JP2021506324A - 生体材料から細胞外小胞を単離する方法および固定相 - Google Patents
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Abstract
Description
− 示差超遠心法(非特許文献3);
− 密度勾配遠心法(非特許文献4;非特許文献5);
− 精密濾過(非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8);
− マイクロフルイディクス(非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12);
− 合成ペプチド(非特許文献13)、ヘパリン(非特許文献14)、膜を認識する抗体の組み合わせ(非特許文献15;非特許文献16)タンパク質(クラスター分化もしくは抗原もしくは成分)、またはTim4タンパク質(非特許文献17);
− ポリマーまたは溶媒ベースの沈殿/単離(非特許文献18;非特許文献19;非特許文献20);
− 超音波(非特許文献21);
− ExoQuick(商標)(System Bioscience)、全エキソソーム単離試薬(Thermo Fisher)、miRCURY(商標)エキソソーム単離キット(Exiqon)、exoEasy(Qiagen)、Exo−spin(商標)(Cell Guidance)、ME(商標)キット(NEP)を含むカラムに基づく商業的な系。
− 迅速性:適用時間が60分未満;
− 簡単さ:特定の手段の使用は、いくつかの手順的ステップでは必要ない;
− 適応性:官能化されたビーズの量は、出発生物学的材料の体積(数十ミリリットルから数リットル)に適応される;
− 効率:未変化のEVの高回収率;
− 不均一性/分散性:限定された凝集現象を伴う不均一なEV(典型的には50〜800nmの寸法範囲)の同時析出;
− 安定性:NBIにより精製された多分散EVは、UCにより精製されたものより安定である;
− 標識/ポリマー非含有:開始生体試料に添加された疎水性ポリマーがないか、またはNBIの全手順中に添加されない;
− 生理学的pH:pH7.4で緩衝した塩溶液を用いて全手順を行う;
− 純度:NBIは、タンパク質に富んだ生体液体からEVを選択的に精製することを可能にする;
− 組み合わせ:NBIは、EVを単離するように設計され、他の物理化学的原理に基づいた他のシステムに結合することができ、特に、同一の開始生体試料から来る異なるサイズのEVサブ集団を得るためである;
− 汎用性:NBIは、トリプシン、プロテイナーゼK、DNA分解酵素、種々のRNA分解酵素のようなタンパク質または核酸分解酵素に曝露された生体試料に適用可能である;NBIで処理後、蛍光親油性プローブで生体試料を標識する可能性がある。
− NBIで精製した細胞外小胞のin vivo注射/注入に対する耐容性。
前述の固定相を含む容器。
− NBI手順にそれ自体で用いるべきウシ胎児血清(FBS)の最大1.5%を含む細胞培養培地。FBSの割合がより高い場合は、pH7.4でPBSで希釈することが好ましい;
− 細菌培養培地(LB、またはペプトン、糖および/もしくは酵母抽出物を含む);
− 生理学的緩衝液;
− ヒトまたは動物由来の液体生検試料(全血または血清または血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、唾液、組織滲出物)。この場合でも、培地の粘度を、適切なPBS体積で希釈することができる。
上記の固定相を含む容器、または代替として、
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器;ならびに
Ni2+もしくはAl3+塩を含む容器。
生理学的pHで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器;
各々が異なるキレート剤を含む少なくとも2つの容器。
生理学的pHでキレート剤の混合物を緩衝する調整pH食塩水溶液を含む少なくとも1つの容器。
微量遠心低結合試料管。
固定相は、25〜40μmのアガロースビーズからなる;
ニッケル塩はNiSO4であり、またはアルミニウム塩はAl2O3もしくはアルミノケイ酸塩である;
生理学的pHで緩衝された生理食塩水溶液は、PBSである;
キレート剤は、陽イオンがNi2+である場合にはEDTAであり、または陽イオンがAl3+である場合にはMgCl2またはMgSO4のようなマグネシウム塩である;
他のキレート剤は、陽イオンがNi2+である場合はクエン酸ナトリウムであり、または陽イオンがAl3+である場合はCaCl2もしくはCa3(PO4)2のようなカルシウム塩である;
pH調整生理食塩水溶液は、KH2PO4またはK2HPO4である。
ビーズ官能化のための手順は、以下のように実施される:
− 市販のNiNTAセファロース高速ビーズ(GE Healthcare、製品コード71−5027−67または17−5268−01)を、開始ビーズとした;正味荷電値を測定し、結果として、Malvern Zetasizer機器を用いて検出されるように、PBS中22〜25℃で3〜25mVの範囲になった。
− 開始ビーズを、200〜300mMのNaClもしくはKCl、100〜300mMのEDTAもしくはEGTA、300〜500mMのイミダゾールを添加した水溶液、または広いpH範囲(一般に5〜8の間)のカチオン性キレート剤を含む溶液での1つ以上の洗浄、および二蒸留水(18.2MΩcm−1)での1つ以上の洗浄によるストリッピングに供する;
− あらかじめ50mlチューブにアリコートしたストリッピング処理を施した開始ビーズ(NiNTA Sepharose High Performance,GE Healthcare,17−5268−01,34μm既知公称サイズ)の40mg/ml懸濁液を、pH7.4のPBS中の濃縮19mM硫酸ニッケル溶液の2倍体積(ビーズ体積に関連する)に再懸濁し、0.2μmシリンジフィルターで滅菌する。
− 硫酸ニッケル溶液中のビーズ混合物を、室温で、かつ穏やかな軌道回転で2分間インキュベートする。
− 50mlチューブを傾斜ローターで200rcfで1分間遠心し、ビーズをチューブの底部に集める。
− 上清を穏やかに吸引し、廃棄し、0.2μmシリンジフィルターで滅菌したpH7.4でのPBSの3倍体積(ビーズ体積に関して)を、ビーズに加える。
− ビーズを前述のように再び遠心分離し、上清を吸引し、廃棄する。
− ビーズへのPBS付加と除去のステップは、残存硫酸塩またはニッケルイオンの微量を除去するために、さらに2回連続して繰り返される。
− pH7.4でPBSの同容積(ビーズ容積に関して)にビーズを再懸濁し、0.2μmシリンジフィルターで滅菌し、これらのビーズ(以下、CBeadと称する)を4℃で保存する。
CBeadを、任意のサイズのチューブに収集した生体液体(2800rcf遠心分離によって細胞破片によって清澄化された)の表面に滴加し、20μl/mlの体積比で30分間室温でインキュベートすることができる。
− CBeadを、生体試料と共に、穏やかな軌道回転(300〜600rpm)で室温で30分間インキュベートし、その末端でチューブを垂直位に安定させて、チューブ底部のCBead(7〜15分)の重力沈降または弱い遠心分離(100〜400rcf)を可能にする。
− 上清は完全に吸い上げられ、廃棄される。
EV−Elution A:最終3.2mMのEDTA、pH8.0でのPBSサプリメント。
EV−Elution B:60mMのNaCl、45μMのクエン酸ナトリウムでの完全なPBS。
− Elution溶液のCBeadと等しい体積を滴下し、穏やかにCBeadに加える。
− CBead+Elution混合物を含むチューブを、軌道回転(500rpm)で15分間、好ましくは28℃でインキュベートする。
− チューブを傾斜ローターで1800rpmで1分間遠心分離する。
NBIを、U87グリオーマ細胞から放出された小胞を単離するために適用し、直径0.5μm以上の粒子数(フローサイトメトリーにより推定)は、官能化されていないビーズにより捕捉された少数の事象とは異なり、差次的UCを用いて得られたものと同等である(図2A)。
粒子集団を分析し、溶液中でのEV濃縮を可能にした溶出ステップを精密化するために、調整可能な抵抗性パルスセンシング(TRPS)を、qNANO機器と共に系統的に使用した。
NBI手順中の機械的力および塩平衡の影響を分析するために、エキソソームに類似したリポソームを、4つの異なる平均サイズ(149、177、196、202nm)で作製し、その混合物を10mlのDMEM培地に添加し、その後NBIで処理した(図5)。NBIおよびUCの両方は、粒子の完全な回収(98.6%)を可能にした。対照的に、本発明者らは、ホスファチジルエタノールアミン−ローダミンで前染色し、超遠心分離(PE−Rho UC)したリポソームは、PE−Rho NBI粒子とは対照的に融合挙動(40nm超の変位)を有し、おそらくUCにより生じたより大きな膜損傷または湾曲に因ることを観察した。これらのデータは、NBIがEV形態をより良好に保存し、辺縁干渉を有するリン脂質結合染色と組み合わせて使用できることを示している。
生物材料は種々の保存条件にさらされるため、本発明者らは、NBIまたはUCによる精製後に4℃で保存された微小胞のターンオーバーを解析した(図6)。単離後24日(t24)のUC試料では、最初に分析された600nm集団は、約300nm集団に置き換えられた。驚くべきことに、最初のEV集団の86%のNBI試料では、同じナノポアを用いてなお検出可能であり(図6、中央)、系統的な微小胞分析では、UCからのEVの7.35日とは対照的に、NBIからのEVの半減期50日超が示された(図6、右)。要約すると、NBIは最初のEV形態とその分散を保持し、溶液中でより良好な安定性をもたらす。
細胞系におけるNBIの頑健性を評価するために、種々の密度で播種したU87細胞培地から6ウェルプレート上で3つ1組でEVを独立して精製した(図7)。回収された粒子は播種した細胞の数に比例し、エキソソーム(197±26nm)および微小胞(595±37nm)の両方について6.14%(NBI 1、2および3についてn=9)の全般的変動係数(CV)を示した;本発明者らは、無血清培養培地(NBI 1)からのEVと無小胞超遠心(dFBS)血清との間に統計的に有意な変動(P=0.459)を観察しなかった。興味深いことに、小容量に適用可能な迅速なNBI手順は、103細胞/cm2のようなより少ない細胞を用いて小胞放出に従うことを可能にした(図8)。本発明者らは、細胞密度の関数としてエキソソームの直線的放出、一方で、微小胞に対して異なる動力学を有するコヒーレントな放出を観察し、おそらく粒子サイズに関連する種々の生体遺伝学的機構、安定性および/または細胞媒介ターンオーバーと関連した。
EVは多くの種類の血液細胞から放出され、バイオマーカーとして研究され得るため、赤血球要素の既知の数を有する健常ドナーからの液体生検でのNBIの性能を評価した(図11)。血漿中のEV濃縮が血清(図12)と比較して観察され、血漿(0.5ml)上のNBIが、45±10歳の平均年齢の47人の被験者に対して系統的に行われた。図13Aに示すように、30.56±25.78×109のエキソソーム/mlが、平均サイズ249.5±36.71nmで回収され、5.49±3.09×108の微小胞/mlが平均サイズ564.4±57.3nmで回収され、約55:1のエキソソーム/微小胞比が得られた。回収されたエキソソームの数は、赤血球数(RBC)(Pearson r:0.998、P値<0.0001)、血小板(PLT、Pearson r:0.958)および白血球(WBC、Pearson r:0.970)と相関し、一方Pearson rは、それぞれ好酸球または好塩基球の亜種の%と0.74または0.72に低下する。一方(図13B)、微小胞の数は、PLT(Pearson r:0.989、P値<0.0001)、RBC(Pearson r:0.976)およびWBC(Pearson r:0.912)の数とより良好に相関し、好酸球(Pearson r:0.58)または好塩基球(Pearson r:0.35)のパーセンテージと低い一貫性を示している。
細胞培養
U87−MGヒトグリオーマ細胞(ATCC(登録商標)HTB−14(商標))、SH−SY5Y dineuroblastoma細胞株(ATCC(登録商標)CRL−2266(商標))およびPC−3前立腺腺癌(ATCC(登録商標)CRL−1435(商標))を、ATCCバンク(American Type Culture Collection)から入手した。代わりに、IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino−IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancroの生物バンクにより、乳腺癌MCF7(ICLC;HTL95021)およびMDA−MB−231(ICLC;HTL99004)の細胞株が提供された。これらの細胞は接着性に成長し、RPMI 1640培地で培養に保持したPC−3細胞を除き、他のすべての系統をDMEM培地で増殖させ、両方に10%のFBS(v/v)、100U/mlのペニシリン+100ug/mlのストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)を添加し、37℃で5%CO2と共にインキュベートした。細胞外小胞含有培地を得るために、最初に、細胞を、75%コンフルエンスに達するまで(通常、48時間で)全培地中で培養し;続いて、PBSで2回穏やかに洗浄した後、細胞を、FBS非含有培地中で24時間インキュベートした。細胞は、実施する試験に従って、異なった平板およびフラスコフォーマットで蒔いたが、密度は、図面の説明に特に記載のない限り、3.2±0.2×104/cm2で一定に保たれた。
T150フラスコ(CLS430823−50EA)中で培養したU87−MG細胞により産生されたEVは、小さな変更を加えて、Di(Vizio et al.,Am J Pathol,2012;15:1573−84)に記載されたプロトコルに準じた示差超遠心法により単離された。簡単に言うと、FBSを含まない培地中で24時間インキュベートした後、上清をファルコンチューブで採取し、4℃で2800rcfで遠心して、細胞破片を除去した。次に上清を超遠心管(Polyallomer Quick−Seal遠心管25×89mm、Beckman Coulter)に移し、SW 32 Tiローター付きOptima XE−90(Beckman Coulter)機器中で4℃、10000rcfで30分間遠心分離した。このステップは、ろ過したPBS中で穏やかに再懸濁した微小胞の優先的沈殿を可能にした。次に、Thery C.et al.(Curr Protoc Cell Biol.2006;Chapter 3:Unit 3.22)に記載されているプロトコルに従って、採取した上清を、0.22μm使い捨てフィルター(Sarstedt,Numbrecht,Germany)を通してろ過して、微小胞の汚染物または凝集体を除去し、4℃で70分間100,000rcfで遠心分離して、エキソソームを優先的にペレット化した。ペレットを、ろ過したPBSに再懸濁した。示差超遠心分離から得たEVを組み合わせ、−80℃で保存するか、またはTRPSで分析する前に4℃に保った。
0.2μm使い捨てフィルター膜で濾過したPBS(ThermoFisher、10010023)(NBIプロトコル全体にわたって使用)。
NiSO4[0.1M](Sigma,656895)
NaCl[5M](Sigma,450006)
クエン酸ナトリウム[0.2M](Sigma,C8532)
EDTA[0.5]M(ThermoFisher,UltraPure pH8.0、15575020)
KH2PO4[1M](Sigma,P9791)
ストリッピング緩衝液:PBS+0.5MのNaCl、50mMのEDTA、pH8.0
EV−Elution A:最終濃度3.2mMのEDTA、pH8.0のPBSで体積まで。
EV−Elution B:60mMのNaCl、45μMのクエン酸ナトリウムでPBSで体積まで。
EV−Elution緩衝液AおよびB(1X溶出液)を混合した後、8μl/mlのKH2PO4を1X液に添加し、その後EV溶出を進めた。
示差超遠心法またはNBI由来の小胞を、0.22μmのろ過したPBSで希釈した。背景シグナルは、ろ過したPBSの取得に基づいて設定され、光散乱閾値は、1秒当たり5事象以下の事象率を有する取得を可能にするように補正された。
EVサイズおよび濃度を、qNano(IZON Science)ツールを用いてTRPSによって特性化した。6ウェルプレートの実験(図9、図3Cおよび図8)について、または粒子速度が100粒子/分未満で、少なくとも2分間の記録を分析した試料の場合を除き、各試料について平均500粒子を計数した。NP200ナノ多孔(A40948、A43545、A43667、A43667)、NP400(A43592、A44117、A44116)、NP800(A40542、A36164、A40548、A44118)およびN1000(A40572)を、I 45.5〜I 47mmのストレッチで用いた。電圧は、95〜130nA範囲で定常電流強度を維持するために0.12〜0.68Vに設定し、背景ノイズは7〜12pAより低く、線状粒子計数率であった。それぞれ114nm、210nm、500nm、710nmおよび940nmの平均直径を有する校正粒子CPC100B(バッチID:B8748N)、CPC200B(バッチID:B6481M)、CPC500E(バッチID:659543B)、CPC800E(バッチID:634561B)およびCPC1000F(バッチID:669582B)を、iZON Scienceによって購入した。qNANOによる解析に関連するデータはすべて、Izon Control Suite v.3ソフトウェアにより記録し、解析した。
小胞は、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて可視化した。簡単に言うと、2.5%ホルムアルデヒドで溶出緩衝液中に固定した各EV試料の5μlアリコートを、薄い炭素膜で被覆した銅およびニッケル中の300方形メッシュグリッド上に置いた。次いで、グリッドをpH4.5の1%酢酸ウラニル緩衝液で陰性に標識し、Olympus Moradaカメラ(使用倍率:20500×および87000×)を備えた100kV TEM FEI Tecnai G2 Spirit顕微鏡を使用して観察した。
EV溶出ステップを、ヒスチジンで標識し、精製した(T7 RNA pol、110kDa;HuR、36kDa;YTH、23kDa)、DH5α大腸菌からのタンパク質抽出物30μg/mlおよび組み換えタンパク質15μg/mlを、U87−MG細胞に由来するEVを含む10ml培地に加えた競合アッセイにより試験した。簡単に述べると、DH5α細胞を、OD6000.5に達するまでLB培地中で培養に保持し、6000rcfで5分間遠心分離により収集した。ペレットは、3mlのDMEM培地+1μg/mlのリソザイム中に再懸濁し、7サイクル(40超音波増幅、7秒オン、10秒オフ)の熱静的浴で4℃で超音波処理した。この溶解物を、13,000rcfで20分間遠心分離することによって清澄化し、次いでEV含有培地に添加する前に0.2μm使い捨てフィルター膜でろ過した。ヒスチジンT7 RNAポリメラーゼで標識した組換えタンパク質は、S.Mansy博士の研究室(CIBIO,University of Trento)から好意的に提供され、組換えタンパク質HuR(D'Agostino et al.、PLoS One、2013年8月12日;8(8):e72426)およびYTH(Xu et al.,J Biol Chem.、2015年10月9日;290:24902−13)が、参考文献に記載されているように製造および精製された。
DH5α大腸菌細胞を、OD600が0.7に達するまで全LB培地中で培養した。細胞を4000rcfで15分間ペレット化し、上清を採取してNBIプロトコルに従って処理した。粒子は、NP150およびNP200ナノポアを用いてqNANO機器によって計数した。
真核生物小胞の脂質組成と類似した脂質組成を有するリポソーム脂質組成は、以下である:20%ホスファチジルコリン分子、10%ホスファチジルエタノールアミン分子、15%オレオホスファチジルセリン分子、15%スフィンゴミエリン分子、40%コレステロール(Llorente et al.Biochim,Biophys,Acta 2013;1831:1302−9;Haraszti et al.,J.Extracell,Vesicles 2016;5:32570)分子。脂質溶液から有機溶媒(例えば、クロロホルム)を回転エバポレータ機器および少なくとも1時間の減圧乾燥により除去する脂質膜を作製した。脂質を最終濃度1mg/mLでDPBSに再懸濁し、渦で激しく撹拌して、多重層リポソームを形成し、これを、さらに6回の凍結融解サイクルに曝露した。最終的なリポソーム形態は、2シリンジ押し出し装置(LiposoFast Basic Unit,Avestin Inc.)を用いて多層リポソームの懸濁液を押し出すことにより得た。サイズの異なる小胞を得るために、サイズの異なる2つの積み重ねたポリカーボネートフィルター(Millipore)を通して31のステップを実施し(MacDonald et al.Biochim Biophys,Acta 1991;1061:297−303)、続いてZeta Sizer機器(Nano−ZS,Malvern Instruments)による光子相関分光法により検証した。
健康なドナーから全血試料を、Meyer Children's University Hospitalで採取した。血漿試料を市販のEDTA処理チューブで採取し、その後、コールドチェーンに従って病院生物バンクから研究所に発送した。試料分析前にドナーからインフォームドコンセントを得た。
QIAzol試薬(QIAGEN)を用いて全RNAを抽出し、いくつかの変形例を加えて同封されている指示に従った。簡単に述べると、EV溶出ステップの前に100μlのQIAzolを直接ビーズに加え、続いて渦で撹拌し、室温で5分間インキュベートした。次にクロロホルム20μlを加えた。15秒間激しく混合した後、試料を室温で3分間インキュベートした。相を、4℃で15分間12,000rcfでの遠心分離によって分離し、水相を排出した。1μlのグリコーゲン(20mg/ml)および100μlのイソプロパノールを添加した後、RNAを−80℃で一晩沈殿させた。12,000rcfで10分間遠心分離した後、RNAペレットを75%エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離し、10μlのRNA分解酵素非含有水に再懸濁した。プロトコルの指示に従って、Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit(Agilent Technologies)を用いてRNAを定量した。
逆転写反応は、以下の反応組成物:2.3μlの5X反応緩衝液、1.15μlの酵素混合物、0.5μlの合成RNAスパイクインおよび7.5μlの鋳型全RNAを有するプロトコルの指示に従って、miRCURY LNA Universal RT microRNA PCRキット、Universal cDNA Synthesis Kit II(Exiqon)を用いて実施した。QX200TM Droplet DigitalTM PCR System(BioRad)を用いて、EvaGreen化学および以下のプライマーを用いてGAPDH mRNAを定量化した:5'−CAACGAATTTGGCTACAGCA−3'(配列番号.1)および5'−AGGGGTCTACATGGCAACTG−3'(配列番号.2)。
反応は、384−Optiplate(Perkin Elmer)で20μlの最終容量で行った。連続的抗体希釈物を有する15μg/mlのニッケル−キレート受容体ビーズおよび10μg/mlのストレプトアビジン−供与体ビーズを使用して、アッセイをPBS中で最適化して、付着点を同定した。表在性マーカーの存在は、以前にTRPSによって特徴付けられたEV連続希釈による用量−応答において分析された。健常なドナー血漿または血清非含有腫瘍細胞試料からNBIによりEVを精製した。室温で暗所で90分間インキュベートした後、Enspire機器(Perkin Elmer)によって蛍光シグナルを最終的に検出した。
独立した実験のデータおよび数を、図面の関連するキャプションに示す。アノバ、t検定、ピアソンr係数は、GraphPad Prism v5.1ソフトウェアを用いて算出し、結果は、P値が0.05未満(*)、0.01未満(**)、0.001未満(***)である場合に統計学的に有意と考慮した。
Claims (17)
- 固定相であって、ニッケルおよびアルミニウムからなる群から選択される陽イオンで官能化され、30〜80mVの正の正味電荷を有し;前記固定相は、マイクロメトリックまたはナノメトリックサイズの磁性または非磁性粒子からなることを特徴とする固定相。
- 前記固定相が、磁性または非磁性のいずれかのアガロースまたはシリコンビーズ、アルギン酸塩マトリックス、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)用ポリマー、ニッケルキレート受容体ビーズ、陰イオン性またはカーボンスチレンポリマーからなる群から選択される、請求項1に記載の固定相。
- マイクロメートルサイズにおける場合は平均サイズ25〜40μmの粒子を有する、請求項1または2に記載の固定相。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の固定相の調製方法であって、前記方法は、官能化されていない固定相を、15〜100mMのニッケルまたはアルミニウム塩を含む生理学的pHで緩衝された生理食塩水溶液中に懸濁することを含む、方法。
- 生理学的pHで緩衝された前記生理食塩水溶液が、PBSまたはpH7〜7.5の任意の他の緩衝液である、請求項4に記載の方法。
- 懸濁液を緩やかな軌道回転で室温でインキュベートする、請求項4〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 真核細胞または原核細胞によって分泌される細胞外小胞(EV)を生体液体中で単離する方法であって、前記方法が、請求項1〜3のいずれか一項に記載の官能化された固定相の使用を含む方法。
- 前記固定相を生体液体の表面に滴加する、請求項7に記載の方法。
- 生体液体中でインキュベートした後、穏やかな遠心分離およびデカンテーションによって前記ビーズを分離する、請求項7〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも2種類の異なるキレート剤を含む生理学的pHで2種類の生理食塩水溶液を混合することによって、使用の数分前に調製した溶出溶液の少なくとも等容量でインキュベーションすることによって、EVを前記固定相から除去する、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キレート剤が、EDTAおよびクエン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記最終的な溶出溶液において、EDTAが3〜6mM濃度を有し、クエン酸ナトリウムが1〜300μM濃度を有する、請求項10に記載の方法。
- 溶出溶液との前記インキュベーションが20〜37℃で軌道回転下で維持される、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体液体が、細胞培養培地、生理学的緩衝液、細菌培養培地、ヒト−動物血液、ヒト−動物組織滲出物からなる群より選択される、請求項7〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離されたEVが、次いで、EVからのタンパク質および核酸抽出(DNA、RNA)、特異的抗体と組み合わせた抗原検出技術、ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)による関連する、および/または小胞を含有する核酸の検出および定量、小滴デジタルPCRによる関連する、および/または小胞を含有する核酸の検出および定量のためのプロトコルに供される、請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 以下:
請求項1〜3のいずれか一項に記載の固定相を含む容器、または
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器;ならびに
ニッケルもしくはアルミニウム塩を含む容器
を含む、キット。 - 以下:
生理学的pHで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器;
各々が種々のキレート剤を含む少なくとも2つの容器
をさらに含む、請求項14に記載のキット。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4431546A (en) * | 1981-04-27 | 1984-02-14 | The Public Health Laboratory Services Board | Affinity chromatography using metal ions |
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CN111148828A (zh) * | 2017-07-26 | 2020-05-12 | 罗塞塔外排体株式会社 | 利用阳离子分离细胞外囊泡的方法 |
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WO2008045526A2 (en) * | 2006-10-11 | 2008-04-17 | Phynexus, Inc. | Method and device for preparing an analyte for analysis by mass spectrometry |
US20090308811A1 (en) * | 2008-06-11 | 2009-12-17 | Argonide Corporation | Chromatography device |
WO2016125243A1 (ja) * | 2015-02-03 | 2016-08-11 | 株式会社日立製作所 | エクソソーム測定方法及びエクソソーム抽出方法 |
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Non-Patent Citations (4)
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FATIN MOHD NASIR ET AL.: "Immobilised metal affinity chromatography (IMAC) beads for lysozyme separation: synthesis and charac", MALAYSIAN J. ANAL. SCI., vol. 20, no. 3, JPN6022045723, June 2016 (2016-06-01), pages 578 - 84, XP055500136, ISSN: 0005127744, DOI: 10.17576/mjas-2016-2003-17 * |
JOSHUA A. BORNHORST AND JOSEPH J. FALKE: "Purification of Proteins Using Poluhistidine Affinity Tags.", METHODS ENZYMOL., vol. 326, JPN5021005228, 2000, pages 245 - 254, XP055310519, ISSN: 0005127745, DOI: 10.1016/S0076-6879(00)26058-8 * |
MARIA CHIARA DEREGIBUS ET AL.: "Charge-based precipitation of extracellular vesicles.", INT. J. MOL. MED., vol. 38, no. 5, JPN6022045721, 29 September 2016 (2016-09-29), pages 1359 - 66, ISSN: 0005127743 * |
小澤真一郎ほか: "カラムクロマトグラフィー", 低温科学, vol. 67巻, JPN6023033661, 31 March 2009 (2009-03-31), pages 397 - 407, ISSN: 0005127746 * |
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