CN110747258A - 一种用于制备微滴式数字pcr中液滴的油相组合物及其应用 - Google Patents
一种用于制备微滴式数字pcr中液滴的油相组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物及其应用。本发明所述油相组合物包括油相1、油相2、油相3以及表面活性剂1；其中，油相1为矿物油或烷烃，油相2为烷烃或酯油，油相3为烷烃，所述油相1‑3有两个以上为烷烃时互不相同；表面活性剂1为硅氧烷类油包水活性剂。本发明联合使用特定的油相和表面活性剂，组成一种性能优异的油相组合物，使其应用在液滴式数字PCR中可使形成的液滴更加均匀，彼此间的偏差较小，同时可充分的扩增目标序列，更加接近目标序列的初始拷贝数，使PCR结果更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物及其应用。
背景技术
数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR不同，数字PCR通过直接计数的方法，可以实现起始DNA模板的绝对定量。
微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是数字PCR三种主要样品分散模式中一种，其将样品进行微滴化处理，形成几万个纳升级液滴，每个液滴或不含待检核酸靶分子，或含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对微滴进行检测，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。目前比较常用的油相为氟化油，如FC-40、FC-7500，配用的表面活性剂有：PFPE-PEG-PFPE、1,1,2,2-四氢全氟癸醇等。一方面氟化油易挥发，易溶解气体在加热时会产生大量气泡，另一方面氟化油相关的一些表面活性剂价格比较昂贵，增加了制备液滴成本。
现有一种微流控芯片可以将生成的液滴单层均匀平铺在一定的位置上，进而对每个液滴进行检测和分析。微滴式数字芯片构体是具有产生微滴颗粒复杂结构的，是用来生成和储存微液滴颗粒的载体，在微滴式数字芯片构体内首先要注入油相成分溶液，而油相成分溶液是用来生成微滴颗粒必备条件，(这就是水相试剂在油相溶液中，由于表面张力的作用而形成的一个独立的油包水颗粒)也是为微液滴颗粒生存提供环境，同时也为微液滴颗粒进行扩增时需要提供温度的热传导介质。
专利CN106755345A公开了一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物，其采用矿物油、正十四烷、EM90和TritonX-100为组合物组分，记载了该组合物可使生成的液滴大小均一，热稳定性好，不易挥发，不易产生气泡，不抑制PCR扩增，然而该油相组合物在数字PCR时不能使扩增体系(水相)扩增充分，同时所形成的液滴大小也不够均匀，液滴间的大小偏差较大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物，使得所述油相组合物形成的液滴大小均匀，液滴间的大小偏差较小；
本发明的另外一个发明目的在于提供一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物，使得所述油相组合物在进行数字PCR时能够更加充分的扩增目标序列。
一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物，包括油相1、油相2、油相3以及表面活性剂1；
其中，油相1为矿物油或烷烃，油相2为烷烃或酯油，油相3为烷烃，所述油相1-3有两个以上为烷烃时互不相同；表面活性剂1为硬脂酸酯类油包水活性剂。
根据现有专利技术存在扩增不充分以及液滴不均匀的问题，本发明通过调整油相组合物中的成分和配比，使得油相组合物形成的液滴更加均匀，彼此间偏差更小，同时可以充分对目标序列进行扩增。
作为优选，所述矿物油为轻质矿物油(白油)。
作为优选，所述烷烃为C10-C16烷烃中的一种或两种以上；进一步地，所述C10-C16烷烃为C10-C16正烷烃；在本发明具体实施方式中，所述C10-C16正烷烃为正十六烷。
作为优选，所述酯油为棕榈酸异丙酯、棕榈酸异辛酯、椰油酸异戊酯、椰油酸癸酯、肉豆蔻酸异丙酯中的一种或两种以上。
作为优选，所述硬脂酸酯类油包水活性剂为isolan PDI、isolan GI34、isolanGPS、ABIL WE09、PGPH或P135。
作为优选，所述油相1、油相2和油相3分别占总油相质量的1/4-3/5、1/5-1/2和1/5-1/2；更优选地，所述油相1占总油相质量的1/4、2/5、1/2或3/5；所述油相2占总油相质量的1/5、1/4、2/5或1/2；所述油相3占总油相质量的1/5、1/4、2/5或1/2；所述油相1、油相2和油相3所占质量比例相加为1(或100％)；
作为优选，所述表面活性剂1的质量为总油相质量的1-5％；在本发明具体实施方式中，所述表面活性剂1的质量为总油相质量的1％、2％、3％、4％或5％。
作为优选，本发明所述油相组合物还包括表面活性剂2，所述表面活性剂2为硅氧烷类油包水活性剂。
作为优选，所述表面活性剂2的质量为总油相质量的2-7％，所述表面活性剂2的质量为总油相质量的2％、3％、4％、5％、6％或7％，
作为优选，所述硅氧烷类油包水活性剂为EM90、EM97S、EM120、EM180或wax9801；
作为优选，表面活性剂1和2的组合形式可采用如下之一：
EM90+PGPH、EM90+P135、EM97S+P135、EM97S+PGPH、EM180+PGPH EM120+isolanPDI、EM180+isolan GI34、EM90+ABIL WE09、EM97S+isolan GPS、EM120+P135、wax9801+isolan PDI、wax9801+isolan GI34、wax9801+isolan GPS、EM120+ABIL WE09和EM180+P135；
本发明具体实施方式中表面活性剂1优选采用Abil EM97s(双一聚乙二醇/聚丙二醇-14/14聚硅氧烷)、Abil EM90(鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1聚二甲基硅氧烷)或AbilEM180(鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1聚二甲基硅氧烷，与Abil EM90分子量不同)；表面活性剂2优选采用DehymulsPGPH(聚甘油-2二聚羟基硬脂酸酯)或DehymulsP135(聚氯乙烯(30)-二聚羟基硬脂酸酯)；
在本发明具体实施方式中，本发明所述油相组合物可具体选择如下之一：
(1)矿物油+正十六烷+正十四烷+EM90+PGPH；
(2)正十六烷+棕榈酸异丙酯+正十四烷+EM90+PGPH；
(3)矿物油+棕榈酸异丙酯+正十四烷+EM90+PGPH；
(4)矿物油+正十六烷+正十四烷+EM97S+P135；
(5)正十六烷+棕榈酸异丙酯+正十四烷+EM97S+P135；
(6)矿物油+棕榈酸异丙酯+正十四烷+EM97S+P135；
(7)矿物油+正十六烷+正十四烷+EM90+P135；
(8)正十六烷+棕榈酸异丙酯+正十四烷+EM180+P135；
(9)矿物油+正十六烷+正十四烷+EM180+P135；
(10)矿物油+正十六烷+正十四烷+EM180+PGPH；
(11)矿物油+棕榈酸异丙酯+正十四烷+EM180+P135；
(12)矿物油+正十六烷+正十四烷+EM97S+PGPH；
采用本发明油相组合物形成的液滴平均大小为96-97.5μm，而现有专利106755345A中2/3矿物油+1/3正十四烷+EM90(3％)+TritonX-100(3％)形成的液滴平均大小为85μm，两者相比较，本发明形成的液滴更加均匀，液滴间的偏差更小；
同时，通过液滴式PCR反应，在相同理论拷贝数400copies/μl的模板前提下，分别使用本发明油相组合物和现有专利CN106755345A中2/3矿物油+1/3正十四烷+EM90(3％)+TritonX-100(3％)油相组合物进行扩增，结果显示，经过PCR扩增后，本发明实验组FAM通道的拷贝数平均值在384-390copies/μl，更接近所加入模板的理论拷贝数400copies/μl，拷贝数标准偏差小于5；而现有专利实验组的拷贝数平均值低于370copies/μl，拷贝数标准偏差在8左右，这表明本发明所述油相组合物在进行数字PCR时能够更加充分的扩增目标序列，相比现有专利更加优越。
基于上述优异的试验结果，本发明提出了所述油相组合物在制备微滴式数字PCR液滴中的应用，或在微滴式数字PCR扩增序列中的应用，或在制备微滴式数字PCR扩增试剂中的应用。
由以上技术方案可知，本发明联合使用特定的油相和表面活性剂，组成一种性能优异的油相组合物，使其应用在液滴式数字PCR中可使形成的液滴更加均匀，彼此间的偏差较小，同时可充分的扩增目标序列，更加接近目标序列的初始拷贝数，使PCR结果更加准确。
附图说明
图1所示为采用矿物油、正十六烷和棕榈酸异丙酯生成的液滴；
图2所示为采用矿物油、正十六烷和棕榈酸异丙酯生成的液滴；
图3所示为采用正十四烷、二甲基硅油、角鲨烷和L-14E生成的液滴；
图4所示为向单一矿物油、正十六烷和棕榈酸异丙酯中等比例掺入角鲨烷或L-14E形成的液滴。
具体实施方式
本发明公开了一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述油相组合物和应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述油相组合物应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施例中，涉及到对比实验，各实验组除了应有的区别外，其余实验环境和原材料等均保持一致。
以下就本发明所提供的一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物及其应用做进一步说明。
实施例1：本发明所述油相组合物
(1)2/5轻质矿物油+1/5正十六烷+2/5正十四烷+EM90(7％)+PGPH(1％)；
(2)1/5轻质矿物油+2/5棕榈酸异丙酯+2/5正十四烷+EM90(5％)+PGPH(2％)；
(3)1/2正十六烷+1/4棕榈酸异丙酯+1/4正十四烷+EM90(2％)+PGPH(3％)；
(4)1/4轻质矿物油+1/2正十六烷+1/4正十四烷+EM97S(5％)+P135(2％)；
(5)1/4轻质矿物油+1/4棕榈酸异丙酯+1/2正十四烷+EM97S(2％)+P135(2％)；
(6)3/5正十六烷+1/5棕榈酸异丙酯+1/5正十四烷+EM97S(2％)+P135(3％)；
(7)1/4轻质矿物油+1/4正十六烷+1/2正十四烷+EM180(7％)+P135(1％)；
(8)3/5轻质矿物油+1/5正十六烷+1/5正十四烷+EM180(2％)+P135(3％)；
(9)1/4轻质矿物油+1/4棕榈酸异丙酯+1/2正十四烷+EM180(2％)+P135(3％)；
(10)3/5轻质矿物油+1/5棕榈酸异丙酯+1/5正十四烷+EM180(2％)+P135(3％)；
(11)1/2正十六烷+1/4棕榈酸异丙酯+1/4正十四烷+EM180(7％)+P135(3％)；
(12)3/5正十六烷+1/5棕榈酸异丙酯+1/5正十四烷+EM180(2％)+P135(3％)；
各组合物中，各油相前的比例值是指占总油相的质量比例，而各表面活性剂后的质量百分比为各自质量与总油相质量的百分比值。
实施例2：对比试验
1、对比油相
实施例1中的(1)-(12)油相组合物，简写为实验组1-12；
现有专利CN106755345A中2/3轻质矿物油+1/3正十四烷+EM90(3％)+TritonX-100(3％)油相组合物，简写为对照组；
各油相组合物混合均匀后抽真空除气后备用；
配制水相即PCR反应体系(表1)，模板来自非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株H1975，具有T790M突变。所用引物序列为：F：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’；R：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGAC-3’。探针序列为：5’-FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ-3’，其中FAM为荧光报告基团，NFQ为荧光淬灭基团。所加入模板的理论拷贝数为400copies/ul。
表1
| 2×PCR反应缓冲液(包括Taq酶、dNTP、镁离子) | 7.5uL |
| BSA(1％) | 1.5uL |
| 上游引物F(10μM) | 0.3uL |
| 下游引物R(10μM) | 0.3uL |
| 探针(5μM) | 0.3uL |
| 模板 | 1.0uL |
| 去离子水 | 4.1uL |
| 总体积 | 15uL |
将各油相平铺在微滴发生装置内(配合领航基因科技(杭州)有限公司的玻璃材质的芯片)，采用阶梯乳化的方式用注射泵将水相加入到油相中同时形成液滴。生成好的微滴按如下程序进行PCR扩增：96℃预变性10min；98℃变性30s，62℃退火延伸1min，共39个循环；62℃延伸1min，25℃保温。扩增结束后，显微镜观察液滴形态，并通过显微镜配置软件对液滴直径进行测量，并通过领航基因科技(杭州)有限公司的阅读仪检测荧光信号，使用领航基因科技(杭州)有限公司配套软件对液滴中阳性点的拷贝数进行定量分析。
2、液滴大小对比
表2
由表2可以看出，本发明油相组合物生成的液滴大小较为稳定，处于96-97.5um，偏差明显小于对照组液滴。
3、数字PCR扩增对比
各实验组和对照组油相生成液滴经过PCR扩增后，均能比较好保持原有的液滴状态。利用同一PCR体系，重复多次实验，并根据领航基因科技(杭州)有限公司软件分析计算出FAM通道拷贝数，见表3。对比可以发现，实验组油相液滴经过PCR扩增后，FAM通道的拷贝数平均值在384-390copies/ul，相比对照组FAM通道的拷贝数平均值369.6copies/ul，更接近所加入模板的理论拷贝数400copies/ul，另外FAM通道的拷贝数标准偏差均小于5，小于对照组油相所生成的液滴经过PCR扩增后计算出的拷贝数标准偏差7.92，说明本发明油相组合物生成的液滴经过PCR扩增后，所包裹水相更加能充分扩增，整体表现相比对照组油相更加优越。
表3
实施例3：不同对照配方油相组合物的液滴形成试验
1、单油相+固定表面活性剂配比
轻质矿物油+EM90(7％)+PGPH(5％)；
正十四烷+EM90(7％)+PGPH(5％)；
正十六烷+EM90(7％)+PGPH(5％)；
二甲基硅油+EM90(7％)+PGPH(5％)；
棕榈酸异丙酯+EM90(7％)+PGPH(5％)；
角鲨烷+EM90(7％)+PGPH(5％)；
L-14E+EM90(7％)+PGPH(5％)；
上述油相组合物中，采用轻质矿物油、正十六烷和棕榈酸异丙酯生成的液滴非常拥挤，挤成了不规则形而不成圆形，见图1和图2；采用正十四烷、二甲基硅油、角鲨烷和L-14E生成的液滴均容易破裂，见图3；
2、双油相(等比例)+固定表面活性剂配比
轻质矿物油+二甲基硅油+EM90(7％)+PGPH(5％)；
轻质矿物油+角鲨烷+EM90(7％)+PGPH(5％)；
轻质矿物油+L-14E+EM90(7％)+PGPH(5％)；
正十六烷+二甲基硅油+EM90(7％)+PGPH(5％)；
正十六烷+角鲨烷+EM90(7％)+PGPH(5％)；
正十六烷+L-14E+EM90(7％)+PGPH(5％)；
棕榈酸异丙酯+二甲基硅油+EM90(7％)+PGPH(5％)；
棕榈酸异丙酯+角鲨烷+EM90(7％)+PGPH(5％)；
棕榈酸异丙酯+L-14E+EM90(7％)+PGPH(5％)；
上述油相组合物中，轻质矿物油+二甲基硅油、正十六烷+二甲基硅油以及棕榈酸异丙酯+二甲基硅油组均不能互溶，无法形成液滴；等比例掺入的角鲨烷或L-14E虽然能改善单一矿物油、正十六烷和棕榈酸异丙酯出现的液滴拥挤的程度，但液滴会出现不稳定，易发生融合的现象，见图4。
3、双油相(等比例)+不同表面活性剂配比
轻质矿物油+角鲨烷+EM90(1-7％)+PGPH(1-5％)；
轻质矿物油+L-14E+EM90(1-7％)+PGPH(1-5％)；
正十六烷+角鲨烷+EM90(1-7％)+PGPH(1-5％)；
正十六烷+L-14E+EM90(1-7％)+PGPH(1-5％)；
棕榈酸异丙酯+角鲨烷+EM90(1-7％)+PGPH(1-5％)；
棕榈酸异丙酯+L-14E+EM90(1-7％)+PGPH(1-5％)；
调整EM90和PGPH的浓度，其中EM90浓度为1-7％，PGPH浓度为1-5％，在该范围内无论如何调整两种活性剂的比例，等比例掺入的角鲨烷或L-14E虽然能改善单一轻质矿物油、正十六烷和棕榈酸异丙酯出现的液滴拥挤的程度，但液滴会出现不稳定，易发生融合的现象，与图4现象相同；
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (15)
1.一种用于制备微滴式数字PCR中液滴的油相组合物，其特征在于，包括油相1、油相2、油相3以及表面活性剂1；
其中，油相1为矿物油或烷烃，油相2为烷烃或酯油，油相3为烷烃，所述油相1-3有两个以上为烷烃时互不相同；表面活性剂1为硬脂酸酯类油包水活性剂。
2.根据权利要求1所述油相组合物，其特征在于，所述矿物油为轻质矿物油。
3.根据权利要求1所述油相组合物，其特征在于，所述烷烃为C10-C16烷烃中的一种或两种以上。
4.根据权利要求3所述油相组合物，其特征在于，所述C10-C16烷烃为C10-C16正烷烃。
5.根据权利要求4所述油相组合物，其特征在于，所述C10-C16正烷烃为正十六烷。
6.根据权利要求1所述油相组合物，其特征在于，所述酯油为棕榈酸异丙酯、棕榈酸异辛酯、椰油酸异戊酯、椰油酸癸酯、肉豆蔻酸异丙酯中的一种或两种以上。
7.根据权利要求1所述油相组合物，其特征在于，所述硬脂酸酯类油包水活性剂为isolan PDI、isolan GI34、isolan GPS、ABIL WE09、PGPH或P135。
8.根据权利要求1所述油相组合物，其特征在于，所述油相1、油相2和油相3分别占总油相质量的1/4-3/5、1/5-1/2和1/5-1/2。
9.根据权利要求1所述油相组合物，其特征在于，所述表面活性剂1的质量为总油相质量的1-5％。
10.根据权利要求9所述油相组合物，其特征在于，所述表面活性剂1的质量为总油相质量的1％、2％、3％、4％或5％。
11.根据权利要求1-10任意一项所述油相组合物，其特征在于，还包括表面活性剂2，所述表面活性剂2为硅氧烷类油包水活性剂。
12.根据权利要求11所述油相组合物，其特征在于，所述硅氧烷类油包水活性剂为EM90、EM97S、EM120、EM180或wax9801。
13.根据权利要求11所述油相组合物，其特征在于，所述表面活性剂2的质量为总油相质量的2-7％。
14.根据权利要求13所述油相组合物，其特征在于，所述表面活性剂2的质量为总油相质量的2％、3％、4％、5％、6％或7％。
15.权利要求1-14任意一项所述油相组合物在制备微滴式数字PCR液滴中的应用，或在微滴式数字PCR扩增序列中的应用，或在制备微滴式数字PCR扩增试剂中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20200204 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |