CN110036111A - 用于细胞外分离的基于脂质的探针 - Google Patents

Abstract

公开了用于从样品中捕获并分离细胞外囊泡的基于脂质的探针及其系统。该系统可以包括标记探针‑捕获探针组合、或在基底的表面上固定的标记探针、或包括在基底的表面上固定的标记探针的装置。标记探针可以包括用于插入细胞外囊泡的脂质双层膜的脂质尾部。标记探针可以进一步包括能够容易地与捕获探针相结合的标签或用于结合至基底的表面从而固定标记探针的高亲和性成分，以及脂质尾部与标签或高亲和性成分之间的间隔物。

Description

用于细胞外分离的基于脂质的探针

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年12月5日提交的美国临时申请No.62/430,161的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金No.CA174508的政府资助下作出的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及用于从样品中捕获并分离细胞外囊泡的基于脂质的探针及其系统。脂质探针可以包括脂质尾部、间隔物和标签和/或可以固定在表面上。该系统可以从诸如来自人类患者的体液之类的样品中分离细胞外囊泡。

背景技术

细胞外囊泡(EV)(其包括外泌体、微囊泡和凋亡小体)为来自细胞的脂质双层封闭结构，其尺寸范围为30nm至5,000nm。在过去的十年中，EV已经作为细胞通讯的重要介质而出现，因为EV可起到能够改变细胞功能和生理机能的生物信号的细胞间传递载体的作用。特别地，含有细胞和细胞状态特异性蛋白和核酸的外泌体(即直径约30nm至150nm的EV，在多囊体与质膜的融合时释放)由许多细胞类型分泌并且已在不同的体液中被鉴定到。虽然外泌体的生物起源尚未被充分了解，但越来越多的证据表明，此类纳米级EV(nEV)可以调节肿瘤免疫应答，启动转移前微环境的形成，确定向器官的转移并有助于化学治疗抗性。因此，nEV是癌症治疗干预的潜在靶标，并且有希望作为能够克服药理学障碍的自体药物载体。nEV也越来越多地被认为是非侵入性诊断标志物及预后肿瘤标志物。因此，非常希望快速分离nEV用于下游分子分析。

然而，报道的用于分离nEV的方法(如超速离心、免疫分离、基于聚合物的沉淀和过滤)涉及冗长的方案，并且可能引入杂质和nEV损伤。因此，仍然需要能够有效分离包括纳米级EV的细胞外囊泡的方法和装置。

发明内容

本发明的优点包括用于从样品中捕获并分离细胞外囊泡的基于脂质的探针及其系统。该系统可以包括标记探针-捕获探针组合、或在基底的表面上固定的标记探针、或包括在装置的基底的表面上固定的标记探针的装置。

通过使标记探针与包含具有脂质双层的细胞外囊泡的样品相接触，其中标记探针被配置为用于与细胞外囊泡的脂质双层相结合，以便标记细胞外囊泡，从而从样品中分离细胞外囊泡的方法，可至少部分地满足这些和其他优点。可以用被配置为用于与标记探针相结合的捕获探针对经标记的细胞外囊泡进行捕获。然后可以从样品中分离利用捕获探针捕获的经标记的细胞外囊泡。

本发明的另一个方面是通过使包含细胞外囊泡的样品与其上固定有标记探针的基底的表面相接触而从样品中分离细胞外囊泡的方法。标记探针被配置为用于与细胞外囊泡的脂质双层相结合，以便将细胞外囊泡固定在基底的表面上。标记探针可以共价结合或非共价结合至基底的表面。

在本公开的另一个方面，用于从样品中分离细胞外囊泡的装置可以包括其上固定有标记探针的基底表面。该装置进一步包括流体流动路径，该流体流动路径被配置为用于为包含细胞外囊泡的样品提供流动路径以接触基底表面。在一些实施方案中，该装置可以包括第一电极和第二电极，第一电极包括基底的囊泡固定表面，第二电极具有与第一电极相反的极性，该装置被配置为用于使用第一电极和第二电极向样品施加电场。

根据本公开(本发明)的实施方案，还可以使用典型方法提取所分离的EV并分析其内容物，如脂质、蛋白质和核酸内容物。例如，在某些实施方案中，在分离并且释放EV后，可以从所分离的和/或所释放的细胞外囊泡中提取核苷酸。然后可以分析所提取的内容物(例如核苷酸、蛋白质、脂质)的结构和/或功能。可供选择地，可以测定依赖于固定在基底的表面上的细胞外囊泡的一种或多种内容物的浓度的参数。

实施方案单独地或组合地包括以下特征中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，标记探针可以包括脂质尾部、间隔物和标签。可用于本公开的标记探针的脂质尾部包括可以容易地将其自身插入细胞外囊泡的脂质双层膜中的脂质尾部。可用于本公开的标记探针的脂质间隔物包括将脂质尾部与标签间隔开并且促进标签与捕获探针或基底表面相结合以固定标记探针的脂质间隔物。可用于本公开的标签包括可以容易地与捕获探针或基底表面相结合以固定标记探针的标签。在一些实施方案中，标记探针包括对基底表面具有高亲和性的成分。在其他实施方案中，捕获探针为包覆有对标签(例如生物素)具有高结合亲和性的结合分子的颗粒。此类颗粒包括中性链亲和素包覆的磁性亚微米颗粒。在其他的实施方案中，该方法包括从捕获探针中释放经标记的细胞外囊泡。例如，这可以通过使用对捕获探针的亲和性比对用以标记细胞外囊泡的标记探针上的标签的亲和性更高的化合物从捕获探针中置换经标记的细胞外囊泡来完成。可供选择地，或组合地，从捕获探针或基底表面释放经标记的细胞外囊泡可以包括：当标记探针包括间隔物时，通过间隔物的降解来释放经标记的细胞外囊泡。

在其他的实施方案中，基底表面可以来自以下基底：二氧化硅；聚合物，如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、胶乳等。在一些其他实施方案中，可以使固定在表面上的细胞外囊泡与脂质双层渗透性荧光标志物相接触。有利地，荧光标志物对固定在表面上的细胞外囊泡中的给定分子具有高结合亲和性。在其他的实施方案中，可以测定依赖于固定在表面上的细胞外囊泡的一种或多种内容物的浓度的参数，如与固定在表面上的细胞外囊泡中的给定分子相结合的荧光标志物的总荧光强度。

从以下详细描述中，本发明的其他优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见，其中仅简单地通过为实施本发明而设计的最佳方式的说明，来示出并描述本发明的优选实施方案。如将认识到的，本发明能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本发明。因此，附图和描述应被认为实质上是说明性的，而非限制性的。

附图说明

参照附图，其中附图标记相同的元件始终表示相似的元件，并且其中：

图1示出了根据本公开的一个方面的标记探针和捕获探针以及分离细胞外囊泡的方法。

图2示出了根据本公开的一个方面的固定在基底表面上的标记探针以及分离细胞外囊泡的方法。

图3a至图3d为分离效率的图。这些图示出了作为LP的量(图3a)、LP与模型样品的孵育时间(图3b)的函数的MDA-MB-231nEV的分离效率；图3c示出了分离效率以及LP标记的MDA-MB-231nEV与CP的孵育时间；平均值±s.e.m.(n＝5)。图3d为作为LP的量的函数的来自健康供体血浆样品的nEV的分离效率的图。误差棒，平均值±s.e.m.(n＝3)。

图4a为示出对于富集在NA包覆的孔板上、而后由RNA染料染色的LP标记的nEV，RNA的量的荧光强度的图。荧光强度(任意单位，a.u.)与完整的nEV中所含的总RNA成正比地增大；平均值±s.e.m.(n＝4)。

图4b为荧光标记的CD9和EpCAM抗体的图，其用于检测从SK-N-BE(2)、MDA-MB-231和SW620细胞释放的模型nEV中的相关蛋白表达。误差棒，平均值±s.e.m.(n＝20)。

具体实施方式

本公开涉及基于脂质的探针系统，该系统可以用于从样品中捕获并分离细胞外囊泡，如nEV。该系统可以包括标记探针(LP)，LP可以包括脂质尾部和间隔物。在本公开的一个方面中，该系统包括捕获探针，捕获探针可以为在样品中移动的颗粒(例如，图1)，或者该系统可以包括固定的基底(例如，图2)，使得LP被固定在基底的表面上，并使样品与固定的基底相接触以捕获EV。

在本公开的一个方面中，通过使标记探针与包含细胞外囊泡的样品相接触，可以从样品中分离细胞外囊泡。如背景技术部分所述，细胞外囊泡具有脂质双层膜。本公开的标记探针被配置为用于与细胞外囊泡的脂质双层相结合，以便标记细胞外囊泡。可以用捕获探针对经标记的细胞外囊泡进行捕获，捕获探针被配置为用于经由标签与标记探针相结合。然后可以对用捕获探针捕获的经标记的细胞外囊泡进行分离。

在本公开的另一个方面中，通过使包含细胞外囊泡的样品与其上固定有标记探针的基底的表面相接触，可以从样品中分离细胞外囊泡。有利地，标记探针被配置为用于与细胞外囊泡的脂质双层相结合，以便将细胞外囊泡固定在基底的表面上。在一些实施方案中，标记探针包括对基底表面具有高亲和性的成分，因此可以通过该成分的共价或非共价结合而固定在基底的表面上。例如，可以经由具有胺类标签的标记探针与基底表面上的醛基进行胺缀合，从而将标记探针共价结合至基底表面。标记探针也可以非共价地结合到基底上，例如核酸杂交，例如脂质-PEG-ssDNA与其他固定的ssDNA杂交等。

可用于本公开的标记探针的脂质尾部包括可以容易地将其自身插入细胞外囊泡的脂质双层膜中的脂质尾部。此类脂质尾部包括(例如)甘油三酯、诸如单酰基脂质(C18)、二酰基脂质(DSPE)之类的磷脂、诸如胆固醇之类的类固醇以及它们的任意组合。其他可用的脂质尾部包括脂肪酸、甘油脂质、甘油磷酸脂质、固醇脂质、异戊烯醇脂质、鞘脂质、糖脂质、聚酮化合物、类二十烷酸、它们的衍生物或它们的任意组合。

可用于本公开的标记探针的脂质间隔物包括将脂质尾部与标签或基底表面间隔开或进行连接，并且促进标记探针与捕获探针或基底表面相结合的脂质间隔物。此类脂质间隔物包括(例如)DNA，肽，诸如聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(环氧丙烷)(PPO)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)之类的聚合物，诸如聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(2-乙基丙烯酸)(PEAAc)和聚(2-丙基丙烯酸)之类的聚酸，诸如聚(甲基丙烯酸N,N'-二乙基氨基乙酯)(PDEAEMA)之类的聚碱以及它们的嵌段共聚物，壳聚糖，藻酸盐，核酸，肽和其他具有一定长度的亲水性不带电材料以及它们的任意组合。在一些实施方案中，脂质间隔物的单体单元可以为大于0且至多20,000个单元，例如排列约10个至约10,000个单体单元，如在50个至约100个的范围。在其他实施方案中，脂质间隔物的长度可以为大于0且至多约200nm，例如1nm至100nm，如3nm至80nm。

本公开的标记探针被配置为由捕获探针捕获或固定在基底的表面上。由捕获探针捕获可以通过标记探针的标签来实现。可用于本公开的标签包括可以容易地与捕获探针或基底表面相结合以固定标记探针的标签。例如，此类标签-捕获探针组合可以包括能够与捕获探针上、基底表面上的中性链亲和素(NA)相结合的生物素标签。其他的标签-捕获探针组合包括核酸杂交、适体和相应的靶标、蛋白质-蛋白质相互作用和具有特异性高结合亲和性的其他分子系统以及它们的任意组合。其他的标签-捕获探针组合包括His标签和固定化金属亲和层析基底或磁性珠粒、通过无铜点击化学的反应性二苄基环丁烯(DBCO)基团和叠氮化物分子。标签-捕获探针组合也可以用于将标记探针固定在基底表面上，其中基底表面具有与标记探针的标签互补的化合物。

可用于本公开的捕获探针包括可以容易地分离的颗粒，如磁性颗粒、金属颗粒、带电颗粒、塑料或陶瓷颗粒等、以及它们的任意组合。捕获探针包括用于结合标记探针的标签的互补化合物，如NA或其表面上的抗原。可以由塑料、玻璃、二氧化硅、陶瓷和金属或它们的任意组合来制成本公开的用于固定脂质探针的基底，并且基底包括用于结合标记探针的标签的互补化合物。

包含细胞外囊泡(EV和/或nEV)的样品可以包括来自诸如人类患者或其他哺乳动物受试者之类的受试者，或来自细胞外囊泡培养物的体液，如泪液、血浆、尿液、腹水等。

有利地，本公开的方法可以高效地分离EV。例如，本公开的方法的分离效率(即，在特定样品中，所分离的EV相对于可用于分离的总量的百分比)可以大于40％，如大于约50％、约60％，甚至大于约70％和约80％。当捕获探针具有磁性时，通过使用磁场可以容易地实现对用捕获探针捕获的经标记的细胞外囊泡进行分离，或者通过抗体、或通过沉淀、基于尺寸的过滤、或通过层析或通过其他力，如静电力、介电力、重力和离心力，例如超速离心等离心进行分离。

一经分离，就可以释放所分离的EV。例如，这可以通过使用对捕获探针或基底表面的亲和性比对用以标记细胞外囊泡的标记探针上的标签的亲和性更高的化合物来完成。可供选择地，可以通过离子交换层析、包含标记探针的间隔物中的间隔物的降解来释放所分离的EV。例如，如果标记探针包含核酸或肽作为间隔物，则也可以通过核酸或肽的降解、核酸的变性、核酸的竞争性杂交来释放所捕获的细胞外囊泡。

还可以使用典型方法提取所分离的EV并分析其内容物，如脂质、蛋白质和核酸内容物。例如，在某些实施方案中，在分离并释放EV之后，可以从所分离的和/或所释放的细胞外囊泡中提取脂质、蛋白质和核苷酸。然后可以分析所提取的内容物的结构和/或功能。例如，可以从所分离的nEV中提取DNA和RNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳以确认RNA和DNA以及它们的片段的存在。可供选择地，可以测定依赖于固定在基底的表面上的细胞外囊泡的一种或多种内容物的浓度的参数。

在本公开的一个方面中，分离nEV的方法包括使用基于脂质的探针系统。该实施方案的系统包括标记探针(LP)和捕获探针(CP)，在本文中有时被称为脂质纳米探针(LNP)。LP可以由用于nEV膜插入的脂质尾部、用于提高试剂溶解度的诸如聚乙二醇(PEG)间隔物(约45个环氧乙烷单元，对应于～的间隔物长度)之类的间隔物、以及用于随后捕获并分离经标记的nEV的诸如生物素标签之类的标签构成。图1示出了具有生物素标签、接头(脂质间隔物)和脂质尾部的标记探针。以下描述具有三种不同的脂质尾部的三个标记探针的实施方案，以进一步帮助理解本公开的各个方面。

我们首先比较了异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的PEG化单酰基脂质(C18)、二酰基脂质(DSPE)和胆固醇之间的标记效率。因为细胞膜和EV膜均为脂质双层，为了便于评价，我们使用10⁷个乳腺癌MDA-MB-231细胞的稀释剂C溶液或5％的人白蛋白磷酸盐缓冲盐水。虽然与稀释剂C组的荧光强度相比，人白蛋白的存在显著降低了用PEG化脂质标记的细胞的荧光强度(P<0.05；双尾t检验)，但是在白蛋白存在时，三种脂质表现出不同的标记效率。5％的人白蛋白中C18标记的细胞的平均荧光强度略高于用DSPE标记的细胞的平均荧光强度，但两组之间无显著差异。考虑到二酰基脂质已广泛用于细胞的操作并且其机制是已知的，因而我们选择DSPE-PEG-生物素作为LP用于以下研究。

中性链亲和素(NA)包覆的磁性亚微米颗粒(MMP)用作CP并且能够捕获并分离样品的悬浮液中的nEV。制备平均尺寸为465.4nm的MMP作为单分散悬浮液。MMP具有由其二氧化硅壳产生的-32.0mV的负ζ电位。在氨基硅烷改性后，在傅里叶变换红外光谱的光谱中，2,920cm^-1和2,852cm^-1处的吸收峰与硅烷中亚甲基的伸缩振动相关，从而表明了氨基的固定。因此，ζ电位的值移至9.6mV，然后一旦缀合异硫氰酸酯，则降低至-17.7mV。利用NA的共价固定来完成表面修饰过程(参见以下实验部分)。

通过超速离心分离来自MDA-MB-231细胞的纳米级细胞外囊泡，并通过电子显微镜进行鉴定。所分离的nEV群体主要包括直径为30nm至200nm的囊泡，这些囊泡在电子显微镜下显示出特有的碟形形态，而在低温扫描电子显微镜下显示出通常的球形形状。

利用低温SEM和透射电子显微镜(TEM)对NA包覆的MMP上所捕获的nEV进行成像。我们还证实了用DSPE-PEG-FITC标记的nEV可以被MDA-MB-231细胞有效地吸收并内在化。将nEV颗粒均匀地重悬于无血清培养基中并分成6份，以用作模型nEV样品。如使用MalvernNanoSight所测定的，各模型样品包含约1.4×10⁹个nEV，并且如分别由AgilentBioanalyzer和TapeStation所测定的，各模型样品包含平均348.5ng的总RNA和189.4ng的DNA。我们首先评价了LP的量(范围为1pmol至10nmol)对nEV分离效率(从所捕获的nEV中提取的RNA相对于总nEV的质量分数)的影响。随着LP的量的增大，分离效率逐渐增大，达到77.6％的最高效率(对应于10nmol的LP)。附加量的LP没有进一步提高分离效率(图3a)。接下来，我们确定了孵育时间对用10nmol LP分离nEV的影响。虽然平均分离效率随孵育时间而略有提高(图3b)，但延长孵育并未提供任何统计学上显著的益处(P>0.05；双尾t检验)。出于可操作性和可靠性的原因，我们将LP与nEV孵育5分钟(经常采用的通过膜染料PKH26进行体外外泌体染色的持续时间)。此外，我们发现为了最大分离效率的与CP的孵育期可以通过连续温和转动而缩短到10分钟(图3c)。总之，使用10nmol的LP和过量的CP、以花费大约15分钟的整个分离过程，可以对大约80％的来自模型样品的nEV进行标记和分离。

在下游分子分析中，所分离的nEV具有灵活性。可以从捕获探针中释放所分离的nEV并进行分析，以检测并量化其内容物，如nEV中所含的核酸和蛋白质。

此外，当我们使用DSPE-PEG-脱硫生物素作为LP时，可以通过用生物素置换DSPE-PEG-脱硫生物素来释放NA包覆的MMP上所捕获的MDA-MB-231nEV，生物素与NA的结合比脱硫生物素更紧密。然后，在30分钟内释放大约84±3％的EV。此外，所释放的nEV是功能性的。我们用来源于高度侵袭性MDA-MB-231细胞的～8×10⁸个nEV训导非侵袭性MCF7细胞。伤口愈合试验显示出在经nEV训导后，MCF-7细胞的伤口闭合速率快约两倍(P<0.05；双尾t检验)，这表明相比于未经训导的MCF-7细胞，LP标记的nEV可以诱导更高水平的迁移。然后我们使用LP系统从血浆中分离nEV。由于白蛋白可能会干扰LP插入nEV的膜，因而我们将LP的量提高到200nmol，用于标记并分离来自健康人类供体的、含有大约13.2ng RNA(通过Qubit荧光计所测定的)的100μl血浆中的nEV。使用100nmol的LP和过量的CP实现了48.3％的分离效率。将LP量加倍仅使效率略微提高至49.5％(无统计学意义；P>0.05，双尾t检验；图3d)。

另一方面，例如图2，通过将LP固定在固定基底的表面上，可以将基于脂质的探针系统简化为单一元件。例如，LP系统使nEV能够直接富集到基底的表面上。此类在某些表面上的捕获和分离有助于随后的分子分析，用于nEV的定量检测和膜蛋白的剖析(profiling)。在一个实施方案中，通过使nEV与LP接触5分钟，从而用LP标记模型MDA-MB-231nEV样品。将混合物转移到多孔板中NA包覆的孔中以进行nEV捕获。这里，NA固定在多孔板的孔表面上，并且NA-生物素反应时间延长至30分钟，这使结合效率能够超过95％。我们使用膜渗透染料(SYTO RNASelect)选择性染色nEV RNA，并发现绿色荧光强度与完整nEV中所含的总RNA成正比增大(测定系数，r2＝0.98147；图4a)。这表明该试验可以在35分钟内对nEV RNA内容物进行半定量，当无法使用纳米颗粒跟踪或动态光散射设备时，该试验可以用作有用的供替代的选择。

还可以使用LP介导的捕获和富集来检测nEV膜中的蛋白质。对来自SK-N-BE(2)成神经细胞瘤细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞和SW620结肠腺癌细胞的模型nEV进行捕获，并且用荧光标记的针对分化簇分子9(CD9)或上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体进行染色(图4b)。CD9为用于所有EV中最普遍存在的分子标志物之一，并且抗EpCAM接枝的磁性珠粒已被广泛用于外泌体分离。几乎没有检测到来自SK-N-BE(2)细胞的nEV中的EpCAM表达，而来自MDA-MB-231细胞的nEV的表达水平弱并且来自SW620细胞的nEV的表达水平强。相反地，对于这三种细胞系的nEV而言，CD9表达水平相当。这些结果与通过免疫细胞化学确定的EpCAM和CD9表达水平相同。

也可以通过CP直接收集纳米级细胞外囊泡，然后进行蛋白质和核酸货物内容物(cargo content)的提取和分析。通过蛋白质印迹法来检测分别从MDA-MB-231细胞裂解物和nEV蛋白质裂解物中提取的CD63(常用的EV标志物)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH；熟知的管家蛋白)。此外，从所分离的MDA-MB-231nEV中提取DNA和RNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳以确认RNA的存在和DNA长片段的存在。

我们还比较了通过超速离心收集的nEV与通过LP系统收集的nEV的内容物。通过新一代测序(NGS)分析来自MDA-MB-231nEV的DNA和未扩增的细胞基因组DNA。经纯化的nEVDNA样品主要包含长度超过10kbp的DNA片段。这与表现出典型的凋亡DNA梯度的循环的无细胞DNA不同。在超速离心和LP系统组中，绘制到人类基因组的读数百分率分别为99.6％和99.5％。通过这两种方法分离的来自nEV的DNA均匀地跨越所有染色体。超速离心和LP系统分离后的nEV DNAn内容物相似，使用100kbp窗口大小计算的皮尔逊相关系数为0.96。如经纯化的nEV样品和基因组DNA样品的拷贝数变异(CNV)图所示，通过这两种方法中的任一种提取的nEV DNA内容物与来自相同细胞系的核基因组DNA相似。此外，来自超速离心的nEVDNA内容物与基因组DNA内容物之间的皮尔逊相关系数为0.87，而来自LP系统的nEV DNA内容物与基因组DNA内容物之间的皮尔逊相关系数为0.92。

此外，从通过LNP系统的超速离心所分离的nEV中提取货物内容物RNA，然后进行比较。对于该数据，用于标记nEV的LP为DSPE-PEG-生物素，而捕获探针为亲和素包覆的磁性珠粒。通过NGS分析含有信使RNA和微小RNA的一式四份的MDA-MB-231nEV RNA样品。对于超速离心和LP系统组，绘制到人类总RNA的读数平均百分率分别为89.3％和86.2％。在来自MDA-MB-231nEV的mRNA的欧几里德距离图中，用LP系统分离的生物复制品和通过超速离心分离的生物复制品在不同的聚集区域中出现。使用绘制序列的读数计数，然后我们对利用LP系统和超速离心从MDA-MB-231细胞分离的nEV的RNA货物进行定量。从MDA-MB-231细胞分离的nEV包含不同的货物RNA，包括除最丰富的RNA类型(蛋白质编码RNA或mRNA)之外的显著量的长基因间非编码RNA、核糖体RNA、小核仁RNA和其他RNA类型。通过LP系统分离的nEV与通过超速离心分离的nEV之间的RNA种类没有显著差异；事实上，在排名前1,000的所表达的mRNA和miRNA中，mRNA(81％)和miRNA(94％)种类存在大量重叠。在比较由超速离心或LP系统分离的mRNA表达水平的Bland-Altman图中，我们发现大多数检测到的mRNA具有相似的表达水平，通过>0.998的总RNA内容物的线性相关系数也表明了这一点。最近的报道表明，来自胎牛血清(FBS)的miRNA会干扰随后的转录分析。然而，当对超速离心nEV样品中的miRNA的数量和LP系统nEV样品中miRNA的数量进行比较时，我们发现所报道的前14种FBS miRNA的干扰最小(参见下表1)。表1通过RNA序列检测，来自超速离心和LNP所分离的nEV的miRNA与来自FBS携带的EV的最丰富的miRNA的比较。在超速离心和LNP方法中分别检测的所报道的FBS中的前14种miRNA的丰度排序。

	FBS<sup>1</sup>	超速离心	LNP
				miR-122-5p	1	266	279
miR-1246	2	N/A	N/A
				miR-148a-3p	3	19	20
miR-423-5p	4	671	643
				miR-92a-3p	5	55	48
let-7b-5p	6	N/A	N/A
				miR-379-5p	7	527	495
miR-127-3p	8	708	684
				let-7a-5p	9	N/A	N/A
miR-320a	10	18	16
				miR-432-5p	11	3365	3365
miR-181a-5p	12	46,51	45,68
				miR-26a-5p	13	184,187	171,206
miR-320b	14	312,601	280,552

1.Wei等人Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culturederived Extracellular RNA.Scientific reports 6,31175(2016)。

此外，我们发现在通过LP系统分离nEV后，提取物中蛋白质与RNA的重量比从12.1降低至4.9，从而表明无需另外的洗涤步骤，我们的方法可以消除平均68.5％的总蛋白质。因为通过某种LP系统的nEV分离导致22％的nEV损失，我们推测去除的蛋白质主要是蛋白质污染物。与之相比，超速离心能够从模型样品中收集61.4％的nEV，并且通过在PBS缓冲液中再悬浮连同进一步的超速离心的另外的洗涤纯化会将总效率降低至仅13.9％。来自液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的结果进一步揭示了超速离心所分离的nEV和LNP所分离的nEV的货物蛋白之间的关系。我们将我们的LC-MS/MS数据与最近公开的关于EV中30种关键蛋白质的报道进行了比较(见下表2)。

表2.分别通过超速离心和LNP从MDA-MB-231细胞分离的30种关键EV货物蛋白的LC-MS/MS分析，以及与最近公开的依次通过超速离心和密度梯度超速离心从人树突状细胞中分离的包括小EV蛋白的各种级分的数据²的比较，其中80％以上可以通过LC-MS/MS直接检测。

2.Kowal等人Proteomic comparison defines novel markers to characterizeheterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes,Proceedings ofthe National Academy of Sciences 113,E968-E977(2016)。

我们发现通过超速离心分离的nEV和通过LNP系统分离的nEV具有相似的货物蛋白组成，所述LNP系统包括DSPE-PEG-生物素LP以及亲和素包覆的磁性珠粒CP。此外，我们的结果也与表2中引用的Kowal等人的工作一致，其使用超速离心和密度梯度超速离心的组合进行小EV的制备。此外，对于在公共数据库Vesiclepedia(www.vesiclepedia.org)中存档的8,452个EV货物蛋白，我们发现其中～91％对应于来自通过超速离心分离的nEV的货物蛋白，并且～94％对应于来自通过LNP分离的nEV的货物蛋白。同样地，参考文献26中报道的约94％的EV货物蛋白可以在数据库中被鉴定。此外，在通过超速离心所分离的nEV中鉴定了来自Vesiclepedia的前100种蛋白质中的76种，并且在通过LNP所分离的nEV中鉴定了来自Vesiclepedia的前100种蛋白质中的89种，而在Kowal等人的nEV中鉴定了该100种中的96种。对所鉴定的蛋白质的细胞分布的分析表明，对于超速离心组，蛋白质的51.8％定位于外泌体而34.2％定位于溶酶体；对于LP系统组，蛋白质的64.7％定位于外泌体而39.7％定位于溶酶体；并且对于Kowal等人组，蛋白质的57.2％定位于外泌体而47.6％定位于溶酶体(P<0.01；双尾t检验)。最后，我们的MS分析还证实了波形蛋白、细胞角蛋白、EGFR和乳腺癌干细胞标志物CD44出现在来自MDA-MB-231细胞的nEV中，其与这种三阴性和侵袭转移性癌细胞系的表型一致。

从NSCLC患者的血浆样品中分离的nEV中的突变DNA的检测。通过使用LP系统，我们从19例非小细胞肺癌(NSCLC)人类患者的100μl血浆样品中分离出nEV。为了实现高灵敏度，我们进行了突变体富集的PCR检测，用于分析EGFR外显子19和21中的突变，并进行了实时PCR检测，用于鉴定KRAS密码子12和13中的突变。对所有PCR产物进行桑格序列分析。在常规PCR扩增后，从所有样品中得到EGFR外显子19和21以及KRAS的所需PCR产物。序列分析仅鉴定了患者42的血浆样品中的KRAS G13D突变。通过传统PCR产物的桑格测序，在其余样品中未检测到突变。由于桑格测序对于突变等位基因分数的检测限为约10％，因而我们采用可以将该限制降低至约0.05％的突变体富集的PCR试验。在突变特异性限制酶消化和巢式PCR后，我们在患者28的血浆样品中发现了EGFR外显子21中的L858R突变，我们无法使用患者的组织样品通过NGS确认该发现，因为可用样品量少。此外，在患者29中易于检测到EGFR外显子19中的缺失突变，其与该患者组织样品的NGS测序结果相匹配。我们还使用实时PCR来富集KRAS密码子12和13中的突变用于下游测序(据制造商所述，通过靶向突变基因并抑制野生型拷贝，检测限可以达到0.01％)，这证实了患者42的血浆样品中的KRAS G13D点突变。在患者51的血浆中检测到KRAS G12D突变，其随后通过患者的组织样品的NGS进行验证。然而，我们未能检测到患者25、27和50中的KRAS突变(表3)，可能是因为KRAS突变在这些患者血液样品的nEV中的丰度极低，或者是因为最初的组织活检和抽血之间的时间段发生了突变状态的变化。通过LNP分离nEV后，患者组织样品中所有的野生型EGFR和KRAS等位基因均被检测为野生型。

表3来自19例NSCLC患者的样品中的KRAS和EGFR突变。

粗体内容表明检测到的突变。WT，野生型；Del，缺失；NA，不适用

为了提高EV的临床效用，需要有效的分离和检测方法。作为磷脂衍生物，PEG化脂质已被用于细胞和脂质体的标记和操作。类似地，PEG化脂质也可用于nEV分离。本文所述的LP系统方法的优点为快速的nEV分离。两步分离方法可以花费短至15分钟；现有方法需要更长的处理时间，从30分钟至超过22小时。此外，LP系统不需要庞大且昂贵的仪器或精密的微流控装置。此外，LP系统的nEV分离效率类似于超速离心的nEV隔分离效率。然而，超速离心的EV分离效率取决于重复循环，并且这种另外的纯化步骤可能会损害nEV并将产率从～70％降低至小于10％。与之相比，在本公开的LP系统中，由于通过一步分离方法可以除去～68％的蛋白质，因而可以消除重复纯化，这会对nEV内容物的下游分子分析产生最小的影响。此外，本公开的LNP系统能够对核酸和蛋白质进行定性和定量的分子分析。总体而言，通过显著缩短样品制备时间并通过经由分离提供相对纯净的nEV，LNP系统能够促进基于nEV的诊断。

关于用于膜标记的脂质，相比于具有其单个疏水性脂肪酸尾部的两亲性胆固醇和C18，带有两个疏水性脂肪酸尾部的DSPE显示出更强的与nEV的脂质膜的非共价相互作用，因此发现DSPE显示出更稳定的滞留。值得注意的是，模型样品与血浆之间的LP的最佳数量以及nEV的分离效率有所不同。差异可归因于血浆中白蛋白和其他与LP结合的脂蛋白的存在；然而，脂质与白蛋白的结合常数在室温下仅为～1×10³M^-1。通过TEM和NanoSight观察到的nEV之间的尺寸差异可能起因于固定期间nEV的收缩，或者起因于NanoSight中导致偏向于检测较大的EV的缺陷。

细胞分泌具有不同尺寸和组成的异质nEV群，并且诸如CD63之类的通用EV标志物并非一致地出现在各单独的nEV中。类似地，我们发现从三种不同的癌细胞系收集的nEV中EpCAM的表达有所不同。然而，这可能反映了基于抗EpCAM的免疫分离的低nEV分离效率。与之相比，本公开的LP系统的独特之处在于，在样品中选择所有脂质囊泡，因此可实现不依赖于抗原和尺寸的分离。因此，该方法适用于所有nEV，无论大小和蛋白质组成如何。总体而言，我们的基因组学、转录组学和小RNA研究表明，LP系统所分离的nEV的货物内容物与通过超速离心分离的nEV的货物内容物相似。利用低覆盖度基因组测序，可以从经纯化的nEV样品中生成的CNV谱与原始细胞的CNV谱相同。由LP系统和超速离心分离的nEV得到的DNA序列不仅可以绘制到人类基因组，该DNA序列还包含与原始MDA-MB-231细胞的CNV谱高度相似的CNV谱。这可以提供一种确认nEV起源的肿瘤的方法。测序数据的基于读数计数的定量分析揭示了通过LNP和超速离心两者分离的nEV中的丰富RNA内容物。大多数已报道的细胞编码的和非编码的RNA存在于所分离的nEV中。在所有情况中，来自LP系统所分离的nEV的RNA与来自通过超速离心分离的nEV的RNA没有显著差异。此外，蛋白质LC-MS/MS分析显示两种分离方法的nEV蛋白质组成相似，并且我们的结果与Vesiclepedia数据库以及最近报道的EV亚型的蛋白质组学分析一致。细胞分布分析进一步证实，LP系统所分离的nEV携带大部分外泌体蛋白和溶酶体蛋白。nEV包含全基因组DNA，并且已经在从人患者血清中沉淀的外泌体中检测到突变的KRAS和p53。

在我们对患有NSCLC癌症的人类患者的群组研究中，肿瘤组织的突变分析显示EGFR外显子19和21或KRAS密码子12和13中至少四分之一携带突变。这与NSCLC中EGFR突变(～5％)和KRAS突变(～15％)的频率吻合得相当好。我们使用LP系统从NSCLC患者收集nEV并提取基因组DNA用于检测KRAS和EGFR突变。在传统PCR后立即使用桑格测序，我们仅在一名患者中鉴定出KRAS G13D突变。通过突变体富集PCR和实时PCR提高检测灵敏度，我们能够从另外三个患者样品中发现nEV的DNA中的突变(然而我们应当注意，组织样品中的EGFR和KRAS突变与血浆样品中的EGFR和KRAS突变可能不相同)。在来自两名患者(分别为28和42；然而，没有足够的样品可用于基于组织的突变分析)的nEV DNA中分别鉴定出EGFR外显子21中的L858R突变和KRAS中的G13D突变。这证明了nEV DNA中突变分析的可行性，并突出了nEV作为液体活组织检查材料的优势，因而可以容易且重复地获得样品。在三名患者(25、27和50)的nEV DNA中未检测到KRAS突变，可能是因为等位基因分数极低。对于循环肿瘤DNA(ctDNA)中的突变检测，存在类似的问题，因此针对ctDNA开发的检测平台形式和策略可能适合于nEV DNA。

数字PCR是一种能够检测0.01％等位基因频率的突变的灵敏工具，其可以解决上述问题。数字PCR能够鉴定来自原发性胰腺癌患者的48％的ctDNA中的KRAS突变。通过选择覆盖潜在驱动基因中复发突变的外显子和内含子，在50％的I期NSCLC患者中，也可检测到ctDNA中的突变。这表明，对于临床诊断应用，nEV DNA的分析需要仔细选择技术和检测策略。

另一方面，例如图2，通过将LP固定在固定的基底的表面上，可以将基于脂质的探针系统简化为单一元件。作为实例，我们建立了粗糙的二氧化硅表面。该粗糙表面为纳米级长度，并使用金属掩模和干式蚀刻实现。表面的特征尺寸可以在30nm至200nm的范围内调节，这对于与小EV的相互作用是最佳的。例如，可以将氨基标记的PEG化胆固醇固定在纳米结构的基底上，用于直接分离细胞外囊泡。分别用AFM和SEM对纳米结构的表面进行表征和确认。表面面积增大了～43％，从而为胆固醇固定提供了更多的基因座，并且为细胞外囊泡附着提供了更大的表面面积。凹坑的尺寸范围为30nm至200nm，其可以很好地容纳细胞外囊泡。在二甲基甲酰胺中的氨基标记的PEG化胆固醇可以在室温下共价固定在异硫氰酸酯基功能化的表面上。测定PEG化胆固醇附着之前和之后的接触角。裸露的纳米结构二氧化硅表面是超亲水的，因此接触角为0。在PEG化胆固醇的表面接枝后，由于胆固醇是两亲性的，因而接触角增大至约25°。一旦细胞外囊泡移动接近胆固醇功能化的表面，则胆固醇可以同时并即刻插入脂质膜并将细胞外囊泡连接在表面上。

另一方面，基于脂质的探针系统可以为用于从样品中分离细胞外囊泡的装置的一部分。该装置可以包括：其上固定有标记探针的基底表面，标记探针被配置为用于与细胞外囊泡的脂质双层相结合；以及流体流动路径，其被配置为用于为包含细胞外囊泡的样品提供流动路径以接触基底表面。

在此类装置的一个实施方案中，单一元件标记探针可以被缀合至珠粒的表面。珠粒经常用于液相色谱。这些标记探针缀合的珠粒可用于填充不同尺寸的柱子，以适合样品尺寸。此类柱子具有流体流动路径，其被配置为用于使包含细胞外囊泡的样品的流动路径能够接触珠粒表面。液体样品将流过填充柱，并且样品中的EV将被珠粒上的标记探针捕获。

例如，可以将氨基标记的PEG化胆固醇固定在二氧化硅珠粒表面上，并且可以将这些珠粒装配形成色谱柱。除了二氧化硅珠粒之外，珠粒的材料也可以为聚合物，如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、乳胶。通过使样品流过此类柱子，细胞外囊泡可以与胆固醇相互作用，然后连接在珠粒表面上。该柱子能够处理大量样品(例如尿液样品)，多达～100mL。洗涤后，可以将EV溶解并分析其内容物。

实施例

以下实施例旨在进一步说明本发明的某些优选实施方案，并且本质上是非限制性的。本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文所述的特定物质和方法的许多等同方式。

血浆样品的收集。根据机构审查委员会批准的方案(IRB31216)，在宾夕法尼亚州立普通临床研究中心(Penn State General Clinical Research Center)从同意的捐赠者处获得正常对照血液。根据机构审查委员会批准的方案(IRB 40267EP)，在宾夕法尼亚州赫尔歇医疗中心(Penn State Hershey Medical Center)，经过晚期肺癌患者的同意而获得临床样品。由外周静脉穿刺将样品抽入10ml Vacutainer K2-EDTA管(Becton Dickinson)中。在4℃以300g离心5分钟而后以16,500g离心20分钟之后，收集血浆，使用0.22μm孔径过滤器过滤并储存在-80℃直至处理。

细胞培养。MDA-MB-231、SW620和SK-N-BE(2)细胞购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。所有细胞通过支原体污染测试，并保持在补充有10％(v/v)FBS、100单位ml^-1青霉素和100μg/ml链霉素的无酚红DMEM培养基(Corning)中。将细胞在37℃时、5％CO₂的潮湿气氛中培养。

nEV的模型样品的制备。使MDA-MB-231细胞在9个T75烧瓶(Falcon)中生长2天至3天，直至细胞汇合度(confluency)达到80％。接下来，将细胞在SFM培养基(Corning)中培养48小时。收集培养基并以300g离心5分钟，然后进行16,500g、20分钟的离心步骤以丢弃细胞碎片。然后，使用0.22μm(孔径)过滤器过滤培养基。收集总共108ml的培养基并在100,000g和4℃连续超速离心2小时。将nEV沉淀物悬浮在200μl的SFM中。将400μl体积的nEV的SFM溶液分成六等份。一式三份的标准化样品用于评价nEV的分离中可聚合脂质的效率。将模型样品与10μl的DNaseI(1单位μl^-1；Life Technologies)或5μg ml^-1RNase在37℃孵育2小时。收集上清液并于-80℃储存。

nEV细胞摄取。将nEV的稀释剂C溶液与2μl PKH26染料(Sigma)的稀释剂C溶液在4℃孵育5分钟，然后通过超速离心进行纯化。通过在96孔板中将细胞培养物与经标记的nEV在37℃孵育2小时来进行摄取。用4％多聚甲醛将细胞在4℃固定10分钟，并在室温下用DAPI溶液(1μg ml^-1)染色10分钟。在Olympus IX71显微镜上使用40×物镜获得细胞的图像。

LNP与细胞的优化。FITC标记的C18-PEG、DSPE-PEG和胆固醇-PEG粉末购自Nanocs并且无需进一步纯化即可使用。以1mM的最终浓度将FITC标记的PEG化脂质溶于纯无水乙醇中，然后于-80℃储存。收集大约10⁷个MDA-MB-231细胞并重悬于250μl稀释剂C或含有5％人白蛋白的PBS中。将10纳摩尔的各LP添加到250μl的稀释剂C中，而后添加到细胞悬浮液中。将样品在4℃温和混合5分钟，然后以500g离心5分钟以除去多余的LP，然后用4％多聚甲醛在4℃固定10分钟。将细胞重悬于1.5ml的PBS中，在室温下用DAPI溶液(1μg ml^-1)染色10分钟，用PBS彻底漂洗三次，最后重悬于500μl的PBS中。将细胞悬浮液(20μl)滴加到玻璃盖片上，使用Olympus IX71显微镜在40×物镜下进行荧光成像。使用ImageJ软件包(NationalInstitutes of Health)分析荧光强度。

CP的制备和表征。通过改良的溶胶凝胶法44-48合成磁性Fe₃O₄-SiO₂核壳亚微米颗粒。简而言之，将30mg如此制备的Fe₃O₄亚微米颗粒超声分散在含有160ml乙醇、40ml水和10ml浓氨水(28％w/w)的溶液中。然后在超声处理下滴加原硅酸四乙酯(0.3ml)，而后在室温下搅拌3小时。使用磁体分离所得的颗粒，用去离子水和乙醇彻底洗涤，并在60℃干燥12小时。

为了用氨基将MMP官能化，将250mg MMP和250μl 3-氨基丙基三乙氧基硅烷超声分散在30ml甲苯中。在氮气气氛下将混合物回流12小时。最后，收集产物，用甲苯和乙醇漂洗三次，并在80℃干燥过夜。使用扫描电子显微镜(Zeiss，Sigma)检查颗粒的形态。使用Bruker Vertex V70，在KBr压片上、然后以6cm^-1的分辨率从400cm^-1至4,000cm^-1进行扫描，从而获得傅里叶变换红外光谱。

将胺功能化的MMP(5mg)添加到含有10％吡啶和1mM苯基二异硫氰酸酯的二甲基甲酰胺溶液中2小时。然后用二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水彻底洗涤颗粒。使用Zetasizer(Malvern)测定化学修饰之前和之后MMP的ζ电位。将约625μg中性链亲和素蛋白(LifeTechnologies)的去离子水溶液与异硫氰酸酯接枝的MMP在37℃缀合1小时，然后用1％BSA的PBS溶液进行封闭，并用PBS洗涤三次。新鲜的NA包覆的MMP立即用于nEV分离。

使用LNP分离nEV。以1mM的最终浓度将LP(生物素标记的DSPE-PEG)粉末溶于纯无水乙醇中，并于-20℃储存。根据稍作修改的PKH26标记方案，用LP标记nEV。将100μl体积的各nEV模型样品添加到1ml稀释剂C中。将LP(0.001nmol、0.01nmol、0.1nmol、1nmol、5nmol或10nmol)添加到另外1ml稀释剂C中，然后添加到nEV和对照中。将样品在4℃温和混合5分钟，然后在室温下与～10¹²CP(NA包覆的MMP)一起孵育30分钟。可以通过磁体从样品中分离出与CP结合的经标记的nEV。也可以通过静电力、介电力、重力和离心力从样品中分离出与CP结合的经标记的nEV。分离后，用PBS彻底漂洗CP三次，以除去CP表面上吸附的非特异性分子。对2分钟至8分钟的LP混合时间以及5分钟至30分钟的CP孵育时间的影响进行评估和优化。使用SEM表征nEV结合的CP的形态。

将包含1nmol、10nmol、50nmol、100nmol或200nmol LP的500μl稀释剂C的等分样品添加到100μl血浆(从健康志愿者中采集)中，然后在4℃混合5分钟，并在室温下与CP孵育10分钟。此外，将100μl血浆添加到30ml PBS中，并在100,000g和4℃进行一次2小时的超速离心。如前所述提取RNA以评价分离效率。所有实验一式三份地进行。

使用生物素释放所捕获的nEV。如上所述制备DSPE-PEG-脱硫生物素(Nanocs)的纯无水乙醇溶液。按照上述方案，用DSPE-PEG-脱硫生物素标记nEV并捕获到CP上。通过用PBS漂洗CP三次来除去剩余的未被捕获的nEV。向PBS中引入二十纳摩尔生物素以置换DSPE-PEG-脱硫生物素。在室温下孵育30分钟后，使用移液管用PBS彻底洗涤CP。收集上清液用于RNA提取。以从上清液中提取的RNA量(所释放的nEV)除以来自所捕获的nEV的RNA的总量来计算释放效率。

nEV的表征。对于TEM，将5μl模型nEV样品置于400目的涂覆有Formvar的铜网上，并在室温下孵育3分钟。用滤纸吸干过量的样品，然后用经过滤的1％乙酸双氧铀水溶液进行1分钟的负染。用滤纸从网格上吸干染色剂，并使样品能够干燥。然后在FEI Tecnai透射电子显微镜中以100kV的加速电压检查样品。

对于SEM，将模型nEV样品(5μl)接种到涂覆有聚-L-赖氨酸的硅晶圆上，并在4％多聚甲醛中固定3小时。然后将样品依次浸入20％、30％、50％、70％、85％、95％和100％的乙醇溶液中，每种溶液浸泡15分钟。将样品冻干过夜，然后在室温下用金溅射涂覆。在Zeiss场发射扫描电子显微镜下检查nEV的形态。

对于低温EM，将5μl模型nEV样品滴加至200目网格(Quantifoil，Ted Pella)，用FEI Vitrobot印迹1秒，然后插入液体乙烷中，并转移至低温样品架。通过TEM(FEI TecnaiF20)和SEM(FEI Helios NanoLab 660)观察样品。使用Nanosight LM10(Malvern)测定nEV的数量。将nEV以1:100稀释，置于腔室中，并使用纳米颗粒追踪分析软件(Malvern)进行分析以计算nEV的数量。

伤口愈合试验。将大约3×10⁵个MCF-7细胞接种到24孔板的各孔中，并使其附着在基底上过夜。当汇合度达到100％时，使用移液管尖端刮擦细胞单层。通过更换培养基除去脱离的细胞。然后将细胞在37℃、5％CO₂中孵育。为了用nEV训导细胞，添加～8×10⁸个所释放的MDA-MB-231nEV。在0小时、24小时和48小时时间点，在显微镜下监测伤口宽度。ImageJ用于计算伤口面积。

使用SYTO RNASelect染色粗略估计nEV中的RNA量。

将0μl、5μl、15μl、25μl、35μl和45μl模型nEV样品的等分样品与5μl 500nM SYTORNASelect染色剂(Life Technologies)混合。用PBS将溶液的最终体积调整至50μl，然后在37℃温育20分钟。使用平板读数器，绿色荧光测量的激发波长为490nm而发射波长为530nm。在另一组中，从等量的nEV样品中提取RNA。然后构建来自RNA量的荧光的标准曲线。将经预热的标记溶液(5μl)应用于50μl样品，并在37℃孵育20分钟。标记完成后，直接在平板读数器中测定各样品的荧光强度而无需进行漂洗。

使用类ELISA试验检测nEV膜蛋白。按照上述方案，将来自三种细胞类型(SK-N-BE(2)、MDA-MB-231和SW620)中的每一种的大约10¹¹个nEV重悬于100μl SFM中，并用5nmol LP进行标记。在室温下孵育30分钟后，nEV被直接锚定在NA包覆的玻璃基底上。用稳定化固定剂(BD，Biosciences)将所有样品固定10分钟，然后用PBS漂洗三次。用1％BSA的PBS溶液在室温下将表面封闭30分钟，并且与荧光团缀合的针对CD9(Santa Cruz Biotechnology，sc-13118FITC)和CD326(EpCAM；Miltenyl Biotec，130-098-115)的抗体在4℃孵育过夜。然后，用PBS彻底洗涤样品并在荧光显微镜(Olympus)下观察。使用ImageJ量化荧光强度。

核酸和蛋白质提取。根据制造商的说明书，使用Trizol(Life Technologies)进行RNA制备。将Trizol(750μl)和氯仿(200μl)添加到nEV中并与之剧烈混合。离心后，用500μl纯异丙醇对样品的水相进行均化和沉淀。然后使用1ml 75％的乙醇进行RNA洗涤。最后，将RNA沉淀溶解在50μl不含RNase的水中。使用Qubit荧光计(Life Technologies)或Agilent2100生物分析仪测定nEV中的RNA浓度。

根据制造商的说明书，使用QIAamp DNA微量试剂盒(Qiagen，德国)提取DNA。简而言之，为了从nEV进行DNA提取，添加10μl蛋白酶K和100μl裂解缓冲液。在56℃加热灭活10分钟后，添加100μl纯乙醇。将整个体积在旋转柱中离心。在两次洗涤步骤后，将DNA在50μl AE缓冲液中洗脱，并于-20℃储存直至PCR扩增。

使用Micro BCA蛋白质试验试剂盒(Pierce)测定重新悬浮在经修饰的RIPA缓冲液中的蛋白质的量。将所分离的nEV与工作试剂充分混合，并在60℃孵育30分钟。使用Infinite M200Pro平板读数器测定各样品的荧光强度。使用BSA标准曲线测定各nEV样品的蛋白质浓度。

为了监测GAPDH和CD63的nEV表达，将所分离的nEV收集在8M尿素、2.5％SDS、5μgml^-1亮抑酶肽、1μg ml^-1抑胃酶肽和1mM苯甲基磺酰氟缓冲液中。根据Micro BCA试剂盒说明书测定蛋白质的量并使用丙烯酰胺凝胶进行分析。使用湿电泳转移将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P)上。在室温下，用5％脱脂奶粉的PBS溶液和0.05％吐温20将蛋白质印迹封闭1小时，然后在4℃与抗GAPDH(Abcam，ab9485)和CD63(Santa CruzBiotechnology，sc-15363)的一抗孵育过夜。然后，在室温下将二抗孵育1小时。用PBS和0.05％Tween 20洗涤样品三次，每次10分钟。使用化学发光(Pierce)来观察印迹。

PCR和测序。使用以下引物进行KRAS分析(466bp)：正向5'-AAG GCC TGC TGA AAATGA CTG-3'和反向5'-TCA CAA TAC CAA GAA ACC CAT-3'(Kahlert等人J.Biol.Chem.289,3869–3875(2014))。使用以下引物进行EGFR外显子19和21的分析：外显子19(372bp)，正向5'-GCA ATA TCA GCC TTA GGT GCG GCT C-3'，反向5'-CAT AGA AAG TGA ACA TTT AGGATG T G-3'；外显子21(300bp)，正向5'-TGC AGA GCT TCT TCC CAT GA-3'，反向5'-GCATGT GTT AAA CAA TAC AGC-3'54。在含有12.5μl GoTaq Green Master Mix(Promega)、10.5μl模板DNA和1μl各引物的25μl反应管中进行PCR。扩增在以下条件下进行：94℃1分钟；94℃10秒、67℃10秒、70℃10秒的两个循环；94℃10秒、64℃10秒、70℃10秒的两个循环；94℃10秒、61℃10秒、70℃10秒的两个循环；94℃10秒、60℃10秒、70℃10秒的55个循环，保持4℃。按照制造商的说明书，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)净化PCR产物，然后在宾夕法尼亚州立大学的基因组学核心机构通过桑格DNA测序(Applied Biosystems 3730XL)进行测序。

可供选择地，使用实时PCR试剂盒PointMan KRAS(密码子12或13)DNA富集试剂盒(EKF分子诊断学)来富集突变。一旦在实时PCR中观察到变体迹线，则纯化相关样品用于桑格测序。对于EGFR突变体富集的PCR试验，分别用Mse I和Msc I在37℃进一步消化2μl EGFR外显子19和外显子21的第一传统PCR产物4小时。在与第一轮PCR相同的条件下，将等分样品用作第二轮巢式PCR扩增的模板，不同的是进行42个循环。外显子19巢式PCR(175bp)引物为：正向5'-TAA AAT TCC CGT CGC TAT CAA-3'和反向5'-ATG TGG AGA TGA GCA GGG-3'。外显子21巢式PCR(213bp)引物为：正向5'-CAG CAG GGT CTT CTC TGT TTC-3'和反向5'-GAA AAT GCT GGC TGA CCT AAA G-3'。将产物纯化并通过桑格DNA测序进行分析。

全基因组NGS。使用聚焦超声波发生器(Covaris)将所分离的nEV DNA机械分割至400bp。在哈佛医学院的生物聚合物机构进行DNA测序。将WaferGen DNA prepX试剂盒用于制备测序文库。使用Illumina NextSeq 500平台(配对末端2×77bp)进行NGS，覆盖深度为3.3×。使用FastQC(Babraham Bioinformatics)评估数据质量。使用bwa-mem(v.0.7.12)将数据绘制到人类基因组(hg38)，并使用Bedtools(v.2.17.0)产生覆盖文件。使用IGV观察绘制结果，并用Bedtools计算10kbp箱中的读数。在各样品的轮廓图(circus plots)中绘制10kbp箱中的读数覆盖率。为了确定nEV样品的CNV，将各NGS数据集向下采样至10Mbp。另外，制备相同细胞系的基因组DNA而不进行扩增，并通过NextSeq测序至覆盖深度为0.16×。使用开源网络平台Gingko(http://qb.cshl.edu/ginkgo/)生成CNV图。

RNA的NGS。使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)提取核糖体RNA耗尽的总nEV RNA。在纽约大学医学中心的基因组学技术中心进行RNA测序。使用llumina TruSeq StrandardmRNA试剂盒制备mRNA和sRNA测序文库。将测序文库合并在一起并在Illumina HiSeq平台(单端50bp)上测序。对于16个样品中的每一者，我们得到了超过2000万个51-bp读数(小RNA-seq，n＝8；总RNA-seq，n＝8)。使用cutadapt(v.1.3)除去小RNA-seq的适配体。使用STAR比对器(v.2.3.0e r291)将所有读数绘制到人类参考基因组(GRCh37/hg19)。根据基因转移文件(GTF版本GRCh37.70)进行比对。使用Bedtools(v.2.17.0)和bedGraphToBigWig工具(v.4)生成每百万个标准化BigWig文件的读数。基于Ensembl基因注释文件(Ensembl GTF版本GRCh37.70)，使用HTSeq(v.0.6.0)60生成读数计数表。然后基于使用DESeq2R包(v.3.0)计算的几何文库尺寸因子校正所有读数计数表的文库尺寸差异，并进行差异表达分析。为了比较我们的数据集中的样品之间基于其归一化基因表达的相似性水平，我们使用基于欧几里德距离的样品聚类。所有下游统计分析和数据观察均在R(v.3.1.1；RFoundation；http://www.r-project.org/)中进行。对于主要成分分析和欧几里德距离分析，我们使用DESeq2的rlogTransformation函数转换归一化计数数据，以修复具有零(或未检测到)表达的基因中的极大log2(表达值)。我们采用DESeq的plotPCA函数来计算前两个主要成分，并且我们使用ggplot2package(v.2.0.0)创建了二维图。对于距离分析，我们通过将方法设置为欧几里德(默认)，根据其距离对样品进行聚类，并在热图(heat map)中观察，从而使用R距离函数来计算经转换的归一化计数数据(如前所述)中的样品距离。

LC-MS/MS。通过BCA蛋白质试验测定蛋白质浓度。使用10％Bis-Tris Nupage凝胶(Life Technologies)通过SDS-PAGE分离大约30μg蛋白质。切下连续的凝胶切片并切成较小的片段。在25mM NH₄HCO₃中，用10mM二硫苏糖醇将样品在56℃还原1小时，并在室温下用55mM碘乙酰胺烷基化45分钟。使用在505mM NH₄HCO₃中稀释的10ngμl^-1测序级经修饰的猪胰蛋白酶(Promega)在37℃进行凝胶内胰蛋白酶消化过夜。用0.5％甲酸和50％乙腈提取肽。蒸发乙腈后，使用ZipTipC18柱(Millipore)对肽进行纯化。使各经洗脱的样品的体积在Speedvac(Savant，Thermo Fisher)中降低至5μl以蒸发乙腈，然后用0.1％甲酸将体积调整至20μl，而后进行LC-MS/MS分析。LC-MS/MS采用陷阱洗脱结构中配备有Eksigent nanoLCUltra和ChiPLC-nanoflex(Eksigent)的AB SCIEX TripleTOF5600系统(Foster City)。使用ProteinPilot 5.0软件(AB SCIEX)通过Paragon搜索模式处理所得的质谱原始数据。将ProteinPilot描述统计模板(AB SCIEX)用于比对多个结果并评价错误发现率。

上述方法的其他细节可以在Wan，Y.等人Rapid magnetic isolation ofextracellular vesicles via lipid-based nanoprobes.Nat.Biomed.Eng.1,0058(2017)中找到。

总之，实施例提供了用于快速分离nEV的脂质纳米探针系统，nEV包括来自无血清细胞培养上清液样品和血浆样品的外泌体。实施例涉及利用生物素标记的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷杂乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)来标记nEV的脂质双层。

然后通过中性链亲和素(NA)包覆的磁性亚微米颗粒(MMP)收集经标记的nEV，用于随后的nEV货物的提取和分析。与差速离心(最普遍的nEV分离方法)相比，LP系统将分离过程从数小时缩短到15分钟，并且不需要庞大或昂贵的设备。LP系统也非常灵活，并且可用于DNA、RNA和蛋白质的各种下游分析。我们应用LP系统从19例IV期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中获得nEV DNA，这使我们能够检测KRAS(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物)密码子12和13以及EGFR(表皮生长因子受体)外显子19和21中的突变。

本公开中仅示出并描述了本发明的优选实施方案及其通用性示例。应当理解，本发明能够用于各种其他组合和环境中，并且能够在如本文所表达的发明构思的范围内进行改变或修改。因此，(例如)使用不超过常规的实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的特定物质、方法和设置的许多等同方式。此类等同方式被认为是在本发明的范围内，并且由以下权利要求所涵盖。

Claims (19)

1.一种从样品中分离细胞外囊泡的方法，该方法包括：

使标记探针与包含具有脂质双层的细胞外囊泡的样品相接触，其中所述标记探针被配置为用于与所述细胞外囊泡的所述脂质双层相结合，以便标记所述细胞外囊泡；

用捕获探针捕获经标记的细胞外囊泡，所述捕获探针被配置为用于与所述标记探针相结合；以及

分离用所述捕获探针捕获的所述经标记的细胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括从所述捕获探针中释放所述经标记的细胞外囊泡。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针包括磁性颗粒、金属颗粒、抗原包覆的颗粒和带电颗粒。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记探针进一步包括脂质尾部、间隔物和标签。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述捕获探针具有对所述标签具有高结合亲和性的分子。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述脂质尾部包括脂肪酸、甘油脂质、甘油磷酸脂质、固醇脂质、异戊烯醇脂质、鞘脂质、糖脂质、聚酮化合物、类二十烷酸、它们的衍生物或它们的任意组合。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述间隔物包括聚乙二醇。

8.一种分析细胞外囊泡的内容物的方法，该方法包括：

分离根据权利要求1至7中任一项所述的细胞外囊泡；

从所分离的细胞外囊泡中提取内容物；以及

分析所提取的内容物的结构和/或功能。

9.一种从样品中分离细胞外囊泡的方法，该方法包括：

使包含细胞外囊泡的样品与其上固定有标记探针的基底的表面相接触，其中所述标记探针被配置为用于与所述细胞外囊泡的脂质双层相结合，以便将所述细胞外囊泡固定在所述基底的所述表面上。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记探针包括脂质尾部、间隔物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述表面具有对所述标记探针具有高结合亲和性的结合分子。

12.一种分析细胞外囊泡的内容物的方法，该方法包括：

固定根据权利要求9至11中任一项所述的细胞外囊泡；以及

测定依赖于固定在所述表面上的细胞外囊泡的一种或多种所述内容物的浓度的参数。

13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括使脂质双层渗透性荧光标志物与固定在所述表面上的所述细胞外囊泡相接触，所述荧光标志物对固定在所述表面上的所述细胞外囊泡中的给定分子具有高结合亲和性。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述参数为与固定在所述表面上的所述细胞外囊泡中的所述给定分子相结合的所述荧光标志物的总荧光强度。

15.一种用于从样品中分离细胞外囊泡的装置，该装置包括：

其上固定有标记探针的基底表面，所述标记探针被配置为用于与所述细胞外囊泡的脂质双层相结合；以及

流体流动路径，其被配置为用于为包含细胞外囊泡的样品提供流动路径以接触所述基底表面。

16.根据权利要求15所述的装置，进一步包括：第一电极，其包括所述基底的囊泡固定表面；以及第二电极，其具有与所述第一电极相反的极性，所述装置被配置为用于使用所述第一电极和所述第二电极向所述样品施加电场。

17.根据权利要求15至16中任一项所述的装置，其中所述标记探针包括脂质尾部和间隔物。

18.根据权利要求17所述的装置，其中所述脂质尾部包括脂肪酸、甘油脂质、甘油磷酸脂质、固醇脂质、异戊烯醇脂质、鞘脂质、糖脂质、聚酮化合物、类二十烷酸、它们的衍生物或它们的任意组合。

19.根据权利要求17所述的装置，其中所述表面具有对所述标记探针具有高结合亲和性的分子。