KR20200107981A - 생물학적 물질로부터 세포외 소포를 분리하는 방법 - Google Patents

생물학적 물질로부터 세포외 소포를 분리하는 방법 Download PDF

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미첼라 노타란젤로
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유니버시타' 데글리 스투디 디 트렌토
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Abstract

본 발명은 다양한 생물학적 유체로부터 세포외 소포체(EVs)를 분리하는 방법을 개시하며, 니켈 기반 분리 방법(NBI)은 크기가 비균질한 생리학적 pH의 EVs의 정제를 위한 신속하고 측정가능한 방법으로서 상기 물질의 무결성 및 용액내 안정성을 보존할 수 있다.

Description

생물학적 물질로부터 세포외 소포체를 분리하는 방법
본 발명은 세포 배지 혹은 생물학적 유체로부터 세포외 소포체를 분리하는 분야에 관한 것이다.
세포외 소포체(EVs)는 엑소좀 (80 내지 200 mn), 마이크로 소포체 (100 내지 600 μm) 및 세포자살체 (800 내지 5000 nm)를 포함하는 막형성 입자들이다. 이의 분류는 주로 소포체 크기에 기초하나 이들의 생물속생에 관련한 다양한 메카니즘이 제시되었다. 종양학에 있어서, EVs는 종양 미소환경 및 면역 감시의 조절을 연구하거나, 종양에서 방출되는 정보 및/또는 바이오마커(생물표지자)를 포집하거나 혹은 치료제의 담체로서 활용하는 측면에서 잠재적 가능성이 있다.
다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 EVs의 역할에 초점을 둔 생물학적 또는 생체의학적 연구가 증가하는 추세이다. 따라서, 현재 생물학적 물질로부터 EV를 분리는 다수의 기술이 제안되었으나 이들 대부분은 그다지 효율적이지 않거나 표준화할 수 없다 (Thery C, et al., Curr Protoc Cell Bio, 2006; Gardiner C, et al. Extracell Vesicles 2016).
EV 분리에 대하여 지금까지 보고된 기술들은 대부분 엑소좀, 즉 크기가 50 내지 200 nm 정도인 작은 EVs의 정제에 관한 것으로서, 널리 언급된 기술은 다음과 같다:
- 분별 초원심분리 (Livshits et al., Sci Rep. 2015);
- 밀도구배 원심분리 (Van Deun et al., J Extracell Vesicles, 2014; Iwai et al., J Extracell Vesicles., 2016);
- 미세여과 (Merchant et al., Proteomics Clin Appl. 2010; Grant et al., J Immunol Methods, 2011; Hyun-Kyung Woo et al., ACS Nano. 2017);
- 미세유체역학 (Davies et al., Lab Chip, 2012; He et al., Lab Chip, 2014; Kanwar et al., Lab Chip, 2014; Liga et al., Lab Chip, 2015);
- 합성 펩티드 (Ghosh et al., PLoS One, 2014), 헤파린 (Balaj et al., Sci Rep. 2015), 막을 인지하는 조합 항체 (Pugholm et al., Biomed Res Int. 2015; Cao et al., Mol Cell Proteomics, 2008), 단백질 (클러스터 분화나 항원 혹은 구성분)), 또는 Tim4 단백질 (Nakai et al., Sci Rep. 2016)을 이용한 면역침전법;
- 고분자- 혹은 용매계 침전/분리 (Deregibus et al., Int J Mol Med. 2016; Taylor et al., Methods Mol Biol., 2011; Gallart-Palau et al., Sci Rep. 2015);
- 초음파 (Lee et al., ACS Nano 2015);
- ExoQuickTM 함유 컬럼 (System Bioscience), 종합 엑소좀 분리시약 (Thermo Fisher), miRCURYTM 엑소좀 분리 키트 (Exiqon), exoEasy (Qiagen), Exo-spinTM (Cell Guidance), METM 키트 (NEP) 등에 기초한 시판 장치.
초원심분리법이 기초적인 분리 분리방법으로서 현재 가장 효과적이며 널리 응용되는 (금-표준) 절차로 간주되고 있는데 (Gardiner C et al, J Extracell Vesicles, 2016; Al-Nedawi K and Read J Methods Mol Biol. 2016) 그 이유는, 대안적인 밀도구배 원심분리 및 침전 기술의 경우 EV 수율, 조성 및 무결성에 장애가 되는 화학 작용제를 사용하는 점; 면역친화성 포집의 경우 EV 소집단의 분별 분리 (따라서 낮은 비균질성)을 유발하며 또한 항체를 수반하므로 고비용이라는 점; 크기배제 크로마토그래피는 대량의 생물학적 시료를 사용해도 매우 낮은 수율을 보인다는 점; 컬럼- 및 원심분리 장치의 경우 EV 무결성에 큰 손상을 입힌다는 점 등의 결점이 있기 때문이다.
그러나, 초원심분리에도 심각한 문제가 있는데 즉: 시간과 노력이 필요하고, 처리 시료의 부피와 처리시간(6 내지 12시간), 결과로 얻어진 시료의 순도, 사용되는 장치, 운전자의 경험, EVs와 공침전하는 고농도 오염물 (단백질 응괴), 처리시간 동안의 생물분자의 분해 등을 들 수 있다 (Lobb et al, J Extracell Vesicles 2015, Gardiner C et al, J Extracell Vesicles, 2016).
종래 기술에 있어서, Ni2+-관능화된 정지상은 공지되어 있으며 이것은 히스티딘 태그가 있는 재조합 단백질의 정제 혹은 인지를 위해 고안된 것이다. 이러한 관능화된 정지상에서, 제조업자는 관능화에 의해 유래된 순수 양전하에 대해 거의 개시한 바가 없으며 그대신 상이한 pH (가변성이 큰)에서의 안정성 지수를 소개했다. 상기의 순수 양전하는 광범위한 크기의 단백질 (수 내지 수백 kDa)에 대해 용액내 결합 효율에 영향을 미친다.
본 발명의 목적은 적절히 관능화된 정지상, 및 세포외 소포체(EVs) 분리 수단으로서 상기 정지상을 관능화 및 활용하는 관련 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 초원심분리보다 더 신속하고, 노동력이 감소되며, 더욱 효율적이고 또한 현재의 방법보다 더 우수한 장점이 있어야 한다.
본 발명은 마이크로미터 혹은 나노미터 크기를 갖고, Ni2+ 혹은 Al3+ 양이온으로 관능화되어 있으며, 또한 하기에서 보는 바와 같이 비균질 EV 분리에 대한 효율과 연계하여 30 내지 80 mV의 순수 양전하를 갖는 자성 혹은 비자성 입자로 구성될 수 있는 정지상을 제공한다.
본 발명에 따른 정지상 (예, 아가로스 비드)은 크기 범위가 50 내지 2000 nm이고 광범위한 분산도를 특징으로 하는 전체 EVs를 신속 및 효율적으로 분리할 수 있으므로 생체유체 내의 엑소좀과 마이크로 소포체를 모두 포집할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 정지상을 제조하는 방법에 관한 것으로서 이 방법은 비관능화 정지상을, 생리학적 pH로 완충처리된 것으로서 최소 15 mM 내지 최대 100 mM (정지상의 용량에 기초하며 비균질 EVs의 분리에 있어 하기에 예시된 효율을 얻기 위한 농도로서)의 Ni2+ 혹은 Al3+ 염을 함유하는 염수 용액에 현탁시키는 것을 포함하며, 또한 어느 경우에서나 상기의 농도는 사용된 정지상의 용량 및 순수 양전하의 수득량에 의존한다.
일 측면에서, 본 발명은 배양액이나 생물학적 유체 내에서 진핵 혹은 원핵세포 (박테리아)에 의해 분비된 EVs를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상술한 바와 같이 니켈 이온으로 관능화된 정지상을 사용하는 것을 포함한다. 이하, 본 발명의 방법은 니켈 기반 분리방법 (NBI)라고 한다.
세포외 소포체(EVs)는 물리화학적 성질, 예컨대, 지질 이중층 구조와 지질 및 단백질 조성에 의존하는 구조, 크기, 부력밀도, 광학적 성질과 동전기 전위 (제타 전위) 등을 나타낸다 (Yanez-Mo M et al, J Extracell Vesicles 2015).
여기서 개시하는 본 발명의 방법의 원리는 EV 동전기 전위 (이하 ZP라고 한다)와 또한 EV 분리 및 정제를 위한 니켈 이온을 이용한 정지상 (아가로스, 실리콘, 자기 비드 등)의 관능화를 조합하여 활용하는 것에 기초한다.
최근 발표된 보고서들에 따르면, PBS의 생리학적 용액에서 세포외 소포체의 ZP는 -17 내지 -35 mV 이고 (Rupert DL et al, BiochimBiophys Acta 2017), 이는 보통-우수한 안정성 및 우수한 분산성을 나타내는 지표이다 (Correia et al., Langmuir, 2004).
본 발명에 따른 NBI 방법의 장점은 EV 정제에 사용된 금 표준기술(UC)에 관련하여 다음과 같다:
- 신속성: 60분 미만의 응용시간;
- 단순성: 처리단계의 수가 적으며 특수장치는 사용할 필요가 없다:
- 순응성: 관능화 비드의 양은 생물학적 출발 물질의 부피에 따라 조정된다 (수십 밀리리터 내지 리터 단위):
- 효율성: 무결한 EVs의 고회수율;
- 비균질성/분산성: 비균질 EVs (대체로 50 내지 800 nm의 크기 범위)의 동시 침전 및 제한된 응집현상:
- 안정성: NBI에 의해 정제된 다분산 EVs는 UC에 의해 정제된 것보다 더 안정하다:
- 표지/고분자-무함유: 생물학적 출발 물질 시료에 대한 혹은 전체 NBI 과정 중의 소수성 고분자의 무첨가;
- 생리학적 pH: 전체 과정을 pH 7.4로 완충 처리한 염 용액을 이용하여 수행한다:
- 순도: NBI로 단백질 농축된 생물학적 유체로부터 EVs를 선택적으로 정제할 수 있다:
- 조합: NBI를 EVs를 분리하기 위해 고안한 다른 장치와 결합시킬 수 있으며 이는, 특히, 동일한 생물학적 출발 물질로부터 나온 상이한 크기의 EV 소집단을 수득하기 위한 기타의 물리화학적 원리에 기반한다:
- 다재다능성: NBI는 단백질- 혹은 핵산-분해 효소, 예컨대, 트립신, 프로테아제 K, DNAse, 다양한 RNAses 등에 노출된 생물학적 시료에 응용할 수 있다: NBI로 처리한 후 생물학적 시료를 형광 친유성 프로브(probe)로 표지화 할 수 있다:
- NBI로 정제한 세포외 소포체의 체내 주사/주입에 대한 내성이 있다.
일 측면에서, 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 정지상을 함유하는 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 정지상은 바람직하게는 니켈로 관능화처리된다.
정지상은 바람직하게는 자성 혹은 비자성의 아가로스나 실리콘 비드, 알기네이트 염 매트릭스, 부동화 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC)를 위한 고분자, 니켈 킬레이트 수용체 비드, 음이온 (스티렌 디비닐벤젠) 혹은 탄소 (그라펜 등) 스티렌 고분자로 이루어진 군에서 선택된다. 아가로스 비드가 특히 바람직하다.
상기 비드의 크기는 마이크로미터 크기 단위로 0.5 내지 1000 μm; 나노미터 크기 단위로는 1 내지 500 nm의 범위이다.
본 발명의 방법을 이하 공지의 공칭크기 (바람직하게는 25 내지 40 μm)의 아가로스 비드에 관한 실시예에 기반하여 기술하며, 이 비드는 니켈 이온, 즉, 양전하에 의해 관능화되고 따라서 생리학적 용액 내에서 음전하 나노입자와 마이크로입자에 대해 결합이 가능하다. 사용된 비드의 농도에 노출된 니켈 이온의 양은 비드에 전기화학적 성질을 부여하며 이에 따라 순수 양전하는 30 내지 80 mV로서, 비드가 4℃의 생리학적 인산염 완충염수 (PBS) 용액에 보관될 경우 적어도 6개월간 안정하다. 아지드산 나트륨 혹은 20% 에탄올 등과 같은 보존제를 보관용액에 첨가할 수 있으며, 정지상은 사용하기 전에 PBS로 충분히 세척해야 한다.
생리학적 pH의 염수 용액이 바람직한 PBS이지만, 2가 양이온, 예컨대, 니켈 (전이형 혹은 검출가능한 형태로 안정화된)을 저해하지 않고 생리학적 pH 7.4로 완충처리한 기타 다른 완충용액 (트리즈마 베이스, HEPES 등)으로 대체할 수도 있다. Ni2+ 이온 완충 염수 용액은 바람직하게는 0.2 μm 필터로 추가적으로 멸균처리한다.
본 발명에 따른 아가로스 비드는 바람직하게는 비관능화된 비드를 0.2 μm 필터를 통해 멸균처리된 pH 7.4의 PBS에 녹인 15 내지 30 mM 니켈염 용액 (바람직하게는 황산니켈, 염화니켈, 산화니켈 등, 혹은 알루미늄, 황산알루미늄, 염화알루미늄, 산화알루미늄 및/또는 규산알루미늄으로 관능화 처리의 경우)에서 배양함으로써 제조된다.
바람직하게, 니켈염 용액내 비드 혼합물은 실온 (20 내지 25℃)에서 및 최소 1 내지 3분간 가벼운 궤도식 회전하에 배양한다. 배양후 비드를 원심분리를 통해 용액에서 분리한다.
상청액을 제거하고 비드는 완충염수 용액 바람직하게는 멸균된 용액으로 세척한다. 바람직하게, 2 내지 3회 세척을 반복하여 니켈 이온 흔적물을 제거하고 또한 카운터 이온 잔사를 현탁, 원심분리 및 상청액 분리를 통해 제거한다.
세척후, 비드를 바람직하게는 비드와 동일 용량으로서 생리학적 pH로 완충된 염수 용액, 바람직하게는 0.2 μm의 필터를 통해 멸균된 용액에 현탁하고, 이 현탁물을 (이하 CB 비드라고 함) 4 ℃에서 보관할 수 있다.
정지상이 상술한 바와 같이 관능화 처리되기 전에 Ni2+ 혹은 Al3+ 양이온에 의해 관능화되면 (시판 형태로), 200 내지 300 mM NaCl 혹은 KCl, 100 내지 300 mM EDTA 혹은 EGTA 또는 300 내지 500 mM 이미다졸을 보충한 수용액, 또는 광범위한 pH 값 (일반적으로 5 내지 8)의 양이온 킬레이트제 함유 용액으로 상기 정지상을 1회 이상 세척하고 또한 이중 증류수 (18.2 MΩ cm-1)로 1회 이상 세척함으로써 박리 처리해야 한다.
본 발명에 따른 방법은, 바람직하게는 2800 rcf로 원심분리하여 세포 조각에 의해 정화된 생물학적 액체의 표면에 점적 첨가, 임의 크기의 튜브관에 수집 및 실온에서 최소 30분간 배양할 수 있는 CB 비드를 사용하는 것을 포함한다.
CB 비드는 시료의 ml 당 10 내지 30 μl의 부피비로 첨가하며, 그 잉여량은 생물학적 유체에서 확인된 입자의 수에 기초하여 실험적으로 설정할 수 있다.
생물학적 액체는 다음과 같다:
- NBI 절차에서와 같이 사용할 수 있는 최대 1.5%의 태아소혈청(PBS)를 함유하는 세포 배양액이며, PBS의 백분율이 클수록 pH 7.4의 PBS로 희석하는 것이 바람직하다:
- 박테리아 배양액 (LB, 혹은 펩톤, 양 및/또는 이스트 추출물 함유)
- 생리학적 완충액;
- 인간 혹은 동물 유래의 액상 생검 시료 (전혈, 혈청 혹은 혈장, 소변, 뇌척수액, 모유, 타액, 조직 삼출액 등). 이 경우에도 배양액의 점도는 적절한 부피의 PBS로 희석할 수 있다.
생체 시료 CB 비드 + EVs는 경사처리(데칸테이션)로 분리한다. 이 단계는 최대 300 rcf의 최대 속도로 저강도 원심분리시 속도를 높일 수 있으며 동시에 NBI 과정에서 EVs와 정지상의 무결성을 확보할 수 있다.
CB 비드로부터 EV의 탈착은, 사용전 pH 7.4의 PBS에 넣어 신선하게 제조하고 적어도 2가지의 킬레이트제를 함유하는 2종류의 용액 A 및 B를 혼합하여 수득한 용액 (합성 용리액)을 첨가함으로써 수행된다.
상기 용액 A는 바람직하게는 pH 8.0의 3 내지 6 mM EDTA를 함유하며; 더 바람직하게는 용액 A는 pH 8.0의 3 내지 6 mM EDTA를 보충한 PBS이다.
상기 용액 B는 바람직하게는 30 내지 300 μM의 시트르산 나트륨을 함유하며; 더 바람직하게는 용액 B는 30 내지 300 μM의 시트르산 나트륨과 50 내지 100 mM NaCl을 보충한 PBS이다. 용액 A 및 B 모두에 있어서, 사용가능한 다른 킬레이트제로는 이미다졸, DTPA, NTA, 아미독사민, 목적에 따라 고안된 분자들 혹은 Ni2+과 공유 결합 및/또는 경쟁적 결합을 형성할 수 있는 펩티드 등이며, 따라서 정지상으로부터 EV를 보다 효율적으로 방출시키는 단계를 촉진한다.
용액 A 및 B를 혼합한 뒤, 적정량의 KH2PO4를 첨가하거나 (EDTA가 3.2 mM, NaCl이 60 mM 및 시트르산 나트륨이 45 μM일 때 8μl의 KH2PO4를 첨가하거나) 혹은 생리학적 pH 7.4로 완충처리된 기타의 염수 용액을 첨가하며, 동시에 니켈 이온 및/또는 EVs의 형태학적-생화학적 성질을 저해하지 않는다.
CB 비드 + EVs는 바람직하게는 적어도 동일 부피의 용리액으로 배양하며, 이 배양은 바람직하게는 최소 10 내지 20분간 20 내지 37℃, 바람직하게는 28℃ 에서 궤도식 회전하에 이루어진다.
CB 비드를 상기 용리액 + EV 용액으로부터 분리하기 위해, 경사형 로터에서 약 1분간 300 rcf로 원심분리하는 것이 바람직하다. 전체 및 다분산 EVs (일반적으로 50 내지 2000 nm 범위로 분산된)을 함유하는 상청액은 바람직하게는 저결합 시료관에 전달한다.
아가로스 비드에 관련한 상기의 설명은 본 발명에 따른 기타의 정지상에 대해서도 적절한 보정을 통해 유효하다.
단계별로 기술된 상기의 방법은, 안정성이나 이동성 (컬럼, 매트릭스, 필터 등)의 조건에서 상기 명시된 생화학적 조건들에 따른 모든 특징에 관련하여 추가적인 개량 혹은 정지상을 함유하기에 적절한 장치의 조합에 의해 뒷받침될 수 있으며, 따라서 간소화 혹은 절차의 최적화가 가능하다.
상술한 방법은 EVs로부터 RNA 추출, EV 침전 및/또는 항체에 기반한 분류, PCR (폴리머라제 사슬 반응) 및 이의 기술적 변형에 따른, EV에 함유 혹은 흡착된 핵산의 증폭, 진핵세포내 EV의 형질전환, 핵산, 헵티드 혹은 약리 작용성 담체로의 EV 이용 등과 같은 후속의 응용분야와 상용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은:
상술한 바와 같은 정지상을 함유하는 용기, 혹은 대안적으로,
마이크로미터 혹은 나노미터 크기로 된 자성 혹은 비자성 입자로 이루어진 비-관능화 정지상을 함유하는 용기; 및
Ni2+ 혹은 Al3+ 염을 함유하는 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 키트는:
생리학적 pH로 완충처리된 염수 용액을 함유하는 용기; 및
각각 상이한 킬레이터제를 함유하는 적어도 2개의 용기를 더 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 키트는:
생리학적 pH로 완충된 pH 조정 염수 용액과 킬레이트제 혼합물을 함유하는 적어도 하나의 용기를 더 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 키트는:
미세원심분리형 저결합 시료관을 더 포함할 수 있다.
상술한 키트에서, 바람직하게는:
상기 정지상은 25 내지 40 μm의 아가로스 비드로 구성되고;
니켈 염은 NiSO4 이고 또는 알루미늄 염은 Al2O3 혹은 알루미노실리케이트이며;
생리학적 pH로 완충처리된 상기 염수 용액은 PBS이고;
양이온이 Ni2+인 경우 킬레이트제는 EDTA이고 또는 양이온이 Al3+인 경우 상기 킬레이트제는 MgCl2이나 MgSO4 같은 마그네슘 염이며;
양이온이 Ni2+인 경우 또다른 킬레이트제는 시트르산 나트륨이고 또는 양이온이 Al3+인 경우 상기 킬레이트제는 CaCl2이나 Ca3(PO4)2 같은 칼슘 염이고; 또한
pH 조정 염수 용액은 KH2PO4 혹은 K2HPO4이다.
본 발명은 하기의 실시예를 참조하면 더욱 잘 이해하게 될 것이다.
도 1은 사용자 친화적 접근방식으로 다양한 기원의 생물학적 물질로부터 시작하여 본 발명에 따라 NBI에 의한 EV 분리 단계들을 나타내는 개략적인 설명이다.
도 2는 초원심분리법 혹은 NBI를 통해 분리된 입자들의 수 (> 0.5 μm) 간의 비교 결과를 나타내는 유동 세포측정 분석결과를 나타내며, 여기서 A)는 FACS Canto (BD) 기기를 1 및 10 μM 직경의 폴리스티렌 비드로 눈금조정한 것을 나타내고 (F13838, Life Technologies), B)는 비-관능화 비드를 이용하여 NBI 방법으로 포집한 입자들의 갯수를 나타내며 (음성 대조군), 및 C)는 19 mM 황산니켈로 관능화 처리된 아가로스 비드를 이용하여 초원심분리 (56.6%) 혹은 NBI (58.8%) 후에 수득된 입자들의 갯수 (> 0.5 μm (P2))를 나타내고, 그래프는 2가지 독립적 실험을 대표적으로 예시한다.
도 3의 A)는 히스티딘 태그를 이용한 단백질의 정제 방법으로서, 재조합 단백질의 15%-SDS 폴리아크릴아미드 겔 처리후 쿠마씨 염색 결과는 다음과 같다: M: 사전염색 단백질 사다리 1: T7p07 단백질, 105 kDa (겔 상에 2 μg 충전); 2: HuR 단백질, 36 kDa (겔 상에.300 ng 충전); 3: YTHDF1 단백질, 23 kDa (겔 상에 2 μg 충전); B)는 500 μg/ml의 대장균 DH5α 총 단백질 추출물 및 A에 도시된 총 150μg/ml의 재조합 단백질이 농축된 무혈청 세포 배양액에서 수행한 경쟁적 분석법으로서 (T7p07, HuR, YTHDF1), SYPRO 루비 염색 혹은 히스티딘 태그에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯 후에 2개의 평행 겔이 전개되었다. FL (유통)은 NBI 비드에 대한 노출후의 배지이며 그래프는 명시된 나노포어를 이용한 qNANO (iZON Science)에 의한 분석의 결과이다. 1X 용액을 이용하여 단백질 농축계에 들어있는 EV를 최대한 선택적 용리할 수 있다; C)는 용리 완충액에 용해된 킬레이트제와 염류의 농도 증가시 1.5X 이상에서 EV 무결성이 변화하는 것을 나타낸다. qNANO 분석으로 얻은 그래프는 2가지 독립적인 실험의 대표적인 예시이며 갯수와 크기의 감소는 EV에 대한 유해한 영향을 가리킨다.
도 4의 A)는 용리 완충액에 녹인 2.5% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 NBI에 의해 수득된 EVs의 투과전자 현미경(TEM) 분석결과이며; B)는 18*106 (NBI1), 9*106 (NBI2) 혹은 1% U87 세포 총 세포용해물(TCL)로부터 회수된 EV 용해물의 웨스턴 블롯 분석결과이다.
도 5는 초원심분리(UC) 혹은 NBI에 의해 회수된 181±23.8 nm 직경의 4.2*109 리포좀 혼합물을 나타낸다. 포스파티딜 에탄올아민-로다민 (PE-Rho, 5 ng/ml)으로 리포좀 염색후 동일한 시험을 반복했다.
도 6은 3 ml의 무혈청 배지에서 배양되고 그 직후 (t0) 혹은 24일후 (t24, 4℃에서 보관) UC 혹은 NBI에 의해 분석된 U87 세포로부터 분리된 마이크로 소포체를 나타낸다. 정제후 최대 52일간 gNANO 측정을 반복 수행하고, 시간 t0 대비 GraphPad Prism 소프트웨어 v.5를 이용하여 마이크로 소포체 집단의 반감기를 계산했다.
도 7은 표시된 바와 같이 (NBI 1, 2 및 3) 6-웰 플레이트에서 상이한 농도로 시드한 U87 세포와 무혈청 배지를 이용하여 NBI 방법의 재현성을 시험했다. 10% 초원심분리 혈청 조건(dFBS)은 NBI1 시료를 이용하여 얻은 결과와 실질적으로 중복되는 것으로 나타났다. 그래프는 3가지 독립적인 실험의 대표적인 예시이며 총 변동계수(CV)는 6.1%로서, 이는 상기 방법의 재현성이 우수함을 입증하는 것이다.
도 8은 분리된 EVs가 6-웰 플레이트 (1 ml)에서의 세포 밀도의 함수로서 배양액내 다양한 방출 역학성을 보여준다. A)는 EVs는 24시간 후 NBI에 의해 정제되고 세포들은 10 ng/ml Hoechst33342에 노출되었으며, DNA 염색으로 시드된 세포의 수를 나타낸다. "고함량" 분석 장치, 하모니 소프트웨어 v4.1 및 오페레타 기기 (페르킨 엘머)로 영상을 수득했다. B)에서는 A에 언급된 배지를 NBI로 처리하고, Log2에 표시된 엑소좀 및 마이크로 소포체의 갯수를 gNANO로 측정했다 (iZON Science). 표준 편차는 3가지 독립적인 실험에 따른 것이다.
도 9는 NBI에 의해 분리된 EVs의 갯수와 크기를 명시된 바와 같이 수개의 종양 세포주에 대해 분석한 결과를 나타낸다. SH-SY5Y 세포만 EV 집단의 방출이 실질적으로 감소한 것을 보여준다 (**P값 = 0.006, F = 70.13, 및 *** < 0.0001, F = 30.84, ANOVA 및 본페로니 사후-시험 이용). 표준 편차는 3가지 독립적인 실험에 따른 것이다.
도 10은 그램-음성 박테리아에 의해 방출된 소포체의 분리에서 확인된 NBI의 다재다능성을 보여준다. 대장균 DH5α 세포는 OD600 = 0.7에 도달할 때까지 전체 LB 배지에서 성장했다. 박테리아는 15분간 4000 rcf로 원심분리하여 펠릿화하며 상청액은 NBI 처리용으로 사용했다. 입자들을 NP150 및 NP200 나노포어를 이용한 qNANO로 분석했으며, 가장 큰 검출 집단의 직경은 92±29 nm로 나타났다. 그래프는 2가지 독립적인 실험의 대표적인 예시이다.
도 11은 플로렌스의 마이어 칠드런스 대학 종합병원에서 평균 연령 45세인 47명의 건강한 공여자로부터 취한 혈액 미립자 성분을 제작사의 지침에 따라 시스멕스 XE-5000 혈액 분석기 (시스멕스 아메리카, 먼델린, IL)로 집계한 결과를 나타낸다.
도 12는 동일한 공여자의 혈장과 혈청으로부터 NBI에 의해 분리한 마이크로입자 (≥ 500 nm)의 갯수간 비교 결과를 나타낸다. 유동 세포 측정값을 2분간 수득하였고 동일한 입자 집단의 상대 백분율을 도시한다.
도 13의 A)는 NBI를 0;5 ml의 혈장에 적용하고, 명시된 소포체의 갯수와 크기를 TRPS 분석으로 검출한 결과를 나타낸다. 엑소좀의 갯수는 적혈구(RBC)와 상관관계가 있으며 피어슨 계수 = 0.99 이었다. B)는 A에서 수행한 동일한 분석을 마이크로 소포체의 집계에 적용한 것이며, 혈소판과의 상관관계 (PLT)는 0.98이었다.
도 14는 공지의 혈소판 혹은 소구체 표지자에 각각 대항하는 CD41a 및 CD235a 비오티닐화 항체가 "EV 계통"의 탐지에 사용되는 것을 보여준다. NBI에 의해 정제된 용액내 각 소구체 시료는 2개의 균등물로 분할되어 각각 항체나 비오틴 (음성 대조군)으로 배양했다. 스트렙타비딘-접합된 자성 비드로 침전시킨 후, 남아있는 용액내 소구체를 qNANO로 특징화했다. 도시된 입자의 갯수는 상대 음성 대조군에 대해 표준화한다 *P 값 < 0.05; **P 값 < 0.01; ***P 값 < 0.001.
도 15는 47명의 공여자의 혈장으로부터 NBI-정제된 소포체에서 추출한 0.1 내지 4 ng RNA에서 출발하여 20개의 cDNA를 2 마이크로리터의 용량으로 합성한 것이다. 물방울 디지탈 PCR (ddPCR) 분석법을 EvaGreen 화학 및 하기의 프라이머와 함께 사용했다: 5'-CAACGAATTTGGCTACAGCA (서열번호 1) 및 5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG (서열번호 2). QuantaSoft 분석 소프트웨어 (BIORAD)로 분석한 후 GAPDH mRNA의 절대 복제수를 수득했다.
도 16 및 도 17은 도 15에 나타낸 GAPDH mRNA의 절대 복제수가 혈소판 갯수와 정방향의(positive) 상관관계가 있음을 보여준다 (r = 0.62).
도 18은 NBI 방법에 사용한 완충 용액이 물방울 디지탈 PCR (ddPCR)과 상용성이 있으며, 또한 V600E 돌연변이를 함유한 특이적 RNA의 정량분석을 위해 SK-MEL-28 흑색종 세포에서 정제된 전체 EVs에 직접적으로 사용되는 것을 보여준다.p
도 19의 A)는 니켈 (양성) 및 EV (음성) 간의 서로 상반되는 신호의 전하간 초기 결합이 NBI와, 니켈 수용체 비드가 비오티닐화 항체 및 EV 표면에서 특이적 항원을 포집 및 검출하기 위한 스트렙타비딘 비드-공여자와 조합하여 사용되는, 알파(Alpha) 테크놀로지간의 결합을 가능하게 할 수 있음을 나타내며; B)는 인간 혈장내에서 순환하는 EV 상에 존재하는 특이적 항원 (CD235a, CD41a, CD45)의 인지 및 정량화를 예시한다. CD146 항원은 실험적인 음성 대조군 역할을 하는 상피계열 세포를 위한 표지자이다.
도 20은 NBI에 사용된 완충 용액이 웨스턴 블롯 등 변성 조건에서 단백질을 검출하는 종래의 기술과도 상용성이 있음을 보여준다.
실시예 1 - 니켈 이온 관능화 비드의 조제
비드 관능화 방법은 다음과 같이 수행된다:
- 시판 NiNTA 세파로스 고성능 비드 (GE 헬스케어 프로덕트 코드 71-5027-67 혹은 17-5268-01)를 출발 비드로 택했다: 순수 전하값을 측정한 결과, 말번 제타사이저 기기를 이용하여 검출시 20 내지 25℃의 PBS에서 3 내지 25 mV의 범위이다:
- 출발 비드를 200 내지 300 mM NaCl 혹은 KCl, 100 내지 300 mM EDTA 혹은 EGTA 및 300 내지 500 mM 이미다졸을 보충한 수용액 또는 광범위한 pH 범위의 (일반적으로 5 내지 8) 양이온 킬레이트제를 함유한 용액으로 1회 이상 세척하고, 또한 재증류수 (18.2 MΩ cm-1)로 1회 이상 세척하여 박리시킨다;
- 앞서 박리처리한 40 mg/ml의 출발 비드 현탁액 (NiNTA 세파로스 고성능, GE 헬스케어, 17-5268-01, 공지의 공칭크기: 34 μm)을 50 ml 시험관에 분취하여, 0.2 μm의 주사기형 필터로 멸균처리한 pH 7.4의 PBS에 용해시킨 2배 부피 (비드 부피에 대해)의 농축된 19 mM 황산니켈 용액에 재현탁한다.
- 황산니켈 용액내 혼합물을 2분간 가볍게 궤도식 회전하면서 실온에서 배양한다.
- 50 ml의 시험관을 경사형 로터에서 200 rcf로 1분간 원심분리한 다음 시험관 바닥에서 비드를 수집한다.
- 상청액을 천천히 흡입하여 제거하고, 0.2 μm의 주사기형 필터로 멸균처리한 pH 7.4의 3배 부피 (비드 부피에 대해)의 PBS를 비드에 첨가한다.
- 비드를 상술한 바와 같이 또다시 원심분리하고 상청액을 흡입 제거한다.
- 비드에 PBS 첨가 및 제거 단계를 차례대로 2회 이상 반복함으로써 잔류 황산염 혹은 니켈 이온 흔적물을 제거한다
- 0.2 μm의 주사기형 필터로 멸균처리한 pH 7.4의 동일 부피 (비드 부피에 대해)의 PBS에 비드를 재현탁하고, 이들 비드 (이후 CB 비드라고 함)를 4 ℃에서 보관한다.
비드에 노출된 니켈 이온의 양 때문에, 인산염 완충염수(PBS)의 생리학적 용액 내에서 40 내지 60 mV의 순수 양전하가 적어도 6개월 동안 실온에서 안정하게 유지되는 전기화학적 성질을 얻게 된다.
실시예 2 - 생물학적 시료로부터 EV 분리 방법
임의 크기의 시험관에 수집하고 또한 20 μl/ml의 부피비로 30분간 실온에서 배양한 생물학적 액체 (2800 rcf의 원심분리를 통해 세포 조각에 의해 정화된)의 표면에 CB 비드를 점적 첨가할 수 있다.
생물학적 유체는 대부분 1.5% 태아소 혈청(FBS)을 함유하는 세포 배양액으로서, 이때 FBS 백분율이 높을 경우 pH 7.4의 PBS로 희석할 수 있으며, 이는 액체 생검 시료 (전혈, 혈청 혹은 혈장, 소변, 뇌척수액, 모유, 타액 등)일 수 있다.
생물학적 시료로부터 EV 분리는 다음과 같이 수행된다:
- CB 비드는 실온에서 30분간 가볍게 궤도형 회전하면서 (300 내지 600 rpm) 생물학적 시료와 함께 배양하고, 종료시 시험관을 수직 위치에서 안정화하여 관의 바닥에 CB 비드를 중력 침전시키거나 약한 원심분리 (100 내지 400 rcf)를 할 수 있다 (7 내지 15분간).
- 상충액을 완전히 흡입 및 제거한다.
EV 정제, 예를 들어. 비드로부터 이의 분리는, 사용하기 수분 전에 pH 7.4의 PBS에 넣어 조제된 것으로서 킬레이트제를 함유하는 2가지 용액 A 및 B의 혼합물로부터 공급된 용액 (이후 용리액으로 한정함)에 의해 촉진된다.
EV-용리액 A: pH 8.0의 3.2 mM EDTA를 보충한 PBS.
EV-용리액 B: 60 mM NaCl 및 45 μM 시트르산 나트륨을 함유하는 완전한 PBS.
EV-용리액 A 및 B 완충제를 혼합하고 (1% 용리 용액을 수득함), 8 μl/ml의 KR2P04를 EV 용리 직전에 상기 용리 용액에 첨가한다.
이 용리 용액으로 용액내 성분 중 이온교환이 가능하며 아가로스 비드로부터 신속한 EV 분리를 촉진하는 한편 EV 무결성, 크기 및 형태를 보존한다.
EV 정제는 다음과 같이 수행된다:
- CB 비드와 동일한 부피의 용리 용액을 CB 비드에 천천히 점적 첨가한다.
- CB 비드 + 용리 혼합물을 함유하는 시험관을 바람직하게는 28 ℃에서 15분간 궤도식 회전 (500 rpm)과 더불어 배양한다.
- 경사형 로터에서 시험관을 1분간 1800 rpm으로 원심분리한다.
전체 및 다분산 EVs (일반적으로 50 내지 80 nm 범위로 분산된)를 함유하는 상청액을 저결합관으로 이동시킨다.
실시예 3 - UC 혹은 NBI에 의해 분리된 입자 수 (> 0.5 μm) 비교
NBI는 U87 신경교종 세포로부터 방출된 소포체를 분리하는데 적용되었으며, 0.5 μm 보다 큰 직경을 갖는 입자의 갯수 (유동 세포측정법으로 산출된)를, 비관능화 비드에 의해 포집된 경우를 제외하고, 분할 UC를 이용하여 수득한 경우와 비교한다.
실시예 4 - 입자 집단 분석 및 용리 단계의 개선
입자 집단을 분석하고 용액내 EV 농축이 가능하도록 하는 용리 단계를 개선하기 위해, 조정가능한 저항 펄스 감지기(TRPS)를 qNANO 기기와 함께 계통적으로 사용한다.
용리 선택성을 평가하기 위해, 재조합 단백질 및 Ni2+와의 최대 상호작용을 부여하는 것으로 공지된 태그인 6X 히스티딘을 포함한 단백질 농축계에서 경쟁적 시험을 수행했다. DH5α 대장균 세포 (500 μg/ml)의 초기 추출물 및 다양한 정제 단백질 (각각 50 μg/ml, T7p07, 105 kDa, HuR, 36 kDa; YTH, 23 kDa, Fig. 3A)이 보충된 U87 세포의 무혈청 배지는, 기준이 되는 1X 용리 용액 (3.2mM EDTA, 45 μM의 시트르산 나트륨 및 60mM NaCl)을 유지하면서, 완충액 용리 구배에 따라 NBI로 처리했다. HuR 및 YTHDF1이 최소 함량인 I7p07에 농축된 최고 분자량(MW) 단백질은 1.5X 용리 용액 (4.8 mM EDTA, 90 mM NaCl 및 67.5 μM NaCitr)에서 출발하여 점진적으로 용리되었으며, 이를 SDS-PAGE, 루비 SYPRO 염색 및 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 나타냈다 (도 3B). 대조적으로, 대부분의 EVs는 1X 용리 완충액으로 용리했으며, 이는 화학 작용제의 양이 감소하여 용액내 니켈 오염 없이 EV/Ni-비드 상호작용을 저지하기에 충분한 것을 입증한다. 이 경우, 용액은 100 mM 초과의 (> 100 mM) EDTA가 필요하다. 특히, EV의 형태는 상이한 용리 완충액에 따라 변화되며, 이때의 완충액은 1.5X 용액으로부터 출발하여 EV의 크기와 분산성에 영향을 미친다 (도 3C).
투과전자 현미경 사진에서 (TEM) (20500x 및 87000x 배율, 도. 4A) NBI 시료내 낮은 단백질 농도를 확인하였으며 이는 1X 용액이 EV 형태 및 광범위한 분산성을 유지하는 것을 가리킨다. 즉, 동적광 산란기에서 측정시 직경 541 ± 120 nm 및 분산지수 0.61 ± 0.05인 것으로 나타났다 (n = 3). 이러한 데이타를, 적은 갯수의 9*106 U87 세포로부터 얻은 EV 용해물 내의 막 관련 혹은 엔도솜 단백질에 대한 양성도(positivity)에 관한 웨스턴 분석방법과 조합한 결과 (도 4B). 비균질 EV 회수에 대한 NBI의 효과가 확인되었다.
실시예 5 - NBI 과정에서 기계적 충격 및 염의 평형
NBI 처리 과정에서 기계적 힘에 의한 충격과 염의 평형을 분석하기 위해, 엑소좀과 유사한 리포좀을 4가지 상이한 크기 (149, 177, 196, 202 nm)로 제조하고 이의 혼합물을 10 ml의 DMEM 배지에 첨가한 다음 NBI로 처리했다 (도 5). NBI와 UC는 모두 입자를 거의 완전 회수할 수 있다 (98.6%). 대조적으로, 포스파티딜에탄올아민-로다민으로 사전염색되고 초원심분리된 (PE-Rho UC) 리포좀은 PE-Rho NBI 입자들과 대조적으로 유착 작용이 있으며 (> 40 nm 변위), 이는 UV에 의해 야기된 더 큰 막 손상이나 만곡 현상 탓으로 판단된다. 이러한 데이타는 NBI가 EV 형태 보존성이 더 우수하고 또한 큰 장애 없이 인지질-접합 염색과 더불어 이용할 수 있음을 증명한다.
실시예 6 - NBI 대 UC에 의해 분리된 EVs의 안정성 증가의 비교
생물학적 물질은 다양한 보관 조건하에 있으므로, NBI 혹은 UC에 의해 정제된 후 4℃에서 보관한 마이크로 소포체의 회전율을 분석했다 (도 6). 24일 사후-분리 (t24) UC 시료에서, 최초 분석한 600 nm 집단을 300 nm 집단으로 대체했다. 뜻밖에도, NBI 시료에서 동일한 나노포어를 사용하면 최초 EV 집단의 86%를 여전히 검출할 수 있는 것으로 나타났으며 (도 6, 가운데), 계통적 마이크로 소포체 분석 결과 NBI에 따른 EVs는 반감기가 50일 초과 ( > 50일)로서 UV에 따른 EVs의 반감기가 7.35일인 것과 크게 대비되는 것으로 나타났다 (도 6, 우측). 요약하면, NBI는 본래의 EV 형태 및 이의 분산성을 유지하며 따라서 용액내 안정성이 더 우수하게 된다.
실시예 7 - 세포계에서 NBI 방법의 강건성
세포계에서 NBI의 강건성을 평가하기 위해, EVs는 6-웰 플레이트 상에서 3회 중복하여 상이한 밀도로 시드한 U87 세포 배지로부터 독립적으로 정제했다 (도 7). 회수된 입자들은 시드 세포의 갯수에 비례하며, 엑소좀 (197 ± 26 nm)과 마이크로 소포체 (595 ± 37 nm) 양측에 있어서 전체 변동계수가 6.14% 이다 (NBI 1, 2 및 3에서 n = 9); 또한 무혈청 배양액 (MBI1)과 무소포체, 초원심분리 (dFBS) 혈청으로부터 각각 얻은 EVs 간에 통계적으로 유의미한 변화 (P = 0.459)를 확인했다. 흥미로운 것은, 작은 부피에 적용가능한 신속 NBI 방법을 통해 소수의 세포 예컨대 103 세포/cm2를 사용하여 소포체를 방출할 수 있다는 점이다 (도 8). 세포 밀도의 함수로서 엑소좀의 선형 방출을 확인하였으며, 또한 마이크로 소포체의 경우 다양한 유전공학적 메카니즘, 안정성 및/또는 입자 크기에 관련한 세포-매개의 회전율 등과 연계 가능한 다양한 역학성에 따른 일관적인 방출성을 확인했다.
다음, 분리된 EVs를 MC=7, PC3, MDA-MB-231 및 SH-SY5Y 종양 세포주에 대한 NBI 방법과 비교했다. 모든 경우에서 상응하는 크기의 소포체의 균등한 분포를 관측했으나, 양측 소포체 집단의 방출이 적은 SH-SY5Y 세포는 예외였다 (도 9). NBI의 다재다능성은 그램-음성 박테리아 (DH5α 대장균 세포) 생성 소포체의 정제에서도 확인되었으며, 이 경우에는 92±29 nm 직경의 집단이 검출되었다 (도e 10).
실시예 8 - 액체 생검에 대한 NBI 수행 능력
EVs가 다수 종류의 혈액 세포로부터 방출되고 생체표지자로서 연구 대상이 뒬 수 있으므로, 미립성 원소의 갯수가 공지된 건강한 공여자로부터 얻은 액체 생검에 대한 NBI의 수행능력을 평가했다 (도 11). 혈장내 EV 농축성을 혈청 대비 관측하였으며 (도 12), 혈장에 대한 NBI (0.5 ml)를 평균 연령 45±10년의 47명의 대상자에서 계통적으로 수행했다. 도 13A에서 보는 바와 같이, 30.56 ± 25.78*109 엑소좀/ml은 249.5±36.71 nm의 평균 크기로 회수되고 5.49 ± 3.09*108 마이크로 소포체/ml는 564.4 ± 57.3 nm의 평균 크기로 회수되며, 따라서 엑소좀/마이크로 소포체 비는 약 55:1이다. 회수된 엑소좀의 갯수는 적혈구 (RBC) (피어슨 r: 0.998 P 값 < 0.0001), 혈소판 (PLT, 피어슨 r: 0.958) 및 백혈구 (WBC, 피어슨 r: 0.970)의 집계와 상관관계가 있고, 피어슨 r은 각각 호산성 세포 혹은 호염기성 세포의 아종의 백분율 (%)에 따라 0.74 내지 0.72로 감소한다. 다른 한편 (도 13B), 마이크로 소포체의 갯수는 PLT (피어슨 r: 0.989, P 값 < 0.0001), RBC (피어슨 r: 0.976) 및 WBC (피어슨: 0.912)의 수와 보다 밀접한 상관관계가 있으며, 호산성 세포 (피어슨 r: 0.58) 혹은 호염기성 세포 (피어슨 r: 0.35)의 백분율에 대해 낮은 일관성을 나타냈다.
적혈구 CD235a 표지자 혹은 혈소판 CD41a 표지자를 사용하는 정제된 소포체의 면역고갈 처리는 용액내 엑소좀이나 마이크로 소포체의 존재를 감소시켰으며 (도 14), 이는 인간 혈장내 생리학적 EV 양이 산출 가능하다는 것을 가리킨다. 중요한 사실은, 특정 막 단백질에 대한 양성도을 이용하여 다양한 "EV 세포주"를 본래의 세포 종류에 기반하여 열거할 수 있다는 점이다.
마지막으로, 47명의 공여자 EVs에서 추출하여 cDNA로 변환시킨 RNA를 물방울 디지탈 PCR 분석을 위한 GAPDH mRNA/~ 3*109 EV의 절대수(absolute number)를 계산하는데 사용했다 (도 15 및 도 16). mRNA 복제수는 PLT수 (피어슨 r: 0.623)와 상관관계가 있으며, 이는 실질적인 GAPDH mRNA 양이 PLT (도 17)에 의해 제조된 마이크로 소포체 내에 함유되어 있다는 점을 시사한다. 혈장 세포는 이미 GAPDH의 유도 생성자로서 인지되고 있다. EV-함유/연계 RNA는 EvaGreen 화학(BIO-RAD)를 이용하여 또한 전술한 핵산 추출 없이, 단, 유상-반응 물방울에 직접 포집된 NBI-정제 EVs를 이용함으로써 물방울 디지탈 PCR에 따라 분석을 수행했으며 (도 18), 이에 의해 NBI 방법이 고감도 핵산 분석 기술에 이용된 하행류 화학 반응과 상용할 수 있음이 확인되었다.
여기서 기술된 NBI 방법은 또한 EV 표면에 존재할 수도 있는 항원(단백질)을 초고감도로 검출하기 위해 사용된 기타의 기술과 상용할 수 있다. 순수 양전하 (니켈이나 알루미늄 등의 금속) 및 음전하 (EV 등) 간의 상호작용 원리에 따라, NBI는 니켈-킬레이트 비드와 또한 공여자 비드에 의해 인지된 비오티닐화 항체를 이용하는 AlphaScreen (페르킨 엘머) 기술과 조합할 수 있다 (도 19A). 따라서 인간 혈장내 순환하는 EVs는 도 19B에 도시된 항체를 이용하여 직접 검출할 수 있으며, 이는 알파 기술과 연계된 NBI의 직접적인 응용을 보여준다.
또한, NBI 방법은 웨스턴 블롯 기술을 통해 EV-연계 단백질의 존재를 입증할 수 있도록 해주며, 상기 기술의 실험적인 결과는 EVs 전체에서 발현하는 단백질을인지하는 항체를 이용한 도 20에서 보는 바와 같다.
결론적으로, NBI는 차세대 세포외 소포체 분리장치이다.
재료와 방법
세포 배양
U87-MG 인간 신경교종 세포 (ATCC® HTB-14TM), SH-SY5Y 신경세포종 세포주 (ATCC® CRL-2266TM) 및 PC-3 전립선 선암종 (ATCC® CRL-1435TM)을 ATCC 은행으로부터 수득했다 (미국세포주은행). 또는 이를 대신하여, 포유류 선암종 MCF7 (ICLC; HTL95021) 및 MDA-MB-231 (ICLC; HTL99004)의 세포주를 IRCCS 아지엔다 오스페달리에라 유니베르시타리아 산마르티노 (Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino) - IST 이스티튜토 나지오날레 페르 라 리세르카 술 칸크로 (Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro)의 생체은행에서 제공했다. 이들 세포는 점착성으로 성장하며, RPMI 1640 배지에서 배양한 PC-3 세포를 제외한 다른 모든 세포주는 10% FBS (v/v), 100 U/ml 페니실린 + 100 ug/ml 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 첨가한 DMEM에서 성장시키고 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 5% CO2와 함께 37 ℃에서 배양했다. 배지가 함유된 세포외 소포체를 수득하기 위해, 상기 세포들을 초기에는 75%의 컨플루언스(합류점)에 도달할 때까지 (통상 48시간 이내) 전체 배지에서 배양하고; 이어서, PBS로 2회 가볍게 세척한 후, FBS 무함유 배지에서 24시간 배양했다. 수행되는 실험에 따라 세포는 다양한 플레이트 및 플라스크 포맷으로 도말하며, 다만 실험의 구상에 있어 별도의 언급이 없는 한 밀도는 3.2 ± 0.2 *104/cm2 로 일정하게 유지했다.
NBI 절차를 시작하기 앞서, 수집된 배양액을 2800 rcf에서 10분간 원심분리한 후 새로운 시험관으로 조심스럽게 이동시켰다. 도 7에 개시된 실험의 경우, dFBS 조건은 100,000 rcf에서 초원심분리된 PBS를 10% 농도가 되도록 첨가한 배양액에서 NBI를 수행하는 것이다. 이 배양액을 다시 1:10 PBS로 희석하여 용액의 점도를 감소시켰다.
도 9의 세포 밀도 실험에서, U-87-MG, MDA-MB-231, SH-SY5Y, MCF7 및 PC-3 세포주를 각 웰내 세포 갯수가 다음과 같이 되도록 6-웰 플레이트에 3회 중복하여 도말했다: 3.4 x 105; 1.7 x 105; 8.5 x 104; 4.2 x 104; 2.1 x 104 및 1.0 x 104. 전체 배지에서 48시간 배양한 후, 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 FBS-무함유 배지에서 24시간 배양하고 이후 NBI 프로토콜을 계속 진행했다. 이 경우, EV-함유 배지를 취한 후, 부착된 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, Hoechst 33342로 표지화하고, PBS로 세척한 후, 정량분석 영상 촬영기 오페레타 (페르킨 엘머)로 영상을 취득했다. 영상은 10% 배율로 취득하고 웰당 50개의 필드를 하모니 소프트웨어로 분석했다. 다음, qNANO를 사용하는 조정가능한 저항 펄스 감지기로 EVs를 분석했다 (IZON Science).
분별 초원심분리에 의한 EV 분리
T150 플라스크 (CLS430823-50EA)에서 배양한 U87-MG 세포로부터 제조한 EVs는 다소 수정된 디(Di)의 프로토콜에 따라 분별 초원심분리를 통해 분리했다 (Voizio et al., Am J Pathol, 2012; 15: 1573-84). 간략히 말하면, FBS-무함유 배지에서 24시간 배양한 후, 상청액을 팰컨 튜브에 수집 및 4 ℃에서 2,800 rcf로 원심분리하여 세포 조각들을 제거했다. 다음, 상청액을 초원심분리관으로 이동시킨 후 (Polyallomer Quick-Seal 원심분리관 25 Х 89 mm, Beckman Coulter), SW 32 Ti 로터가 장착된 옵티마 XE-90 (Beckman Coulter) 장치를 이용하여 4 ℃에서 30분간 10000 rcf로 원심분리했다. 이 단계를 통해, 마이크로 소포체를 우선적으로 침전시킬 수 있으며 이 소포체를 여과된 PBS에 가볍게 재현탁했다. 다음, Thery C. et al.에 개시된 프로토콜에 따라 (Curr Protoc Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22), 상기 수집된 상청액을 0.22 μm의 일회용 필터 (Sarstedt, Numbrecht, Germany)를 통해 여과함으로써 마이크로 소포체 오염물 혹은 응괴를 제거하고, 4 ℃에서 70분간 100,000 rcf로 원심분리하여 펠릿 엑소좀을 우선적으로 분리했다. 이 펠릿들은 여과된 PBS에 재현탁했다. 분별 초원심분리로 얻은 EVs는 TRPS로 분석하기 전에 모두 합하여 -80 ℃에서 보관하거나 4 ℃에서 유지했다.
NBI 시약 (사용하는 것이 바람직함):
0.2 μm의 일회용 필터막으로 여과한 PBS (ThermoFisher, 10010023) (전체 NBI 프로토콜에 따라 사용됨).
NiSO4 [0.1 M] (Sigma, 656895)
NaCl [5 M] (Sigma, 450006)
시트르산 나트륨 [0.2 M] (Sigma, C8532)
EDTA [0.5] M (ThermoFisher, UltraPure pH 8.0, 15575020)
KH2PO4 [1M] (Sigma, P9791)
박리 완충액: PBS + 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA pH 8.0
EV-용리액 A는 최종 농도인.2 mM EDTA pH 8.0 까지 PBS로 부피를 조정함.
EV-용리액 B는 60 mM NaCl 및 45 μM 의 시트르산 나트륨이 되도록 PBS로 부피를 조정함.
EV-용리 완충액 A 및 B (1X 용리 용액)을 혼합한 후, EV 용리를 진행하기 앞서 8 μl/ml KH2PO4를 1X 용액에 첨가했다.
마이크로 소포체 유동 세포측정 분석
분별 초원심분리 혹은 NBI로 얻은 소포체를 0.22 μm 여과된 PBS로 희석했다. 여과된 PBS의 수득에 기초하여 배경신호를 설정하고, 초당 5건 이하 (≤ 5)의 사건율(event rate)로 수득할 수 있도록 광산란 임계치를 조정했다.
광산란 검출은 로그 크기로 설정했고 정방향 산란과 측방향 산란에 할당된 전압은 각각 300 V 및 310 V 이었다. 또한 상기 임계치는 양측 신호에 대해 모두 200 으로 설정했다. 저유속으로 수득하고 시료는 가볍게 희석하여 스웜 효과 및 사건 일치화를 피했다. 표준 1 및 10 μm의 폴리스티렌 비드 (Invitrogen)를 사용하여 마이크로 소포체를 위한 게이트를 설정했다. 각 시료의 분석에서 시간 획득에 기반하여 10,000 건을 집계한 경우, 적어도 1분의 시간 획득이 기록되었다. 시료 수득은 FACS 칸토 유동 세포측정기 (BD Biosciences)로 수행하고 데이타는 BD 디바 소프트웨어 (BD Biosciences)로 분석했다.
TRPS (조정가능한 저항 펄스 감지기)
qNano (IZON Science) 기구를 이용한 TRPS에 의해 EV 크기 및 농도를 특징화 했다. 적어도 2분간의 기록을 분석하는 6-웰 플레이트 실험시 (도 9, 도 3C 및 도 8) 혹은 입자율이 100 입자/분 미만인 시료의 경우가 아니라면, 각 시료에 대해 평균 500개의 입자를 집계했다. NP200 나노포어 (A40948, A43545, A43667, A43667), NP400 (A43592, A44117, A44116), NP800 (A40542, A36164, A40548, A44118) 및 N1000 (A40572)를 I 45.5 내지 I 47 mm의 간격으로 사용했다. 전압은 0.12 내지 0.68 V로 설정하여 95 내지 130 mA 범위의 정상 전류 강도를 유지했고, 이때의 배경 노이즈는 7 내지 12 pA 미만이며 선형 입자 집계율을 수반한다. 눈금보상 입자 CPC100B (Batch ID: B8748N), CPC200B (Batch ID: B6481M), CPC500E (Batch ID: 659543B), CPC800E (Batch ID: 634561B) 및 CPC1000F (Batch ID: 669582B)는 각각의 평균 직경이 114 nm, 210 nm, 500 nm, 710 nm 및 940 nm으로서, iZON Science 사에서 구입했다. qNANO를 이용한 분석에 관련된 모든 데이타는 Izon Control Suite v.3 소프트웨어로 기록 및 분석했다.
투과전자 현미경 측정 (TEM)
투과전자 현미경(TEM)을 이용하여 소포체를 가시화했다. 간략히 말하면, 2.5% 포름알데히드가 포함된 용리 완충액에 고정시킨 각 시료에서 5 μl의 분취물을 탄소 박막으로 피복된 구리 및 니켈로 된 300-스퀘어 메시의 그리드(grid)에 올려놓았다. 다음, 그리드를 pH 4.5의 1% 우라닐 아세테이트 완충액으로 음성 표지화하고, 올림퍼스 모라다 카메라를 장착한 100 kV TEM PEI 테크나이 G2 스피리트 현미경으로 관측했다 (배율: 20500x 및 87000x).
항-CD63 항체 (Abcam, ab193349), 항-플로틸린-1 (BD Biosciences, 610821) 및 항-알릭스 (Cell Signaling Technology, #2171)를 이용하여 연속으로 웨스턴 블롯 분석을 수행했다..
경쟁적 분석
EV 용리 단계는 경쟁적 분석법으로 시험했으며, 구체적으로, DH5α 대장균으로부터 얻은 30 μg/ml의 단백질 추출물 및 히스티딘 태그가 있고 정제된 15 μg/ml의 재조합 단백질 (T7 RNA pol, 110 kDa; HuR, 36 kDa; YTH, 23 kDa)을 U87-MG 세포 유래의 EV가 함유된 10 ml의 배지에 첨가했다. 간략히 말하면, OD600 0.5에 도달할 때까지 LB 배지에서 DH5α 세포를 계속 배양한 다음 6000 rcf에서 5분간 원심분리하여 수집했다. 펠릿을 3 mL의 DMEM 배지 + 1 μg/ml의 리소자임에 재현탁한 다음 4 ℃의 항온조에서 7회 주기로 초음파 처리했다 (40 초음파 진폭, 7 초 진행, 10 초 휴지). 용해물은 EV-함유 배지에 첨가하기 전에 13,000 rcf로 20분간 원심분리하여 정제한 다음 0.2 μm의 일회용 필터로 여과했다. 편리하게는, 히스티딘 T7 RNA 폴리머라제로 태그된 재조합 단백질을 S 맨시 박사의 연구실에서 제공했다 (CIBIO, University of Trento); 재조합 단백질 HuR (D'Agostino et al., PLoS One, 2013 Aug 12; 8 (8): e72426) 및 YTH (Xu et al., J Biol Chem. 2015 Oct 9; 290: 24902-13)은 참조문헌에 기술된 바와 같이 제조 및 정제했다.
도 3B에 명시된 용리 구배 용액을 제외하고, NBI는 상술한 배양 시간 및 시약에 따라 수행되었다. 단백질 시료는 비신코닌산 분석 (BCA)과 브래드포드 분석법을 통해 정량화하고 이때 각각의 프로토콜 지침에 따른다. 등량 부피 (equal volume)의 용리물을 12% SDS-PAGE에 충전한 다음, 1:1000 희석도의 1차 항-히스티딘 항체 (ab1187)을 이용하여 Sypro Ruby 염색 혹은 웨스턴 블롯 분석을 수행했다.
회수된 입자의 갯수와 크기를, NP800, NP400 및 NP200 나노포어를 이용하여 시료의 비균질성을 확인하는 TRPS로 분석했다.
그램-양성 박테리아로부터 EV 분리
OD600이 0.7에 도달할 때까지 전체 LB 배지에서 DH5α 대장균 세포를 배양했다. 세포를 4,000 rcf에서 15분간 펠릿화하고 상청액을 NBI 프로토콜에 따라 처리하기 위해 수집했다. NP150 및 NP200 나노포어를 이용한 qNANO 기기로 입자를 집계했다.
리포좀 조제
진핵세포 소포체와 유사한 지질 조성을 가진 리포좀 지질 조성은: 20% 포스파티딜콜린의 몰수, 10% 포스파티딜에탄올아민의 몰수, 15% 올레오포스파티딜세린 몰수, 15% 스핑고미엘린의 몰수 및 40% 콜레스테롤의 몰수 (Llorente et al. Biochim, Biophys, Acta 2013; 1831: 1302-9; Haraszti et al., J. Extracell, Vesicles 2016; 5: 32570)로 구성된다. 회전식 증발장치에서 유기용매 (예, 클로로포름)를 지질 용액으로부터 제거하고 적어도 1시간 동안 진공 건조함으로써 지질막이 생성되었다. 최종 농도 1 mg/mL의 지질을 DPBS에 재현탁하고 소용돌이 장치로 강하게 교반하여 다층 리포좀을 형성했으며, 이를 6회의 냉동-해동 주기에 노출했다. 최종 리포좀 형태는 2중-주사기형 압출기를 이용하여 다층 리포좀의 현탁물을 압출시켜 수득했다 (LiposoFast Basic Unit, Avestin Inc.). 상이한 기공 크기를 가진 2개의 적층 폴리카보네이트 필터 (밀리포어)를 통해 31 단계를 수행하여 상이한 크기의 소포체를 수득했으며 (MacDonald et al. BiochimBiophys, Acta 1991; 1061: 297-303), 그 후 ZetaSizer 기기를 이용한 광자 상관 분광법으로 이를 확인했다 (Nano-ZS, Malvern Instruments).
혈액 시료
건강한 공여자로부터 얻은 전혈 시료를 마이어 칠드런스 대학종합병원에서 수집했다. 혈장 시료는 시판 EDTA-처리관에 수집하여 냉장시설을 이용하여 종합병원 생체은행에서 연구소로 운반했다. 시료 분석에 앞서 공여자로부터 정보 동의서를 받았다.
냉장 원심분리기 (4 ℃)를 이용하여 2,000 rcf로 10분간 원심분리한 후 세포를 제거하여 혈장을 수득했다 (Eppendorf 5702 R, Milan, Italy). 혈액 응집 후 실온에서 30분간 그대로 놓아두어 혈청 시료를 수득했다. 응괴는 냉장 원심분리기 (4 ℃)를 이용하여 2,000 rcf로 원심분리함으로써 제거했다 (Eppendorf 5702 R, Milan, Italy). 완전 혈구 수치를 시스멕스 XE-500 유동 세포측정기로 분석했다 (Sysmex America, Mundelein, IL). 분석 절차는 프로토콜 지침에 따라 수행되었다.
NBI로 정제한 소포체의 면역고갈 처리는 항-CD235a (MiltenylBiotec, 130-100-271) 및 항-CD41a (MiltenylBiotec, 130-105-608) 비오티닐화 항체와 또한 스트렙타비딘 비드 (ThermoFisher, 11205D)를 각각 사용하여 수행했다. 소포체는 비드의 침전후 qNANO로 분석하고 이를 비오틴의 정량분석 등가물을 함유한 각 대조군 시료의 입자 수를 기준으로 표준화했다 (Sigma, B4501).
RNA 추출
총 RNA를 QIAzol 시약(QIAGEN)을 이용하여 다소 수정된 해당 지침에 따라 추출했다. 간략히 말하면, 100 μl의 QIAzol를 EV 용리 단계 전의 비드에 직접 첨가하고, 그 후 소용돌이 장치로 교반하고 실온에서 5분간 배양했다. 다음, 20 μl의 클로로포름을 첨가했다. 15초간 강하게 혼합한 후 시료를 실온에서 3분간 배양했다. 4 ℃에서 15분간 12,000 rcf로 원심분리하여 상들을 분리하고 수성상을 제거했다. 1 μl의 글리코겐 (20 mg/ml) 및 100 μl의 이소프로판올을 첨가한 후, RNA를 -80 ℃에서 하룻밤 동안 침전시켰다. 12,000 rcf로 10분간 원심분리한 후, RNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고 상술한 바와 같이 원심분리한 다음 10 μl의 RNase-무함유 수액에 재현탁했다. RNA는 해당 프로토콜 지침에 따라 생체분석기 RNA 6000 피코 키트로 정량화했다 (Agilent Technologies).
역전사 반응 및 물방울 디지탈 PCR
다음의 반응 조성물과 함께 해당 프로토콜 지침에 따라 miRCURYLNA 유니버살 RT 마이크로RNA PCR 키트, 유니버살 cDNA 합성 키트 II (Exiqon)를 이용하여 역전사 반응을 수행했다: 2.3 μl의 5X 반응 완충액, 1.15 μl의 효소 혼합물, 0.5 μl의 합성 RNA 스파이크-인 및 7.5 μl의 탬플릿 총 RNA. QX200TM 물방울 디지탈 TM PCR 장치 (BioRad)는 EvaGreen 화학 및 하기의 프라이머를 이용하여 GAPDH mRNA를 정량화하는데 사용했다: 5'-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3'(서열번호 1) 및 5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3' (서열번호 2).
AlphaScreen 분석
384-옵티플레이트 (페르킨 엘머)를 이용하여 20 μl의 최종 부피에서 반응을 수행했다. 분석은 15 μg/ml의 니켈-킬레이트 수용체 비드 및 10 μg/ml의 스트렙타비딘-공여자 비드를 단계식 항체 희석물과 함께 이용하여 PBS에서 분석을 최적화함으로써 부착점을 동정했다. 표면 표지자의 존재는 EV 단계식 희석물과 함께 용량-반응 측면에서 분석했으며 이는 상기 TRPS에 의해 특징화되었다. EVs는 건강한 공여자의 혈장 혹은 혈청-무함유 종양세포 시료로부터 NBI에 의해 정제되었다. 실온 및 어두운 곳에서 90분간 배양한 후 형광신호를 엔스파이어 장치 (페르킨 엘머)로 최종 검출했다.
통계 분석
데이타 및 독립 실험의 개수를 도면 상의 관런 설명에 표시한다. 해석, t-시험 및 피어슨 r 계수 등은 GraphPad 프리즘 v5.1 소프트웨어로 계산했으며, 이 결과는 P 값이 < 0.05(*), < 0.01 (**), < 0.001 (***) 일때 통계적 유의미성이 있는 것으로 판단했다.

Claims (17)

  1. 니켈 및 알루미늄으로 이루어진 군에서 선택된 양이온에 의해 관능화된 정지상으로서, 30 내지 80 mV의 순수 양전하를 갖는 것을 특징으로 하며, 상기 정지상은 마이크로미터나 나노미터 크기의 자성 혹은 비자성 입자들로 구성되는 것인 정지상.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 정지상은 자성 혹은 비자성의 아가로스나 실리콘 비드, 알기네이트 염 매트릭스, 부동화된 금속이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 용도의 고분자, 니켈 킬레이트 수용체 비드, 음이온 혹은 탄소 스티렌 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 정지상.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    마이크로미터 크기인 경우 25 내지 40 μm의 평균 크기를 가진 입자들을 포함하는 것인 정지상.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 정지상을 제조하는 방법으로서,
    비관능화 정지상을 15 내지 100 mM의 니켈 혹은 알루미늄 염을 함유하고 생리학적 pH로 완충된 염수 용액에 현탁시키는 것을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 생리학적 pH로 완충된 염수 용액은 PBS 혹은 pH 7 내지 7.5의 다른 완충액인 것인 방법.
  6. 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁액은 가벼운 궤도식 회전과 함께 실온에서 배양하는 것인 방법.
  7. 생물학적 액체내 진핵세포 혹은 원핵세포에 의해 분비된 세포외 소포체(EVs)를 분리하는 방법으로서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 관능화된 정지상을 사용하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 정지상을 생물학적 액체의 표면에 점적 첨가하는 것인 방법.
  9. 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 액체내 배양 후 가벼운 원심분리 및 경사처리에 의해 비드가 분리되는 것인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2가지의 상이한 킬레이트제를 함유하는 생리학적 pH의 2가지 염수 용액을 혼합하고 사용하기 몇분 전에 조제된 등량 부피의 용리 용액에서 배양함으로써, 이 정지상으로부터 EVs가 분리되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    킬레이트제는 EDTA와 시트르산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법..
  12. 제10항에 있어서,
    최종 용리 용액에 함유된 EDTA는 3.6 mM의 농도를 갖고 또한 시트르산 나트륨은 1 내지 300 μM의 농도를 갖는 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    용리 용액내 배양은 20 내지 37 ℃에서 궤도식 회전하에 유지되는 것인 방법.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 액체는 세포 배양액, 생리학적 완충 용액, 박테리아 배양액, 인간-동물 혈액 및 인간-동물 조직 삼출액으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    분리된 EVs는 후속으로 EVs로부터의 단백질 및 핵산의 추출(DNA, RNA), 특정 항체와 조합된 항원 검출 기술, 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의한 관련 핵산 및/또는 소포체-함유 핵산의 검출과 정량화, 또한 물방울 디지탈 PCR에 의한 관련 핵산 및/또는 소포체-함유 핵산의 검출 및 정량화를 위한 프로토콜에 따라 처리되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 정지상을 함유하는 용기, 또는
    마이크로미터 혹은 나노미터 크기의 자성 및 비자성 입자로 이루어진 비관능화 정지상을 함유하는 용기; 및
    니켈이나 알루미늄 염을 함유하는 용기를 포함하는 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    생리학적 pH로 완충된 염수 용액을 함유하는 용기; 및
    각각 다른 킬레이트제를 함유하는 적어도 2개의 용기를 더 포함하는 것인 키트.
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