KR20220164446A - 염 분별 침전을 이용한 세포외 소포체 분리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분별 침전(fractional precipitation)을 이용하여 생물학적 시료로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 상기 방법 및 키트에 의하면 신속한 분리가 가능하고, 시료 공급원에 관계없이 다양한 종류의 생물학적 시료로부터 효과적으로 세포외 소포체를 분리할 수 있다. 기존의 침전법 기반 세포외 소포체 분리 방법과 달리, 세척을 통해 염을 쉽게 제거할 수 있어 순도와 수율이 높은 세포외 소포체를 분리할 수 있다는 장점이 있으며, 연구 및 진단 분야에서의 소량 세포외 소포체 분리 및 산업적 응용을 위한 대량 세포외 소포체 분리 모두에 적용 가능하다.
Description
본 발명은 생물학적 시료로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생물학적 시료에 염(salt)을 첨가하는 단계를 포함하는 세포외 소포체 분리 방법 및 분리용 키트에 관한 것이다.
세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)는 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 분자물질 운반이 가능한 지질 이중층으로 둘러싸인 미세 입자로, 진핵생물과 원핵생물 모두에서 거의 모든 종류의 세포에 의해 방출된다. 세포간 통신, 신호전달 등을 포함한 다양한 생물 물리학적 과정에 참여한다. 초창기에는 세포사멸 또는 아포토시스(apoptosis) 중에 방출되는 세포 부산물(cellular dust)으로 알려졌으나, 최근 연구에 따르면 세포간 신호전달에 중요한 전달자로서 암세포의 전이, 면역기능, 조직의 재생 등과 연관되어 있는 것으로 보고되고 있으며, 암과 같은 특정 질환의 진단과 관련된 바이오마커로서의 역할도 알려지고 있다. 세포외 소포체는 수십 나노미터 크기의 엑소좀(exosome)과 수백 나노미터 크기의 미세소낭(microvesicle)으로 구분될 수 있다. 복잡한 생체 시료에서의 세포외 소포체 분리는 의료 분야에서 질병 진단, 치료 모니터링 및 유전자 또는 약물 전달을 통한 표적 치료 등에 다양한 이용가능성이 있기 때문에, 생물학적 유체에서 이들을 효율적으로 분리하는 기술이 요구되고 있다.
세포외 소포체를 분리하는 방법에는 여러 가지가 존재한다. 가장 널리 사용되는 방법은 초원심분리(ultracentrifugation; UC)이지만, 고가의 장비, 긴 처리 시간 및 낮은 수율로 인해 세포외 소포체의 물리 화학적 특성을 기반으로 한 다른 분리 방법과 키트가 개발되었다. 예를 들어, 폴리머를 이용한 여러 시약(polyethylene glycol, volume excluding polymer)이 개발되었으며 다양한 생물학적 샘플에서 세포외 소포체 분리용으로 상용화되었다(US 9,005,888 B, US 9,671,321 B, US 2020/0179827 A). 그러나, 분리 이후에 세포외 소포체 샘플에 함께 남아 있는 고분자 시약은 다음 단계에 수행되는 다양한 분석 반응에 방해가 될 수 있다는 단점이 있다.
또한, 세포외 소포체의 표면 생화학적 특성을 기반으로 하는 친화성 기반 분리 방법도 개발되었다(heparin: US 9,829,483 B; Balaj et al., Sci Rep. 2015; 5: 10266; SiC: US 2019/0078078 A; Tim4: Nakai et al., Sci Rep. 2016; 6: 33935; mag capture; Qiagen;Tim4, Nakai et al., Sci Rep. 2016; mag capture, Ghosh et al., PLoS One, 2014). 이러한 방법은 유사한 표면 친화적 특성을 가진 분자 들이 함께 혼합되어 분리된다는 점, 세포외 소포체 특이적인 특정 항체가 요구된다는 점, 세포외 소포체 분리 수율이 재현적이지 않다는 점 등과 같은 한계가 있다.
염을 이용한 세포외 소포체 분리방법으로는 0.1M, pH 4.75 아세트산 나트륨 완충액(J Immunol Methods. 2014, 407, 120-6, US 9,835,626 B)을 사용하여 EV 표면에서 포스포티딜세린의 전하 중화(charge neutralization of the phosphotidylserine)에 의한 세포외 소포체의 침전을 시도한 바 있다. 이 연구에서는, 낮은 pH에서 더 높은 세포외 소포체 획득 수율을 얻었으며 이러한 pH 의존성은 실제로는 중성인 생체시료로부터 세포외 소포체를 분리하는 과정에는 이상적이지 않다. 이는 혈장 및 소변 샘플에서 세포외 소포체 분리 효율을 비교한 연구에서도 확인되었는데(Ana Gamez-Valero, et al., Front. Immunol., 2015; 6: 6), 아세트산 나트륨을 이용한 침전법은 다른 테스트 방법에 비해 세포외 소포체 회수율이 현저히 낮았다. 따라서, 생체시료로부터 세포외 소포체를 효율적으로 분리하기 위한 더 나은 방법의 개발이 매우 필요하다.
이에, 본 발명자들은 시료 볼륨, 유형, 시료 공급원에 관계없이 생물학적 시료에서 EV를 분리하는데 사용할 수 있고, 확장 가능하고 높은 수율의 EV 분리가 가능한 빠르고 효율적이며 사용자 친화적인 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 황산 암모늄(AS) 등의 염을을 이용한 세포외 소포체 분리 방법이 혈장, 혈청, 소변, 배양액 등과 같은 다양한 생물학적 시료로부터, 시료의 부피, 유형, 공급원 등에 관계없이 다양한 생물학적 시료로부터 신속하면서 고수율로 세포외 소포체를 분리할 수 있는 사용자 친화적인 세포외 소포체 분리 방법이며, 특히 점진적으로 증가되는 농도의 염 첨가를 통한 다단계 염 침전법을 이용하면 다양한 단백질 불순물을 침전시켜 고효율로 불순물을 제거할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 생물학적 유체 시료 또는 생물학적 조직 시료와 같은 생물학적 시료로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 효과적으로 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV) 분리용 키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 생물학적 유체 시료에 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 염(salt)을 첨가하는 단계; (b) 상기 염이 첨가된 시료로부터 응집 또는 침전된 세포외 소포체 분획과 상층액을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 분리된 세포외 소포체 분획을 탈염(desalting)하여 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 유체 시료(biological-fluid sample)로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생물학적 조직 시료를 용해(lysing) 또는 분쇄(grinding)하고 정제(clarifying)하는 단계; (b) 상기 정제된 시료에 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 염(salt)을 첨가하는 단계; (c) 상기 염을 첨가한 시료로부터 응집 또는 침전된 세포외 소포체 분획과 상층액을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 분리된 세포외 소포체 분획을 탈염(desalting)하여 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 조직 시료(biological tissue sample)로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 염(salt) 및 완충액(buffer)을 포함하는 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV) 분리용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 종래의 세포외 소포체 분리 방법에 비해 분리 방식이 간단하고, 짧은 시간 내에 세포외 소포체를 고순도 및 고효율로 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 소포체 분리 방법은, 사람, 돼지, 마우스, 쥐 등에서 채취 가능한 시료(혈장, 혈청, 소변, 타액, 조직, 세포 배양액, 복수, 기관지 세척 등)를 포함한 다양한 종류의 생물학적 시료에 적용이 가능하고, 기존의 석출 기반 세포외 소포체 분리 기반 방법과 달리 세척을 통해 염을 쉽게 제거할 수 있어 순도와 수율이 높은 세포외 소포체를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 또한, 연구 및 진단 등의 분야에 적용되는 소규모 세포외 소포체 분리 및 대규모 산업적 응용 모두에 적용 가능하다.
도 1은 생물학적 유체로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하기 위한 다단계 염 분별 침전(salt fractional precipitation; SP)을 나타낸 모식도이다.
도 2는 6 단계 SP에 의한 혈장에서의 EV 분리를 보여주는 모식도이다.
도 3은 6 단계 SP를 사용한 혈장에서 분리된 분획의 총단백질 함량 및 EV 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3A는 총 단백질량 비교(BCA 분석); 도 3B는 EV의 회수율 비교; 도 3C는 EV 마커, CD9-CD81(막표면) 및 Alix(내부)에 대한 ELISA 결과로, F3-F4 분획에 EV 함량이 가장 높음을 확인할 수 있다.
도 4는 6 단계 SP를 사용한 혈장에서 분리된 분획 내에 존재하는 단백질 불순물인 알부민 및 지단백질에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4A는 알부민; 도 4B는 Apo-AI; 도 4C는 Apo-B; 도 4D는 Apo-E를 나타낸 것으로, F5-F6 분획에 불순물 단백질이 가장 많이 존재함을 확인할 수 있다.
도 5는 3 단계 SP에 의해 형성된 분획의 EV 마커(CD9-CD81(막표면) 및 Alix(내부))에 대한 비교 ELISA 결과를 나타낸 그래프로, 동일한 최종 농도에서 고체 AS(도 5A) 및 액체 AS(도 5B)를 사용하여 비교한 결과이다.
도 6은 0.4mL(도 6A) 및 4mL(도 6B) 혈장을 사용하여 3 단계 SP에 의해 형성된 분획의 EV 마커 CD9-CD81 및 Alix에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프로, SP는 확장 가능하며 소량 및 대량 시료에 모두 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 7은 신선한 또는 냉동보관 하였다가 해동된 혈장 또는 혈청으로부터 2 단계 SP에 의해 분리된 EV의 특성화를 보여주는 도면이다. 도 7A는 총 단백질 정량(BCA); 도 7B는 EV의 회수율; 도 7C는 EV 마커에 대한 ELISA 결과; 도 7D는 NTA 분석 결과이다.
도 8은 2 단계 SP를 사용하여 혈장으로부터 분리한 EV 및 ExoQuick 및 exoEasy 등 다른 분리 키트로 분리한 EV의 수율 및 총 단백질량을 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 총 단백질 정량화를 위한 BCA 분석에 의한 EV 분석(도 8A) 및 EV의 % 회수(도 8B)를 나타낸 그래프로, SP에 의해 분리된 EV가 다른 침전법 대비 EV 수율이 높고, 단백질 불순물 함량이 적음을 보여준다.
도 9는 2 단계 SP를 사용하여 혈장으로부터 분리한 EV 및 ExoQuick 및 exoEasy 등 다른 분리 키트로 분리한 EV의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프로, 각 방법으로 분리된 EV의 농도(도 9A) 및 크기 분포(도 9B) 결과이다.
도 10은 SP, Exoquick 및 exoEasy 키트로 분리된 EV의 TEM(투과전자현미경) 이미지를 보여준다.
도 11은 LNCaP 유래 EV를 첨가한 돼지 혈장으로부터 2 단계 SP에 의해 분리된 EV에 대한 총 단백질 정량, ELISA에 의한 EV 분석 결과를 나타낸 그래프로, 도 11A는 총 단백질 정량; 도 11B는 EV 마커용 ELISA 결과이다.
도 12는 SP에 의한 생물학적 유체로부터 EV의 분리를 나타낸 모식도이다.
도 13은 다양한 소태아혈청(FBS) 농도를 갖는 LNCaP 배양액으로부터 EV 분리를 위한 최적 황산암모늄(AS)의 농도 평가를 위한 CD9-CD81 샌드위치 효소결합면역흡착검사(ELISA) 결과를 나타낸 도면이다. 도 13A는 무혈청 advanced RPMI 배양액; 도 13B는 5% FBS를 갖는 RPMI 배양액; 도 13C는 5% 엑소좀 프리(Exo-Free, EF)-FBS를 갖는 RPMI 배양액; 도 13D는 0.1% 엑소좀 프리-FBS가 포함된 RPMI 배양액을 이용한 결과이다.
도 14는 다양한 FBS 농도를 갖는 LNCaP 배양액로부터 염 침전(SP)에 의해 분리된 EV의 분석 결과를 나타낸 그래프로, 도 14A는 총 단백질 정량; 도 14B는 EV의 회수율 결과이다.
도 15는 LNCaP 배양액으로부터 염 침전(SP)에 의해 분리된 EV의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프로, 무 혈청 배양액(도 15B) 및 5% 엑소좀 프리(EF)-FBS(도 15C)를 포함하는 배양액에서 얻은 EV의 농도(도 15A) 및 크기 분포(도 15B 및 도 15C)를 나타낸 도면이다.
도 16은 LNCaP 배양액으로부터 SP에 의해 분리된 EV의 TEM 이미지로, 도 16A는 무 혈청 배양액; 도 16B는 5% EF-FBS 함유 배양액을 이용한 결과이다.
도 17은 황산암모늄과 아세트산 나트륨을 사용한 침전방법으로 분리한 EV의 비교 그래프로, 도 17A는 총 단백질 정량화에 의한 EV 분석; 도 17B는 EV의 회수율; 도 17C는 NTA 분석 결과이다.
도 18은 소변에서 SP로 분리된 EV의 특성화를 보여주는 도면으로, 도 18A는 총 단백질 정량화; 도 18B는 EV의 회수율 결과 그래프이다.
도 19는 동일한 공여자로부터의 혈장 및 혈청으로부터 SP에 의해 분리된 EV의 특성화를 보여주는 도면으로, 도 19A는 총 단백질 정량; 도 19B는 EV의 회수율 결과 그래프이다.
도 20은 SP 및 UC에 의해 MDA-MB231 배양액에서 분리된 EV를 사용한 스크래치 상처 치유 분석의 결과를 나타낸 도면으로, 도 20A는 EV와 함께 0시간 및 20시간 치료에서 찍은 상처 봉합의 대표적인 이미지; 도 20B는 (i) 5μg/mL, (ii) 10μg/mL 및 (iii) 20μg/mL EV에서 EV 선량에 대한 상처 봉합 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 21은 표준(도 21A) 및 암(도 21B) EV 마커의 PCR 분석 결과를 나타낸 그래프로, 프로테이나아제-K의 비처리(i) 및 처리(ii)시, SP와 다른 EV 분리 방법인, ultracentrifugation(UC), Qiagen 및 Norgen을 비교한 결과이다.
도 22는 다양한 단계의 SP 방법을 활용하여 혈장에서 분리한 EV의 회수율과 순도를 함께 비교한 결과이다.
도 23은 호프마이스터 계열(Hofmeister series)을 나타낸 도면으로, 계열의 왼쪽에 있는 이온은 단백질을 안정화시키며, 빨간색으로 표시된(NH4 +, K+, Na+, Mg2 +, SO4 2-, HPO4 2 -, CH3COO-, Citrate-, Cl-), 계열 왼쪽의 양이온과 음이온이 결합된 염이 EV 침전에 사용되었다.
도 24는 다양한 염을 사용하여, 전립선(LNCaP, 도 24A) 및 유방암(MDA-MB231, 도 24B) 세포 조정배지에서 EV의 회수율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 6 단계 SP에 의한 혈장에서의 EV 분리를 보여주는 모식도이다.
도 3은 6 단계 SP를 사용한 혈장에서 분리된 분획의 총단백질 함량 및 EV 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3A는 총 단백질량 비교(BCA 분석); 도 3B는 EV의 회수율 비교; 도 3C는 EV 마커, CD9-CD81(막표면) 및 Alix(내부)에 대한 ELISA 결과로, F3-F4 분획에 EV 함량이 가장 높음을 확인할 수 있다.
도 4는 6 단계 SP를 사용한 혈장에서 분리된 분획 내에 존재하는 단백질 불순물인 알부민 및 지단백질에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4A는 알부민; 도 4B는 Apo-AI; 도 4C는 Apo-B; 도 4D는 Apo-E를 나타낸 것으로, F5-F6 분획에 불순물 단백질이 가장 많이 존재함을 확인할 수 있다.
도 5는 3 단계 SP에 의해 형성된 분획의 EV 마커(CD9-CD81(막표면) 및 Alix(내부))에 대한 비교 ELISA 결과를 나타낸 그래프로, 동일한 최종 농도에서 고체 AS(도 5A) 및 액체 AS(도 5B)를 사용하여 비교한 결과이다.
도 6은 0.4mL(도 6A) 및 4mL(도 6B) 혈장을 사용하여 3 단계 SP에 의해 형성된 분획의 EV 마커 CD9-CD81 및 Alix에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프로, SP는 확장 가능하며 소량 및 대량 시료에 모두 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 7은 신선한 또는 냉동보관 하였다가 해동된 혈장 또는 혈청으로부터 2 단계 SP에 의해 분리된 EV의 특성화를 보여주는 도면이다. 도 7A는 총 단백질 정량(BCA); 도 7B는 EV의 회수율; 도 7C는 EV 마커에 대한 ELISA 결과; 도 7D는 NTA 분석 결과이다.
도 8은 2 단계 SP를 사용하여 혈장으로부터 분리한 EV 및 ExoQuick 및 exoEasy 등 다른 분리 키트로 분리한 EV의 수율 및 총 단백질량을 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 총 단백질 정량화를 위한 BCA 분석에 의한 EV 분석(도 8A) 및 EV의 % 회수(도 8B)를 나타낸 그래프로, SP에 의해 분리된 EV가 다른 침전법 대비 EV 수율이 높고, 단백질 불순물 함량이 적음을 보여준다.
도 9는 2 단계 SP를 사용하여 혈장으로부터 분리한 EV 및 ExoQuick 및 exoEasy 등 다른 분리 키트로 분리한 EV의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프로, 각 방법으로 분리된 EV의 농도(도 9A) 및 크기 분포(도 9B) 결과이다.
도 10은 SP, Exoquick 및 exoEasy 키트로 분리된 EV의 TEM(투과전자현미경) 이미지를 보여준다.
도 11은 LNCaP 유래 EV를 첨가한 돼지 혈장으로부터 2 단계 SP에 의해 분리된 EV에 대한 총 단백질 정량, ELISA에 의한 EV 분석 결과를 나타낸 그래프로, 도 11A는 총 단백질 정량; 도 11B는 EV 마커용 ELISA 결과이다.
도 12는 SP에 의한 생물학적 유체로부터 EV의 분리를 나타낸 모식도이다.
도 13은 다양한 소태아혈청(FBS) 농도를 갖는 LNCaP 배양액으로부터 EV 분리를 위한 최적 황산암모늄(AS)의 농도 평가를 위한 CD9-CD81 샌드위치 효소결합면역흡착검사(ELISA) 결과를 나타낸 도면이다. 도 13A는 무혈청 advanced RPMI 배양액; 도 13B는 5% FBS를 갖는 RPMI 배양액; 도 13C는 5% 엑소좀 프리(Exo-Free, EF)-FBS를 갖는 RPMI 배양액; 도 13D는 0.1% 엑소좀 프리-FBS가 포함된 RPMI 배양액을 이용한 결과이다.
도 14는 다양한 FBS 농도를 갖는 LNCaP 배양액로부터 염 침전(SP)에 의해 분리된 EV의 분석 결과를 나타낸 그래프로, 도 14A는 총 단백질 정량; 도 14B는 EV의 회수율 결과이다.
도 15는 LNCaP 배양액으로부터 염 침전(SP)에 의해 분리된 EV의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프로, 무 혈청 배양액(도 15B) 및 5% 엑소좀 프리(EF)-FBS(도 15C)를 포함하는 배양액에서 얻은 EV의 농도(도 15A) 및 크기 분포(도 15B 및 도 15C)를 나타낸 도면이다.
도 16은 LNCaP 배양액으로부터 SP에 의해 분리된 EV의 TEM 이미지로, 도 16A는 무 혈청 배양액; 도 16B는 5% EF-FBS 함유 배양액을 이용한 결과이다.
도 17은 황산암모늄과 아세트산 나트륨을 사용한 침전방법으로 분리한 EV의 비교 그래프로, 도 17A는 총 단백질 정량화에 의한 EV 분석; 도 17B는 EV의 회수율; 도 17C는 NTA 분석 결과이다.
도 18은 소변에서 SP로 분리된 EV의 특성화를 보여주는 도면으로, 도 18A는 총 단백질 정량화; 도 18B는 EV의 회수율 결과 그래프이다.
도 19는 동일한 공여자로부터의 혈장 및 혈청으로부터 SP에 의해 분리된 EV의 특성화를 보여주는 도면으로, 도 19A는 총 단백질 정량; 도 19B는 EV의 회수율 결과 그래프이다.
도 20은 SP 및 UC에 의해 MDA-MB231 배양액에서 분리된 EV를 사용한 스크래치 상처 치유 분석의 결과를 나타낸 도면으로, 도 20A는 EV와 함께 0시간 및 20시간 치료에서 찍은 상처 봉합의 대표적인 이미지; 도 20B는 (i) 5μg/mL, (ii) 10μg/mL 및 (iii) 20μg/mL EV에서 EV 선량에 대한 상처 봉합 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 21은 표준(도 21A) 및 암(도 21B) EV 마커의 PCR 분석 결과를 나타낸 그래프로, 프로테이나아제-K의 비처리(i) 및 처리(ii)시, SP와 다른 EV 분리 방법인, ultracentrifugation(UC), Qiagen 및 Norgen을 비교한 결과이다.
도 22는 다양한 단계의 SP 방법을 활용하여 혈장에서 분리한 EV의 회수율과 순도를 함께 비교한 결과이다.
도 23은 호프마이스터 계열(Hofmeister series)을 나타낸 도면으로, 계열의 왼쪽에 있는 이온은 단백질을 안정화시키며, 빨간색으로 표시된(NH4 +, K+, Na+, Mg2 +, SO4 2-, HPO4 2 -, CH3COO-, Citrate-, Cl-), 계열 왼쪽의 양이온과 음이온이 결합된 염이 EV 침전에 사용되었다.
도 24는 다양한 염을 사용하여, 전립선(LNCaP, 도 24A) 및 유방암(MDA-MB231, 도 24B) 세포 조정배지에서 EV의 회수율(%)을 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서, 염 침전(salt precipitation), 분별 염 침전(fractional salt precipitation) 및 염 분별 침전(salt fractional precipitation)은 모두 동일한 의미로 사용되며, “SP”로 약칭된다. 염 침전은 생물학적 시료에 염을 첨가함으로써 응집 또는 침전된 분획과 상층액을 분리시키는 방법을 의미한다.
본 명세서에서, “세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)”는 핵산, 단백질 또는 기타 생체 분자를 포함할 수 있는 작은 분비 소포(일반적으로 약 30-800nm)로서, 엑소좀(exosome) 및 미세소낭(microvesicle)을 포함한다. 생명체 또는 생물학적 시스템의 다양한 위치에 생체분자 물질을 이동시킴으로써 세포 전달자 역할을 할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “생물학적 시료(biological sample)”는 생물학적 유체 시료(biological-fluid sample) 및 생물학적 조직 시료(biological tissue sample)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 염 첨가 및 탈염 단계를 포함하는 세포외 소포체 분리 방법이, 종래의 기술에 비해 분리 방식이 간단하고, 매우 높은 분리 효율과 순도를 가지며, 초원심분리 단계를 포함하지 않아도 짧은 시간 내에 세포외 소포체를 매우 효율적으로 분리할 수 있음을 확인하였다.
특히, 종래 침전법 기반 세포외 소포체 분리 방법에서는 세포외 소포체 분리를 위해 첨가한 첨가제가 함께 섞여 있는 단점이 있었던 것에 반해, 본 발명에 따른 염은 탈염을 위한 세척 과정에서 쉽게 제거되어 보다 순도 높은 세포외 소포체를 분리할 수 있다는 장점을 갖고 있을 뿐만 아니라, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 조직, 세포 배양액 등 다양한 바이오 시료에 적용 가능하고, 산업적 응용을 위한 대용량 세포외 소포체 시료 준비 및 진단 및 치료 분야에 필요한 소량의 세포외 소포체 시료 준비에 모두 적합함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 생물학적 유체 시료에 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 염(salt)을 첨가하는 단계; (b) 상기 염이 첨가된 시료로부터 응집 또는 침전된 세포외 소포체 분획과 상층액을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 분리된 세포외 소포체 분획을 탈염(desalting)하여 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 유체 시료(biological-fluid sample)로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 용어 “포화농도(saturation concentration)”는 시료에 염이 첨가되어 용해 평형 상태에 도달하는 농도를 의미한다. 상기 포화농도는 염의 종류, 시료의 종류, 온도 또는 압력에 따라 상이할 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 생물학적 시료가 물(water)과 같은 상태를 가질 때, 이에 대한 황산암모늄의 포화농도는 25℃에서 4.1M, 인산암모늄의 포화농도는 25℃에서 3.9M, 인산칼륨의 포화농도는 25℃에서 0.8M, 황산나트륨의 포화농도는 25℃에서 2.0M, 시트르산삼나트륨의 포화농도는 25℃에서 3.6M인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 염이 첨가된 생물학적 유체 시료의 농도는 0.1M 내지 포화농도인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.1M 내지 4M, 더 바람직하게는 1M 내지 3M, 더욱 바람직하게는 1.4M 내지 2.25M인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 염을 1회 내지 15회 첨가하여 최종 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 세포외 소포체 분리 방법은 염을 첨가하는 단계가 1회인 경우 단일 단계(single step) 염 침전 방법에 해당하며, 1회 초과일 경우 다단계(multi-step) 염 침전 방법에 해당한다.
본 발명에 있어서, 상기 다단계 염 침전 방법의 경우, 염을 첨가하는 단계를 2회 이상 반복 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 2회 내지 15회, 더욱 바람직하게는 2회 내지 10회, 가장 바람직하게는 2회 내지 6회 반복 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 염을 첨가하는 단계의 반복 수행시, 추가되는 염의 경우, 이전 단계에서 첨가된 염과 염의 종류는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 또한, 반복 수행 횟수에 따라 각 염 첨가 단계의 농도는 달라질 수 있으며, 다만, 염 첨가 단계의 반복 수행에 따라 염 첨가 후 시료의 농도는 증가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 다단계 염 침전은 하나 이상의 별개의 침전물을 생성할 수 있으며, 각 침전물은 독립적으로 처리되어 동일하거나 다른 세포외 소포체를 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, EV 분리의 최적 염 농도는, 단일 단계 염 침전 방법의 경우 1.75~2M, 다단계 염 침전 방법 중 2 단계 염 침전의 경우 1.8~2M, 3 단계 염 침전의 경우, 1.5~2.25M, 6 단계 염 침전의 경우 1.4~1.9M이었다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 염이 첨가된 시료의 농도가 1.4M 내지 2.25M인 시료로부터 분리된 세포외 소포체 분획으로부터 세포외 소포체를 분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 생물학적 시료에 염을 첨가하여 침전물과 상층액을 포함하는 용액을 수득할 수 있다. 이 용액은 본 명세서에서 fraction-1(F1)으로 정의한 제1 분획과 제1 상층액으로 분리된다. 다단계 염 침전의 경우, 두 번째 침전을 위해 제1 상층액에 염을 첨가하고, 생성된 용액으로부터 제2 분획인 fraction-2(F2)와 제2 상층액이 분리된다. 제1 상층액에 염을 첨가하기 때문에, 두 번째 용액의 염 농도는 첫 번째 용액의 염 농도보다 더 클 것이다. 모든 분획이 분리될 때까지 염 첨가와 침전물 및 상층액의 분리 과정을 반복한다. 염 침전은 재현탁된 침전물에 대해서도 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염은 코스모트로프(kosmotrope; kosmotropic ion) 또는 카오트로프(chaotrope; chaotropic ion)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 코스모트로프란 단백질 구조를 안정화시키는 염을 지칭하며, 카오트로프란 단백질 구조를 불안정하게 만드는 염을 의미한다(Wiggins, P. M. (2001). Cellular and Molecular Biology, 47, 735-744).
본 발명에 있어서, 상기 염은 다가 음이온(polyvalent anion) 및 1가 양이온(monovalent cation)을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 ‘다가 음이온’이란 이온의 원자가가 1 이상인 음이온을 의미하고, ‘1가 양이온’이란 원자가가 1인 양이온을 의미한다.
구체적으로, 상기 다가 음이온은 황산염(sulfate), 인산염(phosphate) 또는 시트르산염(citrate)이고, 상기 1가 양이온은 암모늄 이온(ammonium ion), 칼륨 이온(potassium ion) 또는 나트륨 이온(sodium ion)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 염은 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 염은 고체 또는 액체의 형태인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 액체 형태의 염은 용어 “염 용액”과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염은 수용성 염 또는 비수용성 염일 수 있으며, 바람직하게는 수용성 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비수용성 염의 용해도를 향상시키는 킬레이트제(chelating agent; 예를 들어, EDTA)와 함께 비수용성 염(예를 들어, 시트르산칼슘(calcium citrate) 및/또는 물에 대한 용해도가 낮은 기타 염)도 사용할 수 있다. 고농도의 염은 시료의 세포외 소포체 농도가 낮을 때 유용하다.
본 발명의 일 실시예에서, 염이 첨가된 세포외 소포체 시료를 처리하는 데 생물학적 시료에 일반적으로 사용되는 다양한 완충액(buffer)이 사용될 수 있으며, 인산염, 아세트산염, 시트르산염 및 TRIS 버퍼를 포함한다. 완충액의 pH는 시료에 적합한 모든 pH일 수 있으며, pH 4 내지 pH 10일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 침강, 여과 또는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 원심분리는 2,000xg 내지 15,000xg로 5분 내지 30분 동안 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 생물학적 유체 시료는 -5 내지 40℃의 온도에서 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포외 소포체가 붕괴되지 않는 온도 조건이면 제한 없이 적용 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 혈장은 실온(RT)을 유지하고, 실온에서 염 용액을 첨가하여 제1 침전물과 상층액을 수득하였다. 제1 침전물과 상층액은 실온에서 여과하거나 실온 또는 4℃에서 > 10000 xg로 원심분리하여 분리된다.
본 발명에 있어서, 상기 탈염은 여과(filtration), 원심분리(centrifugation), 투석(dialysis), 역삼투(reverse osmosis) 또는 탈염 컬럼(desalting column)을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 생물학적 시료에 염을 첨가하고, 침강, 여과 또는 원심분리를 수행하면, 응집(aggregation) 또는 침전(precipitate)된 침전물 분획과 상층액으로 분리되며, 응집 또는 침전된 분획에 포함된 세포외 소포체가 본 발명에 따른 방법의 최종 분리 대상이므로, 응집 또는 침전된 세포외 소포체 분획으로 기재되었다.
침전된 세포외 소포체는 원심분리, 여과 또는 기타 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 소규모의 경우 원심분리가 바람직하고, 대규모의 경우 여과가 바람직하다. 원심분리를 이용하면 침전물이 펠릿(pellet)을 형성하며, 피펫팅으로 상층액을 제거할 수 있다. 여과를 이용하면 침전물이 여과지에 케이크(cake)를 형성하고 여과액이 상층액이다.
침전물은 완충액에 용해될 수 있으며, 분리된 세포외 소포체를 정제하기 위해 탈염, 추가 분별, 크로마토그래피 등 또는 이들의 조합을 포함한 추가 공정을 거칠 수 있다. 상기 방법은 10-100nm 기공 지름 크기의 필터 또는 100kD-300kD의 폴리머 기반 MWCO 필터가 장착된 한외여과 장치를 이용하여 염, 작은 단백질 및 지질단백질을 제거하는 원심 접선 유동 여과(centrifugal tangential flow filtration) 또는 한외여과 단계를 더 포함할 수 있다.
원심 여과 및/또는 한외여과는 모두 염, 저분자량 종(species) 및/또는 가공제(processing agent)를 제거할 수 있다. 원심 여과 또는 한외여과는 염 침전 단계 사이 및/또는 크로마토그래피 단계 사이 및/또는 염 침전 단계와 크로마토그래피 단계 사이에 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외 소포체 분획에 대해 한외여과(ultrafiltration) 단계, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 단계 또는 밀도 구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation) 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 필수적인 것은 아니나, 시료에서 잔해물을 제거하기 위하여, 염 침전 전에 생물학적 유체 시료를 정제하면 고순도 세포외 소포체를 수득할 수 있다. 정제 방법에는 원심분리(centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation), 여과(filtration) 또는 한외여과(ultrafiltration)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 고순도의 세포외 소포체를 얻기 위하여, 염 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체의 표면에 노출된 크기, 밀도 또는 단백질에 기초하여 추가로 더 정제할 수 있다.
밀도 구배, 크로마토그래피, 초원심분리와 같은 기존 방법을 사용하여 세포외 소포체를 추가로 분별할 수 있다. 염을 사용하여 수득한 분획으로부터 세포외 소포체의 정제는 크로마토그래피를 포함하는 정제 단계들이 필요할 수 있고, 또는 크로마토그래피 이외의 정제 단계들이 필요할 수 있다. 세포외 소포체의 하위 집단은 표면 마커의 존재와 같은 세포외 소포체의 다른 특성을 이용하여 분리될 수도 있다. 세포외 소포체의 분류에 사용될 수 있는 표면 마커에는 종양 마커 및 MHC 클래스 II 마커가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포외 소포체와 관련된 다른 표면 마커에는 CD9, CD81, CD63 및 CD82가 포함된다(Thery et al. Nat. Rev. Immunol. 2 (2002) 569-579; Valadi et al. Nat. Cell. Biol. 9 (2007) 654-659).
순수한 세포외 소포체를 얻기 위하여, 크기 배제, 양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 상호작용 또는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피를 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단일 크로마토그래피 공정(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피)을 수행할 수 있다. 일련의 동일 또는 상이한 크로마토그래피를 순차적으로 실행하고(예를 들어, 2번의 이온 교환 크로마토그래피를 순서대로 실행하거나, 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 순서대로 실행), 일련의 프로세스를 수행할 수 있다(예를 들어, 염 침전 후 친화성 크로마토그래피를 실행하고, 뒤이어 소수성 상호작용 크로마토그래피 실행). 일련의 상이한 크로마토그래피 공정을 순서대로 수행하고(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 실행 후 이온 교환 크로마토그래피 실행), 중간 공정과 함께 일련의 상이한 크로마토그래피 공정을 수행할 수 있다(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 실행에 이어 염 침전 후 소수성 상호작용 크로마토그래피 실행). 또는 이러한 과정 중 임의의 조합이 수행할 수 있다.
표면 분자를 활용한 순수한 세포외 소포체를 얻기 위한 방법의 예시로, 표면에 테트라스패닌(tetraspanins)마커인 CD9, CD63 및 CD81을 갖는 세포외 소포체를 항체 코팅된 자성 입자를 이용하여 분리하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, Dynabeads(직경 1~4.5μm의 초상자성 비드)는 항-인간 CD9 항체, 항-인간 CD63 항체 및 항-인간 CD81 항체의 칵테일과 비드 표면에 직접 접합되거나, 2차 링커(예를 들어, 항-마우스 IgG)를 통해 접합될 수 있다. 항체 코팅된 Dynabeads를 염을 이용하여 준비한 세포외 소포체 시료에 첨가하고, 2-8℃ 또는 RT에서 0분 내지 밤새 배양할 수 있다. 세포외 소포체가 결합된 Dynabeads는 자석을 이용하여 수집할 수 있다. 분리된 비드 결합 세포외 소포체는 인산염완충식염수(PBS)와 같은 적절한 완충액에 재현탁되고, 다운스트림 분석(역전사 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 시퀀싱, 웨스턴, 유세포 분석 등)에 사용될 수 있다. 이와 유사한 프로토콜은 항체 또는 다른 특정 리간드를 이용할 수 있는 다른 표면 마커에 대해 이용될 수 있다. 비오틴-아비딘을 사용하는 것과 같은 간접 결합 방법 또한 이용할 수 있다.
시료로부터 세포외 소포체가 분리되면, 연구 및 특성화를 위해 세포외 소포체의 내용물을 추출할 수 있다. 세포외 소포체에서 추출할 수 있는 물질로는 단백질, 펩타이드, RNA, DNA, 지질 등이 있다. 예를 들면, allprep DNA/RNA kit(80204, Qiagen)를 사용하여 세포외 소포체로부터 DNA와 RNA를 분리할 수 있다. 또한, 세포외 소포체로부터 total RNA를 회수하는 데 miRNeasy kit(217004, Qiagen)를 사용할 수 있다. 마찬가지로, mirVanaTM PARIS Kit(AM1556, Life Technologies)를 사용하여 세포외 소포체에서 miRNA, snRNA 및 snoRNA와 같은 small RNA를 포함한 native 단백질 및 RNA species를 회수할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “생물학적 유체(biological-fluid)”는 원핵생물, 진핵생물, 박테리아, 진균, 효모, 무척추동물, 척추동물, 파충류, 어류, 곤충, 식물 및 동물을 포함하는 유기체로부터 분리되거나 유래된 임의의 유체를 의미하며, 혈청, 혈장, 전혈, 소변, 타액, 모유, 눈물, 땀, 관절액, 뇌척수액, 정액, 질액, 객담, 흉수, 림프액, 복수 및 양수를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기관지 세척액 및 배양된 세포에서 채취한 배양액(예를 들어, 세포 배양 상층액, 조건(conditioned) 배양액, 세포 배양액 또는 세포 배양 배지)도 생물학적 유체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염 침전 방법에 의해 생물학적 시료로부터 직접 세포외 소포체가 분리될 수 있고, 또한, 초원심분리(ultracentrifugation), 밀도 구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation), 크기 배제 크로마토 그래피(size-exclusion chromatography; SEC), 접선 유동 여과(tangential flow filtration; TFF) 또는 침전(precipitation)과 같은 다른 방법으로 제조된 세포외 소포체를 포함하는 용액으로부터 염 침전 방법에 의해 세포외 소포체를 분리하거나 농축할 수도 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 생물학적 조직 시료를 용해(lysing) 또는 분쇄(grinding)하고 정제(clarifying)하는 단계; (b) 상기 정제된 시료에 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 염(salt)을 첨가하는 단계; (c) 상기 염을 첨가한 시료로부터 응집 또는 침전된 세포외 소포체 분획과 상층액을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 분리된 세포외 소포체 분획을 탈염(desalting)하여 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 조직 시료(biological tissue sample)로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 염이 첨가된 시료의 농도는 0.1M 내지 포화농도인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.1M 내지 4M, 더 바람직하게는 1M 내지 3M, 더욱 바람직하게는 1.4M 내지 2.25M인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 염을 1회 내지 15회 첨가하여 최종 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 염이 첨가된 시료의 농도가 1.4M 내지 2.25M인 시료로부터 분리된 세포외 소포체 분획으로부터 세포외 소포체를 분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 염은 다가 음이온(polyvalent anion) 및 1가 양이온(monovalent cation)을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 다가 음이온은 황산염(sulfate), 인산염(phosphate) 또는 시트르산염(citrate)이고, 상기 1가 양이온은 암모늄 이온(ammonium ion), 칼륨 이온(potassium ion) 또는 나트륨 이온(sodium ion)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 염은 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염은 고체 또는 액체의 형태인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 침강, 여과 또는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탈염은 여과(filtration), 원심분리(centrifugation), 투석(dialysis), 역삼투(reverse osmosis) 또는 탈염 컬럼(desalting column)을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외 소포체 분획에 대해 한외여과(ultrafiltration) 단계, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 단계 또는 밀도 구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation) 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 조직 시료로부터 세포외 소포체를 분리하는 방법은 상기 생물학적 유체 시료로부터 세포외 소포체를 분리하는 방법과 동일한 단계를 포함하되, 시료가 생물학적 유체가 아닌 생물학적 조직인 것에 기하여 생물학적 조직 시료를 용해 또는 분쇄하고 정제하는 단계와 시료를 배양하는 단계를 추가로 포함할 뿐이며, 염의 종류, 농도, 염 첨가 단계의 반복 수행 등 상기 생물학적 유체 시료로부터 세포외 소포체를 분리하는 방법과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서, 용어 “생물학적 조직(biological tissue)”은 원핵생물, 진핵생물, 박테리아, 진균, 효모, 무척추동물, 척추동물, 파충류, 어류, 곤충, 식물 또는 동물로부터 유래된 세포의 집합을 의미한다. 또한, 배양된 세포는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 조직 시료의 비제한적인 예로 수술 시료, 생검 시료, 조직, 대변, 식물 조직, 곤충 조직 및 배양된 세포를 포함한다.
조직 출처에서 세포외 소포체를 분리할 때, 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 조직을 균질화(homogenization)한 다음, 세포외 소포체를 방출하기 위해 세포를 용해(lysis) 또는 분쇄(grind)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 세포외 소포체를 붕괴시키지 않는 균질화 및 용해/분쇄 절차를 선택하는 것이 중요하다.
본 발명에 있어서, 상기 염이 첨가된 시료의 배양은 임의의 시간 범위에서 수행될 수 있으며, 일반적으로 1초 내지 24시간, 더 일반적으로 5분 내지 12시간일 수 있다. 배양 시간은 다른 요인 중에서도 염의 농도, 배양 온도, 세포외 소포체 및 시료의 기타 구성 요소에 의해 영향을 받는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 염(salt) 및 완충액(buffer)을 포함하는 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV) 분리용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 염은 다가 음이온(polyvalent anion) 및 1가 양이온(monovalent cation)을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로, 상기 다가 음이온은 황산염(sulfate), 인산염(phosphate) 또는 시트르산염(citrate)이고, 상기 1가 양이온은 암모늄 이온(ammonium ion), 칼륨 이온(potassium ion) 또는 나트륨 이온(sodium ion)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 염은 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염은 고체 또는 액체의 형태인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 키트는 생물학적 유체 또는 생물학적 조직으로부터 세포외 소포체를 분리하기 위한 용도로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기 세포외 소포체 분리 방법에 기재된 내용과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 (i) 세포외 소포체의 표면에 노출된 표면 마커 또는 세포외 소포체 내부에 존재하는 단백질에 결합하는 항체 또는 리간드를 포함하는 용기; (ii) 세포외 소포체의 표면에 노출된 표면 마커 또는 세포외 소포체 내부에 존재하는 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합하는 하나 이상의 고체 지지체; 및/또는 (iii) 세포외 소포체의 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 수행할 수 있는 하나 이상의 염 및 완충액을 포함하는 용기;를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 표면 마커는 HLA DP 일배체형(haplotype), HLA DQ 일배체형, HLA DR 일배체형, CD9, CD81, CD63 및 CD82로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 고체 지지체는 레진(resin) 또는 비드(beads)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비드는 실리카(silica), 자성 입자(magnetic particle), 폴리스티렌(polystyrene) 또는 아가로스(agarose)인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: 재료 및 방법
실시예
1-1: 염 저장 용액(stock solution)의 준비
예를 들어, DI water에 포함된 2M 황산암모늄(ammonium sulfate; AS) 저장 용액 100mL는 50mL의 DI water에 30.9g의 AS를 용해하여 준비할 수 있다. pH를 원하는 값으로 조정한 다음, 추가 DI water를 사용하여 용액의 부피를 최대 100mL까지 만들 수 있다. DI water에 포함된 4M AS 저장 용액 100mL를 준비하려면, 40mL DI water에 75g의 AS를 첨가하고, 용액의 pH를 조정한 후 물을 추가하여 최종 부피를 100mL로 만든다. PBS 또는 기타 완충액 또는 NaCl을 포함하거나 포함하지 않는 1-4M AS를 포함하는 용액은 유사한 방식으로 제조될 수 있다. AS 저장 용액은 실온에서 장기간 보관될 수 있다.
실시예
1-2: 생물학적 유체 시료의 준비
시료를 저장고에서 꺼내 얼음 위에 놓는다. 생물학적 유체가 동결된 경우, 시료가 완전히 액체가 될 때까지 실온 또는 미지근한 물에서 천천히 해동시킬 수 있다. 시료는 필요할 때까지 얼음에 보관할 수 있다. 세포 파편을 제거하기 위해 시료를 30분 동안 2,000 xg에서 원심분리할 수 있다. 다음으로, 세포가 없는/파편이 없는(cell-free/debris-free) 시료를 포함하는 상층액을 새 용기로 옮기고 침전될 때까지 얼음에 보관할 수 있다. 세포외 소포체 침전을 위해, 100μl~1mL (또는 기타 적절한 부피)의 무세포 시료를 새 튜브로 옮기고 원하는 부피의 염 침전 시약과 결합시킬 수 있다.
예를 들어, 최종 농도 1M의 염을 얻기 위해 33μL의 4M 저장액을 100μL의 혈청에 첨가할 수 있다. 그 다음, 혈청/시약 혼합물이 균질한 용액이 될 때까지(용액이 탁해질 수 있음) 위아래로 볼텍싱하거나 피펫팅하여 잘 혼합할 수 있다. 이어서, 시료를 실온에서 0분 내지 2시간 동안 배양할 수 있다. 배양 후, 시료를 실온 또는 4℃에서, 2,000 xg 내지 15,000 xg로 5-30분 동안 원심분리할 수 있다. 상층액은 흡인하여 폐기한다. 세포외 소포체는 튜브 하단의 펠릿에 포함될 것이다. 상기 펠릿은 사용하기 편리한 부피의 인산염 완충 식염수(PBS) 버퍼, 예를 들어, 1000μL 혈청 투입시 100μL에서 재현탁될 수 있다. 펠릿을 재현탁하기 어려울 수 있으며, 이 경우 피펫 팁을 사용하여 용액에서 완전히 재현탁할 수 있다. 그렇지 않으면, 펠렛을 37℃에서 30분 동안 배양한 다음 볼텍싱할 수 있다. 펠릿을 재현탁하면 단기간으로는 4℃에서 또는 장기간으로는 -20℃에서 보관할 수 있다. 1-4M 최종 농도의 AS를 포함하는 용액(혈청 시료와 혼합된 경우)은 PBS 버퍼 또는 NaCl의 유무에 관계없이 유사한 방식으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 혈청 투입은 수 마이크로리터에서 수 밀리리터에 이른다.
실시예
1-3: 세포 배양 및 배양
상층액의
준비
ATCC에서 입수한 LNCaP 세포를 (1) 1% antibiotics/antimycotics가 보충된 Roswell Park Memorial Institute medium(RPMI, Gibco, Thermo Fisher Scientific), (2) 5% 소태아혈청(FBS) 및 1% antibiotics/antimycotics가 보충된 RPMI, (3) 5% Exo-Free FBS(ef-FBS, Systems Biosciences Inc, CA, USA) 및 1% antibiotics/antimycotics가 보충된 RPMI, (4) 0.1% ef-FBS 및 1% antibiotics/antimycotics가 보충된 Advanced RPMI(Gibco, Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. 상기 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 세포 배양 액은 배양 48시간 후 수집하고, 4℃에서 300g에서 10분 동안 원심분리하여 죽은 세포를 제거한 후, 15분 동안 2,000g에서 회전시켜 죽은 세포와 세포 파편을 완전히 제거하였다. 상층액은 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예
1-4: CD9-CD81 샌드위치 ELISA
모든 시료는 모든 비교 분석에서 동일한 투입 부피를 유지하도록 준비했다. 96-웰 플레이트(Corning Inc., NY, USA, cat#3590)를 50μL의 코팅 항체(PBS 버퍼 중 10μg/mL 항-CD9; MEM 61; Abcam, Cambridge, UK)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 1% 소혈청알부민(BSA)-PBS 버퍼로 블로킹하였다. 0.1% BSA-PBS 버퍼(세척 완충액)으로 세척한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(50μL) 중 세포외 소포체 용액과 함께 실온에서 2시간 동안 추가로 배양했다. 용액을 제거한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 2회 세척한 다음, PBS 버퍼(50μL; 500ng/mL) 중 비오틴-접합 2차 항체(항-CD81; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA, USA)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(50μL; 1:500) 중 HRP-접합 스트렙타비딘 용액과 함께 실온에서 30분 동안 배양한 다음, 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, TMB 용액(50μL)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양한 다음, 50μL의 정지액을 각 웰에 첨가하였다. 용액 흡광도는 450nm에서 플레이트 리더 분광광도계(TECAN, Morrisville, NC, USA)를 사용하여 측정하였다. 초기 시료를 이용하여 CD9-CD81 ELISA에 대한 표준 곡선을 그리고, EV 회수율(%)을 초기 시료에 대비하여 계산하였다.
실시예
1-5: 알부민 및
지질단백질
마커에
대한 샌드위치 ELISA
R&D systems에서 입수한 상용 duo sets인 Human Serum Albumin DuoSet ELISA(DY1455) 및 Human Apolipoprotein A-I/ApoA1 DuoSet(DY3664-05)를 제조사의 지침에 따라 각각 알부민 및 apo AI 분석에 사용하였다.
실시예
1-6:
ALIX
검출을 위한 직접 ELISA
세포외 소포체(EV)는 1% 단백질가수분해효소(proteinase) 억제제를 포함하는 RIPA 버퍼를 사용하여, 10분 간격으로 부드러운 와류(vortex)와 함께 얼음에서 30분 동안 용해되었다. PBS에 1:50으로 희석된 50μL 부피의 EV 용해물로 96-웰 플레이트(Corning Inc., NY, USA, cat#3590)의 각 웰을 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 1% 소혈청알부민(BSA)-PBS 버퍼로 블로킹하였다. 0.1% BSA-PBS 버퍼(세척 완충액)로 세척한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(50μL; 500ng/mL) 중 항-ALIX 항체(Abcam, Cambridge, UK)로 로딩하고, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 플레이트를 PBS 버퍼(50μL) 중 HRP-접합 검출 항체의 용액과 함께 실온에서 20분 동안 배양한 다음, 세척 완충액으로 3회 세척하였다. TMB 용액(50μL)을 첨가하고, 플레이트를 다시 실온에서 15분 동안 배양하였다. 그 다음, 50μL의 정지액을 각 웰에 첨가하였다. 용액 흡광도는 450nm에서 플레이트 리더 분광광도계를 사용하여 측정하였다.
실시예
1-7:
NanoSight
NS500 기기를 사용한
세포외
소포체의 정량(quantification) 및 크기 측정(sizing)
염 침전에 의해 생물학적 유체 시료로부터 정제된 세포외 소포체는 NS500 기기(Nanosight, Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정량 및 크기 측정되었다. 이미지 분석 NTA 소프트웨어를 사용하면 사용자가 개별적으로 나노 입자를 자동으로 추적하고 크기를 측정할 수 있다. 분리된 세포외 소포체 시료를 볼텍싱하고 200nm 필터로 여과된 PBS로 희석하여 NTA 시스템에서 권장되는 25-100 particles/frame을 얻었다. 모든 측정은 일관된 결과를 보장하기 위해 동일한 설정으로 수행하였다. 각 시료를 3회 분석하고 평균값을 플로팅하였다.
실시예
1-8: 투과전자현미경(transmission electron microscopy;
TEM
)
300-mesh formvar 및 탄소 코팅 구리 그리드(Electron Microscopy Science, PA)를 0.1% poly-L-lysine(Sigma-Aldrich)으로 실온에서 30분 동안 코팅한 다음, PBS 버퍼에서 적절하게 희석된 세포외 소포체 시료와 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그 다음, 그리드의 세포외 소포체를 4% paraformaldehyde 용액으로 실온에서 10분 동안 고정한 다음, 순차적으로 PBS 및 DI water로 세척하였다. 그리드를 Uranyless로 염색하고, JEM-2100 투과전자현미경(JEOL, Japan)으로 이미징하였다.
실시예
1-9:
RNA추출
및
역전사
중합효소 연쇄반응(RT-
qPCR
)
유전자 발현을 분석하기 위해 miRNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 LNEV(LNCaP배양액에서 얻는 EV)가 혼합된 혈장에서 다양한 방법으로 분리된 EV로부터 total RNA를 추출했다. cDNA는 SuperScript VILO cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 준비되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)은 유전자 발현 마스터 믹스 키트(Thermo Fisher Scientific) 및 Taqman 프로브와 QuantStudio 6 실시간 PCR 기기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다: 50℃에서 2분, 95℃ 10분 동안 반응하고, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초 동안 40 사이클을 반복한다. 모든 시료는 3회 반복으로 분석되었으며, 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시하였다.
실시예
2: 다단계 염 분별 침전법에 의한
세포외
소포체(EV)의 분리
생물학적 유체 시료에서 세포외 소포체를 분리하는 다단계 염 분리 침전 방법의 모식도를 도 1에 나타내었다.
본 실시예에서는, 1mL의 신선한 냉동 혈장을 생물학적 유체 시료로 사용했다. 혈장 시료를 증가하는 양의 황산암모늄(AS)과 함께 배양하고, 도 2에 나타난 바와 같이 F1 - F6 분획을 수집하였다. 각 분획은 EV 및 단백질 함량을 확인하기 위해 분석되었다. 다단계 염 분별 침전법(SP) 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(1) 생물학적 유체에 고체 AS를 추가하여 첫 번째 침전물(Fraction-1, F1)을 생성하는 단계, 여기서 용액의 AS 농도는 0.45M이다; (2) 실온에서 > 10000 xg의 원심분리에 의해 첫 번째 침전물을 분리하여 첫 번째 상층액을 생성하는 단계; (3) AS를 첫 번째 상층액에 첨가하여 두 번째 침전물(Fraction-2, F2)을 생성하는 단계, 이 때 용액 내 AS의 농도는 0.95M이다; (4) 두 번째 침전물을 분리하여 두 번째 상층액을 생성하고, AS의 농도가 F3, F4, F5 및 F6에서 각각 1.4, 1.9, 2.35 및 2.8M이 되도록 AS를 첨가하는 단계를 반복하고, 침전물을 모든 원하는 분획이 수집될 때까지 원심분리하는 단계. 이러한 단계의 조합을 “SP”라고 한다. 침전물 F1 내지 F6은 완충액에 재현탁시키고 원심여과 장치를 사용하여 탈염시킨다(도 2).
최종 상층액과 함께 이들 분획은 총 단백질 정량화를 위해 Bicinchonic acid 분석(BCA)에 의해 분석되었다; EV 표준 마커와 비 EV 마커를 모두 사용하여 EV의 정성 분석을 위한 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)을 수행하였다(도 3). 지단백질, Apo B, Apo E 및 Apo AI에 대한 마커는 모든 분획에서 서로 다른 수준으로 발현되었다(도 4).
분획의 내용물을 EV 및 비-EV 마커에 대한 ELISA로 평가한 결과, 대부분의 CD9-CD81 양성 EV는 F3 및 F4에서 발견되었으며, 대부분의 ALIX 포함 EV는 F3에 있었다(도 3). 알부민에 대한 ELISA는 대부분의 알부민이 이후 분획인 F5 및 F6에서 침전됨을 보여준다. 지질단백질에 대한 마커, Apo B, Apo E 및 Apo AI는 모든 분획에서 다른 수준으로 나타났으나 F5, F6에서 가장 높았다(도 4).
실시예
3: 3 단계
염 분별 침전법을 사용한 혈장으로부터
세포외
소포체(EV) 분리
실시예 2에 기재된 6 단계 염 분별 침전법에서, F3, F4에 회수된 EV를 하나의 분획으로 수집하고, 가능한 많은 단백질 불순물을 제거하기 위해 분획의 수를 3 단계로 줄여서 실험하였다. SP는 각각 1mL의 생물학적 유체 시료(신선 냉동 혈장)을 사용하여 고체 및 액체 AS로 수행되었다. 혈장에 고체 AS 또는 액체 AS의 포화 용액을 혼합한 후 결과 용액이 F1, F2 및 F3에 각각 0.75, 1.5 및 2.25M의 AS를 포함하는지 확인했다. 침전물과 상층액을 원심분리로 분리했다. AS 첨가 단계 및 원심분리에 의한 상층액으로부터의 침전물 분리 단계는 침전물의 3개 분획(F1-F3) 및 상층액이 수집될 때까지 계속되었다. EV 마커를 사용하여 ELISA로 EV 함량을 분석했다. CD9-CD81 및 ALIX 양성 EV의 대부분은 고체 및 액체 SP 방법의 F2 및 F3에서 발견되었다(도 5). 따라서, 고체 또는 액체 형태의 AS는 성능 차이 없이 SP에 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예
4: 확장성 평가
다른 부피의 혈장, 구체적으로는 0.4mL 및 4mL의 혈장으로부터 EV를 분리하기 위해 3 다단계 염 분별 침전을 수행하였다. 액체 염을 사용하였으며, 실시예 3에 설명된 방법을 이용하여 3개 침전물 분획과 상층액을 수집하였다. 두 시료에서 분리된 EV의 EV 마커 ELISA의 결과는 유사했으며, 대부분의 EV는 두 경우 모두 F2와 F3에서 확인되었다(도 6). 이는 소량의 부피 시료에만 적용 가능한 filtration 방법이나 size exclusion chromatography 방법과 달리, 다단계 염 침전 방법은 진단 목적의 소규모로도, 산업적 응용의 대규모로도 적용될 수 있음을 의미한다.
실시예
5: 2 단계
염 분별 침전법으로 혈장 시료에서 EV 분리
실시예 3에서 보여준 3 단계 염 분별 침전법에서 F2와 F3에 모인 EVs를 하나의 분획에서 모일 수 있도록 2 단계 SP에 의해 (1) 신선한 혈청 (2) 동결-해동된 혈청 (3) 신선한 혈장 및 (4) 동결-해동된 혈장 각각 1mL로부터 하나의 분획(F2)으로 농축했다. 혈장의 주요 성분에는 피브리노겐, 글로불린 및 알부민이 포함된다. 피브리노겐은 0.85M AS에서, 글로불린은 ~1.5M AS에서 침전되는 것으로 알려져 있으며 알부민은 ≥2.5M AS에서 침전된다. 따라서, 본 2 단계 염 분별 침전법에서는 피브리노겐과 알부민은 선택적으로 제거되었고 대부분의 EV는 F2에 수집되었다. 첫 번째 단계에서 0.85~1.0M AS를 추가하여 피브리노겐을 제거하고 EV는 1.8~2M 농도의 AS에서 수집한 반면 알부민은 상층액에 남아있었다. 혈청과 혈장 시료 사이에는 큰 차이가 없었다. 유사하게, 신선하고 동결 해동된 시료에서 분리된 EV에서 차이가 관찰되지 않았다(도 7). 침전물과 상층액은 BCA, ELISA, NTA에 의해 EV 함량에 대해 분석되었다. EV 마커는 모든 시료의 F2에서 높게 보여주었다.
실시예
6: 2 단계
염 침전(
SP
) 및 기타 상용화된 방법에 의한
세포외
소포체(EV) 회수 비교
2 단계 SP를 사용하여 1mL의 혈장으로부터 EV를 분리하였다. 1mL 혈장으로부터 ExoQuick plasma 키트(EQ; Systems Biosciences)를 사용하고, 1mL 혈장으로부터 exoEasy 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. Fraction-2의 EV를 BCA, EV 마커에 대한 ELISA 및 NTA에 의한 입자 수로 특징지었다. 그 결과, SP 방법은 9.25 X 1011 ± 8.46 X 1010 particles/mL의 회수로 가장 많은 양의 EV를 분리했으며, 6.7 X 1011 ± 1 X 1010 particles/mL의 회수를 나타낸 EQ와 비교할 때, 상대적으로 적은 총 단백질 양과 유사한 EV 회수율(%)을 나타냈다. ExoEasy는 상대적으로 적은 수의 1.05 X 1010 ± 1.44 X 109 입자로, 총 단백질 양이 가장 적고 낮은 EV 회수율(%)을 나타냈다(도 8 및 도 9).
투과전자현미경 이미지에 따르면 세 방법 모두에서 형태학적으로(morphologically) 유사한 소포체를 나타냈지만, exoEasy 키트의 입자 크기는 SP 및 EQ에 비해 작은 것으로 보인다(도 10).
실시예
7: 돼지 혈장으로부터
세포외
소포체(EV)의 분리
LNCaP 세포 유래 EV를 포함하는 1mL의 돼지 혈장으로부터 EV를 분리하였다. 2 단계 염 분별 침전을 사용하였으며, 분획은 BCA 및 LNCaP EV 마커에 대한 ELISA 분석을 이용하여 EV 함량에 대해 분석되었다(도 11). EV는 염 침전의 제1 및 제2 분획에서 분리되었다. 이는 염 침전 방법이 사람혈액 또는 돼지 혈액 등 다양한 생물학적 유체 시료에서 EV를 분리하는 데 적용될 수 있음을 의미한다.
실시예
8:
황산암모늄에
의한
1 단계
염 침전법에 의한 EV 분리
도 12는 다단계 염 분리의 가장 간단한 형태인, 1 단계로 염 분리를 하는 경우를 예시로 도식화한 것이다.
(1) 무 혈청 LNCaP 배양액(LN-CM) (2) 5% FBS를 포함하는 LN-CM (3) 5% ef-FBS를 포함하는 LN-CM 및 (4) 단일 단계 침전 방법을 사용하여 advanced RPMI에서 0.1% ef-FBS를 포함하는 LN-CM으로부터 먼저 EV 분리를 위한 최적 AS 농도를 찾는 실험을 수행하였다. AS의 포화 용액은 혼합 후 1.5, 1.75, 2 및 2.5M의 최종 농도가 되도록 각 LN-CM 1mL에 첨가되었다. 내용물은 튜브를 5~6회 뒤집어 혼합하고 분리된 침전물은 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 수집하였다. 수집된 EV는 CD9-CD81 샌드위치 ELISA로 평가하였다(도 13). 모든 시료에서 나온 대부분의 EV는 배지에 존재하는 FBS의 양에 관계없이 1.75-2M의 최종 농도에서 분리되었다. 또한 2M AS 농도에서 분리된 EV는 BCA, ELISA, NTA 및 TEM으로 분석했다. FBS에서 오염되는 단백질이나 다른 입자가 부족하기 때문에, 무 혈청 배지에서 얻은 EV의 단백질 양과 총 입자 수가 가장 낮았다. EVs의 회수율은 테스트된 4개 시료 모두에서 90%였다(도 14 내지 도 16). 결과적으로, 1.75~2M의 AS 농도를 사용한 1 단계 염 분리 침전법의 경우 사용한 배지 종류에 크게 관계없이 침전물에 대부분의 (90% 이상) EV가 존재함을 알 수 있었다.
실시예
9:
황산암모늄과
아세트산 나트륨에
의한 EV 회수율 비교
기존 보고된 프로토콜(J. Immunol. Met., 2014, 407, 120)에 따라 황산암모늄 및 아세트산 나트륨을 사용하여 5% ef-FBS를 포함하는 LN-CM의 각각 1mL에서 EV를 분리했다. 황산암모늄을 사용한 EV 분리의 경우 LN-CM을 최종 농도 1.8M의 AS 포화 용액과 혼합했다. 두 방법에서 얻은 EV는 BCA, EV 마커의 경우 ELISA 및 NTA의 입자 수로 특성화되었다. 그 결과, 4.85 X 109 ± 5.7 X 108 particles/mL 및 4% EV 회수율을 산출한 아세트산 나트륨 방법에 비해 황산암모늄 방법은 2.8 X 1010 ± 3.06 X 108 particles/mL의 회수율 및 >95% EV 회수율로 훨씬 많은 양의 EV를 분리했다(도 17).
실시예
10:
황산암모늄에
의한 소변에서 EV 분리
AS의 포화 용액을 최종 농도 2M이 되도록 소변 1mL에 첨가하고 단일 단계 염 분리 침전법으로 EV를 분리하였다. 튜브의 내용물을 뒤집어 혼합하고 즉시 10,000xg에서 10분 동안 원심 분리하여 침전물을 분리했다. 침전물 및 상층액은 총 단백질 정량을 위한 BCA 분석 및 EV 마커에 대한 ELISA로 특성화되었다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 2M AS 농도에서 80% 이상 대부분의 EV가 회수되었다.
실시예
11:
황산암모늄에
의한 혈장 및 혈청에서 EV 분리
AS의 포화 용액은 2M의 최종 농도에서 각각의 혈장 및 혈청 1mL에 첨가되었다. 튜브를 여러 번 뒤집어 내용물을 혼합하고 침전물은 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 수집하였다. 침전물과 상층액은 EV 마커에 대한 총 단백질 정량 및 ELISA로 특성화되었다. 그 결과, 2M AS 농도에서 대부분의 EV가 많은 단백질과 함께 회수되었다(도 19). 혈장 및 혈청의 단백질은 단백질의 전하, 크기 및 모양에 따라 선택적으로 분류될 수 있다.
혈장, 혈청 등 시료의 종류에 관계없이 1 단계 염 침전으로도 90% 이상의 EV 회수율을 나타냈다. 많은 양의 불순물 단백질이 함께 분리되지만, 최종 검출하고자 하는 물질이 EV로부터 나오는 핵산인 경우에는 다시 핵산 분리 과정을 갖기 때문에, EV 회수율이 현저하게 증가된 본 방법을 이용하여 효율적으로 목적 물질을 검출할 수 있다.
실시예
12: 염 침전 방법으로 분리된
MDA
-MB231 EV의 상처 치유(scratch wound healing) 촉진 효과 확인
EV는 각 방법, SP 및 UC 마다 50mL의 MDA-MB231 배양액에서 분리되었다. 스크래치 상처 치유 분석을 위해 MDA-MB231 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 100,000개 세포의 밀도로 넣었다. 세포를 단층으로 성장시키고 웰의 중앙에 스크래치 상처를 만들었다. 웰을 여러 번 세척하여 부유 세포를 제거하고 세포를 웰당 0, 5, 10 및 20μg/mL(BCA 총 단백질 분석으로 측정) 농도에서 SP 및 UC로 분리된 EV로 처리했다. 상처는 JuLI Stage Real-time live cell 이미징 시스템으로 4x 배율로 4시간 간격으로 최대 20시간까지 촬영하였다.
배양액 처리시 상처 봉합의 대표적인 이미지, UC로 분리된 EV 및 SP로 분리된 EV는 도 20A에 표시되어 있다. 상처 봉합률은 EV 양에 따라 달라졌고 20μg/mL 농도에서 더 높았다(도 20B). 염 침전에서 준비한 EV는 초원심분리에서 준비한 EV에 비해 스크래치 상처 봉합을 크게 촉진했다. 이는 염 침전 방법으로 준비된 EV가 기능적 활동을 유지함을 시사한다.
실시예
13:
황산암모늄
및
기타 다른
방법으로 분리된 EV에서 RNA 회수율 비교
생물학적 유체 시료에서 EV의 효율적 분리에 대한 황산암모늄 방법과 기타 다른 방법을 비교하기 위해, 초원심분리(UC), exoEasy 키트(Qiagen) 및 Norgen 엑소좀 정제 키트와 같은 다른 방법과 함께 평가되었다. LN-CM에서 EV로 스파이킹된 1mL의 혈장을 각 방법별로 사용했다. EV 분리 전에 시료를 Proteinase-K(P-K)로 처리하거나 처리하지 않았다.
초원심분리(UC)에 의한 EV의 분리를 위해 표준 초원심분리 공정이 사용되었다. 혈장은 TLA 120.2 Ti 고정 각 로터(Beckman Coulter) 및 1.2mL 폴리카보네이트 초원심분리 튜브를 사용하여 4℃에서 90분 동안 120,000xg의 Beckman Coulter Ultracentrifuge에서 원심분리하여 EV를 펠렛화했다. 단백질 오염 물질을 제거하기 위해 상층액을 조심스럽게 제거하고 EV 펠릿을 PBS에 재현탁하고 4℃에서 90분 동안 120,000xg에서 다시 원심분리했다. 상층액을 제거하고 생성된 EV 펠릿을 원하는 부피의 PBS에 재현탁하여 추가 분석을 용이하게 했다. 상업용 키트(Qiagen 및 Norgen)를 사용한 EV 분리는 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. AS에 의한 EV 분리의 경우 단일 단계 침전(SP)을 사용하고 탈염 후 얻은 EV를 RNA 추출에 사용했다.
EV 마커(CD9 및 ALIX)와 암 마커(PSA 및 PSMA)의 상대적 발현을 플롯 팅하였다(도 21). SP 방법은 위의 테스트 방법과 비교했을 때 P-K 처리 및 미처리 시료 모두에서 모든 마커에 대해 가장 높은 발현을 나타냈다.
도 22에는 상기 실시예에서 보여준 다양한 단계의 SP 방법을 활용하여 혈장에서 분리한 EV의 회수율과 순도를 함께 비교하였다. 단계 수를 증가시키면 유사한 회수율을 확보하고도 분리된 EV의 순도를 향상시킬 수 있음을 보여준다. 상기 실시예 들에서 보여준 바와 같이 다양한 시료 종류와 원하는 수율과 순도, 사용 편이성 등 필요에 따라 다양한 단계의 SP 방법을 EV 분리에 사용할 수 있다. 예를 들어 도 9, 도 21, 도 22에 나타낸 것처럼 다양한 단계의 SP 방법 모두 다른 EV 분리 방법에 비하여 80% 이상의 매우 우수한 회수율을 확보하고 있으며, SP 법의 단계를 증가시키면 보다 순도가 높은 EVs를 분리 농축해낼 수 있다.
실시예
13: 다양한 종류의 염에 의한 EV 분리
단백질 염석(salting-out)은 다양한 유형의 중성 염에서 발생할 수 있다. 염은 물과 상호작용하여 단백질(또는 EV) 용매화에 사용할 수 있는 물 분자의 수를 줄인다. 그 결과, 단백질(또는 EV) 상호작용이 증가하여 단백질(또는 EV) 응집 및 침전이 발생한다.
다양한 염의 염석 능력을 테스트하였다(표 1). 호프마이스터 계열(Hofmeister series)에서 높은 이온을 생성하는 염이 사용되었다(도 23). 각각의 염에 대해 4M 용액 또는 포화 용액을 제조하였으며, 4M 용액이 포화 용액이 아닌 염에 대해 4M 및 포화 용액 모두를 준비하였다(표 1).
| Salt solution | Mol . Formula | Mol . Wt |
Solubility
at RT(g)/L |
Wt(g)/25mL |
Saturated
solution? |
pH | |
| 1 | Saturated ammonium sulfate | (NH4)2SO4 | 132 | 750 | 18.8 | O | 5.6 |
| 2 | Saturated ammonium phosphate, dibasic | (NH4)2HPO4 | 132 | 600 | 15 | O | 8.0 |
| 3 | 4M Ammonium chloride | NH4Cl | 53 | 383 | 5.4 | X | 4.3 |
| 4 | Saturated ammonium chloride | 9.6 | O | 4.1 | |||
| 5 | 4M Ammonium Acetate | CH3COONH4 | 77 | 1430 | 7.7 | X | 7.6 |
| 6 | Saturated ammonium Acetate | 35.8 | O | 8.2 | |||
| 7 | Saturated potassium sulfate | K2SO4 | 174 | 120 | 4 | O | 6.0 |
| 8 | 4M Potassium(di) phosphate | K2HPO4 | 174 | 1493 | 17.4 | X | 9.1 |
| 9 | Saturated potassium(di) phosphate | 37.4 | O | 9.7 | |||
| 10 | Saturated potassium chloride | KCl | 75 | 340 | 8.5 | O | 4.6 |
| 11 | 4M Potassium acetate | CH3COOK | 98 | 2686 | 9.8 | X | 8.8 |
| 12 | Saturated potassium acetate | 67.2 | O | 10.2 | |||
| 13 | Saturated sodium sulfate | Na2SO4 | 142 | 281 | 7 | O | 5.2 |
| 14 | Saturated sodium(di) phosphate | Na2HPO4.12H2O | 358 | 118 | 3 | O | 8.8 |
| 15 | 4M Sodium chloride | NaCl | 58 | 360 | 5.84 | X | 4.8 |
| 16 | Saturated sodium chloride | 9 | O | 5.8 | |||
| 17 | 4M Sodium acetate | CH3COONa | 82 | 464 | 8.20 | X | 9.1 |
| 18 | Saturated sodium acetate | 11.6 | O | 9.0 | |||
| 19 | Saturated trisodium citrate | Na3C6H5O7.2H2O | 294 | Sat solution | O | 8.0 | |
| 20 | Saturated magnesium sulfate | MgSO4.7H2O | 246 | 1130 | 28.3 | O | 6.2 |
EV는 실온에서 동일한 부피의 세포 조정배지 및 염 용액을 30분 동안 배양한 다음, 10,000g에서 15분 원심분리하여 분리되었다. 그 다음, PBS 완충액에 재현탁된 펠릿을 여과에 의해 탈염하였다.
CD81-CD9 샌드위치 ELISA를 이용하여 EV 회수율을 계산하였다(도 24). 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 황산나트륨(sodium sulfate), 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)과 같은 다가 음이온(polyvalent anion) 및 1가 양이온(monovalent cation)을 함유하는 염은 침전을 선호하고, 테스트된 염 중에서 가장 높은 회수율을 나타냈다. 그러나, 황산칼륨(potassium sulfate) 및 인산나트륨(sodium phosphate)과 같은 염은 물에 대한 용해도가 낮기 때문에 단백질을 침전시키지 않았다. 또한, 1가 음이온을 갖는 염(예: 염화물 및 아세테이트) 및 다가 양이온을 갖는 염(예: 황산마그네슘(magnesium sulfate))은 포화 상태에서도 모든 EV를 침전시키지 않았다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (30)
- 다음을 포함하는 생물학적 유체 시료(biological-fluid sample)로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법:
(a) 생물학적 유체 시료에 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 염(salt)을 첨가하는 단계;
(b) 상기 염이 첨가된 시료로부터 응집 또는 침전된 세포외 소포체 분획과 상층액을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 분리된 세포외 소포체 분획을 탈염(desalting)하여 세포외 소포체를 분리하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 염을 1회 내지 15회 첨가하여 최종 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 염이 첨가된 시료의 농도가 1.4M 내지 2.25M인 시료로부터 분리된 세포외 소포체 분획으로부터 세포외 소포체를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 염은 다가 음이온(polyvalent anion) 및 1가 양이온(monovalent cation)을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 다가 음이온은 황산염(sulfate), 인산염(phosphate) 또는 시트르산염(citrate)이고, 상기 1가 양이온은 암모늄 이온(ammonium ion), 칼륨 이온(potassium ion) 또는 나트륨 이온(sodium ion)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 염은 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 염은 고체 또는 액체의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 침강, 여과 또는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 탈염은 여과(filtration), 원심분리(centrifugation), 투석(dialysis), 역삼투(reverse osmosis) 또는 탈염 컬럼(desalting column)을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 분획에 대해 한외여과(ultrafiltration) 단계, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 단계 또는 밀도 구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation) 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 유체는 혈청, 혈장, 전혈, 소변, 타액, 모유, 눈물, 땀, 관절액, 뇌척수액, 정액, 질액, 객담, 흉수, 림프액, 복수, 양수, 기관지 세척액 및 배양된 세포에서 채취한 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음을 포함하는 생물학적 조직 시료(biological tissue sample)로부터 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분리하는 방법:
(a) 생물학적 조직 시료를 용해(lysing) 또는 분쇄(grinding)하고 정제(clarifying)하는 단계;
(b) 상기 정제된 시료에 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 염(salt)을 첨가하는 단계;
(c) 상기 염을 첨가한 시료로부터 응집 또는 침전된 세포외 소포체 분획과 상층액을 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 분리된 세포외 소포체 분획을 탈염(desalting)하여 세포외 소포체를 분리하는 단계.
- 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계는 염을 1회 내지 15회 첨가하여 최종 농도가 0.1M 내지 포화농도가 되도록 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 (d) 단계는 염이 첨가된 시료의 농도가 1.4M 내지 2.25M인 시료로부터 분리된 세포외 소포체 분획으로부터 세포외 소포체를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 염은 다가 음이온(polyvalent anion) 및 1가 양이온(monovalent cation)을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 다가 음이온은 황산염(sulfate), 인산염(phosphate) 또는 시트르산염(citrate)이고, 상기 1가 양이온은 암모늄 이온(ammonium ion), 칼륨 이온(potassium ion) 또는 나트륨 이온(sodium ion)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 염은 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 염은 고체 또는 액체의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 (c) 단계는 침강, 여과 또는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 탈염은 여과(filtration), 원심분리(centrifugation), 투석(dialysis), 역삼투(reverse osmosis) 또는 탈염 컬럼(desalting column)을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 세포외 소포체 분획에 대해 한외여과(ultrafiltration) 단계, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 단계 또는 밀도 구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation) 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 생물학적 조직은 원핵생물, 진핵생물, 박테리아, 진균, 효모, 무척추동물, 척추동물, 파충류, 어류, 곤충, 식물 또는 동물로부터 유래된 세포의 집합 및 배양된 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 염(salt) 및 완충액(buffer)을 포함하는 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV) 분리용 키트.
- 제23항에 있어서, 상기 염은 다가 음이온(polyvalent anion) 및 1가 양이온(monovalent cation)을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제24항에 있어서, 상기 다가 음이온은 황산염(sulfate), 인산염(phosphate) 또는 시트르산염(citrate)이고, 상기 1가 양이온은 암모늄 이온(ammonium ion), 칼륨 이온(potassium ion) 또는 나트륨 이온(sodium ion)인 인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제24항에 있어서, 상기 염은 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 황산나트륨(sodium sulfate) 또는 시트르산삼나트륨(trisodium citrate)인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제23항에 있어서, (i) 세포외 소포체의 표면에 노출된 표면 마커 또는 세포외 소포체 내부에 존재하는 단백질에 결합하는 항체 또는 리간드를 포함하는 용기; (ii) 세포외 소포체의 표면에 노출된 표면 마커 또는 세포외 소포체 내부에 존재하는 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합하는 하나 이상의 고체 지지체; 및/또는 (iii) 세포외 소포체의 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 수행할 수 있는 하나 이상의 염 및 완충액을 포함하는 용기;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제27항에 있어서, 상기 표면 마커는 HLA DP 일배체형(haplotype), HLA DQ 일배체형, HLA DR 일배체형, CD9, CD81, CD63 및 CD82로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제27항에 있어서, 상기 고체 지지체는 레진(resin) 또는 비드(beads)인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제29항에 있어서, 상기 비드는 실리카(silica), 자성 입자(magnetic particle), 폴리스티렌(polystyrene) 또는 아가로스(agarose)인 것을 특징으로 하는 키트.
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