CN113136421B - 一种基于微流控系统的w/o/w型pcr扩增后产物的微乳滴及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴和该微乳滴的制备方法，该微乳滴包括扩增后W/O型微乳滴、油相A和外水相，其中扩增后W/O型微乳滴包括内水相和油相B，通过微流控系统制备，扩增后W/O型微乳滴、油相A和外水相的体积比为1:3:1000；所述内水相和油相B的体积比为40:3。本发明提供了一种W/O/W型微乳滴的制备方法，得到的微乳滴可以有效地建立新型的微乳滴分选平台，可以通过一次分析单个细胞的转录组，有效解决组织样本无法破解的细胞异质性难题。本发明通过严格筛选组方配比以及制备参数，其平均粒径为70μm，均为粒度分布均匀的球形粒子，并且通过稳定性实验表明本发明制得的微乳滴在室温储存即可，且室温下短时间内粒径大小变化小。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于微流控系统的W/O/W型PCR 扩增后产物的微乳滴及其制备方法。
背景技术
随着单细胞基因组测序和单分子测序技术的建立与发展，对细胞基因组特征的分析进入了单细胞和单分子水平。单细胞的基因组分辨率不但使研究人员能够在单细胞尺度上分析肿瘤细胞的异质性，也使得传统上难以检测的稀有细胞的基因组研究成为可能。由于细胞的尺寸一般在微米级，因此，微流控芯片微液滴技术在细胞样品处理中得到广泛应用。细胞在微液滴中，可以避免与其他细胞相互干扰。
微流控芯片指的是将化学和生物等领域中所涉及的样本制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块很小的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规化学或生物实验室的各种功能。微流控芯片能快速、准确地将样品分成若干个独立的单元，并进行多步平行反应，成本低、体积小、高通量，是目前理想的数字PCR平台。值得一提的是，现有技术中的微流控芯片大多采用的是W/O型液滴的形式，将细胞、外泌体、DNA分子或RNA 分子等生物样品置于内水相中，最后利用PCR技术对液滴中的生物样品进行扩增，并实时记录液滴的荧光情况，以判断该检测的生物样片的含量及分布情况；由于W/O型液滴的外层油相无法通过流式细胞分选仪，对生物样品的进一步分选和测序则需要在W/O型液滴表面制备一层外水相，生成的W/O/W型液滴可应用于后续的分选和测序研究。众所周知W/O型液滴的稳定性相对较差，因此，多数扩增后的生物样品不能够完好的保存下来以备用其他实验研究，这对于科学研究无疑是一种浪费现象。
发明内容
为解决背景技术中存在的问题，本发明的第一个目的在于提供一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴。
本发明的技术方案如下：
一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴，所述微乳滴通过微流控系统制备，包括扩增后W/O型微乳滴、油相A和外水相，上述组分的体积比为1:3:1000～7:10:4600；所述扩增后W/O型微乳滴包括内水相和油相B，所述内水相和油相B的体积比为40:1～83:6；所述内水相包括PCR反应体系缓冲溶液和生物样品，其中所述生物样品的占比为0.03％～0.14％；所述外水相包括缓冲溶液和亲水性表面活性剂，其中所述亲水性表面活性剂的占比为0.1％～0.8％；所述油相A和油相B组分相同，包括矿物油和亲油性表面活性剂，其中所述亲油性表面活性剂占比为0.5％～3％。
所述扩增后W/O型微乳滴、油相A和外水相的体积比为1:3:1000；所述内水相和油相B的体积比为40:3。
所述矿物油为Droplet Generation Oil for Probes，所述亲油性表面活性剂为Span-80或/和十聚甘油十油酸酯，在油相A和油相B中的占比均为1.5％。
所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液，所述亲水性表面活性剂为十二烷基硫酸钠或/和Tween-80，在外水相中的占比为0.1％。
所述生物样品可以为细胞、外泌体、DNA分子或RNA分子。
本发明的第二个目的在于提供一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：W/O型微乳滴的制备
利用微流控系统，将内水相中的生物样品通过1号泵泵入，将PCR反应体系缓冲溶液通过2号泵泵入，将油相B通过3号泵泵入，制备成W/O型微乳滴；其中内水相中的生物样品和PCR反应体系缓冲溶液的流速为30-35μL/min，油相 B的流速为350-400μL/min；
步骤S2：对W/O型微乳滴中的生物样品进行PCR扩增，得到扩增后W/O 型微乳滴；
步骤S3：W/O/W型微乳滴的制备
利用微流控系统，将扩增后W/O型微乳滴通过1号泵泵入，将油相A通过 2号泵泵入，将外水相通过3号泵泵入，制备成W/O/W型微乳滴；其中扩增后 W/O型乳滴的泵入压力为450mbar，油相A的流速为20μL/min，外水相的泵入压力为950mbar。
所述步骤S1中制备的W/O型微乳滴的平均粒径为50μm。
所述步骤S3中制备的W/O/W型微乳滴的平均粒径为70μm。
本发明的有益效果如下：
1、本发明提供了一种W/O/W型微乳滴的制备方法，得到的微乳滴可以有效地建立新型的微乳滴分选平台，可以通过一次分析单个细胞的转录组，可有效解决组织样本无法破解的细胞异质性难题。
2、本发明通过严格筛选组方配比以及制备参数，获得最优组方制得W/O/W 型微乳滴，其平均粒径为70μm，均为粒度分布均匀的球形粒子，并且通过稳定性实验表明本发明制得的微乳滴在室温储存即可，且室温下短时间内粒径大小变化小。
3、由于W/O型液滴的外层油相无法通过流式细胞分选仪，对生物样品的进一步分选和测序则需要在W/O型液滴表面制备一层外水相，生成的W/O/W 型液滴可应用于后续的分选和测序研究，以备用其他实验研究，这对于科学研究无疑是一种进步的表现。
4、通过对扩增后的O/W型微乳滴在荧光显微镜下观察发现，存在荧光现象，表明本发明中W/O型微乳滴中的生物样品扩增成功，也就是说W/O型微乳滴对生物样品具备装载能力。
附图说明
通过参考以下结合附图的说明，并且随着对本发明的更全面理解，本发明的其它目的及结果将更加明白及易于理解。在附图中：
图1为本发明中W/O型微乳滴的制备流程图；
图2为本发明中W/O/W型微乳滴的制备流程图；
图3为本发明中W/O/W型微乳滴在光学显微镜4倍率下的形态、大小及分布情况图；
图4为本发明中W/O/W型微乳滴在光学显微镜10倍率下的形态、大小及分布情况图；
图5为本发明中W/O型微乳滴包装不同浓度的生物样品在荧光显微镜下的图；
图6为本发明中W/O/W型微乳滴在室温条件下放置3天后光学显微镜4倍率下的形态、大小及分布情况图；
图7为本发明中W/O/W型微乳滴在室温条件下放置7天后光学显微镜4倍率下的形态、大小及分布情况图。
具体实施方式
为使本领域技术人员能够更好的理解本发明的技术方案及其优点，下面结合附图对本申请进行详细描述，但并不用于限定本发明的保护范围。
实施例1
一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴，包括扩增后W/O 型微乳滴、油相A和外水相，上述组分的体积比为1:3:1000；所述扩增后W/O 型微乳滴，包括内水相和油相B，所述内水相和油相B的体积比为40:3；所述内水相包括PCR反应体系缓冲溶液和0.1％的A3G-VR1012(实验室现存)；所述外水相包括PBS缓冲溶液和0.1％的Tween-80；所述油相A和油相B组分相同，包括矿物油Droplet Generation Oil for Probes(Bio-rad公司，批号为186-3005) 和1.5％的Span-80。
实施例2
一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：W/O型微乳滴的制备
利用微流控系统(Dolomite公司，型号为Mitos)，将内水相中的A3G-VR1012 通过1号泵泵入，将PCR反应体系缓冲溶液通过2号泵泵入，将油相B通过3 号泵泵入，制备成W/O型微乳滴；其中内水相中的A3G-VR1012和PCR反应体系缓冲溶液的流速为30-35μL/min，油相B的流速为350-400μL/min；
步骤S2：对W/O型微乳滴中的生物样品进行PCR扩增，得到扩增后W/O 型微乳滴；
步骤S3：W/O/W型微乳滴的制备
利用微流控系统，将扩增后W/O型微乳滴通过1号泵泵入，将油相A通过 2号泵泵入，将外水相通过3号泵泵入，制备成W/O/W型微乳滴；其中扩增后 W/O型微乳滴的泵入压力为450mbar，油相A的流速为20μL/min，外水相的泵入压力为950mbar。
实施例3
利用W/O型微乳滴对其中的A3G-VR1012进行探针法ddPCR
利用ddPCR Supermix for Probes(no dUTP)(Bio-Rad公司，批号为186-3024)PCR体系，以A3G-VR1012为生物样品设计引物，如表1所示；表2为ddPCR Supermix forProbes(no dUTP)PCR体系；表3为ddPCR扩增条件。
表1.以A3G-VR1012为生物样品设计的引物和探针序列
表2.ddPCR Supermix for Probes(no dUTP)PCR体系
表3.ddPCR扩增条件
根据表2的ddPCR Supermix for Probes(no dUTP)PCR体系，在Dolomite微流控系统制备包装有不同分子数的A3G-VR1012 PCR体系的W/O型微乳滴。其中1号泵泵入不同分子数的A3G-VR1012，2号泵泵入PCR体系缓冲溶液，3 号泵泵入Droplet Generation Oil forProbes，体积比为40:3。A3G-VR1012样品分别稀释成0copy/μL、10,000copies/μL、100,000copies/μL，其中样品浓度为0 copy/μL的组为阴性对照组。包装的流速条件分别为内水相流速30μL/min，油相B为400μL/min。
取30μL包装好的W/O型的微乳滴与10μL Droplet Generation Oil for Probes加入PCR管，按照表3的PCR扩增条件进行ddPCR，ddPCR后的微乳滴的荧光结果用荧光显微镜来观察，参见图5。
根据探针法ddPCR原理，当样品的分子数为0时探针不会发出荧光，所以阴性对照没有绿色荧光。阳性微乳滴的荧光强度随着投入样品分子数的增多而提高，而且荧光阳性的微乳滴与阴性对照相比强度区别明显。
实施例4
在光学显微镜下，对W/O/W型微乳滴进行形态、大小及分布情况观察，见图3和图4所示：该微乳滴外表光滑，为球形，平均粒径约为70μm，数量较多，无聚集挤压现象。
实施例5
在光学显微镜下，对在室温条件下放置了3天和7天的W/O/W型微乳滴观察，见图6和图7所示：该微乳滴的形态及粒径大小保持稳定，数量略微减少。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴，其特征在于：包括扩增后W/O型微乳滴、油相A和外水相，上述组分的体积比为1:3:1000；所述扩增后W/O型微乳滴包括内水相和油相B，所述内水相和油相B的体积比为40:1~83:6；所述内水相包括PCR反应体系缓冲溶液和生物样品，其中所述生物样品的占比为0.03%~0.14%；所述外水相包括缓冲溶液和亲水性表面活性剂，其中所述亲水性表面活性剂的占比为0.1%~0.8%；所述油相A和油相B组分相同，包括矿物油和亲油性表面活性剂，其中所述亲油性表面活性剂占比为0.5%~3%；
其中，所述基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴的平均粒径为70μm；所述矿物油为Droplet Generation Oilfor Probes，所述亲油性表面活性剂为Span-80，所述亲水性表面活性剂为Tween-80。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴，其特征在于：所述内水相和油相B的体积比为40:3。
3.根据权利要求1所述的一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴，其特征在于：所述亲油性表面活性剂在油相A和油相B中的占比均为1.5%。
4.根据权利要求1所述的一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴，其特征在于：所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液，所述亲水性表面活性剂在外水相中的占比为0.1%。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴，其特征在于：所述生物样品可以为细胞、外泌体、DNA分子或RNA分子。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种基于微流控系统的W/O/W型PCR扩增后产物的微乳滴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：W/O型微乳滴的制备
利用微流控系统，将内水相中的生物样品通过1号泵泵入，将PCR反应体系缓冲溶液通过2号泵泵入，将油相B通过3号泵泵入，制备成W/0型微乳滴；其中内水相中的生物样品和PCR反应体系缓冲溶液的流速为30-35μL/min，油相B的流速为350-400μL/min；步骤S2：对W/O型微乳滴中的生物样品进行PCR扩增，得到扩增后W/0型微乳滴；步骤S3：W/O/W型微乳滴的制备
利用微流控系统，将扩增后W/O型微乳滴通过1号泵泵入，将油相A通过2号泵泵入，将外水相通过3号泵泵入，制备成W/O/W型微乳滴；其中扩增后W/0型乳滴的泵入压力为450mbar，油相A的流速为20μL/min，外水相的泵入压力为950mbar。
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| CN110747258A (zh) * | 2018-07-23 | 2020-02-04 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 一种用于制备微滴式数字pcr中液滴的油相组合物及其应用 |
| CN111372574A (zh) * | 2017-09-29 | 2020-07-03 | 加利福尼亚大学董事会 | 单分散乳液的制备方法 |
-
2021
- 2021-05-24 CN CN202110563289.8A patent/CN113136421B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107119145A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-09-01 | 深圳瑞科生物科技有限公司 | 一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113136421A (zh) | 2021-07-20 |
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Denomination of invention: Microemulsion of W/O/W PCR amplification products based on microfluidic system and its preparation method Effective date of registration: 20221017 Granted publication date: 20220603 Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Changchun Branch Pledgor: CHANGCHUN WEISHI DETECTION TECHNOLOGY SERVICE Co.,Ltd. Registration number: Y2022220000088 |
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Denomination of invention: A Microemulsion Droplet of W/O/W PCR Amplified Product Based on Microfluidic System and Its Preparation Method Effective date of registration: 20231101 Granted publication date: 20220603 Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Changchun Branch Pledgor: CHANGCHUN WEISHI DETECTION TECHNOLOGY SERVICE Co.,Ltd. Registration number: Y2023220000114 |