CN109234361B - 一种用于制备微滴式数字pcr液滴的油相组合物及其应用 - Google Patents

一种用于制备微滴式数字pcr液滴的油相组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物及其应用。一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，所述的组合物由92～96％白油及1～3％NP‑10、2～5％L548组成，各组分之和为100％。本发明所述的油相组合物在制备微滴式数字PCR检测试剂中的应用。本发明提供了用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物以及在微滴式数字PCR中的应用，最终使用本发明来制备的液滴具有大小均一、热稳定性好、不易产生气泡，不融合，且对PCR扩增无抑制作用等优点。

Description

一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物及其应用。
背景技术
微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是第三代PCR(Polymeras ChainReaction，聚合酶链式反应)技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法，具备较高的灵敏度和准确性。它的原理是利用油包水原理在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级液滴，其中每个液滴不含或者含有一至数个待检核酸靶分子。经过PCR扩增之后，通过对每个微滴荧光信号逐一收集来进行统计，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0。根据阳性微滴的个数与比例以及泊松分布原理，可以得出靶分子的起始拷贝数或浓度。微滴式数字芯片是用来产生微滴颗粒的载体，由于表面张力作用，水相试剂在油相溶液中会形成一个独立的油包水颗粒，油相成分的溶液就是生成微滴颗粒的必备条件，也为微滴颗粒进行扩增时需要提供温度的热传导介质。
油包水(W/O)乳化体系是由油相、水相和表面活性剂组成的。水相是内相或分散相，油相是外相或分散介质，表明活性剂一般是由非极性、亲油的碳氢链部分和极性、亲水的基团共同构成。根据相似相溶原理，易溶于水的属于水相，不易溶于水的属于油相，表面活性剂既亲水又亲油。表面活性剂对于微滴的形成以及稳定性有重要作用，可以降低油相和水相界面的张力，并在界面吸附形成界面膜，从而保证液滴的稳定性。但是液滴只是相对的、暂时的体系，液滴的沉降、聚集及融合使液滴具有不稳定性。
常用的油相为氟化油，其缺点是易挥发、易产生气泡，与其相关的表面活性剂价格较高。因此需要有一种低成本的液滴制备方法，并且可以使生成的液滴大小均一，热稳定性好。故提出本发明。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物。
本发明的另一目的是提供该油相组合物的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，所述的组合物由92～96％白油及1～3％NP-10、2～5％L548组成，各组分之和为100％。其中％表示体积百分含量。
所述的组合物优选由95％白油及2％NP-10、3％L548组成。
本发明所述的白油为5号白油，芳烃含量低，无副作用。主要为饱和的环烷烃与链烷烃混合物。
一种微滴式数字PCR液滴的制备方法，包括以下步骤：
(1)配置水相，包括DNA，正向引物、反向引物、ddPCR Supermix、dNTP以及ddH2O，将上述液体以一定的比例关系均匀混合，作为反应水相予以备用；
(2)配置油相，将本发明所述的油相组合物的各成分白油、NP-10、L548按照配方量均匀混合，获得的溶液作为反应油相予以备用；
(3)水相、油相混合物在QX200微滴数字PCR系统进行微滴化处理获得微滴式数字PCR液滴。
本发明所述的油相组合物在制备微滴式数字PCR检测试剂中的应用。
本发明所述的油相组合物在微滴式数字PCR中的应用。
有益效果：
本发明提供了用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物以及用于微滴式数字PCR液滴的制备方法，最终使用本发明来制备的液滴具有大小均一、热稳定性好、不易产生气泡，不融合，且对PCR扩增无抑制作用等优点。
附图说明
图1实施例1中(1)组合物形成的液滴图
图2实施例1中(2)组合物形成的液滴图
图3实施例1中(4)组合物形成的液滴图
图4微滴式数字PCR对EGFR基因突变的检测分析
具体实施方式
实施例1
对油相加入不同的表面活性剂，根据不同表面活性剂和油相成分的溶解性，设计油相组合物如下：
(1)98％5号白油)+2％NP-10；其中白油为5号工业级白油(国标)，苏州赛帕汉特种油品有限公司,下同
(2)97％5号白油+3％L548
(3)97％5号白油+3％Tween 80
(4)95％5号白油+2％NP-10+3％L548
(5)94％5号白油+3％L548+3％Tween 80
(6)95％5号白油+2％NP-10+3％Tween 80
结果：(1)、(2)和(4)的表面活性剂与油相可以较好相溶，(3)、(5)和(6)的表面活性剂与油相不相溶。
实施例2
进行液滴制备和PCR扩增，具体步骤如下：
1、按照实施例1中筛选到的(1)、(2)、(4)配置油相；
2、配置水相。模板来自非小细胞肺癌细胞株A549，具有EGFR突变。
Figure BDA0001825310100000031
Figure BDA0001825310100000041
3、将配置好的20μL水相加入微滴发生卡中间一排的孔内，将70μL的油相组合物加入最底层一排孔内，通过QX200TM Droplet Generator(Bio-Rad,USA)制备反应微滴于顶层一排孔内。将微滴转移至八连排管中进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性10min，94℃变性30s，57℃退火延伸1min，共45个循环。
4、显微镜观察液滴形态。
结果：
实施例1中组合物(1)(2)形成的液滴大小不均一，稳定性较差，(4)形成的液滴大小均匀且稳定。
5、数据分析:使用QX-100droplet reader(Bio-Rad)和QuantaSoft analysissoftware(Bio-Rad)进行数据分析。
如图4所示，可检测出EGFR突变。

Claims (5)

1.一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，其特征在于所述的组合物由92～96％白油及1～3％NP-10、2～5％L548组成。
2.根据权利要求1所述的油相组合物，其特征在于所述的组合物由白油及2％NP-10、3％L548组成。
3.一种微滴式数字PCR液滴的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配置水相，包括DNA，正向引物、反向引物、ddPCR Supermix、dNTP以及ddH2O，将上述液体以一定的比例关系均匀混合，作为反应水相予以备用；
(2)配置油相，将权利要求1或2所述的油相组合物的各成分白油、NP-10、L548按照配方量均匀混合，获得的溶液作为反应油相予以备用；
(3)水相、油相混合物在QX200微滴数字PCR系统进行微滴化处理获得微滴式数字PCR液滴。
4.权利要求1或2所述的油相组合物在制备微滴式数字PCR检测试剂中的应用。
5.权利要求1或2所述的油相组合物在微滴式数字PCR中的应用。
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