mL的血浆)中分离EV。使用液体盐，并使用实施例3中描述的方法收集三种沉淀物级分和上清液。从两种样品中分离的EV的EV标志物ELISA的结果是相似的，并且在两种情况下在F2和F3中发现了大多数EV(图6)。这意味着，与只能应用于小体积样品的过滤或尺寸排阻层析方法不同，多步盐沉淀方法既可以应用于诊断目的的小规模，也可以应用于工业应用的大规模。
实施例5：两步盐分级沉淀方法从血浆样品中分离EV
为了使在实施例3中所示的三步盐分级沉淀方法中F2和F3中收集的EV能够被收集在一个级分中，通过两步SP将来自1mL的(1)新鲜血清、(2)冻融血清、(3)新鲜血浆和(4)冻融血浆中每一种的EV富集在一个级分(F2)中。血浆的主要成分包括纤维蛋白原、球蛋白和白蛋白。已知纤维蛋白原在0.85M AS时沉淀，已知球蛋白在约1.5M AS时沉淀，并且已知白蛋白在≥2.5M AS时沉淀。因此，在这种两步盐分级沉淀方法中，纤维蛋白原和白蛋白被选择性去除，并且大部分EV被收集在F2中。在第一步中，通过加入0.85至1.0M AS来去除纤维蛋白原，并在1.8至2M的AS浓度下收集EV，而白蛋白则保留在上清液中。血清和血浆样品之间没有显著差异。类似地，在从新鲜和冻融样品中分离的EV中没有观察到差异(图7)。通过BCA、ELISA和NTA分析沉淀物和上清液中EV含量。EV标志物在所有样品的F2中均显示为高。
实施例6：通过两步盐沉淀(SP)与其他市售方法回收细胞外囊泡(EV)的比较
通过两步SP从1mL的血浆中分离出EV。此外，使用ExoQuick血浆试剂盒(EQ；Systems Biosciences)从1mL的血浆中分离EV，并且使用exoEasy试剂盒(Qiagen)从1mL的血浆中分离EV。级分-2中的EV通过BCA、EV标志物的ELISA和通过NTA测定的颗粒数来表征。结果表明，SP方法分离了最大量的EV，其颗粒数浓度为9.25X 1011±8.46X 1010个颗粒/mL，并且当与表现出颗粒数浓度为6.7X 1011±1X 1010个颗粒/mL的EQ相比，表现出总蛋白质量相对较少且EV回收率(％)相似。ExoEasy表现出相对小的颗粒数(1.05X 1010±1.44X 109个颗粒)、最小的总蛋白质量和低EV回收率(％)(图8和图9)。
参考透射电子显微镜图像，似乎三种方法都显示出形态相似的囊泡，但是exoEasy试剂盒显示出比SP和EQ更小的颗粒大小(图10)。
实施例7：从猪血浆中分离细胞外囊泡(EV)
从1mL的含有LNCaP细胞衍生的EV的猪血浆中分离EV。使用两步盐分级沉淀，并通过BCA和LNCaP EV标志物的ELISA测定分析级分的EV含量(图11)。从盐沉淀的第一和第二级分中分离EV。这意味着盐沉淀方法可应用于从各种生物流体样品诸如人血或猪血中分离EV。
实施例8：用硫酸铵通过一步盐沉淀来分离EV
图12是说明通过一步盐沉淀分离的示意图，这是多步盐沉淀的最简单形式。
首先进行了一项实验，通过单步沉淀方法从下列在高级RPMI中的每一种中发现用于EV分离的最佳AS浓度：(1)无血清LNCaP营养培养基(LN-CM)，(2)含有5％ FBS的LN-CM，(3)含有5％ef-FBS的LN-CM，以及(4)含有0.1％ef-FBS的LN-CM。混合后，将AS的饱和溶液加入1mL的LN-CM中至最终浓度分别为1.5、1.75、2和2.5M。通过翻转试管5或6次来混合试管的内容物，并通过在10,000xg下离心10分钟来收集分离出的沉淀物。通过CD9-CD81夹心ELISA评估收集的EV(图13)。不管培养基中FBS的量，所有样品中的大多数EV在1.75至2M的最终浓度下被分离。此外，通过BCA、ELISA、NTA和TEM分析了在2M的AS浓度下分离的EV。由于FBS中缺乏污染蛋白质或其他颗粒，从无血清培养基中获得的EV具有最低的蛋白质量和总颗粒数。所有四种测试样品的EV回收率均为90％(图14至图16)。结果，可以看出，在使用1.75至2M的As浓度的一步盐分级沉淀方法的情况下，可以看出无论使用何种类型的培养基，大多数(90％或更多)的EV都存在于沉淀物中。
实施例9：通过硫酸铵和乙酸钠的EV回收率的比较
根据先前报道的方案(J.Immunol.Met.,2014,407,120)，使用硫酸铵和乙酸钠中的每一种从1mL的含有5％ef-FBS的LN-CM中分离EV。对于使用硫酸铵进行的EV分离，将LN-CM与最终AS浓度为1.8M的饱和AS溶液混合。通过BCA、EV标志物的ELISA以及通过NTA测定的颗粒数对两种方法中获得的EV进行表征。结果，与乙酸钠方法(其产生4.85X 109±5.7X 108个颗粒/mL，并且EV回收率为4％)相比，硫酸铵方法分离了较大量的EV，颗粒数浓度为2.8X1010±3.06X 108个颗粒/mL，并且EV回收率>95％(图17)。
实施例10：通过硫酸铵从尿液中分离EV
将饱和AS溶液加入到1mL的尿液中，使最终AS浓度为2M，通过单步盐分级沉淀方法分离EV。通过翻转来混合试管中的内容物，然后立即通过在10,000xg下离心10min来分离出沉淀物。沉淀物和上清液通过总蛋白质定量的BCA测定以及EV标志物的ELISA来表征。如图18所示，大多数(80％或更多)的EV在2M的As浓度下被回收。
实施例11：通过硫酸铵从血浆和血清中分离EV
将AS的饱和溶液加入到1mL的血浆和血清的每一种中，至最终AS浓度为2M。通过将试管倒置若干次来混合试管中的内容物，并通过在10,000xg下离心10分钟来收集沉淀物。沉淀物和上清液通过总蛋白质定量以及EV标志物的ELISA来表征。结果，发现在2M的AS浓度下，大多数EV与大量总蛋白质一起被回收(图19)。血浆和血清中的蛋白质可以根据它们的电荷、大小和形状选择性地分类。
一步盐沉淀方法表现出90％或更高的EV回收率，而不管样品的类型，诸如血浆或血清。尽管也分离了大量的杂质蛋白质，但是如果最终要检测的物质是来自EV的核酸，则要进一步进行核酸分离过程。因此，使用该方法可以有效地检测目标物质，并显著增加EV的回收率。
实施例12：通过盐沉淀方法分离的MDA-MB231 EV促进划痕伤口愈合的效果的评价
对于方法SP和UC中的每一种，从50mL的MDA-MB231营养培养基中分离出EV。对于划痕伤口愈合测定，将MDA-MB231细胞以每孔100,000个细胞的密度接种在96孔板中。细胞以单层形式生长，并在孔中心形成划痕伤口。将每个孔洗涤若干次以去除漂浮的细胞，并用SP-increase和UC-分离的EV以每孔0、5、10和20μg/mL的浓度(通过BCA总蛋白质测定法测量)处理细胞。伤口用JuLI Stage实时活细胞成像系统以4x放大倍数成像，间隔4小时，持续达20小时。
图20A示出了当用培养基、通过UC分离的EV和通过SP分离的EV处理时伤口闭合的代表性图像。伤口闭合率根据EV的量而变化，并且在20μg/mL的浓度下较高(图20B)。与通过超速离心制备的EV相比，通过盐沉淀制备的EV显著促进划痕伤口的闭合。这表明通过盐沉淀方法制备的EV保持了它们的功能活性。
实施例13：通过硫酸铵和其他方法分离EV的RNA回收率的比较
为了将硫酸铵方法与其他方法在从生物流体样品中有效分离EV方面进行比较，将硫酸铵方法与其他方法(诸如超速离心(UC)、exoEasy试剂盒(Qiagen)和Norgen外泌体纯化试剂盒)一起进行评估。每种方法使用1mL的在LN-CM中掺有EV的血浆。在EV分离之前，用或不用蛋白酶-K(P-K)处理样品。
使用标准超速离心方法通过超速离心(UC)分离EV。使用TLA120.2Ti固定角度转子(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))和1.2-mL聚碳酸酯超速离心管在4℃下在贝克曼库尔特超速离心机中以120,000xg离心血浆90min以形成EV团块。为了去除蛋白质污染物，小心地去除上清液，并将EV团块重悬于PBS中，并在4℃下再次以120,000xg离心90min。去除上清液，并将所得EV团块重悬于所需体积的PBS中，以方便进一步分析。根据制造商的说明，使用商业试剂盒(Qiagen和Norgen)进行EV分离。对于通过AS的EV分离，使用单步沉淀(SP)，并且脱盐后获得的EV用于RNA提取。
绘制了EV标志物(CD9和ALIX)和癌症标志物(PSA和PSMA)的相对表达水平(图21)。与上述测试方法相比时，SP方法在经P-K处理和未经P-K处理的样品两者中显示出所有标志物的最高表达。
图22示出了使用具有上文实施例所示的不同步骤的SP方法从血浆中分离的EV的回收率和纯度的比较结果。如其中所示，增加步骤数可以提高分离的EV的纯度，同时确保相似的回收率。如上文实施例所示，根据各种样品类型和需求，诸如所需的产量和纯度、易用性等，不同步骤的SP方法可用于EV分离。例如，如图9、图21和图22所示，与其他EV分离方法相比，具有不同步骤的所有SP方法确保了超过80％的非常高的回收率，并且随着SP方法的步骤数的增加，可以分离和富集具有更高纯度的EV。
实施例13：使用各种类型的盐进行EV分离
各种类型的中性盐都会发生蛋白质盐析。盐与水相互作用，减少可用于蛋白质(或EV)溶剂化的水分子数量。结果，蛋白质(或EV)相互作用增加，导致蛋白质(或EV)聚集和沉淀。
测试了各种盐的盐析能力(表1)。使用来自霍夫迈斯特系列的高产离子盐(图23)。对于每种盐，制备4M溶液或饱和溶液，对于4M溶液不是饱和溶液的盐，4M和饱和溶液两者都进行制备(表1)。
[表1]
EV沉淀中所用的盐的列表
通过在室温下温育等体积的细胞条件培养基和盐溶液30分钟，然后在10,000g下离心15分钟来分离EV。然后通过过滤将重悬在PBS缓冲液中的团块脱盐。
使用CD81-CD9夹心ELISA计算EV回收率(图24)。含有多价阴离子和一价阳离子的盐类，诸如硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、硫酸钠和柠檬酸三钠，在测试的盐类中优先沉淀并表现出最高的回收率。然而，盐类诸如硫酸钾和磷酸钠由于其在水中的低溶解度而不能使蛋白质沉淀。此外，含有一价阴离子(例如，氯根和乙酸根)的盐类和含有多价阳离子的盐类(例如硫酸镁)即使在饱和状态下也不会使任何EV沉淀。
工业实用性
根据本发明，可以以比常规细胞外囊泡分离方法更简单的方式在短时间内以高纯度和高效率分离细胞外囊泡。
根据本发明的细胞外囊泡分离方法的优点在于，其适用于各种类型的生物样品，包括可以从人、猪、小鼠、大鼠等中收集的样品(血浆、血清、尿液、唾液、组织、细胞营养培养基、腹水、支气管灌洗液等)，并且能够通过洗涤容易地去除盐，不同于基于沉淀的常规细胞外囊泡分离方法，使得其可以获得高纯度和高产量的细胞外囊泡。此外，根据本发明的方法既适用于出于研究和诊断目的的细胞外囊泡的小规模分离，也适用于工业应用的细胞外囊泡的大规模分离。
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域的技术人员将会理解，提供该描述是为了说明的目的而阐述优选实施方式，并且不应该被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。。

Claims (30)

1.一种从生物流体样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括：
(a)向所述生物流体样品中加入盐至范围为0.1M至饱和浓度的浓度；
(b)从已经加入所述盐的所述样品中分离出聚集的或沉淀的细胞外囊泡级分和上清液；以及
(c)通过将步骤(b)中所分离出的细胞外囊泡级分脱盐来分离细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)通过加入1至15次所述盐至范围为0.1M至饱和浓度的最终浓度来进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)包括从已经加入有1.4M至2.25M的浓度的所述盐的所述样品中分离出的细胞外囊泡级分中分离细胞外囊泡。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述盐包含多价阴离子和一价阳离子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述多价阴离子是硫酸根、磷酸根或柠檬酸根，以及所述一价阳离子是铵离子、钾离子或钠离子。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述盐是硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、硫酸钠或柠檬酸三钠。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述盐是固体或液体形式。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)通过沉降、过滤或离心进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述脱盐使用过滤、离心、透析、反渗透或脱盐柱进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，超滤步骤、亲和层析步骤或密度梯度超速离心步骤进一步在所述细胞外囊泡级分上进行。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物流体选自由以下组成的组：血清、血浆、全血、尿液、唾液、母乳、泪液、汗液、关节液、脑脊液、精液、阴道液、痰、胸膜液、淋巴液、腹水、羊水、支气管灌洗液和取自经培养细胞的培养基。
12.一种从生物组织样品中分离细胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括：
(a)裂解或研磨并澄清生物组织样品；
(b)向经澄清的样品中加入盐至范围为0.1M至饱和浓度的浓度；
(c)从已经加入所述盐的所述样品中分离出聚集的或沉淀的细胞外囊泡级分和上清液；以及
(d)通过将步骤(c)中所分离出的细胞外囊泡级分脱盐来分离细胞外囊泡。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，步骤(b)通过加入1至15次所述盐至范围为0.1M至饱和浓度的最终浓度来进行。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，步骤(d)包括从已经加入有1.4M至2.25M的浓度的所述盐的所述样品中分离出的细胞外囊泡级分中分离细胞外囊泡。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述盐包含多价阴离子和一价阳离子。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述多价阴离子是硫酸根、磷酸根或柠檬酸根，以及所述一价阳离子是铵离子、钾离子或钠离子。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述盐是硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、硫酸钠或柠檬酸三钠。
18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述盐是固体或液体形式。
19.根据权利要求12所述的方法，其中，步骤(c)通过沉降、过滤或离心进行。
20.根据权利要求12所述的方法，其中，所述脱盐使用过滤、离心、透析、反渗透或脱盐柱进行。
21.根据权利要求12所述的方法，其中，超滤步骤、亲和层析步骤或密度梯度超速离心步骤进一步在所述细胞外囊泡级分上进行。
22.根据权利要求12所述的方法，其中，所述生物组织选自由来自原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物、鱼类、昆虫、植物或动物的细胞以及经培养细胞的集合组成的组。
23.一种用于分离细胞外囊泡(EV)的试剂盒，包括盐和缓冲液。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述盐包含多价阴离子和一价阳离子。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述多价阴离子是硫酸根、磷酸根或柠檬酸根，以及所述一价阳离子是铵离子、钾离子或钠离子。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述盐是硫酸铵、磷酸铵、磷酸钾、硫酸钠或柠檬酸三钠。
27.根据权利要求23所述的试剂盒，进一步包括：
(i)含有抗体或配体的容器，所述抗体或配体与暴露于所述细胞外囊泡的表面上的表面标志物或与所述细胞外囊泡内存在的蛋白质结合；
(ii)至少一种固体载体，其直接或间接与暴露于所述细胞外囊泡的所述表面上的表面标志物或与所述细胞外囊泡内存在的蛋白质结合；和/或
(iii)含有至少一种盐和至少一种缓冲液的容器，用于进行所述细胞外囊泡的密度梯度离心。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，所述表面标志物选自由以下组成的组：HLADP单倍型、HLA DQ单倍型、HLA DR单倍型、CD9、CD81、CD63和CD82。
29.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，所述固体载体是树脂或珠子。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中，所述珠子是二氧化硅、磁性颗粒、聚苯乙烯或琼脂糖。
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