WO2016185564A1 - 細胞外小胞の分画取得方法及び分画方法 - Google Patents

細胞外小胞の分画取得方法及び分画方法 Download PDF

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WO2016185564A1
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千裕 万里
洋一 西田
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株式会社 日立製作所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to an extracellular vesicle fraction acquisition method and a fractionation method.
  • An exosome is a vesicle that exists inside a multivesicular endosome within a cell and is released to the outside by fusing the outer endosome that is fused with the cell membrane. It was originally thought to be a mechanism for discarding unnecessary molecules for cells, but recently it was discovered that microRNA (miRNA), which plays an important role in suppressing gene expression in vivo, is retained inside the cell. It has become a focus of attention as a biomarker including signal transduction membrane vesicles and diagnosis. miRNA is a small RNA of 18 to 25 bases, and is present not only in cells but also in body fluids such as blood.
  • the expression pattern of miRNA is tissue-specific, the expression pattern is different between cancer tissue and non-cancer tissue, and the expression pattern is also different depending on the cancer type. For this reason, miRNA in the blood is attracting attention as it can serve as a biomarker for identifying the primary tumor focus and identifying the cancer type.
  • exosome miRNA is highly tissue-specific, and other miRNAs and dead cells that exist in blood can be removed in the process of separating exosomes, so exosomes are separated and encapsulated from biological samples such as blood.
  • a method for diagnosing cancer in which after miRNA is extracted and purified, by analyzing the expression and sequence of the miRNA, cancer can be diagnosed and the tissue from which cancer cells are derived can be identified. Development is underway.
  • Exosomes may contain proteins in addition to miRNA, and the types and amounts thereof are known to vary depending on the cells having exosomes and the function of exosomes. In addition, the size of exosomes is also considered to change depending on the amount of contents to be included.
  • an ultracentrifugation method for example, see Non-Patent Document 1. Specifically, after removing unnecessary substances by centrifuging the cell culture supernatant at 300 ⁇ g for 10 minutes, the obtained supernatant was 10000 ⁇ g, centrifuged once for 30 minutes, 70000 ⁇ g, Centrifuge for 60 minutes. The obtained precipitate is dissolved in a sucrose solution having a density gradient, and then ultracentrifugation is performed at 100,000 ⁇ g for 15 minutes, and the obtained precipitate is dissolved in physiological saline and the like, and 200000 ⁇ g, Perform ultracentrifugation for 1 hour. Exosome is contained in the precipitate after centrifugation.
  • PEG polyethylene glycol
  • a PEG reagent having a molecular weight of 6000 or 8000 is mixed with a biological sample to a final concentration of 10% (w / v), and allowed to stand at 4 ° C., followed by centrifugation at 1500 to 3000 ⁇ g for 30 to 60 minutes.
  • the exosome is contained in the precipitate obtained.
  • Patent Documents 1 and 2 all target exosomes with a diameter of about 100 nm, there is a problem that only a part of exosomes with a wide distribution range can be obtained. Further, in Non-Patent Document 1, there is a problem that a special device such as an ultracentrifuge is required and a recovery rate is low and a long time is required.
  • an object of the present invention is to provide a method for easily obtaining an extracellular vesicle fraction based on its size from a biological sample.
  • One embodiment of the present invention is a method for obtaining an extracellular vesicle (EV) fraction from a biological sample, wherein a plurality of the biological samples are mixed with polyethylene glycol (PEG) having different molecular weights, respectively. And centrifuging the biological sample mixed with PEG to obtain a precipitate.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of blood (plasma, serum), urine, bone marrow fluid, semen, breast milk, amniotic fluid, tears, biopsy tissue, and cell culture supernatant.
  • the polyethylene glycol may have an average molecular weight of 200 to 100,000 or 3000 to 20,000.
  • the biological sample mixed with PEG may have a polyethylene glycol concentration of 3 to 20% (w / v).
  • the polyethylene glycol concentration of the biological sample mixed with PEG may be 5 to 10% (w / v).
  • Another embodiment of the present invention is a method for obtaining an extracellular vesicle (EV) fraction from a biological sample, the method comprising the step of mixing a first polyethylene glycol (PEG) with the biological sample. Centrifuging the biological sample mixed with 1 PEG to obtain a supernatant and a first precipitate; and mixing a second PEG having a molecular weight different from the first PEG into the supernatant; And centrifuge the supernatant mixed with the second PEG to obtain a second precipitate.
  • PEG polyethylene glycol
  • a further embodiment of the present invention is a method for fractionating extracellular vesicles (EV) contained in a biological sample, according to the method for obtaining any of the above-mentioned extracellular vesicle fractions.
  • the method includes a step of obtaining a blast fraction.
  • a further embodiment of the present invention is a method for identifying the type of disease affecting a living body, wherein an EV fraction is obtained using a sample obtained from the living body by any one of the above-described EV fraction obtaining methods.
  • the method includes a step of comparing the specific number information and / or information other than the number information, and a step of specifying a type of a disease affected by the living body.
  • the disease may be a tumor.
  • the EV number information of the EV fraction may be the number of the EVs or a ratio thereof with respect to the whole.
  • the EV fraction information other than the EV number information includes the expression level of the surface antigen of the EV, the type or expression level of the protein or microRNA held in the EV, the shape of the EV or the hardness of the EV, It may be.
  • the present invention makes it possible to provide a method for easily obtaining an extracellular vesicle fraction based on its size from a biological sample.
  • the method comprising: mixing a sample with polyethylene glycol (PEG) having a different molecular weight; and centrifuging a biological sample mixed with PEG to obtain a precipitate.
  • Extracellular vesicles according to the present specification EV, also called extracellular granule) refers to vesicles of the order of nm to ⁇ m in diameter, which are formed by lipid bilayers that contain exosomes and are secreted extracellularly.
  • size of EV shall mean the diameter when the said EV is made spherical.
  • the origin of the biological sample for obtaining the EV fraction is not particularly limited, and examples thereof include blood, urine, bone marrow fluid, semen, breast milk, amniotic fluid, tears, biopsy tissue, and cell culture supernatant.
  • the cell type containing EV to be acquired is not limited, and examples thereof include tumor cells, dendritic cells, erythrocytes, lymphocytes, platelets, epithelial cells and the like.
  • the biological species from which the biological sample is derived is not limited, and examples include humans, mice, rats, monkeys, dogs, cats, cows, horses, pigs, and sheep.
  • FIG. 1 shows an example of a method for acquiring a fraction based on the size of EV to which the present invention is applied.
  • a biological sample for acquiring EV is centrifuged, and the contaminants are removed by discarding the precipitate (step S101).
  • Centrifugation conditions are not particularly limited, but it is preferably 2000 to 3000 ⁇ g, 15 to 30 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant after centrifugation is dispensed into a plurality of tubes (n) (step S102).
  • n a plurality of the same biological samples can be prepared, but the biological samples may be separated into a plurality of tubes (n tubes) before centrifugation, and each supernatant may be used for the following operations after centrifugation.
  • the biological sample is a cell mass
  • the cells may be separated in advance by, for example, trypsin treatment or pipetting treatment.
  • each PEG preparation reagent differs in the average molecular weight of the PEG contained.
  • the average molecular weight of PEG is not particularly limited, but is preferably in the range of 200 to 100,000, more preferably in the range of 1000 to 50000, and still more preferably in the range of 5000 to 20000.
  • Fig. 2 shows examples of PEG preparation reagents.
  • PEG5k indicates that PEG having an average molecular weight of about 5000 is dissolved in the reagent.
  • the molecular weight distribution of the PEG is not particularly limited, and may be 5000 ⁇ 4000, 5000 ⁇ 1000, or 5000 ⁇ 300.
  • PEG8k indicates that PEG having an average molecular weight of about 8000 is dissolved in the reagent.
  • the molecular weight distribution of the PEG is not particularly limited, and may be 8000 ⁇ 4000, 8000 ⁇ 1000, or 8000 ⁇ 300.
  • PEG 10k indicates that PEG having an average molecular weight of about 10,000 is dissolved in the reagent.
  • the molecular weight distribution of the PEG is not particularly limited, and may be 10,000 ⁇ 5000, 10,000 ⁇ 1500, or 10,000 ⁇ 500.
  • PEG 20k indicates that PEG having an average molecular weight of about 20000 is dissolved in the reagent.
  • the molecular weight distribution of PEG is not particularly limited, and may be 20000 ⁇ 10000, 20000 ⁇ 5000, or 20000 ⁇ 500.
  • the final PEG concentration of the biological sample is not particularly limited, but is preferably 10% to 50% (w / v), more preferably 3 to 20% (w / v).
  • a solvent for dissolving PEG PBS (Phosphate buffered saline), TBS (Tris buffered saline), HBS (HEPES buffered saline), or the like may be used.
  • a salt such as NaCl or KCl may be added, and the final salt concentration is not particularly limited, but is preferably 0.01 M to 0.5 M, more preferably 0.1 M to 0.3 M.
  • the biological sample mixed with PEG is allowed to stand (step S104).
  • the standing time and temperature are not particularly limited, but it is preferable to stand at 4 ° C. for 30 minutes to overnight.
  • the standing time can be appropriately adjusted by a person skilled in the art, for example, increasing the length of EV when the amount of EV contained in the biological sample is small, and shortening the time when the EV is large.
  • the biological sample mixed with PEG is allowed to stand and then centrifuged (step S105).
  • the conditions are not particularly limited, but may be performed at, for example, 1500 to 10000 ⁇ g, 5 to 60 minutes at 4 ° C.
  • each precipitate is set to EV fractions 1 to n divided by size (step S106).
  • a plurality of same biological samples are not required, and a plurality of EV fractions can be obtained from one biological sample.
  • the biological sample to be used, the drug such as PEG, each basic operation, and each reaction condition are in accordance with “Extracellular vesicle fraction acquisition method 1”.
  • the biological sample is centrifuged to remove impurities.
  • the biological sample mixed with PEG (average molecular weight A) is allowed to stand, then centrifuged, the precipitate is made into fraction 1 of EV, the supernatant is transferred to a new tube, and a PEG preparation reagent (average molecular weight B) is added. .
  • the concentration of PEG (average molecular weight B) at this time can be determined as appropriate regardless of PEG (average molecular weight A), and may be the same as when PEG (average molecular weight B) is added alone. It may be lower.
  • the biological sample mixed with PEG (average molecular weight B) is allowed to stand again and then centrifuged, and the precipitate is designated as EV fraction 2.
  • the average molecular weight of PEG is determined so that A ⁇ B.
  • EV fractions having different sizes can be further obtained.
  • PEG having an average molecular weight of A to N it is possible to obtain EV fractions 1 to n divided by size as in “Extracellular vesicle fraction acquisition method 1”.
  • extracellular vesicle fraction acquisition method 1 By using “extracellular vesicle fraction acquisition method 1”, it is possible to obtain all fractions based on the size of EV at a time. In addition, if “extracellular vesicle fraction acquisition method 2” is used, fractions based on the size of EV can be sequentially obtained by handling few tubes in a single operation. This is effective when there are few samples.
  • a disease identification method for identifying a type of a disease affecting a living body includes a step of acquiring an EV fraction using a sample obtained from the living body by the above EV fraction acquisition method, Step of obtaining EV fraction information other than EV number information of EV fraction and / or EV fraction, number information and / or information other than number information, and number information and / or number information peculiar to disease And a step of comparing information other than the above and a step of identifying the type of disease affecting the living body.
  • the EV number information of the EV fraction is, for example, the number of EVs in the EV fraction or its ratio to the whole EV.
  • the EV fraction information other than the number information can be exemplified by, for example, the expression level of the surface antigen of EV, the type or expression level of the protein or microRNA held in the EV, the shape of EV or the hardness of EV.
  • This method enables early and prognosis diagnosis for diseases such as cancer. For example, because EV contains different constituent components depending on the type of cancer and the degree of cancer progression, the type of cancer, the primary tumor focus, the degree of cancer progression, etc. are identified by EV analysis. can do.
  • FIG. 3 shows the cancer diagnosis method of the present invention.
  • the EV fraction is acquired from the biological sample of the diagnosis subject by the above-described EV fraction acquisition method (S1000). Then, the EV number is measured in each fraction. In cancer cells, the number of EV secretion increases compared to normal cells. Therefore, using the number of EV secretion in normal cells as a reference value, it is determined whether the total number of EVs obtained from each EV fraction is equal to or greater than the reference value (step S1020). When the total number of EVs falls below the reference value, it is determined that the cancer is not a diagnosis target (step S1030), and the process ends. If the total number of EVs exceeds the reference value, the cancer type is identified. Note that the number of EV secretion in normal cells, which is a reference value, may be set in advance from the total number of EVs in the healthy population, the previous value of the diagnosis target, or the like.
  • the number of EV information (number and ratio of EVs included in each EV fraction) of each EV fraction is compared with a database to try to determine whether the cancer type can be identified. (Step S1040).
  • FIG. 4 shows a configuration example of the database used in step S1040.
  • the table 1100 is composed of feature information of each EV fraction for each cancer type.
  • Column 1101 describes the cancer type
  • column 1102 describes the EV number information of each EV fraction
  • column 1103 lists the surface antigen information of each EV fraction
  • column 1104 lists the miRNA information of each EV fraction.
  • the item string is not limited to this, and may be EV shape information of each EV fraction, EV hardness information of each EV fraction, protein information included in the EV of each EV fraction, and the like.
  • the EV number information of each EV fraction in the column 1102 is an essential item.
  • the EV number information of each EV fraction in the column 1102 includes a table 1105.
  • the table 1105 compares the number and ratio of EVs included in each EV fraction (the value obtained by dividing the number of EVs included in the EV fraction by the total number of EVs) with the reference value, which is larger (+) and smaller.
  • the characteristics of (-) are stored for each cancer type and each EV fraction.
  • the column 1103 includes, for example, a table 1106 that is surface antigen information of each EV fraction.
  • the table 1106 stores information on the expression level of EV surface antigen that is higher (+), lower ( ⁇ ), and unchanged (/) than the reference value for each cancer type and EV fraction. is doing.
  • the reference value for example, the surface antigen expression level in each EV fraction of a healthy population can be used.
  • a surface antigen a marker that is present in EV and is expressed specifically in cancer or a cancer type can be used.
  • the column 1104 includes, for example, a table 1107 that is miRNA information of each EV fraction.
  • the table 1107 shows that the expression level of miRNA held in the EV is higher (+), lower ( ⁇ ), no change (/), compared to the reference value, for each cancer type. This is shown for each EV fraction.
  • the reference value for example, the expression level of miRNA in each EV fraction of a healthy population can be used.
  • miRNA cancer type-specific miRNA information and the like are stored.
  • the miRNA information is not limited to the miRNA expression level, and miRNA cancer type-specific sequence information may be used.
  • the EV number information of each EV fraction is compared with such a database, the EV number information is compared with a reference value for each EV fraction of the diagnosis subject, and a large (+) or a small ( ⁇ ) is determined. 4 Compare with column 1102 in the database. If there is an exact profile, the cancer type can be identified. If there are multiple cancer types that do not match the profiles or show matching profiles, the cancer types cannot be identified reliably. In that case, information other than the EV number information of the EV fraction (expression level of EV surface antigen, type or expression level of protein or microRNA retained in EV, shape of EV or hardness of EV) is used. The cancer type is specified (step S1060).
  • the EV fraction and information effective for discrimination can be selected by referring to the profile of the cancer type that is a candidate in the database of FIG. In this way, finally, the cancer type can be identified by comparing the result of the detailed analysis and the database shown in FIG. 4 (step S1050).
  • EV increase / decrease was confirmed as compared with healthy subjects, and EV information on the target disease such as information on EV surface antigens and information on miRNA held by EVs was obtained.
  • This diagnosis method can be applied to any disease that has been clarified.
  • the diagnostic method using the fraction based on the size of EV can diagnose a disease only by information on the size and number of EV, and does not require detailed analysis of EV surface antigens and EV components. Therefore, there is an effect that the disease can be diagnosed at an early stage. In addition, even when the disease cannot be diagnosed only by the EV size and the number information, the disease candidates may be narrowed down, so that the candidates can be established and diagnosed at an early stage.
  • Example 1 Measurement of size of EV contained in fraction
  • the culture supernatant of MCF7 human breast cancer-derived cultured cells
  • the particle size distribution of each EV fraction obtained using the PEG preparation reagent of FIG. 2 was measured.
  • FIG. 5 is shown in a boxplot, where the box represents a distribution that accounts for 50% of the total, the line in the box is the median, and the whiskers run vertically through the box.
  • the tip shows the maximum and minimum values.
  • the particle size distribution was measured using a dynamic light scattering particle size distribution analyzer (LB-550 / HORIBA) and each fraction was suspended in a 200 ⁇ L HBS-N solution.
  • the measurement conditions are as follows. ⁇ Data acquisition iterations: 50 times ⁇ Sample refractive index: “organic sample” 1.600 ⁇ Dispersion medium refractive index: “water” 1.333 Moreover, EV contained in each EV fraction was observed with SEM (Scanning Electron Microscope). The result is shown in FIG. The SEM observation was performed under the following conditions.
  • a SAM Self-Assembled Monolayer having a termination of —NH 3 + was formed on a Si substrate by APTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilane / Sigma Aldrich).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane / Sigma Aldrich).
  • Each EV fraction was suspended in 400 ⁇ L of HBS-N solution, and the whole amount was dropped onto a Si substrate with APTES. After sedimentation for 2 days, the plate was washed with 0.1 M phosphate buffer for 5 minutes. Thereafter, the sample was immersed in 1% osmium tetroxide diluted with 0.1 M phosphate buffer for 15 minutes, and after dehydration of ethanol in ascending series, the sample was air-dried and observed by SEM. A scanning electron microscope (SU8020 / Hitachi HT) was used for SEM observation. The SEM observation conditions are shown below.
  • Example 2 Expression of CD63 and CD9 in EV fraction
  • EV with a diameter of about 160 nm was obtained with the PEG5k fraction
  • EV with a diameter of about 80 nm was obtained from the PEG8k fraction
  • EV with a diameter of about 60 nm was obtained with the PEG10k fraction. It was done.
  • ⁇ Example 2 Expression of CD63 and CD9 in EV fraction
  • FIG. 7 shows the results. ExoELISA kit (System Biosciences) was used for ELISA, and infinite F500 (TECAN) was used for the plate reader. The result was calculated by the difference between the specimen absorbance value and the blank absorbance value, and a graph was created.
  • each fraction contains EV.
  • Example 3 Expression of CK19 in the EV fraction
  • the expression of CK19 highly expressed in MCF7 cells in each EV fraction obtained in Example 1 was determined in the same manner as in Example 2. Measured by ELISA.
  • ELISA was similarly performed on fractions obtained by using commercially available reagents (ExoQuick-TC, System Biosciences) on the culture supernatant of HCT116 (human colon adenocarcinoma-derived cultured cells).
  • HCT116 human colon adenocarcinoma-derived cultured cells
  • each EV fraction obtained in Example 1 was suspended in 200 ⁇ L of PBS, and Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit (Life Technologies) was used. To extract miRNA and measure miRNA expression level using Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit (Life Technologies), TaqMan Micro RNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) and TaqMan Micro RNA Assays (Life Technologies) did.
  • miR21 and “miR155” whose expression was increased in breast cancer patients and whose expression was confirmed in MCF7 were targeted as miRNAs.
  • miR16 which is often used as an endogenous control, was also measured.
  • Example 5 Cancer relevance of EV fraction
  • Epithelial cell adhesion molecule which is an epithelial cancer cell marker
  • the measurement was performed by ELISA in the same manner as in Example 2.
  • the expression of EpCAM antigen was confirmed in each fraction.
  • the PEG5k fraction was confirmed to be more strongly expressed than the other fractions.
  • the method of the present invention can obtain EV related to cancer at a higher concentration than the commercially available reagent as the prior art.
  • the EV fraction acquisition method of the present invention can easily acquire an EV fraction based on size from a biological sample. Furthermore, since all the fractions retain the characteristics of EV and the properties of the cells from which they are derived, any fraction can be used for diagnosis of diseases and the like. Furthermore, since a fraction expressing a cancer-related marker can be obtained at a higher concentration in the method of the present invention than in the prior art, the present invention provides a large amount of fraction effective for cancer diagnosis. You can get it.

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Abstract

【課題】生体試料からその大きさに基づいた細胞外小胞分画を簡便に取得する方法を提供すること。 【解決手段】本発明にかかる生体試料から細胞外小胞分画を取得する方法は、複数の前記生体試料に対し、それぞれ分子量の異なるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を混合する工程と、ＰＥＧを混合した前記生体試料を遠心分離し、沈殿物を得る工程と、を備えることを特徴とする。

Description

細胞外小胞の分画取得方法及び分画方法
　本発明は、細胞外小胞の分画取得方法及び分画方法に関する。
　エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は細胞内では多胞性エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の内部に存在し、その外側を囲むエンドソームが細胞膜と融合することによって細胞外へと放出される小胞である。発見当初は細胞にとって不要な分子の廃棄機構と考えられていたが、近年、生体内で遺伝子発現抑制に重要な働きを示すｍｉｃｒｏＲＮＡ (ｍｉＲＮＡ) を内部に保持していることが発見され、細胞間情報伝達膜小胞、および診断を含めたバイオマーカーとして注目されるようになった。
ｍｉＲＮＡとは１８～２５塩基の小さなＲＮＡであり、細胞内のみではなく血液などの体液中にも存在している。ｍｉＲＮＡの発現パターンは組織特異的であって、がん組織と非がん組織とで発現パターンが異なり、更にはがん種によっても発現パターンが異なる。このことから、血液中のｍｉＲＮＡが、がん原発巣の特定やがん種識別のバイオマーカーになり得るとして注目されている。
　特にエクソソームｍｉＲＮＡの発現は組織特異性が高く、エクソソームを分離する工程で血液中に存在する他のｍｉＲＮＡや死細胞などを除去できることから、血液などの生体試料からエクソソームを分離し、内包されているｍｉＲＮＡを抽出、精製した後、そのｍｉＲＮＡの発現や配列を解析することによって、がんを診断したり、がん細胞の由来となる組織を特定したりすることができる、がんの診断方法の開発が進められている。
　エクソソームにはｍｉＲＮＡの他にタンパク質が含まれることがあり、その種類と量はエクソソームを有する細胞やエクソソームの機能に応じて変化することが知られている。また、エクソソームのサイズも、包含する内容物の量に応じて変化すると考えられている。
　生体試料からエクソソームを分離する技術としては、例えば超遠心分離法がある（例えば、非特許文献１参照）。詳細には、細胞培養上清を３００×ｇ、１０分間遠心することで、不要物を取り除いた後、得られた上清を１００００×ｇ、３０分間の遠心分離を１回、７００００×ｇ、６０分間の遠心分離を行う。得られた沈殿物を密度勾配をもつスクロース溶液などで溶解し、更に、１０００００×ｇ、１５分間の超遠心分離を行い、得られた沈殿物を生理食塩水などに溶解し、２０００００×ｇ、１時間の超遠心分離を行う。遠心後の沈殿物にエクソソームが含まれる。
　また、試薬を用いたエクソソームを分離する技術としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を沈殿剤として使用する方法がある（例えば、特許文献１及び２参照）。どちらも、分子量６０００または８０００のＰＥＧ試薬を生体試料と終濃度１０％（ｗ／ｖ）となるように混合し、４℃で静置した後に、１５００～３０００×ｇ、３０分間～６０分間遠心することで得られた沈殿物にエクソソームが含まれる。
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ (２００６) ３.２２．１－３.２２．２９
ＵＳ２０１３/０２７３５４４ ＵＳ２０１３/０３３７４４０
　しかしながら、非特許文献１、特許文献１、２はいずれも直径１００ｎｍ程度のエクソソームを回収対象としているため、大きさの分布幅が広いエクソソームでは、その一部しか取得できていないといった問題がある。また、非特許文献１では、超遠心分離機といった特殊な機器を要する上に、回収率が低く、多くの時間を要するといった問題もある。
　そこで、本発明は、生体試料からその大きさに基づいた細胞外小胞分画を簡便に取得する方法を提供することを目的とする。
　本発明の一実施態様は、生体試料から細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）分画を取得する方法であって、複数の前記生体試料に対し、それぞれ分子量の異なるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を混合する工程と、ＰＥＧを混合した前記生体試料を遠心分離し、沈殿物を得る工程と、を備えることを特徴とする。前記生体試料が、血液（血漿、血清）、尿、骨髄液、精液、母乳、羊水、涙、生検組織、及び細胞培養上清からなる群から選択されてもよい。前記ポリエチレングリコールは平均分子量が２００から１０００００であってもよく、３０００から２００００であってもよい。ＰＥＧを混合した前記生体試料のポリエチレングリコール濃度は３から２０％（ｗ／ｖ）であってもよい。ＰＥＧを混合した前記生体試料のポリエチレングリコール濃度は５から１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。
　本発明の他の実施態様は、生体試料から細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）分画を取得する方法であって、前記生体試料に第１のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を混合する工程と第１のＰＥＧを混合した前記生体試料を遠心分離し、上清と第１の沈殿物を得る工程と前記上清に、第１のＰＥＧとは異なる分子量をもつ第２のＰＥＧを混合する工程と第２のＰＥＧを混合した前記上清を遠心分離し、第２の沈殿物を得る工程とを含むことを特徴とする。
　本発明のさらなる実施態様は、生体試料に含まれる細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）の分画方法であって、上記いずれかの細胞外小胞分画を取得する方法に従って、細胞外小胞分画を取得する工程を含むことを特徴とする。
　本発明のさらなる実施態様は、生体が罹患している疾患の種類の特定方法であって、上記いずれかのＥＶ分画取得方法によって、生体から得られた試料を用いてＥＶ分画を取得する工程と、前記ＥＶ分画の数情報及び／または前記ＥＶ分画のＥＶの数情報以外の前記ＥＶ分画の情報を得る工程と、前記数情報及び／または数情報以外の情報と、疾患に特有の前記数情報及び／または数情報以外の情報とを比較する工程と前記生体が罹患している疾患の種類を特定する工程とを備えることを特徴とする。前記疾患が腫瘍であってもよい。前記ＥＶ分画のＥＶの数情報が、当該ＥＶの数または全体に対するその割合であってもよい。前記ＥＶの数情報以外の前記ＥＶ分画の情報が、当該ＥＶの表面抗原の発現レベル、当該ＥＶが内部に保持するタンパク質またはｍｉｃｒｏＲＮＡの種類または発現レベル、当該ＥＶの形状または当該ＥＶの硬度、であってもよい。
　本発明により、生体試料からその大きさに基づいた細胞外小胞分画を簡便に取得する方法が提供できるようになった。
本発明の一実施態様における、細胞外小胞分画取得方法のフローチャートである。 本発明の一実施例における、ポリエチレングリコール調製試薬の組成を示す表である。 本発明の一実施態様における、がん診断方法のフローチャートである。 本発明の一実施態様において、がん診断方法で用いられるデータベースの構成を示す図である。 本発明の一実施例において得られたＥＶ分画の粒度分布を示す図である。 本発明の一実施例において得られたＥＶ分画に含まれるＥＶのＳＥＭ画像を示す写真である。 本発明の一実施例において得られたＥＶ分画に含まれるＥＶにおける、細胞表面抗原（ＣＤ６３、ＣＤ９）の発現を測定した結果を示す図である。 本発明の一実施例において得られたＥＶ分画に含まれるＥＶにおける、細胞表面抗原（ＣＫ１９）の発現を測定した結果を示す図である。 本発明の一実施例において得られたＥＶ分画におけるｍｉＲＮＡ定量ＰＣＲの結果を示す図である。 本発明の一実施例において得られたＥＶ分画に含まれるＥＶの細胞表面抗原（ＥｐＣＡＭ）の発現を測定した結果を示す図である。
　以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
　実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
　なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝細胞外小胞分画取得方法　その１＝＝
　本発明の細胞外小胞分画取得方法の一実施態様は、生体試料から細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ、細胞外顆粒とも呼ばれる）分画を取得する方法であって、複数の同じ生体試料に対し、それぞれ分子量の異なるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を混合する工程と、ＰＥＧを混合した生体試料を遠心分離し、沈殿物を得る工程と、を備える
　本明細書における細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ、細胞外顆粒とも呼ばれる）は、エクソソームを包含し、細胞外へ分泌される脂質二重膜で形成された、直径がｎｍからμｍのオーダーの小胞をいう。なお、ＥＶの大きさは、当該ＥＶを球状にしたときの直径を意味するものとする。
　ＥＶ分画を取得するための生体試料の由来は特に限定されず、血液、尿、骨髄液、精液、母乳、羊水、涙、生検組織、細胞培養上清などが例示できる。その中で、取得するＥＶが含まれる細胞種も限定されず、腫瘍細胞、樹状細胞、赤血球、リンパ球、血小板、上皮細胞などが例示できる。更に、生体試料が由来する生体の生物種も限定されず、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが例示できる。
　図１に、本発明が適用されるＥＶの大きさを基にした分画を取得する方法の一例を示す。まず、ＥＶを取得するための生体試料を遠心分離し、沈殿物を破棄することで夾雑物を除去する（ステップＳ１０１）。遠心分離の条件は特に限定されないが、２０００～３０００×ｇ、１５分～３０分間、４℃で行うことが好ましい。そして、遠心分離後の上清を、複数のチューブ（ｎ本）に分注する（ステップＳ１０２）。このようにして、複数の同じ生体試料を準備できるが、遠心分離の前に生体試料を複数のチューブ（ｎ本）分離し、遠心後、それぞれの上清を以下の操作に用いてもよい。また、生体試料が細胞塊の場合、たとえば、トリプシン処理やピペッティング処理などによって、あらかじめ細胞を分離してもよい。
　次に、各上清にＰＥＧを混合するのに、各々にＰＥＧ調製試薬（平均分子量Ａ～Ｎ）の形で添加してもよい（ステップＳ１０３）。各ＰＥＧ調製試薬は、含まれるＰＥＧの平均分子量が異なる。ＰＥＧの平均分子量は特に限定されないが、２００～１０００００の範囲にあることが好ましく、１０００～５００００の範囲にあることがより好ましく、５０００～２００００の範囲にあることがさらに好ましい。
　図２にＰＥＧ調製試薬の例を示す。ここでは、一例として、４種類のＰＥＧ調製試薬を示す。ＰＥＧ５ｋは、平均分子量が約５０００のＰＥＧが試薬中に溶解していることを示す。このＰＥＧの分子量分布は特に限定されず、５０００±４０００であってもよく、５０００±１０００であってもよく、５０００±３００であってもよい。ＰＥＧ８ｋは、平均分子量が約８０００のＰＥＧが試薬中に溶解していることを示す。このＰＥＧの分子量分布は特に限定されず、８０００±４０００であってもよく、８０００±１０００であってもよく、８０００±３００であってもよい。ＰＥＧ１０ｋは、平均分子量が約１００００のＰＥＧが試薬中に溶解していることを示す。このＰＥＧの分子量分布は特に限定されず、１００００±５０００であってもよく、１００００±１５００であってもよく、１００００±５００であってもよい。ＰＥＧ２０ｋは、平均分子量が約２００００のＰＥＧが試薬中に溶解していることを示す。このＰＥＧの分子量分布は特に限定されず、２００００±１００００であってもよく、２００００±５０００であってもよく、２００００±５００であってもよい。なお、図２に示したように特定の平均分子量を有するＰＥＧ１つで１種類のＰＥＧ調製試薬を作製しなくてもよく、異なる平均分子量を有する複数のＰＥＧを混合して調製してもよい。
　生体試料のＰＥＧ最終濃度は特に限定されないが、１０％～５０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、３～２０％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。ＰＥＧを溶解する溶媒はＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）などを用いればよい。更に、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの塩を加えてもよく、最終塩濃度は特に限定されないが、０．０１Ｍ～０．５Ｍであることが好ましく、０．１Ｍ～０．３Ｍであることがより好ましい。
　ＰＥＧを溶媒に添加後、転倒混和などを行い、よく混合する。その後、ＰＥＧを混合した生体試料を静置する（ステップＳ１０４）。静置時間及び温度は特に限定されないが、３０分～一晩、４℃で静置することが好ましい。静置時間については、例えば、生体試料に含まれるＥＶが少なければ長くし、多ければ短くする等、当業者が適宜調整可能である。
　このようにＰＥＧを混合した生体試料を静置後、遠心分離を行う（ステップＳ１０５）。条件は特に限定されないが、例えば１５００～１００００×ｇ、５分～６０分間、４℃で行えばよい。
　その後、上清を取り除き、各沈殿物を、大きさごとに分けられたＥＶの分画１～ｎとする（ステップＳ１０６）。完全に上清を除くために、再度、１５００～１００００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離を行ってもよい。
＝＝細胞外小胞分画取得方法　その２＝＝
　本発明のＥＶ分画取得方法の他の実施態様は、生体試料に第１のＰＥＧを混合する工程と第１のＰＥＧを混合した生体試料を遠心分離し、上清と第１の沈殿物を得る工程と上清に、第１のＰＥＧとは異なる分子量をもつ第２のＰＥＧを混合する工程と第２のＰＥＧを混合した上清を遠心分離し、第２の沈殿物を得る工程とを含む。本態様は、複数の同じ生体試料は必要なく、１つの生体試料から複数のＥＶ分画を取得することができる。なお、用いる生体試料やＰＥＧなどの薬剤、各基本操作、及び各反応条件は「細胞外小胞分画取得方法　その１」に準じる。
　まず、生体試料を遠心分離して、夾雑物を除去する。上清にＰＥＧ調製試薬（平均分子量Ａ）を添加し、混合する。ＰＥＧ（平均分子量Ａ）を混合した生体試料を静置後、遠心分離し、沈澱をＥＶの分画１とするとともに、上清を新しいチューブに移し、ＰＥＧ調製試薬（平均分子量Ｂ）を添加する。この際のＰＥＧ（平均分子量Ｂ）の濃度は、ＰＥＧ（平均分子量Ａ）に関わらず、適宜決めることができ、ＰＥＧ（平均分子量Ｂ）を単独で添加したときと同じであってもよく、それより低くなってもよい。ＰＥＧ（平均分子量Ｂ）を混合した生体試料を再度静置後、遠心分離し、沈澱をＥＶの分画２とする。ここで、ＰＥＧの平均分子量は、Ａ＜Ｂになるように決めておく。
　こうして得られた上清に対し、さらに平均分子量の大きいＰＥＧを添加し、同様の操作を繰り返すことによって、異なる大きさのＥＶ分画をさらに取得することができる。例えば、平均分子量Ａ～ＮのＰＥＧを用いることによって、「細胞外小胞分画取得方法　その１」と同様に、大きさごとに分けられたＥＶの分画１～ｎを取得することが可能になる。
＝＝細胞外小胞分画方法＝＝
　本発明のＥＶ分画方法は、上述した細胞外小胞分画を取得する方法に従って、細胞外小胞分画を取得することにより、当該生体試料に含まれるＥＶを分画することができる。「細胞外小胞分画取得方法　その１」を用いれば、ＥＶの大きさを基にした分画を、一度にすべて得ることが可能である。また、「細胞外小胞分画取得方法　その２」を用いれば、ＥＶの大きさを基にした分画を、一度の操作で数少ないチューブを扱うことによって、順次得ることが可能であり、生体試料が少ない場合に有効である。
＝＝がん診断方法＝＝
　本発明にかかる、生体が罹患している疾患の種類を特定する疾患特定方法は、上記ＥＶ分画取得方法によって、生体から得られた試料を用いてＥＶ分画を取得する工程と、ＥＶ分画の数情報及び／またはＥＶ分画のＥＶの数情報以外のＥＶ分画の情報を得る工程と、数情報及び／または数情報以外の情報と、疾患に特有の数情報及び／または数情報以外の情報とを比較する工程、と生体が罹患している疾患の種類を特定する工程とを含む。ここで、ＥＶ分画のＥＶの数情報とは、例えばそのＥＶ画分におけるＥＶの数またはＥＶ全体に対するその割合である。そして、数情報以外のＥＶ分画の情報とは、例えばＥＶの表面抗原の発現レベル、ＥＶが内部に保持するタンパク質またはｍｉｃｒｏＲＮＡの種類または発現レベル、ＥＶの形状またはＥＶの硬度などが例示できる。この方法によって、がんなどの疾患に対する早期・予後診断が可能になる。例えば、ＥＶはがん種やがんの進行度によって内部に保持している構成成分が異なるため、ＥＶの解析によって、がんの種類、がんの原発巣、がんの進行度などを特定することができる。
　以下、がんを例として、この診断方法の一例を詳細に述べる。図３に、本発明のがん診断の方法を示す。
　まず、上述したＥＶ分画取得方法によって、診断対象者の生体試料からＥＶ分画を取得する（Ｓ１０００）。そして、各分画において、ＥＶ数を測定する。がん細胞では、正常細胞よりＥＶの分泌数が増加する。従って、正常細胞におけるＥＶの分泌数を基準値とし、各ＥＶ分画から得られたＥＶの数の総数が、基準値以上か否かを判定する（ステップＳ１０２０）。ＥＶの総数が基準値を下回る場合、がんの診断対象外と判定し（ステップＳ１０３０）、終了する。ＥＶ総数が基準値を上回る場合、がん種の特定を行う。なお、基準値である、正常細胞におけるＥＶの分泌数は、健常者集団のＥＶ総数や診断対象者の前回値などから予め設定しておけばよい。
　がん種の特定は、まず、各ＥＶ分画のＥＶ数情報（各ＥＶ分画に含まれているＥＶの数や割合）をデータベースと比較し、がん種を判別できるか否かを試みる（ステップＳ１０４０）。
　図４に、ステップＳ１０４０で使用するデータベースの構成例を示す。テーブル１１００は、がん種ごとの各ＥＶ分画の特徴情報で構成されている。列１１０１にはがん種、列１１０２は各ＥＶ分画のＥＶ数情報、列１１０３は各ＥＶ分画の表面抗原情報、列１１０４は各ＥＶ分画のｍｉＲＮＡ情報が記載されている。なお、項目列はこれに限らず各ＥＶ分画のＥＶの形状情報、各ＥＶ分画のＥＶ硬度情報、各ＥＶ分画のＥＶに内包されているタンパク質情報、などでも良い。いずれの項目で構成する場合でも列１１０２の各ＥＶ分画のＥＶ数情報は必須項目とする。
　列１１０２の各ＥＶ分画のＥＶ数情報はテーブル１１０５で構成されている。テーブル１１０５は、各ＥＶ分画に含まれているＥＶの数や割合（ＥＶ分画に含まれるＥＶ数をＥＶ全体数で割った値）を基準値と比較して、多い（＋）、少ない（－）の特性をがん種ごと、ＥＶ分画ごとに格納している。
　列１１０３には、例えば、各ＥＶ分画の表面抗原情報であるテーブル１１０６で構成されている。テーブル１１０６は、ＥＶの表面抗原の発現量が、基準値と比較して、多い（＋）、少ない（－）、変化なし（／）、の情報を、がん種及びＥＶ分画ごとに格納している。ここでの基準値は、例えば健常者集団の各ＥＶ分画での表面抗原発現量を用いることができる。表面抗原として、ＥＶに存在し、がんやがん種特異的に発現しているマーカーなどを利用できる。
　列１１０４には、例えば、各ＥＶ分画のｍｉＲＮＡ情報であるテーブル１１０７で構成されている。例えばテーブル１１０７は、ＥＶが内部に保持しているｍｉＲＮＡの発現量が、基準値と比較して、多い（＋）、少ない（－）、変化なし（／）、の特性をがん種ごと、ＥＶ分画ごとに示している。ここでの基準値は、例えば健常者集団の各ＥＶ分画でのｍｉＲＮＡの発現量を用いることができる。ｍｉＲＮＡとして、がん種特異的なｍｉＲＮＡの情報などを格納しておく。なお、ｍｉＲＮＡ情報として、ｍｉＲＮＡ発現量に限らず、ｍｉＲＮＡのがん種特異的な配列情報などを用いてもよい。
　各ＥＶ分画のＥＶ数情報をこのようなデータベースと比較し、診断対象者のＥＶ分画ごとにＥＶ数情報を基準値と比較して、多い（＋）、少ない（－）を判定し、図４データベース内、列１１０２と比較する。完全一致するプロファイルがあった場合、がん種が判別できる。プロファイルが一致しない、もしくは、一致するプロファイルを示すがん種が複数ある場合は、がん種は確実には特定できない。その場合、前記ＥＶ分画のＥＶの数情報以外の情報（ＥＶの表面抗原の発現レベル、ＥＶが内部に保持するタンパク質またはｍｉｃｒｏＲＮＡの種類または発現レベル、ＥＶの形状またはＥＶの硬度）を用いて、がん種の特定を試みる（ステップＳ１０６０）。判別に有効なＥＶ分画や情報は、図４のデータベース内の候補となったがん種のプロファイルを参照することで選択できる。このようにして、最終的に、詳細解析の結果と図４に示したデータベースとを比較することでがん種を特定できる（ステップＳ１０５０）。
　なお、本実施例ではがんを対象としたが、健常者と比較してＥＶの増減が確認され、ＥＶ表面抗原の情報やＥＶが保持するｍｉＲＮＡの情報など、対象となる疾患のＥＶ情報が明らかになっている疾患であれば本診断方法が適用できる。
　このように、ＥＶの大きさを基にした分画を用いた診断方法は、ＥＶの大きさと数の情報のみで疾患を診断でき、ＥＶ表面抗原やＥＶ構成成分の詳細な解析を必要としないため、早期に疾患を診断できるといった効果がある。また、ＥＶの大きさと数情報だけでは疾患を診断できない場合でも、疾患の候補を絞ることができる場合があるため、早期に候補を立てて診断できるようになる。
＜実施例１＞分画に含まれるＥＶの大きさの測定
　本実施例では、本発明の細胞外小胞分画取得方法を用い、ＭＣＦ７（ヒト乳腺がん由来培養細胞）の培養上清に図２のＰＥＧ調製試薬を用いて得られた各ＥＶ分画の粒度分布を測定した。
　その結果を図５に示すが、結果は箱ひげ図で示されており、箱は全体の５０％を占める分布を、箱の中の線は中央値を、箱を縦に通っているひげの先端は最大値と最小値を示している。
　なお、粒度分布の測定には，動的光散乱式粒度分布測定装置(LB-550／HORIBA社)を用い、各分画を200μLのHBS-N溶液に懸濁して測定した。測定条件は以下の通りである。
・データ取り込み反復回数：　50回
・試料屈折率：　『organic sample』　1.600 
・分散媒屈折率：　『water』 1.333
　また、各ＥＶ分画に含まれるＥＶを、ＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：走査型電子顕微鏡）で観察した。その結果を図６に示す。なお、ＳＥＭ観察は、以下の条件で行った。
　まず、Si基板上に、終端が-NH3 +のSAM(Self-Assembled Monolayer：自己集積化単分子膜)をAPTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilane ／Sigma Aldrich社)により形成した。各EV分画を400μLのHBS-N溶液に懸濁し、APTES付Si基板に全量滴下した。2日間沈降処理後、0.1M リン酸バッファーで5分間洗浄した。その後、0.1Mリン酸バッファーで希釈した1% 四酸化オスミウムに15分間浸漬し、上昇系列のエタノール脱水後、自然乾燥させた試料をSEMで観察した。SEM観察には走査電子顕微鏡(SU8020／日立HT社)を使用した。SEM観察条件を以下に示す。
 
　　・　エクソソーム粒径が50nm以下の場合
・加速電圧           2 kV 
・リターリング電圧   1 kV
・入射エネルギー     1 keV
・プローブ電流              20 pA
　　・　エクソソーム粒径が50nm以上の場合
・加速電圧           3kV
・プローブ電流              20pA
 
　図５に示したように、ＰＥＧの分子量と、得られるＥＶ分画の大きさに相関があり、ＰＥＧの平均分子量が大きくなる程、大きさの小さいＥＶ分画を取得できた。
　また、図６に示したように、ＰＥＧ５ｋ分画では直径約１６０ｎｍのＥＶが、ＰＥＧ８ｋ分画からは直径約８０ｎｍのＥＶが、ＰＥＧ１０ｋ分画では、直径約６０ｎｍのＥＶが取得できたことが確認された。
＜実施例２＞ＥＶ分画におけるＣＤ６３とＣＤ９の発現
　本実施例では、実施例１で得られた各ＥＶ分画において、エクソソームのマーカーとして知られている表面抗原であるＣＤ６３とＣＤ９の発現をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で測定した。図７は、結果を示す。なお、ＥＬＩＳＡには、ExoELISA kit（System Biosciences社)を用い、プレートリーダーには、infinite F500（TECAN社)を用いた。結果を、検体吸光度値とブランク吸光度値との差で算出し、グラフを作成した。
　図７に示したように、いずれの分画においてもＣＤ６３とＣＤ９の発現が確認された。このように、各分画にはＥＶが含まれている。
＜実施例３＞ＥＶ分画におけるＣＫ１９の発現
　本実施例では、実施例１で得られた各ＥＶ分画において、ＭＣＦ７細胞で高発現しているＣＫ１９の発現を、実施例２と同様にしてＥＬＩＳＡで測定した。比較として、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸腺がん由来培養細胞）の培養上清に市販試薬（ExoQuick-TC、System Biosciences社）を用いて得られた分画で、同様にＥＬＩＳＡを行った。図８に結果を示すように、いずれの分画においても、ＣＫ１９の発現が確認され、ＨＣＴ１１６の分画よりも発現が強かった。このように、各分画に含まれるＥＶは、それが由来する細胞の性質を保持していることがわかる。
＜実施例４＞ＥＶ分画におけるｍｉＲＮＡの発現
　本実施例では、実施例１で得られた各ＥＶ分画を、200μLのＰＢＳに懸濁し、Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit(Life Technologies社)を用いてｍｉＲＮＡを抽出し、Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit(Life Technologies社)、TaqMan Micro RNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies社)及びTaqMan Micro RNA Assays(Life Technologies社)を用いてｍｉＲＮＡの発現レベルを測定した。ここでは、ｍｉＲＮＡとして、乳がん患者で発現が上昇し、ＭＣＦ７で発現が確認されている「ｍｉＲ２１」及び「ｍｉＲ１５５」を対象とした。また、内在性コントロールとしてよく用いられている「ｍｉＲ１６」も同時に測定した。
　図９に結果を示すように、いずれの分画においてもｍｉＲ２１、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ１６の発現が検出されたが、発現量に大きな差は見られなかった。このように、各分画に含まれるＥＶは、それが由来する細胞の性質を保持していることがわかる。
＜実施例５＞ＥＶ分画のがん関連性
　本実施例では、実施例１で得られた各ＥＶ分画において、上皮由来のがん細胞マーカーであるＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現を、実施例２と同様にＥＬＩＳＡで測定した。図１０に結果を示すように、各分画でＥｐＣＡＭ抗原の発現が確認できた。特にＰＥＧ５ｋの分画は、他の分画と比較して強い発現が確認された。これは、先行技術である市販試薬よりも、本発明の方法の方が、がんに関連するＥＶを高濃度に取得できることを示す。
＜まとめ＞
　本発明のＥＶ分画取得法は、生体試料から大きさを基にしたＥＶ分画を容易に取得できる。更に全ての分画において、ＥＶの特性とそれが由来する細胞の性質が保持されているため、いずれの分画も疾患等の診断に使用できる。更に、がんに関連するマーカーを発現している分画は、先行技術よりも本発明の方法の方が高濃度に取得できるため、本発明は、がん診断に有効な分画を多量に取得できる。

Claims (12)

  1. 　生体試料から細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）分画を取得する方法であって、
    　複数の前記生体試料に対し、それぞれ分子量の異なるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を混合する工程と、
    　ＰＥＧを混合した前記生体試料を遠心分離し、沈殿物を得る工程と、
    　を備えることを特徴とするＥＶ分画取得方法。
  2. 　請求項１に記載のＥＶ分画取得方法において、
    　前記生体試料が、血液（血漿、血清）、尿、骨髄液、精液、母乳、羊水、涙、生検組織、及び細胞培養上清からなる群から選択されることを特徴とするＥＶ分画取得方法。
  3. 　請求項１または２に記載のＥＶ分画取得方法において、
    　前記ポリエチレングリコールは平均分子量が２００から１０００００であることを特徴とするＥＶ分画取得方法。
  4. 　請求項１または２に記載のＥＶ分画取得方法において、
    　前記ポリエチレングリコールは平均分子量が３０００から２００００であることを特徴とするＥＶ分画取得方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のＥＶ分画取得方法において、
    　ＰＥＧを混合した前記生体試料のポリエチレングリコール濃度は３から２０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とするＥＶ分画取得方法。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のＥＶ分画取得方法において、
    　ＰＥＧを混合した前記生体試料のポリエチレングリコール濃度は５から１０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とするＥＶ分画取得方法。
  7. 　生体試料から細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）分画を取得する方法であって、
    　前記生体試料に第１のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を混合する工程と
    　第１のＰＥＧを混合した前記生体試料を遠心分離し、上清と第１の沈殿物を得る工程と
    　前記上清に、第１のＰＥＧとは異なる分子量をもつ第２のＰＥＧを混合する工程と
    　第２のＰＥＧを混合した前記上清を遠心分離し、第２の沈殿物を得る工程と
    を含むことを特徴とするＥＶ分画取得方法。
  8. 　生体試料に含まれる細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）の分画方法であって、
    　請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞外小胞分画を取得する方法に従って、細胞外小胞分画を取得する工程を含むことを特徴とする、細胞外小胞の分画方法。
  9. 　生体が罹患している疾患の種類を特定する疾患特定方法であって、
    　請求項１～７のいずれか１項のＥＶ分画取得方法によって、生体から得られた試料を用いてＥＶ分画を取得する工程と、
    　前記ＥＶ分画の数情報及び／または前記ＥＶ分画のＥＶの数情報以外の前記ＥＶ分画の情報を得る工程と、
    　前記数情報及び／または数情報以外の情報と、疾患に特有の前記数情報及び／または数情報以外の情報とを比較する工程と
    　前記生体が罹患している疾患の種類を特定する工程と
    を備えることを特徴とする疾患特定方法。
  10. 　請求項９に記載の疾患特定方法において、
    　前記疾患が腫瘍であることを特徴とする疾患特定方法。
  11. 　請求項９または１０に記載の疾患特定方法において、
    　前記ＥＶ分画のＥＶの数情報が、当該ＥＶの数または全体に対するその割合であることを特徴とする疾患特定方法。
  12. 　請求項９～１１に記載の疾患特定方法において、
    　前記ＥＶの数情報以外の前記ＥＶ分画の情報が、当該ＥＶの表面抗原の発現レベル、当該ＥＶが内部に保持するタンパク質またはｍｉｃｒｏＲＮＡの種類または発現レベル、当該ＥＶの形状または当該ＥＶの硬度、であることを特徴とする疾患特定方法。
     
     
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