CN115927556A - 一种用于制备微滴式数字pcr液滴的油相组合物及其制备方法 - Google Patents

一种用于制备微滴式数字pcr液滴的油相组合物及其制备方法 Download PDF

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CN115927556A CN202310182462.9A CN202310182462A CN115927556A CN 115927556 A CN115927556 A CN 115927556A CN 202310182462 A CN202310182462 A CN 202310182462A CN 115927556 A CN115927556 A CN 115927556A
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Abstract

本发明公开一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物及其制备方法，所述油相组合物包括基础油、表面活性剂、纳米粒子；所述基础油为饱和烷烃和硅油的混合物，所述表面活性剂选自聚甘油‑3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷和PEG 30二聚羟基硬脂酸酯的混合物；所述基础油的质量占油相组合物质量的95‑98％，其中，饱和烷烃的质量占所述油相组合物质量的0‑98％，硅油的质量占所述油相组合物质量的0‑98％；所述表面活性剂的质量占油相组合物质量的2‑5％。本发明提供了用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，应用本发明制备的液滴大小均匀、热稳定性好、不挥发，对PCR扩增无抑制作用，且对多数商品化PCR mix均适用。

Description

一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及微流控技术和分子生物学技术的交叉领域，特别涉及一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物及其制备方法。
背景技术
微滴式数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)，以荧光定量PCR为基础，采用基于微流控芯片，将包含核酸模板的荧光定量PCR反应液分散为数以万计的纳升级油包水液滴，每个液滴都可作为一个独立的PCR反应单元。每个液滴不含或含有一至数个待测核酸靶分子，PCR扩增后，包含待检核酸靶分子的液滴可产生荧光信号，不含待检核酸靶分子的液滴不产生荧光信号。逐个检测每个液滴的荧光信号，将有荧光信号的液滴判读为阳性，无荧光信号的液滴判读为阴性。统计阳性液滴的数量和占比，根据泊松分布原理，即可计算出待检核酸靶分子的起始拷贝数或浓度。
已公开报道的ddPCR大多采用微流控芯片，利用表面张力和/或剪切力的作用，将PCR反应液分散到油相中，产生油包水液滴。目前，应用于微流控芯片形成稳定液滴的油相主要有氟化油(包括FC 40、HFE 7500)、烃类油(包括矿物油、十六烷、十四烷等)。ddPCR使用的油相中都需要加入合适的表面活性剂，表面活性剂对于液滴的生成和稳定都具有极其重要的作用。表面活性剂既亲水又亲油，可以吸附在油水界面，这对于保持液滴在PCR热循环(高至95℃)过程的稳定、防止液滴融合至关重要，同时还可避免DNA聚合酶吸附在油/水界面，使PCR扩增反应正常进行。以氟化油为油相，液滴的热稳定性较好，但氟化油易挥发，加热时易产生气泡，对仪器和芯片的密封性要求很高，大大增加了一体化全自动微滴数字PCR系统的开发难度，另外所用表面活性剂价格昂贵，且PCR mix相对封闭，适配性不强。以矿物油等烃类为油相，采用公开报道的表面活性剂，如EM 90，所得液滴的热稳定性无法满足ddPCR反应的要求(高至95℃)。为用于一体化全自动微滴数字PCR，需开发一类新的油相组合物，满足生成液滴大小均匀、热稳定性好、不易挥发、不产生气泡、不抑制PCR扩增等要求。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物及其制备方法，使用该油相组合物制备的液滴大小均匀、热稳定性好、不挥发，PCR加热过程不易产生气泡、对PCR扩增无抑制作用。
为了上述目的，本发明提供一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，所述油相组合物包括基础油、表面活性剂、纳米粒子；
所述基础油为饱和烷烃和硅油的混合物，所述基础油的质量占油相组合物质量的95-98％，其中，饱和烷烃的质量占所述油相组合物质量的0-98％，硅油的质量占所述油相组合物质量的0-98％；
所述表面活性剂的质量占油相组合物质量的2-5％；所述纳米粒子占所述油相组合物总质量的0.1-0.5％。
进一步的，所述饱和烷烃选自正十四烷、正十五烷、正十六烷中的一种或多种，优选的，所述饱和烷烃为正十四、正十五烷、十六烷的混合物。
进一步的，由于单独使用饱和烷烃作为油相的基础油，形成的液滴热稳定性不够，不能保持液滴在PCR扩增反应中的稳定，经过实验，发现向所述饱和烷烃中添加硅油可解决该问题；所述硅油为甲基硅油，优选的，所述硅油为聚甲基硅氧烷，进一步优选的，所述硅油的黏度与饱和烷烃(正十四～十六烷)相近，经过实验，发现八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷中的一种或多种混合物具有良好的效果，因此硅油选自八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷中的一种或多种。
进一步的，所述硅油的体积占所述基础油质量的10－90％，进一步优选的，所述硅油占所述基础油质量的60-80％。实验发现，所述硅油的量过高或过低，所得液滴在PCR扩增过程中易发生融合。
进一步的，所述表面活性剂选自聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷、PEG30二聚羟基硬脂酸酯的的一种或多种，所述聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷的质量占油相组合物总质量的2-5％，PEG 30二聚羟基硬脂酸酯的质量占油相组合物总质量的0.01％-5％，进一步优选的，所述表面活性剂的聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷的质量占油相组合物的3～4％，PEG 30二聚羟基硬脂酸酯的质量占油相组合物的0.05～0.2％。
进一步的，实验发现，同时向油相中加入疏水性的纳米粒子对稳定液滴的效果更佳，因此，所述纳米粒子为表面经疏水修饰的无机或或有机纳米颗粒，优选的，所述纳米粒子为表面经硅烷化处理的二氧化硅纳米颗粒，所述纳米粒子的直径为50-200纳米。
本发明还提供一种微滴式数字PCR液滴的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：配制油相，将油相组合物的各组分按照配方均匀混合，获得的液体作为油相备用；
步骤S2：配置水相，该水相包括PCR缓冲溶液、引物、双链DNA荧光染料或Taqman荧光探针、内参基因ACTB、1％BSA、去离子水，将上述液体以一定的比例混合均匀，获得的溶液作为水相溶液备用；
步骤S3：在数字PCR芯片的水相存储池中加入配制的水相，在数字PCR芯片的油相存储池中加入配制的油相，然后将已加入水相和油相的数字PCR芯片放入数字PCR仪中生成液滴，所得液滴存储在所述数字PCR芯片的液滴存储池。
进一步的，所述步骤S2中的PCR缓冲溶液包括Taq酶、dNTP、镁离子。
进一步的，所述引物包括上游引物F、下游引物R，其中，所述上游引物F的序列为：GGAGAACCAACCAGATGTG，所述下游引物R的序列为：CCTTCGTGCTTGTGATGT。
进一步的，所述Taqman荧光探针的序列为CY5-ctcaccaggcacccagt-MGB，其中，CY5为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。
采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：本发明提供了用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，应用本发明制备的液滴大小均匀、热稳定性好、不挥发，PCR加热过程不易产生气泡、对PCR扩增无抑制作用，且对多数商品化PCR mix均适用。
附图说明
图1为本发明实施例3中组合物(1)中得到的液滴图；
图2为本发明实施例3中组合物(2)中得到的液滴图；
图3为本发明实施例3中组合物(4)中得到的液滴图；
图4为本发明实施例3中组合物(5)中得到的液滴图；
图5为本发明实施例3中组合物(3)中得到的液滴图；
图6为本发明实施例3中组合物(6)中得到的液滴图；
图7为本发明实施例4中组合物(1)中得到的液滴图；
图8为本发明实施例4中组合物(4)中得到的液滴图；
图9为本发明实施例4中组合物(5)中得到的液滴图；
图10为本发明实施例4中组合物(6)中得到的液滴图；
图11为本发明实施例4中组合物(7)中得到的液滴图；
图12为本发明实施例4中组合物(8)中得到的液滴图；
图13为本发明实施例4中组合物(9)中得到的液滴图；
图14为本发明实施例4中组合物(10)中得到的液滴图；
图15为本发明实施例4中组合物(13)中得到的液滴图；
图16为本发明实施例4中组合物(14)中得到的液滴图；
图17为本发明实施例4中组合物(15)中得到的液滴图；
图18为本发明实施例4中组合物(16)中得到的液滴图；
图19为本发明实施例4中组合物(17)中得到的液滴图；
图20为本发明实施例4中组合物(18)中得到的液滴图；
图21为本发明实施例4中组合物(2)中得到的液滴图；
图22为本发明实施例4中组合物(3)中得到的液滴图；
图23为本发明实施例4中组合物(11)中得到的液滴图；
图24为本发明实施例4中组合物(12)中得到的液滴图；
图25为本发明实施例5中组合物(1)中得到的液滴图；
图26为本发明实施例5中组合物(2)中得到的液滴图；
图27为本发明实施例5中组合物(3)中得到的液滴图；
图28为本发明实施例5中组合物(4)中得到的液滴图；
图29为本发明实施例6中组合物(2)中得到的液滴图；
图30为本发明实施例6中组合物(3)中得到的液滴图；
图31为本发明实施例6中组合物(4)中得到的液滴图；
图32为本发明实施例6中组合物(5)中得到的液滴图；
图33为本发明实施例6中组合物(1)中得到的液滴图；
图34为本发明实施例6中组合物(1)中得到的液滴图；
图35为本发明实施例7中组合物(1)中得到的液滴图；
图36为本发明实施例7中组合物(2)中得到的液滴图；
图37为本发明实施例7中组合物(3)中得到的液滴图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进一步说明。
实施例1
对油相加入不同的表面活性剂，根据不同表面活性剂和基础油的溶解性，设计以下几种油相组合物(以质量计)：
(1)97％正十四烷+3％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷；
(2)97％十甲基环五硅氧烷+3％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷；
(3)97％正十四烷+3％ PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(4)97％十甲基环五硅氧烷+3％ PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
结果：(1)、(2)、(3)的表面活性剂与油相可以较好相溶，(4)的表面活性剂与油相的相溶性较差。
实施例2
根据实施例1的实验结果，进一步对油相组合物加入不同的表面活性剂，根据不同表面活性剂和基础油的溶解性，设计以下几种油相组合物(以质量计)：
(1)50％十甲基环五硅氧烷+47％正十四烷+3％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷
(2)50％十甲基环五硅氧烷+47％正十四烷+3％ PEG 30二聚羟基硬脂酸酯
(3)50％十甲基环五硅氧烷+47％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯
(4)50％十甲基环五硅氧烷+47％正十六烷+3％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷
(5)50％十甲基环五硅氧烷+47％正十六烷+3％ PEG 30二聚羟基硬脂酸酯
(6)50％十甲基环五硅氧烷+47％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯
结果：油相组合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)中的表面活性剂与基础油能够较好相溶。
实施例3
根据实施例2筛选到的(1)～(6)油相组合物进行液滴制备操作，并进行PCR扩增，具体步骤如下：
(1)按实施例2中(1)～(6)方案配制油相；
(2)配制水相即PCR反应体系；模板来自内参基因ACTB。
引物序列为：
F:GGAGAACCAACCAGATGTGT
R:CCTTCGTGCTTGTGATGT
探针序列为：CY5-ctcaccaggcacccagt-MGB
其中Cy5为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。
水相配方见表1：
表1
Figure BDA0004102760890000061
Figure BDA0004102760890000071
(3)将油相组合物灌入一种微滴数字PCR芯片内；
(4)将所述一种微滴数字PCR芯片放入一种全自动微滴数字PCR仪，气压驱动水相进入油相，采用阶梯乳化的方式生成液滴；
(5)生成好的液滴在所述一种微滴数字PCR芯片内以单层平铺排列，然后按如下程序进行PCR扩增：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火延伸30s，共40个循环；
(6)扩增结束，所述一种全自动微滴数字PCR仪自动拍照，观察液滴状态。
结果：PCR扩增后，实施例3中，采用实施例2中油相组合物(1)、(2)、(4)、(5)的液滴大小不均匀，融合严重，液滴连成一片(图1、图2、图3、图4)；实施例3中，采用实施例2中油相组合物(3)、(6)中的液滴融合明显改善，大液滴和破碎液滴大幅减少(图5、图6)。即实施例3中，采用实施例2中油相组合物(3)、(6)保持液滴稳定的效果有所改善，但仍有较多破碎液滴和偏大液滴，应为PCR扩增加热所致。
实施例4
根据实施例3确定油相组合物的基础油为正十四烷(或正十六烷)和硅油，使用聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷和PEG 30二聚羟基硬脂酸酯为表面活性剂，继续对正十四烷(或正十六烷)和硅油的添加比例进一步优化。
(1)87％十甲基环五硅氧烷+10％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(2)77％十甲基环五硅氧烷+20％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(3)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(4)57％十甲基环五硅氧烷+40％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(5)47％十甲基环五硅氧烷+50％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(6)37％十甲基环五硅氧烷+60％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(7)27％十甲基环五硅氧烷+70％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(8)17％十甲基环五硅氧烷+80％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(9)7％十甲基环五硅氧烷+90％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(10)87％十甲基环五硅氧烷+10％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(11)77％十甲基环五硅氧烷+20％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(12)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(13)57％十甲基环五硅氧烷+40％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(14)47％十甲基环五硅氧烷+50％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(15)37％十甲基环五硅氧烷+60％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(16)27％十甲基环五硅氧烷+70％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(17)17％十甲基环五硅氧烷+80％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
(18)7％十甲基环五硅氧烷+90％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯；
液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例3相同。
结果：组合物(1)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)中有较多破碎液滴和偏大液滴，应为液滴融合所致(图7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)；组合物(2)、(3)、(11)、(12)中绝大多数液滴均匀稳定，只有少量融合液滴(图21、22、23、24)。
实施例5
根据实施例4确定油相组合物的基础油为正十四烷(或正十六烷)和硅油，使用聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷和PEG 30二聚羟基硬脂酸酯为表面活性剂，依据油相组合物(2)、(3)、(11)、(12)，向油相组合物中添加纳米粒子，继续优化优化油相组合物。继续对聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷和PEG 30二聚羟基硬脂酸酯的添加比例进一步优化。
(1)77％十甲基环五硅氧烷+20％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)
(2)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)
(3)77％十甲基环五硅氧烷+20％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)
(4)7％十甲基环五硅氧烷+30％正十六烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)
液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例3相同。
结果：组合物(1)、(2)、(3)、(4)中基本没有破碎和融合液滴(图25、26、27、28)。
实施例6
根据实施例5确定油相组合物的基础油为正十四烷(或正十六烷)和硅油，使用聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷和PEG 30二聚羟基硬脂酸酯为表面活性剂，继续对聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷和PEG 30二聚羟基硬脂酸酯的添加比例进一步优化。
(1)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十四烷+2.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+0.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
(2)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十四烷+2.0％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.0％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
(3)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十四烷+1.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+1.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
(4)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十四烷+1.0％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+2.0％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
(5)67％十甲基环五硅氧烷+30％正十四烷+0.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+2.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例3、实施例4相同。
结果：组合物(2)、(3)、(4)、(5)中有少量偏大液滴，应为液滴融合所致(图29、30、31、32)；组合物(1)中液滴比较稳定，基本没有融合液滴，可检测到较强荧光信号(图33、图34)。
实施例7
根据实施例6确定油相组合物的基础油为正十四烷(或正十六烷)和硅油，使用聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷和PEG 30二聚羟基硬脂酸酯为表面活性剂，继续对正十四烷和正十六烷的添加比例进一步优化。
(1)67％十甲基环五硅氧烷+20％正十四烷+10％正十六烷+2.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+0.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
(2)67％十甲基环五硅氧烷+15％正十四烷+15％正十六烷+2.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+0.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
(3)67％十甲基环五硅氧烷+10％正十四烷+20％正十六烷+2.5％聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷+0.5％PEG 30二聚羟基硬脂酸酯+0.1％二氧化硅纳米颗粒(经硅烷化处理)；
液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例3、实施例4、实施例5相同。
结果：组合物(1)、(2)、(3)所得结果相近，均能获得均匀液滴，基本没有破碎和融合所致偏大液滴(图35、36、37)。
由上述实施例1至7可知，本发明提供了用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，应用本发明制备的液滴大小均匀、热稳定性好、不挥发，PCR加热过程不易产生气泡、对PCR扩增无抑制作用，且对多数商品化PCR mix均适用。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，其特征在于，所述油相组合物包括基础油、表面活性剂、纳米粒子；
所述基础油为饱和烷烃和硅油的混合物，所述基础油的质量占油相组合物质量的95-98％，其中，饱和烷烃的质量占所述油相组合物质量的0-98％，硅油的质量占所述油相组合物质量的0-98％；
所述表面活性剂的质量占油相组合物质量的2-5％；所述所述纳米粒子占所述油相组合物总质量的0.1-0.5％。
2.根据权利要求1所述的用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷、PEG30二聚羟基硬脂酸酯的的一种或多种，所述聚甘油-3二硅氧烷聚二甲基硅氧烷的质量占所述油相组合物总质量的2-5％，所述PEG 30二聚羟基硬脂酸酯的质量占所述油相组合物总质量的0.01％-5％。
3.根据权利要求2所述的用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，其特征在于，所述饱和烷烃选自正十四烷、正十五烷、正十六烷中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，其特征在于，所述硅油选自八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，其特征在于，所述硅油的体积占所述基础油质量的10-90％。
6.根据权利要求1所述的用于制备微滴式数字PCR液滴的油相组合物，其特征在于，所述纳米粒子为表面经硅烷化处理的二氧化硅纳米颗粒、PMMA纳米颗粒或其他油溶性纳米颗粒；所述纳米粒子的直径为50-200纳米。
7.一种微滴式数字PCR液滴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：配制油相，将上述权利要求1-6所述的油相组合物的各组分按照配方均匀混合，获得的液体作为油相备用；
步骤S2：配置水相，该水相包括PCR缓冲溶液、引物、双链DNA荧光染料或Taqman荧光探针、内参基因ACTB、1％BSA、去离子水，将上述液体以一定的比例混合均匀，获得的溶液作为水相溶液备用；
步骤S3：在数字PCR芯片的水相存储池中加入配制的水相，在数字PCR芯片的油相存储池中加入配制的油相，然后将已加入水相和油相的数字PCR芯片放入数字PCR仪中生成液滴，所得液滴存储在所述数字PCR芯片的液滴存储池。
8.根据权利要求7所述的微滴式数字PCR液滴的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的PCR缓冲溶液包括Taq酶、dNTP、镁离子。
9.根据权利要求7所述的微滴式数字PCR液滴的制备方法，其特征在于，所述引物包括上游引物F、下游引物R，其中，所述上游引物F的序列为：GGAGAACCAACCAGATGTG，所述下游引物R的序列为：CCTTCGTGCTTGTGATGT。
10.根据权利要求7所述的微滴式数字PCR液滴的制备方法，其特征在于，所述Taqman荧光探针的序列为CY5-ctcaccaggcacccagt-MGB，其中，CY5为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。
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