CN110770352A - 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 - Google Patents
用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110770352A CN110770352A CN201880017886.7A CN201880017886A CN110770352A CN 110770352 A CN110770352 A CN 110770352A CN 201880017886 A CN201880017886 A CN 201880017886A CN 110770352 A CN110770352 A CN 110770352A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- barcode
- particle
- particles
- optical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 639
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 116
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 420
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 405
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 363
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 363
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 241
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 213
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 147
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 44
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 44
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 42
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims description 40
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 35
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 29
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 17
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 13
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 8
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 8
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013283 Janus particle Substances 0.000 claims description 7
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 7
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 claims description 6
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 claims description 6
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 claims description 6
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 claims description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 5
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 claims description 4
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 4
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 238000001907 polarising light microscopy Methods 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 196
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 87
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 62
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 50
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 49
- 239000000463 material Substances 0.000 description 49
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 47
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 34
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 33
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 21
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 21
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 18
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 16
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 15
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 14
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- -1 such as a biopsy Substances 0.000 description 14
- 239000002585 base Substances 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 11
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 11
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 10
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 9
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 8
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DBGCAIIXEUUZSK-UHFFFAOYSA-N C=CC(NNP(O)O)=O Chemical group C=CC(NNP(O)O)=O DBGCAIIXEUUZSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- IPVPURUWKGWQQV-UHFFFAOYSA-N aminophosphonous acid;prop-2-enamide Chemical group NP(O)O.NC(=O)C=C IPVPURUWKGWQQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 6
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 5
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 5
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical group NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 4
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 4
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 4
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 4
- 239000012704 polymeric precursor Substances 0.000 description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 3
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 3
- VGLCUHJZKWYDPC-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-aminobutane-1,4-dithiol Chemical compound SC[C@@H](N)CCS VGLCUHJZKWYDPC-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920000569 Gum karaya Polymers 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 2
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000934878 Sterculia Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 235000010494 karaya gum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000231 karaya gum Substances 0.000 description 2
- 229940039371 karaya gum Drugs 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- DJVKJGIZQFBFGS-UHFFFAOYSA-N n-[2-[2-(prop-2-enoylamino)ethyldisulfanyl]ethyl]prop-2-enamide Chemical compound C=CC(=O)NCCSSCCNC(=O)C=C DJVKJGIZQFBFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 2
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 2
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZGSNQJCTOMELT-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylorsellinic acid Chemical compound CC1=C(C)C(C(O)=O)=C(O)C(C)=C1O NZGSNQJCTOMELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001730 Moisture cure polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 235000003421 Plantago ovata Nutrition 0.000 description 1
- 244000134552 Plantago ovata Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000005062 Polybutadiene Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002367 Polyisobutene Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 239000009223 Psyllium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920001800 Shellac Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002334 Spandex Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940023476 agar Drugs 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 description 1
- APQPRKLAWCIJEK-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound NCCSSCCN APQPRKLAWCIJEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000203 droplet dispensing Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000002241 glass-ceramic Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 229920000591 gum Polymers 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 108010074304 kitalase Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000012836 macromolecular constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000000016 photochemical curing Methods 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002493 poly(chlorotrifluoroethylene) Polymers 0.000 description 1
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920002857 polybutadiene Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000671 polyethylene glycol diacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920002620 polyvinyl fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000011112 process operation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 229940070687 psyllium Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 1
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004208 shellac Substances 0.000 description 1
- 235000013874 shellac Nutrition 0.000 description 1
- ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N shellac Chemical compound OCCCCCC(O)C(O)CCCCCCCC(O)=O.C1C23[C@H](C(O)=O)CCC2[C@](C)(CO)[C@@H]1C(C(O)=O)=C[C@@H]3O ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N 0.000 description 1
- 229940113147 shellac Drugs 0.000 description 1
- 229940079862 sodium lauryl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000004759 spandex Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000035892 strand transfer Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000010557 suspension polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000034005 thiol-disulfide exchange Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides
- G16B35/20—Screening of libraries
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本文提供了用于处理来自生物颗粒(例如，细胞)的核酸分子的方法和系统。可产生多个分配区(例如，液滴)，以使多个分配区中的分配区各自包括包含核酸分子的生物颗粒(例如，细胞)和颗粒(例如，珠粒)。可对分配区进行处理(例如，成像)，以获得它们相应的生物颗粒的一种或多种物理和/或光学特性。可对包括在分配区中的核酸分子进行条形码化和测序(例如，使用偶合于分配区的颗粒的核酸条形码分子)以产生核酸分子的核酸序列。核酸序列可与生物颗粒的一种或多种光学特性以电子方式关联。
Description
交叉引用
本申请要求提交于2017年11月17日的美国临时申请62/587,634的权益，所述临时申请以引用方式全文并入本文。
背景技术
可出于各种目的处理样品，如鉴定样品内的样品部分的类型。样品可以是生物样品。可出于各种目的处理生物样品，如检测疾病(例如癌症)或鉴定特定物质。存在各种处理样品的方法，如聚合酶链式反应(PCR)和测序。
可在各种反应环境(如分配区(partition))内处理生物样品。分配区可以是孔或液滴。可采用液滴或孔以使生物样品能够被分配和独立处理的方式处理生物样品。例如，此类液滴可与其他液滴在流体上隔离，从而能够精确控制液滴中的各个环境。
分配区中的生物样品可经受各种过程，如化学过程或物理过程。分配区中的样品可经受加热或冷却，或化学反应，如以产生可定性或定量处理的物质。
可使用现有方法处理生物样品，其中样品信息(例如，表型信息)可能丢失。这种样品处理不可用于分析样品中的细胞间变异。此外，现有方法可能受困于低效的样品制备方法，如可包括多个步骤的耗时程序。
发明内容
本文认识到需要用于分析生物样品中的细胞间变异(例如，表型变异和序列变异)的样品制备的改善方法。
在一个方面中，本公开提供了一种用于处理生物颗粒的核酸分子的方法，其包括：(a)提供(1)多个分配区，其中所述多个分配区中的分配区包含(i)包含多个核酸条形码分子的颗粒，其中所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含条形码序列，以及(ii)包含所述核酸分子的生物颗粒，以及(2)存储在计算机存储器中的第一数据集，其包括指示所述生物颗粒的一种或多种物理特性的数据，所述数据在对所述生物颗粒进行感测后生成；(b)使用所述多个核酸条形码分子中的所述核酸条形码分子和所述生物颗粒的所述核酸分子生成条形码化核酸分子；(c)生成第二数据集，其包括鉴定所述条形码化核酸分子或其衍生物的核酸序列的数据；以及(d)使用所述第一数据集和所述第二数据集将所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性与所述核酸序列相关联。
在一些实施方案中，所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性包括所述生物颗粒的尺寸、所述生物颗粒的形状、所述生物颗粒上的表面标志物、所述生物颗粒中的包含物、所述生物颗粒中的细胞器的结构、所述生物颗粒中的细胞器的数量、相对于所述生物颗粒的分泌或排泄，或细胞器在所述生物颗粒中的定位。
在一些实施方案中，所述生物颗粒包含多个核酸分子。在一些实施方案中，所述多个核酸分子包含多个核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述多个核酸分子包含多个脱氧核糖核酸分子。
在一些实施方案中，所述核酸分子是核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子是脱氧核糖核酸分子。
在一些实施方案中，所述一种或多种物理特性包括所述生物颗粒的表型信息。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述颗粒进行光学检测以生成第三数据集，所述第三数据集包括指示所述颗粒或所述多个核酸条形码分子的一种或多种物理特性的数据。在一些实施方案中，所述颗粒的所述一种或多种物理特性包括所述颗粒的光学特性。在一些实施方案中，所述颗粒的所述物理特性包括所述颗粒或其组分的尺寸、形状、圆度、硬度或对称性。在一些实施方案中，所述颗粒的所述光学特性包括所述颗粒或其组分的吸光度、双折射率、颜色、荧光特征、发光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。
在一些实施方案中，所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含条形码序列，所述条形码序列是相同的。
在一些实施方案中，所述多个分配区是多个液滴。在一些实施方案中，所述多个分配区是多个孔。
在一些实施方案中，所述颗粒包含一个或多个光学条形码。在一些实施方案中，所述颗粒的所述多个核酸条形码分子包含所述一个或多个光学条形码。在一些实施方案中，所述一个或多个光学条形码包含荧光染料、纳米颗粒、微粒，或其任何组合。在一些实施方案中，所述一个或多个光学条形码具有相对于所述多个分配区的其他光学条形码不同的相关联的光学强度或频率。在一些实施方案中，对于所述多个分配区中的另外的分配区，重复(a)-(d)，其中所述另外的分配区包含(i)包含另外多个核酸条形码分子的另外的颗粒，其中所述另外多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含不同于所述条形码序列的另外的条形码序列，以及(ii)包含另外的核酸分子的另外的生物颗粒，其中所述分配区和所述另外的分配区在感测后产生不同强度或频率的光学信号。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含量子点。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含Janus颗粒。
在一些实施方案中，所述多个核酸条形码分子被配置处于几何结构。在一些实施方案中，所述几何结构是核酸折纸。
在一些实施方案中，所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性通过使用(i)亮视野显微术、(ii)荧光显微术、(iii)相差显微术、(iv)多光谱显微术(multispectralmicroscopy)或(v)偏光显微术对所述分配区成像进行鉴定。
在一些实施方案中，所述颗粒是珠粒。在一些实施方案中，所述珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述多个核酸条形码分子可释放地附接于所述凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺聚合物。
在一些实施方案中，所述一种或多种物理特性是一种或多种光学特性。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之后，对所述分配区成像以对所述生物颗粒进行光学检测，从而鉴定所述生物颗粒的所述一种或多种光学特性。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之前，对所述生物颗粒成像以鉴定所述生物颗粒的所述一种或多种光学特性。在一些实施方案中，在将所述生物颗粒提供于所述分配区中之前对所述生物颗粒成像。
在一些实施方案中，所述颗粒偶合于包含一个或多个光学条形码的另一颗粒。
在一些实施方案中，对于所述多个分配区中的另外的分配区，重复(a)-(d)，其中所述另外的分配区各自包含(i)另外多个核酸条形码分子，其中所述另外多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含不同于所述条形码序列的另外的条形码序列，以及(ii)包含另外的核酸分子的另外的生物颗粒，并且其中所述分配区和所述另外的分配区包括包含分子条形码的颗粒和包含光学条形码的颗粒的组合，所述组合在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。
在一些实施方案中，对于所述多个分配区中的另外的分配区，重复(a)-(d)，其中所述另外的分配区各自包含(i)另外多个核酸条形码分子，其中所述另外多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含不同于所述条形码序列的另外的条形码序列，以及(ii)包含另外的核酸分子的另外的生物颗粒，所述另外的分配区包括至少1,000个分配区。在一些实施方案中，所述另外的分配区包括至少10,000个分配区。在一些实施方案中，所述另外的分配区包括至少100,000个分配区。在一些实施方案中，所述另外的分配区包括包含含有至少1,000个条形码序列的核酸条形码分子的多个颗粒，所述至少1,000个条形码序列在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。在一些实施方案中，所述另外的分配区包括包含含有至少10,000个条形码序列的核酸条形码分子的多个颗粒，所述至少10,000个条形码序列在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。在一些实施方案中，所述另外的分配区包括包含含有至少100,000个条形码序列的核酸条形码分子的多个颗粒，所述至少100,000个条形码序列在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。
在一些实施方案中，所述生物颗粒为细胞。
在一些实施方案中，所述生物颗粒包含处于基体中的细胞或其一种或多种组分。在一些实施方案中，所述基体为聚合物基体。在一些实施方案中，所述基体为凝胶基体。
在一些实施方案中，所述方法还包括，将具有所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性的所述生物颗粒的蛋白质与所述核酸序列相关联。在一些实施方案中，所述蛋白质为细胞表面蛋白。
在一些实施方案中，所述方法还包括将所述生物颗粒的一个或多个核糖核酸序列或一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)序列与所述一种或多种物理特性相关联。在一些实施方案中，所述一个或多个DNA序列包含表观遗传学信息。在一些实施方案中，所述一个或多个DNA序列包含染色质信息。
在另一方面中，本公开提供了一种包含多个颗粒的试剂盒，所述多个颗粒包含(i)偶合于其上的多个核酸条形码分子，其中所述多个条形码分子包含多个条形码序列，以及(ii)多个光学条形码，其中所述多个光学条形码包含多个光码，其中所述多个颗粒中的每个颗粒包含(i)偶合于其上的所述多个核酸条形码分子的子集和(ii)所述多个光学条形码的子集，其中所述多个核酸条形码分子的子集的条形码序列在所述多个颗粒中的颗粒间是不同的，并且其中所述多个光学条形码的子集的光码在所述颗粒间是不同的。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含单个光学条形码。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含两个或更多个光学条形码。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码赋予所述多个颗粒光学特性。在一些实施方案中，所述光学特性选自由以下各项组成的组：所述颗粒或其组分的吸光度、双折射率、颜色、荧光特征、发光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含一种或多种荧光染料、纳米颗粒、微粒，或其任何组合。在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含多个纳米颗粒。在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含多个量子点。在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含多个Janus颗粒。在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含多种荧光染料。在一些实施方案中，所述多种荧光染料包括介于2-10种之间的荧光染料。在一些实施方案中，所述多种荧光染料包括具有相同发射波长和不同强度的多种荧光染料。在一些实施方案中，所述多种荧光染料包含至少20种不同强度。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含不同的光码。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含光码的不同组合。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码具有相对于彼此不同的相关联的光学强度或频率。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含至少1,000个不同的光码。在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含至少10,000个不同的光码。在一些实施方案中，所述多个光学条形码包含至少100,000个不同的光码。
在一些实施方案中，所述多个核酸条形码分子的所述子集中的给定子集内的核酸条形码分子包含相同的条形码序列。
在一些实施方案中，所述多个条形码序列包括至少1,000个不同的条形码序列。在一些实施方案中，所述多个条形码序列包括至少10,000个不同的条形码序列。在一些实施方案中，所述多个条形码序列包括至少100,000个不同的条形码序列。
在一些实施方案中，所述多个颗粒包括至少10,000个颗粒。在一些实施方案中，所述多个分配区包含至少100,000个颗粒。
在一些实施方案中，所述多个核酸条形码分子包含多个功能序列，所述多个功能序列被配置成与多个靶分子相互作用。在一些实施方案中，所述多个靶分子包含多个脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述多个靶分子包含多个核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述多个功能序列被配置成捕获所述多个靶分子。
在一些实施方案中，所述多个颗粒包含多个珠粒。在一些实施方案中，所述多个颗粒包含多个凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述多个核酸条形码分子可释放地偶合于所述多个凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述多个凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺聚合物。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码包括在所述多个颗粒的表面上。
在一些实施方案中，所述多个光学条形码包括在所述多个颗粒内。
在一些实施方案中，所述多个颗粒中的第一颗粒偶合于所述多个颗粒中的第二颗粒，其中所述第一颗粒包含所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子并且所述第二颗粒包含所述多个光学条形码中的光学条形码。
本公开的另外的方面和优势从以下具体实施方式变得为本领域技术人员显而易知，其中仅示出并描述本公开的例示性实施方案。应当认识到的是，本公开能够具有其他以及不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种不同方面做出修改，所有均不脱离公开内容。因此，附图和说明书应被视为在本质上是说明性的而不是限制性的。
以引用的方式并入
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用的方式并入一般。如果通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾，则说明书旨在取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述本发明的新颖特征。通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述和附图(在本文中还有“图(Figure和FIG.)”)获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施方案中利用本发明的原理，在附图中：
图1示出用于分配单个生物颗粒的微流体通道结构的实例。
图2示出用于将携带条形码的珠粒递送至液滴的微流体通道结构的实例。
图3示出用于共分配生物颗粒和试剂的微流体通道结构的实例。
图4示出用于将珠粒受控地分配到离散液滴中的微流体通道结构的实例。
图5示出用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的实例。
图6示出用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的另一个实例。
图7A示出具有用于受控分配的几何特征的微流体通道结构的另一个实例的横截面视图。图7B示出图7A的通道结构的透视图。
图8示出用于分配区的光学检测的微流体通道结构的实例。
图9示出用于以电子方式关联生物颗粒的遗传和表型信息的程序的实例。
图10示出已编程或以其他方式配置成实现本文提供的方法的计算机系统。
发明内容
虽然本文已经示出并描述本发明的各种实施方案，但是本领域技术人员显而易知此类实施方案仅作为举例来提供。许多改变、变化和取代可由本领域技术人员想到而不背离本发明。应理解，可使用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
在将值描述为范围的情况下，应理解，此类公开内容包括公开在此范围内的所有可能子范围，以及落入此范围内的特定数值，而不管特定数值或特定子范围是否明确说明。
如本文所用，术语“条形码”通常是指传达或能够传达关于分析物的信息的标记或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以独立于分析物。除了分析物的内源特征(例如，分析物的大小或一个或多个末端序列)之外，条形码可以是附接于分析物(例如，核酸分子)的标签或标签的组合。条形码可以是唯一的。条形码可以有多种不同的格式。例如，条形码可包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；和合成核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附接于分析物。在样品测序之前、期间和/或之后，可以将条形码添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量各个测序读长。
如本文所用，术语“实时”可以指小于约1秒、十分之一秒、百分之一秒、毫秒或更小的响应时间。响应时间可能大于1秒。在一些情况下，实时可以指同时或基本上同时的处理、检测或鉴定。
如本文所用，术语“受试者”通常是指动物，如哺乳动物(例如人)或禽类(例如鸟)，或其他生物(如植物)。受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如小鼠)、灵长类动物、猿猴或人。动物可包括但不限于农场动物、运动型动物和宠物。受试者可以是健康的或无症状的个体、患有或疑似患有疾病(例如，癌症)或易患疾病的个体和/或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。
如本文所用，术语“基因组”通常是指来自受试者的基因组信息，其可以是例如受试者遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以在DNA或RNA中编码。基因组可包含编码区(例如，蛋白质的编码区)以及非编码区。基因组可以包括生物体中所有染色体一起的序列。例如，人类基因组普通具有共计46条染色体。所有这些染色体一起的序列可构成人类基因组。
术语“一个或多个衔接子”、“一个或多个接头”和“一个或多个标签”可以同义地使用。接头或标签可以通过任何方法包括连接、杂交或其他方法与待“标记”的多核苷酸序列偶合。
如本文所用，术语“测序”通常是指用于确定一种或多种多核苷酸中的核苷酸碱基序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如核酸分子例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可以通过目前可用的各种系统执行，例如但不限于通过Pacific Biosciences
Oxford
或Life Technologies(Ion
)的测序系统。可替代地或另外地，可使用核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来执行测序。此类系统可以提供对应于受试者(例如人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如从受试者提供的样品由系统所产生。在一些实例中，此类系统提供测序读长(在本文中也称为“读长”)。读长可以包括一串核酸碱基，其对应于已经测序的核酸分子的序列。在一些情况下，本文提供的系统和方法可与蛋白质组信息一起使用。
如本文所用，术语“珠粒”通常是指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可包括聚合物基体(例如，通过聚合或交联形成的基体)。聚合物基体可包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。交联可以通过共价、离子或诱导、相互作用或物理缠结。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以通过分子(例如大分子)的共价或非共价组装形成，如单体或聚合物。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如DNA或RNA)。珠粒可以由聚合物材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。珠粒可以是用包含一种或多种聚合物的涂层覆盖的固体颗粒(例如，包括但不限于氧化铁、金或银的金属基颗粒)。这种涂层可以是可破坏的或可溶解的。
如本文所用，术语“样品”通常是指受试者的生物样品。生物样品可包含任何数量的大分子，例如细胞大分子。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品也可以是碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可以来源于另一样品。样品可以是组织样品，例如活组织检查、核心活组织检查(core biopsy)、针吸出物或细针吸出物。样品可以是流体样品，如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是面颊拭子(cheekswab)。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是无细胞(cell-free或cell free)样品。无细胞样品可包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，所述身体样品可以选自由血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰液、粪便和泪液组成的群组。
如本文所用，术语“生物颗粒”通常是指来源于生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞衍生物。生物颗粒可以是细胞器。生物颗粒可以是来自细胞群的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其他细胞型，无论是来源于单细胞还是多细胞生物。生物颗粒可以是或可以包括基体(例如，凝胶或聚合物基体)，其包含细胞或来自细胞的一种或多种组分(例如，细胞珠)，例如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。生物颗粒可以从受试者的组织获得。生物颗粒可以是硬化细胞。这种硬化细胞可以包括或不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可包括细胞的一种或多种组分，但可不包括细胞的其他组分。此类组分的一个实例是细胞核或细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以能够被培养，例如，当被包封在凝胶或聚合物基体中时被培养，或者当包含凝胶或聚合物基体时被培养。
生物颗粒可以是固定细胞或固定细胞的群体，如组织。生物颗粒可以是FFPE细胞或组织。生物颗粒可通过激光捕获细胞而从FFPE样品获得。
细胞可分裂成两个或更多个子细胞，如通过例如二分裂。细胞可以处于细胞分裂的任何阶段(例如，前期、中期)。生物颗粒的一种或多种物理特性可包括子细胞的数量、细胞分裂的阶段和/或细胞分裂的类型。
如本文所用，术语“大分子组分”通常是指包含在生物颗粒内或来自生物颗粒的大分子。大分子组分可包含核酸。大分子组分可包含DNA。大分子组分可包含RNA。RNA可以是编码的或非编码的。例如，RNA可以例如是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA可包括长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA主要包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转移RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。大分子组分可包含蛋白质。大分子组分可包含肽。大分子组分可包含多肽。
如本文所用，术语“分子标签”通常是指能够结合大分子组分的分子。分子标签可以以高亲和力结合大分子组分。分子标签可以以高特异性结合大分子组分。分子标签可包含核苷酸序列。分子标签可包含核酸序列。核酸序列可以是分子标签的至少一部分或全部。分子标签可以是核酸分子或可以是核酸分子的一部分。分子标签可以是寡核苷酸或多肽。分子标签可包含DNA适体。分子标签可以是或包含引物。分子标签可以是或包含蛋白质。分子标签可包含多肽。分子标签可以是条形码。
如本文所用，术语“分配区”通常是指可适合于包含一种或多种物质或进行一个或多个反应的空间或体积。分配区可以将空间或体积与另一个空间或体积隔离。分配区可以是例如液滴或孔。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如像水相中的胶囊或脂质体。
本公开提供了用于从生物颗粒(例如，细胞)中获得遗传和/或蛋白质组学信息并且将这种信息与生物颗粒的一种或多种物理特性(如生物颗粒的尺寸、形状或密度，或任何其他表型特性)相关联的方法和系统。这可允许将来自生物颗粒的遗传和/或蛋白质组学信息与生物颗粒的一种或多种物理特性联系起来。
用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统
在一个方面中，本公开提供了一种用于处理生物颗粒(例如，细胞)的核酸分子的方法。所述方法可包括提供多个分配区(例如，多个孔或液滴)。多个分配区中的分配区可包含(i)包含多个核酸条形码分子的颗粒；以及(ii)包含核酸分子的生物颗粒。多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子可包含条形码序列。所述方法还可包括提供第一数据集，所述第一数据集包括指示生物颗粒的一种或多种物理特性的数据。第一数据集可存储在计算机存储器中。第一数据集可在例如对生物颗粒进行感测后生成。一种或多种物理特性可包括，例如，生物颗粒的尺寸、形状或密度。一种或多种物理特性的感测可生成光学信息，如通过对生物颗粒和/或分配区进行光学检测。
多个核酸条形码分子中的给定核酸条形码分子可用于将生物颗粒的核酸分子(例如，包括在生物颗粒内或来源于所述生物颗粒)条形码化，以产生条形码化核酸分子。然后可生成包括鉴定条形码化核酸分子或其衍生物的核酸序列的数据的第二数据集(例如，使用核酸测序)。第一数据集和第二数据集接着可用于将生物颗粒的一种或多种物理特性与核酸序列相关联(例如，以电子方式关联)。
生物颗粒可以是细胞。作为替代方案，生物颗粒可以是包含细胞的凝胶或聚合物基体、细胞的衍生物，或细胞的一种或多种组分。
在一些实例中，生物颗粒为细胞。细胞可分裂成两个或更多个子细胞，如通过例如二分裂。细胞可以处于细胞分裂的任何阶段(例如，前期、中期)。细胞的一种或多种物理特性可包括子细胞的数量、细胞分裂的阶段和/或细胞分裂的类型。生物颗粒可包含多个核酸分子。一些或所有核酸分子可设置在细胞内部。可替代地，核酸分子可设置在细胞外部或部分设置在细胞外部。可将细胞裂解或透化以使得细胞内的一个或多个核酸分子可被接近。
可将生物颗粒的或与所述生物颗粒缔合的一个或多个核酸分子与生物颗粒的一种或多种物理特性相关联。例如，可将来自生物颗粒或与所述生物颗粒缔合的至少1、10、100、1,000、10,000、100,000或1,000,000个核酸分子与生物颗粒的一种或多种物理特性相关联。
一个或多个核酸分子可缀合于一种或多种抗体，所述一种或多种抗体与偶合于生物颗粒(例如，细胞)表面的一种或多种蛋白质偶合。鉴定此类一个或多个核酸分子的序列可允许鉴定一种或多种抗体和一种或多种蛋白质。随后可将来自生物颗粒的一种或多种蛋白质与生物颗粒的一种或多种物理特性相关联。这种蛋白质组学信息可与来自生物颗粒的遗传信息结合使用，所述遗传信息如DNA序列信息、转录组信息(即，转录物的序列)或两者。例如，细胞的细胞表面蛋白可以使用一种或多种抗体进行鉴定。可利用核酸分子将细胞表面蛋白与细胞的一种或多种物理特性(例如，细胞的形状)相关联。一种或多种物理特性可通过对细胞成像进行表征。可对细胞的核酸分子或其衍生物进行测序以获得核酸序列。核酸序列可与细胞表面蛋白相关联，继而与细胞的一种或多种物理特性(例如，细胞的形状)相关联。在一些情况下，可将生物颗粒(例如，细胞)的一个或多个核糖核酸(RNA)序列和/或一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)序列与一种或多种物理特性相关联。在一些情况下，一个或多个DNA序列可包含表观遗传学信息。例如，一个或多个DNA序列可包括甲基化DNA(例如，5-甲基胞嘧啶)，如通过表观遗传学测定(例如，亚硫酸氢盐测序)所指出的那样。在一些情况下，一个或多个DNA序列可包括染色质信息，如导致高度可接近的染色质或“开放”染色质的较低核小体占据率。开放染色质可通过以下方式进行评估：对一个或多个DNA序列进行酶促处理(例如，DNA酶I、转座酶)，从而释放开放染色质中两个核小体之间的核酸分子的区段。
分配区(例如，液滴)可包含颗粒(例如，珠粒)和生物颗粒(例如，细胞)。分配区可区别于其他分配区以便唯一地鉴定分配区。可通过，例如，对分配区成像以获得颗粒、附接于颗粒的多个核酸条形码分子和/或生物颗粒的光学信息来对分配区进行表征。在一个实例中，分配区可通过分配区中包括的颗粒而区别于其他分配区。例如，颗粒可包括一个或多个特征，如一个或多个光学条形码或可用于使分配区区别于其他分配区的其他特征。查找表(LUT)可用于将多个核酸条形码分子与颗粒相关联。分配区的光学信息可允许将颗粒(例如，凝胶珠粒)与分配区(例如，液滴)中的生物颗粒(例如，细胞)相关联。颗粒与生物颗粒的关联还可允许将生物颗粒的核酸分子的核酸序列与生物颗粒的一种或多种物理特性(例如，细胞的颜色)相关联。例如，分配区(例如，液滴)可包括具有第一颜色的颗粒(例如，珠粒)和具有第二颜色或其他光学特征(如生物颗粒的形状或形态)的生物颗粒(例如，细胞)，可将所述第一颜色和第二颜色或特征彼此相关联。颗粒可具有附接于其上的多个核酸条形码分子。多个核酸条形码分子可包含条形码序列。附接于给定颗粒的多个核酸分子可具有相同的条形码序列。
在一些实例中，LUT可用于将颗粒的特征(例如，光学条形码，如颜色和/或强度)与条形码序列相关联。特征可来源于颗粒或与颗粒缔合的光学标签。可以对分配区(例如，液滴)成像，以获得分配区的光学信息，包括例如，颗粒或与颗粒缔合的光学标签的特征(例如，颜色和/或强度)，以及分配区中的生物颗粒的光学信息。例如，图像可以包括处于可见光谱、非可见光谱或两者的光学信息。例如，可获得分配区的跨越各种光学频率的多个图像。
生物颗粒可包含核酸分子，所述核酸分子可用分配区中的颗粒的核酸条形码分子的条形码序列条形码化，以提供条形码化核酸分子。可对条形码化核酸分子进行测序，以获得核酸序列。核酸序列可包含生物颗粒的遗传信息。核酸序列可包含条形码序列，或其互补序列。可使用LUT将核酸序列的条形码序列或其互补序列与颗粒的特征(例如，颜色和/或强度)以电子方式关联，以鉴定颗粒。可替代地，LUT可用于查找条形码序列以鉴定特征(例如，颜色和/或强度)，所述特征随后可用于鉴定具有这种特征的图像，所述图像可鉴定包含颗粒的分配区。颗粒的鉴定可用于鉴定分配区。这继而可允许通过使用分配区的光学信息鉴定生物颗粒。这可允许来自生物颗粒(例如，细胞)的基因型信息与生物颗粒的表型信息相关联。
在一个实例中，捕获包含含有核酸条形码分子的生物颗粒(例如，细胞或细胞珠)和颗粒(例如，珠粒)的分配区(例如，液滴)的图像。核酸条形码分子包括相同的条形码序列。图像将颗粒鉴定为具有颜色(例如，绿色)并且捕获生物颗粒(例如，细胞)的形状。核酸条形码分子用于将来自生物颗粒(例如，细胞)的核酸分子(例如，RNA分子)条形码化，以生成测序文库，随后对所述测序文库进行测序以产生多个测序读长。多个测序读长中的一些或全部包括条形码序列。接着，LUT用于将来自捕获图像的颗粒的颜色与条形码序列相关联，这允许鉴定由测序文库生成的测序读长。接着将测序读长与生物颗粒的形状相关联。
在一些情况下，分配区(例如，液滴)和/或其组分(例如，颗粒或生物颗粒)的一种或多种光学特性可用于使单个分配区区别于其他分配区。在一些情况下，分配区的光学特性，如分配流体(例如，含水流体)的颜色可用于使分配区区别于其他分配区。例如，分配区可具有能够使分配区彼此区别开的与其相关联的不同颜色。在一些情况下，分配区可包括具有与其相关联的不同颜色的液滴。分配区可以是任何容器或器皿，如孔、微孔、管、纳米阵列或其他容器。在一些情况下，多个分配区可包括至少1,000个分配区、至少10,000个分配区或至少100,000个分配区。在此类情况下，多个分配区中的至少一部分可具有一种或多种唯一光学特性。在一个实例中，分配区(例如，液滴)和/或其组分(例如，颗粒或生物颗粒)的一种或多种光学特性可用于鉴定分配区是否包括颗粒和/或生物颗粒(例如，分配区是否被占据)。
分配区或其组分(例如，颗粒或生物颗粒)的光学特性的非限制性实例可包括吸光度、双折射率、颜色、荧光、发光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。此类光学特性可与分配区、颗粒或生物颗粒相关联，如与直接来自分配区、颗粒或生物颗粒，或来自偶合于分配区、颗粒或生物颗粒的一个或多个部分的信号相关联。
分配区和/或其组分(例如，颗粒或生物颗粒)可通过包括分配区中的光学材料而可光学检测，以使分配区彼此区别开。例如，多个分配区可包括第一分配区和第二分配区。第一分配区和第二分配区可产生不同强度和/或频率的光学信号。例如，第一分配区和第二分配区可包括一种或多种光学材料，如可提供不同光学信号的一种或多种荧光染料、纳米颗粒和/或微粒。一种或多种光学材料可与分配区(例如，分配流体)、颗粒(例如，颗粒的核酸条形码分子)或生物颗粒相关联。在一些实例中，分配流体(例如，含水流体)可包括荧光染料。在一些实例中，分配流体可包括纳米颗粒，如量子点，以提供增强的光谱分辨率，以便在分配区之间区别开。在一些情况下，一种或多种光学材料可在产生分配区之前或之后引入。例如，可在产生分配区(例如，液滴)之后将荧光染料注射到分配流体中。在一些实例中，荧光染料可在产生分配区(例如，液滴)之前包括在分配流体中。
在一些情况下，颗粒(例如，珠粒)的光学特性可用于颗粒(例如，分配区内的)的光学检测。例如，颗粒可具有能够使彼此区别开的不同颜色。在一些实例中，基于颗粒的组成，颗粒可具有不同的折射率。颗粒可以是珠粒，如凝胶珠粒。凝胶珠粒可包含聚丙烯酰胺聚合物。基于聚合度、链长或单体化学，凝胶珠粒可具有不同的双折射率值。颗粒可包括(例如，包封或具有附接于其上的)多个核酸分子，所述核酸分子可以是核酸条形码分子。在一些情况下，核酸条形码分子的光学特性可用于颗粒的光学检测。例如，核酸条形码分子对光的吸光度可用于使颗粒彼此区别开。
可通过在颗粒中、在颗粒表面上，或在颗粒中和颗粒表面上包括光学条形码而使得颗粒可光学检测。光学条形码可处于颗粒的内部和/或外部表面上。光学条形码可包括光码(例如，一种或多种特征频率和/或强度)。光学条形码的非限制性实例可包括荧光染料、纳米颗粒和/或微粒。例如，颗粒可包括多种不同的荧光染料。荧光染料可附接于颗粒表面和/或可掺入颗粒中以用作光学条形码或其组分。荧光染料可附接于颗粒表面、掺入颗粒内，和/或附接于与颗粒偶合的核酸条形码分子。不同荧光染料的不同强度可用于增加可使用的光学条形码(例如，光码)的数量。例如，如果N为荧光染料的数量(例如，介于2种与10种之间的荧光染料，如4种荧光染料)并且M是染料的可能强度(例如，介于2种与50种之间的强度，如20种强度)，那么MN为可能的不同光学条形码。在一个实例中，具有20种可能强度的4种荧光染料将用于产生160,000种不同的光学条形码。在一些实例中，纳米颗粒，如量子点或Janus颗粒，可用作光学条形码或其组分。在一些实例中，量子点可附接于颗粒的核酸条形码分子。颗粒的光学条形码(例如，光码)可提供增强的光谱分辨率，以便在具有唯一核酸条形码分子的颗粒(例如，包含唯一条形码序列的颗粒)之间区别开。在一个实例中，第一颗粒包含第一光学条形码和各自具有第一条形码序列的核酸条形码分子。第二颗粒包含第二光学条形码和各自具有第二条形码序列的核酸条形码分子。第一光学条形码和第二光学条形码可以是不同的(例如，由两种不同的荧光染料或两种不同强度的相同荧光染料提供)。第一条形码序列和第二条形码序列可以是不同的核酸序列。可对颗粒成像以感测第一光学条形码和第二光学条形码并且第一光学条形码和第二光学条形码接着可用于分别将第一光学条形码和第二光学条形码与第一条形码序列和第二条形码序列相关联。
光学条形码可在生成颗粒的同时被包括在内。例如，颗粒可以是珠粒(例如，凝胶珠粒)。凝胶珠粒可包含聚丙烯酰胺聚合物。光学条形码可包括在聚合物结构中，或在珠粒产生的预聚合物或单体阶段中附接。在一些情况下，珠粒可包含可附接于一个或多个光学条形码(例如，附接于珠粒表面和/或珠粒内)的部分。在一些情况下，可使用一种或多种试剂将光学条形码装载到珠粒中。例如，可通过试剂(例如，包含光学条形码的试剂的溶液)的扩散将试剂和光学条形码装载到珠粒中。在一些情况下，可在制备核酸条形码分子的同时将光学条形码包括在内。例如，可通过合成包含条形码序列的分子制备核酸条形码分子(例如，使用分裂汇集(split pool)或组合方法)。光学条形码可在核酸条形码分子附接于颗粒之前附接于核酸条形码分子。在一些情况下，可在将核酸条形码分子附接于颗粒之后将光学条形码包括在内。例如，光学条形码可附接于与颗粒偶合的核酸条形码分子。核酸条形码分子或其序列可以可释放地附接于颗粒。光学条形码可以可释放地或非可释放地附接于颗粒。在一些情况下，第一颗粒(例如，包含多个核酸条形码分子的颗粒)可偶合于包含一个或多个光学条形码的第二颗粒。例如，第一颗粒可以经由化学键共价偶合于第二颗粒。在一些情况下，第一颗粒可以与第二颗粒非共价地缔合。第一和/或第二颗粒可包含多个核酸条形码分子。偶合于给定颗粒的多个核酸条形码分子可包含相同的条形码序列。在第一颗粒和第二颗粒包含核酸条形码分子的情况下，第一颗粒和第二颗粒可包含含有相同条形码序列或不同条形码序列的核酸条形码分子。
生物颗粒(例如，细胞)的光学特性可用于生物颗粒的光学检测。生物颗粒的光学检测可提供生物颗粒的一种或多种物理特性(例如，光学信息)。生物颗粒的一种或多种物理特性可包括表型信息。生物颗粒的表型信息可包括选自由以下各项组成的组的一个或多个成员：生物颗粒的尺寸、生物颗粒的形状、生物颗粒上的表面标志物、生物颗粒中的包含物、生物颗粒中的细胞器的结构、生物颗粒中的细胞器的数量、相对于生物颗粒的分泌或排泄、细胞器在生物颗粒中的定位、生物颗粒的圆度、生物颗粒的密度、生物颗粒的对称性以及生物颗粒的硬度。包含表型信息或与所述表型信息相关的光学特性可用于表征生物颗粒。例如，细胞(例如，色素颗粒体)中包含物的吸光度可用于使生物颗粒彼此区别开。在一些情况下，生物颗粒可包括处于基体(例如，聚合物基体或凝胶基体)中的细胞的一种或多种组分。在此类情况下，基体的光学特性可用于包括在基体中的生物颗粒(例如，细胞)或其组分的光学检测。在一些情况下，生物颗粒(例如，细胞)的表型信息可通过在分配之前包封(例如，在微胶囊中)生物颗粒来保存。
可通过在生物颗粒中、在生物颗粒表面上或在生物颗粒中和生物颗粒表面上包括光学材料(例如，光学条形码或标记)而使得生物颗粒可光学检测。光学材料可处于生物颗粒的内部和或外部表面(例如，细胞膜)上。例如，生物颗粒(例如，细胞)或其组分(例如，核酸分子)可用荧光染料进行标记。在一些实例中，可使用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对核酸分子，如DNA分子进行荧光标记。可对来自DAPI与DNA的结合的荧光进行成像以光学检测生物颗粒。在一些情况下，光学材料可附接于抗体。例如，生物颗粒或其组分可使用与针对蛋白质的抗体缀合的光学材料(例如，荧光染料，如Alexa Fluor)进行光学检测。在一些情况下，生物颗粒可被工程化以表达一种或多种光学材料。例如，生物颗粒(例如，细胞)可被工程化以表达绿色荧光蛋白(GFP)。
分配区(例如，液滴)和/或其组分(例如，颗粒和/或生物颗粒)的一种或多种物理特性可用于使分配区区别于其他分配区。物理特性的非限制性实例可包括分配区和/或其组分的尺寸、形状、圆度、硬度、体积或对称性。在一些情况下，分配区的物理特性可用于使分配区区别于其他分配区。例如，分配流体(例如，含水流体)的体积可用于使分配区区别于其他分配区。在其他实例中，分配区的形状和/或对称性(其可反映包括在其中的颗粒和/或生物颗粒的特征)可用于使分配区区别于其他分配区。可通过产生具有唯一物理特性的分配区而使得可对分配区进行物理检测。在一些情况下，多个分配区可包括至少1,000个分配区、至少10,000个分配区或至少100,000个分配区。在此类情况下，分配区中的至少一部分可具有一种或多种唯一物理特性。例如，可产生具有不同体积的分配区。在一些情况下，分配流体(例如，含水流体)的体积在多个分配区中是不同的。
颗粒(例如，珠粒)的物理特性可用于表征颗粒(例如，分配区内)。颗粒可以是珠粒，如凝胶珠粒。颗粒可以是生物颗粒。颗粒可包括(例如，包封或具有附接于其上的)核酸分子，所述核酸分子可以是核酸条形码分子。核酸条形码分子可包括条形码序列(例如，核酸条形码序列)。条形码序列在多个核酸条形码分子(例如，偶合于给定珠粒的多个核酸条形码分子)间可以是相同的。颗粒的物理特性的非限制性实例可包括尺寸、形状、圆度、密度、对称性和硬度。例如，颗粒可具有不同尺寸。不同尺寸的颗粒可通过使用被配置成提供特定尺寸的颗粒(例如，基于通道尺寸、流动速率等)的微流体通道网络获得。在一些实例中，颗粒可具有不同的硬度值，这可通过改变用于产生颗粒的聚合物的浓度来获得。在一些情况下，附接于颗粒(例如，珠粒)的核酸条形码分子可使用核酸分子的物理特性进行光学检测。例如，核酸折纸，如脱氧核糖核酸(DNA)折纸可用于生成可光学检测的核酸条形码分子。例如，可将核酸分子，或多个核酸分子折叠以产生二维和/或三维几何形状。接着可进一步光学检测不同的几何形状。在一些实例中，具有多于一种不同的光学特性的特殊类型的纳米颗粒可用于使得颗粒可物理区别开。在一个实例中，具有亲水性和疏水性表面的Janus颗粒可用于提供唯一物理特性。在一些情况下，颗粒的物理特性可在分配之前和/或之后进行表征。
可通过对分配区进行成像，使用分配区和/或其组分(例如，颗粒、颗粒的核酸条形码分子、和/或生物颗粒)的一种或多种物理和/或光学特性对分配区进行表征。可使用成像单元对分配区成像。成像单元可以被配置成基于待表征的分配区的期望特性(例如，光学特性)对分配区成像。例如，成像单元可被配置成激发并随后检测包含一种或多种荧光染料的分配区的发射波长。成像单元可被配置成执行亮视野显微术、荧光显微术、相差显微术、多光谱显微术或偏光显微术。成像单元可被配置成包括基于所执行的显微术的光学传感器。在一些实例中，成像单元可被配置成执行亮视野显微术，以确定分配区的物理特性(例如，分配区、颗粒和生物颗粒的形状和/或尺寸)。在其他实例中，成像单元可被配置成执行荧光显微术以对分配区成像(例如，荧光标记的分配区、颗粒和/或生物颗粒)。在一些情况下，微流体芯片可包括用于对单个分配区无干扰地成像的另外的特征。例如，微流体芯片可包括如轨道、非对称转弯、人字形混合器(herringbone mixer)的特征，以有利于分配区的无干扰成像。
如图8所示，微流体通道结构800可包括在通道汇合点810处连通的通道区段801、802、804、806和808。在操作中，通道区段801可沿通道区段801输送包括多个珠粒812(例如，具有核酸条形码分子)和试剂814的含水流体或第一液相。多个珠粒812可以可释放地附接于具有条形码序列和/或另外序列(例如，R1和R2)的多个核酸条形码分子。多个珠粒812可源自珠粒的悬浮液。例如，通道区段801可连接至包含珠粒的含水悬浮液的贮存器。试剂814可包括裂解试剂、PCR试剂、连接酶等。通道区段802可将包括多个生物颗粒816的含水流体沿通道区段802输送到汇合点810中。多个生物颗粒816可源自生物颗粒的悬浮液。多个生物颗粒816可以是细胞或其衍生物，如大分子组分。多个生物颗粒816可以是从福尔马林固定的石蜡包埋组织获得的样品。与含水流体不混溶的第二流体或第二液相818(例如，油)可经由通道区段804递送至汇合点810。在来自通道区段801和802中的每一个的含水流体和来自通道区段804的第二流体818在通道汇合点810处相遇后，含水流体可以在第二流体814中以离散液滴816的形式被分配并且沿着通道区段808从汇合点810流出。通道区段808可以将离散液滴递送至流体联接至通道区段808的出口贮存器，在所述贮存器中将它们加以收集。单个液滴820可包括生物颗粒、颗粒和试剂。单个液滴820可利用成像单元822进行成像。成像单元822可以通信地耦接至微流体通道结构800。成像单元822可被配置成在液滴流动通过通道区段808时对单个液滴成像。成像单元822可向控制器824提供液滴的光学信息。控制器822可以可操作地耦接至成像单元822。控制器824可被配置成引导通道区段808中的流体流动。控制器824可被配置成向处理器826传送光学信息以用于进一步处理。作为成像单元822的替代方案或除成像单元822之外，其他传感器可用于检测单个液滴820和/或单个液滴820的组分的一种或多种物理特性。
在一些情况下，可评估分配区的和/或来自所述分配区的多于一种特性。例如，可使用成像单元对颗粒的尺寸和颗粒上的光学条形码进行成像。在一些情况下，可在将颗粒注射在分配区中之前对分配区成像。例如，可在注射颗粒(例如，珠粒)之前对生物颗粒(例如，细胞、细胞珠或微胶囊)成像。可在分配到分配区(例如，液滴)中之前和之后对生物颗粒成像。在另一个实例中，可在将颗粒注射在分配区中之后对分配区成像。例如，可对包含生物颗粒和颗粒的分配区成像。在对分配区成像之后，可以产生光学信息。光学信息可包括分配区和/或颗粒的光学信息。在一些情况下，光学信息可包括颗粒(例如，珠粒)的光学信息。光学信息可包括生物颗粒(例如，细胞)的表型信息。在一些情况下，光学信息可包括颗粒的光学信息和生物颗粒的表型信息。
在成像之后，单个分配区可进行反应以生成条形码化核酸分子。生物颗粒可包含核酸分子。生物颗粒可包含多个核酸分子。一个或多个核酸分子可包含核糖核酸(RNA)。一个或多个核酸分子可包含脱氧核糖核酸(DNA)。生物颗粒可以是单一生物颗粒，如细胞或聚合物基体(例如，细胞珠)，如本文其他地方所公开。生物颗粒可以是多个生物颗粒，如多个细胞。生物颗粒可包括活的或固定的细胞，如FFPE细胞。生物颗粒可以是任何细胞衍生物或其组合，如DNA、RNA、细胞核等。生物颗粒可包封在凝胶基体中以保存颗粒。
生物颗粒可在分配到分配区中之前和/或之后包封。分配区可以是任何容器或器皿，如孔、微孔、管、纳米阵列或其他容器。分配区可在流体流内流动，如具有被外部屏障围绕着的内部流体核心的微胶囊。分配区可以是非含水相(如油相)内的含水流体的液滴。将一种或多种材料(例如，颗粒和生物颗粒)分配到分配区中可通过本文公开的任何方法进行。
颗粒可包含多个核酸条形码分子。多个核酸条形码分子可包含条形码序列(例如，核酸条形码序列)。在一些情况下，条形码序列在多个核酸条形码分子间可以是相同的。多个分配区可包含含有多个核酸条形码分子的多个颗粒。多个核酸条形码分子可包含至少1,000个条形码序列，所述至少1,000个条形码序列、至少10,000个条形码序列或至少100,000个条形码序列在多个分配区间可以是不同的。在一些情况下，核酸条形码分子可包含另外的序列。另外的序列可包括引物结合位点，如测序引物位点(例如，R1或R2)、流动池结合序列(例如，P5、P7)。引物结合位点可包含用于使测序引物与核酸在测序反应中杂交的序列。引物结合位点可包含用于使引物与核酸在扩增或其他延伸反应中杂交的序列。另外的序列可用于下游测定，如测序测定。另外的序列可基于所用的测定进行选择。
一旦从珠粒中释放，偶合于颗粒的多个核酸分子的给定核酸条形码分子或其部分可将来自生物颗粒的核酸分子条形码化，以生成条形码化核酸分子。给定核酸条形码分子可通过退火、延伸和扩增反应和/或连接反应附接于核酸分子。延伸和扩增试剂，如DNA聚合酶、核苷三磷酸和具有辅因子(例如Mg2+)的缓冲液可与生物颗粒和珠粒共分配。核酸条形码分子可附接于区段的一个或两个末端以产生条形码化核酸分子。可替代地或另外地，核酸杂交和延伸过程可发生在分配区内并且另外的延伸或扩增反应可发生在分配区外部(例如，在汇集来自多个此类分配区的材料之后)。
可将不同分配区的条形码化核酸分子或其衍生物(例如，已经添加一个或多个功能序列，或已经移除一个或多个特征的条形码化核酸分子)汇集并一起处理以用于后续分析，如在高通量测序仪上测序。在汇集时进行处理可使用条形码序列实施。例如，给定分配区的条形码化核酸分子可具有相同的条形码序列，所述条形码序列不同于其他分配区的条形码序列。可替代地，不同分配区的条形码化核酸分子可单独处理以用于后续分析(例如，测序)。条形码化核酸分子的测序(例如，在汇集混合物中或单独地)可提供包含核酸序列的测序读长。此类核酸序列可包含条形码化核酸分子的条形码序列或其互补序列。例如，可生成与给定分配区(例如，给定条形码化核酸分子或其集合体)对应的多个测序读长，其中多个测序读长的子集包括条形码化核酸分子的条形码序列或其互补序列。核酸序列可包含与分配区中的颗粒的核酸条形码分子对应的序列和/或与分配区中的生物颗粒的核酸分子对应的序列。
核酸序列中的条形码序列可实现核酸分子(且因此条形码化核酸分子)所来源的生物颗粒(例如，细胞)的物理和/或光学信息与核酸序列的电子关联。例如，核酸序列中的条形码序列可实现核酸条形码分子的条形码序列所来源的颗粒的鉴定。颗粒的鉴定可通过颗粒的物理和/或光学信息与分配区的电子关联而实现分配区的鉴定。分配区的鉴定可通过生物颗粒(例如，细胞)的光学信息与分配区的电子关联而实现分配区中的生物颗粒的鉴定。生物颗粒的鉴定可使得能够将与生物颗粒关联的任何表型信息(例如，细胞尺寸、形状等)与核酸序列相关联。在一些情况下，生物颗粒的表型信息与核酸序列的电子关联可用于测定对疗法的细胞反应。例如，对疗法的反应可包括细胞表型信息(例如，细胞器的数量)的变化。细胞表型信息的变化可与细胞的核酸分子的核酸序列相关联。
如图9所示，多个分配区可包括第一分配区902和第二分配区904。第一分配区902可包括第一生物颗粒(例如，细胞)906和第一颗粒(例如，凝胶珠粒)908。第二分配区904可包括第二生物颗粒(例如，细胞)910和第二颗粒(例如，凝胶珠粒)912。第一分配区902和第二分配区904可各自具有唯一物理和/或光学特性以区分于其他分配区。唯一物理和/或光学特性可以是分配区本身的特性(例如，分配区的体积或其他特征)和/或分配区的组分(如分配区的颗粒或生物颗粒)的特性。例如，第一颗粒908可以是圆形珠粒并且第二颗粒912可以是方形珠粒。第一颗粒和第二颗粒可包含偶合于其上的多个核酸条形码分子。多个核酸条形码分子可包含条形码序列。偶合于给定颗粒(例如，第一颗粒)的核酸条形码分子的条形码序列可以是相同的(例如，偶合于第一颗粒的核酸条形码分子各自包含相同的条形码序列并且偶合于第二颗粒的核酸条形码分子各自包含相同的条形码序列)，而与第一颗粒缔合的条形码序列可不同于与第二颗粒缔合的条形码序列。例如，第一颗粒可具有包含第一条形码序列的第一核酸条形码分子914并且第二颗粒可具有包含第二条形码序列的第二核酸条形码分子916。第一核酸条形码分子914的第一条形码序列可在分配颗粒之前和/或之后偶合于第一颗粒908。第二核酸条形码分子916的第二条形码序列可在分配颗粒之前和/或之后偶合于第二颗粒912。查找表(LUT)可用于将颗粒(例如，圆形或方形珠粒)的形状、颜色或形状和颜色的组合(或其他光学特性)与条形码序列(例如，第一或第二条形码序列)相关联。例如，具有圆形珠粒的第一颗粒908可与第一核酸条形码分子914的第一条形码序列相关联。具有方形珠粒的第二颗粒912可与第二核酸条形码分子916的第二条形码序列相关联。可替代地或另外地，颜色可用于区分第一颗粒908和第二颗粒912。
继续参考图9，第一生物颗粒和第二生物颗粒可具有不同的表型特性，如分别为细胞的圆形形状和细胞的方形形状。可分别在操作918和920中对第一分配区和第二分配区进行成像，以获得分配区的第一光学表征和第二光学表征。第一光学表征和第二光学表征可包括颗粒的物理表征和生物颗粒的表型信息。生物颗粒(例如，第一生物颗粒)可各自包含核酸分子。第一生物颗粒906的核酸分子可使用第一核酸条形码分子914的第一条形码序列条形码化，以生成第一条形码化核酸分子922。第二生物颗粒910的核酸分子可使用第二核酸条形码分子916的第二条形码序列条形码化，以生成第二条形码化核酸分子924。可对第一条形码化核酸分子和第二条形码化核酸分子进行测序(例如，一起或单独)，以产生分别与第一生物颗粒和第二生物颗粒的核酸分子和/或第一条形码序列和第二条形码序列对应的第一核酸序列926和第二核酸序列928。
继续参考图9，通过将核酸序列与分配区的物理和/或光学信息以电子方式关联，核酸序列中的条形码序列可实现条形码序列所来源的分配区(例如，条形码序列所来源的颗粒)的鉴定。电子关联可允许将核酸序列与生物颗粒(例如，细胞)的表型信息(例如，细胞的形状)相关联。核酸序列可包含生物颗粒的遗传信息。例如，在操作930中，第一核酸序列926中的第一条形码核酸分子914的第一条形码序列可用于使用LUT鉴定第一颗粒908。鉴定第一颗粒908可允许通过使用第一光学表征918鉴定第一生物颗粒906。此外，第一生物颗粒906(例如，圆形细胞)的表型信息可与第一核酸序列926相关联，继而与生物颗粒的遗传信息相关联。类似地，在操作932中，第二核酸序列中的第二核酸条形码分子916的第二条形码序列可用于使用LUT鉴定第二颗粒912。鉴定第二颗粒912可允许通过使用第二光学表征920鉴定第二生物颗粒910。此外，第二生物颗粒910(例如，细胞的方形形状)的表型信息可与第二核酸序列928相关联，继而与生物颗粒的遗传信息相关联。
本公开还提供了一种包含多个颗粒(例如，如本文所述)的试剂盒。试剂盒可包含多个颗粒，所述多个颗粒包含(i)偶合于其上的多个核酸条形码分子，其中多个条形码分子包含多个条形码序列。多个颗粒还可包含(ii)多个光学条形码，其中多个光学条形码包含多个光码。多个颗粒中的每个颗粒可包含(i)偶合于其上的多个核酸条形码分子的子集，以及(ii)多个光学条形码的子集。多个核酸条形码分子的子集的条形码序列在多个颗粒中的颗粒间是不同的，并且多个光学条形码的子集的光码在颗粒间是不同的。多个光学条形码的子集中的每个子集可包含单个光学条形码或两个或更多个光学条形码。多个光学条形码可赋予多个颗粒光学特性。此类光学特性可选自由以下各项组成的组：例如，颗粒或其组分的吸光度、双折射率、颜色、荧光特征、发光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。
如本文其他地方所述，光学条形码可包含一种或多种荧光染料、纳米颗粒、微粒，或其任何组合。例如，光学条形码可包含多个纳米颗粒，如多个量子点或Janus颗粒。在另一个实例中，光学条形码可包含多种荧光染料，如介于2-10种之间的荧光染料，如4种荧光染料。多种荧光染料可包括具有相同发射波长和不同强度的荧光染料，如介于2与50种之间的不同强度，如20种不同强度。多个光学条形码的子集中的每个子集可包含不同的光码。多个光学条形码可具有相对于彼此不同的相关联的光学强度或频率。多个光学条形码可包括至少1,000个不同光码，如至少10,000个不同光码或至少100,000个不同光码。
如本文其他地方所述，多个核酸条形码分子的子集的给定子集内的核酸条形码分子可包含相同的条形码序列。多个条形码序列可包括至少1,000个不同的条形码序列，如至少10,000个不同的条形码序列或至少100,000个不同的条形码序列。多个核酸条形码分子可包含多个功能序列(例如，启动子序列、测序衔接子、引发序列、随机N聚体、捕获序列等)。功能序列可被配置成与一个或多个靶分子相互作用，如一种或多种不同类型的靶分子(例如，RNA分子和DNA分子)。在一个实例中，附接于给定颗粒的多个核酸条形码分子可各自包含N聚体序列(例如，随机N聚体序列)，所述N聚体序列被配置成与多个DNA分子相互作用。在另一个实例中，附接于给定颗粒的多个核酸条形码分子可各自包含poly(T)序列，所述poly(T)序列被配置成与多个RNA分子(例如，信使RNA(mRNA)分子)相互作用。功能序列可被配置成捕获靶分子。例如，功能序列可被配置成与靶分子杂交，以有利于核酸延伸反应。
试剂盒的多个颗粒可包含至少10,000个颗粒，如至少100,000个颗粒。多个颗粒可包含多个珠粒，如多个凝胶珠粒。多个凝胶珠粒可包含聚丙烯酰胺聚合物。多个凝胶珠粒可各自包含可释放地偶合于其上的多个核酸条形码分子。例如，第一珠粒可包含可释放地偶合于其上的多个第一核酸条形码分子，并且第二珠粒可包含可释放地偶合于其上的多个第二核酸条形码分子。光学条形码(例如，光学材料，如荧光染料)可包括在颗粒表面上和/或颗粒内。在一个实例中，多个颗粒中的第一颗粒偶合于多个颗粒中的第二颗粒，其中第一颗粒包含多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子并且第二颗粒包含多个光学条形码中的光学条形码。
样品分配
本文提供了用于处理来自细胞的核酸分子的方法和系统。所述方法可用于将细胞的光学信息与来自细胞的核酸分子的核酸序列以电子方式关联。
在一个方面中，本文所述的系统和方法提供将单个生物颗粒的大分子组成内容物区室化、沉积或分配到离散隔室或分配区(在本文中可互换地称为分配区)中，其中每个分配区保持其自己的内容物与其他分配区的内容物的分离。分配区可以是乳液中的液滴。分配区可以包括一个或多个其他分配区。
本公开的分配区可包含生物颗粒和/或其大分子组分。分配区可包括一个或多个凝胶珠粒。分配区可包括一个或多个细胞珠。分配区可包括单个凝胶珠粒、单个细胞珠，或单个细胞珠和单个凝胶珠粒。细胞珠可以是例如通过含有生物颗粒的液滴和能够被聚合或胶凝的前体的聚合而包裹在凝胶或聚合物基体内的生物颗粒和/或其大分子组分中的一种或多种。可以在液滴产生之前、之后或同时如通过微胶囊(例如珠粒)将唯一标识符(如条形码)注射到液滴中，如下文进一步描述。微流体通道网络(例如，在芯片上)可用于产生如本文所述的分配区。在单个生物颗粒的分配中也可以采用替代机制，包括多孔膜，通过多孔膜将细胞的含水混合物挤出到非含水流体中。
分配区可在流体流内流动。分配区可包括例如微囊泡，其具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障。在一些情况下，分配区可包括多孔基体，其能够在其基体内夹带和/或保留材料。分配区可包括非含水连续相(例如油相)内的含水流体的液滴。分配区可包括第二相内的第一相的液滴，其中第一相和第二相是不混溶的。在例如美国专利申请公布2014/0155295中描述了多种不同的容器，所述申请出于所有目的以引用方式全文并入本文。用于在非含水或油状连续相中产生稳定液滴的乳液体系描述于例如美国专利申请公布2010/0105112中，所述申请出于所有目的以引用方式全文并入本文。
就乳液中的液滴而言，在一个非限制性实例中，将单个生物颗粒分配到离散分配区中可以通过将含水流体中的生物颗粒的流动流引入非含水流体的流动流中，使得在两股流的汇合点处产生液滴来实现。通过提供生物颗粒的一定浓度和/或流速下的含水流，可以控制所得分配区的占据率(例如，每个分配区的生物颗粒的数量)。在使用单个生物颗粒分配区的情况下，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，分配区可以每个分配区包含少于一个生物颗粒，以确保被占据的那些分配区主要被单独占据。在一些情况下，多个分配区中的分配区可包含至多一个生物颗粒(例如，珠粒、细胞或细胞材料)。在一些实施方案中，可以选择流体的相对流速，使得大多数分配区被占据，例如，仅允许一小部分未占据的分配区。可以控制流和通道架构以确保给定数量的单独占据分配区、小于一定水平的未占据分配区和/或小于一定水平的多占据分配区。
图1示出用于分配单个生物颗粒的微流体通道结构100的实例。通道结构100可包括在通道汇合点110处连通的通道区段102、104、106和108。在操作中，包括悬浮生物颗粒(或细胞)114的第一含水流体112可沿通道区段102输送到汇合点110中，同时与含水流体112不混溶的第二流体116从通道区段104和106中的每一个输送到汇合点110，以产生第一含水流体112的离散液滴118、120，离散液滴118、120流入通道区段108并从汇合点110流走。通道区段108可以流体联接到可以储存和/或收集离散液滴的出口贮存器。产生的离散液滴可包括单个生物颗粒114(如液滴118)。产生的离散液滴可包括多于一个单独生物颗粒114(图1中未示出)。离散液滴可以不包含生物颗粒114(例如液滴120)。每个离散分配区可以保持其自身内容物(例如，单独的生物颗粒114)与其他分配区的内容物的分离。
第二流体116可包含油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴118、120的后续聚结)的含氟表面活性剂。特别有用的分配流体和含氟表面活性剂的实例描述于例如美国专利申请公布2010/0105112中，所述申请出于所有目的以引用方式全文并入本文。
如将理解的，本文描述的通道区段可以联接到多种不同流体源或接收部件中的任一个，包括其他系统的贮存器、管道、歧管或流体部件。如将理解的，微流体通道结构100可具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于一个通道汇合点。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4或5个通道区段，所述通道区段各自承载在通道汇合点处相遇的生物颗粒、细胞珠和/或凝胶珠粒)。可以通过一个或多个流体流动单元引导流体沿着一个或多个通道或贮存器流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。还可以或以其他方式通过施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
产生的液滴可包括两个液滴子集：(1)占据的液滴118，其包含一个或多个生物颗粒114，和(2)未占据的液滴120，其不包含任何生物颗粒114。占据的液滴118可以包括单占液滴(具有一个生物颗粒)和多占液滴(具有多于一个生物颗粒)。如本文其他地方所述，在一些情况下，大多数占据的分配区可以每个占据的分配区包括不多于一个生物颗粒，并且一些产生的分配区可以未被(任何生物颗粒)占据。但是，在一些情况下，一些占据的分配区可能包括多于一个生物颗粒。在一些情况下，可以控制分配过程，使得少于约25％的占据分配区包含多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，少于约20％的占据分配区具有多于一个生物颗粒，而在一些情况下，少于约10％或甚至少于约5％的占据分配区包括每个分配区多于一个生物颗粒。
在一些情况下，可能希望最小化过度数量空分配区的产生，例如以降低成本和/或提高效率。尽管这种最小化可以通过在分配汇合点110处提供足够数量的生物颗粒(例如，生物颗粒114)例如以确保至少一个生物颗粒被包封在分配区中来实现，但是泊松分布可以预期地增加包含多个生物颗粒的分配区的数量。因此，在要获得单占分配区的情况下，至多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少产生的分配区可以是未被占据的。
在一些情况下，可以控制一个或多个生物颗粒(例如，在通道区段102中)的流动，或者引导到分配汇合点中的其他流体(例如，在通道区段104、106中)的流动，使得在许多情况下，不多于约50％产生的分配区、不多于约25％产生的分配区或不多于约10％产生的分配区未被占据。可以控制这些流以便呈现单占分配区的非泊松分布，同时提供较低水平的未占据分配区。可以实现上述范围的未占据分配区，同时仍然提供上述任何单占率。例如，在许多情况下，使用本文所述的系统和方法可以产生具有小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％，并且在许多情况下，小于约5％的多占率的所得分配区，同时具有小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或更少的未占据分配区。
如应理解，上述占据率也适用于包括生物颗粒和另外试剂的分配区，包括但不限于携带条形码化核酸分子(例如，寡核苷酸)的微胶囊(参照图2描述)。占据分配区(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的占据分配区)可包括包含条形码化核酸分子的微胶囊(例如珠粒)和生物颗粒。
在另一方面中，除了基于液滴的分配之外或作为基于液滴的分配的替代方案，生物颗粒可以包封在微胶囊内，所述微胶囊包括其中夹带有一个或多个单独生物颗粒或少量生物颗粒的外壳、层或多孔基体。微胶囊可包括其他试剂。可以通过多种方法执行生物颗粒的包封。此类方法将含有生物颗粒的含水流体与聚合物前体材料组合，所述聚合物前体材料在将特定刺激施加到聚合物前体后能够形成凝胶或其他固体或半固体基体。这样的刺激可以包括，例如，热刺激(加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过交联、前体的聚合引发(例如，通过添加的引发剂))等，和/或上述各项的组合。
包含生物颗粒的微胶囊的制备可以通过多种方法执行。例如，气刀液滴或气溶胶发生器可用于将前体流体液滴分配到胶凝溶液中，以形成包含单独生物颗粒或少量生物颗粒的微胶囊。同样地，基于膜的包封系统可用于产生包含如本文所述的包封生物颗粒的微胶囊。本公开的微流体系统，如图1所示，可容易地用于包封如本文所述的细胞。特别地，并且参考图1，包含(i)生物颗粒114和(ii)聚合物前体材料(未示出)的含水流体112流入通道汇合点110，在通道汇合点110中含水流体112通过非含水流体116的流动被分配成液滴118、120。就包封方法而言，非含水流体116还可包括引发剂(未示出)，以引起聚合物前体的聚合和/或交联，从而形成包含夹带的生物颗粒的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的实例包括美国专利申请公布2014/0378345中描述的那些，所述申请出于所有目的以引用方式全文并入本文。
例如，在聚合物前体材料包含线性聚合物材料(例如线性聚丙烯酰胺、PEG或其他线性聚合物材料)的情况下，活化剂可包含交联剂或活化在所形成的液滴中的交联剂的化学品。同样，对于包含可聚合单体的聚合物前体，活化剂可包括聚合引发剂。例如，在某些情况下，当聚合物前体包含丙烯酰胺单体与N，N′-双-(丙烯酰基)胱胺(BAC)共聚单体的混合物时，可在通道区段104和106中的第二流体流116内提供如四乙基甲二胺(TEMED)的试剂，其可以引发丙烯酰胺和BAC共聚成交联聚合物网络或水凝胶。
在汇合点110处第二流体流116与第一流体流112接触后，在液滴形成期间，TEMED可以从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的含水流体112中，这将活化液滴118、120内的聚丙烯酰胺的交联，导致以夹带细胞114的固体或半固体珠粒或颗粒的形式的凝胶(例如，水凝胶)微胶囊的形成。尽管描述了聚丙烯酰胺包封，但是其他“可活化的”包封组合物也可以用于本文所述的方法和组合物的上下文中。例如，形成藻酸盐液滴，然后暴露于二价金属离子(例如，Ca2+离子)，可以用作使用所述方法的包封方法。同样地，琼脂糖液滴也可以通过基于温度的胶凝(例如，在冷却后等)转化成胶囊。
在一些情况下，包封的生物颗粒可以选择性地从微胶囊中释放，例如通过时间的推移或在施加特定刺激后，所述刺激使微胶囊充分降解以允许生物颗粒(例如，细胞)或其其他内容物从微胶囊中释放，例如进入分配区(例如，液滴)。例如，就上述聚丙烯酰胺聚合物而言，微胶囊的降解可以通过引入适当的还原剂如DTT等以裂解交联聚合物基体的二硫键来完成。参见，例如，美国专利申请公布2014/0378345，所述申请出于所有目的以引用方式全文并入本文。
可以使生物颗粒经受足以聚合或胶凝前体的其他条件。足以聚合或胶凝前体的条件可包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光。足以聚合或胶凝前体的条件可包括足以聚合或胶凝前体的任何条件。在聚合或胶凝之后，可以在生物颗粒周围形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶可扩散地渗透到化学或生物化学试剂中。聚合物或凝胶不可扩散地渗透到生物颗粒的大分子组分中。以这种方式，聚合物或凝胶可以起允许生物颗粒经受化学或生物化学操作，同时在空间上将大分子组分限制在由聚合物或凝胶限定的液滴区域的作用。聚合物或凝胶可包括二硫键交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-硫醇、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可包含任何其他聚合物或凝胶。
可以将聚合物或凝胶官能化以结合目标分析物，例如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其他分析物。聚合物或凝胶可以通过被动机制聚合或胶凝。聚合物或凝胶可以在碱性条件下或在升高的温度下是稳定的。聚合物或凝胶可具有与珠粒的机械性质类似的机械性质。例如，聚合物或凝胶可具有与珠粒类似的尺寸。聚合物或凝胶可具有与珠粒类似的机械强度(例如拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可以低于油。聚合物或凝胶的密度可以与缓冲液的密度大致类似。聚合物或凝胶可具有可调的孔径。可以选择孔径以例如保留变性的核酸。可以选择孔径以保持对外源性化学物质如氢氧化钠(NaOH)和/或内源性化学物质如抑制剂的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以保持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生物化学相容的。聚合物或凝胶可以以热、化学、酶促和/或光的方式聚合和/或解聚。
聚合物可包含与二硫键交联的聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)。聚合物的制备可包括两步反应。在第一活化步骤中，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于酰化剂以将羧酸转化为酯。例如，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)。可以将聚丙烯酰胺-共-丙烯酸暴露于4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉的其他盐。在第二交联步骤中，可以将在第一步中形成的酯暴露于二硫化物交联剂。例如，可以将酯暴露于胱胺(2，2′-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后，生物颗粒可以被通过二硫桥连接在一起的聚丙烯酰胺链包围。以这种方式，生物颗粒可以被包裹在凝胶或基体(例如，聚合物基体)内部或包含凝胶或基体以形成“细胞珠”。细胞珠可以包含生物颗粒(例如，细胞)或生物颗粒的大分子组分(例如，RNA、DNA、蛋白质等)。细胞珠可包括单个细胞或多个细胞，或单个细胞或多个细胞的衍生物。例如，在裂解和洗涤细胞后，可以从细胞裂解物中洗去抑制成分，并且可以将大分子组分结合为细胞珠。本文公开的系统和方法可适用于含有生物颗粒的细胞珠(和/或液滴或其他分配区)和含有生物颗粒的大分子组分的细胞珠(和/或液滴或其他分配区)。
与基于液滴分配的生物颗粒相比，包封的生物颗粒可以提供更易储存和更便携的某些潜在优点。此外，在一些情况下，希望允许生物颗粒在分析之前温育一段选定时间，例如以便表征在存在或不存在不同刺激的情况下此类生物颗粒随时间的变化。在此类情况下，与在乳液液滴中分配相比，包封可以允许更长时间的温育，但是在一些情况下，液滴分配的生物颗粒也可以温育不同的时间段，例如，至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、或至少10小时或更长时间。生物颗粒的包封可以构成生物颗粒的分配，其他试剂在其中共分配。可替代地或另外地，包封的生物颗粒可以轻易地沉积到如上所述的其他分配区(例如，液滴)中。
珠粒
分配区可包含一个或多个唯一标识符，如条形码。条形码可预先、随后或同时递送到保持分室化或分配生物颗粒的分配区。例如，可以在液滴产生之前、之后或同时将条形码注射到液滴中。将条形码递送到特定分配区允许稍后将单独生物颗粒的特征归属于特定分配区。条形码可通过任何合适的机制在例如核酸分子(例如，寡核苷酸)上递送至分配区。条形码化核酸分子可以通过微胶囊递送至分配区。在一些情况下，微胶囊可包含珠粒。珠粒在下面进一步详细描述。
在一些情况下，条形码化核酸分子可以最初与微胶囊缔合，然后从微胶囊释放。条形码化核酸分子的释放可以是被动的(例如，通过从微胶囊中扩散出来)。另外地或可替代地，从微胶囊中的释放可以在施加允许条形码化核酸分子从微胶囊中解离或释放的刺激后发生。这种刺激可破坏微胶囊，是将条形码化核酸分子与微胶囊偶合或在微胶囊内偶合的相互作用，或两者。这种刺激可以包括，例如，热刺激、光刺激、化学刺激(例如，pH的变化或使用一种或多种还原剂)、机械刺激、辐射刺激；生物刺激(例如酶)或其任何组合。
图2示出用于将携带条形码的珠粒递送至液滴的微流体通道结构200的实例。通道结构200可包括在通道汇合点210处连通的通道区段201、202、204、206和208。在操作中，通道区段201可将包含多个珠粒214(例如，具有核酸分子、寡核苷酸、分子标签)的含水流体212沿着通道区段201输送到汇合点210处。多个珠粒214可以源自珠粒的悬浮液。例如，通道区段201可以连接到包含珠粒214的含水悬浮液的贮存器。通道区段202可以将包括多个生物颗粒216的含水流体212沿着通道区段202输送到汇合点210。多个生物颗粒216可以源自生物颗粒的悬浮液。例如，通道区段202可以连接到包含生物颗粒216的含水悬浮液的贮存器。在一些情况下，第一通道区段201或第二通道区段202中或两个区段中的含水流体212可以包括一种或多种试剂，如下面进一步描述的。与含水流体212不混溶的第二流体218(例如，油)可以从通道区段204和206中的每一个被递送到汇合点210。在来自通道区段201和202中的每一个的含水流体212与来自通道区段204和206中的每一个的第二流体218在通道汇合点210处相遇后，含水流体212可以在第二流体218中以离散液滴220的形式被分配并且沿着通道区段208从汇合点210流出。通道区段208可以将离散液滴递送到流体联接到通道区段208的出口贮存器，在所述贮存器中将它们加以收集。
作为替代方案，通道区段201和202可以在汇合点210的上游的另一个汇合点处相遇。在这样的汇合点处，珠粒和生物颗粒可以形成混合物，所述混合物沿着另一个通道被引导到汇合点210以产生液滴220。所述混合物可以以交替的方式提供珠粒和生物颗粒，使得例如液滴包含单个珠粒和单个生物颗粒。
珠粒、生物颗粒和液滴可以基本上常规的流动模式(例如，以常规流速)沿着通道流动。此类常规的流动模式可允许液滴包括单个珠粒和单个生物颗粒。此类常规的流动模式可以允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的占据率(例如，具有珠粒和生物颗粒的液滴)。在例如美国专利公布2015/0292988中提供了此类常规流动模式和可用于提供此类常规流动模式的装置，所述专利以引用方式全文并入本文。
第二流体218可包含油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴220的后续聚结)的含氟表面活性剂。
产生的离散液滴可包括单独的生物颗粒216。产生的离散液滴可包括携带条形码或其他试剂的珠粒214。产生的离散液滴可包括单个生物颗粒和携带条形码的珠粒，如液滴220。在一些情况下，离散液滴可以包括多于一个单独的生物颗粒或不包括生物颗粒。在一些情况下，离散液滴可包括多于一个珠粒或不包括珠粒。离散液滴可能未被占据(例如，没有珠粒、没有生物颗粒)。
有利地，分配生物颗粒和携带条形码的珠粒的离散液滴可以有效地允许将条形码归属于分配区内的生物颗粒的大分子组分。分配区的内容物可保持与其他分配区的内容物离散。
如将理解的，本文描述的通道区段可以联接到多种不同流体源或接收部件中的任一个，包括其他系统的贮存器、管道、歧管或流体部件。如将理解的，微流体通道结构200可具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于一个通道汇合点。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4或5个通道区段，每个通道区段携带在通道汇合点处相遇的珠粒。可以通过一个或多个流体流动单元引导流体沿着一个或多个通道或贮存器流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。还可以或以其他方式通过施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的、可破坏的和/或可降解的。在一些情况下，珠粒可以是不可降解的。在一些情况下，珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由分子前体形成，例如聚合物或单体物质。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在其他情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。
珠粒可具有任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长圆形、无定形、圆形、圆柱形及其变型形式。
珠粒可具有均匀尺寸或不均匀尺寸。在一些情况下，珠粒的直径可为至少约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠粒的直径可小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小。在一些情况下，珠粒的直径可以在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm、或20-500μm的范围内。
在某些方面中，珠粒可以以具有相对单分散尺寸分布的珠粒群体或多个珠粒提供。在需要在分配区内提供相对一致量的试剂的情况下，保持相对一致的珠粒特征(如尺寸)可有助于总体一致性。特别地，本文所述的珠粒可具有其横截面尺寸的变异系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％，并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小的尺寸分布。
珠粒可包含天然和/或合成材料。例如，珠粒可包含天然聚合物、合成聚合物或天然和合成聚合物。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，例如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基链烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐树胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、琼脂糖、海藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸类、尼龙、硅氧烷、氨纶、粘胶人造丝、多元羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(三氟氯乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)和/或其组合(例如，共聚物)。珠粒也可以由除聚合物之外的材料形成，包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些情况下，珠粒可含有分子前体(例如，单体或聚合物)，其可通过分子前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是已经聚合的物质，其能够通过例如化学交联进行进一步聚合。在一些情况下，前体可包含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠粒可包含预聚物，其是能够进一步聚合的低聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠粒。在一些情况下，珠粒可含有可进一步聚合在一起的单个聚合物。在一些情况下，可以通过不同前体的聚合生成珠粒，使得它们包含混合聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些情况下，珠粒可在聚合物前体(例如，单体、低聚物、线性聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间包含共价键或离子键。在一些情况下，共价键可以是碳-碳键或硫醚键。
交联可以是永久的或可逆的，这取决于所用的特定交联剂。可逆交联可允许聚合物在适当条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联还可以允许结合至珠粒表面的材料的可逆附接。在一些情况下，交联剂可形成二硫键。在一些情况下，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或改性胱胺。
在一些情况下，二硫键可以在掺入珠粒的分子前体单元(例如，单体、低聚物或线性聚合物)或前体与核酸分子(例如，寡核苷酸)之间形成。例如，胱胺(包括改性胱胺)是包含二硫键的有机试剂，其可以用作珠粒的单个单体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可以在胱胺或包含胱胺的物质(例如，改性胱胺)的存在下聚合，以生成包含二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如，包含可化学还原交联剂的可化学降解珠粒)。二硫键可以使珠粒在珠粒暴露于还原剂后被降解(或溶解)。
在一些情况下，壳聚糖(线性多糖聚合物)可以通过亲水链与戊二醛交联以形成珠粒。壳聚糖聚合物的交联可以通过由热、压力、pH变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些情况下，珠粒可包含Acrydite部分，其在某些方面可用于将一个或多个核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)附接于珠粒。在一些情况下，丙烯酰胺亚磷酰胺部分可以指由丙烯酰胺亚磷酰胺与一种或多种物质反应例如丙烯酰胺亚磷酰胺与其他单体和交联剂在聚合反应期间的反应所生成的丙烯酰胺亚磷酰胺类似物。可以修饰Acrydite部分以与待附接的物质形成化学键，例如核酸分子(例如条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)。丙烯酰胺亚磷酰胺部分可以用能够形成二硫键的硫醇基团修饰，或者可以用已经包含二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(通过二硫化物交换)可以用作待附接的物质的锚点，或者丙烯酰胺亚磷酰胺部分的另一部分可以用于附接。在一些情况下，附接可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在还原剂存在下)，附接的物质从珠粒中释放出来。在其他情况下，Acrydite部分可包含可用于附接的反应性羟基。
用于附接核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠粒的官能化可以通过多种不同方法实现，包括活化聚合物内的化学基团、将活性或可活化的官能团掺入聚合物结构中或者在珠粒生产中的预聚物或单体阶段进行附接。
例如，聚合形成珠粒的前体(例如，单体，交联剂)可包含丙烯酰胺亚磷酰胺部分，使得当生成珠粒时，珠粒还包含丙烯酰胺亚磷酰胺部分。所述Acrydite部分可以附接于核酸分子(例如，寡核苷酸)，其可以包括引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、用于信使RNA的引物序列)和/或一个或多个条形码序列。一个或多个条形码序列可包括对于与给定珠粒偶合的所有核酸分子相同的序列和/或对于与给定珠粒偶合的所有核酸分子不同的序列。核酸分子可被掺入珠粒中。
在一些情况下，核酸分子可以包含例如用于附接于测序流动池的功能序列，例如用于
测序的P5序列。在一些情况下，核酸分子或其衍生物(例如，由核酸分子产生的寡核苷酸或多核苷酸)可以包含另一种功能序列，例如像用于附接于测序流动池以用于Illumina测序的P7序列。在一些情况下，核酸分子可包含条形码序列。在一些情况下，引物还可包含唯一分子标识符(UMI)。在一些情况下，引物可包含用于Illumina测序的R1引物序列。在一些情况下，引物可包含用于Illumina测序的R2引物序列。可以与本公开的组合物、装置、方法和系统一起使用的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)及其用途的实例提供于美国专利公布2014/0378345和2015/0376609中，所述专利各自以引用方式全文并入本文。
在一些情况下，包含具有反应性或能够被活化以使得变得具有反应性的官能团的前体可以与其他前体聚合以生成包含活化或可活化官能团的凝胶珠粒。然后官能团可以用于将另外的物质(例如，二硫化合物接头、引物、其他寡核苷酸等)附接于凝胶珠粒。例如，包含羧酸(COOH)基团的一些前体可与其他前体共聚合以形成也包含COOH官能团的凝胶珠粒。在一些情况下，丙烯酸(包含游离COOH基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰基)胱胺可以共聚合在一起以生成包含游离COOH基团的凝胶珠粒。可以将凝胶珠粒的COOH基团活化(例如，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM))使得它们具有反应性(例如，具有与胺官能团的反应性，其中EDC/NHS或DMTMM用于活化)。然后，活化的COOH基团可以与适当的物质(例如，包含胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以具有与胺官能团的反应性)反应，所述物质包含与珠粒连接的部分。
在聚合物网络中包含二硫键的珠粒可以通过将一些二硫键还原成游离硫醇来用另外的物质官能化。二硫键可以通过例如还原剂(例如DTT，TCEP等)的作用被还原，以生成游离硫醇基团，而不会溶解珠粒。然后，珠粒的游离硫醇可以与物质的游离硫醇或包含另一个二硫键的物质(例如，通过硫醇-二硫化物交换)反应，使得物质可以与珠粒连接(例如，通过生成的二硫键)。在一些情况下，珠粒的游离硫醇可与任何其他合适的基团反应。例如，珠粒的游离硫醇可与包含丙烯酰胺亚磷酰胺部分的物质反应。珠粒的游离硫醇基团可通过迈克尔加成化学与丙烯酰胺亚磷酰胺反应，使得包含丙烯酰胺亚磷酰胺的物质与珠粒连接。在一些情况下，可以通过包含硫醇加帽剂如N-乙基马来酰胺或碘乙酸酯来防止不受控制的反应。
可以控制珠粒内二硫键的活化，使得仅少量二硫键被活化。例如，可以通过控制用于生成游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的浓度来进行控制。在一些情况下，低浓度(例如，还原剂分子：凝胶珠粒比率小于或等于约1∶100,000,000,000、小于或等于约1∶10,000,000,000、小于或等于约1∶1,000,000,000、小于或等于约1∶100,000,000、小于或等于约1∶10,000,000、小于或等于约1∶1,000,000、小于或等于约1∶100,000、小于或等于约1∶10,000)还原剂可用于还原。控制还原成游离硫醇的二硫键的数量可用于确保官能化期间的珠粒结构完整性。在一些情况下，光学活性剂(例如荧光染料)可以通过珠粒的游离硫醇基团与珠粒偶合，并用于定量珠粒中存在的游离硫醇的数量和/或追踪珠粒。
在一些情况下，在凝胶珠粒形成之后向凝胶珠粒中添加各部分可能是有利的。例如，在凝胶珠粒形成之后添加寡核苷酸(例如，条形码化寡核苷酸)可以避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物质的损失。此外，较小的前体(例如，不包含侧链基团和连接部分的单体或交联剂)可以用于聚合，并且由于粘性效应而可以最小程度地阻碍链末端生长。在一些情况下，在凝胶珠粒合成之后的官能化可以在潜在的破坏剂(例如，自由基)和/或化学环境的情况下使待负载的物质(例如，寡核苷酸)的暴露最小化。在一些情况下，所生成的凝胶可具有上限临界溶液温度(UCST)，其可允许温度驱动的珠粒溶胀和塌陷。在随后用寡核苷酸官能化珠粒期间，这种官能团可有助于寡核苷酸(例如，引物)渗入珠粒中。产生后官能化也可用于控制珠粒中物质的负载比率，使得例如负载比率的可变性最小化。物质负载也可以在分批过程中进行，使得多个珠粒可以在单批次中用物质官能化。
注射或以其他方式引入到分配区中的珠粒可包括可释放、可裂解或可逆附接的条形码。注射或以其他方式引入到分配区中的珠粒可包括可活化的条形码。注射或以其他方式引入到分配区中的珠粒可以是可降解的、可破裂的或可溶解的珠粒。
条形码可以可释放地、可裂解地或可逆地附接到珠粒，使得条形码可以通过裂解条形码分子与珠粒之间的连接而释放或为可释放的，或者通过下面的珠粒自身的降解释放，从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近，或两者兼而有之。在非限制性实例中，可以通过还原二硫键、使用限制酶、光活化裂解或通过其他类型的刺激(例如，化学、热、pH、酶等)和/或反应进行裂解来实现，例如本文其他地方所述。可释放的条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦释放就可用于反应。因此，例如，可通过从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分配区)释放条形码来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中还设想了其他可活化配置。
除了珠粒与缔合分子(例如含有条形码的核酸分子(例如条形码化寡核苷酸))之间的可裂解键之外或作为其替代，珠粒可以在自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)后为可降解、可破坏或可溶解的。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的，使得珠粒的材料组分在暴露于特定化学物质或环境变化(例如变化温度或pH变化)时溶解。在一些情况下，凝胶珠粒可以在升高的温度和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠粒可以是可热降解的，使得当珠粒暴露于适当的温度变化(例如，加热)时，珠粒降解。与物质(例如，核酸分子，例如条形码化寡核苷酸)结合的珠粒的降解或溶解可导致物质从珠粒中释放。
从以上公开内容可以理解，珠粒的降解可以指在使物理珠粒本身的结构发生和不发生降解的情况下结合或夹带的物质从珠粒中解离。例如，珠粒的降解可以涉及通过本文其他地方描述的一种或多种物质和/或方法裂解可裂解键。在另一个实例中，可以通过例如由改变化学环境引起的渗透压差从珠粒中释放夹带的物质。举例来说，由渗透压差引起的珠粒孔径的改变通常可以在珠粒本身的结构没有降解的情况下发生。在一些情况下，由珠粒的渗透溶胀引起的孔径增加可以允许珠粒内的夹带物质的释放。在其他情况下，由于孔径收缩，珠粒的渗透收缩可能使珠粒更好地保留夹带物质。
可以将可降解的珠粒引入到分配区(例如乳液中的液滴或孔)中，使得珠粒在分配区内降解，并且当施加适当的刺激时，任何缔合的物质(例如，寡核苷酸)在液滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分配区中包含的其他试剂相互作用。例如，包含胱胺并通过二硫键与条形码序列连接的聚丙烯酰胺珠粒可以与油包水乳液的液滴中的还原剂组合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致珠粒降解并将条形码序列释放到液滴的含水内部环境中。在另一个实例中，加热在碱性溶液中包含结合珠粒的条形码序列的液滴也可导致珠粒降解并将附接的条形码序列释放到液滴的含水内部环境中。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)可以与珠粒缔合，使得在从珠粒中释放后，分子标签分子(例如，引物，例如，条形码化寡核苷酸)以预先定义的浓度存在于分配区中。可以选择这种预定义浓度以促进用于在分配区内生成测序文库的某些反应(例如扩增)。在一些情况下，引物的预先定义的浓度可以通过产生携带核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠粒的过程来限制。
在一些情况下，珠粒可以非共价地负载有一种或多种试剂。珠粒可以通过例如使珠粒经受足以使珠粒溶胀的条件，使试剂有足够的时间扩散到珠粒的内部，并使珠粒经受足以使珠粒去溶胀的条件来非共价负载。例如，可以通过将珠粒置于热力学上有利的溶剂中，使珠粒经受较高或较低的温度，使珠粒经受较高或较低的离子浓度，和/或使珠粒经受电场来实现珠粒的溶胀。珠粒的溶胀可以通过各种溶胀方法来实现。珠粒的去溶胀可以通过例如将珠粒转移到热力学上不利的溶剂中，使珠粒经受较低或较高温度，使珠粒经受较低或较高的离子浓度，和/或除去电场来实现。珠粒的去溶胀可以通过各种去溶胀方法来实现。转移珠粒可能导致珠粒中的孔收缩。然后收缩可能阻碍珠粒内的试剂从珠粒的内部扩散出来。阻碍可能是由于试剂与珠粒内部之间的空间相互作用。转移可以以微流体方式完成。例如，转移可以通过将珠粒从一种共流动的溶剂流移动到不同的共流动的溶剂流中来实现。珠粒的溶胀性和/或孔径可通过改变珠粒的聚合物组成来调节。
在一些情况下，与前体连接的Acrydite部分、与前体连接的另一种物质或前体本身可包含不稳定键，例如化学、热或光敏感键，例如二硫键、UV敏感键等。一旦丙烯酰胺亚磷酰胺部分或包含不稳定键的其他部分被掺入珠粒中，珠粒也可包含不稳定键。例如，不稳定键可用于将物质(例如，条形码、引物等)可逆地连接(例如，共价连接)到珠粒。在一些情况下，例如，在寡核苷酸与附接于珠粒的互补序列杂交时，热不稳定键可包括基于核酸杂交的附接，使得杂合体的热解链将寡核苷酸(例如含有条形码的序列)从珠粒或微胶囊释放。
向凝胶珠粒中添加多种类型的不稳定键可导致生成能够对不同刺激有反应的珠粒。每种类型的不稳定键可能对相关联的刺激(例如，化学刺激、光、温度、酶等)敏感，使得通过每个不稳定键附接到珠粒上的物质的释放可以通过施加适当的刺激来控制。这种官能团可用于从凝胶珠粒受控地释放物质。在一些情况下，包含不稳定键的另一物质可以在凝胶珠粒形成之后通过例如如上所述的凝胶珠粒的活化官能团与凝胶珠粒连接。如应当理解的，可释放地、可裂解地或可逆地附接到本文所述的珠粒的条形码包括通过条形码分子与珠粒之间的键联的裂解来释放或可释放的条形码，或通过下面的珠粒本身的降解来释放的条形码，允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近，或两者兼而有之。
如本文所述可释放的条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦释放就可用于反应。因此，例如，可通过从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分配区)释放条形码来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中还设想了其他可活化配置。
除了可热裂解的键、二硫键和UV敏感键之外，可以与前体或珠粒偶合的不稳定键的其他非限制性实例包括酯键(例如，可用酸、碱或羟胺裂解)、邻位二醇键(例如，可通过高碘酸钠裂解)、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)键(例如，可通过热裂解)、砜键(例如，可通过碱裂解)、甲硅烷基醚键(例如，可通过酸裂解)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶裂解)、肽键(例如，可通过蛋白酶裂解)或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶(例如，DNA酶)裂解))。键可以通过其他核酸分子靶向酶裂解，例如限制酶(例如限制性内切核酸酶)，如下文进一步描述的。
在珠粒产生期间(例如，在前体聚合期间)，可以将物质包封在珠粒中。此类物质可能参与或可能不参与聚合。此类物质可以进入聚合反应混合物中，使得生成的珠粒在珠粒形成后包含各物质。在一些情况下，可在形成之后将此类物质加入凝胶珠粒中。此类物质可包括，例如，核酸分子(例如，寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲液)包括文中所述的那些、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液)、用于核酸修饰反应的试剂(例如聚合、连接或消化)和/或用于一种或多种测序平台的模板制备(例如，标记)的试剂(例如，用于
的
)。此类物质可包括本文所述的一种或多种酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性酶(例如，内切核酸酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。此类物质可包括本文其他地方所述的一种或多种试剂(例如，裂解剂、抑制剂、失活剂、螯合剂、刺激)。此类物质的捕集可以通过在前体的聚合期间生成的聚合物网络密度、凝胶珠粒内离子电荷的控制(例如，通过与聚合物质连接的离子物质)或通过其他物质的释放来控制。可以在珠粒降解后和/或通过施加能够从珠粒释放物质的刺激从珠粒释放包封的物质。可替代地或另外地，物质可在分配区形成期间或之后在分配区(例如，液滴)中分配。此类物质可包括但不限于也可包封在珠粒中的上述物质。
可降解珠粒可包含一种或多种具有不稳定键的物质，使得当珠粒/物质暴露于适当的刺激时，键断裂并且珠粒降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于产生珠粒的交联剂可包含不稳定键。在暴露于适当的条件后，不稳定键可以断裂并且珠粒降解。例如，当将包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠粒暴露于还原剂后，胱胺的二硫键可以断裂并且珠粒降解。
与不降解的珠粒相比，当将适当的刺激施加到珠粒上时，可降解的珠粒可用于更快地从珠粒释放附接的物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于与多孔珠粒的内表面结合的物质或在包封物质的情况下，该物质在珠粒降解后可具有较大迁移率并且可被溶液中的其他物质接近。在一些情况下，物质也可以通过可降解的接头(例如，二硫化物接头)附接于可降解的珠粒。可降解的接头可以对与可降解珠粒相同的刺激有反应，或者两种可降解物质可以对不同的刺激有反应。例如，条形码序列可以通过二硫键附接到包含胱胺的聚丙烯酰胺珠粒上。在条形码化珠粒暴露于还原剂后，珠粒降解并且条形码序列在条形码序列与珠粒之间的二硫键断裂以及珠粒中胱胺的二硫键断裂后释放。
从以上公开内容可以理解，虽然被称为珠粒的降解，但在如上所述的许多情况下，所述降解可以指在使物理珠粒本身的结构发生和不发生降解的情况下结合或夹带的物质从珠粒中解离。例如，可以通过例如由改变化学环境引起的渗透压差从珠粒中释放夹带的物质。举例来说，由渗透压差引起的珠粒孔径的改变通常可以在珠粒本身的结构没有降解的情况下发生。在一些情况下，由珠粒的渗透溶胀引起的孔径增加可以允许珠粒内的夹带物质的释放。在其他情况下，由于孔径收缩，珠粒的渗透收缩可能使珠粒更好地保留夹带物质。
在提供可降解珠粒的情况下，避免将此类珠粒在给定时间之前暴露于引起这种降解的一个或多个刺激可能是有益的，以便例如避免过早的珠粒降解和由这种降解引起的问题，包括例如不良的流动特性和聚集。举例来说，在珠粒包含可还原的交联基团例如二硫化物基团的情况下，希望避免使此类珠粒与还原剂例如DTT或其他二硫化物裂解试剂接触。在此类情况下，对本文所述珠粒的处理将在一些情况下不提供还原剂，例如DTT。因为还原剂通常在商业酶制剂中提供，所以可能需要在处理本文所述的珠粒时提供不含还原剂(或不含DTT)的酶制剂。此类酶的实例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂、以及可用于处理本文所述珠粒的许多其他酶制剂。术语“不含还原剂”或“不含DTT”的制剂可以指对于用于降解这些珠粒的此类材料而言具有小于约1/10、小于约1/50、或甚至小于约1/100的较低范围的制剂。例如，对于DTT，不含还原剂的制剂可具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM DTT、0.0005mM DTT、或甚至小于约0.0001mM DTT。在许多情况下，DTT的量可能无法检测到。
可以使用许多化学触发剂来触发珠粒的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于pH介导的珠粒内组分完整性的改变、通过交联键的裂解的珠粒组分的降解以及珠粒组分的解聚。
在一些实施方案中，珠粒可以由包含可降解的化学交联剂(例如BAC或胱胺)的材料形成。此类可降解交联剂的降解可通过许多机制完成。在一些实施例中，可以将珠粒与化学降解剂接触，所述化学降解剂可以诱导氧化、还原或其他化学变化。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的其他实例可包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1，4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可降解在形成珠粒的凝胶前体之间形成的二硫键，并且因此降解珠粒。在其他情况下，溶液的pH变化(例如pH增加)可触发珠粒的降解。在其他情况下，暴露于水溶液(例如水)可触发水解降解，并且因此触发珠粒的降解。
在施加热刺激后，还可以诱导珠粒释放其内容物。温度的变化可导致珠粒的各种变化。例如，热可导致固体珠粒液化。热的变化可导致珠粒的熔化，使得珠粒的一部分降解。在其他情况下，热可增加珠粒组分的内压，使得珠粒破裂或爆炸。热还可以作用于用作构建珠粒的材料的热敏聚合物。
任何合适的试剂可使珠粒降解。在一些实施方案中，温度或pH的变化可用于降解珠粒内的热敏性或pH敏感性键。在一些实施方案中，化学降解剂可用于通过氧化、还原或其他化学变化降解珠粒内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如DTT，其中DTT可以降解在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，因此降解珠粒。在一些实施方案中，可以添加还原剂以使珠粒降解，所述还原剂可以使珠粒释放或不释放其内容物。还原剂的实例可包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1，4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的浓度存在。还原剂可以以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更低的浓度存在。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)可以与珠粒缔合，使得在从珠粒中释放后，分子标签分子(例如，引物，例如，条形码化寡核苷酸)以预先定义的浓度存在于分配区中。可以选择这种预定义浓度以促进用于在分配区内生成测序文库的某些反应(例如扩增)。在一些情况下，引物的预先定义的浓度可以通过产生携带寡核苷酸的珠粒的过程来限制。
尽管以上已经就提供基本上单独占据的分配区描述了图1和图2，但在某些情况下，可能希望提供例如包含两个、三个、四个或更多个细胞的多占分配区和/或在单个分配区内包括条形码化核酸分子(例如，寡核苷酸)的微胶囊(例如珠粒)。因此，如上所述，可以控制含有生物颗粒和/或珠粒的流体和分配流体的流动特性，以提供这种多占分配区。特别地，可以控制流动参数以提供大于约50％、大于约75％、并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的分配区的给定占据率。
在一些情况下，可以使用另外的微胶囊以将额外的试剂递送到分配区。在这种情况下，从不同的珠粒源(例如，包含不同的缔合试剂)通过不同的通道入口进入公共通道或液滴产生汇合点(例如，汇合点210)将不同的珠粒引入这样的公共通道或液滴产生汇合点可能是有利的。在此类情况下，可以控制不同珠粒进入通道或汇合点的流动和频率，以提供来自每个源的一定比率的微胶囊，同时确保到分配区中的此类珠粒与给定数量的生物颗粒的给定配对或组合(例如，每个分配区一个生物颗粒和一个珠粒)。
本文所述的分配区可包括小体积，例如，小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更低。
例如，在基于液滴的分配区的情况下，液滴可具有小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更少的总体积。在与微胶囊共分配的情况下，应当理解，分配区内的样品流体体积(例如包括共分配的生物颗粒和/或珠粒)可小于上述体积的约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、或小于上述体积的约10％。
如本文其他地方所述，将物质分配可产生分配区群或多个分配区。在此类情况下，可以产生或以其他方式提供任何合适数量的分配区。例如，可以产生或以其他方式提供至少约1,000个分配区、至少约5,000个分配区、至少约10,000个分配区、至少约50,000个分配区、至少约100,000个分配区、至少约500,000个分配区、至少约1,000,000个分配区、至少约5,000,000个分配区、至少约10,000,000个分配区、至少约50,000,000个分配区、至少约100,000,000个分配区、至少约500,000,000个分配区、至少约1,000,000,000个分配区或更多分配区。此外，多个分配区可以包括未占据的分配区(例如，空分配区)和占据的分配区。
试剂
根据某些方面，生物颗粒可以连同裂解试剂一起分配，以释放分配区内的生物颗粒的内容物。在此类情况下，裂解剂可以在将生物颗粒例如通过通道汇合点上游的另外通道或多个通道引入分配汇合点/液滴产生区(例如，汇合点210)的同时或就在其之前与生物颗粒悬浮液接触。根据其他方面，另外地或可替代地，生物颗粒可以连同其他试剂一起分配，如下面将进一步描述的。
图3示出用于共分配生物颗粒和试剂的微流体通道结构300的实例。通道结构300可包括通道区段301、302、304、306和308。通道区段301和302在第一通道汇合点309处连通。通道区段302、304、306和308在第二通道汇合点310处连通。
在示例性操作中，通道区段301可以将包括多个生物颗粒314的含水流体312沿着通道区段301输送到第二汇合点310中。作为替代或除此之外，通道区段301可以运输珠粒(例如，凝胶珠粒)。珠粒可包含条形码分子。
例如，通道区段301可以连接到包括生物颗粒314的含水悬浮液的贮存器。在第二汇合点310的上游和就在达到其之前，通道区段301可以在第一汇合点309处与通道区段302相遇。通道区段302可以将悬浮在含水流体312中的多个试剂315(例如，裂解剂)沿着通道区段302输送到第一汇合点309中。例如，通道区段302可以连接到包含试剂315的贮存器。在第一汇合点309之后，通道区段301中的含水流体312可以将生物颗粒314和试剂315携带到第二汇合点310。在一些情况下，通道区段301中的含水流体312可包括一种或多种试剂，所述一种或多种试剂可以是与试剂315相同或不同的试剂。与含水流体312不混溶的第二流体316(例如，油)可从通道区段304和306中的每一个递送到第二汇合点310。在来自通道区段301的含水流体312与来自通道区段304和306中的每一个的第二流体316在第二通道汇合点310处相遇后，含水流体312可以在第二流体316中以离散液滴318的形式被分配并且沿着通道区段308从第二汇合点310流出。通道区段308可以将离散液滴318递送到流体联接到通道区段308的出口贮存器，在所述贮存器中将它们加以收集。
第二流体316可包含油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴318的后续聚结)的含氟表面活性剂。
产生的离散液滴可以包括单独的生物颗粒314和/或一种或多种试剂315。在一些情况下，产生的离散液滴可以包括携带条形码的珠粒(未示出)，例如通过本文其他地方描述的其他微流体结构。在一些情况下，离散液滴可能未被占据(例如，没有试剂、没有生物颗粒)。
有利地，当裂解试剂和生物颗粒共分配时，裂解试剂可以促进分配区内生物颗粒的内容物的释放。分配区中释放的内容物可能保持与其他分配区的内容物离散。
如将理解的，本文描述的通道区段可以联接到多种不同流体源或接收部件中的任一个，包括其他系统的贮存器、管道、歧管或流体部件。如将理解的，微流体通道结构300可具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可具有多于两个通道汇合点。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4、5个或更多个通道区段，每个通道区段携带在通道汇合点处相遇的相同或不同类型的珠粒、试剂和/或生物颗粒。可以控制每个通道区段中的流体流动以控制不同元素到液滴中的分配。可以通过一个或多个流体流动单元引导流体沿着一个或多个通道或贮存器流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。还可以或以其他方式通过施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡球菌素、labiase、kitalase、溶细胞酶和可从例如Sigma-Aldrich公司(St Louis，MO)购得的各种其他裂解酶、以及其他可商购的裂解酶。其他裂解剂可以另外地或可替代地与生物颗粒共分配以引起生物颗粒内容物释放到分配区中。例如，在一些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，但是这些可能不太适用于基于乳液的系统，在基于乳液的系统中表面活性剂可干扰稳定的乳液。在一些情况下，裂解溶液可包括非离子表面活性剂，例如像TritonX-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如像十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。在某些情况下，也可以使用电穿孔、热、声学或机械细胞破坏，例如，基于非乳液的分配区如生物颗粒的包封可以补充或代替液滴分配区，其中在细胞破坏后，包封物的任何孔径足够小以保留给定大小的核酸片段。
除了与上述生物颗粒共分配的裂解剂之外，其他试剂也可以与生物颗粒共分配，包括例如DNA酶和RNA酶灭活剂或抑制剂(例如蛋白酶K)、螯合剂(例如EDTA)和用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对核酸后续处理的负面活性或影响的其他试剂。另外，就包封的生物颗粒而言，可以将生物颗粒暴露于适当的刺激以从共分配的微胶囊中释放生物颗粒或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可以连同包封的生物颗粒一起共分配，以允许微胶囊的降解和细胞或其内容物向更大的分配区中的释放。在一些情况下，所述刺激可以与本文其他地方描述的用于从其各自的微胶囊(例如珠粒)中释放核酸分子(例如，寡核苷酸)的刺激相同。在替代方面中，这可以是不同的且不重叠的刺激，以允许包封的生物颗粒在与核酸分子释放到相同分配区中不同的时间释放到分配区中。
另外的试剂也可以与生物颗粒共分配，例如片段化生物颗粒的DNA的内切核酸酶、DNA聚合酶和用于扩增生物颗粒的核酸片段并将条形码分子标签附接到扩增片段的dNTP。其他酶可共分配，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。另外的试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸、以及可以用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换oligo”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板转换可用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板转换可用于将预定义的核酸序列附加到cDNA。在模板转换的实例中，cDNA可以从模板(例如细胞mRNA)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以以模板非依赖性方式向cDNA添加另外的核苷酸，例如polyC。转换oligo可包括与另外的核苷酸(例如polyG)互补的序列。cDNA上的另外核苷酸(例如polyC)可以与转换oligo上的另外核苷酸(例如polyG)杂交，由此转换oligo可以被逆转录酶用作模板以进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可包含杂交区和模板区。杂交区可包含能够与靶杂交的任何序列。在一些情况下，如前所述，杂交区包含一系列G碱基以与cDNA分子3′末端的突出C碱基互补。所述系列G碱基可包含1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或多于5个G碱基。模板序列可包含任何掺入cDNA的序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2、3、4、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换oligo可包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸包括2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、5-甲基dC、2′-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔-2′-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA，例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2′氟代碱基(例如，氟代C、氟代U、氟代A和氟代G)或任何组合。
在一些情况下，转换oligo的长度可为至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换oligo的长度可为至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。
一旦细胞的内容物释放到它们各自的分配区中，其中包含的大分子组分(例如，生物颗粒的大分子成分，例如RNA、DNA或蛋白质)可以在分配区内进一步处理。根据本文所述的方法和系统，单个生物颗粒的大分子组分内容物可以具有唯一标识符，使得在表征那些大分子组分时，它们可以归属为来源于相同的一个或多个生物颗粒。通过将唯一标识符特定地分配给单独的生物颗粒或生物颗粒群组来提供将特征归属于单独的生物颗粒或生物颗粒群组的能力。唯一标识符(例如，以核酸条形码的形式)可以被指定或与各个生物颗粒或生物颗粒群组缔合，以便用唯一标识符对生物颗粒的大分子组分(并且导致其特征)加标签或进行标记。然后可以使用这些唯一标识符以将生物颗粒的组分和特征归属于单独的生物颗粒或生物颗粒群组。
在一些方面中，这通过将单个生物颗粒或生物颗粒群组与唯一标识符共分配来执行，例如如上所述(参见图2)。在一些方面中，唯一标识符以核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供，所述核酸分子包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可以附接于单独的生物颗粒的核酸内容物或以其他方式与单独的生物颗粒的核酸内容物缔合，或附接于生物颗粒的其他组分，特别是那些核酸的片段。核酸分子被分配，使得在给定分配区中的核酸分子之间，其中包含的核酸条形码序列是相同的，但是在不同分配区之间，核酸分子可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少表示在给定分析中所有分配区中的大量不同条形码序列。在一些方面中，单个核酸条形码序列可与给定的分配区缔合，但是在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可以在核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内包括约6至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单个区段中，或者它们可以被分成两个或更多个由1个或多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
共分配的核酸分子还可以包含可用于处理来自共分配的生物颗粒的核酸的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，其用于从分配区内的各个生物颗粒扩增基因组DNA，同时附接缔合的条形码序列、测序引物或引物识别位点，杂交或探测序列，例如用于鉴定序列存在或用于下拉条形码化核酸，或许多其他潜在的功能序列中任一种。还可以使用共分配寡核苷酸的其他机制，包括例如两个或更多个液滴的聚结，其中一个液滴包含寡核苷酸，或寡该苷酸微分配到分配区中，例如微流体系统内的液滴。
在一个实例中，提供微胶囊(例如珠粒)，其各自包括大量可释放地附接于珠粒的上述条形码化核酸分子(例如，条形码化寡核苷酸)，其中附接于特定珠粒的所有核酸分子将包括相同的核酸条形码序列，但是在所使用的珠粒群体中表示大量不同的条形码序列。在一些实施方案中，水凝胶珠粒(例如包含聚丙烯酰胺聚合物基质)用作核酸分子进入分配区的固体支持物和递送载体，因为它们能够携带大量核酸分子，并且可以配置为在暴露于特定刺激后释放那些核酸分子，如本文其他地方所述。在一些情况下，珠粒群体提供各种条形码序列文库，其包括至少约1,000种不同的条形码序列、至少约5,000种不同的条形码序列、至少约10,000种不同的条形码序列、至少约50,000种不同的条形码序列、至少约100,000种不同的条形码序列、至少约1,000,000种不同的条形码序列、至少约5,000,000种不同的条形码序列或至少约10,000,000种不同的条形码序列或更多。另外，每个珠粒可以具有大量附接的核酸(例如寡核苷酸)分子。特别地，在单独的珠粒上包括条形码序列的核酸分子的分子数可以是至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个该酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下至少约10亿个核酸分子，或更多。给定珠粒的核酸分子可包括相同(或共有)条形码序列、不同条形码序列或两者的组合。给定珠粒的核酸分子可包括多个核酸分子集合。给定集合的核酸分子可包括相同的条形码序列。相同的条形码序列可以与另一集合的核酸分子的条形码序列不同。
此外，当分配珠粒群体时，所得到的分配区群体还可以包括各种条形码文库，其包括至少约1,000种不同的条形码序列、至少约5,000种不同的条形码序列、至少约10,000种不同的条形码序列、至少约50,000种不同的条形码序列、至少约100,000种不同的条形码序列、至少约1,000,000种不同的条形码序列、至少约5,000,000种不同的条形码序列、或至少约10,000,000种不同的条形码序列。另外，群体的每个分配区可以包括至少约1,000个核酸分子、至少约5，000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下至少约10亿个核酸分子。
在一些情况下，可能希望将多个不同的条形码掺入给定分配区内，或附接至分配区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，混合但已知的条形码序列集合可以在后续处理中提供更大的识别保证，例如，通过向给定分配区提供更强的地址或条形码属性，作为从给定分配区输出的重复或独立确认。
核酸分子(例如，寡核苷酸)在对珠粒施加特定刺激后可从珠粒中释放。在一些情况下，刺激可以是光刺激，例如通过裂解光不稳定键以释放核酸分子。在其他情况下，可以使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高将导致键裂解或核酸分子从珠粒中的其他释放。在其他情况下，可以使用化学刺激，其裂解核酸分子与珠粒的键，或者以其他方式导致核酸分子从珠粒中释放。在一种情况下，此类组合物包括上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂如DTT而降解以释放附接的核酸分子。
在一些方面中，提供了用于受控分配的系统和方法。可以通过调节通道架构(例如，微流体通道架构)中的某些几何特征来控制液滴尺寸。例如，可以调节通道的扩张角、宽度和/或长度来控制液滴尺寸。
图4示出用于将珠粒受控地分配到离散液滴中的微流体通道结构的实例。通道结构400可包括在通道汇合点406(或交叉点)处与贮存器404连通的通道区段402。贮存器404可以是腔室。如本文所用，对“贮存器”的任何提及也可以指“腔室”。在操作中，包括悬浮珠粒412的含水流体408可以沿着通道区段402输送到汇合点406处以相遇与贮存器404中含水流体408不混溶的第二流体410，以产生流入贮存器404的含水流体408的液滴416、418。在含水流体408和第二流体410相遇的汇合点406处，可以基于各种因素形成液滴，例如在汇合点406处的流体动力，两种流体408、410的流速，流体性质以及通道结构400的某些几何参数(例如，w、h0、α等)。多个液滴通过连续地从通道区段402注入含水流体408通过汇合点406而收集在贮存器404中。
产生的离散液滴可包括珠粒(例如，如在占据的液滴416中)。可替代地，产生的离散液滴可包括多于一个珠粒。可替代地，产生的离散液滴可以不包括任何珠粒(例如，如在未占据的液滴418中)。在一些情况下，产生的离散液滴可含有一个或多个生物颗粒，如本文其他地方所述。在一些情况下，产生的离散液滴可包含一种或多种试剂，如本文其他地方所述。
在一些情况下，含水流体408可以具有基本均匀浓度或频率的珠粒412。珠粒412可以从单独的通道(图4中未示出)引入到通道区段402中。通道区段402中珠粒412的频率可以通过控制珠粒412被引入通道区段402的频率和/或通道区段402和单独通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，珠粒可以从多个不同的通道引入到通道区段402中，并且相应地控制频率。
在一些情况下，通道区段402中的含水流体408可包括生物颗粒(例如，参见图1和图2描述)。在一些情况下，含水流体408可具有基本均匀浓度或频率的生物颗粒。与珠粒一样，生物颗粒可以从单独通道引入到通道区段402中。可以通过控制生物颗粒被引入到通道区段402的频率和/或通道区段402和单独通道中流体的相对流速来控制通道区段402中的含水流体408中的生物颗粒的频率或浓度。在一些情况下，可以从多个不同的通道将生物颗粒引入到通道区段402中，并相应地控制频率。在一些情况下，第一单独通道可以引入珠粒，并且第二单独通道可以将生物颗粒引入通道区段402中。引入珠粒的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。
第二流体410可包含油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴的后续聚结)的含氟表面活性剂。
在一些情况下，第二流体410可以不经受和/或被引导任何流入或流出贮存器404。例如，第二流体410可以在贮存器404中是基本静止的。在一些情况下，第二流体410可以在贮存器404内流动，但不流入或流出贮存器404，例如通过向贮存器404施加压力和/或在汇合点406处受到含水流体408的进入流的影响。可替代地，第二流体410可以经受和/或被引导流入或流出贮存器404。例如，贮存器404可以是将第二流体410从上游引导到下游的通道，从而输送所产生的液滴。
在汇合点406处或附近的通道结构400可具有某些几何特征，其至少部分地确定通过通道结构400形成的液滴的尺寸。通道区段402可在汇合点406处或附近具有高度h0和宽度w。举例来说，通道区段402可包括矩形横截面，其通向具有较宽横截面(例如在宽度或直径方面)的贮存器404。可替代地，通道区段402的横截面可以是其他形状，例如圆形、梯形、多边形或任何其他形状。在汇合点406处或附近的贮存器404的顶壁和底壁可以以扩张角α倾斜。扩散角α允许舌部(在汇合点406处离开通道区段402并在液滴形成之前进入贮存器404的部分含水流体408)增加深度并有助于减小中间形成的液滴的曲率。液滴尺寸可随着扩张角的增加而减小。可以通过针对上述几何参数h0、w和α的以下等式预测所得的液滴半径Rd：
举例来说，对于w＝21μm，h＝21μm和α＝3°的通道结构，预测的液滴尺寸为121μm。在另一个实例中，对于w＝25μm，h＝25μm和α＝5°的通道结构，预测的液滴尺寸是123μm。在另一个实例中，对于w＝28μm，h＝28μm和α＝7°的通道结构，预测的液滴尺寸是124μm。
在一些情况下，扩张角α的范围可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°、或约0°至约90°的范围之间。例如，扩张角可以是至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，扩张角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。在一些情况下，宽度w可以在约100微米(μm)至约500μm的范围之间。在一些情况下，宽度w可以在约10μm至约200μm的范围之间。可替代地，宽度可小于约10μm。可替代地，宽度可以大于约500μm。在一些情况下，进入汇合点406的含水流体408的流速可在约0.04微升(μL)/分钟(min)与约40μL/min之间。在一些情况下，进入汇合点406的含水流体408的流速可在约0.01微升(μL)/分钟(min)与约100μL/min之间。可替代地，进入汇合点406的含水流体408的流速可小于约0.01μL/min。可替代地，进入汇合点406的含水流体408的流速可以大于约40μL/min，例如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更高。在较低的流速下，例如约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可能不取决于进入汇合点406的含水流体408的流速。
在一些情况下，至少约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的产生的液滴可以具有一致的尺寸。可替代地，小于约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。
可以通过增加生成点来增加液滴生成的通量，例如增加含水流体408通道区段(例如，通道区段402)与贮存器404之间的汇合点(例如，汇合点406)的数量。可替代地或另外地，可以通过增加通道区段402中的含水流体408的流速来增加液滴产生的通量。
图5示出用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的实例。微流体通道结构500可包括多个通道区段502和贮存器504。多个通道区段502中的每一个可与贮存器504流体连通。通道结构500可在多个通道区段502与贮存器504之间包括多个通道汇合点506。每个通道汇合点可以是液滴产生点。来自图4中的通道结构400的通道区段402以及对其部件的任何描述可以对应于通道结构500中的多个通道区段502的给定通道区段以及对其相应部件的任何描述。来自通道结构400的贮存器404以及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构500的贮存器504以及对其相应部件的任何描述。
多个通道区段502中的每个通道区段可包括含水流体508，所述含水流体包括悬浮珠粒512。贮存器504可包括与含水流体508不混溶的第二流体510。在一些情况下，第二流体510可以不经受和/或被引导任何流入或流出贮存器504。例如，第二流体510可以在贮存器504中是基本静止的。在一些情况下，第二流体510可以在贮存器504内流动，但不流入或流出贮存器504，例如通过向贮存器504施加压力和/或在汇合点处受到含水流体508的进入流的影响。可替代地，第二流体510可以经受和/或被引导流入或流出贮存器504。例如，贮存器504可以是将第二流体510从上游引导到下游的通道，从而输送所产生的液滴。
在操作中，包括悬浮珠粒512的含水流体508可以沿着多个通道区段502输送到多个汇合点506中以与贮存器504中的第二流体510相遇以产生液滴516、518。从每个通道区段，在与贮存器504的每个相应汇合点处，可形成液滴。在含水流体508和第二流体510相遇的汇合点处，可以基于各种因素形成液滴，例如在汇合点处的流体动力，两种流体508、510的流速，流体性质以及通道结构500的某些几何参数(例如，w、h0、α等)，如本文其他地方所述。多个液滴可以通过连续地从多个通道区段502注入含水流体508通过多个汇合点506而收集在贮存器504中。通过通道结构500的平行通道配置，通量可以显著增加。例如，具有五个包括含水流体508的入口通道区段的通道结构可以产生频率是具有一个入口通道区段的通道结构五倍的液滴，条件是通道区段中的流体流速基本上相同。不同入口通道区段中的流体流速可以基本上相同或不同。通道结构可以具有依据实际并且允许贮存器的尺寸那么多的平行通道区段。例如，通道结构可以具有至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、500、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、5000或更多个平行或基本平行的通道区段。
对于多个通道区段502中的每个通道区段，几何参数w、h0和α可以是一致或不一致的。例如，每个通道区段可以在其与贮存器504的各自通道汇合点处或附近具有相同或不同的宽度。例如，每个通道区段可以在其与贮存器504的各自通道汇合点处或附近具有相同或不同的高度。在另一个实例中，贮存器504可以在与多个通道区段502的不同通道汇合点处具有相同或不同的扩张角。当几何参数一致时，有利地，即使增加了通量，也可以控制液滴尺寸为一致的。在一些情况下，当希望具有不同的液滴尺寸分布时，可以相应地改变多个通道区段502的几何参数。
在一些情况下，至少约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的产生的液滴可以具有一致的尺寸。可替代地，小于约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。
图6示出用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的另一个实例。微流体通道结构600可包括围绕贮存器604的周边大致圆形布置的多个通道区段602。多个通道区段602中的每一个可与贮存器604流体连通。通道结构600可在多个通道区段602与贮存器604之间包括多个通道汇合点606。每个通道汇合点可以是液滴产生点。来自图2中的通道结构400的通道区段402以及对其部件的任何描述可以对应于通道结构600中的多个通道区段602的给定通道区段以及对其相应部件的任何描述。来自通道结构400的贮存器404以及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构600的贮存器604以及对其相应部件的任何描述。
多个通道区段602中的每个通道区段可包括含水流体608，所述含水流体包括悬浮珠粒612。贮存器604可包括与含水流体608不混溶的第二流体610。在一些情况下，第二流体610可以不经受和/或被引导任何流入或流出贮存器604。例如，第二流体610可以在贮存器604中是基本静止的。在一些情况下，第二流体610可以在贮存器604内流动，但不流入或流出贮存器604，例如通过向贮存器604施加压力和/或在汇合点处受到含水流体608的进入流的影响。可替代地，第二流体610可以经受和/或被引导流入或流出贮存器604。例如，贮存器604可以是将第二流体610从上游引导到下游的通道，从而输送所产生的液滴。
在操作中，包括悬浮珠粒612的含水流体608可以沿着多个通道区段602输送到多个汇合点606中以与贮存器604中的第二流体610相遇以产生多个液滴616。从每个通道区段，在与贮存器604的每个相应汇合点处，可形成液滴。在含水流体608和第二流体610相遇的汇合点处，可基于多种因素形成液滴，例如汇合点处的水动力，两种流体608、610的流速，流体性质以及通道结构600的某些几何参数(例如，通道区段602的宽度和高度、贮存器604的扩张角等)，如本文其他地方所述。多个液滴可以通过连续地从多个通道区段602注入含水流体608通过多个汇合点606而收集在贮存器604中。通过通道结构600的基本平行通道配置，通量可以显著增加。通道结构可以具有依据实际并且贮存器的尺寸允许的那么多的基本平行通道区段。例如，通道结构可以具有至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、5000或更多个平行或基本平行的通道区段。多个通道区段可以基本上均匀地间隔开，例如，围绕贮存器的边缘或周边。可替代地，多个通道区段的间隔可以是不均匀的。
贮存器604可以在每个通道汇合点处或附近具有扩张角α(图6中未示出)。多个通道区段602中的每个通道区段可以在通道汇合点处或附近具有宽度w和高度h0。对于多个通道区段602中的每个通道区段，几何参数w、h0和α可以是一致或不一致的。例如，每个通道区段可以在其与贮存器604的各自通道汇合点处或附近具有相同或不同的宽度。例如，每个通道区段可以在其与贮存器604的各自通道汇合点处或附近具有相同或不同的高度。
贮存器604可以在与多个通道区段602的不同通道汇合点处具有相同或不同的扩张角。例如，圆形贮存器(如图6所示)可以具有圆锥形、圆顶状、或者半球形顶板(例如，顶壁)以在多个通道汇合点606处或附近为每个通道区段602提供相同或基本相同的扩张角。当几何参数一致时，有利地，即使增加了通量，也可以控制所得液滴尺寸为一致的。在一些情况下，当希望具有不同的液滴尺寸分布时，可以相应地改变多个通道区段602的几何参数。
在一些情况下，至少约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的产生的液滴可以具有一致的尺寸。可替代地，小于约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。注入液滴中的珠粒和/或生物颗粒可以具有一致或不一致的尺寸。
图7A示出具有用于受控分配的几何特征的微流体通道结构的另一个实例的横截面视图。通道结构700可包括在通道汇合点706(或交叉点)处与贮存器704连通的通道区段702。在一些情况下，通道结构700和其一个或多个部件可对应于通道结构100和其一个或多个部件。图7B示出图7A的通道结构700的透视图。
包括多个颗粒716的含水流体712可以沿着通道区段702输送到汇合点706处以相遇与贮存器704中含水流体712不混溶的第二流体714(例如，油等)，以产生流入贮存器704的含水流体712的液滴720。在含水流体712和第二流体714相遇的汇合点706处，可以基于各种因素形成液滴，如在汇合点706处的流体动力，两种流体712、714的相对流速，流体特性以及通道结构700的某些几何参数(例如，Δh等)。多个液滴可以通过连续地从通道区段702注入含水流体712在汇合点706处收集在贮存器704中。
产生的离散液滴可包括多个颗粒716中的一个或多个颗粒。如本文其他地方所述，颗粒可以是任何颗粒，如珠粒、细胞珠、凝胶珠粒、生物颗粒、生物颗粒的大分子组分、或其他颗粒。可替代地，产生的离散液滴可以不包括任何颗粒。
在一些情况下，含水流体712可以具有基本均匀浓度或频率的颗粒716。如本文其他地方所述(例如，参考图4)，可以将颗粒716(例如，珠粒)从单独通道(在图7中未示出)引入通道区段702中。通道区段702中颗粒716的频率可以通过控制颗粒716被引入通道区段702的频率和/或通道区段702和单独通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，颗粒716可以从多个不同的通道引入到通道区段702中，并且相应地控制频率。在一些情况下，可以通过单独通道引入不同的颗粒。例如，第一单独通道可以引入珠粒，并且第二单独通道可以将生物颗粒引入到通道区段702中。引入珠粒的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。
在一些情况下，第二流体714可以不经受和/或被引导任何流入或流出贮存器704。例如，第二流体714可以在贮存器704中是基本静止的。在一些情况下，第二流体714可以在贮存器704内流动，但不流入或流出贮存器704，如通过向贮存器704施加压力和/或在汇合点706处受到含水流体712的进入流的影响。可替代地，第二流体714可以经受和/或被引导流入或流出贮存器704。例如，贮存器704可以是将第二流体714从上游引导到下游的通道，从而输送所产生的液滴。
在汇合点706处或附近的通道结构700可具有某些几何特征，其至少部分地确定通过通道结构700形成的液滴的尺寸和/或形状。通道区段702可具有第一横截面高度h1，并且贮存器704可具有第二横截面高度h2。第一横截面高度h1和第二横截面高度h2可以是不同的，以使在汇合点706处，存在Δh的高度差。第二横截面高度h2可大于第一横截面高度h1。在一些情况下，贮存器此后可以逐渐增加横截面高度，例如，距离汇合点706越远。在一些情况下，贮存器的横截面高度可根据汇合点706处或附近的扩张角β而增大。高度差Δh和/或扩张角β可允许舌部(在汇合点706处离开通道区段702并在液滴形成之前进入贮存器704的部分含水流体712)增加深度并有助于减小中间形成的液滴的曲率。例如，液滴尺寸可随着高度差增大和/或扩张角增大而减小。
高度差Δh可以是至少约1μm。可替代地，高度差可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500μm或更多。可替代地，高度差可以是至多约500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1μm或更小。在一些情况下，扩张角β的范围可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°、或约0°至约90°的范围之间。例如，扩张角可以是至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，扩张角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。
在一些情况下，进入汇合点706的含水流体712的流速可在约0.04微升(μL)/分钟(min)与约40μL/min之间。在一些情况下，进入汇合点706的含水流体712的流速可在约0.01微升(μL)/分钟(min)与约100μL/min之间。可替代地，进入汇合点706的含水流体712的流速可小于约0.01μL/min。可替代地，进入汇合点706的含水流体712的流速可以大于约40μL/min，例如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更高。在较低的流速下，例如约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可能不取决于进入汇合点706的含水流体712的流速。第二流体714可以在贮存器704中是静止的或者基本静止的。可替代地，第二流体714可以是流动的，例如以上针对含水流体712所述的流速。
在一些情况下，至少约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。在一些情况下，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的产生的液滴可以具有一致的尺寸。可替代地，小于约50％的产生的液滴可具有一致的尺寸。
虽然图7A和7B示出高度差Δh在汇合点706处突然变化(例如，梯度增加)，但是高度差可逐渐增加(例如，从约0μm至最大高度差)。可替代地，高度差可以从最大高度差逐渐减小(例如，渐缩)。如本文所使用的，高度差的逐渐增大或减小可以指高度差的连续增量增大或减小，其中高度轮廓的任一差别区段与高度轮廓的紧邻的差别区段之间的角度大于90°。例如，在汇合点706处，通道的底壁和贮存器的底壁可以以大于90°的角度相遇。可替代地或另外地，通道的顶壁(例如，天花板)和贮存器的顶壁(例如，顶板)可以以大于90°的角度相遇。逐渐增加或减小可以是线性的或非线性的(例如，指数的、正弦的等)。可替代地或另外地，高度差可以线性地或非线性地可变地增加和/或减小。虽然图7A和7B示出线性扩张的贮存器横截面高度(例如，恒定扩张角β)，但是横截面高度可以非线性扩张。例如，贮存器可以至少部分地由具有可变扩张角的圆顶状(例如，半球形)形状限定。横截面高度可以以任何形状扩张。
例如，如上文或本文其他地方所述的通道网络可以流体地联接到适当的流体部件。例如，入口通道区段流体地联接到它们要递送到通道汇合点的材料的适当来源。这些来源可以包括多种不同的流体部件中的任一种，从在微流体装置的主体结构中限定或与其连接的简易贮存器，到从装置外来源、歧管、流体流动单元(例如，致动器、泵、压缩机)等递送流体的流体管道。同样地，出口通道区段(例如，通道区段208、贮存器604等)可以流体地联接到分配细胞的接收容器或导管以便后续处理。同样，这可以是在微流体设备的主体中限定的储存器，或者其可以是用于将分配细胞递送到随后的过程操作、仪器或部件的流体导管。
本文描述的方法和系统可用于极大地提高单细胞应用和/或接收基于液滴的输入的其他应用的效率。例如，在对占据细胞和/或适当大小的细胞进行分选之后，可以执行的后续操作可以包括产生扩增产物、纯化(例如，通过固相可逆固定化(SPRI))、进一步处理(例如，剪切、功能序列的连接和随后的扩增(例如，通过PCR))。这些操作可以本体发生(例如，在分配区外)。在分配区是乳液中的液滴的情况下，可以破坏乳液并且将液滴的内容物汇集用于另外的操作。可连同携带条形码的珠粒共分配的其他试剂可包括阻断核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和消化细胞中基因组DNA的核酸酶。可替代地，可以在另外的处理操作期间应用rRNA去除剂。通过这种方法生成的构建体的构型可有助于在测序期间最小化(或避免)poly-T序列的测序和/或对多核苷酸序列的5′末端进行测序。可以对扩增产物(例如，第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序以进行序列分析。在一些情况下，可以使用测序用部分发夹扩增(Partial Hairpin Amplification for Sequencing；PHASE)方法执行扩增。
多种应用需要生物颗粒群体内不同生物颗粒或生物体类型的存在的评估和其量化，包括例如微生物菌群分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析，例如，追踪污染等。
计算机系统
本公开提供了被编程用于实现本公开的方法的计算机系统。图10示出计算机系统1001，其被编程或以其他方式配置用于(i)控制微流体系统(例如，流体流动)，(ii)从未占据的液滴中分选占据的液滴，(iii)聚合液滴，(iv)对单个液滴成像以获得光学信息，(v)执行测序应用，(vi)产生和维持条形码化核酸分子的文库，(vii)分析测序数据，(viii)将测序数据映射至参考基因组，以及(ix)将测序数据与单个液滴以电子方式关联。。计算机系统1001可以调节本公开的各种方面，如调节用于产生具有不同的物理和/或光学特性的颗粒(例如，珠粒)的聚合应用单元、调节一个或多个通道中的流体流速、调节流体流动以使得成像单元能够对流动通过通道的单个液滴成像并存储液滴的光学信息以用于进一步处理。计算机系统1001可以是用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统1001包括中央处理单元(CPU，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1005，其可为单一核心或多核心处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1001还包括存储器或存储单元1010(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)，电子存储单元1015(例如，硬盘)，与一个或多个其他系统通信的通信接口1020(例如，网络适配器)，和外围设备1025，如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1010、存储单元1015、接口1020和外围设备1025经由通信总线(实线)如母板与CPU1005通信。存储单元1015可为用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1001可借助于通信接口1020来可操作地耦接至计算机网络(“网络”)1030。网络1030可为互联网、互联网和/或外联网或与互联网通信的内部网和/或外联网。网络1030在一些情况下为电信和/或数据网络。网络1030可包括一个或多个计算机服务器，其可实现分布式计算，如云计算。网络1030在一些情况下借助于计算机系统1001，可实施对等网络，其可使得耦接至计算机系统1001的设备能够作为客户端或服务器来运作。
CPU 1005可执行序列机器可读指令，所述指令可在程序或软件中具体实现。指令可存储于存储单元，如存储器1010中。指令可被引导至CPU 1005，其可随后编程或另外配置CPU 1005来实施本公开的方法。由CPU 1005执行的操作的实例可包括撷取、解码、执行和写回。
CPU 1005可为电路的一部分，如集成电路。系统1001的一个或多个其他部件可包含于电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元1015可存储文件，如驱动程序、文库和保存程序。存储单元1015可存储使用者数据，例如，使用者偏好和使用者程序。计算机系统1001在一些情况下可包括一个或多个额外数据存储单元，所述单元在计算机系统1001外部，如位于经由内部网或互联网与计算机系统1001通信的远程服务器上。
计算机系统1001可经由网络1030与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1001可以与用户(例如，运营商)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板式PC或平板PC(例如，
iPad、
GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，
iPhone、支持Android的设备、
)或个人数字助理。用户可以经由网络1030访问计算机系统1001。
如本文描述的方法可经由机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实施，所述代码存储于计算机系统1001的电子存储位置上，例如像，存储器1010或电子存储单元1015。机器可执行或机器可读代码可以软件形式提供。在使用期间，代码可由处理器1005执行。在一些情况下，代码可从存储单元1015撷取并且存储在存储器1010上准备由处理器1005访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1015，并且机器可执行指令存储于存储器1010上。
代码可预先编译并且被配置来供具有适于执行代码的处理器的机器来使用，或可在执行时间期间加以编译。代码可以程序语言来提供，可选择所述程序语言以使得代码能够以预先编译或原样编译方式来执行。
本文提供的系统和方法，如计算机系统1001的方面可在编程中具体实现。技术的各个方面可被认为是通常呈机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据形式的“产品”或“制品”，所述数据承载或具体实现于一定类型的机器可读介质中。机器可执行代码可存储于电子存储单元，如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”类型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关联模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时候提供非暂时性存储用于软件编程。软件的全部或一部分可有时经由互联网或各种其他电信网络来传送。此类通信，例如，可使得将软件从一个计算机或处理器加载至另一个计算机或处理器，例如，从管理服务器或主机计算机加载至应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元件的另一种类型的介质包括光、电和电磁波，如跨越本地设备之间的物理接口、经由有线和光学陆地线网络和各种空中链路所使用的光、电和电磁波。携带此类波的物理元件，如有线或无线链路、光链路等也可被认为是承载软件的介质。如本文使用，除非限于非暂时性、有形“存储”介质，术语如计算机或机器“可读介质”是指参与提供指令至处理器供执行的任何介质。
因此，机器可读介质，如计算机可执行代码，可采用许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储器介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机等中的任何存储设备，如在附图中示出的可用于实施数据库等的存储设备。易失性存储器介质包括动态存储器，如这类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光导纤维，包括构成计算机系统中的总线的导线。载波传输介质可采用电或电磁信号，或声或光波的形式如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的信号。常见形式的计算机可读介质因此包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、冲孔卡纸带、具有孔图案的任何其他物理存储器介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、快闪EPROM、任何其他存储器芯片或盒、运输数据或指令的载波、运输这类载波的电缆或链路，或计算机可读取编程代码和/或数据的任何其他介质。许多这些形式的计算机可读介质可涉及运送一个或多个指令的一个或多个序列至处理器供执行。
计算机系统1001可包括电子显示器1035或与其通信，所述电子显示器1035包括用于提供，例如，液滴的光学信息、测序分析的生物颗粒(例如，细胞)结果的表型信息以及序列数据与光学信息的关联的用户界面(UI)1040。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。
本公开的方法和系统可经由一个或多个算法来实施。算法可在由中央处理单元1005执行时经由软件来实施。算法可以，例如，获得液滴的光学信息、执行测序、执行序列分析、将序列数据与光学信息相关联等。
本公开的设备、系统、组合物和方法可用于各种应用，比如例如，处理单细胞的单个分析物(例如，RNA、DNA或蛋白质)或多种分析物(例如，DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质、或RNA、DNA和蛋白质)。例如，将生物颗粒(例如，细胞或细胞珠)分配在分配区(例如，液滴)中，并处理生物颗粒的多种分析物以用于后续处理。多种分析物可以来自单细胞。这可以实现例如对细胞的蛋白质组、转录组和基因组同时分析。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为实例提供。本发明不旨在受到本说明书中提供的具体实施例限制。尽管已经参考上述说明书描述本发明，但本文中的实施方案的描述和说明不意图以限制意义解释。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不偏离本发明。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解的是，可以在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还应涵盖任何此类替代方案、修改、变型或等同物。所意图的是，以下权利要求限定本发明的范围以及由此涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
Claims (86)
1.一种用于处理生物颗粒的核酸分子的方法，其包括：
(a)提供(1)多个分配区，其中所述多个分配区中的分配区包含(i)包含多个核酸条形码分子的颗粒，其中所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含条形码序列，以及(ii)包含所述核酸分子的生物颗粒；以及(2)存储在计算机存储器中的第一数据集，其包括指示所述生物颗粒的一种或多种物理特性的数据，所述数据在对所述生物颗粒进行感测后生成；
(b)使用所述多个核酸条形码分子中的所述核酸条形码分子和所述生物颗粒的所述核酸分子生成条形码化核酸分子；
(c)生成第二数据集，所述第二数据集包括鉴定所述条形码化核酸分子或其衍生物的核酸序列的数据；以及
(d)使用所述第一数据集和所述第二数据集将所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性与所述核酸序列相关联。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性包括所述生物颗粒的尺寸、所述生物颗粒的形状、所述生物颗粒上的表面标志物、所述生物颗粒中的包含物、所述生物颗粒中的细胞器的结构、所述生物颗粒中的细胞器的数量、相对于所述生物颗粒的分泌或排泄，或细胞器在所述生物颗粒中的定位。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒包含多个核酸分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述多个核酸分子包含多个核糖核酸分子。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述多个核酸分子包含多个脱氧核糖核酸分子。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子是核糖核酸分子。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子是脱氧核糖核酸分子。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种物理特性包括所述生物颗粒的表型信息。
9.如权利要求1所述的方法，其还包括对所述颗粒进行光学检测以生成第三数据集，所述第三数据集包括指示所述颗粒或所述多个核酸条形码分子的一种或多种物理特性的数据。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述颗粒的所述一种或多种物理特性包括所述颗粒的光学特性。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述颗粒的所述物理特性包括所述颗粒或其组分的尺寸、形状、圆度、硬度或对称性。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述颗粒的所述光学特性包括所述颗粒或其组分的吸光度、双折射率、颜色、荧光特征、发光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含条形码序列，所述条形码序列是相同的。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述多个分配区是多个液滴。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述多个分配区是多个孔。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒包含一个或多个光学条形码。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述颗粒的所述多个核酸条形码分子包含所述一个或多个光学条形码。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个光学条形码包含荧光染料、纳米颗粒、微粒，或其任何组合。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个光学条形码具有相对于所述多个分配区的其他光学条形码不同的相关联的光学强度或频率。
20.如权利要求16所述的方法，其中对于所述多个分配区中的另外的分配区，重复(a)-(d)，其中所述另外的分配区包含(i)包含另外多个核酸条形码分子的另外的颗粒，其中所述另外多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含不同于所述条形码序列的另外的条形码序列，以及(ii)包含另外的核酸分子的另外的生物颗粒，其中所述分配区和所述另外的分配区在感测后产生不同强度或频率的光学信号。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述纳米颗粒包含量子点。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述纳米颗粒包含Janus颗粒。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述多个核酸条形码分子被配置处于几何结构。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述几何结构为核酸折纸。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性通过使用(i)亮视野显微术、(ii)荧光显微术、(iii)相差显微术、(iv)多光谱显微术或(v)偏光显微术对所述分配区成像进行鉴定。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒是珠粒。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述珠粒是凝胶珠粒。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述多个核酸条形码分子可释放地附接于所述凝胶珠粒。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺聚合物。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种物理特性是一种或多种光学特性。
31.如权利要求30所述的方法，其还包括，在(a)之后，对所述分配区成像以对所述生物颗粒进行光学检测，从而鉴定所述生物颗粒的所述一种或多种光学特性。
32.如权利要求30所述的方法，其还包括，在(a)之前，对所述生物颗粒成像以鉴定所述生物颗粒的所述一种或多种光学特性。
33.如权利要求32所述的方法，其中在将所述生物颗粒提供于所述分配区中之前对所述生物颗粒成像。
34.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒偶合于包含一个或多个光学条形码的另外的颗粒。
35.如权利要求1所述的方法，其中对于所述多个分配区中的另外的分配区，重复(a)-(d)，其中所述另外的分配区各自包含(i)另外多个核酸条形码分子，其中所述另外多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含不同于所述条形码序列的另外的条形码序列，以及(ii)包含另外的核酸分子的另外的生物颗粒，并且其中所述分配区和所述另外的分配区包括包含分子条形码的颗粒和包含光学条形码的颗粒的组合，所述组合在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。
36.如权利要求1所述的方法，其中对于所述多个分配区中的另外的分配区，重复(a)-(d)，其中所述另外的分配区各自包含(i)另外多个核酸条形码分子，其中所述另外多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子包含不同于所述条形码序列的另外的条形码序列，以及(ii)包含另外的核酸分子的另外的生物颗粒，所述另外的分配区包括至少1,000个分配区。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述另外的分配区包括至少10,000个分配区。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述另外的分配区包括至少100,000个分配区。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述另外的分配区包括包含含有至少1,000个条形码序列的核酸条形码分子的多个颗粒，所述至少1,000个条形码序列在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述另外的分配区包括包含含有至少10,000个条形码序列的核酸条形码分子的多个颗粒，所述至少10,000个条形码序列在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述另外的分配区包括包含含有至少100,000个条形码序列的核酸条形码分子的多个颗粒，所述至少100,000个条形码序列在所述分配区和所述另外的分配区间是不同的。
42.如权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒是细胞。
43.如权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒包括处于基体中的细胞或其一种或多种组分。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述基体是聚合物基体。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述基体是凝胶基体。
46.如权利要求1所述的方法，其还包括将具有所述生物颗粒的所述一种或多种物理特性的所述生物颗粒的蛋白质与所述核酸序列相关联。
47.如权利要求47所述的方法，其中所述蛋白质是细胞表面蛋白。
48.如权利要求1所述的方法，其还包括将所述生物颗粒的一个或多个核糖核酸序列或一个或多个脱氧核糖核酸(DNA)序列与所述一种或多种物理特性相关联。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述一个或多个DNA序列包含表观遗传学信息。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述一个或多个DNA序列包含染色质信息。
51.一种包含多个颗粒的试剂盒，所述多个颗粒包含(i)偶合于其上的多个核酸条形码分子，其中所述多个条形码分子包含多个条形码序列，以及(ii)多个光学条形码，其中所述多个光学条形码包含多个光码，
其中所述多个颗粒中的每个颗粒包含(i)偶合于其上的所述多个核酸条形码分子的子集，以及(ii)所述多个光学条形码的子集，
其中所述多个核酸条形码分子的子集的条形码序列在所述多个颗粒中的颗粒间是不同的，并且其中所述多个光学条形码的子集的光码在所述颗粒间是不同的。
52.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含单个光学条形码。
53.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含两个或更多个光学条形码。
54.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码赋予所述多个颗粒光学特性。
55.如权利要求54所述的试剂盒，其中所述光学特性选自由以下各项组成的组：所述颗粒或其组分的吸光度、双折射率、颜色、荧光特征、发光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。
56.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包含一种或多种荧光染料、纳米颗粒、微粒，或其任何组合。
57.如权利要求56所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包含多个纳米颗粒。
58.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包含多个量子点。
59.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包含多个Janus颗粒。
60.如权利要求56所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包含多种荧光染料。
61.如权利要求60所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料包含介于2-10种之间的荧光染料。
62.如权利要求60所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料包括具有相同发射波长和不同强度的多种荧光染料。
63.如权利要求62所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料包含至少20种不同强度。
64.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含不同的光码。
65.如权利要求53所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码的所述子集中的每个子集包含光码的不同组合。
66.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码具有相对于彼此不同的相关联的光学强度或频率。
67.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包括至少1,000个不同的光码。
68.如权利要求67所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包括至少10,000个不同的光码。
69.如权利要求68所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包括至少100,000个不同的光码。
70.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个核酸条形码分子的所述子集中的给定子集内的核酸条形码分子包含相同的条形码序列。
71.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个条形码序列包括至少1,000个不同的条形码序列。
72.如权利要求71所述的试剂盒，其中所述多个条形码序列包括至少10,000个不同的条形码序列。
73.如权利要求72所述的试剂盒，其中所述多个条形码序列包括至少100,000个不同的条形码序列。
74.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个颗粒包括至少10,000个颗粒。
75.如权利要求74所述的试剂盒，其中所述多个分配区包含至少100,000个颗粒。
76.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个核酸条形码分子包含多个功能序列，所述多个功能序列被配置成与多个靶分子相互作用。
77.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述多个靶分子包含多个脱氧核糖核酸分子。
78.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述多个靶分子包含多个核糖核酸分子。
79.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述多个功能序列被配置成捕获所述多个靶分子。
80.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个颗粒包括多个珠粒。
81.如权利要求80所述的试剂盒，其中所述多个颗粒包括多个凝胶珠粒。
82.如权利要求81所述的试剂盒，其中所述多个核酸条形码分子可释放地偶合于所述多个凝胶珠粒。
83.如权利要求81所述的试剂盒，其中所述多个凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺聚合物。
84.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包括在所述多个颗粒的表面上。
85.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个光学条形码包括在所述多个颗粒内。
86.如权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个颗粒中的第一颗粒偶合于所述多个颗粒中的第二颗粒，其中所述第一颗粒包含所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子并且所述第二颗粒包含所述多个光学条形码中的光学条形码。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311574737.XA CN117604074A (zh) | 2017-11-17 | 2018-11-16 | 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762587634P | 2017-11-17 | 2017-11-17 | |
| US62/587,634 | 2017-11-17 | ||
| PCT/US2018/061629 WO2019099908A1 (en) | 2017-11-17 | 2018-11-16 | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311574737.XA Division CN117604074A (zh) | 2017-11-17 | 2018-11-16 | 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110770352A true CN110770352A (zh) | 2020-02-07 |
| CN110770352B CN110770352B (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=65041876
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311574737.XA Pending CN117604074A (zh) | 2017-11-17 | 2018-11-16 | 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 |
| CN201880017886.7A Active CN110770352B (zh) | 2017-11-17 | 2018-11-16 | 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311574737.XA Pending CN117604074A (zh) | 2017-11-17 | 2018-11-16 | 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP3559272B1 (zh) |
| CN (2) | CN117604074A (zh) |
| DK (1) | DK3559272T3 (zh) |
| SG (1) | SG11201906717SA (zh) |
| WO (1) | WO2019099908A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111372574A (zh) * | 2017-09-29 | 2020-07-03 | 加利福尼亚大学董事会 | 单分散乳液的制备方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2882872B1 (en) | 2012-08-13 | 2021-10-06 | The Regents of The University of California | Methods and systems for detecting biological components |
| US10697007B2 (en) | 2014-06-27 | 2020-06-30 | The Regents Of The University Of California | PCR-activated sorting (PAS) |
| CN107107058B (zh) | 2014-10-22 | 2021-08-10 | 加利福尼亚大学董事会 | 高清晰度微液滴打印机 |
| WO2016126871A2 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | The Regents Of The University Of California | Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities |
| US11142791B2 (en) | 2016-08-10 | 2021-10-12 | The Regents Of The University Of California | Combined multiple-displacement amplification and PCR in an emulsion microdroplet |
| EP3571308A4 (en) | 2016-12-21 | 2020-08-19 | The Regents of The University of California | GENOMIC SEQUENCING OF SINGLE CELLS USING HYDROGEL-BASED DROPS |
| US10501739B2 (en) | 2017-10-18 | 2019-12-10 | Mission Bio, Inc. | Method, systems and apparatus for single cell analysis |
| EP3938537A1 (en) | 2019-03-11 | 2022-01-19 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing optically tagged beads |
| WO2021094421A1 (en) * | 2019-11-15 | 2021-05-20 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Color and bardcoded beads for single cell indexing |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016149661A1 (en) * | 2015-03-18 | 2016-09-22 | The Broad Institute, Inc. | Massively parallel on-chip coalescence of microemulsions |
| CN107208158A (zh) * | 2015-02-27 | 2017-09-26 | 赛卢拉研究公司 | 空间上可寻址的分子条形编码 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9012390B2 (en) | 2006-08-07 | 2015-04-21 | Raindance Technologies, Inc. | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
| US20140378345A1 (en) | 2012-08-14 | 2014-12-25 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| CN113528634A (zh) | 2012-08-14 | 2021-10-22 | 10X基因组学有限公司 | 微胶囊组合物及方法 |
| KR102536833B1 (ko) * | 2013-08-28 | 2023-05-26 | 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 | 대량의 동시 단일 세포 분석 |
| AU2015243445B2 (en) | 2014-04-10 | 2020-05-28 | 10X Genomics, Inc. | Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same |
| CN113249435B (zh) | 2014-06-26 | 2024-09-03 | 10X基因组学有限公司 | 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法 |
| US11098304B2 (en) * | 2015-11-04 | 2021-08-24 | Atreca, Inc. | Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells |
-
2018
- 2018-11-16 DK DK18836715.5T patent/DK3559272T3/da active
- 2018-11-16 CN CN202311574737.XA patent/CN117604074A/zh active Pending
- 2018-11-16 EP EP18836715.5A patent/EP3559272B1/en active Active
- 2018-11-16 WO PCT/US2018/061629 patent/WO2019099908A1/en unknown
- 2018-11-16 EP EP22186351.7A patent/EP4212629A1/en active Pending
- 2018-11-16 CN CN201880017886.7A patent/CN110770352B/zh active Active
- 2018-11-16 SG SG11201906717SA patent/SG11201906717SA/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107208158A (zh) * | 2015-02-27 | 2017-09-26 | 赛卢拉研究公司 | 空间上可寻址的分子条形编码 |
| WO2016149661A1 (en) * | 2015-03-18 | 2016-09-22 | The Broad Institute, Inc. | Massively parallel on-chip coalescence of microemulsions |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 陈志森等: "用于Roche/454高通量测序的12个多重标签转录组文库的构建", 《厦门大学学报(自然科学版)》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111372574A (zh) * | 2017-09-29 | 2020-07-03 | 加利福尼亚大学董事会 | 单分散乳液的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110770352B (zh) | 2023-12-15 |
| EP3559272A1 (en) | 2019-10-30 |
| DK3559272T3 (da) | 2022-10-10 |
| EP4212629A1 (en) | 2023-07-19 |
| SG11201906717SA (en) | 2019-08-27 |
| WO2019099908A1 (en) | 2019-05-23 |
| EP3559272B1 (en) | 2022-08-31 |
| CN117604074A (zh) | 2024-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10829815B2 (en) | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles | |
| CN111479631B (zh) | 用于样品制备和分析的方法和系统 | |
| CN111699388B (zh) | 用于单细胞处理的系统和方法 | |
| US11660601B2 (en) | Methods for sorting particles | |
| US11725231B2 (en) | Methods and systems for nucleic acid preparation and chromatin analysis | |
| US12104200B2 (en) | Systems and methods for processing nucleic acid molecules from one or more cells | |
| US11459607B1 (en) | Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes | |
| US10544413B2 (en) | Methods and systems for sorting droplets and beads | |
| CN110770352B (zh) | 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统 | |
| CN113874521A (zh) | 用于富集条形码的方法和系统 | |
| CN112703252A (zh) | 用于最小化条形码交换的方法和系统 | |
| CN113767178A (zh) | 用于处理光学标签化珠粒的系统和方法 | |
| WO2019108851A1 (en) | Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis | |
| CN112262218A (zh) | 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法 | |
| CN109526228B (zh) | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 | |
| CN118818037A (zh) | 用于单细胞处理的系统和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |