CN111372574A - 单分散乳液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本文所述的方法称为颗粒模板乳化(PTE)，提供一种改进的单分散乳液制备方法，其中单分散乳液可对关注的目标颗粒进行包封且无需使用微流体装置。将单分散颗粒作为形成液滴的模板，可有效地获得单分散液滴且不会破坏液滴的完整性，这些液滴可包括单分散单乳液滴、多乳液滴或超大型单重脂质体(GUV)等。

Description

单分散乳液的制备方法
交叉引用
本专利申请案要求于2017年9月29日提交的编号为62/565,976的美国临时专利申请案的优先权，上述专利申请全文以引用方式并入本文中。
政府支持
本发明专利获得了政府的支持，其中，美国国立卫生研究院的资助项目为AR068129、R01EB019453和R21HG007233；美国国防高级研究计划局的资助项目为HR0011-12-C-0065；美国国家科学基金会的资助项目为DBI1253293。政府拥有本发明的某些权利。
介绍
液滴微流体技术将反应体积降低至皮升并将微粒处理频率增加至千赫兹，从而提高了实验室自动化程度。微流体装置在载液中生成悬浮液滴并对其进行处理和分选。每个液滴中具有一个独立的可作为反应器的“试管”。此方法采用高通量技术并且试剂消耗极少，为开启高通量科学的新时代提供了前所未有的可能性。此外，单分散液滴隔室化是生物学领域的一种通用方法。然而，对于大多数很少使用先进微流体系统的研究人员来说，微流体技术对液滴包封的基本要求是一个巨大的阻碍。无法将液滴微流体技术的研究成果快速转化给研究人员，阻碍了新型有效液滴技术的实施。本发明解决了上述问题并提供了相应的优势。
摘要
本文所述的方法称为颗粒模板乳化(PTE)，提供一种改进的单分散乳液制备方法，其中单分散乳液可对关注的目标颗粒进行包封且无需使用微流体装置。本发明部分基于这一惊人的发现：将单分散颗粒作为形成液滴的模板，可有效地获得单分散液滴且不会破坏液滴的完整性，这些液滴可包括单分散单乳液滴、多乳液滴或超大型单重脂质体(GUV)(本文中也称脂质体)等。
在示例性实施例中，本发明所揭示的单分散乳液的制备方法包括：将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体中包括多个目标颗粒；将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包括所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。按照本文所述制备单分散乳液时，可不采用微流控技术。
在一些实施例中，所述目标颗粒可能包括细胞、病毒和/或核酸的异质性群体。在一些实施例中，可在包封之前稀释目标颗粒，其目的可包括在单分散液滴中对一定数量的细胞、病毒和/或核酸进行包封。核酸合成试剂，例如核酸等温扩增试剂、非特异性核酸扩增试剂(例如MDA试剂)和/或PCR试剂，可(例如)与一个或多个目标颗粒一同包封在单分散液滴中，或在前者被包封后，使用本文所述的一种或多种方法将该试剂加入到单分散液滴中，以便进行本文所述的下游检测、分选和/或分析。
本文所述多乳液滴的形成方式可能包括：将包含多个目标颗粒(例如，细胞、病毒和/或核酸)的第一液体以及核酸合成试剂与多个模板单分散颗粒混合以形成第一混合物；将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包含所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴；将所述第二混合物与第三液体混合，其中所述第三液体与所述第二液体互不相溶；通过剪切所述第三混合物，将含或不含所述模板单分散颗粒的一个或多个所述单分散液滴包封在所述第三液体中的一个或多个液滴中，以形成一个或多个双乳液滴。在一些实施例中，所述第三液体与所述第一液体和所述第二液体互不相溶。
可通过诱导多乳液滴(例如双乳液滴)的反浸润来使其形成GUV，其中所述第二液体被除去，表面活性剂形成界面膜，膜外侧吸附了所述第二液体的小液滴。
本文所述方法中使用的模板单分散颗粒的制备方法可包括：使第一液体(例如一种液体凝胶前驱物)流入微流体装置的通道内；使所述第一液体与第二液体接触，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶，此过程可使用单乳液滴生成装置。在一些实施例中，可使用包括连续分裂和分配板的平行液滴制备技术更快速地生成模板单分散颗粒。然后，通过胶凝作用使单分散单乳液滴固化，胶凝作用的触发方式可包括使液滴内的凝胶基质聚合或使基质发生交联。在一些实施例中，可使用表面活性剂防止接触的模板单分散颗粒相互聚结。模板单分散颗粒制备方法的一个或多个步骤可在微流控环境下进行。
在一些实施例中，将包含目标颗粒(例如细胞)的样品包封在按本文所述方法制备的单分散单乳液滴中或按本文所述方法制备的多乳液滴或GUV中，并将其置于核酸等温扩增条件和/或本文所述的核酸扩增条件。在一些实施例中，对被包封的细胞采用一种或多种细胞裂解技术，例如蛋白酶K消化裂解法或热裂解法。核酸等温扩增实验或对目标细胞具有特异性的核酸扩增实验可使按本文所述方法制备的单分散单乳液滴中或按本文所述方法制备的含目标细胞的多乳液滴或GUV或源自目标细胞的核酸具有可检测标记，如荧光标记。然后，可通过分选所述单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV并通过使液滴破裂(例如化学法或电场法)来回收其内容物，对细胞和/或细胞内核酸进行回收。上述步骤完成后，可进行一步或多步测序，例如一种或多种下一代测序技术。
对于按本文所述方法制备的单分散单乳液滴或按本文所述方法制备的多乳液滴或GUV，可进行的其他扩增反应包括链置换扩增(SDA)和滚环扩增(RCA)反应等。
在一个实施例中，提供了一种用于富集目标核酸序列的方法，其中所述方法包括：对多个目标颗粒进行包封，所述目标颗粒包括按本文所述方法制备的多个单分散单乳液滴中的核酸或按本文所述方法制备的多个多乳液滴或多个GUV中的核酸；为所述单乳液滴或多乳液滴或GUV引入多重置换扩增(MDA)试剂、聚合酶链式反应(PCR)试剂和/或其他核酸合成方法(例如扩增试剂)以及适合的引物；在足以实现PCR扩增的条件下或先在足以实现MDA扩增的条件下而后在足以实现PCR扩增的条件下，孵育单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV，以生成PCR扩增产物，其中适合的PCR引物可包括一种或多种各自与结合了所述目标核酸序列的一个或多个寡核苷酸杂交的引物，所述PCR扩增产物不包括完整的目标核酸序列；在孵育之前或之后，为单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV引入检测组分；通过检测组分的检测结果来确定是否存在PCR扩增产物，其中检测组分的检测结果提示了是否存在PCR扩增产物和目标核酸序列；根据检测组分的检测结果对单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV进行分选，其中分选目的是将包含PCR扩增产物和目标核酸序列(存在时)的单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV从不包含PCR扩增产物和目标核酸序列的单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV中分离；从分选出的单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV中汇集核酸序列，从而形成一个目标核酸序列(存在时)的富集库。上述步骤完成后，可进行一步或多步测序，例如一种或多种下一代测序技术。
如本文所述，术语“下一代测序”通常指相对于标准DNA测序技术(例如桑格测序)的改进技术。虽然从业人员可通过标准DNA测序技术精准地确定DNA序列中核苷酸的排列排序，但下一代测序技术还具备并行测序能力，可对DNA上数百万个碱基对片段同时测序。为了对DNA模板分子进行扩增，标准DNA测序技术通常需要用到单链DNA模板分子、DNA引物和DNA聚合酶。下一代测序技术促进了高通量测序的发展，与标准DNA测序技术相比，该技术可在很短时间内对整个基因组进行测序。下一代测序技术也可能有助于鉴别致病性突变，从而辅助病理学诊断。下一代测序技术还可在单次分析中提供样品中转录组的完整信息，并且无需提前获得基因序列。
本发明所揭示的方法可与任何适当的非特异性核酸扩增方法和试剂(例如MDA方法和试剂)结合使用，前提是这类方法和试剂应与本发明所述方法采用的任何其他后续的扩增步骤和/或试剂等(例如PCR扩增步骤和试剂)兼容。Bst聚合酶是一种适合MDA技术的聚合酶，可与Taq DNA聚合酶同时使用。Bst聚合酶相比其他MDA聚合酶(例如phi29聚合酶)可能具有一定的优势，因为Bst聚合酶可发挥效用的温度范围更广并且在与Taq DNA聚合酶相似的缓冲液条件下具有活性。
在实施标的方法时，可采用各种基于PCR的检测方法，例如定量PCR(qPCR)和微滴式数字PCR。这类检测方法中使用的引物数量和性质可能存在差异，至少有部分原因是取决于进行的检测类型、生物样品的性质和/或其他因素。在某些方面，一个单分散液滴(例如，单分散单乳液滴、多乳液滴或GUV)中可添加的引物数量可为1到100个或更多，并且/或者可包括用于检测约1到100个或更多个不同基因(如致癌基因)的引物。除了使用这些引物，或作为替代方法，可在实施标的方法时使用一种或多种探针(例如
Figure BDA0002499691020000041
探针)。
本文中使用的术语“微滴”和“液滴”可互换使用，指的是微小隔室，通常为球形并且至少包含结合了第二液体(例如油)的第一液体(如水等水相液体)，其中所述第一液体与所述第二液体互不相溶。在一些实施例中，所述第二液体将采用一种不混溶相载液。液滴(例如单乳和多乳液滴)的直径或最大径通常约为0.1至1,000μm，并且可用于包封细胞、DNA、酶类和其他组分。在一些实施例中，液滴(例如单乳和多乳液滴)的直径或最大径约为1.0μm至1,000μm(含)，例如约为1.0μm至750μm(含)、约为1.0μm至500μm(含)、约为1.0μm至250μm(含)、约为1.0μm至200μm(含)、约为1.0μm至150μm(含)、约为1.0μm至100μm(含)、约为1.0μm至10μm(含)或约为1.0μm至5μm(含)。在一些实施例中，液滴(例如单乳和多乳液滴)的直径或最大径约为10μm至200μm，例如约为10μm至150μm、约为10μm至125μm或约为10μm至100μm。
可由双乳液滴形成的GUV的大小通常与其来源的双乳液滴大小相似。因此，本文所述的GUV的直径或最大径范围约为0.1至1,000μm。在一些实施例中，本文所述的GUV的直径或最大径约为1.0μm至1,000μm(含)，例如1.0μm至750μm(含)、1.0μm至500μm(含)、1.0μm至250μm(含)、1.0μm至200μm(含)、1.0μm至150μm(含)、1.0μm至100μm、1.0μm至10μm(含)或1.0μm至5μm(含)。在一些实施例中，本文所述的GUV的直径或最大径约为10μm至200μm，例如约为10μm至150μm、约为10μm至125μm或约为10μm至100um。
液滴(例如单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV)自身的大小、组成、内容物等可能发生变化。单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV的内体积通常约为0.001至1,000皮升或更高，例如约为0.001皮升至0.01皮升、约为0.01皮升至0.1皮升、约为0.1皮升至1皮升、约为1皮升至10皮升、约为10皮升至100皮升或约为100皮升至1,000皮升或更高。此外，表面活性剂和/或颗粒可能也可能不会使液滴处于稳定。
向液滴(例如单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV)中加入试剂的方法可能有很大差异。试剂可通过一步或多步添加，例如2步或更多步骤、4步或更多步骤或10步或更多步骤。在某些方面，可通过一个或多个包封和破裂步骤将试剂添加到单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV中。举例而言，在一些实施例中，本发明所揭示的方法可能包括以下步骤：将多个目标颗粒(例如病毒、细胞或核酸)包封在第一单分散液滴或GUV中，将一种或多种试剂盒所述第一单分散液滴或GUV包封在第二液滴或GUV中，使所述第一单分散液滴或GUV破裂，从而使所述多个目标颗粒与所述一个或多个试剂接触。
在一个此类实施例中，使用按本文所述方法制备的单分散单乳液滴以及适合的裂解缓冲液将细胞包封在双乳液滴或GUV中，在足以实现细胞裂解和/或蛋白质消化的条件下进行孵育，并通过加热使蛋白酶失活。然后，可将双乳液滴或GUV包封在含适当核酸合成试剂的双乳液滴或GUV中，且对前者进行破裂处理后，使其内容物释放到负责包封的双乳液滴或GUV中，从而使细胞裂解物与核酸合成试剂混合。随后，可在适合核酸扩增的条件下对其余的双乳液滴或GUV进行孵育。由于双乳液滴或GUV兼具亲水性和疏水性，因此它们在药物递送(包括药物包封和递送)、化妆品用途(包括化妆品包封)和生物医学研究(包括在合成生物学领域，通过基于FACS的双乳液滴分选和膜蛋白功能研究实现的体外隔室化和菌株分离)方面的适用范围较广。
作为对上述方法的调整，可采用适合的裂解缓冲液将细胞包封到单分散单乳液滴中。在完成可选步骤蛋白酶灭活之后，可通过液滴合并技术将单分散单乳液滴与含适当核酸合成试剂的单分散单乳液滴合并。然后，可将合并后的单分散单乳液滴包封到双乳液滴或GUV中，用于随后的核酸扩增实验。或者，可采用适合的裂解缓冲液将细胞包封到单乳液滴中，然后在完成可选步骤蛋白酶灭活之后，将其包封到含核酸扩增试剂的双乳液滴或GUV中。应当注意，可在不使用微流体装置的情况下完成单乳液滴包封以及双乳液滴包封步骤。
如上所述，按本文所述方法使用单分散单乳液滴时，可利用多种适用于单乳液滴的技术，例如液滴聚结、皮量注入、多液滴聚结等，本文将作更详细的描述。在某些实施例中，添加试剂时注入流体本身用作电极。所述注入流体可包含允许其按原样使用的一种或多种类型的溶解的电解质。当所述注入流体本身用作电极时，可避免在微流控芯片中出于向液滴添加试剂的目的而对金属电极的需要。在某些实施例中，所述注入流体不用作电极，而是采用一个或多个液体电极代替金属电极。
可使用多种不同的检测组分，采用检测是否存在核酸扩增产物的各种方法。目标检测组分包括但不限于荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、花青及其衍生物、香豆素及其衍生物、Cascade Blue及其衍生物、荧光黄及其衍生物、氟硼二吡咯及其衍生物等等。示例性荧光团包括吲哚羰花青(C3)、吲哚二羰花青(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TexasRed、Pacific Blue、Oregon Green 488、Alexa fluor-355、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor-555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、JOE、丽丝胺、罗丹明绿、氟硼二吡咯、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明(dRhodamine)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、羧基-X-罗丹明(ROX)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen等。检测组分可包括微珠(例如磁珠或荧光珠子，包括Luminex微珠)等。在某些方面，检测时可在热循环过程中将单分散液滴保持在固定位置，以便对其进行重复成像。这种重复成像可能涉及Megadroplet Array的使用，本文将作更详细的描述。在某些方面，检测时可将一个或多个细胞固定和/或渗透到一个或多个单分散液滴(例如，一个或多个多乳单分散液滴或GUV)中。
本发明所揭示方法的适用对象包括哺乳动物，例如人类。该对象可以是具有疾病临床表现或已诊断出疾病的个体。在某些方面，所述对象可以是具有以下特征的个体：被诊断为癌症、具有癌症临床表现或因家族史、环境暴露、基因突变、生活方式(例如饮食和/或吸烟)等一种或多种因素而被确定存在患癌风险、存在一种或多种其他疾病等。在某些方面，所述对象可以是具有以下特征的个体：被诊断为微生物感染、具有微生物感染的临床表现或因家族史、环境暴露、基因突变、生活方式(例如饮食和/或旅游)等一种或多种因素而被确定存在微生物感染风险、存在一种或多种其他疾病等。在某些方面，所述对象可以是具有以下特征的个体：被诊断为病毒性感染、具有病毒性感染的临床表现或因家族史、环境暴露、基因突变、生活方式(例如饮食和/或旅游)等一种或多种因素而被确定存在病毒性感染风险、存在一种或多种其他疾病等。
单分散液滴制备过程中使用的制备模板单分散颗粒的微流体装置包括但不限于美国专利公开号2015/0232942中所述的装置，该发明专利以引用方式并入本文中。在一些实施例中，在处理/孵育和分析按本文所述制备的单分散液滴时，可结合使用一种包括核酸扩增区域和检测区域的微流体系统。在一些实施例中，所述核酸扩增区域可包括热循环仪。在一些实施例中，所述系统包括一个检测区域，其用于检测是否存在来自核酸扩增区域的反应产物，并且可通过流体连接至核酸扩增区域。在一些实施例中，所述系统包括用于将第一试剂添加至单分散单乳液滴的方法和/或发热元件。在一些实施例中，所述系统包括通过流体连接至核酸扩增区域的分选区域或组合检测/分选区域。在一些实施例中，除了“芯片上”分选区域之外，或作为替代方法，单分散液滴的分选可在“芯片外”进行。举例而言，在水相包不混溶相再包水相双乳液的情况下，可使用FACS装置或MACS装置等芯片外流式细胞分析装置进行分选。
附图说明
结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。附图中包括以下图示：
图1显示了一种用于制备PTE所需颗粒的微流体装置的设计。
图2为根据本发明中的一个实施例制备PTE单分散液滴的流程图。小图A描述了将多个模板单分散颗粒与包含目标颗粒的第一液体混合以形成第一混合物。小图B描述了将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶。小图C描述了所述第二混合物在剪切作用下，使得所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的单分散液滴中，从而形成包括所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。
图3为显示图2中描述的一个PTE工作流程实施例的示意图。小图A描述了将单分散聚丙烯酰胺(PAA)微珠添加到PCR反应混合物中。小图B描述了在PAA微珠中捕获PCR试剂。小图C描述了除去过量的水溶液。小图D描述了添加具有稳定表面活性剂的油，小图E描述了通过涡旋方式制备乳液。小图F描述了在单分散液滴内扩增单个核酸目标颗粒以及检测与扩增产物有关的荧光信号。
图4中提供了比较PTE制备的液滴粒度单分散性与微流体装置制备的液滴粒度单分散性的差异的图像。小图A描述了不使用模板单分散颗粒制备的液滴的图像。通过涡旋方式(左)或微流体装置(右)制备乳液。小图B描述了使用PTE方法结合不同颗粒组成和水溶性去污剂制备的单分散乳液。小图C描述了不同乳化方法下液滴粒度的分布情况。
图5提供了示例2所示的不同PTE条件下制备的液滴的图像。小图A描述了将PAA颗粒(不含水相表面活性剂)涡旋20分钟后制备的液滴。小图B描述了在1％聚乙二醇(西格玛奥德里奇)中将PAA颗粒涡旋3分钟后制备的液滴。小图C描述了在2％吐温20(西格玛奥德里奇)中将PAA颗粒涡旋3分钟后制备的液滴。小图D描绘了将PAA颗粒与0.5％Triton裂解缓冲液、FC-40和5％含氟表面活性剂混合并涡旋3分钟后制备的液滴。小图E描述了以0.18％N，N′-双丙烯酰胱胺作为交联剂并在0.5％Triton裂解缓冲液中将PAA颗粒涡旋30秒后制备的液滴。
图6提供了在不同涡旋时间下制备的液滴的图像和直方图。小图A描述了涡旋时间为5秒的图像和直方图。小图B描述了涡旋时间为15秒的图像和直方图。小图C描述了涡旋时间为1分钟的图像和直方图。小图D描述了涡旋时间为2分钟的图像和直方图。
图7显示的结果表明，PTE可将单分散乳液的制备量从微升增加至毫升。小图A描述了不同总体积下PTE乳液的图像。小图B描述了200μL和2mL乳液的液滴粒度分布直方图。小图C提供了PTE和微流体制备方法下液滴制备时间的对照表。
图8提供了使用模板单分散颗粒进行PTE微滴式数字PCR(ddPCR)和量化分析的图像。小图A描述了使用
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探针和酵母基因组DNA模板引物在不同稀释倍数(A.U.＝0、0.001、0.01、0.1、1.0)下进行PCR扩增后液滴的荧光图像。观察到的荧光阳性液滴的倍数与模板浓度相一致。小图B描述了显示一个样品在一系列稀释浓度下粒度和荧光分布的散点图。低荧光强度(<20AU)和小直径(<30μm)的液滴群由不含水凝胶颗粒的液滴组成。有预期直径(30-40μm)的液滴群由含单个水凝胶核的液滴组成。这些液滴群形成了两个紧密聚集区域：高荧光强度(PCR阳性)和低荧光强度(PCR阴性，无模板液滴)。小图C描述了在测试的三个10倍指数范围内通过假设泊松分布尺度估算的每个液滴中模板的平均拷贝量与受控模板浓度的关系图(R^2＝0.9994，误差条显示的是标准差)。
图9提供显示微流体ddPCR的结果比较的图表。在测试的三个10倍指数范围内，通过假设泊松分布尺度，针对受控模板浓度估算的每个液滴中模板的平均拷贝量(R^2＝0.9993，误差条显示的是标准差)。
图10A和10B提供了使用市售颗粒进行基于PTE的ddPCR和定量分析的示意图、图像和图表。图10A描述了显示使用同类市售单分散颗粒制备可用于基于PTE的ddPCR的液滴的示意图。图10B的小图A描述了酵母基因组DNA在不同浓度(A.U.＝0、0.1、1)下进行PCR扩增后的荧光图像。图10B的小图B描述了显示一个样品在一系列稀释浓度下粒度和荧光分布的散点图。可清楚地区分荧光阳性和阴性粒子，从而可通过图像分析进行定量。图10B的小图C描述了根据液滴体积加权后的多个泊松分布得出的泊松估计值，这些数值与模板浓度呈线性相关(R^2＝0.9409，误差条显示的是标准差)。
图11提供了显示λ病毒与酵母DNA混合物基于PTE方法进行多重ddPCR的图像。小图A描述了靶向λ病毒或酵母的探针分别用Cy5(红色)和羧基荧光素(FAM)(绿色)进行了荧光标记。小图B描述了在PTE方法制备的液滴中生长的酵母细胞。孵育10小时后，可通过内源性黄色荧光蛋白(YFP)检测出单个包封细胞中生长的细胞集落。
图12提供了采用96孔板制备的单分散乳液的图像，如示例7所述。
图13提供了通过PTE方法制备双乳液滴和GUV(即脂质体)的工作流程的示意图和相关图像。小图A描述了脂质体即时制备方法的工作流程图。小图B描述了采用聚丙烯酰胺微珠涡旋后形成的单乳液滴。小图C描述了通过添加外部水溶液并经过涡旋后形成的脂质体的图像。比例尺＝400μm。小图D描述了已形成脂质体以及油相中其他荧光脂质的荧光图像。
图14A-C提供了通过PTE实施高通量scRNA-seq方法的示意图。图14A描述了包封到水凝胶中的Drop-seq微珠。将细胞、蛋白酶K和杂交缓冲液进行混合。图14B描述了通过涡旋混合物以实现乳化的步骤。图14C描述了Drop-seq微珠的回收和RT测序以及随后进行的数据分析。
图15提供了通过PTE进行高通量scRNA-seq(不使用微流体装置的scRNA-seq)实验获得的图像结果。小图A描述了加入Drop-seq微珠的颗粒的显微图像，比例尺为2,000μm。小图B描述了加入Drop-seq微珠的乳液的显微图像，比例尺为1,000μm。小图C(比例尺为400μm)和小图D(比例尺为1,000μm)描述了包封到液滴中的钙黄绿素染色细胞在裂解前后的显微图像。小图E提供了描述了人类-小鼠混合细胞实验中的数据图表。
图16提供了一个采用即时乳化技术生成核壳微凝胶的工作流程的实施例的示意图，该技术将基于亲和力的PTE与靶向分析结合使用。
图17提供了外壳为琼脂糖且内核为聚丙烯酰胺的微珠的图像。小图A描述了液滴破裂后被琼脂糖外壳包裹的聚丙烯酰胺内核的微珠。小图B描述了两种稀释倍数下带琼脂糖外壳的聚丙烯酰胺内核微珠的ddPCR结果。小图C描述了经过FACS之后的液滴图像。小图D描述了qPCR结果。
实施方式
本发明提供了一种用于制备单分散乳液的改进后的颗粒模板乳化(PTE)方法。此类乳液中存在的液滴在本文中称为PTE液滴和PIP且二者可互换使用。本发明所揭示的方法可促进对受关注目标颗粒的包封以及后续的分析，并且无需使用微流体装置。本发明所揭示的方法涉及使用单分散颗粒作为模板来制备单分散液滴。
本发明所揭示的方法可促进对核酸等目标颗粒的包封，然后可根据PCR和/或MDA等核酸扩增技术测得的序列或根据其他方面对这些颗粒进行检测、量化和/或分选。
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了一些潜在和示例性的方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本发明内容应取代所引用出版物中的任何公开内容。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一个液滴”的指代对象包括多个此类液滴，而“所述核酸”指的是一种或多种核酸及所属领域技术人员已知的等效物，等等。
还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与陈述权利要求要素有关的专用术语或使用“否定”限制的前置基础。
本文所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，本文所描述和列出的每个单独的实施例都具有分层的组分和特征，这些组分和特征可在不脱离本发明的范围和精神的情况下与其他几个实施例中任一实施例的特征进行快速分解或合并。可按陈述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序对任何陈述的方法进行实施。例如，本文描述了多种其他方法和应用，它们可与本文中与制备单分散乳液相关的方法合并使用，或者它们可采用根据本文所述方法制备的单分散液滴进行单分散乳液的制备。就这一点而言，认为可通过上述方法和应用的一个或多个步骤对本专利1-62项的任何非限制性内容进行适当修改，并且/或者在实施上述方法和/或应用时，可利用按照本专利1-62项的一个或多个非限制性内容制备的单分散液滴。此类方法和应用包括但不限于以下标题部分所述的方法和应用：方法；模板单分散颗粒及其制备；单乳液滴和多乳液滴等单分散液滴及其制备；超大型单重脂质体(GUV)；单分散乳液制备中涉及的液体；表面活性剂；剪切；向单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中添加试剂；连接基团；单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的反应；检测PCR产物；检测单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的细胞(例如肿瘤细胞)；单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的核酸检测；多重置换扩增；PCR；双重PCR；数字PCR；RNA测序(RNAseq)；测量核酸长度；单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中用于序列分析的微流体富集(MESA)；单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的PCR激活细胞分选(PACS)；活细胞PCR激活细胞分选(PACS)；质谱法激活细胞分选(MS-ACS)；细胞集落的生长和裂解；多路复用技术；数字酶联免疫吸附试验(ELISA)；数字寡核苷酸联接免疫吸附试验(dOLISA)；分选；适用对象和/或样品；通过酶联探针检测蛋白质或DNA；癌症检测。
方法
如上所述，本发明提供了一种用于制备单分散乳液的改进的PTE方法。本发明所揭示的方法可促进对受关注目标颗粒的包封以及可选的后续分析，并且无需使用微流体装置。特别而言，本专利所揭示的方法涉及在无需采用先进的微流体系统的情况下制备含有单分散目标颗粒的液滴。尽管微流体系统可与按本文所述方法制备的单分散液滴合并使用，例如在液滴中添加试剂或进行液滴分选时，但是在单纯制备单分散液滴时不需要使用这类系统。本专利所揭示的方法涉及使用单分散颗粒作为模板并通过施加剪切力来制备单分散液滴。可采用均质器(例如涡旋混合器)来施加剪切力，即将适合的混合物通过移液管尖端，然后采用珠磨式研磨机或任何其他适用的方法来振荡混合物。
本文中所使用的术语“生物样品”涵盖了多种来源的多种样品类型，这些样品类型中包含生物材料。例如，该术语包括从哺乳动物对象(例如人类对象)中采集的生物样品以及通过食物、水或其他环境来源等获得的生物样品。该定义涵盖了血液和其他生物学来源的液体样品以及实性组织样品，例如活检标本或组织培养物或该组织培养物中的细胞以及此细胞的后代。该定义还包括在采购后以任何方式处理过的样品，例如通过试剂、增溶或富集某些成分(例如多核苷酸)而处理过的样品。术语“生物样品”涵盖临床样品，还包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、细胞、血清、血浆、生物流体和组织样本。“生物样品”包括细胞(例如，细菌细胞或真核细胞)、生物流体(例如，血液、脑脊液、精液、唾液等)、胆汁、骨髓、皮肤(例如皮肤活检组织)以及从个体中获得的抗体。
在各种情况下，都可采用本发明的方法对这类生物样品中的各种成分进行检测，本文已对此作了更详细的描述。受关注的成分包括但不限于细胞(例如循环细胞和/或循环肿瘤细胞)、病毒、多核苷酸(例如DNA和/或RNA)、多肽(例如肽和/或蛋白质)以及生物样品中可能存在的许多其他成分。
本文中所使用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”指核苷酸单体的线性聚合物，并且二者可互换使用。多核苷酸和寡核苷酸可具有多种结构形式中的任何一种，例如，单链、双链或两者组合，并且在分子内或分子间可具有高阶的二级/三级结构，例如发夹结构、环结构、三链区域等。多核苷酸的大小通常从几个单体核苷酸单元(例如，通常将其称为“寡核苷酸”时，为5-40个单体单元)到几千个单体核苷酸单元不等。每当多核苷酸或寡核苷酸由一系列字母(大写或小写)表示时，例如“ATGCCTG”，应当理解，除非另有说明或从上下文中显而易见，否则核苷酸由左向右表示从5’端→3’端，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。术语和原子编号应遵循Strachan和Read编写的《人类分子遗传学》第2版(Wiley-Liss出版社，纽约，1999年)中的惯例，除非另外注释。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示任何长度的氨基酸聚合物。NH2指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基端的游离羧基。多肽的命名方法采用《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)243(1969)，3552-3559中的命名标准。
在某些方面，提供了用于细胞计数和/或基因分型的方法，其中包括正常细胞或肿瘤细胞，例如CTC。这类方法的一个特点是使用微流体技术。
本文所述的方法通常涉及制备多个单分散液滴，包括单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV，之后可能会进行例如一个或多个核酸合成步骤和/或一个或多个检测和/或分选步骤。图2为根据本发明中的一个实施例的PTE工作流程的示意图。小图A描述了该流程的第一步：将多个模板单分散颗粒与包含目标颗粒的第一液体混合以形成第一混合物。小图B描述了该流程的第二步：将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶。小图C描述的步骤为：所述第二混合物在剪切作用下，使得所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的单分散液滴中。这些步骤完成后，形成了包含所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。
在单分散液滴制备完成后，可对这些液滴进行本文所述的任一适用的工作流程、技术和/或反应，或者所属领域内与目标颗粒(例如细胞、病毒及其组分，如DNA和RNA等核酸)液滴分析有关的其他已知方法。按照本文所述方法制备的单分散液滴可使用的其他液滴分析方法可见于以下出版物(以引用方式并入本文)等：美国专利公开号2015/0232942、美国专利公开号2017/0121756、美国专利公开号2017/0022538和美国专利公开号2017/0009274。
图3为图2中所示PTE工作流程的更详细实施例的示意图。小图A描述了一个向PCR反应混合物中添加单分散聚丙烯酰胺(PAA)微珠的步骤，从而形成第一混合物，这些PCR反应混合物可包括模板核酸、引物、探针、dNTP以及合适的酶(例如Taq聚合酶)等。小图B中描述的步骤通过将PAA微珠浸泡在PCR反应混合物中来捕获PAA微珠中的PCR试剂。小图C描述的步骤是将PAA微珠浸泡在PCR反应混合物中之后从所述第一混合物中除去过量的水溶液。小图D描述的步骤是通过添加油(与PCR反应混合物互不相溶的第二液体)和起稳定作用的表面活性剂来形成第二混合物。小图E描述了通过涡旋第二混合物来生成单分散乳液的步骤。小图F描述的步骤是在单分散液滴内扩增单个核酸目标颗粒以及检测与扩增产物有关的荧光信号。
本文所述的某些方法的特征在于：使用基于聚合酶链式反应(PCR)的测定法来检测某些寡核苷酸和/或基因(例如，细胞中的致癌基因)是否存在。举例而言，受关注的PCR测定法包括但不限于定量PCR(qPCR)、荧光定量PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、数字液滴PCR(ddPCR)、单细胞PCR、PCR-RFLP/实时PCR-RFLP、热启动PCR、巢式PCR、原位polonyPCR、原位滚环扩增(RCA)、桥式PCR、皮滴定PCR、乳液PCR和逆转录酶PCR(RT-PCR)。其他合适的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)、转录介导扩增、自主序列复制、目标多核苷酸序列的选择性扩增、共有序列引物聚合酶链式反应(CP-PCR)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。
基于PCR的测定法可用于检测某些基因是否存在，例如某些致癌基因。在进行这类检测时，需采用每个目的基因的一种或多种特异性引物与每个细胞的基因组进行反应。这些引物具有特定基因的特异性序列，因此它们仅在与细胞基因组互补时才可进行杂交并启动PCR。如果存在目的基因并且引物与该基因序列匹配，那么该基因可产生多个拷贝。为了确定是否存在特定基因，可通过探测单分散液滴中的液体来检测PCR产物(例如通过SybrGreen或溴化乙锭等嵌入型染料对溶液进行染色)，然后使PCR产物与微珠(例如磁珠或荧光珠子，包括Luminex微珠)等固体底物进行杂交，或者可通过分子间反应(例如FRET)进行检测。这些染料、微珠等分别为“检测组分”的示例，“检测组分”是本文中广泛使用且通用的术语，指的是用于检测核酸扩增产物(例如PCR产物)是否存在的任何组分。
下文对于这些基本方法的多种变化进行了详细地列举。
模板单分散颗粒及其制备
本文中针对模板颗粒所使用的术语“单分散”指的是模板颗粒的直径或最大径发生变化，使得至少50％或更多(例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多或99％或更多)的单分散颗粒的直径或最大径变化系数小于10倍，例如小于5倍、小于4倍、小于3倍、小于2倍、小于1.5倍、小于1.4倍、小于1.3倍、小于1.2倍、小于1.1倍、小于1.05倍或小于1.01倍。
本文中所使用的术语“多个模板颗粒”和“一个模板颗粒”可互换使用，指的是通常为球形的微小颗粒。模板颗粒可以是多孔颗粒或无孔颗粒。在本文的任一适当实施例中，模板颗粒可能包括微小隔室，隔室中可包含其他的组分和/或试剂，例如，可释放至本文所述单分散液滴中的其他组分和/或试剂。在本文的任一适当实施例中，模板颗粒中可包括聚合物，例如水凝胶。在一些实施例中(例如本文所述的其中第一液体为水相液体的实施例)，所述聚合物为亲水性聚合物。在一些实施例中(例如本文所述的其中第一液体为油等非水相液体的实施例)，所述聚合物为亲脂性聚合物。通常，模板颗粒的直径或最大径范围约为0.1至1,000μm。在一些实施例中，模板颗粒的直径或最大径约为1.0μm至1,000μm(含)，例如1.0μm至750μm(含)、1.0μm至500μm(含)、1.0μm至250μm(含)、1.0μm至200μm(含)、1.0μm至150μm(含)、1.0μm至100μm、1.0μm至10μm(含)或1.0μm至5μm(含)。在一些实施例中，模板颗粒的直径或最大径约为10μm至200μm，例如约为10μm至150μm、约为10μm至125μm或约为10μm至100μm。
在实施本文所述的方法时，模板单分散颗粒的组成和性质可能发生变化。例如，在某些方面，模板单分散颗粒可以是微凝胶颗粒，一种以凝胶为基质的微米级球形颗粒。在一些实施例中，所述微凝胶由可溶于水的亲水性聚合物组成，包括海藻酸盐或琼脂糖。在其他实施例中，所述微凝胶由亲脂性微凝胶组成。
在其他方面，所述模板单分散颗粒可以是水凝胶。在某些实施例中，所述水凝胶选自天然材料、合成材料及其组合。举例而言，水凝胶包括但不限于胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、纤维蛋白、明胶、海藻酸盐、琼脂糖、硫酸软骨素、聚丙烯酰胺、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺/聚丙烯酸(PAA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、聚N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和聚酸酐、聚富马酸丙二醇酯(PPF)。
在一些实施例中，所述模板单分散颗粒具有平均体积，本文所述方法包括使所述模板单分散颗粒收缩以减小平均体积。进行加热等外部刺激时，可能发生颗粒收缩。例如，可通过剪切作用将模板单分散颗粒包封在液体中，然后通过加热使模板单分散颗粒的粒径缩小。单分散单乳液滴或双乳液滴或GUV不会收缩，因为液滴的体积是恒定的并由模板单分散颗粒的原始粒径决定，但液滴内的模板单分散颗粒将从液滴表面回缩。
在本文的任一适当实施例中，所述模板单分散颗粒可包括以下至少一者：细胞、基因、药物分子、治疗药物、颗粒、生物活性剂、促骨形成药物、骨引导药物、骨诱导药物、抗炎药物、生长因子、蚕丝蛋白来源的多肽颗粒、核酸合成试剂、核酸检测试剂、目标颗粒、DNA分子、RNA分子、基因组DNA分子及其组合。在涉及单分散单乳液滴或双乳液滴或GUV内包含多种试剂组合的实施例中，模板单分散颗粒可包含多个隔室。所述模板单分散颗粒可用于包封试剂，该试剂在经触发后可释放所需的化合物，例如酶促反应的底物。举例而言，可将双乳液滴包封在所述模板单分散颗粒中，在进行加热等刺激后，该颗粒可发生破裂。当所述模板单分散颗粒被包封在不混溶相载液中之后，该刺激可触发反应。
可采用微流控技术制备模板单分散颗粒，例如使用美国专利公开号2015/0232942中所述的方法，该发明专利以引用方式并入本文。微流体装置可制备出液滴粒径极其均匀的乳液。可通过向管道中注入两种互不相溶的液体(例如油和水)来完成所述模板单分散颗粒的制备流程。管道形状、液体特性(粘度、界面张力等)和流速会影响所制备的所述模板单分散颗粒的特性，但在特性范围相对宽泛的情况下，可采用T型管道和流动聚焦工艺等方法制备出粒径均匀可控的模板单分散颗粒。为了改变模板单分散颗粒的粒径，可以改变不混溶液体的流速，因为对于一定特性范围内使用的T型管道和流动聚焦工艺，模板单分散颗粒的粒径取决于总流速和以及两种液体流速的比值。在使用微流体方法制备模板单分散颗粒时，通常将两种液体装载到有两个进液口的容器(例如注射器、压力管)中，然后根据需要加压以产生所需的流速(例如，使用注射泵、调压器、重力法等)。这样，液体会以所需的流速通过装置，进行而制备出所需粒径和流速的液滴。
在一些实施例中，可使用平行液滴制备技术来制备模板单分散颗粒，这些技术包括但不限于连续的液滴分裂和分配板。所需的平行液滴制备技术还包括Lab Chip 2011，Jun 7；11(11)：1911-5(Abate和Weitz)和RSCAdvances2017，7，14932-14938(Huang等)中描述的方法；出版物分别以引用方式并入本文。
在一些实施例中，通过触发胶凝机制(包括但不限于凝胶基质的聚合或交联)使所述模板单分散颗粒固化。举例而言，聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺和双丙烯酰胺在共聚作用下形成的。该反应是自由基发生系统引起的烯类加成聚合反应。在某些方面，通过将水凝胶冷却至胶凝温度以下而使琼脂糖水凝胶发生胶凝。
在一些实施例中，可从液体中除去所述模板单分散颗粒，干燥后以稳定形式储存一段时间。举例而言，干燥方法包括但不限于加热、真空干燥、冷冻干燥和超临界干燥。在一些实施例中，干燥后的模板单分散颗粒可与液体混合，但其形状和结构多保持为独立的球形凝胶颗粒。在一些实施例中，干燥后的模板单分散颗粒与适当的液体混合后，一部分所述液体会被所述模板单分散颗粒吸收。在一些实施例中，为了在与适当液体混合后有至少一个目标颗粒被吸收至所述模板单分散颗粒中，模板单分散颗粒的孔隙度可有所改变。可采用任何可在模板单分散颗粒内实现所需吸收过程的实用液体。
本文中针对模板单分散颗粒所使用的术语“吸收”、“溶胀”和“膨胀”可互换使用，指的是液体渗入物质或物质吸收液体的过程。在一些实施例中，被吸收的物质可保留至少一部分形状和结构。在一些实施例中，被吸收的物质可汇入液体中以形成溶液。
在某些方面，可使用表面活性剂使所述模板单分散颗粒保持稳定。因此，模板单分散颗粒可形成经表面活性剂稳定的乳液，例如经表面活性剂稳定的单乳液或经表面活性剂稳定的双乳液。可采用任何可在所述模板单分散颗粒内发生所需反应的实用表面活性剂。在其他方面，不采用表面活性剂或颗粒来稳定模板单分散颗粒。
单乳液滴和多乳液滴等单分散液滴及其制备
本文中针对液滴(例如单分散单乳液滴)所使用的术语“单分散”指的是有模板单分散颗粒时通过剪切产生的液滴直径或最大径的变化，这种变化要小于无模板单分散颗粒时在相同条件下剪切产生的液滴粒径的变化。通常，单分散单乳液滴或多乳液滴的直径或最大径与其制备材料模板单分散颗粒相比差异较大，但在本文所述的多种方法中仍有使用。单分散液滴的直径或最大径通常在约0.1至约1,000μm的范围内，并且直径或最大径的变化系数可能小于10倍，例如，直径或最大径的变化系数小于5倍、小于4倍、小于3倍、小于2倍、小于1.5倍、小于1.4倍、小于1.3倍、小于1.2倍、小于1.1倍、小于1.05倍或小于1.01倍。在一些实施例中，单分散液滴的直径或最大径会发生变化，使得至少50％或更多(例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多或99％或更多)的单分散液滴的直径或最大径变化系数小于10倍，例如小于5倍、小于4倍、小于3倍、小于2倍、小于1.5倍、小于1.4倍、小于1.3倍、小于1.2倍、小于1.1倍、小于1.05倍或小于1.01倍。在一些实施例中，单分散液滴的直径约为1.0μm至1,000μm(含)，例如约为1.0μm至750μm(含)、约为1.0μm至500μm(含)、约为1.0μm至250μm(含)、约为1.0μm至200μm(含)、约为1.0μm至150μm(含)、约为1.0μm至100μm(含)、约为1.0μm至10μm(含)或约为1.0μm至5μm(含)。在一些实施例中，单分散液滴的内体积可能约为0.01pL或更低、约为0.1pL或更低、1pL或更低、约为5pL或更低、10pL或更低、100pL或更低或者1,000pL或更低。在一些实施例中，单分散液滴的内体积可能约为1fL或更低、约为10fL或更低或者100fL或更低。在一些实施例中，单分散液滴的内体积可包含皮升至飞升范围内的液体体积(例如，约0.001pL至约1,000pL)。在一些实施例中，单分散液滴的内体积被严格地控制在纳升水平以下(例如，严格地控制在皮升水平、严格地控制在飞升水平或其组合)。
在实施本文所述的方法时，单乳和多乳液滴等单分散液滴的组成和性质可能发生变化。例如，在某些方面，可使用表面活性剂使液滴保持稳定。因此，液滴可形成经表面活性剂稳定的乳液，例如经表面活性剂稳定的单乳液或经表面活性剂稳定的双乳液。可采用任何可使液滴内发生所需反应的实用表面活性剂。在其他方面，不采用表面活性剂来稳定单分散液滴。
本文所述的液滴可制备成乳液，例如分散在不混溶相载液(例如，碳氟油或烃油)中的水相液体，反之亦然。特别是本文所述的多乳液滴，可制备成双乳液，例如分散在水相载液中的不混溶相液体中的水相液体；也可制备成四重乳液，例如水相液体包不混溶相液体，再包水相液体，再包不混溶相液体，最后分散在水相载液中；等等。按照本文所述制备单分散单乳液滴或多乳液滴时，可不采用微流控技术。在替代性实施例中，制备单分散单乳液滴时可不使用微流体装置，但获得液滴后可通过微流体装置将其改性为多乳液滴，例如双乳液滴。
按照本文所述方法制备单分散单乳液时，可不采用微流体装置。采用模板单分散颗粒制备单分散乳液时，可使乳液中液滴的粒径极其均匀。可通过以下方式完成液滴的制备：将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体中包括多个目标颗粒；将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包括所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。为了改变液滴粒径，可改变剪切速率和模板单分散颗粒的粒径。对于琼脂糖凝胶，可通过外部刺激(例如加热)使模板单分散颗粒液化以形成液状的单分散乳液。
含一个或不超过一个模板单分散颗粒的单分散液滴(例如，单分散单乳液滴或多乳液滴)的比例可能约为70％或以上；约为75％或以上；约为80％或以上；约为85％或以上；约为90％或以上；或约为95％或以上。举例而言，含一个或不超过一个模板单分散颗粒的单分散液滴的比例可能约为70％至100％，例如约为75％至100％、约为80％至100％、约为85％至100％、约为90％至100％或约为95％至100％。进一步举例，含一个或不超过一个模板单分散颗粒的单分散液滴的比例可能约为70％至95％，例如约为75％至90％或约为80％至85％。所述第二液体的单分散液滴中包封的模板单分散颗粒的比例可能约为70％或以上；约为75％或以上；约为80％或以上；约为85％或以上；或约为90％或以上。举例而言，所述第二液体的单分散液滴中包封的模板单分散颗粒的比例可能约为70％至100％，例如约为75％至100％、约为80％至100％、约为85％至100％、约为90％至100％或约为95％至100％。进一步举例，所述第二液体的单分散液滴中包封的模板单分散颗粒的比例可能约为70％至95％，例如约为75％至90％或约为80％至85％。
按照本文所述方法制备双乳液时，也可不采用微流体装置。双乳液为液滴包裹液滴，例如，水相液体被不混溶相外壳包裹后，分散在水相载液中(例如，水包油再包水)，或者不混溶相液体被水相外壳包裹后，分散在不混溶相载液中(例如，油包水再包油)。本文所述的第二混合物(包括所述第二液体中的单分散单乳液滴)与第三液体混合以形成第三混合物，其中所述第三液体至少与所述第二液体互不相溶。然后，第二混合物在发生剪切后将模板单分散颗粒包封在第三液体的双乳液滴中。所述第三液体可同时与所述第一液体和第二液体互不相溶。一种非常实用的双乳液包括包封在稍大油滴内的水性液滴，而油滴本身分散在水相载液中。双乳液的价值在于其结构内部的“核心”可用于提供溶解物或生物材料等活性化合物，被油性外壳包裹后，可将这些物质与外部环境隔离。使用模板单分散颗粒制备双乳液的益处与制备单乳液的益处相似，因为这种方法可在较宽泛的范围内控制双乳液的粒径(内外液滴粒径)，并且可以形成均匀度较高的液滴。如本文所述，在合适的实施例中，所述模板单分散颗粒可在所述单分散液滴内部发生溶解和/或融化。因此，在一些实施例中，可以采用不再包含完整模板颗粒但仍保持其原始粒径的单分散液滴来制备多重乳液，例如双乳液。以这种方式，此类单分散液滴可用作制备多重乳液(例如双乳液)的模板。
可通过多种方法(包括微流体和非微流体方法)实现样品材料和/或试剂(例如核酸和/或核酸合成试剂，如核酸等温扩增试剂和/或核酸扩增试剂)在液滴内的包封。在使用微流体方法的情况下，可应用多种技术，包括玻璃微毛细管双重乳化法或在可湿性图案化装置中通过连续液滴制备的方式进行双重乳化。微毛细管技术通过产生不混溶相的同轴射流形成液滴，其间通过喷嘴产生同轴流动聚焦，从而迫使不混溶相进入液滴。但是，这种方法的潜在缺点是，装置通常由并行排列且粘合在一起的微毛细管制成。由于液滴形成喷嘴的尺寸为数十微米，因此即使毛细管排列的微小误差也可能导致设备失效。相比之下，可以在用光刻技术制成的装置中利用空间图案化的液滴生成管道来实现连续液滴制备，从而在进行简易和大批量操作的同时保持粒径的均一性。然而，在某些情况下，这些装置的平面性质对于制备双乳液可能不是理想的，因为独立相都在接触通道壁的同时全部进入装置，因此必须仔细地设计可湿性以使各相被吞入相应的位置。这可能会增加装置的制造难度，并且在某些情况下，对于未结合装置情况优化可湿性的液体，这可能会阻碍液体的乳化。因此，在某些方面，本发明提供的用于制备单分散乳液的方法可在不使用微流体装置的情况下对样品材料和/或试剂(例如核酸和/或核酸合成试剂，如核酸等温扩增试剂和/或核酸扩增试剂)进行包封。
举例而言，本文所述方法的特征在于：将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体包含多个目标颗粒，例如核酸等。在一些实施例中，将多个模板单分散颗粒与所述第一液体混合以形成所述第一混合物的过程中，会使一部分所述第一液体及其包含的目标颗粒和/或试剂被所述模板单分散颗粒吸收。在一些实施例中，将所述多个模板单分散颗粒与所述第一液体混合以形成所述第一混合物包括使一部分所述第一液体流入所述模板单分散颗粒中。在一些实施例中，将所述多个模板单分散颗粒与所述第一液体混合以形成所述第一混合物包括使一部分所述第一液体扩散到所述模板单分散颗粒中。在一些实施例中，将所述多个模板单分散颗粒与所述第一液体混合以形成所述第一混合物包括使用一部分所述第一液体使所述模板单分散颗粒溶胀。
在一些实施例中，使部分所述第一液体被所述模板单分散颗粒吸收后，从所述第一混合物中除去过量的第一液体。被除去的过量第一液体的量可能存在差异。例如，通过除去大部分的过量液体，使细胞等目标颗粒在物理距离上接近多个模板单分散颗粒中的至少一个颗粒，可对无法汇入模板单分散颗粒的目标颗粒进行包封。将该混合物与第二液体(与所述第一液体互不相溶)混合以形成第二混合物。所述第二混合物在剪切作用下，使得多个模板单分散颗粒可被包封在第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包括第一液体、单个模板单分散颗粒和单个无法汇入模板单分散颗粒的目标颗粒的单分散液滴。
在一些实施例中，所述目标分子为细胞。在此类实施例中，所述单分散液滴的每个液滴中可含有一个或多个细胞。或者，所述单分散液滴的每个液滴中含有的细胞不超过一个。在一些实施例中，发生剪切作用后，乳液中的部分液滴不含有任何的目标颗粒。
在一些实施例中，本发明所揭示的方法包括将包括多个模板单分散颗粒的第一混合物、包括多个目标颗粒的第一液体与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包括所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。在一些实施例中，所述第二液体在发生剪切后包括多个不含有所述模板单分散颗粒的液滴。可通过合适的分离技术，例如过滤或离心，从单分散乳液中除去不含有模板单分散颗粒的液滴。与含有单个模板单分散颗粒的液滴相比，不含有单个模板单分散颗粒的液滴的直径可能较小。相对于不含有单个模板单分散颗粒的液滴，包含模板单分散颗粒的单分散液滴也会出现富集。
本文中所使用的术语“富集(enriched)”和“富集(enrichment)”可互换使用，指的是单分散乳液中目标实体(例如，含有模板单分散颗粒的单分散液滴)与非目标实体(例如，不含有模板单分散颗粒的单分散液滴)的比率较原始单分散乳液比率增加的过程。使用本发明所揭示的方法时，相对于不含有单个模板单分散颗粒的液滴，含有模板单分散颗粒的单分散液滴可富集至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多。
在一些实施例中，通过剪切作用，从包括包封在多个单分散液体中的多个模板单分散颗粒的所述第二混合物中除去过量的第二液体。可采用任何适当的方法除去过量的第二液体，例如通过离心并除去上清液。
按照本文所述方法制备多重乳液(例如双乳液)的情况下，可通过额外的操作对乳液进行改性。例如，在许多双乳制剂中，某些分子可穿透双乳液的外壳，从而导致这些分子被动地向双乳液内部或外部扩散。可利用这一原理来调节双乳液中的环境等。类似地，通过使溶剂向双乳液内部或外部扩散，从而使其内部液滴收缩或膨胀。举例而言，通过将双乳液分散在包括高浓度盐的缓冲液中，可以诱导水相液体从双乳液中扩散出来，直到内部液滴和外部载相的渗透压浓度达到一致，此时液滴的粒径将保持不变。可采用这种方法来改变内部液滴的粒径，或者通过添加或除去过量的溶剂使双乳液内的试剂发生浓缩或稀释。
还可以使用诸如溶剂萃取等技术来修饰双乳液的外壳，例如，对于水包油再包水的双乳液，可从外壳中除去过量的疏水相。这种操作可使双乳液产生其他变化，例如，通过反浸润或其他现象转变为脂质囊泡、聚合物囊泡或胶体体。举例而言，还可将气泡引入双乳液的内部液滴或中间的包封相中。在一些实施例中，如有需要，还可以利用对空气的膨胀和压缩能力来增加或减小双乳液的粒径或双乳液外壳的厚度等。例如，可通过降低系统压力使中间相的气泡膨胀，这会在内部液滴上施加外力，可借助这种外力使液滴转变为另一种结构，例如聚合物囊泡或囊泡。也可通过添加胶凝剂来使液滴外层固化。举例而言，胶凝剂包括但不限于明胶、琼脂、黄原胶、吉兰糖胶、角叉菜胶、车前子胶和瓜尔豆胶。
超大型单重脂质体(GUV)
双乳液通常指乳液中含乳液，即第二不混溶相的液滴内含有的液滴。这类乳液可通过表面活性剂保持稳定，但重要的是，作为中间相的“外壳”中除了可选的表面活性剂以外还包括液相。随着外壳体积的减小，双乳液逐渐从液滴包液滴的结构转化为类囊泡结构，其核心的液体被包封在表面活性剂分子的薄膜中。通过诱导双乳液的反浸润过程，可形成上述“囊泡”。在此过程中，中间液相的液体从外壳逸出，但保留了表面活性剂层，然后生成了包括水核的囊泡并且周围包裹了表面活性剂分子的薄层，同时还形成了小油滴，该油滴原本是粘附于液体的外壳。这类囊泡在本文中也称为脂质体。
双乳液的反浸润趋势取决于不同溶液和表面活性剂的特性，尤其是不同相之间的界面张力。当载相中添加氟化油、
Figure BDA0002499691020000231
表面活性剂、
Figure BDA0002499691020000232
(聚醚胺)
Figure BDA0002499691020000233
表面活性剂和普朗尼克等水性制剂时，似乎能够形成双乳液和囊泡且二者的热稳定温度均能达到95℃以上。
Figure BDA0002499691020000234
的液体是六氟环氧丙烷与功能性端基结合后形成的氟化合成油。在双乳液中诱导GUV的生成时，
Figure BDA0002499691020000235
20(聚山梨醇酯20)和
Figure BDA0002499691020000236
80(山梨醇单油酸酯)等其他表面活性剂可与或不与增稠剂(如PEG、海藻酸盐、甘油等)一同使用。
单分散乳液制备中涉及的液体
正如本文所讨论的，所揭示的方法通常涉及：将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体中包括多个目标颗粒；将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包括所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。在一些实施例中，所述方法还包括进一步操作：所述第二混合物经过剪切后，将第三液体与所述第二混合物混合以形成第三混合物，其中所述第三液体与所述第二液体互不相溶。
所选择的第一液体通常与第二液体互不相溶并与构成模板单分散颗粒的材料具有同样的亲水性/疏水性。所选择的第三液体通常与所述第二液体互不相溶并且可能与所述第一液体相溶或互不相溶。因此，在一些实施例中，所述第一液体是水相液体；所述第二液体是与所述第一液体互不相溶的液体，例如碳氟油、烃油或其组合等非水相；所述第三液体是水相液体。或者，在一些实施例中，所述第一液体是非水相液体，例如碳氟油、烃油或其组合；所述第二液体是与第一液体互不相溶的液体，例如水相液体；所述第三液体是碳氟油、烃油或其组合。
非水相可用作形成与水互不相溶的连续相的载液，或非水相也可作为分散相。非水相可指包括至少一种油的油相，但非水相可包括与水互不相溶的任何液体(或可液化)化合物或液体化合物的混合物。油可以是合成油或天然油。油可包括或不包括碳和/或硅，并且可包括或不包括氢和/或氟。油可以是亲脂性或疏脂性油。换言之，油通常可与有机溶剂相溶或互不相溶。举例而言，油可包括硅油、矿物油、碳氟油、植物油中的至少一种或其组合。
在示例性实施例中，油是氟化油(例如碳氟油)，可能是一种全氟化有机溶剂。举例而言，合适的碳氟油包括但不限于C9H5OF15(HFE-7500)、C21F48N2(FC-40)和全氟(甲基十氢化萘)(PFMD)。
正如本文所讨论的，在一些实施例中，第一液体包含多个目标颗粒(例如，DNA分子(基因组DNA分子、RNA分子等)、核酸合成试剂(例如核酸扩增试剂，包括PCR和/或等温扩增试剂))。
在一些实施例中，可通过添加胶凝剂来使液滴外层固化。
表面活性剂
在某些方面，表面活性剂可包括在所述第一液体、第二液体和/或第三液体中。因此，液滴可形成经表面活性剂稳定的乳液，例如经表面活性剂稳定的单乳液或经表面活性剂稳定的双乳液，其中表面活性剂可溶于所述第一液体、第二液体和/或第三液体。可采用任何可使液滴内发生所需反应的实用表面活性剂，包括但不限于辛基酚乙氧基化物(Triton X-100)、聚乙二醇(PEG)、C26H50O10(吐温20)和/或辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇(IGEPAL)。在其他方面，不采用表面活性剂来稳定液滴。
表面活性剂的选择取决于多种因素，例如乳液所用的油相和水相(或其他合适的不混溶相，例如任何合适的疏水相和亲水相)。举例而言，当在碳氟油中使用水性液滴时，表面活性剂可以具有亲水性嵌段(PEG-PPO)和疏水性氟化嵌段(
Figure BDA0002499691020000251
FSH)。但是，举例而言，如果将油换成烃油，则可选择具有疏水性烃嵌段的表面活性剂，例如ABIL EM90。
也可考虑使用其他表面活性剂，包括离子型表面活性剂。还可在油中加入其他添加剂来使液滴保持稳定，包括在高于35℃的温度下添加可增加液滴稳定性的聚合物。
在不受任何特定理论束缚的情况下提出了观点：若要制备出热稳定乳液，需使用能够形成耐高温薄膜或双乳液交界面的表面活性剂，例如可引起标准PCR反应的表面活性剂。实现此目的的一种方法是使用分子量较高的表面活性剂，以便在形成液滴交界面或形成薄膜时，从交界面去除表面活性剂(或破坏膜)所需的能量高于kT所提供的能量。
举例而言，可用于保持乳液热稳定性的表面活性剂为“生物相容性”表面活性剂，包括PEG-PFPE(聚乙二醇-全氟聚醚)嵌段共聚物，例如
Figure BDA0002499691020000252
(可参见Holtze等的“Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions”，Lab Chip，2008，8，1632-1639，该出版物中的内容以引用方式并入本文)，还包括油相离子型
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和水相
Figure BDA0002499691020000254
(聚醚胺)等表面活性剂(可参见DeJoumette等的“CreatingBiocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis：Direct Interactionsbetween Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants”，Anal.Chem.2013，85(21)：10556-10564，该出版物中的内容以引用方式并入本文)。只要可形成稳定的交界面，则可使用其他的和/或替代性表面活性剂。因此，许多合适的表面活性剂都是具有高分子量的嵌段共聚物(例如
Figure BDA0002499691020000255
)。这些示例包括氟化分子和溶剂，但也很可能用到非氟化分子。
因此，本发明的一些实施例中提供了具有热稳定性的乳液。这些乳液适合进行PCR、RT-PCR等生物反应以及蛋白质相互作用研究等。
在制备乳液尤其是双乳液时，需要考虑到保持乳液的稳定性，这样便可使乳液保持双乳液状态且不会发生破裂或聚结。这通常使用表面活性剂等稳定剂来实现。然而，在某些方面，制备出极其稳定的双乳液可能是有利的。在本文所述的方法中，这可通过使用可交联中间相(包封相)等方式来实现，例如使用聚二甲基硅氧烷等聚合物凝胶相。或者，可通过生成交联基团等方式使表面活性剂分子彼此交联。该基团可存在于表面活性剂的疏水尾部，或者存在于亲水头部。该基团可使表面活性剂分子彼此交联，或者可通过在水相中添加试剂来诱导交联，例如添加诱导聚合作用、共价键连接等的分子。生物分子(例如抗体或生物素-链霉亲和素系统)也可以用于实现表面活性剂分子间的交联。
界面交联是使双乳液外壳保持热稳定的另一种方法。举例而言，这种交联方式可通过油相交联或膜囊泡交联来实现。如上所述，界面交联的方法可使用链霉亲和素等生物分子。例如，一种
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聚合物的头基可在多种生物素的作用下被生物素化。然后，将链霉亲和素添加到水相中，从而将多个
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聚合物交联在一起，并在水/油界面形成交联的外壳。然后，这些外壳可直接分散在水中，或者如有需要，可通过包封将其制备成双乳液。
剪切
为了制备单分散乳液，本发明所揭示的方法中包括了所述第二混合物的剪切步骤，其中所述第二混合物的制备方式为将所述第一混合物与第二液体(与所述第一液体互不相溶)混合。可采用任何适当的方法或技术向第二混合物施加足够的剪切力。例如，可通过使所述第二混合物穿过移液管尖端来对所述第二混合物进行剪切。其他方法包括但不限于采用均质器(例如涡旋混合器)振荡所述第二混合物，或采用珠磨式研磨机振荡所述第二混合物。通过施加足够的剪切力，使所述第二混合物破碎成包封了单个模板单分散颗粒的单分散液滴。有些液滴也可能不含有单个模板单分散颗粒。
通常，如果增加剪切力，则产生的平均液滴粒径将小于所述模板单分散颗粒的粒径。然而，由于所述模板单分散颗粒成固态，因此包裹着这些颗粒的液滴的粒径不会再减小，进而可制备出单分散乳液。如果剪切速率显著高于所述模板单分散颗粒的模量，则施加剪切力后可将液体从所述模板单分散颗粒中挤出。在不受任何特定理论束缚的情况下提出了观点：合适的剪切速率应与模板单分散颗粒的模量适当匹配。例如，选择的剪切速率/剪切力应高于所需粒径下液滴的拉普拉斯压力，但应低于模板颗粒的模量。
作为非限制性举例说明，在单分散PAA、PEG或琼脂糖模板颗粒的水相中添加Triton或IGEPAL并将HFE-7500氟化油作为非水相的情况下，涡旋30秒会产生足够的用于制备单分散液滴的剪切力。
向单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中添加试剂
在实施标的方法时，可能需要在一个或多个步骤(例如，约2个、约3个、约4个或约5个或更多步骤)中向液滴添加多种试剂。向液滴中添加试剂的方式可能存在多方面的差异，这可能由液滴的乳化阶段决定。举例而言，相对于双乳液滴等多乳液滴，向单分散单乳液滴中添加试剂可能存在不同的适用方法。受关注的方法包括但不限于以下出版物中描述的方法：Ahn等，Appl.Phys.Lett.88，264105(2006)；Priest等，Appl.Phys.Lett.89，134101(2006)；Abate等，PNAS，2010年11月9日第107卷第45期，19163-19166；Song等，Anal.Chem.，2006，78(14)，第4839-4849页；出版物中的内容以引用方式并入本文。在一些实施例中，可在本文所述的乳化过程中将试剂添加到液滴中，例如作为第一液体的成分，其间可不使用微流体装置或系统。在其他实施例中，如果按照其他所述方式制备乳液，则可采用微流体技术、装置和/或系统来添加试剂和/或对单分散液滴改性。
举例而言，如本文所述，可通过使液滴与第二个含有试剂的液滴相融合的方式将试剂添加至单分散单乳液滴。可通过任何便利的方法添加所述第二液滴中包含的试剂，具体包括本文中描述的方法。此液滴可与所述第一液滴融合以生成包括所述第一和第二液滴内容物的液滴。在一些实施例中，所述第一液滴的粒径要比所述第二液滴大很多且数目也较多。
或者，也可采用液滴聚结和/或皮量注入等技术将一种或多种试剂添加到本文所述的单分散单乳液滴中。在液滴聚结过程中，可使目标液滴随着另一种液滴一起流动，而后者含有即将添加到所述目标液滴中的试剂。这两个液滴一起流动时可彼此接触，但不会触碰其他液滴。然后，这些液滴会经过电极或其他电场装置，其中电场可降低液滴的稳定性，从而使其相互融合。
在皮量注入过程中，目标液滴会流经含有待添加试剂的通道，期间试剂处于高压状态。然而，在不施加电场的情况下，液滴会在表面活性剂的影响下直接流过而不会注入通道，这是因为液滴上涂覆的表面活性剂可阻止液体进入。但是，如果在液滴经过注液器时对液滴施加电场，则包含试剂的液体将被注入液滴中。可通过几个不同的参数来控制添加到液滴中的试剂量，诸如调节注液压力和液滴流速、接通和断开电场等。
在其他方面，还可或替而通过另一种方法将一种或多种试剂添加到本文所述的单分散单乳液滴中，该方法不采用两个液滴相融或向液滴中注液的方式。将一种或多种试剂添加到液滴中时，更多的是采用以下方法：将试剂乳化成由极小液滴组成的液滴流，并将这些小液滴与目标液滴融合。这类方法在本文中称为“通过多液滴聚结的方式添加试剂”。这些方法基于以下事实：由于待添加液滴的粒径小于目标液滴，因此小液滴的流动速度会比目标液滴快，并且会在目标液滴后方聚集。然后，可通过施加电场等方式使聚集的液滴融合。通过多种液体小液滴共轴流动的方式，还/或可采用上述方法将多种试剂添加到液滴中。为了能使微滴与目标液滴有效融合，重点在于微滴的粒径应小于包含目标液滴的通道，并且目标液滴注入通道与施加电场的电极之间应保持足够长的距离，从而使微滴有足够的时间“追赶”上目标液滴。如果该通道太短，则并非所有微滴都会与目标液滴融合，并且添加的试剂量可能小于所需量。在某种程度上，可通过增加电场强度进行弥补，这往往可对距离较远的液滴进行融合。除了在同一微流体装置上制备微滴外，还/或可采用另一台微流控液滴制备装置或通过均质技术脱机制备，然后将其注入到含有目标液滴的装置内。
因此，在某些方面，采用以下方法将试剂添加到按本文所述方法制备的液滴中：将试剂乳化成液滴流，其中所述液滴的粒径小于目标液滴(例如，单分散单乳液滴或多乳液滴或GUV)；使这些液滴与目标液滴一同流动；最后使液滴与目标液滴融合。液滴流中含有的液滴直径的变化范围约为目标液滴直径的75％或以下，例如流动液滴的直径约为目标液滴直径的75％或以下、约为目标液滴直径的50％或以下、约为目标液滴直径的25％或以下、约为目标液滴直径的15％或以下、约为目标液滴直径的10％或以下、约为目标液滴直径的5％或以下或约为目标液滴直径的2％或以下。在某些方面，目标液滴会与多个流动液滴相融合，例如2个或2个以上、3个或3个以上、4个或4个以上或者5个或5个以上。可通过任何便利的方法实现这种融合，包括但不限于施加电场，其中电场可使流动液滴与目标液滴有效融合。
作为对上述方法的调整，可对液体进行喷射。也就是说，使该液体形成一股较长的射流，然后随目标液滴一起流动，而并非将待添加至流动液滴中的液体乳化。然后，可通过施加电场等方式使这两种液体融合。在最终形成的射流中，液滴所在的位置是凸起的。由于存在Rayleigh-Plateau不稳定性，该射流会在液滴融合前自然地分裂成与目标液滴粒径大致相同的液滴。对此，可考虑通过多种方式进行调整。例如，可在喷射液体中加入一种或多种物质，使其更易喷射，例如胶凝剂和/或表面活性剂。此外，还可通过调节连续流体的粘度来使其便于喷射，例如Utada等人在Phys.Rev.Lett.99，094502(2007)中描述的方法，该出版物中的内容以引用方式并入本文。
在其他方面，可将注入流体本身作为电极，利用溶液中溶解的电解质来添加一种或多种试剂。
在另一种情况下，将待添加试剂的液滴(即“目标液滴”)包封在含有待添加试剂的微滴(“目标试剂”)中，可将试剂添加到先前制备出的液滴中。在某些实施例中，这种方法的操作方法如下：首先将所述目标液滴包封在合适的疏水相(例如油)外壳中以形成双乳液。然后，将所述双乳液包封在含有目标试剂的液滴中以形成三重乳液。然后，为了使目标微滴与含有目标试剂的微滴融合，应通过任何适当的方法使双乳液裂开，包括但不限于施加电场、添加使液滴界面不稳定的化学物质、使三重乳液通过压缩装置和其他微流体几何构型、施加剪切力或超声波、提高或降低温度，或者将磁性粒子包封在液滴中，当受到磁场牵拉时，磁性粒子会使双乳液交界面破裂。
对于上述将试剂添加到液滴中的方法，美国专利公开号2015/0232942提供了更加详细的描述，此专利中的内容以引用方式全文并入本文中并用于所有目的。
尽管以上将试剂添加到液滴中的方法可能适用于将试剂添加到单分散单乳液滴中，但是上述的一种或多种方法可能不适用于直接将试剂添加到多乳液滴中，例如双乳液滴和/或GUV。举例而言，这种方法会破坏多乳液滴和/或GUV的结构。然而，上述方法可用于将试剂添加至单分散单乳液滴中，在包封液滴后形成多乳液滴和/或GUV。因此，下文描述了将试剂添加至多乳液滴和/或GUV中的其他方法。举例而言，在一些实施例中，可通过将试剂(例如为核酸扩增产物添加可检测标记的试剂和/或用于产生核酸合成产物的核酸合成试剂)添加至混相载液中的方式使试剂进入到多乳液滴和/或GUV中，其中，试剂在混相载液中扩散并穿过多乳液滴和/或GUV的不混溶相外壳，然后进入到多乳液滴和/或GUV的第一混相液体中。
在一些实施例中，多乳液滴和/或GUV是第二多乳液滴和/或GUV，而向第二多乳液滴和/或GUV中添加核酸合成试剂的方法包括：将核酸(例如，目标核酸)包封在第一多乳液滴和/或GUV中，将合成试剂和第一多乳液滴包封在第二多乳液滴和/或GUV中，并使所述第一多乳液滴和/或GUV破裂，从而使所述核酸与所述合成试剂接触。
在一些实施例中，多乳液滴和/或GUV是第二多乳液滴和/或GUV，而向第二多乳液滴和/或GUV中添加核酸合成试剂的方法包括：将核酸合成试剂包封在第一多乳液滴和/或GUV中，将核酸(例如，目标核酸)和所述第一多乳液滴和/或GUV包封在所述第二多乳液滴和/或GUV中，并使所述第一多乳液滴和/或GUV破裂，从而使所述核酸与所述合成试剂接触。
在一些实施例中，多乳液滴和/或GUV是第一多乳液滴和/或GUV，而将试剂添加至所述第一多乳液滴和/或GUV中的适用方法包括：将所述第一多乳液滴和/或GUV包封在包括所述试剂的第二多乳液滴和/或GUV中，并使第二多乳液滴和/或GUV内的第一多乳液滴和/或GUV破裂，从而使所述试剂与所述第一多乳液滴和/或GUV的内容物接触。
在一些实施例中，多乳液滴和/或GUV是第二多乳液滴和/或GUV，而将试剂添加至所述第二多乳液滴和/或GUV中的适用方法包括：将包括试剂的第一多乳液滴和/或GUV包封在第二多乳液滴和/或GUV中，并使第二多乳液滴和/或GUV内的第一多乳液滴和/或GUV破裂，从而使所述试剂与所述第二多乳液滴和/或GUV的内容物接触。
连接基团
在一些实施例中，目标颗粒(例如，核酸靶分子；核酸合成试剂；和/或核酸检测试剂)通过模板单分散颗粒表面或内部的一个或多个连接基团与所述模板单分散颗粒相结合。连接基团可与待连接的目标颗粒发生相互作用。例如，连接基团可能为具有特定序列的寡核苷酸，而这些序列结合于模板单分散颗粒的表面或内部。特定的寡核苷酸可通过碱基配对和交联等方式与液体中的目标颗粒进行杂交。
在一些实施例中，某些目标颗粒的粒径可能过大而无法通过含有可捕获目标颗粒的官能团的模板单分散颗粒。在这种情况下，连接基团可能是包封在模板单分散颗粒中的功能化珠子。例如，当目标颗粒在模板单分散颗粒之间扩散时，它们将与功能化珠子接触，从而有机会被捕获。即使模板单分散颗粒被可混溶的载液吸收，目标颗粒也会与基团相连，因为这些颗粒连接的是捕获在模板单分散颗粒内部或表面的珠子。
单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的反应
本发明所揭示的方法通常有助于大量分区化反应的进行并且可采用多种检测方法(例如，光谱法、化学技术、生物技术、测序技术等)对这些反应的结果进行后续读取和分类。这些反应可包括在不使用生物分子的情况下进行的有机或无机反应，或涉及生物分子和/或细胞的反应，例如PCR等酶促反应。这些反应还可能会涉及到胞内物质或细胞提取物，包括无需使用活细胞即可表达DNA、RNA和蛋白质的转录和翻译过程提取物。这可应用于合成生物学领域，例如筛选出发挥活性的通路。
举例而言，采用可表达一种或多种通路蛋白的无细胞提取物，可使包封在单分散单乳液滴或多乳液滴(例如双乳液滴和/或GUV)中核酸对由一种或多种蛋白实现的通路进行编码。为了能对通路进行检测，也可将检测组分考虑在内。根据通路活性和测定的结果，可对反应物进行分选，以便回收刚好能包封所需通路的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV。分选后，可继续对其进行分析、扩增等，从而进行筛选或者在定向进化后生成通路强化的序列。
单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的反应也可用于核酸操作等，包括构建偏倚较小的测序文库或者对分子赋予特定属性。例如，可将表达特定基因序列的细胞或核酸合成和/或扩增产物包封在所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，然后采用本文所述的方法分离、扩增并连接序列，从而生成可用于分析或其他应用的单个分子。举例而言，如果上述细胞包括可产生人类抗体的细胞，则可将细胞重链和轻链对应的基因相结合，从而生成可用于检测重链和轻链配对的的单个分子，或者生成scFv或Fab等抗体样分子。
检测PCR产物
在实施标的方法时，核酸合成和/或扩增产物(核酸等温扩增产物或PCR产物)的检测方式可能有所改变。举例而言，如果目标仅是计算群体中存在的特定细胞类型(例如肿瘤细胞)的数量，则可以通过简单的二元分析来实现。在测定过程中，将SybrGreen或任何其他染料和/或嵌入型染料添加到每个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，从而在有特征性基因(例如致癌基因)并生成PCR产物的情况下，使单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV发出荧光信号。采用荧光偏振技术时，可能使荧光信号强度发生改变。检测组分中可使用嵌入型染料(例如SybrGreen)。
在实施标的方法时，可使用多种检测组分，包括本领域已知的荧光染料。荧光染料通常可以分为多个家族，例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、花青及其衍生物、香豆素及其衍生物、Cascade Blue及其衍生物、荧光黄及其衍生物、氟硼二吡咯及其衍生物等等。示例性荧光团包括吲哚羰花青(C3)、吲哚二羰花青(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Texas Red、Pacific Blue、Oregon Green 488、Alexa fluor-355、Alexa Fluor 488、AlexaFluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor-555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、JOE、丽丝胺、罗丹明绿、氟硼二吡咯、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明(dRhodamine)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、羧基-X-罗丹明(ROX)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen等。荧光团及其用途可参见其他出版物：R.Haugland，Handbook ofFluorescent Probes and Research Products，9th ed.(2002)，Molecular Probes，Eugene，Oreg.；M.Schena，Microarray Analysis(2003)，John Wiley&Sons，Hoboken，N.J.；Synthetic Medicinal Chemistry 2003/2004Catalog，Berry and Associates，AnnArbor，Mich.；G.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996)；GlenResearch2002Catalog，Sterling，VA。
在其他方面，特别是为了进一步确定当前核酸(例如致癌基因)的特征时，则可能需要进行额外的检测。例如，在采用多重检测的情况下，可通过输出的光学信号来确定核酸特征，而这些信号可提示单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中有哪些基因发生了扩增。另一种方法是采用二进制输出，例如，采用嵌入型染料确定具有致癌基因的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV。然后，在分选后对这些液滴和/或GUV进行回收，通过更细致的分析来确定其中含有的致癌基因。为了确定这类液滴和/或GUV中存在的致癌基因，可采用微流体技术或非微流体技术。在使用非微流体技术时，可将确定含有致癌基因的液滴和/或GUV注入微孔板的板孔内，使其稀释至较大体积，从而释放在多重PCR反应中生成的所有PCR产物。然后，将该板孔中的样品转移到其他板孔中，并在每个板孔中添加一种致癌基因的引物。之后，对这些板孔进行温度循环处理以启动PCR，此时添加嵌入型染料，使致癌基因与引物相匹配的板孔发出荧光信号。
因此，在实施标的方法时，可根据荧光信号强度的变化等检测某个组分。在某些方面，采用荧光共振能量转移(FRET)技术可能使荧光信号强度发生改变。在这种方法中，可使用一组特殊的引物，其中5’端引物标记淬灭染料，而3’端引物标记荧光染料。这些染料可标记在引物上的任何位置，不论是末端还是中间。由于引物间是互补的，因此引物会以双链体形式存在于溶液中，这会导致荧光染料发出的信号被淬灭染料淬灭。因为引物间的距离极为接近，所以溶液颜色会变暗。PCR操作结束后，这些引物将并入较长的PCR产物中，因此彼此的距离会变远。这种情况下，荧光染料便会发光，进而使溶液呈现出荧光。因此，为了检测是否存在特定的致癌基因，可根据荧光染料的波长来测定液滴和/或GUV的强度。为了检测是否存在不同的致癌基因，可采用不同颜色的染料标记不同的引物。这种做法会导致与细胞致癌基因引物对应的所有波长处的液滴和/或GUV都发出荧光。
检测单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的细胞(例如肿瘤细胞)
标的方法的方面涉及检测生物样品中一种或多种细胞或细胞亚群(例如肿瘤细胞)。举例而言，此类方法可包括的步骤如下：将细胞包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中；使所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV达到足以使所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中细胞实现裂解的条件；使所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV达到一种条件，即足以使一种或多种可抑制核酸扩增的物质失活或被除去；将核酸合成试剂(例如核酸扩增试剂)引入所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中；使所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV达到足以合成(例如扩增)目标核酸(存在时)的核酸合成条件(例如核酸扩增条件)；对目标核酸(存在时)合成(例如扩增)期间生成的扩增或合成产物进行检测。
可采用任何便利的方法从某个对象中采集生物样品(例如全血)。可通过离心、过滤等处理步骤来处理生物样品，从而除去细胞以外的成分。如有需要，在将细胞包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中之前，可采用一种或多种抗体和/或探针对细胞进行染色。
还可以向含有细胞的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中添加一种或多种裂解剂，在细胞破裂后释放其基因组。可以在将细胞包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中后加入裂解剂。可采用任何适当的裂解剂，例如任何适当的外肽酶和/或内肽酶(例如具有广泛底物特异性的外肽酶和/或内肽酶，包括蛋白酶K等非特异性丝氨酸蛋白酶、地衣芽孢杆菌来源蛋白酶[例如CAS 9014-01-1]、OB蛋白酶[购自Omega Bio-Tek])或细胞毒素。在特定的实施例中，可以将细胞与含有去污剂的裂解缓冲液(例如，Triton X-100和/或蛋白酶K)一同包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中。细胞发生破裂的具体条件取决于使用了哪种裂解剂。举例而言，如果添加的裂解剂为蛋白酶K，则可将单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV加热至约37-60℃，持续约15至20分钟，使细胞裂解并使蛋白酶K消化胞内蛋白，然后将其加热至约95℃，持续约5-10分钟，从而使蛋白酶K失活。
在某些方面，可在将细胞包封至本文所述的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV之前或同时，向细胞中添加裂解剂。可采用任何适用的裂解剂，例如任何适当的外肽酶和/或内肽酶(例如具有广泛底物特异性的外肽酶和/或内肽酶，包括蛋白酶K等非特异性丝氨酸蛋白酶、地衣芽孢杆菌来源蛋白酶[例如CAS 9014-01-1]、OB蛋白酶[购自Omega Bio-Tek])或细胞毒素。在一些实施例中，不会特意地使用去污剂，因为这可能导致细胞在包封前提前裂解。在此类实施例中，可向细胞中添加蛋白酶K等外肽酶和/或内肽酶。举例而言，在没有去污剂的情况下，在将细胞包封至单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV之前或同时，向细胞中添加蛋白酶。为了确保在细胞包封之前或过程中外肽酶和/或内肽酶未处在活化状态，可在足够低的温度下添加蛋白酶K等外肽酶和/或内肽酶，例如约为0℃至25℃，包括约1℃至5℃、约1℃至10℃、约1℃至15℃以及约1℃至20℃。在一些实施例中，可在约4℃时添加外肽酶和/或内肽酶。随后，可将单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的温度升高至足以确保外肽酶和/或内肽酶活化的温度，例如37-80℃(如30-50℃、37-55℃、40-60℃、50-60℃、60-70℃或70-80℃，以促进外肽酶和/或内肽酶的活化和细胞的裂解。外肽酶和/或内肽酶的孵育时间应足以实现细胞的裂解，例如15-60分钟(也可酌情延长时间)、15-20分钟。然后，可使乳液液滴破裂并根据需要洗掉外肽酶和/或内肽酶。此类方法可用于本文所述的单细胞RNA测序(scRNAseq)等方法。
在某些情况，还/或可依赖不添加裂解液的技术实现细胞裂解。例如，可通过机械裂解技术实现细胞的裂解，这类技术会采用多种几何形状对细胞进行穿透、剪切、磨蚀等。也可使用声学技术等其他类型的机械破损技术。此外，也可利用热能实现细胞裂解。在本文所述的方法中，可采用任何便利的方式实现细胞裂解。
可将每种待检测的基因和/或遗传学标记物(例如致癌基因)的引物添加到单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中。因此，在某些方面，单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中可同时存在多种基因和/或遗传学标记物(例如所有致癌基因)的引物，以便进行多重检测。可通过对液滴和/或GUV进行温度循环处理，使包含目标细胞(例如癌细胞)的液滴和/或GUV进行PCR。还/或可利用MDA或其他核酸等温扩增方法，例如环介导核酸等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)。只有与基因组中致癌基因和/或遗传学标记物相匹配的引物才能诱导核酸的扩增，进而在液滴和/或GUV中对这些致癌基因和/或遗传学标记物生成多个拷贝。可通过多种方式来检测这些扩增产物，例如FRET技术、嵌入型染料染色或将其附着在微珠上。可采用光学探针检测液滴和/或GUV中的扩增产物。在一些实施例中，用光学探针检测液滴和/或GUV的方法可涉及：计算初始液滴群中肿瘤细胞的数目，同时/或者对每个肿瘤细胞中的致癌基因进行鉴定。
本部分所述方法可用于确定生物学样品中是否含有特定的目的细胞，例如肿瘤细胞。在某些方面，本部分所述方法可包括对生物样品中的目的细胞(例如肿瘤细胞)进行定量检测。对生物样品中的目的细胞(例如肿瘤细胞)进行定量时，必须获得的一部分数据是可检测出扩增产物的液滴和/或GUV的数量。举例而言，可在预期大部分液滴含有零个或一个细胞的条件下，制备液滴和/或GUV。可除去不含任何细胞的液滴和/或GUV，所采用的技术在本文中作了更详细的描述。在进行上述PCR步骤之后，可计算检测出扩增产物的液滴和/或GUV的总数，从而确定生物样品中目的细胞(例如肿瘤细胞)的数量。在某些方面，所述方法还可包括计算液滴和/或GUV的总数，以确定生物样品中目的细胞(例如肿瘤细胞)的比例或百分数。
在一些实施例中，将合成试剂引入按本文所述方法通过单分散液滴制备的多乳液滴和/或GUV包括将合成试剂引入第三液体，其中所述合成试剂在第三液体中扩散，在穿过不混溶外壳后进入多乳液滴和/或GUV内的第一液体中。
可通过分选单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV并通过使液滴破裂(例如本文中更加详细描述的化学法、电场法或机械法)来回收其内容物，对目的细胞和/或胞内物质进行回收。可利用各种适当的分选技术和相关装置对含有扩增和/或合成产物(包括本文所述物质)的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV进行分选和分离。
单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的核酸检测
如本文所述，本发明所揭示的方法可用于检测多种生物样品中的目的核酸，例如DNA或RNA。举例而言，此类方法可包括如下步骤：将核酸和合成试剂包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中；使单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV达到足以实现核酸扩增的扩增条件；检测核酸扩增反应中生成的扩增产物。扩增条件可包括MDA条件和/或PCR条件，例如RT-PCR条件和/或其他核酸等温扩增条件，包括环介导核酸等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)等。
可通过分选单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV并通过使液滴破裂(例如本文中更加详细描述的化学法、电场法或机械法)来回收其内容物，对目的核酸进行回收。可利用各种适当的分选技术和相关装置对含有扩增产物(包括本文所述物质)的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV进行分选和分离。在一个方面，提供了一种富集目标核酸序列的方法，其中所述方法包括：对样品进行包封，所述样品包括多个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或多个GUV中的核酸；为所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV引入MDA试剂、聚合酶链式反应(PCR)试剂以及适合的引物；在足以实现MDA扩增和PCR扩增的条件下，孵育所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，以分别生成MDA扩增产物和PCR扩增产物，其中适合的PCR引物可包括一种或多种各自与结合了目标核酸序列的一个或多个寡核苷酸杂交的引物，且所述PCR扩增产物不包括完整的目标核酸序列；在孵育之前或之后，为所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV引入检测组分；通过检测组分的检测结果来确定是否存在PCR扩增产物，其中检测组分的检测结果提示了是否存在PCR扩增产物和目标核酸序列；根据检测组分的检测结果对所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV进行分选，其中分选目的是将包含PCR扩增产物和目标核酸序列(存在时)的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV从不包含PCR扩增产物和目标核酸序列的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中分离；从分选出的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中汇集核酸序列，从而形成一个目标核酸序列(存在时)的富集库。在上述步骤中，有一个或多个步骤可在微流控技术下进行。
举例而言，通过上述方法，可根据PCR检测出的序列情况，对异质样品中的DNA分子进行富集。DNA分子可能较短(例如数百个碱基)，也可能较长(例如兆碱基或更长)。可将样品包封在单分散液滴中，以便通过数字手段检测液滴中的目标分子，即每个液滴中含有0个或1个目标分子。然后，可采用荧光染色等方法对单分散液滴进行分选，从而回收目标分子。该方法可用于在DNA片段的异质样品中富集较大的基因组区域，例如长度数量级为兆碱基的区域。
上述方法能够回收足够的DNA，而无需通过PCR来扩增需要测序的DNA。举例而言，当PCR无法保留目的序列或表观遗传因子或者无法回收所需长度(例如，超过约10kb，即长片段扩增PCR的实际限值)的序列时，制备出无需扩增的DNA样品是非常有价值的。
上述方法的另一个用途是对用于表观遗传学测序的DNA进行富集。PCR无法保留DNA上的表观遗传标记，因此对其进行测序时需要采用宿主核酸中未扩增的DNA。利用上述方法，无需进行PCR即可获得足够的DNA用于测序，从而保留了表观遗传标记。
当目标核酸的长度超过长片段扩增PCR的实际限值时(例如当核酸长度超过约10kb时，并且/或者需要在DNA上保留表观遗传标记时)，可专门采用上述方法。在一些实施例中，待富集的目标核酸长度超过约100kb，例如长度大于约1兆碱基。在一些实施例中，待富集的目标核酸长度约为10kb至100kb、约为100kb至500kb或约为500kb至1兆碱基。
完成扩增和/或纯化之后，可采用化学和渗透手段使乳液破碎，以备后续分析。例如，可将等体积的1H，1H，2H，2H-全氟-1-辛醇添加到纯化的样品中，然后通过移液或涡旋操作进行混合。然后，在获得的混合物处于平衡状态后，可对水层进行洗脱，以备进一步分析。类似地，可将大量过量的纯化水添加到分选后的样品中并进行混合，然后在室温下孵育几个小时。然后，可直接对所得混合物中的纯化目标样品进行分析。
多重置换扩增
如上所述，在实施本发明所述方法时，可采用MDA技术对核酸(例如基因组DNA)进行非特异性扩增并且通常不产生偏倚，以便通过下一代测序等方式进行下游分析。
本文所述方法的一个示例性实施例包括：将从生物样品中获得的模板核酸分子包封在单分散液滴(例如，单分散单乳液滴或单分散多乳液滴)中，将MDA试剂和多个MDA引物引入单分散液滴，在能够有效生成MDA扩增产物的条件下孵育所述单分散液滴，其中孵育步骤能使所述模板核酸分子有效地生成MDA扩增产物。在一些实施例中，所述包封和引入步骤是分开实施的，例如，将所述模板核酸分子与MDA试剂和多个MDA引物混合，然后进行乳化，举例而言，乳化方法可采用微流体装置的流动聚焦功能。
本文所述的基于MDA的测定法的条件可发生一种或多种变化。例如，添加到(或包封在)单分散液滴中的MDA引物数量可发生变化。术语“引物”代表一种或多种引物并且指的是寡核苷酸，既包括天然引物(例如限制性内切酶消化后纯化的引物)，也包括人工合成引物。在催化合成核酸链互补的引物延伸产物的条件下，引物会沿着互补链的方向启动核酸的合成。可通过以下方式实现这种条件：在适合的温度下，向适合的缓冲液(“缓冲剂”中包含作为辅助因子或影响pH、离子强度等的取代基)中添加四种脱氧核苷三磷酸和一种聚合诱导剂，例如一种适合的DNA聚合酶(例如Φ29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶)。优选地，应采用单链引物，以便最大程度地提高扩增效率。采用MDA技术时，通常使用随机六聚体引物。
本文采用的核酸序列的互补序列是一种发生“反向缔合”的寡核苷酸，当互补序列与核酸序列对齐时，一个序列的5’端与另一个序列的3’端互补配对。不需要完全互补配对；稳定的二聚体中可能包含不匹配的碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可根据经验确定二聚体稳定性，考察的变量包括寡核苷酸的长度、寡核苷酸中胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的浓度百分数、离子强度以及碱基对错配的发生率等。
可添加至(或包封在)单分散液滴中的MDA引物数量约为1至500个或者更多，例如，约为2至100个、约为2至10个、约为10至20个、约为20至30个、约为30至40个、约为40至50个、约为50至60个、约为60至70个、约为70至80个、约为80至90个、约为90至100个、约为100至150个、约为150至200个、约为200至250个、约为250至300个、约为300至350个、约为350至400个、约为400至450个、约为450至500个或约为500个或更多。
可通过一个或多个步骤将这类引物和/或试剂添加到单分散液滴中。例如，可通过两个或两个以上步骤、三个或三个以上步骤、四个或四个以上步骤或者五个或五个以上步骤来添加引物。在使用裂解剂的情况下，无论通过一个还是多个步骤添加引物，都可在添加裂解剂之后、之前或同时添加引物。当在添加裂解剂之前或之后添加MDA引物时，添加引物的步骤可独立于添加裂解剂的步骤。
将引物添加到单分散液滴中之后，立即在足够进行MDA的条件下孵育所述单分散液滴。可采用与添加引物相同的微流体装置孵育单分散液滴，或者也可在其它装置上孵育。在某些实施例中，采用与细胞裂解相同的微流体装置并在足够进行MDA的条件下孵育单分散液滴。单分散液滴的孵育条件有多种，例如可在恒温(例如30℃)下对单分散液滴孵育约8到16小时。或者，先以25℃孵育5分钟，再以42℃孵育25分钟，如此交替循环。
尽管用本文所述方法生成MDA扩增产物时不需要使用特异性探针，但本发明中的方法也可包括向单分散液滴中引入一种或多种探针。本文中针对核酸使用的术语“探针”通常指的是带标记的寡核苷酸，所述探针中有至少一个序列与目标核酸区域中的一个序列互补，从而与目标核酸中的序列形成了二聚体结构。优选地，所述探针中不包含与触发MDA反应的序列互补的序列。添加的探针数量可能约为1至500个，例如，约为1至10个、约为10至20个、约为20至30个、约为30至40个、约为40至50个、约为50至60个、约为60至70个、约为70至80个、约为80至90个、约为90至100个、约为100至150个、约为150至200个、约为200至250个、约为250至300个、约为300至350个、约为350至400个、约为400至450个、约为450至500个或约为500个或更多。可在添加一种或多种引物之前、随后立即或之后向单分散液滴中引入探针。
在某些实施例中，基于MDA的测定法可用于检测细胞中存在的某些RNA转录物或对一种或多种RNA病毒的基因组进行测序。在这类实施例中，可使用本文所述的任何方法将MDA试剂添加到单分散液滴中。在添加(或包封)MDA试剂前后，可在适合逆转录的条件以及适合MDA的条件(如本文所述)下孵育单分散液滴。可采用与添加MDA试剂相同的微流体装置孵育单分散液滴，或者也可在其它装置上孵育。在某些实施例中，采用与一个或多个细胞包封和/或裂解相同的微流体装置并在适合MDA的条件下孵育单分散液滴。
在某些实施例中，添加到单分散液滴中用于MDA分析的试剂进一步包括能够检测出MDA扩增产物的荧光DNA探针。可使用任何合适的荧光DNA探针，包括但不限于SYBRGreen、
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Molecular Beacons和Scorpion探针。在某些实施例中，添加到单分散液滴中的试剂包括一个以上的DNA探针，例如，两个荧光DNA探针、三个荧光DNA探针或四个荧光DNA探针。使用多个荧光DNA探针可在单次反应中同时测定MDA扩增产物。
PCR
如上所述，在实施本发明所述方法时，可通过基于PCR的测定法检测细胞或异质性核酸样品中存在的某些目的核酸，例如目的基因和/或遗传标记物，如致癌基因等。这类基于PCR的测定法可采用前一个或后一个MDA扩增步骤中相同的单分散液滴，例如单分散单乳液滴或单分散多乳液滴。在其他实施例中，可采用独立的单分散液滴进行PCR反应。此类基于PCR的测定法的条件可发生一种或多种变化。
例如，添加至单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中的PCR引物数量会发生变化。术语“引物”可指多种引物并且指的是寡核苷酸，既包括天然引物(例如限制性内切酶消化后纯化的引物)，也包括人工合成引物。在催化合成核酸链互补的引物延伸产物的条件下，引物会沿着互补链的方向启动核酸的合成。可通过以下方式实现这种条件：在适合的温度下，向适合的缓冲液(“缓冲剂”中包含作为辅助因子或影响pH、离子强度等的取代基)中添加四种脱氧核苷三磷酸和一种聚合诱导剂，例如DNA聚合酶或逆转录酶。优选地，应采用单链引物，以便最大程度地提高扩增效率。
本文采用的核酸序列的互补序列是一种发生“反向缔合”的寡核苷酸，当互补序列与核酸序列对齐时，一个序列的5’端与另一个序列的3’端互补配对。不需要完全互补配对；稳定的二聚体中可能包含不匹配的碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可根据经验确定二聚体稳定性，考察的变量包括寡核苷酸的长度、寡核苷酸中胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的浓度百分数、离子强度以及碱基对错配的发生率等。
可添加至单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中的PCR引物数量约为1至500个或者更多，例如，约为2至100个、约为2至10个、约为10至20个、约为20至30个、约为30至40个、约为40至50个、约为50至60个、约为60至70个、约为70至80个、约为80至90个、约为90至100个、约为100至150个、约为150至200个、约为200至250个、约为250至300个、约为300至350个、约为350至400个、约为400至450个、约为450至500个或约为500个或更多。
这些引物可含有一种或多种目的基因(例如致癌基因)的引物。添加的目的基因引物数量可约为1至500个，例如，约为1至10个、约为10至20个、约为20至30个、约为30至40个、约为40至50个、约为50至60个、约为60至70个、约为70至80个、约为80至90个、约为90至100个、约为100至150个、约为150至200个、约为200至250个、约为250至300个、约为300至350个、约为350至400个、约为400至450个、约为450至500个或约为500个或更多。目的基因和致癌基因包括但不限于BAX、BCL2L1、CASP8、CDK4、ELK1、ETS1、HGF、JAK2、JUNB、JUND、KIT、KITLG、MCL1、MET、MOS、MYB、NFKBIA、EGFR、Myc、EpCAM、NRAS、PIK3CA、PML、PRKCA、RAF1、RARA、REL、ROS1、RUNX1、SRC、STAT3、CD45、细胞角蛋白、CEA、CD133、HER2、CD44、CD49f、CD146、MUC1/2和ZHX2。
可通过一个或多个步骤将这类引物和/或试剂添加到单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中。例如，可通过两个或两个以上步骤、三个或三个以上步骤、四个或四个以上步骤或者五个或五个以上步骤来添加引物。无论通过一个还是多个步骤添加引物，都可在添加裂解剂之后、之前或同时添加引物。当在添加裂解剂之前或之后添加PCR引物时，添加引物的步骤可独立于添加裂解剂的步骤。
将引物添加到单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中之后，立即在适合PCR的条件下孵育单分散单乳液滴或单分散多乳液滴和/或GUV。可采用与添加引物相同的微流体装置孵育所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV，或者也可在其它装置上孵育。在某些实施例中，采用与细胞包封和/或裂解相同的微流体装置并在适合PCR扩增的条件下孵育所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV。所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV的孵育条件有多种。在某些方面，可使含有PCR混合物的单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV流经一个通道，该通道可在适用于PCR的条件下孵育所述单分散液滴。在一些实施例中，进行PCR反应时未使用微流体装置和/或系统。所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV流经的通道可能走行于多种温度区，各个区域维持在适合PCR的温度。这类通道可走行于两个或多个温度区，其中至少一个区域控制在约65℃，至少一个区域控制在约95℃。或者，可采用86℃、60℃和20℃的温度区。当所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV经过这些区域时，它们会接受PCR所需的温度循环处理。为了达到预期的PCR扩增效果，本领域技术人员可自由确定温度区的确切数量以及各区域的温度。
在其他实施例中，孵育所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV时可能会用到Megadroplet Array。在此类装置中，热力系统上方的通道(例如PDMS通道)中，存在一排凹槽，其数量可为几百、几千或几百万个。可通过对通道加压的方式来防止气体逸出。所述微流体通道的高度小于所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV的直径，使单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV呈现出扁平的饼状。当单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV流至空凹槽时，凹槽会在较低的曲率半径下以较低的能耗产生一种拉力，从而将所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV完全拉入凹槽。通过单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV的密集流动，可确保阵列上的所有凹槽都能被液滴占据。可通过加热器对整个装置进行热循环操作。
在某些方面，加热器包括帕尔贴板、散热器和计算机控制装置。帕尔贴板可通过控制施加的电流将芯片加热或冷却至室温以上或以下。为确保温度可控且可重现，计算机可采用集成的温度探测器监测阵列的温度，并可根据加热和冷却的需要来调整施加的电流。在使用金属(例如铜)板时，可在冷却循环期间均匀地加热并散去多余的热量，能够在约一分钟内将装置从约95℃冷却到约60℃。
本发明中的方法还包括将一种或多种探针引入单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV。本文中针对核酸使用的术语“探针”指的是带标记的寡核苷酸，该探针中有至少一个序列与目标核酸区域中的一个序列互补，从而与目标核酸中的序列形成了二聚体结构。在一些实施例中，所述探针中不包含与触发聚合酶链式反应的序列互补的序列。添加的探针数量可能约为1至500个，例如，约为1至10个、约为10至20个、约为20至30个、约为30至40个、约为40至50个、约为50至60个、约为60至70个、约为70至80个、约为80至90个、约为90至100个、约为100至150个、约为150至200个、约为200至250个、约为250至300个、约为300至350个、约为350至400个、约为400至450个、约为450至500个或约为500个或更多。可在添加一种或多种引物之前、随后立即或之后向所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中引入探针。目的探针包括但不限于
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探针(例如以下出版物中所述的探针：Holland，P.M.；Abramson，R.D.；Watson，R.；Gelfand，D.H.(1991)，“Detection of specific polymerasechain reaction product by utilizing the5′-3′exonuclease activity of Thermusaquaticus DNA polymerase”，PNAS，88(16)：7276-7280)。
在某些实施例中，基于RT-PCR的测定法可用于检测细胞中存在的某些目的转录物，例如致癌基因。在此类实施例中，除了添加实施本文所述PCR所需的试剂外，还向单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中添加了cDNA合成所需的逆转录酶和任何其他试剂(统称为“RT-PCR试剂”)。使用本文所述的任何适当方法将RT-PCR试剂添加到单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中。将RT-PCR试剂添加到单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中之后，立即在适合逆转录的条件下以及适合PCR的条件(如本文所述)下孵育单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV。可采用与添加RT-PCR试剂相同的微流体装置孵育所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV，或者也可在其它装置上孵育。在某些实施例中，采用与细胞包封和/或裂解相同的微流体装置并在适合RT-PCR的条件下孵育所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV。
在某些实施例中，添加到所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中用于RT-PCR或PCR的试剂进一步包括能够检测出RT-PCR或PCR产物的荧光DNA探针。可使用任何合适的荧光DNA探针，包括但不限于SYBR Green、
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Molecular Beacons和Scorpion探针。在某些实施例中，添加到所述单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中的试剂包括一个以上的DNA探针，例如，两个荧光DNA探针、三个荧光DNA探针或四个荧光DNA探针。使用多个荧光DNA探针可在单次反应中同时测定RT-PCR或PCR产物。
双重PCR
为了对极少量的转录物进行扩增，可使已经接受第一步RT-PCR或PCR反应(如本文所述)的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV接受第二步PCR反应。在一些实施例中，将已经接受第一步RT-PCR或PCR反应的第一个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV包封在含有其他PCR试剂的第二个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，这些试剂包括但不限于酶类(例如DNA聚合酶)、DNA探针(例如荧光DNA探针)和引物。然后，再使所述第一个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV发生破裂。在某些实施例中，含有其他PCR试剂的第二个单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的粒径大于已经接受第一步RT-PCR或PCR反应的单分散液滴。这种粒径差异可能是有益的，原因之一是可能抑制第二步PCR的细胞成分可在这种条件下发生稀释。在进行所述第二步PCR反应时，可采用与所述第一步反应相同或不同的微流体装置，也可不使用微流体装置。
在一些实施例中，所述第二步PCR反应所使用的引物与所述第一步RT-PCR或PCR反应所使用的引物相同。在其他实施例中，所述第二步PCR反应所使用的引物与所述第一步反应所使用的引物不同。
数字PCR
可采用本文所述的方法对核酸进行定量，例如数字PCR。进行数字PCR时，需要对溶液中的目标核酸进行稀释，因此当样品分散在隔室中时，大多数的隔室可包封零个或一个目标分子，但只要能对样品进行建模，通常都能实现较高的上样率。隔室中还包含了足以使目标核酸扩增的试剂，并且隔室所处的条件适合扩增反应。隔室可具有多种结构，包括底物或单乳液滴中形成的微孔。如本文所述，这些隔室也可形成单分散单乳液滴、单分散多乳液滴(例如双乳液)和/或GUV等。在一些实施例中，样品被包裹在所述单分散单乳液滴、单分散多乳液滴(例如双乳液)和/或GUV的隔室内，并且诉搜狐单分散单乳液滴、单分散多乳液滴(例如双乳液)和/或GUV处于扩增条件下。对含有目标核酸的液滴进行扩增，而不含目标核酸的不进行扩增，因此后者不生成核酸扩增产物。如果包括检测组分，则包括目标核酸的单乳液或多重乳液可能会布满可检测信号，使其可通过影像检查或流动液滴学等进行鉴定。使用双乳液进行此数字PCR的强大优势在于，可将双乳液悬浮在与已分配样品可混溶的水性载相中，因此可以使用市售流式细胞仪和荧光激活细胞分选仪(FACS)进行有效的检测和/或分选。这种操作可对来自样品的目标分子进行富集，而对于其他难以实施分选的方法，这一点无法实现。
在一些实施例中，大多数情况下都可采用本发明所揭示的方法，通过计算单乳液滴或多乳液滴的比例来对核酸进行定量，被计数的液滴是发荧光且接受过扩增的液滴，因此会包含至少一个目标核酸；扩增过程中可能因随机性因素发生错误，例如包封了影像扩增反应特异性的粉尘或其他污染物。还可包括
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探针、分子信标、SYBR和其他类型的检测组分，从而允许使用多个光谱同时检测目标分子中不同核酸序列的扩增情况。或者，当多个目标分子被包封在相同的单分散单乳液滴、单分散多乳液滴(例如双乳液)和/或GUV中时，在某些情况下采用上述检测组分可能是有利的。
像其他PCR分析方法一样，可使用带有不同荧光染料标记的探针进行多重dPCR分析。由于dPCR针对的是液滴中的分子，因此检测的专一性高，这是普通方法无法实现的，例如不同序列的物质关联。这对于基因组生物学的各类重要应用领域都是有价值的，包括表征病毒多样性、定相微生物基因组、癌症基因组的单倍型分析、测定mRNA剪接形式以及表征溶液中目标分子的长度分布。
RNA测序(RNAseq)
本发明所揭示的方法可用于单个细胞的包封和RNAseq。RNAseq利用了下一代测序(NGS)技术实现的大规模并行测序，这是计数组织样本中RNA转录物的另一种方法。具体来说，RNAseq可用于研究基因表达变化、可变剪接事件、等位基因特异性表达和嵌合转录物等现象，包括基因融合事件、新型转录物和RNA编辑。可从单分散乳液中回收互补DNA(cDNA)，并针对NGS进行标准体外转录和文库制备，从而收集单个细胞基因表达谱的分析数据。
本文提供了一种单细胞RNA测序方法，所述方法包括：将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，所述第一液体中包含多个细胞；将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包含所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个细胞的单分散液滴。此方法可包括本文所述的细胞裂解步骤，例如本文所述的外肽酶和/或内肽酶裂解步骤(例如蛋白酶K裂解步骤)。例如，可向细胞中添加外肽酶和/或内肽酶(例如具有广泛底物特异性的外肽酶和/或内肽酶，包括蛋白酶K等非特异性丝氨酸蛋白酶、地衣芽孢杆菌来源蛋白酶[例如CAS 9014-01-1]或OB蛋白酶[购自Omega Bio-Tek])，可在没有去污剂的情况下，在将细胞包封至单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV之前和同时，向细胞中添加上述酶。为了确保在细胞包封之前或过程中外肽酶和/或内肽酶未处在活化状态，可在足够低的温度下添加外肽酶和/或内肽酶，例如约为0℃至25℃，包括约1℃至5℃、约1℃至10℃、约1℃至15℃、约1℃至20℃以及约1℃至25℃。在一些实施例中，可在约4℃时添加外肽酶和/或内肽酶。随后，可将单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的温度升高至足以确保外肽酶和/或内肽酶活化的温度，例如37-80℃(如30-50℃、37-55℃、40-60℃、50-60℃、60-70℃或70-80℃，以促进蛋白酶K的活化和细胞的裂解。蛋白酶K的孵育时间应足以实现细胞的裂解，例如15-60分钟(也可酌情延长时间)、15-20分钟。然后，可使乳液液滴破裂并根据需要洗掉外肽酶和/或内肽酶，例如蛋白酶K。可通过任何适当的方法和试剂，在单分散液滴中捕获细胞裂解后释放的用于测序的RNA，例如在乳液破裂前。举例而言，可将功能化的RNA捕获珠子(例如Drop-seq微珠，购自ChemGenes Corporation)与细胞一同包封在单分散液滴中。在一些实施例中，可将这种功能化的RNA捕获珠子直接并入到模板颗粒中。例如，可将功能化的RNA捕获珠子包封在合适的聚合物(例如水凝胶)材料中，例如以双(丙烯酰)胱胺作为交联剂用于合成聚丙烯酰胺微珠的BAC聚丙烯酰胺水凝胶。
测量核酸长度
本文所述的方法可用于测量溶液中核酸的长度分布。为了实现这一目标，可设计出在目标核酸长度上不同区域退火的探针序列，并且这些区域间的距离已知。然后，可将探针与目标核酸混合，并包裹在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的隔室内。每个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV可包含两个引物和探针组合，它们释放出的信号会提示是否存在目标核酸上距离已知的两个不同区域。可采用不同的探针组合重复上述操作，以便通过不同的配对方式探测出目标分子中的不同距离和不同区域。如有需要，可对样品进行扩增、分析和分选。在分析过程中，会发现某些单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV仅在一种探针作用下发生扩增，而其他液滴可能仅在另一个探针作用下发生扩增。这说明在这些单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，一类液滴中包含的核酸区域只能结合一个探针，而另一类液滴中包含的区域只能结合另一个探针。在该液滴群中，也可能存在着受两个探针作用发生扩增的单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，说明液滴中的目标核酸包含两个区域。同一混悬液中会包含大量的单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，并且这三种液滴中每种液滴的比例都是可以测定的。除此之外，混悬液中当然也包含未发生扩增的液滴，推断这些液滴中不包含目标区域。该数据可用于推断溶液中核酸的长度。
例如，如果溶液中的核酸从整个分子角度看基本是完整的，则大多数接受扩增的液滴将同时在探针和引物的作用下发生扩增，并释放出混合信号。相反，如果目标核酸高度片段化，则大多数的液滴会反映出一个或另一个探针的检测结果，而只有极少数的液滴会呈现出两个探针的结果。由于探针之间的距离是已知的，因此可以估算溶液中分子的长度和碎片化程度。可采用靶向不同区域和/或二者间距离不同的不同探针组合重复上述过程，从而更充分地表征目标核酸的片段化程度。
单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中用于序列分析的微流体富集(MESA)
可通过本文所述的方法对目标核酸进行用于序列分析的微流体富集。实现这一目的的方法是：将目标核酸包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，然后对这些液滴进行扩增，含有目标序列的液滴会产生荧光信号。然后，可对这些液滴进行分选，以便在分选池中富集核酸。如有需要，也可采用多重分析来区分出含有多种不同子序列的分子。为了便于测序，也可在分选之前、同时或之后对分选的核酸进行扩增。
这种方法的核心优势在于，液滴中被扩增的区域可仅用作“检测区域”，即扩增子不需要包括接受测序的分子。但是，当液滴中存在目标分子时，扩增子会释放信号，从而可回收整个分子用于下游分析。这项强大的技术可为下游分析回收到较大的核酸，甚至能回收到分子过大而无法有效扩增的核酸。例如，假设在尚未被发现的微生物中存在着与重要生物学通路有关的基因，例如信号级联通路。该技术的目标是对编码该通路相关蛋白质的基因进行回收，以便对其测序和研究。由于无法对未知的微生物进行特异性培养，因此很难通过现有的富集方法实现这一目标。此外，由于探针杂交的序列除个别基因外尚不清楚，而这些基因可能太小而无法富集到整个通路，因此无法使用杂交探针来纯化大部分序列未知的通络。然而，可通过本文所述的MESA方法来实现这一目标。
在一些实施例中，可将目标分子中提取的核酸切割成足够包封整个通路的片段，例如长度为数十或数百个千碱基对，甚至是长度为兆碱基或更长的片段。如果这个片段包含了整个通路，那么就可能含有已知基因。大多数核酸片段是不包含目标分子的，采用本文中所述的技术对核酸片段处理后，产生单分散单乳液滴，这些液滴在大多数情况下不包含富集通路，因此未发生扩增，而会有极少数的液滴中包含富集途径并发生了扩增。然后，可采用FACS对发荧光的双乳液滴进行分选，从而回收发生扩增的液滴。然后，可进一步处理这些液滴。举例而言，在必要时，可进行特异性和非特异性扩增、通过数字或定量PCR进行定量以及DNA测序。与其他富集策略相比，MESA的强大优势在于，该技术可基于较短的已知序列(数千个碱基对)检测并且回收非常大的核酸，甚至是整个基因组大小的核酸。在这种序列信息有限的情况下，其他富集方法基本上不能从大小不均的多个序列中富集出这种较大的核酸序列。
该方法还可用于鉴定单个基因组的DNA序列。在该实施例中，可将目标分子中提取的核酸切割成片段并与PCR试剂和目的DNA序列的特异性引物一同包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中。扩增后，可通过FACS或MACS将发生扩增的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV分选到区室中，例如微孔板阵列。然后，可对各个区室进行进一步操作，例如特异性或非特异性扩增。然后，可利用所得的扩增子制备下一代测序技术的基因文库，或直接将其用作桑格测序的材料。举例而言，采用桑格测序法，可有效鉴定出个体患者体内逆转录病毒群(例如HIV)的遗传学差异。
如上所述，本文中所述的方法可用于数字PCR以及相关的用于序列分析的微流体富集(MESA)。在一些实施例中，将包括核酸、病毒、细胞、颗粒等的样品分配到本文所述的单乳液或多重乳液。将液滴收集到PCR管等容器中，并在适合扩增的条件(例如热循环)下进行孵育。也可采用等温扩增的方法，例如MDA、MALBAC、LAMP等。可将荧光报告分子包括在液滴中或添加到载相中，从而使含有目标核酸的液滴与不含目标核酸的液滴之间产生荧光强度的差异。
例如，可向载相中添加SYBR Green，使其分配到单乳液或多重乳液中。由于Sybr染料在与双链DNA结合后会发出更强的荧光信号，因此发生扩增的液滴会比未发生扩增的液滴释放出更强的荧光。为了量化样品中的目标分子，可对液滴进行流式细胞术分析，甚至可进行荧光激活细胞分选(FACS)。
当液滴经过流式细胞仪时，仪器可记录有关液滴大小和荧光强度的信息。在通过有限稀释法对目标分子上样后，一些液滴会因为含有目标分子而发荧光，而其他液滴会因为不含目标分子而发暗。可根据泊松分布原理，利用发亮与发暗液滴的比例来估算原始样品中目标分子的起始浓度。通过FACS根据荧光强度对液滴进行分选后，可以回收含有目标分子的双乳液，而使双乳液破裂后可回收目标分子。这种方法可用于较大异质核酸群体的筛选，从而有选择地回收目标序列。在适当的情况下，在实施上述方法时，也可用GUV来代替多乳液滴。
单乳液滴、多乳液滴和/或GUY中的PCR激活细胞分选(PACS)
MESA技术能够从溶液中富集裸核酸，但是对于实体内包含的核酸(例如细胞、病毒、孢子、颗粒等)也可采用类似方法，操作过程基本相同。举例而言，可将包括目标核酸的实体包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，并且使这些液滴处于足以扩增目标核酸的条件，如上所述。然后，可根据扩增的结果对所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV进行分选，以便回收含有目标核酸的实体。
当该技术应用于生物实体，特别是有膜或保护壳的生物实体(例如细胞)时，一个重要的考虑因素是，为了能进行特异性检测，核酸必须可接触到扩增试剂，这可能需要专门的操作流程。例如，可将实体与释放核酸的试剂(例如蛋白酶、溶菌酶、去污剂、强碱等)一同包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中。也可先将实体包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，然后浸泡在含有裂解剂的溶液中，裂解剂可分割开单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的外壳，从而诱导裂解。例如，也可将实体包封在可浸泡于裂解剂的凝胶颗粒中。然后，将这些含有实体内核酸的凝胶颗粒包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，以便在扩增步骤中进行检测。举例而言，为了使凝胶不抑制细胞裂解或扩增反应，可按照以下标准选择凝胶：保证足够大的孔径，使试剂在捕获核酸的同时可穿过凝胶，或者在加热单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的过程中可使凝胶融化，就像使用琼脂糖时的表现一样。如有需要，还可对凝胶进行功能化处理，使其粘附RNA分子等所需的细胞化合物，反之，这些化合物可能从凝胶中漏出，导致无法检测。可使合成试剂接触到目标核酸的另一种方法是通过电流裂解细胞、病毒、颗粒等，因为这些物质被包封在了单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中。举例而言，要实现这一目的，可使细胞流经通有电流的通道，这样做可在细胞膜上打孔并促进细胞裂解等。
活细胞PCR激活细胞分选(PACS)
如本文所述的乳液PCR操作和细胞分选过程中涉及到细胞裂解，在大部分情况下，这会导致生物体死亡。然而，通过对技术进行改进并采用本文所述的方法，也可能回收到完整的活细胞。举例而言，可通过以下方法实现这一目标：将活细胞包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，其操作条件是在保持细胞活力的同时使细胞内容物渗入到用于包封的单分散单乳液滴、单分散多乳液滴和/或GUV中。举例而言，若要实现这一目的，可使细胞流经通有电流的通道，这样做可在细胞膜上形成小孔，从而使细胞裂解产物渗出。当细胞经过此通道后，细胞膜可重新封闭，而渗出的裂解产物仍会存在于细胞周围。在层流条件下，这种操作可使细胞周围的裂解产物随细胞一起流动并包封在同一区室中，例如单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中。也可以向液滴中添加适用于细胞核酸扩增的试剂或用于检测其他细胞组分的试剂，这样可使细胞周围的裂解产物在进入液滴时与这些试剂发生反应。该反应可设计如下：通过产生荧光信号，使含有目标细胞的滴液在分选过程中回收，并且可回收到活细胞。这项技术的强大之处在于它发挥了PACS的优势，即能够根据分子和RNA等序列标记物对细胞进行区分，同时还能保留细胞活力以便进行其他反应和分析。
质谱法激活细胞分选(MS-ACS)
在一些实施例中，本文所述的方法依赖于以下能力：在单分散单乳液滴、多乳液滴(例如双乳液滴)和/或GUV中进行区室反应；检测单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的反应产物；根据其产物对液滴和/或GUV进行分选，回收特定的实体并进行适合的分析。可采用多种测定方法对不同的实体(例如细胞和病毒)进行区分，例如酶法(PCR等)。但是，在某些情况下，酶法可能无法检测到目的分析物。在这些情况下，可采用其他方法，例如光谱法。质谱法是一种非常强大的检测方法，因为此方法具有通用性且敏感度高。但是，质谱法的局限性在于该技术具有破坏性，会破坏其分析的样品。如果分析目标仅仅是回收信息，那这种方法是可接受的，但在某些情况下，还需要从系统中回收那些通常会被质谱仪破坏的材料。
在使用本文所述的方法时，质谱法不仅可以分析样品，还可以回收样品。例如，假设分析目的是鉴别出表达某通路相关蛋白质的细胞。可将这些细胞引入单分散单乳液滴、多乳液滴(例如双乳液滴)和/或GUV中并进行培养，使得每个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中都会存在多个细胞，并且/或者会使细胞生成通路产物，例如分子、化合物等，这些产物会存在于单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中。然后，可将单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV引入分析装置中，该装置将分离出一部分单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，从而对接受了破坏性质谱分析的细胞或细胞分泌物中的部分物质进行捕获。然后，可对其他未分离的液滴进行分选。质谱仪可对采样部分中的化合物进行分析，可根据其分析结果确定另一部分液滴的分选方式。采用这种方法，可通过灵敏度高且具有通用性的质谱法对细胞进行特异性分选，同时还可回收完整的细胞或细胞裂解产物。
细胞集落的生长和裂解
将细胞包封在单分散单乳液滴、多乳液滴(例如双乳液滴)和/或GUV中的能力对于生物体(如细胞和病毒)的培养非常有价值。例如，如果细胞在统一的等体积环境中生长，细胞间的竞争可能导致整个细胞群中某些细胞生长速度较快，那么在培养一段时间后，这些细胞就会占据群体中的大部分。通过将细胞包裹在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV形成的区室内，然后进行培养，可以控制和/或减轻细胞间的竞争。此外，可对单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的渗透性进行设计，使某些分子能够通过液滴而其他分子则不能通过。举例而言，这种情况下，信号传递分子或其他对细胞生长有重要意义的分子能够自由穿透单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的外壳，以便更好地控制培养条件。
多路复用技术
在标的方法的某些实施例中，可针对特定细胞检测和分析多种生物标记物。检测到的生物标记物可能包括但不限于细胞基因组中的一种或多种蛋白质、转录物和/或遗传学标记物或其组合。利用标准的荧光检测方法时，可同时分析的生物标记物数量可能取决于在每个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中观察到的独立荧光染料的数量。在某些实施例中，可增加特定单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV内可单独检测的生物标记物的数量。举例而言，为实现这一目的，可使染料分散到单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的不同区域。在特定的实施例中，可将与染料和探针(例如核酸或抗体探针)偶联的微珠(例如
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微珠)包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中以增加待分析的生物标记物的数量。在另一个实施例中，可利用荧光偏振技术为单个细胞的不同生物标记物产生更多的可检测信号。例如，可将荧光染料附着到各种探针上，并在不同的偏振条件下观察单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV。这样，便可利用同种颜色的染料对单个细胞的不同目标探针进行标记。使用固定细胞和/或透化细胞(下文提供了更详细的讨论)还可提升多路复用的水平。例如，可利用标记后的抗体靶向由细胞组分定位的目标蛋白，而标记后的PCR和/或RT-PCR产物在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中是游离的。在这种条件下，可采用相同颜色的染料标记抗体和RT-PCR的扩增子。
数字酶联免疫吸附试验(ELISA)
在一些实施例中，可结合本发明所揭示的方法和装置，采用数字ELISA技术定量某样品中的抗原表位。举例而言，在一些实施例中，固体基质上结合的抗原表位(如平面底物的表面或微珠表面的抗原表位)还可与带有酶催化剂标记的亲和试剂相结合。可通过清洗样品来除去未结合的亲和试剂以及酶类。然后，可通过多种方法使标记后的抗原表位或其中一部分抗原表位释放到溶液中。为了便于操作，可使酶催化剂与亲和试剂相连接，而这种连接方式可通过化学法或加热、光照等方式分解。另一种方法是破坏亲和试剂与抗原表位之间的相互作用，或者也可破坏抗原表位和底物之间的相互作用。如果抗原表位与微珠相结合，那么可在完成清洗步骤后使微珠悬浮在溶液中，从而使酶催化剂悬浮。然后，可将悬浮的酶催化剂与足以检测出酶催化剂的试剂(例如在酶催化剂作用下可转化成荧光产物的底物)一同包封在单分散单乳液滴、多乳液滴(例如双乳液滴)和/或GUV中。然后，可在适合催化的条件下孵育所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，从而在有催化剂的情况下使所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中含有大量反应产物，而在没有催化剂时反应产物量少。然后，可确定发荧光的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的数量并将其与发暗的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的数量进行比较，从而测定样品中催化剂分子的数量。然后，可通过获得的信息来推断原始样品中抗原表位的浓度。
采用本文所述的多路复用方法，也可在结合后不清洗样品的情况下实现上述目标。举例而言，可将检测相同目标物质的两种抗体引入样品，每种抗体标记不同的催化剂。然后，可将样品包封在单分散单乳液滴、多乳液滴(例如双乳液滴)和/或GUV中。如果存在目标物质，那么在许多情况下，该目标物质都应同时与两种抗体相结合，就像常用的“夹心法”ELISA的情况一样，除非以下情况除外，即分子可在溶液中自由扩散而不与基质相结合。最后溶液中将形成有时仅含有含一种抗体或同时含有两种抗体的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，可通过监测液滴中的催化剂反应来检测目标物质。如果通过适当控制稀释度使大部分液滴中不含目标物质，那么当同时检测出两种催化剂产物时，则认为液滴中可能存在目标物质，而只检测出一种催化剂产物时，很可能是因为其中一种抗体未与目标物质相结合。通过确定双阳性液滴的比例，可估算出溶液中目标物质所占的比例并且无需实施清洗操作。
数字寡核苷酸联接免疫吸附试验(dOLISA)
本文所述的方法可对RNA分子进行高灵敏度检测和绝对定量分析。受关注的测定方法还包括但不限于Chang等，Methods.378(1-2)，102-15(2012)中描述的方法，该出版物中的内容以引用方式并入本文。此方法适用于极低浓度的分析物，其结合特征可能不符合典型免疫测定法或ELISA平台的结果。理论分析说明了在一组实验参数中可预期获得的性能指标(检测灵敏度、检测速度等)。
该方法涉及到了目标蛋白分子与微珠表面偶联抗体的结合。平衡状态下结合的蛋白数量(捕获效率)通过解离常数KD确定，该参数设定了捕获效率的上限。结合反应是由结合速率常数与解离速率常数(kon和koff)决定的动态过程，可通过对动力学微分方程的数值分析来模拟系统内变量随时间的变化。在不受任何理论束缚的情况下，结合动力学主要取决于kon值，而KD值对的影响可忽略不计。如果可以结合更高浓度的抗体，则可改善缓慢的动力学过程。
在一些实施例中，kon速率常数提示了为达到所需检测效率而需要的孵育时间。在使用dOLISA时，第二抗体会与DNA寡核苷酸偶联。将三元复合物(Ab-Ligand-oligoAb)包封到10-1,000万个液滴中，例如单分散单乳液滴(每个体积为5-50pL)，使每个液滴中含有单个DNA模板分子，然后在添加荧光试剂的条件下对液滴进行PCR扩增并计算释放荧光信号的液滴的数量。
通过PTE技术形成核壳微凝胶
本发明提供了使用PTE技术生成核壳微凝胶的方法。这类方法的通常包括：将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，所述第一液体中包含多个目标颗粒和一种聚合物组分；将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体和聚合物组分互不相溶；所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包含所述第一液体、被聚合物组分外壳包裹的单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。
新形成的外壳能够保留生物材料和试剂，从而拓宽了即时乳化技术的适用范围。在一些实施例中，可在剪切后形成外壳。在一些实施例中，可通过在适合的温度下孵育，使聚合物部分的外壳固态化，例如在约0℃到25℃的温度条件下，包括约1℃到5℃、约1℃到10℃、约1℃到15℃以及约1℃到20℃。在一些实施例中，使用的孵育温度为4℃。
在实施这类方法时，可通过基于亲和力的颗粒模板乳化技术(如本文所述)与靶向分析结合使用。例如，在一些实施例中，可采用抗体或核酸捕获试剂(例如寡核苷酸)等捕获剂实现模板单分散颗粒的功能化。
分选
在实施本文所述的方法时，可采用一个或多个步骤进行分选。受关注的分选方法包括但不限于涉及使用以下装置或技术的方法：隔膜阀、分叉通道、表面声波、选择性聚结、介电泳力偏转法、液流控制法和/或其他使单分散液滴发生选择性偏转的其他刺激方法。受关注的分选方法还包括Agresti等，PNAS vol.107，no 9，4004-4009中描述的方法；该出版物中的内容以引用方式并入本文。可通过分选技术对液滴群进行富集。分选时，可通过除去无期望属性的成分来富集含有多种有或无期望属性的成分的液滴群，从而富集出具有期望属性的液滴群。
可在实施本文所述的任何步骤之前或之后进行分选。此外，可通过两个或更多步骤对液滴(例如，单分散液滴和/或GUV)进行分选，例如2个或更多分选步骤、约3个或更多、约4个或更多或约5个或更多等。当进行多步分选时，这些步骤可基本相同或存在一种或多种差异(例如，根据不同属性分选、采用不同技术分选等)。
对于包括按照本文所述方法制备的单分散液滴在内的液滴，可根据一种或多种属性进行分选。目的属性包括但不限于粒径、粘度、质量、浮力、表面张力、电导率、电荷、磁性、荧光和/或是否存在一种或多种组分。在某些方面，分选操作在某种程度上至少应基于单分散液滴中是否存在细胞。在某些方面，分选操作在某种程度上至少应基于能否检测出核酸扩增产物(例如扩增或合成产物)，如检测出荧光扩增产物；或检测出扩增产物上的表面抗原。
举例而言，可通过单分散液滴的分选来除去不含细胞的单分散液滴。包封时可导致一个或多个单分散液滴(包括大多数单分散液滴)中不含细胞。如果将这种不含细胞的单分散液滴留在系统中，这些液滴的处理方式会与任何其他单分散液滴相同，处理时会浪费试剂和时间。为了实现速度和效率的最大化，可通过对单分散液滴的分选来除去这些不含细胞的单分散液滴。举例而言，在操作液滴制备装置时，液滴大致从滴入状转变为喷射状，因此在不含细胞的情况下会形成直径为8μm的液滴；相反，当存在细胞时，液流会产生干扰，导致射流分裂，形成直径为25μm的液滴。因此，该装置可产生两组分散的液滴群，其中不含细胞的液滴直径为8μm，含单个细胞的液滴直径为25μm，然后可采用水流动力分选仪等装置根据直径分选液滴，并仅回收直径较大且含有单个细胞的液滴。
受关注的被动式分选仪包括水流动力分选仪，该装置根据直径将单分散液滴分选至不同的通道内，并且直径较小和较大的单分散液滴会沿着不同的路径穿过微流体通道。还可考虑使用批量分选仪，举例而言，该装置可简单地设计成重力场中含有不同质量单分散液滴的试管。通过离心、搅拌和/或振荡试管中的物质，较轻的单分散液滴浮力更大，会自然地迁移到容器的顶部。可通过类似的方法对有磁性的单分散液滴进行分选，但向容器施加磁场的情况除外，因为在这种情况下有磁性的单分散液滴会根据磁场强度进行迁移。本部分所述方法中使用的被动式分选仪也可能包括相对较大的通道，这些通道同时也会根据流动性分选出大量的单分散液滴。
此外，还可利用皮量注入技术改变单分散液滴的电性质。例如，可通过添加离子来改变单分散液滴的电导率，然后可根据其电导率利用介电泳力等方式进行分选。或者，也可利用皮量注入技术使单分散液滴带电。为实现这一目的，可将带电的液体注入到单分散液滴中，注入后便会使单分散液滴带电。这种情况下，所形成的单分散液滴中有一部分带电而其他不带电。然后，可使这些液滴流经电场区域，从而提取出带电的单分散液滴，在电场中液滴会根据带电量发生偏转。通过调节皮量注入的设置来改变液体的注入量，或者通过调节电压使固定注入量的液体产生不同的电荷量，可对单分散液滴的电荷量进行调节，从而生成电荷量不同的单分散液滴。然后，液滴会在电场中发生不同程度的偏转，使其可被分选至不同的容器中。
在本文所述的任一方法中，流式细胞术(FC)可替代芯片上单分散液滴分选法。Lim和Abate，Lab Chip，2013，13，4563-4572中对这类方法以及实施此方法时采用的装置进行了描述；该出版物中的内容以引用方式全文并入本文并用于所有目的。简言之，可采用本文所述的液滴分裂和皮量注入等技术制备和处理单分散液滴，从而制备出单乳液滴。然后，可采用本文所述的一种或多种装置或Lim和Abate，Lab Chip，2013，13，4563-4572中的装置对这些单乳液滴进行双重乳化，以制备本文所述的多乳液滴和/或GUV等。然后，可通过FC(例如FACS)分析双乳液滴。
本文所述方法制备的液滴(例如单分散单乳液滴或双乳液滴和/或GUV)在经过包封后，可进行多种化学和生物学反应，包括酶促反应(例如PCR)等。在多数情况下，反应的结果可能是需要检测的产物。此外，可预期回收具有不同水平产物的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，也可能同时回收多种产物。本发明可通过多种途径实现这一目标。例如，可将单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV作为反应器，实现分区式的反应，使不同的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV在不同的水平上发生反应并具有不同的最终产物浓度。然后，可采用光谱技术(例如光学或荧光成像)、流式细胞术、拉曼光谱分析法、质谱法等技术深入研究单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV。这些方法或其组合可用于确定单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中不同化合物的浓度。在实施这些方法时，可结合单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV的分选机制，例如，双乳液滴的分选方式可包括微流体装置分选或流式细胞术。可对经过正选和负选的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的内容物进行分析，鉴定出这些分选池的各种属性。
此外，在某些情况下，可能需要将正选液滴分别上样至独立的板孔中用于进一步研究，以便对每个液滴额外进行详细的个体化分析。作为非限制性实施例，本文所述的方法和装置可用于深入研究含有特异性核酸序列的病毒。举例而言，可将异质性群体来源的病毒以及足以实现细胞裂解和目标核酸扩增的试剂一同添加到单分散单乳液滴、多乳液滴(例如双乳液滴)和/或GUV中。然后，可对所述单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV进行分析和分选(例如，对双乳液滴采用流式细胞术)，从而对发生目标核酸扩增的所有液滴进行检测和回收。例如，可将这些液滴分选至一个正选池中或将液滴分别分选至微孔板阵列的板孔中。如有需要，可将液滴按照具体的组别上样，使阵列上的每个板孔中含有所需正选部分的组合，这些正选液滴可能完全相同，也可能存在不同的扩增目标物质。然后，可对分选液滴进行其他分析，例如质谱分析或下一代测序。
在合并分析的情况下，上样至正选容器中的所有细胞的核酸将混合在一起并进行整体分析。但是，将液滴单独上样到板孔中后，便可单独分析每个板孔中的内容物，例如在合并液滴和测序前对每个板孔中的核酸贴条形码。举例而言，这种操作可实现目标种群中单个病毒基因组的裂解，不仅可以检测目标种群，还可以回收单个基因组，从而可对同一种群的不同病毒进行比较。这种分析方法对于宏基因组学等多种领域或病毒多样性的研究非常实用。
在本发明的一些实施例中，除了以检测为目的的扩增外，还需要对目标分子进行扩增，以实现对分选的目标核酸进行其他分析等。举例而言，在一些应用中，目标分子中将包括测序所需的核酸，但目标分子中的核酸量过少而导致无法测序。在这些情况下，可在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV进行分选之前或之后实施扩增，例如特异性PCR和/或非特异性多重置换扩增。举例而言，对于具有相对较小的线性基因组的病毒(例如脊髓灰质炎病毒或HIV)，可在分选之前或之后进行PCR，以便在分选后对每个基因组生成足够的拷贝数用于测序分析。例如，可将单个基因组包封在液滴中，然后对整个或部分基因组进行扩增。在此扩增反应同时或之后，可通过额外的扩增反应鉴定单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中的基因组，并根据此信息对单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV进行分选。此时分选出的单乳液滴或多乳液滴含有大量的目标核酸拷贝，可更有利于后续的分析。
另一种方法是，对单个基因组包封并以检测为目的进行扩增，举例而言，这样可使每个正选单分散单乳液滴、单分散多乳液滴和/或GUV中只包含一个全长目标核酸的拷贝并在较小检测区域内产生大量扩增子。可根据这些扩增子的情况，将单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV回收为一个整体，从而使每个正选粒子中包含一个全长目标基因组的拷贝。为了制备测序文库，可采用特异性PCR扩增这些正选基因组，这些PCR带有目标区域的侧翼引物。另一种方法是，通过非特异性方法扩增整个基因组，例如多重置换扩增(MDA)或多重退火环状循环扩增(MALBAC)。此外，如果不合并正选的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，例如，如果将正选的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV分选到微孔板阵列中，然后使用带有目标区域侧翼引物的特异性PCR进行扩增，所得的每个扩增子可直接用作桑格测序的材料。
本文所述方法和装置的强大优势在于：能够进行大量独立且分散的反应，然后应用各种光谱技术来检测反应产物并在分选后回收发生过所需反应的特定反应器。在实施本发明的方法时，可能存在的难点在于：在某些情况下，进一步分析中所需要的正选粒子数量可能极少。举例而言，如果通过本发明的方法从含有多种病毒的大型病毒群体中检测某种特定的病毒，而待检测病毒水平很低，那么为了回收到特定的病毒，可能需要对大量的个体病毒进行分析。此外，如果需要回收种群中的多个实体，则可能需要分析的总病毒数量更多。由于本发明的方法可进行的反应次数以及分选次数有限，因此可能出现目标物质过少而导致检测可靠性不高的情况。
在某些情况下，可通过本文所述的方法进行分层分选，以便回收极其稀少的粒子，每一轮分选都能获得富集因子。通过对样品进行反复分选，可以富集样品中的目标物质，从而使目标物质的总富集量为所有单次富集量相乘的结果。举例而言，假设本文所述的系统能够产生、分析和分选至多一百万个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV。在理想条件下，这意味着通过直接使用系统不太可能检测到粒子，例如，从十亿个粒子中检测出一个粒子。但是，通过进行分层分选并在每一轮分选时富集目标物质，则可回收这些稀少的粒子。
例如，在第一轮中，可在一百万个单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中分离出100亿个待检测实体，使每个液滴和/或GUV包含约10,000个实体。如果目标实体以十亿分之一的比例存在，那么在这类的样品中，最多会有10个含有目标物质的单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，并将其确定为正选粒子。对这些粒子进行分选后，每个可提供10,000个实体，产生的实体总数为100,000个，其中有10个所需实体发生混合。在某些情况下，这种富集程度就是充分的，但在另一些情况下，可能需要进一步富集，甚至达到100％的纯度。在这种情况下，可采用分层分选的方法，将100,000个实体装载到100万个液滴中，例如，每10个液滴中就有1个液滴包含1个实体，液滴的装载符合泊松分布。在这种情况下，大多数被确定为目标物质阳性的液滴将仅含有该目标实体，但由于泊松分布的上样方式具有随机性，有些液滴还将包含恰好也被阳性液滴包封的阴性脱靶实体。
当对一百万个液滴进行分析和分选时，将再次确定其中有十个包含目标实体的液滴，并将通过分选进行回收，从而提供了高度富集的种群，该种群几乎全部包含目标实体。为了进一步富集目标实体，可以多进行一轮分选。分层分选的优势在于，在这种情况下，最终的富集量为单次富集量相乘的结果。例如，如果该方法能够在一轮分选中最多富集10^3个实体，则通过对同一样品进行两次分选，最终的富集量将计算为10^3×10^3＝10^6，而第二轮分选后最终的富集量可能为10^9或其他。此外，根据用户需求的不同，每一轮分选后的富集量可相似或不同。例如，液滴相关性不大的第一轮分选可获得10^3等的富集量，然后下一轮可采用更为密集的分选操作获得10^6的富集量，而最终得出的富集量为10^9。可根据需要调整这些数值，以针对特定的应用进行优化，但是分层分选方法通常具有非常强大的优势：即使在富集能力有限的情况下，也可以从大规模种群中富集极其稀少的目标实体。
当使用本发明的方法通过PCR激活分选进行富集时，可能需要特别关注的是，确保每次富集成功并增加溶液中目标实体的浓度。例如，如果分析目标是在大型种群中检测一种非常罕见的病毒，则在第一轮中，可针对病毒基因组中的特定序列制备扩增引物。这些引物会使对应区域产生多个拷贝，而这些拷贝将被收集到分选容器内。如果在额外轮次的分选中使用了同一区域，则较早几轮分选后获得的产物扩增子会发生检测和分选，导致大量阳性实体产生，从而严重影响该方法实现大量富集的能力。在这种情况下，可对后几轮分选中的引物进行改性，以避免检测到前几轮分选中的扩增产物。可以通过多种方式实现这一目的，例如，使用巢式PCR时，后几轮分选中的引物在前几轮分选中使用的区域之外进行扩增，从而使前几轮分选中的产物无法在后几轮分选中扩增。或者，可在后几轮分选中靶向完全不同的区域，例如同一基因的不同部分或完全不同的基因。通过对这些方法进行组合，也可实现样品的高度富集。
适用对象和/或样品
标的方法适用于从多种对象中采集的生物样品。在多个实施例中，对象为“哺乳动物”，此术语被广泛地用于描述属于哺乳动物类的生物体，包括食肉动物(例如狗和猫)、啮齿类动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)以及灵长类动物(例如人、黑猩猩和猴子)。在多个实施例中，对象是人类。标的方法可适用于任何发育阶段(即新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的男性和女性对象，在其中某些实施例中，所述人类对象是少年、青少年或成人。尽管本发明适用于人类对象，但应当理解，本部分所述方法也可在其他动物对象(即在“非人类对象”中)实施，这些对象包括但不限于鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、家畜和马。因此，应当理解，本文所述的任何需要评估的对象都是适用的。
此外，适用对象包括已经诊断和未诊断出癌症等疾病的对象。适用对象包括目前存在和不存在一种或多种癌症临床表现的对象。在某些方面，对象可以是具有以下特征的个体：因家族史、化学和/或环境暴露、基因突变(例如，BRCA1和/或BRCA2突变)、荷尔蒙、传染源、辐射暴露、生活方式(例如饮食和/或吸烟)等一种或多种因素而可能存在患癌风险、存在一种或多种其他疾病等。
正如上文详细描述的那样，可从这类对象中获得多种生物样品。在某些实施例中，从对象体内提取全血。如有需要，可在实施标的方法之前，通过离心、分离、纯化等方式处理全血。从对象体内提取的全血样品体积可为100mL或以下，例如，约位100mL或以下、约为50mL或以下、约为30mL或以下、约为15mL或以下、约为10mL或以下、约为5mL或以下或约为1mL或以下。
标的方法和装置与固定细胞和活细胞均兼容。在某些实施例中，标的方法和装置采用的是活细胞。在其他实施例中，标的方法和装置采用的是固定细胞。将细胞样品固定后，可对其进行清洗，从而提取出可能干扰下游分析的小分子和脂质。此外，进行细胞的固定和透化后，可通过抗体对细胞表面的蛋白质以及胞内蛋白进行染色。结合本文所述的核酸扩增方法，这种染色操作可实现高水平的多路复用分析，因为抗体在细胞样品中，而单分散单乳液滴、单分散多乳液滴和/或GUV中的核酸扩增产物是游离的。在这种配置下，可采用相同颜色的染料标记抗体以及核酸扩增反应所生成的扩增子。可通过任何适用的方法来固定细胞，包括但不限于使用甲醛、甲醇和/或丙酮进行固定。
通过酶联探针检测蛋白质或DNA
采用本文所述的方法和装置，可通过多种形式对不均一溶液中的实体进行检测和分选。目前所述的一些实施例通过对单分散单乳液滴或多乳液滴(例如双乳液滴)和/或GUV进行核酸扩增的方式实现了上述目标，但如本文所述，也可采用其他方法。当使用本发明所揭示的方法和装置检测核酸时，举例而言，可通过以下方式实现上述目标：将单个核酸实体包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，然后采用目标核酸的特异性引物对其进行扩增，检测目标扩增子，最后根据扩增情况进行分选。然而，可通过其他方式生成其他可检测信号，例如使亲和试剂与目标物质相结合。举例而言，如果目标物质是核酸，那么可以合成目标物质的特异性探针，该探针可与当前的目标物质杂交；这些探针可用染料标记，在某些情况下也可用催化剂标记，例如酶催化剂或非酶催化剂。接下来，可对结合了探针的目标物质进行纯化处理以除去未结合的探针，然后可使用本文所述的方法将剩余的材料包封在液滴和/或GUV中。
如果用催化剂标记探针，那么催化剂的底物也会包含在单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中。在这种情况下，包含靶点的单分散单乳液滴或多乳液滴将与探针结合，因此液滴中将包含催化剂，从而导致底物被催化并形成催化产物，所述产物可能为荧光产物。随着时间的推移，这一步操作会使单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中充满荧光产物。相反，空的或含有脱靶分子的单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中不会包含催化剂，也不会形成产物，因此没有可检测的信号。利用这种方法，可收集到大量的单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV，其中有一些粒子可发出荧光而其他粒子发暗。这种条件下，对发荧光的包封用单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV进行分选后，可回收目标物质。该操作还适用于可与亲和试剂(例如抗体)结合的其他类型的目标物质，例如生物分子、病毒、细胞等。在这种情况下，亲和试剂将与催化剂等物质结合，并且操作方法与上述针对结合核酸探针的目标核酸的方法相同。
在这两个实施例中，可通过清洗样品来除去未结合的催化剂，否则催化剂会被包封在单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV中，从而产生假阳性结果。但是，如果不希望或者无法通过清洗样品来除去未结合催化剂，那么可采用的另一种方法是多重检测法，例如，通过定位两个信号来鉴定阳性事件。举例而言，如果分析目的是检测溶液中的目标核酸，则可对该目标核酸上的两个不同序列合成相应的探针，每个探针都与不同的催化剂结合，从而可发生反应并生成荧光产物。在一个实施例中，不同催化剂的荧光产物可显示出不同的颜色，例如一种催化剂产生绿色荧光产物而另一种催化剂产生红色荧光产物。所述探针可照常与目标物质结合。在这种情况下，尽管溶液中会有许多未结合的探针，但在大多数情况下，对应第一类催化剂的探针将不会与结合了不同催化剂的第二种探针发生物理层面的结合，除非它们都结合了相同的目标核酸。
为了实现高浓度下的杂交，也可根据需要来稀释溶液。然后，可通过降低溶液浓度使溶液在规定液滴当量体积下仅包含一个探针或带有两个结合探针的目标物质。然后，可将该溶液与催化剂底物一同包封，并进行孵育、检测和分选。在该实施例中，许多单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV将仅含有红色或绿色催化剂，而其他液滴将同时含有红色和绿色催化剂(与目标物质结合的催化剂)。通过检测在两个波长下均发出荧光的液滴，即可将含有目标核酸的液滴与仅含有催化剂的液滴区分开，并且无需清洗样品。
同样，当未结合两种催化剂的探针被包封在同一液滴中时，可能会得出假阳性结果，但这种情况可通过稀释溶液来改善并且稀释的程度应充分确保假阳性事件的发生率远低于目标物质的检测率。所以，当单分散单乳液滴或多乳液滴和/或GUV被鉴定为双阳性时，通常表示溶液中存在目标物质。对其他类型的目标物质(例如细胞或蛋白质)可采用相似的技术和不同种类的亲和试剂(例如抗体等结合分子)，这些试剂可与具有不同反应性等特征的催化剂二次结合。
癌症检测
本文所述的方法还涉及到癌症的检测方法。此类方法可包括的步骤如下：将从对象生物样品中获得的寡核苷酸包封在单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，其中单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中存在至少一种寡核苷酸；将聚合酶链式反应(PCR)试剂、检测组分和多种PCR引物引入单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV中，并在适合PCR扩增的条件下孵育单分散单乳液滴、多乳液滴和/或GUV，从而生成PCR扩增产物，其中所述多个PCR引物包括一种或多种各自与一个或多个致癌基因杂交的引物；通过检测组分的检测结果来确定是否存在PCR扩增产物，其中检测组分的检测结果表明是否存在PCR扩增产物。
针对一种或多种致癌基因检测一种或多种PCR扩增产物，可提示对象是否患有癌症。添加到液滴中的特定致癌基因可能存在差异。在某些方面，致癌基因可能对特定类型的癌症(例如乳腺癌、结肠癌等)具有特异性。
此外，在实施标的方法时，含待检测组分的生物样品可能不同，并且在某种程度上至少应根据所检测的特定癌症类型来确定此样品。举例而言，如果需要确定对象是否患有乳腺癌等疾病，则在某些情况下可生物样品可以是乳腺组织。在实施癌症检测方法时，可对本文所述的一般步骤进行调整，例如改变可添加的引物数量、添加试剂的方式、合适的对象等。在实施上述方法时，也可用单乳液滴来代替多乳液滴。
本发明的非限制性方面的示例
上述本发明标的物(包括实施例)可单独使用或与一项或多项内容或实施例合并使用。在不限制前述内容的情况下，下文提供了本专利1-73项的某些非限制性内容。在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，每个单独编号的内容可单独使用，也可与之前或之后任一单独编号内容组合使用。这旨在为各项内容的所有此类组合提供支持，并且不仅限于以下明确提供的内容的组合：
1.一种用于制备单分散乳液的方法，所述方法包含：
将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体中包含多个目标颗粒；
将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与第一液体互不相溶；并且
所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包含所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。
2.根据1所述的方法，其中将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，包含使一部分所述第一液体被所述模板单分散颗粒吸收。
3.根据1所述的方法，包含使一部分所述第一液体被所述模板单分散颗粒吸收后，从所述第一混合物中除去过量的第一液体。
4.根据1所述的方法，其中将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，包含使一部分所述第一液体流入所述模板单分散颗粒中。
5.根据1-4任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒中包含一种水凝胶。
6.根据5所述的方法，其中所述水凝胶选自琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)及其组合。
7.根据1-6任一项所述的方法，其中所述第一液体包含一种水相液体。
8.根据1-7任一项所述的方法，其中所述第二液体包含一种油。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述油包含碳氟油、烃油或其组合。
10.根据1-9任一项所述的方法，其中所述第二液体包含一种可溶于所述第二液体的表面活性剂。
11.根据1-10任一项所述的方法，其中所述第一液体包含一种可溶于所述第一液体的表面活性剂。
12.根据11所述的方法，其中所述可溶于第一液体的表面活性剂包含辛基酚乙氧基化物和/或辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇。
13.根据1-12任一项所述的方法，其中所述方法不使用微流体。
14.根据1-13任一项所述的方法，其中所述第二液体在发生剪切后包含多个不含所述单个模板单分散颗粒的液滴。
15.根据14所述的方法，包含使包含模板单分散颗粒的单分散液滴相比不含单个模板单分散颗粒的液滴出现富集。
16.根据15所述的方法，其中通过过滤或离心方法从单分散乳液中除去不含单个模板单分散颗粒的一个或多个液滴。
17.根据14-16任一项所述的方法，其中所述单分散液滴的平均直径以及多个不含单个模板单分散颗粒的液滴的平均直径小于所述模板单分散颗粒的平均直径。
18.根据1-17任一项所述的方法，其中所述剪切作用包含使所述第二混合物通过移液管尖端，然后采用均质器振荡第二混合物，或采用珠磨式研磨机振荡所述第二混合物。
19.根据1-18任一项所述的方法，包含使包封在所述单分散液滴中的所述模板单分散颗粒溶胀。
20.根据1-19任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为DNA分子。
21.根据20所述的方法，其中所述DNA分子为基因组DNA分子。
22.根据1-19任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为RNA分子。
23.根据1-22任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为细胞。
24.根据23所述的方法，其中所述单分散液滴的每个液滴包含一个或多个细胞。
25.根据23所述的方法，其中所述单分散液滴的每个液滴包含的细胞不超过一个。
26.根据1-25任一项所述的方法，其进一步包含在所述单分散液滴中加入一种细胞裂解试剂。
27.根据26所述的方法，其中在将多个模板单分散颗粒包封在多个单分散液滴中之前，所述细胞裂解试剂存在于第一混合物中。
28.根据26或27所述的方法，其中所述细胞裂解试剂不包含去污剂。
29.根据26-28任一项所述的方法，其中所述细胞裂解试剂包含蛋白酶K。
30.根据1-29任一项所述的方法，其进一步包含对单分散液滴进行分选。
31.根据30所述的方法，其中分选可通过以下方式进行：介电泳力偏转法、选择性聚结、荧光激活细胞分选法(FACS)、电泳法、超声分离法、磁激活细胞分选法(MACS)、液流控制法或其他用于选择性偏转单分散液滴的刺激方法。
32.根据1-31任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为核酸，所述包含多个目标颗粒的第一液体进一步包含核酸合成试剂，所述核酸合成试剂被包封在单分散液滴中。
33.根据32所述的方法，包含将包含所述第一液体的一个或多个所述单分散液滴和所述多个目标颗粒中的一个或多个颗粒置于核酸合成条件下。
34.根据32所述的方法，其中所述核酸合成试剂包含核酸扩增试剂。
35.根据1-34任一项所述的方法，包含将包含所述第一液体的一个或多个所述单分散液滴和所述多个目标颗粒中的一个或多个颗粒置于核酸扩增条件下。
36.根据1-34任一项所述的方法，包含从所述多个单分散液滴中的一个或多个液滴中分离核酸。
37.根据36所述的方法，包含从所述多个单分散液滴中的一个或多个液滴中分离核酸合成和/或扩增产物。
38.根据1-37任一项所述的方法，包含对从所述多个单分散液滴中的一个或多个液滴中分离的核酸和/或核酸合成和/或扩增产物进行测序。
39.根据34所述的方法，其中所述核酸扩增试剂包括聚合酶链式反应(PCR)试剂或多重置换扩增(MDA)试剂，所述核酸扩增条件分别包括PCR条件或MDA条件。
40.根据34所述的方法，其中所述核酸扩增试剂包括核酸等温扩增试剂，所述核酸扩增条件包括核酸等温扩增条件。
41.根据1-40任一项所述的方法，其中包含所述多个目标颗粒的所述第一液体包含核酸检测试剂，所述核酸检测试剂被包封在所述单分散液滴中。
42.根据41所述的方法，包含通过检测一种或多种所述检测试剂检测一个或多个所述目标颗粒、其一部分、其核酸合成产物和/或其核酸扩增产物。
43.根据1-42任一项所述的方法，包含使一个或多个所述目标颗粒、所述核酸合成试剂以及所述核酸检测试剂与一个或多个所述模板单分散颗粒相结合。
44.根据43所述的方法，其中一个或多个所述目标颗粒、所述核酸合成试剂以及所述核酸检测试剂通过所述模板单分散颗粒表面或内部的一个或多个连接基团与所述模板单分散颗粒相结合。
45.根据44所述的方法，其中一个或多个所述连接基团是依附在所述模板单分散颗粒表面或内部的寡核苷酸。
46.根据44所述的方法，其中一个或多个所述连接基团是包封在模板单分散颗粒中的功能化珠子。
47.根据1-46任一项所述的方法，其中每个所述单分散液滴包含一个容纳试剂的单独隔室。
48.根据47所述的方法，包含从所述单独隔室中释放试剂。
49.根据1-48任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒具有平均体积，所述方法包含使所述模板单分散颗粒收缩以减小平均体积。
50.根据1-49任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒为第一类颗粒，其中所述方法包含将一个或多个第二类颗粒包封在含一个或多个所述第一类颗粒的液滴中。
51.根据1-50任一项所述的方法，包含在所述第二混合物经过剪切后，从所述第二混合物中除去过量的第二液体。
52.根据51所述的方法，其中从所述第二混合物中除去过量的第二液体包含对所述混合物进行离心操作并除去上清液。
53.根据1-52任一项所述的方法，包含在所述第二混合物经过剪切后，将第三液体与所述第二混合物混合以形成第三混合物，其中所述第三液体与所述第二液体互不相溶。
54.根据1-52任一项所述的方法，包含在所述第二混合物经过剪切后，将第三液体与所述第二混合物混合以形成第三混合物，其中所述第三液体与所述第一和第二液体互不相溶。
55.根据53所述的方法，其中所述第三液体包含一种水相液体。
56.根据49或54所述的方法，其中所述第三液体包含一种油。
57.根据53-56任一项所述的方法，其中第三液体包含一种可溶于所述第三液体的表面活性剂。
58.根据53-57任一项所述的方法，包含通过剪切所述第三混合物，将所述模板单分散颗粒包封在所述第三液体中的双乳液滴中。
59.根据53-53任一项所述的方法，包含通过剪切所述第三混合物，将含或不含所述模板单分散颗粒的一个或多个所述单分散液滴包封在所述第三液体中的一个或多个液滴中，以形成一个或多个双乳液滴。
60.根据53-59任一项所述的方法，其中所述第三液体包含一种胶凝剂。
61.根据1-60任一项所述的方法，其中75％或75％以上的所述单分散液滴包含一个且不超过一个模板单分散颗粒。
62.根据1-60任一项所述的方法，其中85％或85％以上的所述单分散液滴包含一个且不超过一个模板单分散颗粒。
63.根据1-60任一项所述的方法，其中95％或95％以上的所述单分散液滴包含一个且不超过一个模板单分散颗粒。
64.根据1-62任一项所述的方法，其中75％或75％以上的所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的单分散液滴中。
65.根据1-62任一项所述的方法，其中90％或90％以上的所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的单分散液滴中。
66.根据1-65任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒中包含一种亲脂性聚合物。
67.一种方法，包含：
将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体中包含多个细胞和一种细胞裂解试剂；
将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；
所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包含所述第一液体、单个模板单分散颗粒、所述细胞裂解试剂和单个细胞的单分散液滴；
将所述细胞裂解试剂的温度维持在足以防止所述细胞裂解试剂活化的水平，直到获得所述多个单分散液滴；并且
在获得所述多个单分散液滴后，在足以活化所述细胞裂解试剂并使所述单个细胞裂解的温度下孵育所述多个单分散液滴。
68.根据67所述的方法，其中所述细胞裂解试剂包含蛋白酶K。
69.根据67或68所述的方法，其中所述细胞裂解试剂不包含去污剂。
70.根据67-69任一项所述的方法，包含使所述多个单分散液滴破裂。
71.根据67-70任一项所述的方法，其中所述第一液体包含多个RNA捕获珠子。
72.根据67-70任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒包含加入其中的一个或多个RNA-捕获珠子。
73.根据71-72所述的方法，包含对RNA捕获珠捕获的RNA分子进行测序。
示例
提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制发明人所认为其发明的范围，也无意表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保所使用数字(例如数量、温度等)的准确性，但是应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力指大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp：碱基对；kb：千碱基；pl：皮升；s或sec：秒；min：分钟；h或hr：小时；aa：氨基酸；kb：千碱基；bp：碱基对；nt：核苷酸；i.m.：肌内；i.p.：腹膜内；s.c.：皮下注射；等等。
材料和方法
除非另有说明，否则以下材料和方法通常适用于本文所述示例中的结果。
单分散水凝胶颗粒的制备
使用6.2％丙烯酰胺(西格玛奥德里奇)、0.18％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(西格玛奥德里奇)和0.3％过硫酸铵(西格玛奥德里奇)制备单分散聚丙烯酰胺(PAA)颗粒。使用含14％(w/v)八臂PEG-巯基(Creative PEGworks)的100mM NaHCO3和含聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)(6 kDA)(Creative PEGworks)的100mMNaHCO3制备聚乙二醇(PEG)颗粒。使用1％低熔点琼脂糖(西格玛奥德里奇)制备琼脂糖颗粒。在乳化过程中，使用空间加热器加热琼脂糖混悬液，以防止凝固。利用注射泵(New Era，NE-501)将琼脂糖和PEG溶液注入含油(含5％(w/w)去质子化Krytox 157FSH的HFE-7500氟化油)的液滴生成装置(图1)。将PAA溶液注入装有含1％四甲基乙二胺(TEMED)的氟化油的液滴制备装置中。将水凝胶溶液和油装入单独的1mL注射器(BD)中，并使用注射泵分别向液滴制备装置中注入300μl和500μl，受Python脚本控制，示例请参见网站“https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program”。收集PAA和PEG液滴，并在室温下孵育1小时以实现胶凝。将琼脂糖液滴在冰上孵育以实现胶凝。完成胶凝后，通过加入等体积的含20％(v/v)全氟-1-辛醇的HFE-7500使油中的胶凝液滴失稳，然后将液滴转移到水性载体中。颗粒用含2％Span-80(西格玛奥德里奇)的己烷洗涤两次，除去残留的油。己烷洗涤后，用无菌水清洗颗粒直到将油除去。使用EVOS细胞成像系统(赛默飞世尔)对液滴进行成像。使用EVOS FITC LED光源在4倍和10倍物镜下拍摄图像。
装置构建
通过将未固化聚二甲基硅氧烷(PDMS)(聚合物与交联剂比例为10∶1)倒在硅片上的光刻胶层(SU-83025，MicroChem)上，构建出用于制备单分散水凝胶颗粒的PDMS装置。将该装置在80℃烤箱中固化1小时，用手术刀切下，并使用0.75mm活检打孔器(WorldPrecision Instruments，#504529)对进样口打孔。使用氧等离子体将该装置结合到载玻片上，并用Aquapel(PPG Industries)处理通道的内表面以使其具有疏水性。将密封的装置在80℃下烘烤10分钟。
dPCR
用含0.5％Triton-X100(西格玛奥德里奇)的无菌水洗涤单分散PAA颗粒或市售的PAA颗粒(Bio-Rad)。取33μL洗涤过的PAA颗粒，与17μL PCR试剂混合，使总反应体积为50μL。50μL的混合物中包括一份LongAmp Taq反应缓冲液(NEB)、2个单位的LongAmp Taq DNA聚合酶(NEB)、0.6μM的正向和反向引物(IDT)、0.6μM的
Figure BDA0002499691020000691
探针(IDT)、300μM dNTP(Fisher Scientific)和不同数量的出芽酵母/酿酒酵母基因组DNA(Milipore)。在进行多重ddPCR时，还另包括0.6μM的正向和反向引物以及λ病毒DNA的
Figure BDA0002499691020000692
探针。所使用的引物和探针的序列为-酵母正向引物：5’-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3’(SEQ ID：1)，酵母反向引物：5’-ACACGTATGTATCTAGCCGAATAAC-3’(SEQ ID：2)，酵母探针：5’-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABkFQ/-3’(SEQ Id：3)，λ，λ病毒正向引物：5’-GTGGCATTGCAGCAGATTAAG-3’(SEQ Id：4)，λ，λ病毒反向引物：5’-GGCAGTGAAGCCCAGATATT-3’(SEQ Id：5)，λ，λ病毒探针：5’-/Cy5/TATCCGTCAGGCAATCGACCGT TG/3IAbRQSp/-3’(SEQ ID：6)。混合物孵育15分钟，使PCR试剂扩散到颗粒中，并以6,000g离心1分钟。用微量吸液管除去过量的水相。取20μL颗粒和25μL含2％(w/w)PEG-PFPE两亲嵌段共聚物表面活性剂(008-Fluoro-surfactant含氟表面活性剂，Ran Technologies)的HFE-7500油，在1.7mLEppendorf管中通过敲击混匀。使用涡旋混合器(VWR)在2,300rpm下对混合物搅拌30s。将乳液转移到PCR管后，用移液管除去悬浮液滴下方的油，并用含5％(w/w)PEG-PFPE两亲嵌段共聚物表面活性剂的FC-40油(西格玛奥德里奇)代替。这种油/表面活性剂的组合在PCR过程中提高了热稳定性。将乳液转移到T100热循环仪(Bio-Rad)中并进行以下程序：先从94℃开始加热30s，然后进行45次循环，94℃循环30s、53℃循环60s、65℃循环50s，最后在65℃循环10分钟并将温度控制在12℃。借助EVOS GFP和FITC LED光源在10倍和20倍物镜下通过EVOS细胞成像系统(ThermoFisher Scientific)对液滴进行成像。
细胞培养
在30℃条件下，使用标准富集培养基(YPD)培养表达黄色荧光蛋白(YSP)荧光的出芽酵母/酿酒酵母菌株，并使用NanoDrop(ThermoFisher Scientific)测量细胞密度。用含0.5％Triton的YPD洗涤PAA颗粒，并通过离心除去过量的水性液体。通过制备稀释的酵母混悬液，使每个液滴中的细胞呈泊松分布。取1μL酵母混悬液、20μL颗粒和25μL含2％(w/w)PEG-PFPE两亲嵌段共聚物表面活性剂的HFE-7500油，在1.7mL Eppendorf管中通过敲击混匀。将混合物以2,300rpm的速度涡旋30秒。在试管盖上打孔，使酵母细胞进行氧交换，并加入1mL YPD培养基。将细胞在30℃下孵育10小时，然后借助EVOS RFP和FITC LED光源在20倍物镜下通过EVOS细胞成像系统进行成像。
单分散乳液制备的放大
将单分散PAA颗粒重悬于0.3％IGEPAL中，然后向96孔板的每个孔中添加20μL的重悬PAA颗粒，从而制备乳液。将合并的混合物以2900rpm涡旋1分钟或者移液30次，产生96个单分散乳液。
通过PTE制备双乳液(脂质体)
在含10mM TrisHCl pH8、137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM EDTA和0.01％TritonX100的内水相中，台式涡旋混合器(购自VWR)加入聚丙烯酰胺微珠，以10的速度涡旋1分钟，从而制备单乳液。添加含5mM TrisHCl pH8和0.01％TritonX100的外部水溶液，然后在台式涡旋混合器(购自VWR)上以7的速度涡旋20s，从而制备脂质体。脂质体是一种双乳液，其制备方法是在含5％(w/v)单油酸甘油酯和5mg/ml二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)的角鲨烷混合物的油相中额外添加荧光脂质。
通过PTE进行高通量scRNA-seq
这项新技术通过增加通量并简化Chemgene中所述的方案(请参见Chemgenes网站)扩展了scRNA-seq的测序能力。以双(丙烯酰)胱胺作为聚丙烯酰胺微珠合成的交联剂，将seq-drop微珠包封到BAC聚丙烯酰胺水凝胶中。将细胞、蛋白酶K和杂交缓冲液与BAC聚丙烯酰胺微珠在4℃下混合。加入用2-巯基乙醇(2-Me)进行预饱和处理的油。对该混合物进行涡旋，使其乳化。在液滴水凝胶解离过程中，2-Me扩散到液滴中并导致BAC聚丙烯酰胺颗粒解离并释放Drop-seq微珠。在55℃下对蛋白酶K孵育15分钟，从而进行细胞裂解。将RNA捕获到Drop-seq微珠上。回收Drop-seq微珠。进行逆转录酶测序和数据分析。
物种混合实验
洗涤小鼠3T3细胞和人HEK293细胞，重悬后以1∶1的比例混合并储存在PBS缓冲液中。带Drop-seq微珠的聚丙烯酰胺的合成方案与通过向溶液中添加Drop-seq微珠来合成聚丙烯酰胺颗粒的方案相同，下文对此提供了更为详细的描述。合成的颗粒直径为125μm。
水凝胶微珠的合成
用于水凝胶颗粒合成的BAC水凝胶混合物如下：Tris pH 7.5 10mM、EDTA 1mM、NaCl 15mM、6.2％丙烯酰胺、0.54％BAC(以2％的浓度溶于乙醇的双丙烯酰胱胺(BAC))、0.3％过硫酸铵和含有HFE 2％Weitz和1％TEMED的油。
采用标准的Drop-seq装置合成水凝胶(用一块银焊料封闭细胞入口通道)。将Drop-seq微珠以100/μ l的浓度重悬，目的是在BAC水凝胶合成混合物中使每10个液滴获得1个微珠。水相流速为2,000μl/h，油相流速为3,200μl/h。生成液滴后，将液滴在室温下放置4小时，然后再进行乳化。采用TBEST缓冲液根据相同的洗涤方案进行洗涤，并于4℃下保存在TBEST缓冲液中。
检查微珠的粒径(通常与液滴粒径大致相同)和Drop-seq上样效率。为了增加装有Drop-seq的微珠的比例，可使用40％Ficoll重悬水凝胶，然后进行离心(500g，持续2min)。根据需要重复此步骤以获得更好的上样效率。
即时乳液制备
制备单细胞混悬液并将其稀释至合适的浓度。用PTE-seq缓冲液(Drop-seq裂解缓冲液，不含肌氨酰和DTT，含500mM NaCl)洗涤BAC水凝胶微珠，以置换全部缓冲液。
通过离心操作将水凝胶微珠紧密包裹，并使用20X的蛋白酶K(购自NEB)。将混合物在冰上孵育5分钟，使其温度平衡。通过将bME添加到5％Weitz HFE油(0.2％)中来制备bME油。将混合物以最大速度涡旋1分钟，充分混合并在冰上储存。
紧密包裹微珠的浓度约为每微升300个水凝胶微珠。根据水凝胶微珠的数量计算乳液振荡所需的细胞数量。目标细胞输入量是水凝胶微珠数量的10％。将细胞添加到紧密包裹的水凝胶微珠中并轻轻混合。加入至少2倍体积的bME-油水凝胶微珠，然后以速度7涡旋30s。使用显微镜检查乳液质量，如有需要，可对乳液进一步涡旋。在室温下将水凝胶解离15分钟，并在55℃下对细胞裂解20分钟，然后置于冰上20分钟以捕获RNA。
Drop-seq方案
在乳液的顶部添加30ml 6X SSC，同时另加50μ1的10％肌氨酰，并用1ml的PFO破坏乳液。根据“http://mccarrolllab.com/dropseq/”网站上给出的方案，按照Drop-seq的方案进行Drop-seq微珠清理、RT反应和测序分析。
通过PTE和靶向分析制备核壳微凝胶
聚丙烯酰胺微珠与寡核苷酸偶联，寡核苷酸用作PCR的引物。将微珠浸入PCR试剂中。除去过量的水溶液。加入琼脂糖、Triton和细胞，然后加入油。根据本文所述方法进行PTE。转移油并进行热循环。破坏乳液并洗涤。在回收基因组之前，使用FACS收集正选微珠。
通过寡核苷酸(MH075，最终2μM)对聚丙烯酰胺微珠改性。捕获枯草芽孢杆菌(菌株168)，并将MH 100和101用于PCR。带有荧光阳性液滴的部分对应于枯草芽孢杆菌(菌株168)模板浓度。使用BD的FACSAria II对荧光阳性液滴进行分选，并在显微镜下观察。进行FACS操作后，分选的微珠发荧光并且被琼脂糖外壳包围。进行qPCR以观察琼脂糖外壳中基因组的回收情况。使用了位于不同基因座的四组引物。进行35次循环后观察信号，并将基因组DNA包封到琼脂糖外壳中。
MH075：/5Acryd//iSpPC/ATATTACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC(SEQ ID：7)
MH100：CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCACGAACTGGACAAGAA(SEQ ID：8)
MH101：/56-FAM/ATGGAGCGTTCAAGGTTCTCAA(SEQ ID：9)
示例1：使用颗粒模板乳化(PTE)技术制备单分散单乳液滴
结果
用作模板的水凝胶颗粒中水的含量超过95％，因此最终的液滴属性主要为水性，这是最终液滴进行生化反应所需要的条件。将颗粒与油和表面活性剂一同添加到待包封的溶液中，并对混合物进行涡旋(图2的小图A-C以及图3的小图A-E)。水凝胶颗粒对于水力直径小于孔径的分子具有渗透性，但是对于基因组DNA等大分子则不具有渗透性，这些大分子保留在液滴颗粒周围的水溶液薄层内。在涡旋过程中，颗粒被分散到连续的小液滴内，直到每个液滴仅包含一个颗粒和水溶液的薄壳，如(图3的小图E)。除此之外，由于需要将固体颗粒粉碎，因此进一步抑制了液滴破裂。在最终获得的乳液中，液滴的粒径与原始单分散颗粒的粒径相似，因此它们本身也呈单分散状态。
PTE将初始溶液中的任何试剂包封在液滴中，使其能够进行类似于微流体技术的区室化反应。小于水凝胶孔径的化合物在乳化之前被吸收，因此存在于含有水凝胶的最终液滴中。如图2的小图E所示，较大的化合物最终保留在水凝胶周围的水溶液薄层中。由于PTE具有可重复性，因此使用了涡旋操作，尽管其他搅拌技术也适用，例如移液和敲管。
示例2：优化颗粒模板乳化
结果
虽然在没有模板颗粒的情况下可通过涡旋操作轻松制备出乳液，但这种乳液呈多分散状态并且对精准生物学的价值有限(图4的小图A)。如图4的小图A(左)所示，在无颗粒情况下涡旋乳剂后生成了粒径大小不一的多分散液滴，其直径为8-218μm(n＝561)，4.3％的液滴直径为35-40μm。另一方面，微流体乳液制备需要专门的装置和技能，但这类乳液表现出了优异的单分散性并且具有很高的价值(图4的小图A)。如图4的小图A(右)所示，微流体乳液制备过程中生成的单分散液滴情况如下：95.7％的液滴直径为35-38μm(n＝816)。因此，对样品包封技术的改进结合了涡旋操作的简易性以及微流体技术的质量。
为了实现这一目标，PTE利用颗粒的硬度来抵御直径小于粒径的液滴发生破裂，在涡旋时也一样。如图4的小图C所示，PTE制备出的液滴粒径与原始PAA颗粒相似，58.2％的液滴直径为35-40μm(n＝1421)。达到最终液滴粒径的时间和所得乳液的单分散性取决于液体和颗粒的性质。举例而言，粒径和自身亲和性等颗粒性质以及粘度和界面张力等溶液性质会影响液滴的模板化过程。为了表征这些参数对乳液质量的影响，采用不同的水凝胶材料和溶液界面张力进行了PTE(图4的小图B)。粒径、载体油和油溶性表面活性剂是固定的，因为这些性质通常是由生物反应的需要决定的，并且灵活性较低。
为了调节界面张力，将水溶性表面活性剂添加到液滴相中，这与大多数生化反应兼容。当忽略水相表面活性剂时，所有水凝胶类的涡旋液滴均呈多分散状态(图4的小图B)；在不受任何特定理论束缚的情况下，这可能是由于颗粒间亲和力和较高界面张力所致，防止了不均匀的较大多核液滴的破裂。涡旋时间增加至20分钟并不会明显改变乳液质量。观察到多芯乳液并且乳液呈多分散状态(图5的小图A)。相反，当水相中包含表面活性剂时，颗粒的亲和力和界面张力均降低；涡旋30s后生成单分散单核液滴(图4的小图B)中，较长的涡旋时间基本上不改变所得乳液的外观(图6的小图A-D)。将PAA颗粒与含0.5％Triton的HFE油与2％含氟表面活性剂混合并涡旋5 sec(图6的小图A)、15 sec(图6的小图B)、1min(图6的小图C)和2min(图6的小图D)。直方图显示了不同涡旋时间下的液滴粒径分布。
如图4的小图B所示，将PAA、PEG或琼脂糖颗粒用作模板并采用不同的表面活性剂进行乳化。用水相表面活性剂(Triton和IGEPAL)制备单分散液滴。在测试的颗粒中，由聚丙烯酰胺(PAA)和聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG)颗粒形成的液滴制备出了了最均匀的乳液(图4的小图B)。琼脂糖颗粒制备的乳液不均匀。在不受任何特定理论束缚的情况下，这可能是颗粒自身的亲和性导致的。虽然必需的涡旋参数和乳液质量有所不同，但也使用了其他水相表面活性剂(图5，小图B-E)。
PTE可推广使用，因为制备乳液所需的时间不取决于乳液的体积(图7的小图A和B)。PTE可从微升到毫升范围内快速简单地制备单分散乳液。该样品为PAA颗粒与0.5％Triton混合后，悬浮在1.25体积的HFE油中，其中含有2％(20μL)或5％(200μL和2mL)的含氟表面活性剂(图7的小图A)。将不依赖于总体积的所有乳液涡旋30秒以制备液滴。200μL和2mL乳液的液滴粒径分布直方图显示，二者的单分散性相同(图7的小图B)。
这些结果与常规微流体乳化的结果不同，在常规的微流体乳化中，制备时间与体积成比例。根据常用的液滴制备速率1kHz，比较了PTE和微流体技术的液滴制备时间。采用PTE技术时，制备20μL乳液与制备2mL乳液所需要的时间相同(图7的小图C，顶部)，而使用微流体技术制备2mL乳液需要大约11个小时(图7的小图C，底部)。对于需要乳化大量样品的应用，PTE的可推广性是一个优势。此外，由于乳液在样品容器中制备，并且样品不需要往返于微流体装置，因此PTE也可推广于大量样品的乳化。
使用直径约30μm至80μm的水凝胶可获得相似的结果，本文提供了50μm水凝胶的数据，但其他颗粒类型可能与该方法兼容，包括不同的粒径、水凝胶化学成分和孔隙率。尽管载相使用了氟化油和表面活性剂，但其他制剂也可兼容，包括硅油和烃油以及表面活性剂。也可使用其他极性相，只要它们能形成稳定的乳液。这对于核壳结构的制备可能是有价值的。这些特性可为将PTE推广到其他领域提供所需的灵活性，例如具有成本效益以及放大到双乳液中化合物包封。
除了粒径与模板颗粒相似的单分散液滴外，PTE还制备出不包含任何颗粒的微小“卫星液滴”。卫星液滴的数量取决于颗粒周围过量水溶液的量、乳液界面张力以及涡旋时间和功率。为了减少液滴数量，可在涡旋之前从颗粒样品混合物中除去过量的水溶液。然而，尽管卫星液滴不够美观，但卫星液滴对乳液中进行的生物反应的影响可忽略不计，因为它们通常只占样品总量的一小部分(<3％)。
在考虑涡旋功率、表面张力和粒径等因素后，可预测吞噬的体积。涡旋操作会在样品中产生速度分布，并且每个液滴在乳化过程中都会随机遭遇这些速度下的样品。涡旋是一种用于搅拌液体的合理可控的方法，因此，有可能确定一种功率，该功率主要产生具有均匀吞噬体积的单核液滴，如此处所示。
液滴微流体技术的一个常见难点是需要有效地包封离散实体，例如微珠和细胞。微流体技术通常将这些实体随机包封，导致泊松分布的上样方式效率低下，其中只有一小部分液滴被正确上样。PTE独有的重要特性是，每个大小适合的液滴都含有一个模板颗粒(图4的小图B)。如果这些颗粒是反应的重要组成部分，则大多数液滴都包含所需的物质。但是，其他组分(例如细胞、微珠和DNA分子)则是随机上样的。的确，有效的水凝胶包封是最近报道的单个细胞测序技术的关键步骤，并已在市售仪器中得到进行应用(Zhu Z，Yang CJ(2017)，Hydrogel Droplet Microfluidics for High-Throughput Single Molecule/Cell Analysis，Acc Chem Res50(1)：22-31)。
示例3：PTE通过数字液滴PCR(ddPCR)实现了DNA的准确定量
结果
PTE可在不使用微流体技术的情况下进行简单的ddPCR操作。为了说明这一点，使用PTE技术包封了几种不同浓度目标分子的DNA样品(图8的小图A)。就像微流体ddPCR的情况一样，增加目标物质的浓度会使荧光液滴的数量增加。为了确定该技术是否可进行浓度估算，采用常规的ddPCR分析并使用成像技术对液滴荧光强度进行定量，将结果绘制成荧光强度与直径的关系图(图8的小图B)。观察到的三个液滴群的特征分别为：荧光强度低和直径小(卫星液滴)、预期直径30-40μm和荧光强度低(PCR阴性)、直径范围相似但荧光强度高(PCR阳性)。忽略了卫星液滴，并通过泊松统计量对直径正确的液滴的目标浓度建立了模型，
λ＝-ln(1-p)，其中λ为每个液滴的模板拷贝数，p为荧光阳性比例。
在测试的三个10倍指数范围内，测得的浓度符合预期的放大比例，这表明基于PTE的ddPCR(图8的小图C)的操作方式类似于基于微流体的ddPCR(图9)。PTE方法利用水凝胶颗粒使液滴模板化，这些液滴是通过微流体技术制备的。即使使用微流体技术制备的颗粒，PTE也可大大简化ddPCR的操作，因为一大批合成颗粒可用于多次分析。
可从供应商那里购买具有各种组成、粒径和均匀度的水凝胶微球。这些微球通常作为纯化柱的组分出售，因此，微球质量控制合格且不含可能干扰液滴反应的污染物。为了表明可通过市售模板单分散颗粒进行PTE(图10A和10B)购买了直径为45-90μm的单分散PAA微球；这种粒径分布比用微流体技术制备的颗粒要大，通常低于5％，但对于大多数应用(包括ddPCR)而言都是可接受的。为了证明这一点，通过PTE对颗粒进行ddPCR，并观察到了相似的液滴荧光特性(图10B的小图A)。较大的直径分布导致该图在粒径和荧光区域的点较为分散，但仍可辨认出PCR阳性和阴性的液滴群(图10B小图B)。改变目标物质浓度并进行标准ddPCR分析，从而在相同范围内获得准确的测量值(图10B的小图C)。使用多个液滴体积加权的泊松分布来纳入液滴直径的变异性时，估计拷贝数的校正因子很小，范围为0.1％(最低浓度)到4.5％(最高浓度)。
通过微流体技术制备的颗粒表征PTE，因为它们是单分散颗粒，因此可以精确测量液滴的体积变化。然而，如本文所示，相对均匀的市售微珠可满足多种用途。
示例4：多重PTE-ddPCR
结果
为了证明基于PTE的ddPCR可以多重使用，分析了λ病毒和酿酒酵母的基因组DNA。使用针对λ病毒(红色)或酵母(绿色)基因组的TaqMan探针。将两种生物体的DNA混合在一起，并采用PTE技术乳化样品。许多液滴是纯红色或绿色的，说明它们分别包含λ病毒或酵母基因组DNA(图11的小图A)。然而，在极少数情况下，液滴中含有其中一个目标物质，因此呈双阳性，显示为黄色(图11的小图A，合并)。由于这些核酸不存在物质关联，因此可通过双重包封过程的泊松分布情况来描述双阳性的可能性。因此，泊松统计量的偏差显示了序列的关联性。
示例5：酵母细胞中PTE的应用
结果
以水凝胶微球作为液滴制备模板，通过PTE技术包封单个酵母细胞。将PAA模板单分散颗粒添加到酵母混悬液中，并通过涡旋操作使混合物乳化。将细胞在低浓度条件下悬浮，使大多数的液滴不含细胞，但有一小部分液滴含有单个细胞，就像采用微流体技术进行细胞包封时的情况一样。由于微米级酵母菌无法扩散到模板单分散颗粒的纳米孔中，因此它们最终保留在接近液滴周围的水性外壳中(图11的小图B)。每个液滴包封的酵母数量可根据样品中的细胞浓度进行调整。
液滴环境适合酵母生长。在不受任何特定理论束缚的情况下，这可能是因为PAA是一种具有生物惰性的水凝胶，其中包含95％以上的水。因此，将包封的酵母细胞孵育10小时后，这些细胞生长为克隆的微菌落(图11的小图B)。
示例6：RNAseq(预测)
首先，通过结合超过10^9个单链寡核苷酸，合成聚丙烯酰胺水凝胶微珠，然后进行洗涤并重悬。微珠的构建过程采用“分裂和合并”方法，从而在微珠上贴条形码。最后贴码的微珠包含唯一贴条码的单链DNA，其他成分包括polyT尾巴和T7启动子序列。这些单链DNA可以在UV曝光器的作用下从水凝胶微珠中释放出来。合并微珠、细胞和RT混合物，按本文所述方法通过逆转录反应混合物进行PETE，从而将单个细胞包封在液滴中。将乳液暴露于UV光下，然后加热至50℃以进行逆转录反应。在此过程中，微珠上的单链DNA被释放后用作RT引物，而细胞中的RNA被释放后用作模板。然后，破坏乳液并回收cDNA，随后为下一代测序进行标准的体外转录和文库制备，从而收集单个细胞基因表达谱的分析数据。
示例7：单分散乳液制备的放大
结果
首先根据本发明所揭示的方法合成单分散聚丙烯酰胺颗粒，然后用IGEPAL洗涤。将单分散颗粒添加到96孔板中。根据本发明进行PTE，同时产生96个均匀的单细胞乳液(图12)。
示例8：使用粒子模板乳化(PTE)技术制备双乳液
结果
采用本文所述的技术，能够在精确控制下生成脂质体，即一种双乳液。如图13的小图A中，在内水相(10mM TrisHCl pH8、137mM NaCl、2.7mM Kcl、10mM EDTA和0.01％TritonX100)中加入聚丙烯酰胺颗粒，然后通过PTE制备双乳液(或脂质体)。如图13的小图B中，首先通过添加油相(含有5％(w/v)单油酸甘油酯和5mg/ml DPPC的角鲨烷混合物)制备单乳液。如图13的小图C中，加入含有5mM TrisHCl pH8和0.01％TritonX100的外水相，然后通过涡旋操作制备双乳液。通过相位分离生成脂质体。如图13的小图D中，采用EVOS荧光显微镜对油相中含其他荧光脂质的合成脂质体进行成像。
示例9：通过PTE进行高通量RNAseq
如图14A-14C所示，制定了一种可在不使用微流体技术的情况下进行单细胞RNAseq(scRNA-seq)的方案。根据该方案，可使用简单的试剂从数千个单细胞中分析转录组特征。结合蛋白酶裂解法、化学触发的水凝胶解聚和条码化RNA捕获珠子，可在一个步骤中实现液滴制备、细胞裂解和RNA捕获。该技术通过增加通量并简化常规方案，从而扩展了scRNA-seq的能力。
以双(丙烯酰)胱胺(BAC)作为聚丙烯酰胺微珠合成的交联剂，先将Drop-seq微珠(图14A；图15的小图A)包封到BAC聚丙烯酰胺水凝胶中，然后进行洗涤和重悬。将微珠、细胞、蛋白酶K与杂交缓冲液合并。加入用2-巯基乙醇(2-Me)进行预饱和处理的油，并按照本文所述方法进行PTE以将单个细胞包封在液滴中(图14B；图15的小图B)。采用蛋白酶K裂解细胞。细胞裂解时不使用去污剂，以避免在形成液滴之前发生裂解。蛋白酶K需要更长的时间和更高的温度才能有效裂解细胞，因此非常适合该方法。加入蛋白酶K并形成液滴后，温度从4℃升高到55℃，以促进蛋白酶K的活化和细胞裂解。细胞发生裂解并且捕获RNA后，破坏乳液，将蛋白酶K洗掉并回收Drop-seq微珠(图14C)。
在图15中，显微图像描述了钙黄绿素染色细胞在裂解前(图15的小图C)和裂解后(图15的小图D)被包封在液滴中。人鼠混合细胞实验的数据说明了本文所述的scRNA-seq工作流程的有效性(图15的小图E)。
示例10：通过PTE和靶向分析制备核壳微凝胶
如图16所示，开发了一种使用即时乳化技术制备核壳微凝胶的方法，该方法将基于亲和力的PTE与靶向分析相结合。使用即时乳化技术制备的核壳微凝胶预期可用于保留多种生物材料和试剂，从而拓宽了即时乳化技术的应用范畴。聚丙烯酰胺微珠(图17的小图A)与寡核苷酸偶联，寡核苷酸用作PCR的引物。通过使用DNA将模板颗粒功能化，利用即时乳化技术进行的这种靶向分析可实现广泛的应用，例如异质细胞群体来源的靶向(针对特定细胞类型)scRNA-seq。虽然本实施例采用了用寡核苷酸功能化处理的微珠，但本领域的普通技术人员可以很容易联想到其他功能化手段，例如使用抗体或其结合片段。将微珠浸入PCR试剂中。除去过量的水溶液。加入琼脂糖、Triton和细胞，然后加入油。根据本文所述方法进行PTE。转移油并进行热循环。在两种稀释倍数下，对带琼脂糖外壳的聚丙烯酰胺内核微珠进行ddPCR(图17的小图B)。荧光阳性液滴的比例与模板浓度相一致。带琼脂糖外壳的聚丙烯酰胺内核微珠的图像显示，在液滴发生破裂并洗涤后，聚丙烯酰胺内核微珠被琼脂糖外壳包围。如图17的小图C所示，描绘了FACS操作之后的液滴图像，对荧光阳性液滴进行分选、收集并在显微镜下观察。进行FACS操作后，分选的微珠发荧光并且被琼脂糖外壳包围。进行qPCR以观察琼脂糖外壳中基因组的回收情况(图17的小图D)。使用了位于不同基因座的四组引物。进行35次循环后观察信号，并将基因组DNA包封到琼脂糖外壳中。
尽管已经参照本发明的特定实施例进行了阐述，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以作出各种变更并且可以用等效物替换。此外，为了使特定情况、材料、物质组成、过程、一个或多个操作步骤能够适应本发明的目的、精神和范围，可进行多种修改。所有这类修改内容旨在被所附权利要求的范围覆盖。
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Claims (73)

1.一种用于制备单分散乳液的方法，所述方法包含：
将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体中包含多个目标颗粒；
将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与第一液体互不相溶；并且
所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包含所述第一液体、单个模板单分散颗粒和单个目标颗粒的单分散液滴。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，包含使一部分所述第一液体被所述模板单分散颗粒吸收。
3.根据权利要求1所述的方法，包含使一部分所述第一液体被所述模板单分散颗粒吸收后，从所述第一混合物中除去过量的第一液体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，包含使一部分所述第一液体流入所述模板单分散颗粒中。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒包含一种水凝胶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述水凝胶选自琼脂糖、海藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)及其组合。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述第一液体包含一种水相液体。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述第二液体包含一种油。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述油包含碳氟油、烃油及其组合。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中第二液体包含一种可溶于所述第二液体的表面活性剂。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中第一液体包含一种可溶于所述第一液体的表面活性剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可溶于第一液体的表面活性剂包含辛基酚乙氧基化物和/或辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述方法不使用微流体。
14.根据权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述第二液体在发生剪切后包含多个不含所述单个模板单分散颗粒的液滴。
15.根据权利要求14所述的方法，包含使包含模板单分散颗粒的单分散液滴相比不含单个模板单分散颗粒的液滴出现富集。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过过滤或离心方法从单分散乳液中除去不含单个模板单分散颗粒的一个或多个液滴。
17.根据权利要求14-16任一项所述的方法，其中所述单分散液滴的平均直径以及多个不含单个模板单分散颗粒的液滴的平均直径小于所述模板单分散颗粒的平均直径。
18.根据权利要求1-17任一项所述的方法，其中所述剪切作用包含使所述第二混合物通过移液管尖端，然后采用均质器振荡第二混合物，或采用珠磨式研磨机振荡所述第二混合物。
19.根据权利要求1-18任一项所述的方法，包含使包封在所述单分散液滴中的所述模板单分散颗粒溶胀。
20.根据权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为DNA分子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述DNA分子为基因组DNA分子。
22.根据权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为RNA分子。
23.根据权利要求1-22任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述单分散液滴的每个液滴包含一个或多个细胞。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述单分散液滴的每个液滴包含的细胞不超过一个。
26.根据权利要求1-25任一项所述的方法，其进一步包含在所述单分散液滴中加入一种细胞裂解试剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在将多个模板单分散颗粒包封在多个单分散液滴中之前，所述细胞裂解试剂存在于第一混合物中。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述细胞裂解试剂不包含去污剂。
29.根据权利要求26-28任一项所述的方法，其中所述细胞裂解试剂包含蛋白酶K。
30.根据权利要求1-29任一项所述的方法，其进一步包含对单分散液滴进行分选。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述分选方式为介电泳力偏转法、选择性聚结、荧光激活细胞分选法(FACS)、电泳法、超声分离法、磁激活细胞分选法(MACS)、液流控制法或其他用于选择性偏转单分散液滴的刺激方法。
32.根据权利要求1-31任一项所述的方法，其中所述目标颗粒为核酸，所述包含多个目标颗粒的第一液体进一步包含核酸合成试剂，所述核酸合成试剂被包封在单分散液滴中。
33.根据权利要求32所述的方法，包含将包含所述第一液体的一个或多个所述单分散液滴和所述多个目标颗粒中的一个或多个颗粒置于核酸合成条件下。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述核酸合成试剂包含核酸扩增试剂。
35.根据权利要求1-34任一项所述的方法，包含将包含所述第一液体的一个或多个所述单分散液滴和所述多个目标颗粒中的一个或多个颗粒置于核酸扩增条件下。
36.根据权利要求1-34任一项所述的方法，包含从所述多个单分散液滴中的一个或多个液滴中分离核酸。
37.根据权利要求36所述的方法，包含从所述多个单分散液滴中的一个或多个液滴中分离核酸合成和/或扩增产物。
38.根据权利要求1-37任一项所述的方法，包含对从所述多个单分散液滴中的一个或多个液滴中分离的核酸和/或核酸合成和/或扩增产物进行测序。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述核酸扩增试剂包含聚合酶链式反应(PCR)试剂或多重置换扩增(MDA)试剂，所述核酸扩增条件分别包含PCR条件或MDA条件。
40.根据权利要求34所述的方法，其中所述核酸扩增试剂包含核酸等温扩增试剂，所述核酸扩增条件包含核酸等温扩增条件。
41.根据权利要求1-40任一项所述的方法，其中包含所述多个目标颗粒的所述第一液体包含核酸检测试剂，所述核酸检测试剂被包封在所述单分散液滴中。
42.根据权利要求41所述的方法，包含通过检测一种或多种所述检测试剂检测一个或多个所述目标分子、其一部分、其核酸合成产物和/或其核酸扩增产物。
43.根据权利要求1-42任一项所述的方法，包含使一个或多个所述目标颗粒、所述核酸合成试剂以及所述核酸检测试剂与一个或多个所述模板单分散颗粒相结合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中一个或多个所述目标颗粒、所述核酸合成试剂以及所述核酸检测试剂通过所述模板单分散颗粒表面或内部的一个或多个连接基团与所述模板单分散颗粒相结合。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述一个或多个连接基团是依附在所述模板单分散颗粒表面或内部的寡核苷酸。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述一个或多个连接基团是包封在所述模板单分散颗粒中的功能化珠子。
47.根据权利要求1-46任一项所述的方法，其中每个所述单分散液滴包含一个容纳试剂的单独隔室。
48.根据权利要求47所述的方法，包含从所述单独隔室中释放试剂。
49.根据权利要求1-48任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒具有平均体积，且所述方法包含使所述模板单分散颗粒收缩以减小平均体积。
50.根据权利要求1-49任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒为第一类颗粒，其中所述方法包含将一个或多个第二类颗粒包封在含一个或多个所述第一类颗粒的液滴中。
51.根据权利要求1-50任一项所述的方法，包含在所述第二混合物经过剪切后，从所述第二混合物中除去过量的第二液体。
52.根据权利要求51所述的方法，其中从所述第二混合物中除去过量的第二液体包含对所述混合物进行离心操作并除去上清液。
53.根据权利要求1-52任一项所述的方法，包含在所述第二混合物经过剪切后，将第三液体与所述第二混合物混合以形成第三混合物，其中所述第三液体与所述第二液体互不相溶。
54.根据权利要求1-52任一项所述的方法，包含在所述第二混合物经过剪切后，将第三液体与所述第二混合物混合以形成第三混合物，其中所述第三液体与所述第一和第二液体互不相溶。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述第三液体包含一种水相液体。
56.根据权利要求49或54所述的方法，其中所述第三液体包含一种油。
57.根据权利要求53-56任一项所述的方法，其中所述第三液体包含一种可溶于所述第三液体的表面活性剂。
58.根据权利要求53-57任一项所述的方法，包含通过剪切所述第三混合物，将所述模板单分散颗粒包封在所述第三液体中的双乳液滴中。
59.根据权利要求53-53任一项所述的方法，包含通过剪切所述第三混合物，将含或不含所述模板单分散颗粒的一个或多个所述单分散液滴包封在所述第三液体中的一个或多个液滴中，以形成一个或多个双乳液滴。
60.根据权利要求53-59任一项所述的方法，其中所述第三液体包含一种胶凝剂。
61.根据权利要求1-60任一项所述的方法，其中75％或75％以上的所述单分散液滴包含一个且不超过一个模板单分散颗粒。
62.根据权利要求1-60任一项所述的方法，其中85％或85％以上的所述单分散液滴包含一个且不超过一个模板单分散颗粒。
63.根据权利要求1-60任一项所述的方法，其中95％或95％以上的所述单分散液滴包含一个且不超过一个模板单分散颗粒。
64.根据权利要求1-62任一项所述的方法，其中75％或75％以上的所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的单分散液滴中。
65.根据权利要求1-62任一项所述的方法，其中90％或90％以上的所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的单分散液滴中。
66.根据权利要求1-65任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒中包含一种亲脂性聚合物。
67.一种方法，包含：
将多个模板单分散颗粒与第一液体混合以形成第一混合物，其中所述第一液体中包含多个细胞和一种细胞裂解试剂；
将所述第一混合物与第二液体混合以形成第二混合物，其中所述第二液体与所述第一液体互不相溶；
所述第二混合物在剪切作用下，使得多个所述模板单分散颗粒被包封在所述第二液体中的多个单分散液滴中，从而形成多个包含所述第一液体、单个模板单分散颗粒、所述细胞裂解试剂和单个细胞的单分散液滴；
将所述细胞裂解试剂的温度维持在足以防止所述细胞裂解试剂活化的水平，直到获得所述多个单分散液滴；并且
在获得所述多个单分散液滴后，在足以活化所述细胞裂解试剂并使所述单个细胞裂解的温度下孵育所述多个单分散液滴。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述细胞裂解试剂包含蛋白酶K。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述细胞裂解试剂不包含去污剂。
70.根据权利要求67-69任一项所述的方法，包含使所述多个单分散液滴破裂。
71.根据权利要求67-70任一项所述的方法，其中所述第一液体包含多个RNA捕获珠子。
72.根据权利要求67-70任一项所述的方法，其中所述模板单分散颗粒包含加入其中的一个或多个RNA-捕获珠子。
73.根据权利要求71或72所述的方法，包含对RNA捕获珠捕获的RNA分子进行测序。
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