JP2019518428A - 体液試料からの細胞外小胞（ｅｖ）の単離 - Google Patents

Abstract

本発明は、体液試料から細胞外小胞（ＥＶ）を単離する組成物および方法に関する。本発明の組成物および方法は、ポリカチオンと細胞外マトリックス形成ポリマーとの組合せに基づいている。細胞外小胞（ＥＶ）は、血液、血清、血漿、唾液、尿もしくは脳脊髄液のような体液、または成熟幹細胞培養のような細胞培養の馴化培地から単離される。本発明の単離方法および組成物の使用は、より高いＥＶ回収、エキソソームにおける濃縮、簡便性、費用効果、およびそれらの生物活性をインビトロで保持するＥＶの単離をもたらす。

Description

本発明は、体液試料からの細胞外小胞（ＥＶ）の単離方法および体液試料から細胞外小胞（ＥＶ）を沈殿させる組成物に関する。

小胞が媒介する細胞間の情報伝達は、多くの生物学的プロセスにおいて重要であると思われる。細胞から放出された小型の小胞は、最近、細胞間情報伝達の重要なメディエーターとして浮上している。細胞外小胞（ＥＶ）と命名されたこれらの小胞は、エンドソームの細胞膜コンパートメントから放出されたエキソソーム、および細胞膜出芽によって細胞表面から放出された微小胞を含む。ＥＶに含有されるタンパク質、脂質および核酸は、起源の細胞によって異なり、レシピエント細胞に取り込まれた後、レシピエント細胞の表現型および機能を変化させる情報を伝達する場合がある。
生物活性および分子成分に基づいて、生理学的および病理学的状態におけるＥＶの役割を扱ったいくつかの研究がなされている。さらに、ＥＶは起源細胞の特徴を保持し、すべての体液中に存在するため、異なる病理学的状態における診断薬としてのそれらの潜在的使用が示唆されている。

根本的な問題は、生物学的機能を研究するために培養細胞から、または診断目的のために体液から、ＥＶをどのように単離するかである。細胞培養に高頻度に用いられるウシ胎仔血清はＥＶに富んでいるので、インビトロ実験では、ＥＶ枯渇血清の使用が必要である。一方、体液からのＥＶの単離は、異なる細胞起源のＥＶの同時存在による複雑さに直面している。したがって、潜在的バイオマーカーを同定するために、プロテオームまたはゲノム分析により、ＥＶ分子発現または含有物に基づいて細胞起源を識別することが重要である。遠心分離による細胞破片の除去後、３つの主要な方法、すなわちスクロース勾配の非存在下または存在下における分画超遠心分離法、サイズ排除クロマトグラフィおよび免疫アフィニティがＥＶの単離のために従来から使用されている。これらの方法はすべて、異なるＥＶ集団間を識別する可能性に主に関連したいくつかの利点と、生物活性の喪失を伴った精製の過程で小胞を損傷する危険性、十分に多量の試料の必要性、および単離効率に関連した懸念を有する。
さらに、主に、含有されるＲＮＡおよびタンパク質の評価に焦点を当てた代替方法として、ＥＶのポリマー沈殿が示唆されている。ポリマー沈殿法は、６０〜１８０ｎｍの範囲のサイズのＥＶを包埋したメッシュ状ネットの形成に基づいている。そのような方法は、培養培地または体液のいずれかに適用される場合がある。特に、ポリマー沈殿法は、少量の生物試料に由来する小胞中のバイオマーカーの検出に利点がある場合がある。

現在、ＥＶ精製の「ゴールドスタンダード」方法は、分画超遠心分離法または密度勾配超遠心分離法である。しかし、これらの方法は、溶液の粘性、ローターのタイプ、遠心半径およびｇ力のような標準化が困難ないくつかのパラメータの影響を受ける。さらに、長時間の高速超遠心分離後に、ＥＶの完全性が損なわれる可能性がある。実際に、膜破片が電子顕微鏡で観察され、ＲＮＡおよびエキソソームタンパク質の回収が困難であることが報告されている。
ＥＶ精製についての他のいくつかの方法が研究されている。サイズ排除クロマトグラフィは、この方法ではＥＶがせん断応力を受けないので、ＥＶの完全性を維持する点で超遠心分離に対して利点を有する場合がある。適切な細孔を有する膜を用いた濾過でも代替されるが、いくつかの小さな混入物質の除去を保証するものではなく、膜に結合することによるＥＶの損失を回避するものでもない。免疫アフィニティ精製は、カーゴの完全性を維持しながら特定のエキソソーム亜型を単離する場合がある。
これらの技術の大部分の限界は、少量の生物試料から出発して十分な量のＥＶを回収する効率である。

ＥＶを捕捉するＰＥＧの能力に基づくポリマー沈殿技術は、生物試料からＥＶを単離する迅速な方法であることが示されている。この技術は、ＰＥＧがウイルス沈殿を可能にするという観察によって開発され、分子量８０００ＤａのＰＥＧの使用に基づくいくつかの製品が市販されている。
ＵＳ９，００５，８８８は、４００〜８，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の少なくとも１種を含む沈殿溶液の使用によって、液体試料から細胞分泌微小胞を単離する方法を開示する。
ＷＯ２０１３／１８８８３２は、約８，０００ダルトンまたは約１０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の少なくとも１種を含む沈殿溶液の使用によって、液体試料から細胞分泌微小胞を単離する方法を開示する。
ＵＳ８，９０１，２８４は、ポリエチレングリコール、デキストラン、デキストラン硫酸、デキストラン酢酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、またはポリ硫酸ビニルのような体積排除ポリマーの使用によって、体液試料からエキソソームを単離する方法を開示する。

先行技術の欠点、特に上述の先行技術の方法が複雑であり高価であること、ＥＶ回収の効率が低いこと、単離されたＥＶにおける混入物質の存在の可能性およびＥＶ膜の損傷の危険性を克服するために、本発明は、添付の請求項１に記載の、体液試料からＥＶを単離する方法を提供する。
さらに本発明の方法の特徴および長所は、従属請求項に記載されている。
また、添付の請求項１３に記載の沈殿組成物は本発明の範囲内にあり、本発明の単離方法における使用に適している。

図１Ａは、血清又はＨＬＳＣを様々な用量のプロタミンと共にインキュベートした後、回収したＥＶを示す。図１Ｂ〜図１Ｄは、超遠心分離（ＵＣ）またはＰ／ＰＥＧ、ＰＥＧ単独およびプロタミン単独での沈殿後の血清（図１Ｂ）、唾液（図１Ｃ）およびＨＬＳＣ（図１Ｄ）の無細胞上清からのＥＶ回収のＮＴＡによる比較を示す。 図２は、ＵＣまたはＰ／ＰＥＧでの沈殿後の、血清、唾液およびＨＬＳＣ由来のＥＶの顕微鏡写真（図２Ａ）、超遠心分離によって得られたＥＶについて、Ｐ／ＰＥＧによって血清、唾液およびＨＬＳＣから沈殿したＥＶのウエスタンブロット分析により、ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１エキソソームマーカーが発現したこと（図２Ｂ）を示す。 図３は、超遠心分離およびＰ／ＰＥＧ沈殿によって得られたＥＶにおけるＡｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａ１の存在をウエスタンブロットによる評価（図３Ａ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００によるゲル濾過により、ＥＶ調製物からＡｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａ１が除去されたこと（図３Ｂ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００の予備吸収後に抽出されたＲＮＡの量が、血清中および唾液中の両方で減少したこと（図３Ｃ）、血清ＥＶ中に存在する代表的なｍＲＮＡの約２サイクルの減少を示したこと（図３Ｄ）を示す。 図４は、Ｐ／ＰＥＧ沈殿によって調製したＥＶから抽出したＲＮＡと超遠心分離によって調製したＥＶから抽出したＲＮＡとの比較（図４Ａ）、超遠心分離および沈殿によって得られたＥＶにおけるｍｉＲ１９１の代表的な増幅プロット（図４Ｂ）、ｍｉＲ１６について、同等な量の選択されたｍＲＮＡが、超遠心分離またはＰ／ＰＥＧ沈殿のいずれかによって精製された血清、唾液およびＨＬＳＣ由来のＥＶにおいて検出されたこと（図４Ｃ）、ｍｉＲ１９１について、同等な量の選択されたｍＲＮＡが、超遠心分離またはＰ／ＰＥＧ沈殿のいずれかによって精製された血清、唾液およびＨＬＳＣ由来のＥＶにおいて検出されたこと（図４Ｄ）を示す。 図５は、唾液ＥＶの生物活性を試験するために、ヒトＨａＣａＴ角化細胞を用いてインビトロ創傷閉鎖アッセイを行ったところ、Ｐ／ＰＥＧによって得られた唾液ＥＶが、ＥＧＦと同等な有意な創傷閉鎖を誘導したこと（図５Ａ〜Ｅ）、尿細管上皮細胞のインビトロ増殖を行ったところ、沈殿および超遠心分離したＥＶの両方が、細胞増殖を有意に増加させることができたこと（図５Ｆ）を示す。

本発明の細胞外小胞（ＥＶ）を単離する方法は、ＥＶは負荷電を示し、正荷電分子と相互作用することができるという研究結果から得られる。
本研究結果に基づいて、本発明者らは、ポリマーマトリックス中の正に荷電したプロタミンの存在下で体液および細胞培養馴化培地からＥＶを沈殿させ、回収された小胞の数の収率、ＲＮＡ抽出の効率、エキソソームタンパク質の発現および生物活性に関して、超遠心分離のものと効率を比較した。

驚いたことに、プロタミンは、超遠心分離を必要とせずにＥＶ沈殿を誘導することが見出された。さらに、プロタミン（Ｐ）沈殿が細胞外マトリックス形成ポリマーの存在下で行われた場合、ＥＶ再懸濁が促進された。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析によって評価された沈殿したＥＶの回収は、超遠心分離によって得られたものより、より効率的であった。電子顕微鏡により、ＥＶのサイズは、２つの方法で類似しており、本発明の方法に従って単離されたＥＶにおけるＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１エキソソームマーカーの発現は、エキソソームの濃縮を示した。本発明の方法に従って単離されたＥＶのＲＮＡ回収は、超遠心分離によって単離されたＥＶのものと類似していた。さらに、本発明の方法に従って単離されたＥＶは、角化細胞による創傷閉鎖および尿細管上皮細胞の増殖の誘導において見られたように、インビトロの生物活性を保持した。要約すると、本発明の方法によるＥＶの単離は、簡便性の利点を有し、高価な装置の必要性を回避し、少量の生物試料からのＥＶの効率的な単離に使用される。

本発明に従って体液試料から細胞外小胞（ＥＶ）を単離する方法は、体液試料をポリカチオン物質および細胞外マトリックス形成ポリマーと混合するステップ、得られた混合物をインキュベートし、それによってＥＶを沈殿させるステップ、および混合物から沈殿したＥＶを分離するステップを含む。
ポリカチオン物質は、複数の場所で正荷電を有するポリマー分子である。ＥＶは負に帯電しており、ポリカチオンはそれらを凝集させるという事実のために、任意のポリカチオン物質が本発明の方法で使用される。好ましいポリカチオン物質は、０．５〜５０ｋＤａの分子量および／または２〜２０ｍＶの正のゼータ電位を有する。

プロタミンは、好ましくは塩の形状であり、臨床用途に適しているのでより好ましい。プロタミンの最も好ましい形状は、プロタミン塩化物または塩酸塩である。プロタミンの適した代替物は、例えば、好ましくは塩酸塩のような塩の形状のポリリジンまたはＤＥＡＥデキストランのようなカチオン性デキストランである。
ポリカチオン物質、好ましくはプロタミンの塩は、好ましくは細胞外マトリックス形成ポリマーおよび体液試料と混合され、混合物中で０．０２〜２ｍｇ／ｍｌの濃度になる。

本発明の方法での使用に適した細胞外マトリックス形成ポリマーは、任意のポリマー物質であり、体液試料に含まれるＥＶを包埋したメッシュ状ネットを形成することができる。好ましくは、細胞外マトリックス形成ポリマーはハイドロゲルである。ハイドロゲル形成天然ポリマーは、コラーゲンおよびゼラチンのようなタンパク質、ならびにデンプン、アルギン酸塩およびアガロースのような多糖を含む。ハイドロゲルを形成する合成ポリマーは、化学的重合方法を用いて伝統的に調製される。より好ましくは、細胞外マトリックス形成ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、デキストラン硫酸、デキストラン酢酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、またはポリ硫酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｙｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される。４〜１００ｋＤａの範囲内に含まれる平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、好ましい細胞外マトリックス形成ポリマーである。より好ましくは、１０〜５０ｋＤａの範囲内に含まれる、さらにいっそう好ましくは約３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧが本発明の方法で用いられる。

本発明の方法で使用する、好ましいポリカチオン物質／細胞外マトリックス形成ポリマーの組の例は、
（ｉ）プロタミン（Ｐ）＋ＰＥＧ、
（ｉｉ）ポリ−Ｌ−リジン＋ＰＥＧ、
（ｉｉｉ）ポリ−Ｌ−リジン＋デキストラン硫酸、
（ｉｖ）ＤＥＡＥデキストラン＋ＰＥＧ、である。
これらのポリカチオン物質／細胞外マトリックス形成ポリマーの組のすべてを実験的に試験し、血清試料からのＥＶの沈殿に効果的であることが証明された（実施例を参照）。
本発明の方法の好ましい実施形態によれば、細胞外マトリックス形成ポリマーは、ポリカチオン物質および体液試料と混合され、混合物中で０．０１〜０．２ｇ／ｍｌの濃度になる。
混合物から沈殿したＥＶを分離するために、ＥＶ膜の完全性を破壊する危険性を防止する可能性がある任意の分離技術を使用してよい。好ましい方法は、好ましくは１０００〜５００００ｇ、より好ましくは１０００〜１００００ｇ、さらにいっそう好ましくは１０００〜５０００ｇの範囲内に含まれる速度の遠心分離である。

以下の実験例により詳細に示すように、本発明者らは、体液（血清および唾液）ならびに細胞培養馴化培地（ＨＬＳＣ）の両者からＥＶを単離するために、本発明の方法を用いた。その結果、本発明の方法を、例えば血液、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、または細胞培養馴化培地、好ましくは成熟幹細胞培養馴化培地、より好ましくは間葉系幹細胞培養馴化培地もしくは肝臓多能性前駆細胞培養馴化培地のような任意の体液または細胞培養馴化培地からＥＶを単離するために使用することができる。
本発明の範囲は、体液試料から細胞外小胞（ＥＶ）を沈殿させる組成物も含み、本発明の方法における使用に適している。そのような組成物はビヒクル（好ましくは水、例えば蒸留水）、ならびに方法に関してあらかじめ定義されたポリカチオン物質および細胞外マトリックス形成ポリマーを含む。本発明者らは、体液に対する沈殿溶液の好ましい体積比は約４であることを見出したので、本発明の沈殿組成物は、好ましくは０．０５〜１ｇ／ｍｌの範囲内に含まれる濃度の細胞外マトリックス形成ポリマー、および０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲内に含まれる濃度のポリカチオン物質を含む。
以下の実施例は、説明のみのために提供され、添付の特許請求の範囲によって決定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例は、ポリカチオン物質としてプロタミン、および細胞外マトリックス形成ポリマーとしてＰＥＧ３５０００Ｄａを用いて行った。本発明者らは、本技術を、以下では「Ｐ／ＰＥＧ沈殿」またはそれ以上簡潔に言えば「Ｐ／ＰＥＧ」と命名し、ＥＶ単離のゴールドスタンダードである分画超遠心分離法と比較した。
以下の実施例は、ＮＴＡによって判断されるように、Ｐ／ＰＥＧが、超遠心分離よりも少量の血清および唾液ならびに培養細胞の馴化培地からのＥＶの回収に対してより効率的であることを示す。
電子顕微鏡で観察されたように、ＥＶのサイズは類似していたが、超遠心分離したＥＶ中に存在する膜破片は、Ｐ／ＰＥＧのＥＶ調製物には存在しなかった。特に唾液から沈殿したＥＶは、サイズおよび形が非常に均一であった。
Ｐ／ＰＥＧ沈殿によって得られたＥＶにおけるエキソソームマーカーの発現は、これらの沈殿物中のエキソソームの濃縮を示唆している。

沈殿法によって得られたＥＶの主な懸念の１つは、リポタンパク質のような非小胞起源の混入物質が存在することであるので、本発明者らは、得られた異なる調製物中のＡｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａの存在も評価した。この結果は、血清ＥＶにおいてＡｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａ１がＥＶ沈殿物だけでなく、分画超遠心分離法によって精製されたＥＶにも存在することを示している。このことは、小胞に付随するｅｘＲＮＡをリポタンパク質に付随するものから区別することが意図されている場合に、診断上の提案に血清ＥＶを使用する上で制限となる場合がある。しかし、生物試料中のｅｘＲＮＡの検出は、それらのビヒクルとは独立して液体生検に利用され、沈殿技術は、この目的に適している場合がある。Ａｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａ１は、唾液中のＥＶおよびＰ／ＰＥＧ調製によって培養培地から精製されたＥＶにおいて存在しないか、またはほとんど検出されなかったことは、リポタンパク質の汚染は、これらの生物試料ではあまり関連がないことを示唆する。

Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スピンカラムの使用は、沈殿したＥＶから、ＰＥＧ ８０００を含有するリポタンパク質を除去することが示唆されている（１）。本発明者らは、ＰＥＧ ３５０００Ｄａと会合した形で、プロタミンを用いてＥＶを沈殿させたので、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００スピンカラムを使用したところ、アポリポタンパク質混入物質の効果的な除去が示された。吸収後、総ＲＮＡは減少したが、ＥＶに含有されるｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの検出にはまだ適していた。

Ｐ／ＰＥＧ沈殿によって得られたＥＶは、唾液からのＥＶで刺激された角化細胞による創傷閉鎖の誘導、およびＨＬＳＣによって放出されたＥＶで促された尿細管上皮細胞の増殖の誘導によって示されるように、インビトロでの生物活性を保持していた。
さらに異なるポリカチオン物質／細胞外マトリックス形成ポリマーの組で実験を行い、ＥＶの沈殿に効果的であることが証明された。
ＥＶの精製に利用可能なすべての従来技術の方法は、いくつかの長所と短所を有しており、おそらくどれも各々の用途に理想的ではない。本明細書で記載された方法は、簡便性の利点を有し、高価な装置の必要性を回避する。さらに、単離されたＥＶは生物活性を保持していた。
結論として、本発明者らは、本発明の沈殿方法は、生物試料からのＥＶの効率的な単離を提供し、新しいバイオマーカーの探索のために利用され得ることを示した。

材料および方法
生物試料
唾液は成人の正常なボランティアから得た（ｎ＝５）。健康なドナーからのヒト血清（ｎ＝５）は、インフォームドコンセントおよび内部Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋによる承認後、Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｉｔｔａ ｄｅｌｌａ Ｓａｌｕｔｅ ｅ ｄｅｌｌａ Ｓｃｉｅｎｚａ ｄｉ Ｔｏｒｉｎｏによって提供された。

成人ヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）
ＨＬＳＣを、以前に記載されたように培養し特徴付けた、ヒト凍結保存正常成人肝細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から単離した（２）。簡潔に、肝細胞を最初に２週間、Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ−ＳＦＭ培地で培養し、次いでＨｅｐｅｓ（１２ｍＭ、ｐＨ７．４）、ｌ−グルタミン（５ｍＭ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（すべてＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡから）、およびウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（１０％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したα−ＭＥＭ／ＥＢＭ−１（３：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）培地で培養し、細胞を増殖させ、特徴付けた。細胞蛍光分析によるＨＬＳＣの特徴づけは、間葉系幹細胞マーカーの発現を示したが、記載のように内皮および造血マーカーの発現を示さなかった（３）。ＨＬＳＣはアルファ−フェトプロテインおよびヒトアルブミン、ならびにビメンチンおよびネスチン常在性幹細胞マーカーも発現したが、ＣＤ３４、ＣＤ１１７およびサイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）１９卵形細胞マーカーは発現しなかった（２）。さらに、ＨＬＳＣは、ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびＳＳＥＡ４の胚性幹細胞マーカーに陽性であった（４）。適切な培養条件下でＨＬＳＣは、内皮分化、骨形成分化および肝分化を受けた（２）。

角化細胞
角化細胞（ＨａＣａＴ）は、Ｌｏｎｚａ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し、ＫＢＭ−ｇｏｌｄ基本培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。１ｃｍ²当たり１ｍｌの培地を用いて細胞を密度３５００細胞／ｃｍ²で播種し、細胞集密度が７０〜８０％で継代培養した。簡潔に言えば、フラスコをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩溶液で洗浄し、トリプシン溶液で６分間インキュベートし、次いで１０％ＦＣＳを含む培地でトリプシンを中和した。７分以内に細胞が完全に剥離しなかった場合、トリプシンでのインキュベーションを反復した。

腎臓尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）
ハイブリッドＡｄｅｎｏ５／ＳＶ４０ウイルスによる感染によって不死化されたＴＥＣ系統は以前にＣａｎｔａｌｕｐｐｉらによって開発された（５）。細胞を１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）および２ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で増殖させた。ＴＥＣはｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の陰性染色、デスミンおよびビメンチンの最小染色、およびサイトケラチンおよびアクチンに対する抗体による著しい染色を示した。ＴＥＣはまた、アルカリホスファターゼ、アミノペプチダーゼＡおよびメガリンのような、完全に分化した近位ＴＥＣのマーカーに対して陽性であった。

ＥＶの単離
ＨＬＳＣ培養培地、ヒト血清および唾液からＥＶを精製した。ＨＬＳＣ（２×１０⁶細胞／Ｔ７５）の上清から単離されたＥＶは、ＦＣＳを欠くＲＰＭＩ中で２４時間培養した後に得られた。ＥＶ単離の時点で、細胞の９７〜９９％がトリパンブルー排除アッセイによって生存可能であり、ＴＵＮＥＬアッセイはアポトーシス細胞を検出しなかった。
唾液試料（５ｍｌ）を滅菌チューブに回収し、採取の間、氷中に保った。提供の１時間前に、健康なドナーは飲食をしないで断食するという手順に従った。
血清分離チューブ（ＢＤ）を用いて健康なドナーから血清試料を採取し、１５００ｇで１５分間遠心分離した。
単離手順の前に、ＨＳＬＣ上清、唾液および血清試料を、細胞破片および他の混入物質を除去するために３０００ｇで２０分間、２回遠心分離にかけた。唾液試料をＰＢＳで１：１に希釈し、０．２２μｍフィルターで濾過した。

分画超遠心分離法
細胞破片およびアポトーシス小体を３，０００ｇで２０分間、２回の遠心分離によって除去後、ＥＶは、Ｔｈｅｒｙら（１０）によって記載されているように、１０，０００ｇでの最初の超遠心分離、続いて４℃で１時間１００，０００ｇでの超遠心分離によって精製された（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ−９０Ｋ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）。

電荷に基づいた沈殿
沈殿操作のために準備された生物試料を、滅菌バイアルに移し、プロタミン（Ｐ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ３５０００ Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）沈殿溶液（Ｐ／ＰＥＧ）（１体積沈殿溶液：４体積試料）を添加した。対照として、ＰまたはＰＥＧ ３５０００単独（ＰＥＧ）を使用した。沈殿溶液の組成物は、０．２５ｇポリエチレングリコール（ＰＥＧ ３５０００、Ｍｅｒｃｋ）および１ｍｇプロタミン塩酸塩／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）蒸留水であった。
一晩４℃でインキュベーション後、混合物を１５００ｇで３０分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物を、生物活性を研究するために適した緩衝液、またはＲＮＡ抽出およびウエスタンブロット分析のための溶解緩衝液に再懸濁した。
リポタンパク質を除去するために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）スピンカラムを使用した。ＥＶは空隙容量で回収された。

ＥＶ電荷の測定
Ｚｅｔａ−ｓｉｚｅｒ ｎａｎｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＳＡ、Ｖｅｎｉｓｓｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ、サイズ範囲０．３ｎｍ〜１０μｍ）によって分析を行った。ゼータ電位（滑り平面）は、分散体中の隣接する同様に荷電した粒子間の静電反発の程度を示す粒子から、距離ｘで発生する。負ゼータ電位は、粒子を横切る高度の分散体を示す。
ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）
ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＳＡ）を使用して、ＮＴＡソフトウェアによってＥＶの濃度およびサイズ分布を分析した。レーザ光源に供された試料中に存在するＥＶのブラウン運動をカメラで記録し、ＮＴＡによってＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ式を介してサイズおよび濃度パラメータに変換した。
透過型電子顕微鏡
透過型電子顕微鏡法は、超遠心分離または電荷に基づく沈殿によって単離し、ＰＢＳに再懸濁し、２００メッシュのニッケルフォルムバール炭素コーティンググリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）に置き、２０分間接着させたＥＶで行った。グリッドを、次いで２％スクロースを含む２．５％グルタルアルデヒドでインキュベートし、蒸留水で洗浄後、ＥＶをＮａｎｏ Ｖａｎ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、Ｙａｐｈａｎｋ、ＮＫ、ＵＳＡ）でネガティブ染色し、Ｊｅｏｌ ＪＥＭ １０１０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって観察した。

ウエスタンブロット分析
ＥＶ調製物に含有されるタンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって定量化した。タンパク質試料を４％〜１５％のグラジエントドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ウサギポリクローナル抗体抗ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、抗アポリポタンパク質（ａｎｔｉ−ａｐｏｌｉｐｏｒｏｔｅｉｎ）Ｂ１００およびヤギポリクローナル抗体抗アポリポタンパク質Ａ１（Ａｂｃａｍ、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵＫ）とイムノブロッティングを行った。タンパク質バンドを高感度化学発光（ＥＣＬ）検出キットおよびＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標） ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）で視覚化した。細胞およびＥＶ溶解物を３０μｇ／ウエルの濃度でロードした。
ＲＮＡ抽出
ｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、製造業者の手順に従ってＥＶから総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを分光光度法で定量化した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）。

定量的リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡプロファイリング
４８ウエルＳｔｅｐＯｎｅ（商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、以前に（６）に記載されたように、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。簡潔には、ｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、最初に０．２μｇのＲＮＡを逆転写し、次いで３連の３ｎｇのｃＤＮＡをｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）でｑＲＴ−ＰＣＲを行う重要なｍｉＲＮＡを同定および測定するために用いた。ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、２９ａ、９９ｂ、１９１、２２３に対するｍｉＲＮＡ特異的プライマーを別々の反応で使用した。ＲＮＡの代わりにＲＮＵ４４およびＲＮＵ４８ ｓｎｏＲＮＡを陽性対照として使用し、１０μｌの水を陰性対照として使用した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析はまた、ＩＬ８およびＭｅｏｓｉｎ ｍＲＮＡの存在について唾液ＥＶで、Ａｇｏ２およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡの存在についてＨＬＳＣＥＶで実行した。

細胞増殖アッセイ
不死化尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭに、９６ウエルプレートに３×１０³細胞／ウエルの密度で播種した。１２時間後、ＦＣＳを含まない培地で２時間、ＴＥＣを飢餓状態にし、ＨＬＳＣ ＥＶで刺激し、次いで１０μＭ ＢｒｄＵを一晩添加した。プレートをＢｒｄＵキット（ＢｒｄＵ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で分析し、吸収値を４０５ｎｍの波長で測定した。

インビトロスクラッチ−創傷治癒アッセイ
ＨＡＣＡＴ細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭに、２４ウエルプレートに５０×１０³細胞／ウエルの密度で播種した。細胞が完全な集密に達した時点で、ＦＣＳを含まない培地で一晩飢餓状態にした。翌日、スクラッチ創傷を滅菌チップで作製した。刺激前に（ｔ＝０）、ウエルの顕微鏡写真をＬＥＩＣＡ顕微鏡で得た。次いで、３つの異なるドナーの唾液から単離されたＥＶ（標的細胞あたり５０，０００個のＥＶ）で細胞を刺激した。ＬＥＩＣＡ顕微鏡を用いて３６時間にわたって「創傷閉鎖」現象をモニターし、ＥＶで刺激していない細胞と比較して唾液ＥＶで刺激した細胞の創傷面積の減少を観測する画像Ｊソフトウェアで画像を分析した。
統計分析
結果は平均±ＳＤとして表す。統計分析は、適切な場合にＤｕｎｎｅｔの多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡを用いて行った。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。

結果
ゼータ電位の分析は、異なる生物試料で実施され、ＥＶが負電荷を示すことを示した（表１）。

予備実験では、血清を様々な用量のプロタミン（１、０．５、０．２５、０．１ｍｇ／ｍｌ）と共に４℃で一晩インキュベートし、沈殿したＥＶを３０００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した（図１Ａ）。しかし、ＥＶ沈殿物は０．２５ｍｇプロタミン／ｍｌ血清の用量で容易に再懸濁したが、最高用量の生成された沈殿物を再懸濁させるのはより困難であった。本発明者らは、プロタミンへのＰＥＧ ３５，０００の添加が再懸濁に有利に働くことを観察した。これに基づいて、超遠心分離のステップを必要とせずに遠心分離後にＥＶを回収することができるポリマーマトリックス中での負に帯電したＥＶの沈殿に有利に働くように沈殿戦略が設定された。

図１は、超遠心分離（ＵＣ）またはＰ／ＰＥＧ、ＰＥＧ単独およびプロタミン単独での沈殿後の血清（Ｂ）、唾液（Ｃ）およびＨＬＳＣ（Ｄ）の無細胞上清からのＥＶ回収のＮＴＡによる比較を示す。結果は、ＮＴＡによって検出されたＥＶの数に関して、Ｐ／ＰＥＧ沈殿が他の条件よりも効率的であったことを示している。異なった条件で単離されたＥＶのサイズは、透過型電子顕微鏡で見られるように類似していた。血清由来のＥＶは３５〜９５ｎｍの範囲であったが、唾液由来のものは４５〜６５ｎｍの範囲のより均質な集団であった。ＨＬＳＣ由来のＥＶは、４５〜７５ｎｍの範囲であった（図２Ａ）。

超遠心分離によって得られたＥＶについては、Ｐ／ＰＥＧによって血清、唾液およびＨＬＳＣから沈殿したＥＶのウエスタンブロット分析により、ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１エキソソームマーカーの発現が示された（図２Ｂ）。沈殿技術は混入したリポタンパク質を共に単離させることが示唆されているので（７、８）、本発明者らは、超遠心分離およびＰ／ＰＥＧ沈殿によって得られたＥＶにおけるＡｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａ１の存在をウエスタンブロットによって評価した。図３Ａに示すように、Ａｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａ１は、超遠心分離および沈殿の両者によって得られた血清ＥＶで検出された。唾液ＥＶにおいては、Ａｐｏ Ｂ１００は存在しなかった。Ａｐｏ Ａ１は、超遠心分離後の唾液から得られたＥＶにおいて検出可能であったが、Ｐ／ＰＥＧ沈殿試料ではほとんど検出できなかった。Ａｐｏ Ｂ１００は、超遠心分離および沈降の両方によってＨＬＳＣ培養培地から精製されたＥＶには存在しなかったが、Ａｐｏ Ａ１は、超遠心分離によって精製されたＥＶのみで検出可能であった。リポタンパク質を除去するために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００スピンカラムを使用し、アポリポタンパク質を保持したまま、ＥＶを空隙容量で回収した。図３Ｂに見られるように、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００によるゲル濾過により、ＥＶ調製物からＡｐｏ Ｂ１００およびＡｐｏ Ａ１を除去した。

ＥＶにおけるＲＮＡの検出
図３Ｃに示すように、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００の予備吸収後に抽出されたＲＮＡの量は、血清中および唾液中の両方で減少したが、その差は統計的に有意ではなかった。ＰＣＲ分析はまた、血清ＥＶ中に存在する代表的なｍＲＮＡの約２サイクルの減少を示した（ＩＤ１ ｍＲＮＡ、図３Ｄ）。図４は、Ｐ／ＰＥＧ沈殿によって調製したＥＶから抽出したＲＮＡと超遠心分離によって調製したＥＶから抽出したＲＮＡとの比較を示す。これら２つの方法によって単離されたＥＶ間で、含有されるＲＮＡの有意差は観察されなかった。Ｐ／ＰＥＧ沈殿によって調製されたＥＶから抽出されたＲＮＡが、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡの検出に適しているかどうかを評価するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、両方の技術を用いて正常な被験者から単離されたＥＶ中にｍｉＲ１６、２９ａ、９９ｂ、１９１ ｅ ２２３と同等な量の存在を示した。一方、ｍｉＲ５００、１４２−３ｐ、１２７−３ｐ、および１５５は、検出不能、または非常に低いレベルで検出可能のいずれかであった（図示せず）。図４Ｂは、超遠心分離および沈殿によって得られたＥＶにおけるｍｉＲ１９１の代表的な増幅プロットを示す。本発明者らは、ｍＲＮＡを検出するｑＲＴ−ＰＣＲ分析も行った。図４Ｃに示すように、同等な量の選択されたｍＲＮＡが、超遠心分離またはＰ／ＰＥＧ沈殿のいずれかによって精製された血清、唾液およびＨＬＳＣ由来のＥＶにおいて検出された。
電荷に基づく沈殿によって単離されたＥＶの生物活性を保持する能力の評価
超遠心分離およびＰ／ＰＥＧ沈殿によって得られたＥＶの生物活性を、唾液およびＨＬＳＣのＥＶについて評価した。

唾液ＥＶの生物活性を試験するために、ヒトＨａＣａＴ角化細胞を用いてインビトロ創傷閉鎖アッセイを行った。Ｐ／ＰＥＧによって得られた唾液ＥＶは、ＥＧＦと同等な有意な創傷閉鎖を誘導した（図５Ａ〜Ｅ）。特に、沈殿したＥＶは、超遠心分離によって得られたＥＶよりも効果的であった（図５Ｅ）。
ＨＬＳＣＥＶの生物活性を試験するために、尿細管上皮細胞のインビトロ増殖を行った。沈殿および超遠心分離したＥＶの両方が、細胞増殖を有意に増加させることができた（図５Ｆ）。

試験した追加のポリカチオン物質／細胞外マトリックス形成ポリマーの組

表は、蛍光赤色色素ＰＫＨ２６で標識し、提示した物質で沈殿させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した血清細胞外小胞（ＥＶ）の蛍光測定を示す。定量は、蛍光の平均強度として表される効果的な標識を共焦点顕微鏡によって検証した。

得られた結果は、ａ）試験したポリカチオン物質はすべて、血清試料からのＥＶの沈殿を促進するのに効果的であること、およびｂ）ポリマー物質／細胞外マトリックス形成ポリマーの組を含む沈殿溶液は、ポリマー物質単独または細胞外マトリックス形成ポリマー単独のいずれかを含む沈殿溶液より効果的であることを示す。
参考文献

Claims (18)

1. 体液試料から細胞外小胞（ＥＶ）を単離する方法であって、
   （ｉ）体液試料をポリカチオン物質および細胞外マトリックス形成ポリマーと混合するステップ、
   （ｉｉ）混合物をインキュベートし、それによってＥＶを沈殿させるステップ、および
   （ｉｉ）混合物から沈殿したＥＶを分離するステップ、
   を含む方法。
2. 混合物から沈殿したＥＶを分離するステップが、遠心分離によって行われる、請求項１に記載の方法。
3. ポリカチオン物質が、プロタミン塩、ポリリジン塩またはカチオン性デキストラン塩から選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 塩が、塩酸塩である、請求項３に記載の方法。
5. 細胞外マトリックス形成ポリマーが、ハイドロゲルである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 細胞外マトリックス形成ポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、デンプン、アルギン酸塩、アガロース、ポリエチレングリコール、デキストラン、デキストラン硫酸、デキストラン酢酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、またはポリ硫酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 体液が、血液、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液および細胞培養の馴化培地からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 細胞培養が、成熟幹細胞培養、好ましくは間葉系幹細胞培養または肝臓多能性前駆細胞培養である、請求項７に記載の方法。
9. ポリカチオン物質を、細胞外マトリックス形成ポリマーおよび体液試料と混合し、混合物における濃度を０．０２〜２ｍｇ／ｍｌとする、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 細胞外マトリックス形成ポリマーを、ポリカチオン物質および体液試料と混合し、混合物における濃度を０．０１〜０．２ｇ／ｍｌとする、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 細胞外マトリックス形成ポリマーが、４〜１００ｋＤａの範囲内に含まれる平均分子量を有する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 遠心分離が、１０００〜５００００ｇ、好ましくは１０００〜１００００ｇ、より好ましくは１０００〜５０００ｇで行われる、請求項２から１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 体液試料から細胞外小胞（ＥＶ）を沈殿させるための組成物であって、ビヒクル、ポリカチオン物質および細胞外マトリックス形成ポリマーを含む組成物。
14. 細胞外マトリックス形成ポリマーが、請求項５または６に記載のものである、請求項１３に記載の組成物。
15. ポリカチオン物質が、請求項３または４に記載のものである、請求項１３または１４に記載の組成物。
16. 細胞外マトリックス形成ポリマーが、０．０５〜１ｇ／ｍｌの範囲内に含まれる濃度を有する、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. ポリカチオン物質が、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲内に含まれる濃度を有する、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. ビヒクルが、水、好ましくは蒸留水である、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の組成物。