CN117070452A - 一种可用于cd47和dll3基因液态活检的高质量外泌体提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，包括以下步骤：S1、提取恶性肿瘤患者0.5‑1m l血浆外泌体；S2、将血浆外泌体进行4℃‑1600g离心‑10分钟，弃沉淀，留上清液；S3、将存留的上清液进行4℃‑16000g离‑心10分钟，弃沉淀，留上清液；S4、将存留的上清液4℃‑15万g离心‑70分钟，弃上清液，留下沉淀；S5、将存留的沉淀进行1m l预冷PBS涡旋振荡洗涤5S；S6、洗涤完成之后进行4℃‑15万g离心‑70分钟，弃上清液，留下沉淀；S7、将沉淀进行300μl预冷PBS重悬即得外泌体悬液。本发明的有益效果是，本改良方法可利用少量的血浆样本(0.5‑1m l)在3小时内获得109个/m l的外泌体，得率高、纯度高且耗时短。
Description
技术领域
本发明涉及人血浆外泌体的提取方法领域，特别是一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法。
背景技术
创伤性组织活检困难是恶性肿瘤临床诊疗面临的难题，因此近年来液态活检在临床诊疗中发挥的作用越来越大。液态活检标本包括外周循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞和外泌体等。ctDNA和循环肿瘤细胞已经用于临床实践，是对肿瘤组织良好的补充和替代。外泌体是一种新兴的液态标本，存在于细胞外囊泡中。细胞外囊泡是直径约为40-1000纳米的有膜物质。外泌体可以从许多类型的活细胞内释放到细胞外空间，直径约为30-150纳米，广泛存在于肿瘤患者的体液环境中，在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用。近年来已经证实外泌体可用于EGFR、ALK、ROS1、MET和HGF等基因的液态活检和信号通路的研究。但依赖于目前常规的提取方法，外泌体的液态活检和科学研究很大程度上受限于提取量和纯度不高，因此，亟需优化提取方法。
相比于非小细胞肺癌，小细胞肺癌(SCLC)的组织标本更难获取。而且近年来免疫治疗在肿瘤的治疗上展现了惊人的效果，新的免疫治疗药物也在SCLC中进行探索。AMG 757是一种双特异性T细胞衔接器，带有针对肿瘤细胞的DLL3抗体和吸引T细胞的CD3抗体，诱导患者自身的T细胞清除表达DLL3的肿瘤细胞。在AMG757治疗复发SCLC的1期研究中纳入66例患者，其中有29例(44％)既往接受过PD-1/PD-L1抑制剂治疗，在安全性方面，18例(27％)患者发生≥3级治疗相关的AE。CRS(细胞因子释放综合征)是比较关注的毒性，研究发现CRS为1-2级，仅有1例为3级，CRS通常表现为发热、恶心，也有心动过速发生，一般发生在AMG治疗的第一周期内，给予支持治疗或者预防性应用糖皮质激素可获得有效控制。从疗效看，64例至少接受1剂AMG757治疗且持续随访8周，获得确认PR的患者13例，ORR为20％，而且在各个剂量水平都有患者发生应答，DCR为47％，10例(15％)完成超过6个月治疗，DOR：8.7个月。提示AMG 757治疗复发SCLC具有良好的安全性和持久的应答，剂量扩增研究正在进行。与AMAG757具有相同作用靶点的另一款双抗BI 764532在DLL3阳性复发SCLC的1期研究也在进行中。此外，CD47作为一种免疫检查点蛋白，在肿瘤的治疗研究中也崭露头角，因此开发DLL3和CD47的外泌体检测对患者的辅助诊断和治疗也是十分有益的。
目前针对人血浆外泌体的提取方法多样，最常见的是超高速离心提取法和试剂盒提取法。超高速离心方法的成本低(每例约几十元人民币)，提取量大，但缺点在于需要的起始样本量大，易被杂质蛋白污染、得率不稳定等。试剂盒法的优势在于极大程度上降低了杂质蛋白污染的问题，但价格昂贵，每例约几百至上千元人民币，且提取的外泌体总量较少，约为超高速离心法的十分之一，很难满足后续的液态活检和科学研究需要。此外，这两种提取方法都不能将外泌体中的胞外大囊泡完全去除，因此，为了后续临床应用和科学研究，本专利主要针对超高速离心法进行优化。
已有研究报道外泌体的超高速离心通常采用300-500g离心去除细胞成分，1-2万g去除细胞碎片和大颗粒物质，10-14万g获得外泌体和胞外大囊泡的混合物，且耗时一般在6个小时以上。如何提高超高速离心法提取外泌体的纯度和得率、减少细胞外大囊泡和杂质的干扰，是目前亟待解决的问题。我们在临床检验工作中发现经过两步离心法获得的ctDNA具有较高的质量和纯度。ctDNA是一种比外泌体更微小的血浆成分，广泛存在于肿瘤患者的外周血中。提取ctDNA与提取外泌体都面临着血浆中的大分子蛋白和细颗粒物质对提取物造成干扰、降低样本纯度的问题。在临床液态活检中，通常使用1600g和16000g两步离心法(参考《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查实验室技术专家共识》)可有效去除血浆中残留的细胞、巨大细胞囊泡、碎片和大分子蛋白杂质等。因此，为了提高外泌体的提取质量和纯度，将1600g和16000g两步离心法应用于外泌体的超高速离心提取法中，来取代300-500g和1-2万g的离心条件；同时本方法将采用15万g的离心条件提高外泌体的得率，替代多数研究采用的10-14万g的离心条件，也可以到达缩短离心时间的效果。最后通过检测外泌体的物理和免疫化学参数、颗粒浓度和蛋白浓度的线性一致性来评估本方法对外泌体的提取质量，同时对外泌体进行CD47和DLL3两种因子的流式检测，确定应用本方法提取的外泌体是否满足临床液态活检的需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法。
实现上述目的本发明的技术方案为，一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，包括以下步骤：
S1、提取恶性肿瘤患者0.5-1m l血浆外泌体；
S2、将血浆外泌体进行4℃-1600g离心-10分钟，弃沉淀，留上清液；
S3、将存留的上清液进行4℃-16000g离-心10分钟，弃沉淀，留上清液；
S4、将存留的上清液4℃-15万g离心-70分钟，弃上清液，留上沉淀；
S5、将存留的沉淀进行1m l预冷PBS涡旋振荡洗涤5S；
S6、洗涤完成之后进行4℃-15万g离心-70分钟，弃上清液，留上沉淀；
S7、将沉淀进行300μl预冷PBS重悬即得外泌体悬液；
S8、电子显微镜对外泌体进行形态学鉴定；
S9、纳米粒子示踪技术(NTA法)对外泌体的物理参数进行测定；
S10、外泌体表面标志物的鉴定；
S11、外泌体的蛋白浓度测定；
S12、外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的线性一致性评估；
S13、改良的超高速差速离心法与商业试剂盒法提取外泌体的参数对比；
S14、对外泌体进行CD47和DLL3的液态活检。
所述步骤S8中使用透射电镜对外泌体形态进行鉴定，将外泌体样本使用预冷的电镜固定液及包埋剂进行固定和包埋，制作透射电镜外泌体检测样本，上机检测。
所述步骤S9使用ZetaVi ew纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体样本进行粒子的物理参数测定，配制外泌体悬液上机检测，稀释上机样本粒子控制浓度为1×108～9个/ml为宜，上机检测，仪器自动对外泌体粒子进行拍照和粒径分析，保存检测数据。
所述步骤S10使用Wako PS CaptureTM Exosome ELI SA Kit(日本，WDE1567)试剂盒，按照试剂盒说明书进行ELI SA方法检测，使用CD9、CD63和CD81抗体在室温下进行样本孵育2小时，使用试剂盒自带二抗室温孵育1小时，洗板后使用酶标仪在450nm和620nm处进行吸光度测定，使用酶标仪软件计算外泌体CD9、CD63和CD81的表达量。
所述步骤S11使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定外泌体蛋白浓度，标准曲线浓度梯度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，平行3个复孔，待测样本分别加入20μl外泌体悬液，平行3个复孔，按照试剂盒说明书配制BCA工作液，每孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟，用酶标仪测定A562吸光度值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样本浓度。
所述步骤S12使用Exce l软件做粒子浓度和蛋白浓度的线性曲线，观察两个结果曲线的趋势一致性。
所述步骤S13使用试剂盒提取的外泌体进行上述NTA法检测，将结果与超高速差速离心提取的外泌体NTA检测结果对比，比较外泌体基础物理参数的差异。
所述步骤S14使用流式细胞仪检测外泌体CD47和DLL3基因的蛋白表达水平，按照BD canto II plus仪器长清洗程序进行仪器的彻底清洗，使用超纯水和PBS溶液进行体系污染残留鉴定，确定无杂质污染后，使用德国Thermo YG488荧光纳米Beads(直径100nm)和PS-100非荧光纳米Beads(直径100nm)分别作为阳性标准品和阴性标准品进行圈门，确定Beads位置，然后将外泌体分别进行CD47(BD，20μl/样本)和DLL3(博奥森，5μl/样本)抗体染色，以超纯水和PBS溶液为空白对照，以未加抗体染色的外泌体为阴性对照，进行外泌体上机检测。
利用本发明的技术方案制作的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，本改良方法可利用少量的血浆样本(0.5-1ml)在3小时内获得109个/ml的外泌体，得率高且耗时短，本改良方法获得的细胞外囊泡以外泌体居多(占83.3％)，所有颗粒粒径均在300nm以下，排除了300nm以上胞外大囊泡对外泌体的干扰，本改良方法获得的外泌体可用于CD47和DLL3的液态活检，且有望扩展应用于其他基因的检测。
附图说明
图1是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的外泌体提取框图；
图2是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的透射电镜下外泌体颗粒的形态特征的图；
图3是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的NTA纳米粒子示踪检测外泌体颗粒的物理特征的图；
图4是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的每m l外泌体样本中CD9、CD63和CD81的相对表达量的图；
图5是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的外泌体颗粒浓度与蛋白浓度的线性一致率比对的图；
图6是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的改良超高速差速离心法提取的外泌体直径范围分布的图；
图7是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的试剂盒法和超高速差速离心法提取的外泌体粒子参数对比的图；
图8是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的NSCLC血浆来源的外泌体表达CD47的图；
图9是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的DLL3在NC I-H446细胞中的表达的图；
图10是本发明所述一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法的NSCLC血浆来源的外泌体表达DLL3蛋白的图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1-10所示，一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，包括以下步骤：
S1、提取恶性肿瘤患者0.5-1m l血浆外泌体；
S2、将血浆外泌体进行4℃-1600g离心-10分钟，弃沉淀，留上清液；
S3、将存留的上清液进行4℃-16000g离-心10分钟，弃沉淀，留上清液；
S4、将存留的上清液4℃-15万g离心-70分钟，弃上清液，留上沉淀；
S5、将存留的沉淀进行1m l预冷PBS涡旋振荡洗涤5S；
S6、洗涤完成之后进行4℃-15万g离心-70分钟，弃上清液，留上沉淀；
S7、将沉淀进行300μl预冷PBS重悬即得外泌体悬液；
S8、电子显微镜对外泌体进行形态学鉴定；
S9、纳米粒子示踪技术(NTA法)对外泌体的物理参数进行测定；
S10、外泌体表面标志物的鉴定；
S11、外泌体的蛋白浓度测定；
S12、外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的线性一致性评估；
S13、改良的超高速差速离心法与商业试剂盒法提取外泌体的参数对比；
S14、对外泌体进行CD47和DLL3的液态活检。
所述步骤S8中使用透射电镜对外泌体形态进行鉴定，将外泌体样本使用预冷的电镜固定液及包埋剂进行固定和包埋，制作透射电镜外泌体检测样本，上机检测。
所述步骤S9使用ZetaVi ew纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体样本进行粒子的物理参数测定，配制外泌体悬液上机检测，稀释上机样本粒子控制浓度为1×108～9个/ml为宜，上机检测，仪器自动对外泌体粒子进行拍照和粒径分析，保存检测数据。
所述步骤S10使用Wako PS CaptureTM Exosome ELI SA Kit(日本，WDE1567)试剂盒，按照试剂盒说明书进行ELI SA方法检测，使用CD9、CD63和CD81抗体在室温下进行样本孵育2小时，使用试剂盒自带二抗室温孵育1小时，洗板后使用酶标仪在450nm和620nm处进行吸光度测定，使用酶标仪软件计算外泌体CD9、CD63和CD81的表达量。
所述步骤S11使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定外泌体蛋白浓度，标准曲线浓度梯度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，平行3个复孔，待测样本分别加入20μl外泌体悬液，平行3个复孔，按照试剂盒说明书配制BCA工作液，每孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟，用酶标仪测定A562吸光度值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样本浓度。
所述步骤S12使用Exce l软件做粒子浓度和蛋白浓度的线性曲线，观察两个结果曲线的趋势一致性。
所述步骤S13使用试剂盒提取的外泌体进行上述NTA法检测，将结果与超高速差速离心提取的外泌体NTA检测结果对比，比较外泌体基础物理参数的差异。
所述步骤S14使用流式细胞仪检测外泌体CD47和DLL3基因的蛋白表达水平，按照BD canto II plus仪器长清洗程序进行仪器的彻底清洗，使用超纯水和PBS溶液进行体系污染残留鉴定，确定无杂质污染后，使用德国Thermo YG488荧光纳米Beads(直径100nm)和PS-100非荧光纳米Beads(直径100nm)分别作为阳性标准品和阴性标准品进行圈门，确定Beads位置，然后将外泌体分别进行CD47(BD，20μl/样本)和DLL3(博奥森，5μl/样本)抗体染色，以超纯水和PBS溶液为空白对照，以未加抗体染色的外泌体为阴性对照，进行外泌体上机检测。
实施例:
对本改良方法提取的外泌体进行定性鉴定；
1.透射电镜鉴定提取的外泌体的形态特征；
应用透射电镜检测本方法提取的外泌体，镜下如图1所示，外泌体的球径约为30-150nm2，形态近似球形或卵圆形，表面符合细胞膜质结构特征，提取物较为纯净，未见明显大颗粒杂质。证实采用改良的超高速差速离心法成功获得了血浆中的外泌体提取物。
2.NTA纳米粒子示踪技术对外泌体颗粒的粒径、跨度范围和浓度等物理参数进行测定；
A.外泌体粒径分布曲线，B.NTA纳米粒子动态跟踪镜下外泌体颗粒图像(亮点)；
NTA纳米粒子示踪法检测外泌体的中位粒子直径为111nm，跨度为39.5nm，浓度为1.8×109个颗粒/ml。如图2所示，外泌体的粒子直径、跨度范围符合外泌体的标准特征。外泌体颗粒较为均匀，其形态为球形或近球形颗粒，无明显的镜下可见的大颗粒污染物，表明本方法提取效果良好，各项检测指标均符合外泌体特征，物理指标合格，这种高质量的外泌体满足常规的科学研究需求。
3.外泌体表面标志物的鉴定；
ELISA法测定血浆外泌体是否表达外泌体的标志性蛋白CD9、CD63和CD81，评估每ml外泌体样本中CD9、CD63和CD81的相对表达量。结果如图3所示，肿瘤患者血浆外泌体的CD9、CD63和CD81表达呈阳性，提示本方法提取到的纳米级颗粒具有外泌体的表面标志特征。
综上，本研究对外泌体进行了定性鉴定，可以确定本改良方法获得了高质量的血浆外泌体提取物。
对本改良方法提取的外泌体进行纯度鉴定；
1.外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的线性一致性评估；
本改良超高速差速离心法提取的外泌体蛋白浓度中位值为0.110μg/μl(范围0.027-0.641μg/μl)。为了验证提取方法的均一性和外泌体的纯度，评估外泌体颗粒浓度与蛋白浓度的线性符合率，我们对22个血液样本进行了检测。如图4所示，其中21个样本的蛋白浓度和外泌体颗粒浓度趋势相同，只有8号样本趋势相反，颗粒浓度与蛋白浓度一致率为95.45％(21/22)。结果表明改良超高速差速离心法提取的外泌体较为纯净，无明显杂质蛋白的污染，各样本间均一性较好，样本间重复率较高。
2.外泌体颗粒直径分布；
如图5所示，在改良超高速差速离心条件下，提取的细胞外囊泡有83.3％(4130/4960)直径小于150nm，且100％小于300nm。表明提取物中外泌体占比为83.3％，无300nm以上较大型的细胞外囊泡干扰，此方法可获得纯度较高的外泌体，优于传统工艺报道。
3.本方法提取的外泌体数量和纯度均优于试剂盒法；
NTA纳米粒子跟踪检测结果显示，试剂盒法提取的细胞外囊泡中位粒径为131.9nm，跨度为61.4nm，粒子浓度为5.7×108个颗粒/ml；而本方法提取的中位粒径为118.7nm，跨度为42.3nm，粒子浓度为2.3×109个颗粒/m l。如图6所示，本方法提取的细胞外囊泡粒径均一性高、跨度范围窄、浓度高，外囊泡中的外泌体纯度和数量均优于试剂盒法。
综上，理论上本方法提取的外泌体从数量和质量上更能满足后续科研和临床液态活检的需求。
对本改良方法提取的外泌体用于液态活检的能力鉴定；
1.使用外泌体进行CD47液态活检；
本方法使用改良超高速差速离心提取血浆外泌体后，对外泌体进行CD47的流式细胞检测。结果如图7所示，所有样本(n＝15)的CD47均呈阳性表达，表达量在50％-78％之间，外泌体检测的敏感性、特异性、阳性率均为100％，阴性率为0％。表明利用本方法提取的外泌体可用于CD47的检测。
A.100nm阴性对照磁珠；B.100nm阳性对照磁珠；
C.PBS溶剂(空白对照)；D.CD47阴性对照样本(CD47-)；
E.CD47阳性对照样本(CD47+)；F.NSCLC外泌体样本。
2.使用外泌体进行DLL3液态活检
由于DLL3在小细胞肺癌(SCLC)中表达率较高，因此本研究以SCLC细胞系NC I-H446为阳性对照样本进行DLL3的检测。流式细胞检测结果如图8所示，DLL3在NC I-H446细胞中高表达，细胞阳性率为96％。
以SCLC患者血浆外泌体做阳性对照，以PBS做空白对照，以不加抗体的外泌体样本做阴性对照，对肿瘤患者血浆外泌体进行DLL3检测，结果如图9所示，各外泌体样本(n＝8)均表达DLL3，外泌体阳性率为40-90％之间。使用外泌体检测DLL3的阳性率为100％，阴性率为0％。表明利用本方法提取的外泌体可用于DLL3的检测。
A.PBS溶剂(空白对照)；B.DLL3阴性对照样本(DLL3-)；
C.SCLC外泌体样本(阳性对照)；D.NSCLC样本。
综上，本方法获得的外泌体满足进行临床液态活检的条件，本发明有望在临床液态活检及外泌体的科学研究领域实现转化应用。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取恶性肿瘤患者0.5-1ml血浆外泌体；
S2、将血浆外泌体进行4℃-1600g离心-10分钟，弃沉淀，留上清液；
S3、将存留的上清液进行4℃-16000g离-心10分钟，弃沉淀，留上清液；
S4、将存留的上清液4℃-15万g离心-70分钟，弃上清液，留下沉淀；
S5、将存留的沉淀进行1m l预冷PBS涡旋振荡洗涤5S；
S6、洗涤完成之后进行4℃-15万g离心-70分钟，弃上清液，留下沉淀；
S7、将沉淀进行300μl预冷PBS重悬即得外泌体悬液；
S8、电子显微镜对外泌体进行形态学鉴定；
S9、纳米粒子示踪技术(NTA法)对外泌体的物理参数进行测定；
S10、外泌体表面标志物的鉴定；
S11、外泌体的蛋白浓度测定；
S12、外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的线性一致性评估；
S13、改良的超高速差速离心法与商业试剂盒法提取外泌体的参数对比；
S14、对外泌体进行CD47和DLL3的液态活检。
2.根据权利要求1所述的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤S8中使用透射电镜对外泌体形态进行鉴定，将外泌体样本使用预冷的电镜固定液及包埋剂进行固定和包埋，制作透射电镜外泌体检测样本，上机检测。
3.根据权利要求1所述的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤S9使用ZetaVi ew纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体样本进行粒子的物理参数测定，配制外泌体悬液上机检测，稀释上机样本粒子控制浓度为1×108～9个/m l为宜，上机检测，仪器自动对外泌体粒子进行拍照和粒径分析，保存检测数据。
4.根据权利要求1所述的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤S10使用Wako PS CaptureTM Exosome ELISA Kit(日本，WDE1567)试剂盒，按照试剂盒说明书进行EL ISA方法检测，使用CD9、CD63和CD81抗体在室温下进行样本孵育2小时，使用试剂盒自带二抗室温孵育1小时，洗板后使用酶标仪在450nm和620nm处进行吸光度测定，根据标准曲线使用酶标仪软件计算外泌体表面标志CD9、CD63和CD81的表达量。
5.根据权利要求1所述的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤S11使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定外泌体蛋白浓度，标准曲线浓度梯度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/m l，平行3个复孔，待测样本分别加入20μl外泌体悬液，平行3个复孔，按照试剂盒说明书配制BCA工作液，每孔加入200μlBCA工作液，37℃放置30分钟，用酶标仪测定A562吸光度值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样本浓度。
6.根据权利要求1所述的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤S12使用Excel软件做粒子浓度和蛋白浓度的线性曲线，观察两个结果曲线的趋势一致性。
7.根据权利要求1所述的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤S13使用试剂盒提取的外泌体进行上述NTA法检测，将结果与超高速差速离心提取的外泌体NTA检测结果对比，比较外泌体基础物理参数的差异。
8.根据权利要求1所述的一种可用于CD47和DLL3基因液态活检的高质量外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤S14使用流式细胞仪检测外泌体CD47和DLL3基因的蛋白表达水平，按照BD cantoII plus仪器长清洗程序进行仪器的彻底清洗，使用超纯水和PBS溶液进行体系污染残留鉴定，确定无杂质污染后，使用德国Thermo YG488荧光纳米Beads(直径100nm)和PS-100非荧光纳米Beads(直径100nm)分别作为阳性标准品和阴性标准品进行圈门，确定Beads位置，然后将外泌体分别进行CD47(BD，20μl/样本)和DLL3(博奥森，5μl/样本)抗体染色，以超纯水和PBS溶液为空白对照，以未加抗体染色的外泌体为阴性对照，进行外泌体上机检测。
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|---|---|---|---|---|
| CN117330481A (zh) * | 2023-11-27 | 2024-01-02 | 南京联笃生物科技有限公司 | 一种外泌体的流式检测方法及其应用 |
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2023
- 2023-08-24 CN CN202311071664.2A patent/CN117070452A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
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