CN114369647A - 一种用于微滴式数字pcr的油包水液滴及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴及其应用，其中所述液滴的水相中包括DSPE‑PEG‑BSA改性蛋白、质粒模板、探针引物对组合、PCR反应缓冲液，所述液滴的油相中含有氟碳油、硅油和/或矿物油。本发明的DSPE‑PEG‑BSA改性蛋白作为表面活性剂的应用，有效降低了水相体系的表面张力，DSPE‑PEG‑BSA改性蛋白同时还可以作为稳定剂，提高了液滴的稳定性。此外，本发明的液滴还兼容氟油、硅油和矿物油等微滴式数字PCR体系。

Description

一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴及其应用
技术领域
本发明属于微流控技术领域，特别是涉及一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴及其应用。
背景技术
微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是一种精准的核酸绝对定量技术，可对目标基因进行绝对定量，具有卓越的灵敏度和精准度。其通过微流控的方式，将PCR混合液分散至数万个油包水微滴中，单个微滴就是一个独立的PCR反应单元。有的微滴未分配到靶核酸模板，有的微滴分配到大于等于1个靶核酸模板，经过PCR扩增循环之后，分配到靶核酸模板的微滴会发出强荧光信号，而没有分配到靶核酸模板的微滴就仅有本底荧光信号，统计完阳性微滴的个数与比例，再根据泊松分布原理及液滴的体积即可推算出靶核酸分子的起始拷贝数或浓度。与传统定量PCR不同，微滴式数字PCR通过直接计数的方式实现起始DNA模板的绝对定量。
微滴式数字PCR的关键在于维持油包水液滴的稳定性。而从热力学观点来看，油包水液滴天然是一个不稳定的体系，液滴只是相对的、暂时稳定的体系，其不稳定性主要体现在液滴的破碎、聚集和融合。尤其是PCR扩增，高低温循环，液滴更加容易出现破碎和融合。仅依靠油相中的表面活性剂，并不能维持液滴的95℃高温稳定，为了液滴能保证扩增的稳定性和储存稳定性，水相中往往也需要加入稳定剂，和油相中表面活性剂共同作用，维持液滴的稳定性。
现有的为维持液滴高温稳定性而在水相中添加的稳定剂的方法之一，是在水相中添加可溶解的交联蛋白质如牛血清蛋白BSA、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)等。其作用机理是通过溶于氟碳油种的离子型表面活性剂溶解在水相中产生电离，吸引可溶性蛋白质到油包水液滴表面，PCR高温加热过程，蛋白质交联固化形成一层类似固态的蛋白膜，提高液滴稳定性，大大减少液滴的破碎和融合。但是此方法有一定局限性。其一，因大多数DNA嵌入式染料如EvaGreen染料带正电，会与阴离子表面活性剂嵌入成离子对，然后离子表面活性剂/染料络合物跨越相界迁移到氟油相内，导致微滴荧光随时间降低，而背景荧光随时间增加而增强，降低结果可信度；其二，此类方法也局限于氟油体系，数字PCR常用油相—矿物油极难溶解离子型表面活性剂，难以靠表面活性剂的静电作用，吸引蛋白质到油包水液滴膜表面，形成蛋白膜。综上，需要一种能有效提高液滴稳定性，且能多体系兼容，多种PCR反应模式兼容的水相体系。
发明内容
本发明的目的在于一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴及其应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴，其中所述液滴的水相中包括DSPE-PEG-BSA改性蛋白、质粒模板、探针引物对组合、PCR反应缓冲液，所述液滴的油相中含有氟碳油、硅油和/或矿物油。本发明的DSPE-PEG-BSA改性蛋白在PCR高低温循环过程中作为液滴的稳定剂而存在。所述DSPE-PEG-BSA改性蛋白可以作为表面活性剂发挥作用，其一端是亲水的，其一端是能溶于油相中亲油物质，能有效降低水性体系的表面张力。所述DSPE-PEG-BSA改性蛋白能在油包水液滴形成过程中，作为水相中表面活性剂的存在自动分配到油水界面膜上，在PCR高温过程中，亲水端的蛋白质变性交联成类似固态的蛋白膜，从而提高油包水微滴的稳定性。
在本发明的一个优选实施方式中，所述DSPE-PEG-BSA改性蛋白在水相中的质量浓度在0.1-5％之间。
在本发明的一个优选实施方式中，所述氟碳油选自HFE7500、FC40；所述硅油选自PMX-200、5225C；所述矿物油选自正十四烷、正十二烷、碳酸二乙基己酯等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述油相中还包括表面活性剂。优选地，所述表面活性剂包括但不限于：Krytox系列氟化表面活性剂，Capstone系列氟化表面活性剂的一种或多种，聚二甲基硅氧烷为骨架的大分子非离子型表面活性剂如EM 90、ABIL EM 180、或ABIL WE 09中的一种或多种，含有聚乙二醇小分子非离子型表面活性剂如吐温系列、诺纳德系列、和曲拉通系列中的一种或多种。
本发明另一方面涉及一种基于微滴式数字PCR定量测定核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将上述将油相加入到反应杯中，将上述水相放入到进样杯中，通过气泵驱动水相进入到微流控芯片中，切割形成油包水微滴；
(2)PCR扩增。
在本发明的一个优选实施方式中，所述核酸为DNA或RNA。
在本发明的一个优选实施方式中，还包括PCR扩增后在荧光显微镜下观察液滴信号的步骤。
本发明带来的有益效果有：1)本发明的DSPE-PEG-BSA改性蛋白作为表面活性剂的应用，有效降低了水相体系的表面张力。2)DSPE-PEG-BSA改性蛋白同时还可以作为稳定剂，提高了液滴的稳定性。在PCR过程中，在油包水界面膜上形成固态蛋白膜，阻止液滴的融合和破碎，阻止了液滴在PCR热循环过程中的融合和破碎，提高定量的准确性和试剂利用率，也可以实现液滴的长期稳定。3)兼容探针法和染料法两种反应方式。4)兼容氟油、硅油和矿物油等微滴式数字PCR体系。
附图说明
图1为实施例1含有改性蛋白油包水微滴经过PCR扩增程序之后的显微镜照片；
图2为实施例1含有未改性蛋白油包水微滴经过PCR扩增程序之后的显微镜照片；
图3为实施例1含有改性蛋白油包水微滴经过PCR扩增程序之后的荧光显微镜照片；
图4为实施例2含有改性蛋白油包水微滴经过PCR扩增程序之后的显微镜照片；
图5为实施例2含有未改性蛋白油包水微滴经过PCR扩增程序之后的显微镜照片；
图6为荧光定量PCR实时跟踪荧光的原始曲线；
图7为荧光定量PCR实时跟踪荧光的扩增曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但是下述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制，因此在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
实施例1
(1)配置水相溶液，包括DSPE-PEG-BSA改性蛋白(购自重庆渝偲医药科技有限公司)、L858R模板(模板来自非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株H1975，含有L858R突变)、L858R突变检测探针引物对组合(上游引物F：5’
-GCAGCATGTCAAGATCACAGATT-3’；下游引物：R：5’
-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3’，探针序列5’
-FAM-AGTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQ-3’，其中FAM为荧光报告基团，NFQ为荧光淬灭基团)、DPCR反应缓冲液(其包含Taq酶，缓冲盐，DNTP，镁离子)。
(2)将上述液体以表1所示的比例关系均匀混合，获得的溶液作为水相溶液作为实验组备用；按照表2所示的比例关系均匀混合所得的水相溶液作为对照组。
表1：含有改性蛋白的水相组分1(实验组)
Figure BDA0003452548590000051
表2：加入未改性的蛋白水相组分2(对照组)
Figure BDA0003452548590000052
(2)油相采用含有表面活性剂的氟化油体系(FC40作为基础油相，含有2％的PFPE-PEG-PFPE)；
(3)将油相加入到反应杯中，水相放入到进样杯中，通过气泵驱动水相进入到微流控芯片中，切割形成数万个大小均一的油包水微滴；
(4)进行PCR扩增，扩增程序如下表3所示；
表3：PCR扩增程序
Figure BDA0003452548590000061
(5)扩增后显微镜下观察液滴状态，并在荧光显微镜下观察液滴信号，其中，显微镜下观察含有改性蛋白的水相形成的液滴有蛋白膜如图1所示，液滴表面出现皱缩的膜，液滴均一且无破碎和融合；而加入未改性的天然BSA则不能形成蛋白膜，且液滴大小不均一，出现了较多融合，液滴表面有蛋白析出，如图2所示。含有改性蛋白的微滴经PCR扩增后荧光显微镜下观察液滴信号，如图3所示，进一步说明实验组的液滴均一且无破碎和融合，并且实验组的油包水液滴也不影响探针法PCR的扩增信号。
实施例2
(1)按照实施例1配置水相组分1和对照实验为不加DSPE-PEG-BSA的水相；
(2)油相采用含有表面活性剂的矿物油体系(油相是正十六烷，含有1％w/w DPHSArlacel P135和2％w/w WE 09)；
(3)将油相加入到反应杯中，水相放入到进样杯中，通过气泵驱动水相进入到微流控芯片中，切割形成数万个大小均一的油包水微滴；
(4)进行PCR扩增，扩增程序如下表4所示；
表4：PCR扩增程序2
Figure BDA0003452548590000071
(5)扩增后显微镜下观察液滴状态，PCR扩增后，液滴状态如图4所示，液滴均一且无破碎和融合；而不加改性蛋白的对照实验，液滴破碎融合现象较为严重，如图5所示。说明这种方法同样适用于矿物油，且进一步说明其能稳定油包水液滴。
实施例3
(1)配置水相溶液，包括DSPE-PEG-BSA改性蛋白、L858R模板、L858R突变检测引物对组合、2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(来自南京诺唯赞)；
(2)将上述液体以表5所示的比例关系均匀混合，获得的溶液作为非微滴水相溶液作为实验组备用；按照表6所示的比例关系均匀混合所得的水相溶液作为对照组。
表5：加入改性蛋白的qPCR水相组分3
Figure BDA0003452548590000081
表6：未加入改性蛋白的qPCR水相组分4
Figure BDA0003452548590000082
(3)在宏石96P上进行PCR扩增，扩增程序如下表7所示；
表7：PCR扩增程序
Figure BDA0003452548590000083
(4)对实施例PCR产物进行荧光定量PCR实时跟踪，原始荧光曲线如图6所示，Ct值结果如图7所示，对照组和实验组没有差异，CT值一致，曲线完全重合，说明DSPE-PEG-BSA改性蛋白对SYBR Green染料法PCR反应无任何抑制。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (8)

1.一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴，其中所述液滴的水相中包括DSPE-PEG-BSA改性蛋白、质粒模板、探针引物对组合、PCR反应缓冲液，所述液滴的油相中含有氟碳油、硅油和/或矿物油。
2.根据权利要求1所述的油包水液滴，所述DSPE-PEG-BSA改性蛋白在水相中的质量浓度在0.1-5％之间。
3.根据权利要求1所述的油包水液滴，所述氟碳油选自HFE7500、FC40；所述硅油选自PMX-200、5225C；所述矿物油选自正十四烷、正十二烷、正十六烷、碳酸二乙基己酯等。
4.根据权利要求1所述的油包水液滴，所述油相中还包括表面活性剂。
5.一种基于微滴式数字PCR定量测定核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将权利要求1-4任意一项所述的油相加入到反应杯中，将权利要求1-4任意一项所述的水相放入到进样杯中，通过气泵驱动水相进入到微流控芯片中，切割形成油包水微滴；
(2)PCR扩增。
6.根据权利要求5所述的方法，所述核酸为DNA或RNA。
7.根据权利要求5所述的方法，还包括PCR扩增后在荧光显微镜下观察液滴信号的步骤。
8.根据权利要求5所述的方法，所述方法为探针法或染料法。
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