JP2020535951A - 単分散エマルションを生成する方法 - Google Patents

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Abstract

粒子テンプレート乳化（ＰＴＥ）と呼ばれる、本明細書に記載される方法は、マイクロ流体デバイスの使用を必要とせずに対象の標的粒子を封入する単分散エマルションを生成するための改善されたアプローチを提供する。単分散ドロップレットを、単分散粒子を使用してドロップレットの形成をテンプレート化することにより、ドロップレットの完全性を破壊せずに効果的に取得できる。ドロップレットには、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、または巨大単層小胞（ＧＵＶ）が含まれ得る。【選択図】図３

Description

相互参照
本出願は、２０１７年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／５６５，９７６号の利益を主張し、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
政府支援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された認可番号ＡＲ０６８１２９、Ｒ０１ ＥＢ０１９４５３およびＲ２１ ＨＧ００７２３３；アメリカ国防高等研究計画局により付与された認可番号ＨＲ００１１−１２−Ｃ−００６５；アメリカ国立科学財団により付与された認可番号ＤＢＩ１２５３２９３のもとで政府支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
緒言
ドロップレットマイクロフルイディクスは、反応容量をピコリットルに減らし、処理をキロヘルツに増やすことにより、実験室の自動化を進捗させる。マイクロ流体デバイスは、キャリア流体に懸濁されたドロップレットを形成、処理、およびソートする；各ドロップレットは、反応を行うことができる分離された「試験管」を提供する。このアプローチのスループットは、試薬の消費量がとても少ないことと相まって、ハイスループット科学の新時代に前例のない可能性をもたらす。さらに、単分散ドロップレットの区画化は、生物学全体にわたった用途のための多目的なアプローチである。しかしながら、ドロップレット封入のためのマイクロフルイディクス（マイクロ流体力学）の一般的な要件は、高度なマイクロ流体システムを利用することがめったにないほとんどの研究者にとって重大な障壁である。ドロップレットマイクロ流体の進歩を研究者に即座に移し変えられないことは、新しい有用なドロップレット技術の実現を妨げる。本開示は、上記の問題に取り組み、関連する利点を提供する。
粒子テンプレート乳化（ＰＴＥ）と呼ばれる、本明細書に記載される方法は、マイクロ流体デバイスの使用を必要とせずに目的の標的粒子を封入する単分散エマルションを生成するための改善されたアプローチを提供する。本開示は、単分散ドロップレットが、単分散粒子を用いてドロップレットの形成をテンプレート化することにより、ドロップレットの完全性を破壊せずに効果的に取得できるという驚くべき発見に一部基づいている。ドロップレットとして、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、または巨大単層小胞（ＧＵＶ）（本明細書ではリポソームとも呼ばれる）が挙げられる。
例示的な実施形態では、単分散エマルションを生成するための開示される方法は、複数の単分散テンプレート粒子を、複数の標的粒子を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップ；第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；および第２の混合物を剪断することで、複数の単分散テンプレート粒子を第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させて、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップを含む。本明細書に記載される単分散エマルションの生成は、マイクロ流体制御なしで行われ得る。
一部の実施形態では、標的粒子は、細胞、ウイルス、および／または核酸の不均一な集団を含み得る。一部の実施形態では、標的粒子は、たとえば、制御された数の細胞、ウイルス、および／または核酸を単分散ドロップレットに封入するように、封入前に希釈され得る。核酸合成試薬、たとえば、等温核酸増幅試薬、非特異的核酸増幅試薬（たとえばＭＤＡ試薬）、および／またはＰＣＲ試薬が、たとえば、１つまたは複数の標的粒子と一緒に、単分散ドロップレットに共封入され得るか、または本明細書に記載される方法の１つまたは複数を用いて後で単分散ドロップレットに加えられてよいことで、本明細書に記載される下流での検出、ソート、および／または分析が容易になる。
本明細書に記載される多相エマルションドロップレットは、たとえば、複数の標的粒子、たとえば細胞、ウイルス、および／または核酸を含む第１の流体を、核酸合成試薬と一緒に、複数の単分散テンプレート粒子と組み合わせることにより第１の混合物を提供するステップ；第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；第２の混合物を剪断することで、複数の単分散テンプレート粒子を第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させて、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップ；第２の混合物を、第２の流体と混和しない第３の流体と組み合わせるステップ；ならびに第３の混合物を剪断し、単分散テンプレート粒子の有無にかかわらず、単分散ドロップレットの１つまたは複数を第３の流体中の１つまたは複数のドロップレットに封入して、１つまたは複数の二相エマルションドロップレットを提供するステップにより形成され得る。一部の実施形態では、第３の流体は、第１および第２の流体と混和しない。
ＧＵＶは、多相エマルションドロップレット（たとえば二相エマルションドロップレット）から、この多相エマルションドロップレットを脱濡れさせることにより生成され得、ここで、第２の流体は、第２の流体の小さなドロップレットが界面活性剤の膜の外側に付着した状態で、その膜を残して排出される。
本明細書に記載される方法で使用するための単分散テンプレート粒子は、たとえば、第１の流体、たとえば液体ゲル前駆体を、マイクロ流体デバイスのチャネルに流入させること；および第１の流体を、第１の流体と混和しない第２の流体と、たとえば単相エマルションドロップレット生成器を用いて接触させることにより生成され得る。一部の実施形態では、段階分裂および分配プレートを含む並列ドロップレット生成技術を用いて、単分散テンプレート粒子をより迅速に形成できる。次いで、単分散の単相エマルションドロップレットは、ゲル化の誘発、たとえばドロップレット内のゲルマトリックスの重合またはマトリックスの架橋により固化される。一部の実施形態では、界面活性剤を用いて、接触する単分散テンプレート粒子が互いに合一するのを妨げることができる。単分散テンプレート粒子を生成する方法の１つまたは複数のステップを、マイクロ流体制御下で行ってよい。
一部の実施形態では、標的粒子、たとえば細胞を含むサンプルが、本明細書に記載されるように調製された単分散の単相エマルションドロップレットまたは本明細書に記載されるように調製された多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶに封入され、かつ本明細書に記載される等温核酸増幅条件および／または核酸増幅条件に供される。一部の実施形態では、封入された細胞は、プロテイナーゼＫ消化または熱溶解などの１つまたは複数の細胞溶解技術に供される。目的の細胞に特異的な等温核酸増幅アッセイまたは核酸増幅アッセイが、目的の細胞を含む本明細書に記載されるように調製された単分散の単相エマルションドロップレットもしくは本明細書に記載されるように調製された多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶ、または目的の細胞に由来する核酸を引き起こすことができるため、検出可能に標識、たとえば蛍光標識されることになる。次いで、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶをソートし、それらの内容物を、たとえば化学的または電気的手段によるドロップレットの破裂を介して回収することにより、細胞および／または細胞核酸が回収され得る。上記のステップの後に、１つまたは複数のシーケンシングステップ、たとえば、１つまたは複数の次世代シーケンシング技術を続けてよい。
本明細書に記載されるように調製された単分散の単相エマルションドロップレットまたは本明細書に記載されるように調製された多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶで行うことができる更なる増幅反応として、たとえば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が挙げられる。
一実施形態では、標的核酸配列を濃縮する方法が提供され、ここで、この方法は、核酸を含む複数の標的粒子を、本明細書に記載されるように調製された複数の単分散の単相エマルションドロップレットまたは本明細書に記載されるように調製された多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶに封入するステップ；多置換増幅（ＭＤＡ）試薬、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、および／または他の核酸合成物、たとえば、適切なプライマーを含む増幅試薬を、単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶ中に導入するステップ；ＰＣＲ増幅に十分な条件、またはＭＤＡ増幅に十分な条件の後に、ＰＣＲ増幅に十分な条件下で単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶをインキュベートして、ＰＣＲ増幅産物を生成するステップ（ここで、適切なＰＣＲプライマーは、標的核酸配列を組み込む１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにそれぞれハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含んでもよく、かつＰＣＲ増幅産物は、完全な標的核酸配列を含まない）；インキュベーションの前または後のいずれかに、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶ中に検出成分を導入するステップ；検出成分の検出によりＰＣＲ増幅産物の存在または非存在を検出するステップ（ここで、検出成分の検出は、ＰＣＲ増幅産物および標的核酸配列の存在を示す）；ならびに検出成分の検出に基づいて、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶをソートするステップ（ここで、ソーティングは、ＰＣＲ増幅産物および標的核酸配列を含む単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶを、存在する場合、ＰＣＲ増幅産物および標的核酸配列を含まない単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶから分離する）；ならびに、存在する場合、ソートされた単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶから核酸配列をプールして、標的核酸配列の濃縮されたプールを提供するステップを含む。上記のステップの後に、１つまたは複数のシーケンシングステップ、たとえば、１つまたは複数の次世代シーケンシング技術が続いてよい。
本明細書に記載される場合、「次世代シーケンシング」という用語は、一般に、標準的なＤＮＡシーケンシング（たとえばサンガーシーケンシング）に対する進歩を指す。標準的なＤＮＡシーケンシングにより、当業者はＤＮＡ配列のヌクレオチドの正確な順序を判定できるが、次世代シーケンシングでは、並列シーケンシングも提供され、その間に何百万ものＤＮＡの塩基対フラグメントを同時にシーケンシングできる。標準的なＤＮＡシーケンシングでは、一般に、ＤＮＡテンプレート分子を増幅するために、一本鎖ＤＮＡテンプレート分子、ＤＮＡプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼが必要である。次世代シーケンシングは、ハイスループットシーケンシングを容易にし、これにより標準的なＤＮＡシーケンシングと比べてゲノム全体を大幅に短い時間でシーケンシングすることが可能になる。次世代シーケンシングはまた、病的状態の診断のための疾患の原因となる変異の特定を容易にし得る。次世代シーケンシングはまた、遺伝子配列の事前知識を必要とせずに、１回の分析でサンプルのトランスクリプトーム全体に関する情報を提供できる。
任意の適切な非特異的核酸増幅方法および試薬、たとえばＭＤＡ方法および試薬を、開示される方法と共に、そのような方法および試薬が、任意の追加の、たとえば、その後の方法の増幅ステップおよび／または試薬、たとえばＰＣＲ増幅ステップおよび試薬と適合するという条件で利用してよい。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いられ得る適切なＭＤＡポリメラーゼの例は、Ｂｓｔポリメラーゼである。Ｂｓｔポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ポリメラーゼなどの他のＭＤＡポリメラーゼよりも有利であり得る。これは、Ｂｓｔポリメラーゼがより幅広い温度範囲で有効であり、かつＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと同様のバッファー条件下で活性であるからである。
主題の方法を実行する際に、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルドロップレットＰＣＲなどの広範囲の異なるＰＣＲベースのアッセイを用いることができる。そのようなアッセイで用いられるプライマーの数と性質は、行われるアッセイのタイプ、生体サンプルの性質、および／または他の因子に基づいて少なくとも部分的に変化してよい。ある態様では、単分散ドロップレット、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、またはＧＵＶに加えられてよいプライマーの数は、１〜１００以上であり得、かつ／または約１〜１００以上の異なる遺伝子（たとえばオンコジーン）を検出するためのプライマーを含み得る。そのようなプライマーに加えて、またはその代わりに、１つまたは複数のプローブ（たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を、主題の方法を実行する際に用いることができる。
本明細書で用いられる場合、「ドロップ」および「ドロップレット」という用語は、第１の流体と混和しない第２の流体（たとえば油）と境界を接する、少なくとも第１の流体、たとえば水相（たとえば水）を含む、極めて小さな、一般に球状のマイクロ区画を指すために互換的に用いられる。一部の実施形態では、第２の流体は非混和性相キャリア流体であろう。たとえば単相エマルションおよび多相エマルションのドロップレットを含むドロップレットは、一般に、直径または最大寸法が約０．１から約１０００μｍまでに及び、かつ細胞、ＤＮＡ、酵素、および他の成分を封入するために用いられ得る。一部の実施形態では、ドロップレット、たとえば単相エマルションおよび多相エマルションのドロップレットは、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜約７５０μｍ、約１．０μｍ〜約５００μｍ、約１．０μｍ〜約２５０μｍ、約１．０μｍ〜約２００μｍ、約１．０μｍ〜約１５０μｍ、約１．０μｍ〜約１００μｍ、約１．０μｍ〜約１０μｍ、または約１．０μｍ〜約５μｍなど、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜１０００μｍの直径または最大寸法を有する。一部の実施形態では、ドロップレット、たとえば単相エマルションおよび多相エマルションのドロップレットは、約１０μｍ〜約２００μｍ、たとえば、約１０μｍ〜約１５０μｍ、約１０μｍ〜約１２５μｍ、または約１０μｍ〜約１００μｍの直径または最大寸法を有する。
二相エマルションドロップレットから形成され得るＧＵＶは、一般に、元の二相エマルションドロップレットと同様のサイズである。したがって、本明細書に記載されるＧＵＶは、直径または最大寸法が約０．１から約１０００μｍまでに及び得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧＵＶは、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜約７５０μｍ、約１．０μｍ〜約５００μｍ、約１．０μｍ〜約２５０μｍ、約１．０μｍ〜約２００μｍ、約１．０μｍ〜約１５０μｍ、約１．０μｍ〜約１００μｍ、約１．０μｍ〜約１０μｍ、または約１．０μｍ〜約５μｍなど、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜１０００μｍの直径または最大寸法を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧＵＶは、約１０μｍ〜約２００μｍ、たとえば、約１０μｍ〜約１５０μｍ、約１０μｍ〜約１２５μｍ、または約１０μｍ〜約１００μｍの直径または最大寸法を有する。
ドロップレット、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶは、サイズ、組成、内容物などを含めて、それ自体変化してよい。単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶは、一般に、約０．００１〜１０００ピコリットル以上、たとえば、約０．００１ピコリットル〜約０．０１ピコリットル、約０．０１ピコリットル〜約０．１ピコリットル、約０．１ピコリットル〜約１ピコリットル、約１ピコリットル〜約１０ピコリットル、約１０ピコリットル〜約１００ピコリットル、または約１００ピコリットル〜約１０００ピコリットル以上の内部体積を有し得る。さらに、ドロップレットは、界面活性剤および／または粒子で安定化されてもされなくてもよい。
試薬が、ドロップレット、たとえば単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶに加えられる手段は大きく異なり得る。試薬が、１ステップまたは複数のステップ、たとえば、２以上のステップ、４以上のステップ、もしくは１０以上のステップで加えられてよい。ある態様では、試薬が、１つまたは複数の封入および破裂ステップを介して、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶに加えられてよい。たとえば、一部の実施形態では、開示される方法は、複数の標的粒子、たとえば、ウイルス、細胞または核酸を第１の単分散ドロップレットまたはＧＵＶに封入し、１つまたは複数の試薬および第１の単分散ドロップレットまたはＧＵＶを第２のドロップレットまたはＧＵＶに封入し、第１の単分散ドロップレットまたはＧＵＶを破裂させ、それにより複数の標的粒子を１つまたは複数の試薬と接触させるステップを含み得る。
そのような一実施形態では、本明細書に記載されるように調製された単分散の単相エマルションドロップレットを適切な溶解バッファーと一緒に使用して、細胞を二相エマルションドロップレットまたはＧＵＶ中に封入し、細胞溶解および／またはタンパク質消化に十分な条件下でインキュベートし、加熱してプロテアーゼを不活性化する。次いで、二相エマルションまたはＧＵＶを、適切な核酸合成試薬を含む二相エマルションまたはＧＵＶ中に封入し、封入する二相エマルションまたはＧＵＶ中にそれらの内容物が放出するように破裂させ、それにより細胞溶解物を核酸合成試薬と混合してよい。次いで、残りの二相エマルションまたはＧＵＶを、核酸増幅に適した条件下でインキュベートしてよい。二相エマルションまたはＧＵＶは、それらが親水性と疎水性を兼ね備えていることにより、薬物の封入および送達を含む薬物送達；化粧品の封入を含む化粧品用途；ならびにＦＡＣＳベースの二相エマルションソートおよび膜タンパク質機能研究による合成生物学におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ区画化および菌株分離を含む生物医学研究に幅広く適用できる。
上記の方法の変形例として、細胞を、適切な溶解バッファーを用いて単分散の単相エマルションに封入してよい。任意のプロテアーゼ不活性化ステップに続いて、次いで、単分散の単相エマルションを、ドロップレット併合を介して、適切な核酸合成試薬を含む単分散の単相エマルションと併合させてよい。次いで、併合された単分散の単相エマルションドロップレットを、その後の核酸増幅のために、二相エマルションまたはＧＵＶに封入してよい。あるいは、細胞を、適切な溶解バッファーを用いて単相エマルションに封入してから、任意のプロテアーゼ不活性化ステップに続いて、核酸増幅試薬を含む二相エマルションまたはＧＵＶに封入してよい。単相エマルションへの封入のステップおよび二相エマルションへの封入のステップは、マイクロ流体デバイスを使用せずに行われ得ることに留意されたい。
上述のように、単分散の単相エマルションドロップレットが本明細書に記載されるように利用される場合、本明細書でより完全に説明されるように、たとえば、ドロップレット合一、ピコインジェクション、複数ドロップレット合一などを含む、単相エマルションドロップレットに適用可能な種々の技術を利用できる。ある実施形態では、試薬は、インジェクション流体自体が電極として機能する方法により加えられる。インジェクション流体は、それ自体で用いられることを可能にする１つまたは複数のタイプの溶解電解質を含み得る。インジェクション流体自体が電極として機能する場合、試薬をドロップレットに加える目的でマイクロ流体チップに金属電極を設ける必要が無くなり得る。ある実施形態では、インジェクション流体は電極として機能しないが、金属電極の代わりに１つまたは複数の液体電極が利用される。
種々の異なる検出成分を用いて、核酸増幅産物の有無を検出する多様な手法を用いることができる。目的の検出成分として、フルオレセインとその誘導体；ローダミンとその誘導体；シアニンとその誘導体；クマリンとその誘導体；カスケードブルーとその誘導体；ルシファーイエローとその誘導体；ＢＯＤＩＰＹとその誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なフルオロフォアとして、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ−３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎなどが挙げられる。検出成分として、ビーズ（たとえば、磁気ビーズまたはＬｕｍｉｎｅｘビーズなどの蛍光ビーズ）などが挙げられ得る。ある態様では、検出は、サーマルサイクリング中に単分散ドロップレットを固定位置に保持することを含み、そうすることで、それを繰り返し画像化できる。本明細書でより完全に説明されるように、そのような繰り返されるイメージングは、Ｍｅｇａｄｒｏｐｌｅｔアレイの使用を含み得る。ある態様では、検出は、１つまたは複数の単分散ドロップレット、たとえば１つまたは複数の多相エマルションの単分散ドロップレット、またはＧＵＶ中の１つまたは複数の細胞を固定および／または透過化処理することを含み得る。
本明細書に開示される方法に適切な対象として、哺乳類、たとえばヒトが挙げられる。対象は、疾患症状の臨床像を示すか、または疾患と診断された対象であってよい。ある態様では、対象は、癌と診断され、癌の臨床像を示すか、または１つもしくは複数の因子、たとえば、家族歴、環境曝露、遺伝子変異、ライフスタイル（たとえば、食事および／または喫煙）、１つもしくは複数の他の疾患症状の存在などにより、癌を発病するリスクがあると判定される対象であってよい。ある態様では、対象は、微生物感染と診断され、微生物感染の臨床像を示すか、または１つもしくは複数の因子、たとえば、家族歴、環境曝露、遺伝子変異、ライフスタイル（たとえば、食事および／または移動）、１つもしくは複数の他の疾患症状の存在などにより、微生物感染を発病するリスクがあると判定される対象であってよい。ある態様では、対象は、ウイルス感染と診断され、ウイルス感染の臨床像を示すか、または１つもしくは複数の因子、たとえば、家族歴、環境曝露、遺伝子変異、ライフスタイル（たとえば、食事および／または移動）、１つもしくは複数の他の疾患症状の存在などにより、ウイルス感染を発病するリスクがあると判定される対象であってよい。
単分散ドロップレットの調製に使用するための単分散テンプレート粒子を生成するために用いられるマイクロ流体デバイスには、米国特許出願公開第２０１５／０２３２９４２号明細書に記載されているものが含まれるが、これらに限定されず、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるように調製された単分散ドロップレットの処理／インキュベーションおよび分析と共に、核酸増幅領域および検出領域を含むマイクロ流体システムを使用できる。一部の実施形態では、核酸増幅領域は、サーマルサイクラーを含み得る。一部の実施形態では、システムは、核酸増幅領域由来の反応生成物の有無を検出し、かつ核酸増幅領域に流体連通され得る検出領域を含む。一部の実施形態では、システムは、第１の試薬を単分散の単相エマルションドロップレット、および／または加熱素子に加えるための手段を含む。一部の実施形態では、システムは、核酸増幅領域に流体連通されたソーティング領域または検出／ソーティング領域の組合せを含む。一部の実施形態では、「オンチップ」ソーティング領域の代わりに、またはそれに加えて、単分散ドロップレットのソーティングが「オフチップ」で起こり得る。たとえば、水相中非混和性相中水相型の二相エマルションの場合、オフチップフローサイトメトリーデバイス、たとえばＦＡＣＳデバイスまたはＭＡＣＳデバイスが、ソーティングのために利用され得る。
本発明は、添付の図面と併せて読まれるとき、以下の詳細な説明から最もよく理解され得る。図面には、次の図が含まれている。
ＰＴＥ用の粒子を生成するために用いられるマイクロ流体デバイスの設計図を示す。 本開示の実施形態によるＰＴＥ単分散ドロップレット生成ワークフローを示す概略図である。パネルＡは、複数の単分散テンプレート粒子を、標的粒子を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供することを示す。パネルＢは、第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供することを示す。パネルＣは、第２の混合物を剪断することで、単分散テンプレート粒子を第２の流体中の単分散ドロップレットに封入させ、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および標的粒子の１つを含む単分散ドロップレットを提供することを示す。 図２に示されるＰＴＥワークフローの実施形態を示す概略図である。パネルＡは、ＰＣＲ反応ミックスへの単分散ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ビーズの添加を示す。パネルＢは、ＰＡＡビーズ中でのＰＣＲ試薬の捕捉を示す。パネルＣは、過剰な水溶液の除去を示す。パネルＤは、安定化界面活性剤を含む油の添加を示し、パネルＥは、ボルテックスすることによるエマルションの生成を示す。パネルＦは、単分散ドロップレット内部の複数の核酸標的粒子の１つを増幅し、増幅産物に関連する蛍光シグナルを検出することを示す。 ＰＴＥにより生成されたドロップレットサイズの単分散性を、マイクロ流体デバイスを用いて生成されたドロップレットサイズの単分散性と比べて比較する画像を提供する。パネルＡは、単分散テンプレート粒子なしで生成されたドロップレットの画像を示す。エマルションは、ボルテックスする（左）ことによるか、またはマイクロフルイディクスデバイスを使用する（右）ことにより生成した。パネルＢは、異なる粒子組成物および水溶性界面活性剤を含むＰＴＥを用いて生成された単分散エマルションを示す。パネルＣは、異なる乳化法によるドロップレットサイズ分布を示す。 例２に記載される異なるＰＴＥ条件下で調製されたドロップレットの画像を提供する。パネルＡは、ＰＡＡ粒子（水相界面活性剤なし）を２０分間ボルテックスすることにより調製されたドロップレットを示す。パネルＢは、１％ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にＰＡＡ粒子を３分間ボルテックスすることにより調製されたドロップレットを示す。パネルＣは、２％Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にＰＡＡ粒子を３分間ボルテックスすることにより調製されたドロップレットを示す。パネルＤは、ＰＡＡ粒子を０．５％ＴｒｉｔｏｎとＦＣ−４０と５％フッ素系界面活性剤と共に混合し、３分間ボルテックスすることにより調製されたドロップレットを示す。パネルＥは、架橋剤として０．１８％Ｎ，Ｎ’−ビスアクリロイルシスタミンを伴ったＰＡＡ粒子を使用し、ＰＡＡ粒子を０．５％Ｔｒｉｔｏｎと共に３０秒間ボルテックスして調製されたドロップレットを示す。 異なるボルテックス時間で生成されたドロップレットの画像とヒストグラムを提供する。パネルＡは、ボルテックス時間が５秒のときの画像とヒストグラムを示す。パネルＢは、ボルテックス時間が１５秒のときの画像とヒストグラムを示す。パネルＣは、ボルテックス時間が１分のときの画像とヒストグラムを示す。パネルＤは、ボルテックス時間が２分のときの画像とヒストグラムを示す。 ＰＴＥがマイクロリットルからミリリットルスケールの単分散エマルションの生成を可能にすることを示す実証の結果を提供する。パネルＡは、総容量が異なるＰＴＥエマルションの画像を示す。パネルＢは、２００μＬおよび２ｍＬのエマルションのドロップレットサイズ分布のヒストグラムを示す。パネルＣは、ＰＴＥのドロップレット生成時間とマイクロフルイディクスベースの生成法とを比較した表を提供する。 ＰＴＥデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の画像と、単分散テンプレート粒子を使用した定量化とを示す。パネルＡは、さまざまな希釈係数（Ａ．Ｕ．＝０、０．００１、０．０１、０．１、１．０）での酵母ゲノムＤＮＡテンプレート用のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーを用いたＰＣＲ増幅後のドロップレットの蛍光画像を示す。観察された蛍光ポジティブドロップレットの割合は、テンプレート濃度に対応する。パネルＢは、希釈系列におけるサンプル由来のサイズおよび蛍光分布を示す散布図である。低蛍光（＜２０ＡＵ）かつ小径（＜３０μｍ）の集団は、ヒドロゲル粒子を含まないドロップレットで構成されている。予想される直径（３０〜４０μｍ）の集団は、単一のヒドロゲルコアのドロップレットからなる。この集団は２つの密なクラスターを形成する：高蛍光（ＰＣＲポジティブ）と低蛍光（ＰＣＲネガティブ、テンプレートなしのドロップレット）。パネルＣは、テストされた３ディケード範囲にわたり制御されたテンプレート濃度でポアソン分布スケールを仮定することにより推定された、ドロップレットあたりの平均テンプレートコピー数を示す（Ｒ２＝０．９９９４およびエラーバーは標準偏差を示す）。 比較のためのマイクロ流体ｄｄＰＣＲの結果を示すグラフを提供する。ドロップレットあたりの平均テンプレートコピー数は、テストされた３ディケード範囲にわたり制御されたテンプレート濃度でポアソン分布スケールを仮定することにより推定された（Ｒ２＝０．９９９３およびエラーバーは標準偏差を示す）。 ＰＴＥベースのｄｄＰＣＲの概略図、画像、およびグラフと、市販の粒子を用いた定量化とを提供する。図１０Ａは、準単分散の市販の粒子を用いてＰＴＥベースのｄｄＰＣＲに有用なドロップレットの生成を示す概略図を表す。 ＰＴＥベースのｄｄＰＣＲの概略図、画像、およびグラフと、市販の粒子を用いた定量化とを提供する。図１０ＢのパネルＡは、異なる濃度（Ａ．Ｕ．＝０、０．１、１）での酵母ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅後の蛍光画像を表す。図１０ＢのパネルＢは、希釈系列におけるサンプル由来のサイズと蛍光分布を示す散布図を示す。蛍光ポジティブと蛍光ネガティブは互いに明確に区別でき、画像分析による定量化が可能である。図１０ＢのパネルＣは、ドロップレット体積で重み付けされた複数のポアソン分布を用いて得られたポアソン推定値を示し、テンプレート濃度との線形相関を示す（Ｒ２＝０．９４０９およびエラーバーは標準偏差を示す）。 ラムダウイルスと酵母ＤＮＡを混合したマルチプレックスＰＴＥベースのｄｄＰＣＲを示す画像を提供する。パネルＡは、ラムダウイルスまたは酵母を標的とするプローブが、それぞれＣｙ５（赤）およびカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）（緑）で蛍光標識されていることを示す。パネルＢは、ＰＴＥにより調製されたドロップレット中で増殖する酵母細胞を示す。１０時間のインキュベーション後、単一の封入された細胞から増殖したコロニーが、内因性黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）蛍光により検出され得る。 例７で考察される９６ウェルプレートフォーマット内で調製された単分散エマルションの画像を提供する。 ＰＴＥにより二相エマルションおよびＧＵＶ（すなわちリポソーム）を生成するためのワークフローの概略図および関連画像を提供する。パネルＡは、本リポソーム生成法のワークフローの概要を示す。パネルＢは、ポリアクリルアミドビーズと共にボルテックスすることにより形成された単相エマルションを示す。パネルＣは、外側の水溶液を加え、続いてボルテックスすることにより形成されたリポソームの画像を示す。スケールバー＝４００μｍ。パネルＤは、油相中に蛍光脂質を追加で含んで形成されたリポソームの蛍光画像を示す。 ＰＴＥによりハイスループットｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを行うための方法の概略図を提供する。図１４Ａは、ヒドロゲルに封入されているＤｒｏｐ−ｓｅｑビーズを示す。細胞、プロテイナーゼＫ、およびハイブリダイゼーションバッファーが混合される。 ＰＴＥによりハイスループットｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを行うための方法の概略図を提供する。図１４Ｂは、乳化のために混合物をボルテックスすることを示す。 ＰＴＥによりハイスループットｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを行うための方法の概略図を提供する。図１４Ｃは、Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズの回収およびＲＴシーケンシングと、その後のデータ分析を示す。 マイクロフルイディクスを用いないｓｃＲＮＡ−ｓｅｑであるＰＴＥによるハイスループットｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを行った実験の画像結果を示す。パネルＡは、２０００μｍのスケールバーを有するＤｒｏｐ−ｓｅｑビーズを含む粒子の顕微鏡画像を示す。パネルＢは、１０００μｍのスケールバーを有するＤｒｏｐ−ｓｅｑビーズを含むエマルションの顕微鏡画像を示す。パネルＣは４００μｍのスケールバー、パネルＤは１０００μｍのスケールバーで、溶解前および溶解後にドロップレットに封入されたカルセイングリーン染色細胞の顕微鏡画像を示す。パネルＥは、ヒトとマウスの混合細胞実験のデータを示すグラフを提供する。 親和性ベースのＰＴＥをターゲット解析と組み合わせた本エマルション技術を用いてコアシェルマイクロゲルを作製するためのワークフローの実施形態の概略図を提供する。 アガロースシェルを備えたポリアクリルアミドコアビーズの画像を提供する。パネルＡは、ドロップレットが壊れた後のアガロースシェルで囲まれたポリアクリルアミドコアビーズを示す。パネルＢは、２つの希釈係数でのアガロースシェルを備えたポリアクリルアミドコアビーズのｄｄＰＣＲを示す。パネルＣは、ＦＡＣＳ後のドロップレットの画像を示す。パネルＤは、ｑＰＣＲの結果を示す。
本開示は、単分散エマルションを生成するための改善された粒子テンプレート乳化（ＰＴＥ）法を提供する。そのようなエマルションに存在するドロップレットは、本明細書ではＰＴＥドロップレットおよびＰＩＰと互換的に呼ばれる。開示される方法は、マイクロ流体デバイスの使用を必要とせずに、目的の標的粒子の封入とその後の分析を容易にする。開示される方法は、単分散ドロップレットの形成をテンプレート化するための単分散粒子の使用を含む。
開示される方法は、標的粒子、たとえば核酸の封入を容易にし、標的粒子は、次いで、たとえば、核酸増幅技術、たとえばＰＣＲおよび／またはＭＤＡにより検出されるそれらの配列に基づいて、検出、定量および／またはソートされ得る。
本発明をさらに説明していく前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図していないことも理解されたい。これは、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるからである。
値の範囲が提供されている場合、当該範囲の上限と下限との間の、文脈上そうでないとする明確な規定がない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびに他に言及した任意の値またはその言及した範囲内の介在値は、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより狭い範囲の上限および下限は、より狭い範囲に独立して含まれてもよく、言及した範囲内での具体的に除外される任意の限定に従って、同じく本発明に包含される。言及した範囲が限定の一方または双方を含む場合、それらの含まれる限定の一方または双方を除く範囲も本発明に含まれる。
別に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語と科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用できるが、いくつかの潜在的かつ例示的な方法および材料をここで説明する。本明細書で言及されるすべての公表文献は、公表文献を引用することに関連して、方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある限りにおいて、組み込まれた公表文献の任意の開示に取って代わるものであると理解される。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。したがって、たとえば、「ドロップレット」への言及は、複数のそのようなドロップレットを含み、「核酸」への言及は、１つまたは複数の核酸および当業者に知られているその同等物への言及などを含む。
さらに、特許請求の範囲は、任意であり得る任意の要素を除外するように作成され得ることも留意される。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載と関連して、「単独で」、「のみ」等の排他的な専門用語を使用したり、または「否定的な」限定を使用するための先行詞の役割を担うことが意図される。
本明細書で考察される公表文献は、本出願の出願日に先立つそれらの開示のためにのみ提供される。さらに、提供された公表日は実際の公表日とは異なることがあり得、実際の公表日は独立して確認される必要があり得る。
本開示を読めば当業者に明らかとなるように、本明細書に記載および例示される個々の実施形態の各々は別個の構成要素および特徴を有し、それらは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他の一部の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または当該特徴と組み合わされ得る。任意の言及される方法は、言及される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施され得る。たとえば、本明細書に記載されているのは、種々の更なる方法および用途であって、これらは、単分散エマルションの生成に関する本明細書に記載される方法と共に行うことができるか、または単分散エマルションの生成のために本明細書に記載される方法に従って調製された単分散ドロップレットを利用できる。この点に関して、本明細書で１〜６２の番号を付した開示の非限定的な態様のいずれも、そのような方法および用途の１つまたは複数のステップで適宜変更することができ、かつ／またはそのような方法および用途は、本明細書で１〜６２の番号を付した本開示の非限定的な態様の１つまたは複数に従って調製された単分散ドロップレットを利用できると考えられる。そのような方法および用途には、以下のタイトルで本明細書の各セクションに記載される方法および用途が含まれるが、これらに限定されない：方法；単分散テンプレート粒子とその生成；単相エマルションドロップレットおよび多相エマルションドロップレットを含む単分散ドロップレット、ならびにそれらの生成；巨大単層小胞（ＧＵＶ）；単分散エマルションの生成に関与する流体；界面活性剤；剪断；単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶへの試薬の添加；係留部分；単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中での反応；ＰＣＲ産物の検出；単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中の細胞（たとえば腫瘍細胞）の検出；単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中の核酸検出；多置換増幅；ＰＣＲ；ダブルＰＣＲ；デジタルＰＣＲ；ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）；核酸の長さの測定；単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中の配列分析（ＭＥＳＡ）のためのマイクロ流体濃縮；単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中のＰＣＲ活性化細胞ソーティング（ＰＡＣＳ）；生細胞ＰＣＲ活性化細胞ソーティング（ＰＡＣＳ）；質量分析活性化細胞ソーティング（ＭＳ−ＡＣＳ）；コロニーの増殖と溶解；マルチプレキシング；デジタル酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；デジタルオリゴ結合免疫吸着検定法（ｄＯＬＩＳＡ）；ソーティング；適切な被験体および／またはサンプル；酵素結合プローブを用いたタンパク質またはＤＮＡの検出；ならびに癌の検出。
方法
上記で要約したように、本開示は、単分散エマルションを生成するための改善されたＰＴＥ法を提供する。開示される方法は、マイクロ流体デバイスの使用を必要とせずに、目的の標的粒子の封入と、任意にその後の分析とを容易にする。特に、開示される方法は、高度なマイクロ流体システムを必要とせずに、単分散の標的粒子含有ドロップレットの生成を含む。マイクロ流体システムは、たとえば、ドロップレットへの試薬の添加またはドロップレットのソーティングのために、本明細書に記載されるように調製された単分散ドロップレットと共に利用され得るが、そのようなシステムは、単分散ドロップレット自体の生成には必要でない。開示される方法は、たとえば、ホモジナイザー（たとえばボルテックスミキサー）を使用するか、適切な混合物をピペットチップに通すか、ビードビーターを用いて適切な混合物を振とうするか、または他の任意の適切な方法により適用され得る剪断力の適用を介して単分散ドロップレットの形成をテンプレート化するための単分散粒子の使用を含む。
本明細書で用いられる場合、「生体サンプル」という用語は、種々の供給源から得られる種々のサンプルのタイプを包含し、これらのサンプルのタイプは、生体材料を含む。たとえば、この用語は、哺乳類対象、たとえばヒト対象から得られた生体サンプル、および食物、水、または他の環境源などから得られた生体サンプルを含む。この定義は、生体起源の血液および他の液体サンプル、ならびに固形組織サンプル、たとえば生検標本もしくは組織培養体またはそれらに由来する細胞およびそれらの後代を包含する。この定義はまた、試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドなどの特定の成分の濃縮など、入手後に任意の方法で操作されたサンプルを含む。「生体サンプル」という用語は、臨床サンプルを包含し、培養体中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、細胞、血清、血漿、生体液、および組織サンプルも含む。「生体サンプル」は、個体から得られた細胞、たとえば細菌細胞または真核生物細胞；生体液、たとえば血液、脳脊髄液、精液、唾液等；胆汁；骨髄；皮膚（たとえば皮膚生検）；および抗体を含む。
本明細書でより完全に説明されるように、さまざまな態様では、主題の方法を用いて、そのような生体サンプルから種々の成分を検出できる。目的の成分として、細胞（たとえば循環細胞および／または循環腫瘍細胞）、ウイルス、ポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、ポリペプチド（たとえばペプチドおよび／またはタンパク質）、ならびに生体サンプルに存在し得る他の多くの成分が挙げられるが、これらに必ずしも限定されない。
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを指し、互換的に用いられ得る。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、種々の構造的形態のいずれかを有することができ、たとえば、一本鎖、二本鎖、または双方の組合せ、ならびにより高次の分子内または分子間の二次／三次構造、たとえば、ヘアピン、ループ、三本鎖領域などである。ポリヌクレオチドのサイズは、典型的には、通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれるときの少数のモノマー単位、たとえば５〜４０から、数千のモノマー単位にまで及ぶ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字列（大文字または小文字）で表される場合は常に、文脈上そうでないことが示されないか、または明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表し、「Ｉ」はデオキシイノシンを表し、「Ｕ」はウリジンを表すことが理解されるであろう。特に明記しない限り、専門用語および原子番号の規則は、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示されたものに従うことになるであろう。
本明細書で互換的に用いられる用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシル基を指す。標準的なポリペプチド命名法に沿って、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（１９６９），３５５２〜３５５９が用いられる。
ある態様では、正常細胞またはＣＴＣなどの腫瘍細胞を含む細胞を計数および／または遺伝子型決定する方法が提供される。そのような方法の特徴が、マイクロフルイディクスの使用である。
本明細書に記載される方法は、一般に、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶを含む複数の単分散ドロップレットを生成するステップを含み、続いて、たとえば、１つまたは複数の核酸合成ステップ、および／または１つまたは複数の検出および／またはソーティングステップを続けてよい。図２は、本開示の実施形態によるＰＴＥワークフローを示す概略図を提示する。パネルＡは、複数の単分散テンプレート粒子を、標的粒子を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供する第１のステップを示す。パネルＢは、第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供する第２のステップを示す。パネルＣは、第２の混合物を剪断することで、単分散テンプレート粒子を第２の流体中の単分散ドロップレットに封入させるステップを示す。これらのステップの結果として、第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および標的粒子の１つを含む単分散ドロップレットが提供される。
単分散ドロップレットの生成に続いて、そのようなドロップレットは、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ標的粒子、たとえば細胞、ウイルス、および核酸、たとえばＤＮＡおよびＲＮＡなどのそれらの成分のドロップレットベースの分析と共に当該技術分野で知られている、種々の適切なワークフロー、技術および／または反応のいずれかに供され得る。本明細書に記載される方法に従って調製された単分散ドロップレットと共に用いられ得る更なるドロップレットベースの分析方法が、たとえば、以下の公表文献：米国特許出願公開第２０１５／０２３２９４２号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１２１７５６号明細書、米国特許出願公開第２０１７／００２２５３８号明細書、および米国特許出願公開第２０１７／０００９２７４号明細書に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
図３は、図２に示されるＰＴＥワークフローのより詳細な実施形態を示す概略図を提示する。パネルＡは、ＰＣＲ反応ミックスに単分散ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ビーズを加えて、第１の混合物を提供するステップを示し、反応ミックスは、たとえば、テンプレート核酸、プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、および適切な酵素（たとえばＴａｑポリメラーゼ）を含み得る。パネルＢは、ＰＡＡビーズをＰＣＲ反応ミックスに浸すことにより、ＰＡＡビーズ中にＰＣＲ試薬を捕捉するステップを示す。パネルＣは、ＰＡＡビーズをＰＣＲ反応ミックスに浸漬した後、第１の混合物から過剰な水溶液を除去するステップを示す。パネルＤは、安定化界面活性剤を含む油（ＰＣＲ反応ミックスと混和しない第２の流体）を加えて第２の混合物を提供するステップを示す。パネルＥは、第２の混合物をボルテックスすることにより単分散エマルションを生成するステップを示す。パネルＦは、単分散ドロップレット内部の複数の核酸標的粒子の１つを増幅し、増幅産物に関連する蛍光シグナルを検出するステップを示す。
本明細書に記載される特定の方法の特徴は、特定のオリゴヌクレオチドおよび／または遺伝子、たとえば細胞に存在するオンコジーンの存在を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイの使用である。目的のＰＣＲベースのアッセイの例として、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、マルチプレックス蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）単一細胞ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／リアルタイムＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕポロニーＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ、エマルションＰＣＲおよび逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な増幅方法として、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅法、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。
ＰＣＲベースのアッセイを用いて、特定のオンコジーンなどの特定の遺伝子の存在を検出できる。そのようなアッセイでは、目的の各遺伝子に特異的な１つまたは複数のプライマーが、各細胞のゲノムと反応させられる。これらのプライマーは特定の遺伝子に特異的な配列を有しているため、細胞のゲノムに相補的な場合にのみハイブリダイズしてＰＣＲを開始するであろう。目的の遺伝子が存在し、かつプライマーが一致するならば、遺伝子の多くのコピーが作製される。特定の遺伝子が存在するかどうかを判定するために、ＰＣＲ産物の検出は、単分散ドロップレットの液体をプローブするアッセイを通して、たとえば、サイバーグリーンもしくは臭化エチジウムのようなインターカレート色素で溶液を染色することによってか、ＰＣＲ産物をビーズなどの固体基質（たとえば、磁気ビーズまたはＬｕｍｉｎｅｘビーズなどの蛍光ビーズ）にハイブリダイズすることによってか、またはＦＲＥＴなどの分子間反応を通してそれらを検出することによって行われ得る。これらの色素、ビーズ等は、それぞれ「検出成分」の例であり、核酸増幅産物、たとえばＰＣＲ産物の有無を検出するために用いられる任意の成分を指すために、本明細書で広く一般に用いられる用語である。
これらの基本的なアプローチのいくつかの変形例を、これから以下でより詳細に概説する。
単分散テンプレート粒子とその生成
本明細書で用いられる場合、テンプレート粒子に適用される「単分散」という用語は、テンプレート粒子の少なくとも５０％以上、たとえば、６０％以上、または７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の直径または最大寸法が、１０倍未満、たとえば、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、１．４倍未満、１．３倍未満、１．２倍未満、１．１倍未満、１．０５倍未満、または１．０１倍未満で変動するような、テンプレート粒子の直径または最大寸法の変動を指す。
本明細書で用いられる場合、「複数のテンプレート粒子」および「テンプレート粒子」という用語は、極めて小さな、一般に球状の粒子を指すために互換的に用いられる。テンプレート粒子は、多孔性でも非多孔性であってもよい。本明細書の任意の適切な実施形態では、テンプレート粒子は、追加の成分および／または試薬、たとえば、本明細書に記載される単分散ドロップレット内に放出可能であり得る追加の成分および／または試薬を含み得るマイクロ区画を含み得る。本明細書の任意の適切な実施形態では、テンプレート粒子は、ポリマー、たとえばヒドロゲルを含み得る。一部の実施形態、たとえば、第１の流体が水性流体である本明細書に記載される実施形態では、ポリマーは親水性ポリマーである。一部の実施形態、たとえば、第１の流体が非水性流体、たとえば油である本明細書に記載される実施形態では、ポリマーは親油性ポリマーである。テンプレート粒子は、一般に、直径または最大寸法が約０．１から約１０００μｍまでに及ぶ。一部の実施形態では、テンプレート粒子は、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜約７５０μｍ、約１．０μｍ〜約５００μｍ、約１．０μｍ〜約２５０μｍ、約１．０μｍ〜約２００μｍ、約１．０μｍ〜約１５０μｍ、約１．０μｍ〜約１００μｍ、約１．０μｍ〜約１０μｍ、または約１．０μｍ〜約５μｍなど、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜１０００μｍの直径または最大寸法を有する。一部の実施形態では、テンプレート粒子は、約１０μｍ〜約２００μｍ、たとえば、約１０μｍ〜約１５０μｍ、約１０μｍ〜約１２５μｍ、または約１０μｍ〜約１００μｍの直径または最大寸法を有する。
本明細書に記載される方法を実行する際に、単分散テンプレート粒子の組成と性質は変化してよい。たとえば、ある態様では、単分散テンプレート粒子は、ゲルマトリックスのミクロンスケールの球体であるマイクロゲル粒子であり得る。一部の実施形態では、マイクロゲルは、アルギン酸塩またはアガロースを含む、水に溶解する親水性ポリマーから構成される。他の実施形態では、マイクロゲルは親油性マイクロゲルから構成される。
他の態様では、単分散テンプレート粒子はヒドロゲルであり得る。ある実施形態では、ヒドロゲルは、天然由来の材料、合成由来の材料およびそれらの組合せから選択される。ヒドロゲルの例として、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、フィブリン、ゼラチン、アルギン酸塩、アガロース、コンドロイチン硫酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド／ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、およびポリ無水物、ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、単分散テンプレート粒子は平均体積を有し、本明細書に記載される方法は、単分散テンプレート粒子を収縮させて平均体積を減少させることを含む。収縮は、熱などの外部刺激を適用すると起こり得る。例として、単分散テンプレート粒子は、剪断に続けて、熱の適用により流体に封入され得ることで、単分散テンプレート粒子のサイズが収縮させられる。ドロップレットの体積は一定であり、単分散テンプレート粒子の元のサイズにより規定されるので、単分散の単相エマルションドロップレットまたは二相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶは収縮しないが、ドロップレット内の単分散テンプレート粒子は、ドロップレットの表面から収縮していくであろう。
本明細書の任意の適切な実施形態では、単分散テンプレート粒子は、細胞、遺伝子、薬物分子、治療剤、粒子、生物活性剤、骨形成剤、骨伝導剤、骨誘導剤、抗炎症剤、成長因子、フィブロイン由来のポリペプチド粒子、核酸合成試薬、核酸検出試薬、標的粒子、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子の少なくとも１つ、およびそれらの組合せを含み得る。単分散の単相エマルションドロップレットまたは二相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶ中に複数の試薬の組合せを含む実施形態では、単分散テンプレート粒子は複数の区画を含み得る。単分散テンプレート粒子は、所望の化合物、たとえば酵素反応のための基質を放出するように誘発され得る試薬を封入するために用いられ得る。例として、二相エマルションドロップレットが、刺激、たとえば熱を適用すると破裂するように誘発される単分散テンプレート粒子に封入され得る。単分散テンプレート粒子が非混和性のキャリア相流体に封入された後、刺激が反応を開始する。
単分散テンプレート粒子は、たとえば、米国特許出願公開第２０１５／０２３２９４２号明細書に記載される方法を用いて、マイクロ流体制御下で生成され得、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。マイクロ流体デバイスは、サイズが非常に均一なドロップレットからなるエマルションを形成し得る。単分散テンプレート粒子の生成プロセスは、２つの非混和性流体、たとえば油と水をジャンクションにポンプで送ることにより達成され得る。ジャンクションの形状、流体の特性（粘度、界面張力など）、および流量は、生成される単分散テンプレート粒子の特性に影響を及ぼすが、比較的広範囲の特性では、Ｔジャンクションおよびフローフォーカシングなどの方法を用いて、制御された均一サイズの単分散テンプレート粒子を生成できる。単分散テンプレート粒子サイズを変えるために、非混和性液体の流量を変えることができる。これは、Ｔジャンクションおよびフローフォーカスの方法論では、特性の特定の範囲にわたって、単分散テンプレート粒子サイズが総流量と２つの流体流量の比率に依存するからである。マイクロ流体法で単分散テンプレート粒子を生成するために、通常、２つの流体が２つの入口リザーバー（たとえば、シリンジ、圧力チューブ）内にロードされてから、必要に応じて、（たとえば、シリンジポンプ、圧力レギュレーター、重力など使用して）加圧されて所望の流量が生成される。これは、所望の流量でデバイスに流体をポンプで送り、そうすることで、所望のサイズおよび速度のドロップレットを生成する。
一部の実施形態では、単分散テンプレート粒子は、段階分裂および分配プレートを含むがこれらに限定されない並列ドロップレット生成技術を用いて生成され得る。目的の並列ドロップレット生成技術としてさらに、Ａｂａｔｅ ａｎｄ Ｗｅｉｔｚ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１１，Ｊｕｎ ７；１１（１１）：１９１１−５；ならびにＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２０１７，７，１４９３２−１４９３８に記載されるものが挙げられ、それぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、単分散テンプレート粒子は、ゲルマトリックスの重合または架橋を含むがこれらに限定されないゲル化メカニズムを誘発することにより固化可能である。例として、ポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドとビスアクリルアミドとの共重合により形成される。反応は、フリーラジカル生成システムにより開始されるビニル付加重合である。ある態様では、アガロースヒドロゲルは、ヒドロゲルをゲル化温度未満に冷却することによりゲル化される。
一部の実施形態では、単分散テンプレート粒子は、流体から取り出され、乾燥され、一定期間安定した形態で保管され得る。乾燥アプローチの例として、加熱、真空乾燥、凍結乾燥、および超臨界乾燥が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、乾燥された単分散テンプレート粒子は、流体と組み合わせることができるが、独立した、しばしば球状のゲル粒子として形状および構造を保持し続ける。一部の実施形態では、乾燥された単分散テンプレート粒子は、適切な流体と組み合わされることで、流体の一部が単分散テンプレート粒子により吸収される。一部の実施形態では、単分散テンプレート粒子の多孔度は、複数の標的粒子の少なくとも１つが適切な流体と組み合わされたときに単分散テンプレート粒子に吸収可能となるために変化してよい。単分散テンプレート粒子において所望の吸収が行われることを可能にする任意の好都合な流体が用いられ得る。
本明細書で用いられる場合、単分散テンプレート粒子に適用される「吸収」、「膨潤」、および「拡張」という用語は、流体が物質に浸透するか、または物質が流体を組み込むプロセスを指すために互換的に用いられ得る。一部の実施形態では、吸収される物質は、その形状および構造の少なくとも一部を保持し得る。一部の実施形態では、吸収される物質は、溶液を形成するように流体に組み込まれることになり得る。
ある態様では、界面活性剤を用いて、単分散テンプレート粒子を安定化できる。したがって、単分散テンプレート粒子は、界面活性剤で安定化されたエマルション、たとえば、界面活性剤で安定化された単相エマルション、または界面活性剤で安定化された二相エマルションを含み得る。単分散テンプレート粒子中で所望の反応を行うことを可能にする任意の好都合な界面活性剤を使用できる。他の態様では、単分散テンプレート粒子は、界面活性剤または粒子で安定化されない。
単相エマルションドロップレットおよび多相エマルションドロップレットを含む単分散ドロップレットおよびその生成
本明細書で用いられる場合、ドロップレット、たとえば単分散の単相エマルションドロップレットに適用される「単分散」という用語は、単分散テンプレート粒子の存在下で剪断することにより生成されるドロップレットの直径または最大寸法の変動を指し、これは、単分散テンプレート粒子が無い場合に同じ条件下で剪断によりドロップレットが生成されるときに生ずるものよりも少ない。一般に、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットは、それらを生成するもとになる単分散テンプレート粒子と比較して、本明細書に記載されるさまざまな方法で機能しながら、直径または最大寸法の変動が大きくなり得る。単分散ドロップレットは、一般に、直径または最大寸法が約０．１から約１０００μｍにまで及び、かつ直径または最大寸法の変動が、１０倍未満、たとえば５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、１．４倍未満、１．３倍未満、１．２倍未満、１．１倍未満、１．０５倍未満、または１．０１倍未満であり得る。一部の実施形態では、単分散ドロップレットは、単分散ドロップレットの少なくとも５０％以上、たとえば、６０％以上、または７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の直径または最大寸法が、１０倍未満、たとえば、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、１．４倍未満、１．３倍未満、１．２倍未満、１．１倍未満、１．０５倍未満、または１．０１倍未満で変動するような、直径または最大寸法の変動を有する。一部の実施形態では、単分散ドロップレットは、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜約７５０μｍ、約１．０μｍ〜約５００μｍ、約１．０μｍ〜約２５０μｍ、約１．０μｍ〜約２００μｍ、約１．０μｍ〜約１５０μｍ、約１．０μｍ〜約１００μｍ、約１．０μｍ〜約１０μｍ、または約１．０μｍ〜約５μｍなど、始めと終わりを含む約１．０μｍ〜１０００μｍの直径を有する。一部の実施形態では、単分散ドロップレットの内部体積は、約０．０１ｐＬ以下、約０．１ｐＬ以下、１ｐＬ以下、約５ｐＬ以下、１０ｐＬ以下、１００ｐＬ以下、または１０００ｐＬ以下であり得る。一部の実施形態では、単分散ドロップレットの内部体積は、約１ｆＬ以下、約１０ｆＬ以下、または１００ｆＬ以下であり得る。一部の実施形態では、単分散ドロップレットの内部体積は、ピコリットルからフェモリットルまでの間の範囲の液体体積（たとえば、約０．００１ｐＬ〜約１０００ｐＬ）を包含し得る。一部の実施形態では、単分散ドロップレットの内部体積は、厳密にはナノリットルレベルよりも下（たとえば、厳密にはピコリットル、厳密にはフェムトリットル、またはそれらの組合せ）に達する。
本明細書に記載される方法を実行する際に、単分散ドロップレット、たとえば、単相エマルションドロップレットおよび多相エマルションドロップレットの組成と性質は変化してよい。例として、ある態様では、界面活性剤を用いて、ドロップレットを安定化できる。したがって、ドロップレットは、界面活性剤で安定化されたエマルション、たとえば、界面活性剤で安定化された単相エマルション、または界面活性剤で安定化された二相エマルションを含み得る。ドロップレット中で所望の反応を行うことを可能にする任意の好都合な界面活性剤を用いてよい。他の態様では、単分散ドロップレットは界面活性剤で安定化されない。
本明細書に記載されるドロップレットは、エマルションとして、たとえば、非混和性相キャリア流体（たとえば、フルオロカーボン油またはハイドロカーボン油）に分散された水相流体として、またはその逆として調製されてよい。特に、本明細書に記載される多相エマルションドロップレットは、二相エマルションとして、たとえば、水相キャリア流体中に分散された非混和性相流体中の水相流体として；四相エマルション、たとえば、水相キャリア流体中に分散された非混和性相流体中、水相流体中、非混和相流体中の水相流体などとして提供され得る。本明細書に記載される単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットを生成することは、マイクロ流体制御なしで行われ得る。代替的な実施形態では、単分散の単相エマルションは、マイクロ流体デバイスを使用せずに調製され得るが、その場合は、マイクロ流体デバイスを用いて調整されて、多相エマルション、たとえば二相エマルションが提供される。
本明細書に記載される方法を用いて、マイクロ流体デバイスを使用せずに、単分散の単相エマルションを生成できる。単分散テンプレート粒子を用いて単分散エマルションを生成すると、サイズが非常に均一なドロップレットを含むエマルションを提供できる。ドロップレット生成プロセスは、複数の単分散テンプレート粒子を、複数の標的粒子を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップ；第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；および第２の混合物を剪断することで、複数の単分散テンプレート粒子を第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させ、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップにより達成され得る。ドロップレットサイズを変えるために、剪断速度および単分散テンプレート粒子サイズを変えてよい。アガロースゲルの場合、単分散テンプレート粒子は、外部刺激（たとえば熱）を用いて液化して、液体単分散エマルションを生成できる。
１つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む単分散ドロップレット、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットのパーセンテージは、約７０％以上；約７５％以上；約８０％以上；約８５％以上；約９０％以上；または約９５％以上であり得る。たとえば、１つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む単分散ドロップレットのパーセンテージは、約７０％〜約１００％、たとえば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、または約９５％〜約１００％であり得る。更なる例として、１つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む単分散ドロップレットのパーセンテージは、約７０％〜約９５％、たとえば、約７５％〜約９０％、または約８０％〜約８５％であり得る。第２の流体中の単分散ドロップレットに封入される単分散テンプレート粒子のパーセンテージは、約７０％以上；約７５％以上または；約８０％以上；約８５％以上；または約９０％以上であり得る。たとえば、第２の流体中の単分散ドロップレットに封入される単分散テンプレート粒子のパーセンテージは、約７０％〜約１００％、たとえば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、または約９５％〜約１００％であり得る。更なる例として、第２の流体中の単分散ドロップレットに封入される単分散テンプレート粒子のパーセンテージは、約７０％〜約９５％、たとえば、約７５％〜約９０％、または約８０％〜約８５％であり得る。
本明細書に記載される方法を用いて、マイクロ流体デバイスを使用せずに、二相エマルションを生成することもできる。二相エマルションとして、ドロップレット中に含まれるドロップレット、たとえば、水相キャリア流体中の非混和性相シェルで囲まれた水相流体（たとえば水中油中水）、または非混和性相キャリア流体中の水相シェルで囲まれた非混和相流体（たとえば油中水中油）が挙げられる。本明細書に記載される第２の混合物は、第２の流体中に単分散の単相エマルションドロップレットを含み、少なくとも第２の流体と混和しない第３の流体と組み合わされて第３の混合物を生成する。次いで、第３の混合物を剪断して、単分散テンプレート粒子を第３の流体中の二相エマルションドロップレットに封入する。第３の流体は、第１および第２の流体の双方と混和しないことがあり得る。特に有用な種類の二相エマルションは、わずかに大きい油滴に封入された水滴を含み、それ自体がキャリア水相に分散している。二相エマルションは価値がある。これは、構造の内部「コア」を、溶質または生体材料のような活性化合物を提供するために用いられ得、それらが周囲のオイルシェルにより外部環境から保護されるからである。単分散テンプレート粒子を用いて二相エマルションを生成することの利点は、二相エマルションの寸法（内側と外側のドロップレットサイズ）を広範囲に制御でき、ドロップレットを高度の均一性で形成できるという点で、単相エマルションの生成の場合と同じでる。本明細書で考察されるように、適切な実施形態では、単分散テンプレート粒子は、単分散ドロップレット内で溶解および／または溶融され得る。したがって、一部の実施形態では、多相エマルション、たとえば、二相エマルションは、無傷のテンプレート粒子をもはや含まないが、それらの元のサイズを保持する単分散ドロップレットから調製され得る。このようにして、そのような単分散ドロップレットは、多相エマルション、たとえば二相エマルションの調製のためのテンプレートとして役立ち得る。
サンプル材料および／または試薬、たとえば、核酸および／または核酸合成試薬（たとえば等温核酸増幅試薬および／または核酸増幅試薬）のドロップレットへの封入は、マイクロ流体法および非マイクロ流体法を含むいくつかの方法を介して達成され得る。マイクロ流体法においては、ガラスのマイクロキャピラリー二相乳化または濡れ性パターン化デバイスでの連続的なドロップレット生成を使用した二相乳化を含む、適用可能な技術がいくつかある。マイクロキャピラリー技術は、ノズルを通じて集束する同軸流を介してドロップレットに分解するように誘導される非混和性相の同軸ジェットを生成することによりドロップレットを形成する。しかしながら、このアプローチの潜在的な欠点は、デバイスが、一般に互いに整列して接着されたマイクロキャピラリーチューブから組み立てられていることである。ドロップ形成ノズルは数十ミクロンのスケールであるので、キャピラリーの配置にわずか誤差が生じただけでもデバイスの故障につながり得る。対照的に、空間的にパターン化されたドロップ生成ジャンクションにおける連続的なドロップレット形成は、リソグラフィーで組み立てられたデバイスで達成され得ることから、寸法全体の均一性を維持しながら、それらをより簡単に構成し、大量に作製できる。しかしながら、場合によっては、これらのデバイスの平面的な性質が二相エマルションの生成に理想的でないこともあり得る。これは、分離相がすべてチャネル壁と接触しながらデバイスに入るので、適切な場所で適切な相を取り込めるように、濡れ性を慎重にパターン化する必要があるからである。これは、デバイスの組立てをより困難なものとすることがあり得、場合によっては、濡れ特性がデバイスに対して最適化されていない液体の乳化を妨げる可能性がある。したがって、いくつかの態様では、本開示は、マイクロ流体デバイスを使用せずに、サンプル材料および／または試薬、たとえば、核酸および／または核酸合成試薬（たとえば等温核酸増幅試薬および／または核酸増幅試薬）を封入する単分散エマルションを生成する方法を提供する。
たとえば、本明細書に記載される方法は、複数の単分散テンプレート粒子を、複数の標的粒子、たとえば核酸などを含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップを含み得る。一部の実施形態では、複数の単分散テンプレート粒子を第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップは、第１の流体の一部、ならびにそこに含まれる標的粒子および／または試薬を単分散テンプレート粒子に吸収させるステップを含む。一部の実施形態では、複数の単分散テンプレート粒子を第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップは、第１の流体の一部を単分散テンプレート粒子に流入させるステップを含む。一部の実施形態では、複数の単分散テンプレート粒子を第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップは、第１の流体の一部を単分散テンプレート粒子に拡散させるステップを含む。一部の実施形態では、複数の単分散テンプレート粒子を第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップは、単分散テンプレート粒子を第１の流体の一部で膨潤させるステップを含む。
一部の実施形態では、過剰の第１の流体は、第１の流体の一部を単分散テンプレート粒子に吸収させた後、第１の混合物から除去される。除去される過剰な第１の流体の量は変化してよい。たとえば、過剰な流体の大部分を除去することにより、単分散テンプレート粒子に流入できない標的粒子を、標的粒子、たとえば細胞を、複数の単分散テンプレート粒子の少なくとも１つに物理的に近接させることにより、封入することができる。この混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせると、第２の混合物が提供される。この第２の混合物を剪断することにより、複数の単分散テンプレート粒子が第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させ、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および単分散テンプレート粒子に流入できない複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットが提供され得る。
一部の実施形態では、標的分子は細胞である。そのような実施形態では、単分散ドロップレットは、ドロップレットあたり１つまたは複数の細胞を含み得る。あるいは、単分散ドロップレットは、ドロップレットあたり１つより多くの細胞を含まない。一部の実施形態では、剪断後、エマルション中のいくつかのドロップレットは、複数の標的粒子のいずれも含まない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の単分散テンプレート粒子を含む第１の混合物および複数の標的粒子を含む第１の流体を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；ならびに第２の混合物を剪断することで、複数の単分散テンプレート粒子を第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させて、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップを含む。一部の実施形態では、剪断後、第２の流体は、単分散テンプレート粒子の１つを含まない複数のドロップレットを含む。単分散テンプレート粒子の１つを含まないドロップレットは、濾過または遠心分離などの適切な分離技術により単分散エマルションから除去され得る。単分散テンプレート粒子の１つを含まないそれらのドロップレットは、単分散テンプレート粒子の１つを含むそれらのドロップレットよりも直径が小さくあり得る。単分散テンプレート粒子を含む単分散ドロップレットはまた、単分散テンプレート粒子の１つを含まないドロップレットと比べて濃縮され得る。
本明細書で用いられる場合、「濃縮（豊富化）された」および「濃縮（豊富化）」という用語は、元の単分散エマルション中での比率と比較して、単分散エマルション中での非標的実体（たとえば、単分散テンプレート粒子を含まない単分散ドロップレット）に対する標的実体（たとえば、単分散テンプレート粒子を含む単分散ドロップレット）の比率を増加させるプロセスを指すために互換的に用いられ得る。本明細書に開示される方法を用いて、単分散テンプレート粒子を含む単分散ドロップレットは、単分散テンプレート粒子の１つを含まないドロップレットと比べて、たとえば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍以上濃縮され得る。
一部の実施形態では、過剰な第２の流体が、剪断後、複数の単分散ドロップレットに封入された複数の単分散テンプレート粒子を含む第２の混合物から除去される。過剰な第２の流体は、たとえば、遠心分離および上清の除去など、任意の適切な方法を用いて除去され得る。
本明細書に記載されるように生成された多相エマルション、たとえば二相エマルションにおいては、それらに追加の操作を行って、それらの特性を調整してよい。たとえば、多くの二相エマルション配合物では、二相エマルションのシェルは特定の分子に対して透過性であり、これらの分子を二相エマルションの内部または外部に受動的に拡散させる。これは、たとえば、二相エマルションの環境を調節するために用いられ得る。同様に、二相エマルションの内部ドロップレットは、たとえば、溶媒をそれらの内部または外部に拡散させることにより、収縮または成長させる。たとえば、高濃度の塩を含むバッファーに二相エマルションを分散させることにより、水相流体は、内部ドロップレットと外側キャリア相の浸透圧が一致し、その時点でドロップレットサイズが一定になり続けるまで、二相エマルションから拡散するように誘導され得る。これは、内部ドロップレットのサイズを変更するためか、あるいは、過剰な溶媒を追加または除去することにより、二相エマルション内に含まれる試薬を濃縮または希釈するために用いられ得る。
二相エマルションのシェルは、たとえば、水中油中水型二相エマルションの場合、シェルから過剰な疎水性相を除去するために、溶媒抽出などの技術を用いて調整することもできる。これは、たとえば、脱濡れまたは他の現象を介して、脂質小胞、ポリマーソーム、またはコロイドソームへのそれらの移行などの、二相エマルションの他の変化を誘発し得る。気泡が、たとえば、内部ドロップレット中または中間の封入相中の二相エマルションに導入されてもよい。空気を膨張および圧縮する能力は、必要に応じて、たとえば、一部の実施形態では、二相エマルションのサイズまたは二相エマルションシェルの厚さを増加または減少させるために利用することもできる。中間相の気泡は、たとえば、システムの圧力を低下させることにより膨張し、これは、たとえば、ポリマーソームまたは小胞などの別の構造への移行を誘発するために用いられ得る内部ドロップレットに力を及ぼすことになるであろう。ゲル化剤を加えて、ドロップレットの外層を固化することもできる。ゲル化剤の例として、ゼラチン、寒天、キサンタンガム、ジェランガム、カラギーナン、イサゴール、およびグアーガムが挙げられるが、これらに限定されない。
巨大単層小胞（ＧＵＶ）
二相エマルションは、一般に、エマルション内のエマルション、すなわち、第２の非混和性相の液滴中に含まれる液滴を指す。それらは界面活性剤で安定化され得るが、重要なことに、中間相「シェル」は、任意の界面活性剤に加えて液相を含む。シェルの体積が減少するにつれて、二相エマルションは小胞様の構造よりもドロップレット内ドロップレットに類似しなくなり、コア流体が界面活性剤分子の薄膜に封入される。二相エマルションを使用したそのような「小胞」の形成は、「小胞」を脱湿移行（中間液相流体がシェルから除去されるが、界面活性剤層が維持される）させ、水性コアとそれを取り囲む界面活性剤分子の薄い層と、もともとそれに付着していたシェルであった小さな油滴とを含む小胞を生成することにより行うことができる。そのような小胞は、本明細書ではリポソームとも呼ばれる。
二相エマルションが脱湿する傾向は、異なる溶液および界面活性剤の特性、特に、異なる相の相互の界面張力に依存する。フッ素化油、ＰＥＧ−Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）界面活性剤、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）（ポリエーテルアミン）−Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）界面活性剤、およびプルロニック（登録商標）を含む水性配合物は、キャリア相に加えられると、９５℃を超える温度で熱安定性である二相エマルションと小胞の双方を形成できる。Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）流体は、官能性末端基と組み合わされたヘキサフルオロプロピレンオキシドをベースにしたフッ素化合成油である。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０）およびＳｐａｎ（登録商標）８０（ソルビタンモノオレエート）などの他の界面活性剤を、ＰＥＧ、アルギン酸塩、グリセロールなどの増粘剤の有無にかかわらず、二相エマルションからＧＵＶ形成を誘導するために利用できる。
単分散エマルションの生成に関与する流体
本明細書で考察されるように、開示される方法は、一般に、複数の単分散テンプレート粒子を、複数の標的粒子を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップ；第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；および第２の混合物を剪断することで、複数の単分散テンプレート粒子を第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させ、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、第２の混合物の剪断に続いて、第２の流体と混和しない第３の流体を第２の混合物と組み合わせて第３の混合物を生成する更なるステップを含む。
第１の流体は、一般に、第２の流体と混和しないように選択され、単分散テンプレート粒子を構成する材料と共通の親水性／疎水性を共有する。第３の流体は、一般に、第２の流体と混和しないように選択され、第１の流体と混和してもしなくてもよい。したがって、一部の実施形態では、第１の流体は水相流体であり、第２の流体は、第１の流体と混和しない流体、たとえば、非水相、たとえばフルオロカーボン油、ハイドロカーボン油、またはそれらの組合せである。第３の流体は水相流体である。あるいは、一部の実施形態では、第１の流体は、非水相、たとえばフルオロカーボン油、ハイドロカーボン油、またはそれらの組合せであり、第２の流体は、第１の流体と混和しない流体、たとえば水相流体であり、かつ第３の流体は、フルオロカーボン油、ハイドロカーボン油、またはそれらの組合せである。
非水相は、水と混和しない連続相を形成するキャリア流体として役立ち得るか、または非水相は分散相であり得る。非水相は、少なくとも１つの油を含む油相と呼ばれ得るが、水と混和しない任意の液体（または液化可能な）化合物または液体化合物の混合物を含み得る。油は、合成または天然のものであってよい。油は、炭素および／またはケイ素を含んでも含まなくてもよく、かつ水素および／またはフッ素を含んでも含まなくてもよい。油は、親油性または疎油性であってよい。言い換えれば、油は、一般に有機溶媒と混和してもしなくてもよい。例示的な油として、とりわけ、少なくとも１つのシリコーン油、鉱油、フルオロカーボン油、植物油、またはそれらの組合せが挙げられ得る。
例示的な実施形態では、油は、過フッ素化有機溶媒であり得るフルオロカーボン油などのフッ素化油である。適切なフルオロカーボン油の例として、Ｃ９Ｈ５ＯＦ１５（ＨＦＥ−７５００）、Ｃ２１Ｆ４８Ｎ２（ＦＣ−４０）、およびパーフルオロメチルデカリン（ＰＦＭＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で考察されるように、一部の実施形態では、第１の流体は、複数の標的粒子（たとえば、ＤＮＡ分子、たとえばゲノムＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸増幅試薬、たとえばＰＣＲを含む核酸合成試薬および／または等温増幅試薬）を含む。
一部の実施形態では、ゲル化剤を加えて、ドロップレットの外層を固化することができる。
界面活性剤
ある態様では、界面活性剤が、第１の流体、第２の流体、および／または第３の流体に含まれ得る。したがって、ドロップレットは、界面活性剤が、第１の流体、第２の流体、および／または第３の流体に溶解する場合、界面活性剤で安定化されたエマルション、たとえば、界面活性剤で安定化された単相エマルション、または界面活性剤で安定化された二相エマルションを含み得る。ドロップレット中で行われる所望の反応を可能にする任意の好都合な界面活性剤を使用でき、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｃ２６Ｈ５０Ｏ１０（Ｔｗｅｅｎ ２０）および／またはオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様では、ドロップレットは界面活性剤で安定化されない。
用いられる界面活性剤は、エマルションに用いられる油相および水相（または他の適切な非混和性相、たとえば、任意の適切な疎水性相および親水性相）などのいくつかの要因に依存する。たとえば、フルオロカーボン油中で水滴を使用する場合、界面活性剤は、親水性ブロック（ＰＥＧ−ＰＰＯと疎水性フッ素化ブロック（Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）ＦＳＨ）を有し得る。しかしながら、たとえば、油がハイドロカーボン油に切り替えられた場合、界面活性剤は、代わりに、それが界面活性剤ＡＢＩＬ ＥＭ９０のような疎水性炭化水素ブロックを有するように選択されてよい。
イオン性界面活性剤を含む他の界面活性剤も想定され得る。ドロップレットを安定化させるために、３５℃を超える温度でのドロップレットの安定性を向上させるポリマーを含めた他の添加剤が油に含まれていてもよい。
何らかの特定の理論に縛られることを意図するものではないが、熱安定性エマルションの調製は、標準ＰＣＲ反応に関連するものなど、高温に耐え得る膜または二相エマルション界面を形成できる界面活性剤の使用に依存することが提案されている。これを達成する１つの方法は、比較的高分子量の界面活性剤を使用することであり得、ドロップレットの界面または膜構成で組み立てたときに、界面から界面活性剤を除去（または膜を破壊）するのに必要なエネルギーは、ｋＴで提供され得るエネルギーよりも高くなる。
熱安定性エマルションを提供するために利用され得る例示的な界面活性剤は、ＰＥＧ−ＰＦＰＥ（ポリエチレングリコール−パーフルオロポリエーテル）ブロックコポリマー、たとえばＰＥＧ−Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）（たとえばＨｏｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ｆｏｒ ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２００８，８，１６３２−１６３９（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照）、および油相中にイオン性Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）と水相中にＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）（ポリエーテルアミン）を含む界面活性剤（たとえば、ＤｅＪｏｕｒｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｏｉｌ−Ｗａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｄｉｒｅｃｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ」，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，８５（２１）：１０５５６−１０５６４（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照）を含む「生体適合性」界面活性剤である。追加および／または代替的な界面活性剤が、それらが安定した界面を形成するという条件で用いられてよい。したがって、多くの適切な界面活性剤は、高分子量を有する（ＰＥＧ−Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）のような）ブロックコポリマー界面活性剤であろう。これらの例として、フッ素化分子および溶媒が挙げられるが、非フッ素化分子も同様に利用できる可能性がある。
したがって、一部の実施形態では、本開示は熱安定性エマルションを提供する。これらのエマルションは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、タンパク質間相互作用研究などの生物学的反応を行うことに使用するのに適している。
エマルション、特に二相エマルションを形成する際の留意点は、二相エマルションを維持し、破裂したり合一したりしないように、それらを安定させることである。これは、界面活性剤などの安定剤を用いて達成されることが多い。しかしながら、場合によっては、非常に安定した二相エマルションを作製することが有利であり得る。本明細書に記載される方法では、これは、たとえば、ポリジメチルシロキサンのようなポリマーゲル相などの、架橋され得る中間相（エンベロープ相）を使用することで達成され得る。あるいは、界面活性剤自体を、たとえば、架橋基を作り出すことにより、互いに架橋させてよい。この基は、界面活性剤の疎水性の尾部、あるいは親水性の頭部に存在し得る。この基は、界面活性剤を互いに架橋してもよく、あるいは、架橋は、水相からの試薬、たとえば、重合、共有結合による架橋などを誘発する分子なの添加により誘発してよい。抗体またはビオチン−ストレプトアビジンのような生体分子も、界面活性剤と界面活性剤の架橋を生成するために用いられ得る。
界面を架橋することは、二相エマルションシェルを熱安定性にする別の方法である。たとえば、そのような架橋は、油相を架橋することによるか、または膜小胞を架橋することより達成され得る。上記で考察されるように、界面を架橋するための１つの方法には、ストレプトアビジンなどの生体分子が用いられる。たとえば、Ｋｒｙｔｏｘ（登録商標）ポリマーの頭部基を、複数のビオチンでビオチン化してよい。次いで、ストレプトアビジンを水相に加え、それにより異なるＫｒｙｔｏｘ（登録商標）ポリマーが一緒に架橋され、水／油の界面で架橋シェルが生成される。次いで、これらのシェルを直接水に分散させるか、または、必要に応じて、二相エマルションとして封入してよい。
剪断
単分散エマルションを生成するために、開示される方法には、第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせることにより提供される第２の混合物を剪断するステップが含まれる。任意の適切な方法または技術を利用して、第２の混合物に十分な剪断力を適用することができる。たとえば、第２の混合物は、ピペットチップに第２の混合物を流すことにより剪断され得る。他の方法として、ホモジナイザー（たとえば、ボルテクサー）で第２の混合物を振とうすること、またはビードビーターで第２の混合物を振とうすることが挙げられるが、これらに限定されない。十分な剪断力を適用すると、第２の混合物は、複数の単分散テンプレート粒子の１つを封入する単分散ドロップレットに破壊される。複数の単分散テンプレート粒子の１つを含まないいくつかのドロップレットも存在し得る。
一般に、剪断が増加するならば、生成される平均ドロップレットサイズは、単分散テンプレート粒子のサイズよりも小さくなるであろう。しかしながら、単分散テンプレート粒子は固体形状であるため、それらを含むドロップレットのサイズはさらに小さくならず、それにより単分散エマルションが生成されるであろう。剪断速度が単分散テンプレート粒子の弾性率よりも実質的に高い場合、剪断により単分散テンプレート粒子から液体を絞り出すことができる。何らかの特定の理論に縛られることを意図するものではないが、適切な剪断速度が、単分散テンプレート粒子の弾性率に適切に一致するものであることが提案される。たとえば、所望のサイズのドロップレットのラプラス圧力よりも高いが、テンプレート粒子の弾性率よりは小さな剪断速度／力を選択することが望ましい場合がある。
限定するものではなく、例として、単分散ＰＡＡ、ＰＥＧまたはアガローステンプレート粒子が水相でＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬと共に使用され、非水相としてＨＦＥ−７５００フッ素化油が用いられる場合、３０秒間ボルテックスすると、単分散ドロップレットを生成するための十分な剪断力が生じる。
単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶへの試薬の添加
主題の方法を実行する際に、いくつかの試薬を１つまたは複数のステップ（たとえば、約２、約３、約４、または約５またはそれ以上のステップ）でドロップレットに加える必要があり得る。ドロップレットに試薬を加える手段は、たとえば、ドロップレットの乳化段階に応じて、いくつかの手法では変化してよく、たとえば、異なるアプローチを、二相エマルションドロップレットなどの多相エマルションドロップレットに対して単分散の単相エマルションドロップレットへの試薬の添加に適用可能であり得る。目的のアプローチとして、以下のものに限定されないが、Ａｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８８，２６４１０５（２００６）；Ｐｒｉｅｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８９，１３４１０１（２００６）；Ａｂａｔｅ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ９，２０１０ ｖｏｌ．１０７ ｎｏ．４５ １９１６３−１９１６６；およびＳｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７８（１４），ｐｐ．４８３９−４８４９が挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、試薬が、たとえば、マイクロ流体デバイスまたはシステムを使用せずに、たとえば、第１の流体の成分として、本明細書に記載される乳化プロセス中にドロップレットに加えられてよい。他の実施形態では、マイクロ流体技術、デバイス、および／またはシステムを利用して、試薬を加え、かつ／または本明細書に別途記載されるように調製されたら単分散ドロップレットを調整してよい。
例として、試薬を含む第２のドロップレットとドロップレットを併合することを含む方法により、試薬が、本明細書に記載される単分散の単相エマルションドロップレットに加えられてよい。第２のドロップレットに含まれる試薬は、特に本明細書に記載されるものを含む、任意の好都合な手段により加えられてよい。このドロップレットを第１のドロップレットと併合して、第１のドロップレットと第２のドロップレットの双方の内容物を含むドロップレットを作製してよい。一部の実施形態では、第１のドロップレットは第２のドロップレットより実質的に大きく、第２のドロップレットよりも数が多い。
１つまたは複数の試薬がまた、またはその代わりに、ドロップレット合一、および／またはピコインジェクションなどの技術を用いて、本明細書に記載される単分散の単相エマルションドロップレットに加えられてもよい。ドロップレット合一では、標的ドロップレットを、標的ドロップレットに加えられる試薬を含むドロップレットと一緒に流れてよい。２つのドロップレットは、それらが互いに接触するが、他のドロップレットには接触しないように流れてよい。次いで、これらのドロップレットは、電極または電界を印加する他の手段に通過させてよく、ここで、電界は、ドロップレットが互いに併合するように、それらを不安定にし得る。
ピコインジェクションでは、標的ドロップレットは、加えられる試薬を含むチャネルを通過して流れてもよく、試薬は高圧下にある。しかしながら、界面活性剤が存在することにより、電界が無い場合、ドロップレットをコーティングする界面活性剤が流体の進入を妨げる可能性があるので、ドロップレットは注入されずに通過して流れるであろう。ただし、ドロップレットがインジェクターを通過するときに電界がドロップレットに印可されるならば、試薬を含む流体がドロップレットに注入されるであろう。ドロップレットに加えられる試薬の量は、いくつかの異なるパラメーター、たとえば、注入圧力と、流れるドロップの速度とを調節することや、電界をオン・オフに切り替えることなどにより制御され得る。
他の態様では、１つまたは複数の試薬がまた、またはその代わりに、２つのドロップレットを一緒に併合するか、または液体をドロップレット内に注入することに依拠しない方法により、本明細書に記載される単分散の単相エマルションドロップレットに加えられてよい。むしろ、１つまたは複数の試薬は、試薬を非常に小さなドロップの流れに乳化し、これらの小さなドロップを標的ドロップレットと併合するステップを含む方法によりドロップレットに加えられてよい。そのような方法は、本明細書では「複数ドロップ合一による試薬添加」と呼ばれる。これらの方法は、標的ドロップレットのサイズと比較して追加されるドロップのサイズが小さいことにより、小さなドロップは標的ドロップレットよりも速く流れ、それらの後方に集積する点をうまく利用している。次いで、たとえば、電界を印加することにより、集積体を併合してよい。このアプローチはまた、またはその代わりに、異なる流体の小さなドロップのいくつかの並行流を使用することにより、ドロップレットに複数の試薬を加えるために用いられ得る。極めて小さなドロップと標的ドロップレットを効果的に併合するために、極めて小さなドロップレットを、標的ドロップレットを含むチャネルよりも小さくし、電界を印加する電極から標的ドロップレットを注入するチャネル間の距離を十分に長くすることで、極めて小さなドロップが標的ドロップレットに「追いつく」時間を与えることが重要である。このチャネルが短すぎる場合、極めて小さなすべてのドロップが標的ドロップレットと併合することにはならず、所望の量よりも少ない試薬が加えられることになり得る。これはある程度、電界の大きさを増加させることにより補償でき、これにより、さらに遠く離れてドロップを併合し易くなる。同じマイクロ流体デバイスで極めて小さなドロップを作製することに加えて、それらはまた、またはその代わりに、別のマイクロ流体ドロップ生成器を用いて、または均質化によりオフラインにしてから、標的ドロップレットを含むデバイスに注入してもよい。
したがって、ある態様では、試薬が、本明細書に記載されるように調製されたドロップレットに加えられるが、これは、試薬をドロップレットの流れに乳化するステップであって、ここで、ドロップレットは、標的ドロップレット（たとえば、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットもしくはＧＵＶ）のサイズよりも小さいステップ；ドロップレットを標的ドロップレットと一緒に流すステップ；およびドロップレットを標的ドロップレットと併合するステップを含む方法により行われる。ドロップレットの流れに含まれるドロップレットの直径は、標的ドロップレットの直径の約７５％以下の範囲で変化してよく、たとえば、流れるドロップレットの直径は、標的ドロップレットの直径の約７５％以下、標的ドロップレットの直径の約５０％以下、標的ドロップレットの直径の約２５％以下、標的ドロップレットの直径の約１５％以下、標的ドロップレットの直径の約１０％以下、標的ドロップレットの直径の約５％以下、または標的ドロップレットの直径の約２％以下である。ある態様では、複数の流れるドロップレット、たとえば２つ以上のドロップレット、３つ以上、４つ以上、または５つ以上を標的ドロップレットと併合してよい。そのような併合は、電界を印加することを含むがこれに限定されない任意の好都合な手段により達成され得、ここで、電界は、流れるドロップレットを標的ドロップレットと併合するのに有効である。
上記の方法の変形例として、流体を噴射してよい。すなわち、流れるドロップレットに加えられる流体を乳化するのではなく、この流体の長い噴流を形成して、標的ドロップレットと一緒に流してよい。次いで、たとえば、電界を印加することにより、２つの流体を併合してよい。その結果、ドロップレットがある場所に膨らみのある噴流が生じ、これは、Ｒａｙｌｅｉｇｈ ｐｌａｔｅａｕ不安定性により、併合前に標的ドロップレットとほぼ同じサイズのドロップレットに自然に分解し得る。いくつかの変形例が考えられる。例として、ゲル化剤および／または界面活性剤などの１つまたは複数の薬剤を、噴射をより容易にするために噴射流体に加えてよい。さらに、連続流体の粘度は、噴射、たとえば、Ｕｔａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．９９，０９４５０２（２００７）に記載されるものを可能にするように調節でき、この開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
他の態様では、溶液中に溶解した電解質を利用することにより、注入流体自体を電極として使用する方法を用いて、１つまたは複数の試薬を加えてよい。
別の態様では、試薬が、より早い時間で形成されたドロップレットに加えられるが、これは、試薬が加えられる相手であるドロップレット（すなわち「標的」ドロップレット）を、加えられる試薬（「標的」試薬）を含むドロップ内に包むことにより行われる。ある実施形態では、そのような方法は、最初に標的ドロップレットを、適切な疎水性相、たとえば油のシェルに封入して、二相エマルションを形成することにより行われる。次いで、二相エマルションは、標的試薬を含むドロップレットにより封入されて、三相エマルションを形成する。次いで、標的ドロップを、標的試薬を含むドロップと組み合わせるために、二相エマルションは、電界の印加、ドロップレット界面を不安定にする化学物質の添加、狭窄部および他のマイクロ流体形状部への三相エマルションの流通、剪断もしくは超音波の適用、温度の上昇もしくは低下を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて開裂されるか、または磁界で引っ張られたときに二相エマルション界面を破裂させ得る磁性粒子をドロップレットに封入することにより行われる。
ドロップレットに試薬を加える上記の方法の態様は、米国特許出願公開第２０１５／０２３２９４２号明細書により詳細に記載されており、この開示は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
ドロップレットに試薬を加える上記の方法は、単分散の単相エマルションドロップレットへの試薬の添加に適し得ると言えるが、上記の方法の１つまたは複数は、多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションドロップレット、および／またはＧＵＶに試薬を直接加えるのには適していない可能性がある。これは、たとえば、そのような方法が、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの構造を破壊する場合に当てはまり得る。しかしながら、上記の方法は、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを形成するように後で封入される単分散の単相エマルションドロップレットに試薬を加えることに用いられ得る。したがって、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに試薬を加える更なる方法を以下に説明する。たとえば、一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出可能に標識するように設計された検出可能な標識および／または核酸合成産物を生成するように設計された核酸合成試薬などの試薬が、この試薬を混和性相キャリア流体に加えることにより多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加えられ得、ここで、試薬は、混和性相キャリア流体から、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの非混和性シェルを通って、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの第１の混和性相流体中に拡散する。
一部の実施形態では、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶであり、核酸合成試薬を第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加える方法は、核酸、たとえば標的核酸を、第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入するステップ、合成試薬および第１の多相エマルションドロップレットを、第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入するステップ、ならびに第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを破裂させ、それにより核酸を合成試薬と接触させるステップを含む。
一部の実施形態では、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶであり、核酸合成試薬を第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加える方法は、核酸合成試薬を第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入するステップ、核酸、たとえば標的核酸、および第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入するステップ、ならびに第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを破裂させ、それにより核酸を合成試薬と接触させるステップを含む。
一部の実施形態では、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶであり、適切な方法は、第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、試薬を含む第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入することにより、試薬を第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加えるステップ、ならびに第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内の第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを破裂させて、試薬を第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの内容物と接触させるステップを含む。
一部の実施形態では、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶであり、適切な方法は、試薬を含む第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入することにより、試薬を第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加えるステップ、ならびに第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内の第１の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを破裂させて、試薬を第２の多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの内容物と接触させるステップを含む。
係留部分
一部の実施形態では、標的粒子、たとえば核酸標的分子；核酸合成試薬；および／または核酸検出試薬は、単分散テンプレート粒子上または単分散テンプレート粒子中に配置された１つまたは複数の係留部分を介して単分散テンプレート粒子に付着される。係留部分は、係留される標的粒子と相互作用し得る。たとえば、係留部分は、単分散テンプレート粒子上または単分散テンプレート粒子中に結合された特定の配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。特定のオリゴヌクレオチドは、たとえば、塩基対形成および架橋を通じて、流体中の標的粒子にハイブリダイズできる。
一部の実施形態では、ある標的粒子は、標的粒子を捕捉するための官能基を含む単分散テンプレート粒子を通って移動するにはサイズが大きすぎる場合がある。そのような場合、係留部分は、単分散テンプレート粒子に封入された官能性ビーズであり得る。たとえば、標的粒子が単分散テンプレート粒子を通って拡散すると、それらは官能性ビーズと接触し、捕捉される機会を提供するであろう。単分散テンプレート粒子が混和性キャリア流体に吸収されたとしても、標的粒子は、単分散テンプレート粒子中または単分散テンプレート粒子上に捕捉されたビーズに係留されるので、係留されたままとなる。
単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中での反応
本明細書に開示される方法は、一般に、分光法、化学技術、生物学的技術、シーケンシングなどの種々の検出方法を用いて、多数の区画化された反応の実施およびその後のそれらの反応の読み取りおよびソーティングを容易にする。反応として、生体分子なしで行われる有機反応もしくは無機反応、または酵素反応、たとえばＰＣＲなどの生体分子および／または細胞が関与する反応が挙げられる。反応はまた、生細胞を使用せずにＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を発現できる転写抽出物および翻訳抽出物を含む、細胞物質または細胞ベースの抽出物を含み得る。これは、たとえば、活性用経路をスクリーニングすることを含む、合成生物学的用途に使用できる。
たとえば、１つまたは複数のタンパク質が実装された経路が、１つまたは複数の経路タンパク質を発現できる無細胞抽出物を用いて、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／もしくはＧＵＶに封入された核酸でコードされ得る。経路の試験を可能にするアッセイコンポーネントも含められ得る。経路の活性とアッセイの測定に基づいて、リアクターをソートして、特に望ましい経路を偶然封入した単分散の単相エマルションのドロップレット、多相エマルションのドロップレット、および／またはＧＵＶを回収できる。ソーティング後、それらを分析、増幅などして、プロセスを続行し、スクリーニングを行うか、あるいは、指向性進化法を行って、強化された経路配列を生成することができる。
単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中での反応はまた、バイアスの少ないシーケンシングライブラリーの生成または特定の機能を持つ分子を組み合わせることを含む、核酸操作などの用途にも使用できる。たとえば、特定の遺伝子配列または核酸合成および／または増幅産物を発現する細胞を、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入してから、本明細書に記載される方法に供して、配列を単離、増幅および連結することで、更なる用途で分析または用いられ得る単一の分子が生成する。たとえば、細胞にヒト抗体生成細胞が含まれるならば、細胞の重鎖と軽鎖に対応する遺伝子を一緒に連結して、分析して重鎖と軽鎖のペアを検出したり、またはｓｃＦｖもしくはＦａｂなどの分子のような抗体を生成したりするために分析され得る単一の分子を作製できる。
ＰＣＲ産物の検出
主題の方法を実行する際に、核酸合成および／または増幅産物、たとえば等温核酸増幅産物またはＰＣＲ産物を検出できる方法は変化してよい。たとえば、集団に存在する特定の細胞タイプ、たとえば腫瘍細胞を計数することが目的であるならば、これは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、または他の任意の色素および／またはインターカレート色素が、各単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加えられる単純なバイナリアッセイを用いて達成され得ることから、特徴を明らかにする遺伝子、たとえばオンコジーンが存在し、かつＰＣＲ産物が生成される場合、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、蛍光性になるであろう。蛍光の変化は、蛍光偏光に起因し得る。検出成分として、インターカレート色素（たとえば、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）の使用が挙げられ得る。
種々の異なる検出成分が、主題の方法を実行する際に用いられ得、当該技術分野において知られている蛍光色素を使用することを含む。蛍光色素は典型的には、フルオレセインとその誘導体；ローダミンとその誘導体；シアニンとその誘導体；クマリンとその誘導体；カスケードブルーとその誘導体；ルシファーイエローとその誘導体；ＢＯＤＩＰＹとその誘導体などの系統に区分され得る。例示的なフルオロフォアとして、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ−３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎなどが挙げられる。フルオロフォアとその使用の記載は、特に、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，９ｔｈ ｅｄ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．；Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００３），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３／２００４ Ｃａｔａｌｏｇ，Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．；Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；およびＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００２ Ｃａｔａｌｏｇ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡに見出すことができる。
他の態様では、特に、存在する核酸、たとえばオンコジーンをさらに特徴付けることが目的であるならば、更なる試験が必要とされ得る。例として、多重化アッセイの場合、これは、光出力を単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶにおいて増幅される遺伝子のどれかと関連させることにより達成され得る。代わりのアプローチは、たとえばインターカレートされた色素によるバイナリ出力を用いて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶのどれかが何らかのオンコジーンを有するかを判定することになる。次いで、これらがソートされて、これらのドロップレットおよび／またはＧＵＶが回収され得るので、これらをより詳細に分析して、どのオンコジーンを含有するのかを判定できる。そのようなドロップレットおよび／またはＧＵＶに存在するオンコジーンを判定するために、マイクロ流体技術または非マイクロ流体技術を使用できる。非マイクロ流体技術を用いて、オンコジーンを含有すると同定されたドロップレットおよび／またはＧＵＶが、ウェルプレート上のウェルに入れてよく、そこでより大容量に希釈されて、多重化ＰＣＲ反応中に生じたＰＣＲ産物のすべてが放出される。次いで、このウェルのサンプルを、他のウェルに移してよく、各ウェルの中に、１つのオンコジーン用のプライマーが加えられる。次いで、これらのウェルは、温度サイクルを受けてＰＣＲが開始されることになり、その位置で、インターカレート色素が加えられて、マッチするオンコジーンおよびプライマーを有するウェルが明るくなる。
したがって、主題の方法を実行する際に、たとえば、蛍光の変化に基づいて成分が検出され得る。ある態様では、蛍光の変化は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に起因する。このアプローチでは、５’プライマーがクエンチャー色素を有し、３’プライマーが蛍光色素を有する、特別なプライマーセットが用いられ得る。これらの色素は、プライマー上の末端でも中間でも、どこに配置されていてもよい。プライマーは相補的であるので、それらは溶液中で二本鎖として存在し、そのため、互いに近接することから、蛍光色素の放射は、クエンチャー色素によりクエンチされ、溶液は暗く見えることになるであろう。ＰＣＲ後、これらのプライマーは、長いＰＣＲ産物に組み込まれることになるため、互いに遠く離れることになるであろう。これにより、蛍光色素が発光し、溶液は蛍光性になるであろう。したがって、特定のオンコジーンが存在するかを検出するために、蛍光色素の波長にてドロップレットおよび／またはＧＵＶの強度を測定することができる。異なるオンコジーンが存在するかを検出するために、これは、異なるプライマーについて異なって着色された色素で行われる。これにより、ドロップレットおよび／またはＧＵＶは、細胞に存在するオンコジーンのプライマーに対応するすべての波長にて蛍光性になる。
単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中の細胞（たとえば腫瘍細胞）の検出
主題の方法の態様は、生体サンプル内の１つまたは複数の細胞または細胞サブセット（たとえば腫瘍細胞）の存在を検出することを含む。そのような方法は、たとえば、細胞を、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入するステップ；単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中の細胞の溶解をもたらすのに十分な条件に供するステップ；単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、核酸増幅に阻害効果を及ぼす１つまたは複数の物質を不活化または除去するのに十分な条件に供するステップ；核酸合成試薬、たとえば核酸増幅試薬を、単分散の単相エマルションドロップレット、複数エマルションドロップレット、および／またはＧＵＶに導入するステップ；存在する場合、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、合成、たとえば標的核酸の増幅をもたらすのに十分な核酸合成条件、たとえば核酸増幅条件に供するステップ；存在する場合、標的核酸の合成、たとえば増幅から生じる増幅産物または合成産物を検出するステップを含み得る。
生体サンプル（たとえば全血）は、任意の好都合な手段を用いて、対象から回収され得る。生体サンプルは、たとえば、遠心分離、濾過などの処理ステップを用いて、細胞以外の成分を除去するように処理されてよい。所望される場合、細胞は、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入される前に、１つまたは複数の抗体および／またはプローブで染色されてよい。
１つまたは複数の溶解剤がまた、細胞の破裂を引き起こし得る条件下で、細胞を含有する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加えられ、それにより細胞のゲノムが放出され得る。溶解剤は、細胞が単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入された後に加えられてよい。任意の適切な溶解剤、たとえば、任意の適切なプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ（たとえば、広範な基質特異性を有するプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ、たとえば、非特異的セリンプロテアーゼ、たとえば、プロテイナーゼＫ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼ（たとえば、ＣＡＳ番号９０１４−０１−１））、ＯＢプロテアーゼ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｔｅｋから入手可能）、または細胞毒素が用いられ得る。特定の実施形態では、細胞は、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに、トリトンＸ−１００および／またはプロテイナーゼＫなどの界面活性剤を含有する溶解バッファーと共封入され得る。細胞の破裂を引き起こし得る特定の条件は、用いられる特定の溶解剤に応じて変化することになるであろう。たとえば、プロテイナーゼＫが溶解剤として組み込まれるならば、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、約３７〜６０℃に約１５〜２０分間加熱されて、細胞が溶解し得、プロテイナーゼＫは細胞タンパク質を消化することができるようになり、次いで、それらは約９５℃に約５〜１０分間加熱されて、プロテイナーゼＫを不活化することができる。
ある態様では、溶解剤は、本明細書に記載される単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶへの細胞の封入前または封入と同時に細胞に加えられてよい。任意の好都合な溶解剤、たとえば、任意の適切なプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ（たとえば、広範な基質特異性を有するプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ、たとえば、非特異的セリンプロテアーゼ、たとえば、プロテイナーゼＫ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼ（たとえば、ＣＡＳ番号９０１４−０１−１））、ＯＢプロテアーゼ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｔｅｋから入手可能）、または細胞毒素が用いられ得る。一部の実施形態では、界面活性剤は、封入前に早期の細胞溶解をもたらす可能性があるため、特に利用されない。そのような実施形態では、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ、たとえば、プロテイナーゼＫは、たとえば、界面活性剤の非存在下で、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに細胞が封入される前または封入されると同時に、細胞に加えられてよい。プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ、たとえばプロテイナーゼＫは、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼが細胞の封入前または封入中に活性化状態にないことを保証するのに十分な低い温度、たとえば、約１℃〜約５℃、約１℃〜約１０℃、約１℃〜約１５℃、約１℃〜約２０℃を含む、約０℃〜約２５℃の温度で加えられてよい。一部の実施形態では、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼは、約４℃で加えられてよい。続いて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの温度は、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼの活性化を保証するのに十分な温度、たとえば、３７〜８０℃、たとえば３０〜５０℃、３７〜５５、４０〜６０℃、５０〜６０℃、６０〜７０℃または７０〜８０℃の温度に増加されて、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ活性化と溶解細胞を促進できる。プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼのインキュベーションは、細胞溶解をもたらすのに十分な時間、たとえば１５〜６０分（または必要に応じてそれ以上）、たとえば１５〜２０分であってよい。次いで、エマルションを破壊し、必要に応じてプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼを洗い流してよい。そのような方法は、たとえば、本明細書に記載される単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）方法において用いられる。
特定の態様では、細胞溶解はまた、またはその代わりに、溶解剤の添加を含まない技術に依拠し得る。たとえば、溶解は、細胞の穿孔、剪断、研磨などを行うためにさまざまな幾何学的特徴を用い得る機械的技術により達成され得る。音響技術などの他のタイプの機械的破壊も用いられ得る。さらに、熱エネルギーを用いて細胞を溶解することもできる。本明細書に記載される方法では、細胞溶解を行う任意の好都合な手段が用いられ得る。
プライマーが、検出されるべき各遺伝子および／または遺伝子マーカー、たとえばオンコジーン用に、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに導入され得る。したがって、ある態様では、種々の遺伝子および／または遺伝子マーカー、たとえばすべてのオンコジーン用のプライマーが、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに同時に存在し、それにより多重化アッセイを実現ができる。ドロップレットおよび／またはＧＵＶは、標的細胞、たとえば癌細胞を含有するドロップレットおよび／またはＧＵＶがＰＣＲを受けるように温度サイクルを受けてよい。あるいは、またはさらに、ＭＤＡまたは他の等温核酸増幅法、たとえば、ループ媒介等温核酸増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、およびニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）が利用され得る。ゲノムに存在するオンコジーンおよび／または遺伝子マーカーに対応するプライマーのみが増幅を誘導し、ドロップレットおよび／またはＧＵＶ中のこれらのオンコジーンおよび／または遺伝子マーカーの多くのコピーを作製することになるであろう。これらの増幅産物の存在の検出は、ＦＲＥＴ、インターカレート色素による染色、またはビーズへの付着などの種々の方法で達成され得る。ドロップレットおよび／またはＧＵＶは、増幅産物を検出するために光学的にプロービングされ得る。一部の実施形態では、ドロップレットおよび／またはＧＵＶを光学的にプロービングすることには、初期の集団に存在する腫瘍細胞を計数すること、および／または各腫瘍細胞に存在するオンコジーンの同定を可能にすることを含み得る。
主題の方法は、生体サンプルが、目的の特定の細胞、たとえば腫瘍細胞を含むか否かを判定するために用いられ得る。ある態様では、主題の方法は、生体サンプルに存在する目的の細胞、たとえば腫瘍細胞の数を定量化することを含み得る。生体サンプルに存在する目的の細胞、たとえば腫瘍細胞の数の定量化は、増幅産物が検出されたドロップレットおよび／またはＧＵＶの数に少なくとも部分的に基づき得る。たとえば、ドロップレットおよび／またはＧＵＶは、ドロップレットの大部分が０または１つの細胞を含有すると予想される条件下で生成され得る。本明細書でより完全に説明される技術を用いて、細胞を一切含まないドロップレットおよび／またはＧＵＶが除去され得る。上記で概説されるＰＣＲステップを行った後、増幅産物を含有すると検出されたドロップレットおよび／またはＧＵＶの総数が計数されることで、生体サンプル内の目的の細胞、たとえば腫瘍細胞の数を定量化され得る。ある態様では、方法はまた、目的の細胞、たとえば腫瘍細胞である生体サンプル由来の細胞の割合またはパーセンテージを判定するために、ドロップレットおよび／またはＧＵＶの総数をカウントすることを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される単分散ドロップレットから調製された多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶへの合成試薬の導入は、第３の流体中に合成試薬を導入することを含み、ここで、合成試薬は、第３の流体から、非混和性シェルを通って、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの第１の流体中に拡散する。
目的の細胞および／または細胞物質は、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶをソートし、ドロップレットの破裂を介して、たとえば、本明細書により詳細に説明される化学的手段、電気的手段または機械的手段により内容物を回収することによって、回収され得る。種々の適切なソーティング技術および関連デバイスを利用して、本明細書に記載されるものを含む増幅および／または合成産物を含有する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶがソートおよび分離され得る。
単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中の核酸検出
本明細書で考察されるように、開示される方法は、さまざまな生体サンプルから関心のある核酸、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出に用途を見出す。そのような方法は、たとえば、核酸および合成試薬を、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入するステップ；単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、核酸の増幅をもたらすのに十分な増幅条件に供するステップ；ならびに核酸の増幅から生じる増幅産物を検出するステップを含み得る。増幅条件は、ＭＤＡ条件および／またはＰＣＲ条件、たとえばＲＴ−ＰＣＲ条件、および／または追加の等温核酸増幅条件、たとえばループ媒介等温核酸増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）およびニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）であり得る。
目的の核酸は、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶをソートし、ドロップレットの破裂を介して、たとえば、本明細書により詳細に説明される化学的手段、電気的手段または機械的手段により内容物を回収することにより、回収され得る。種々の適切なソーティング技術および関連デバイスを利用して、本明細書に記載されるものを含む増幅産物を含有する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶがソートおよび分離され得る。一態様では、標的核酸配列を濃縮する方法が提供され、ここで、この方法は、核酸を含むサンプルを、複数の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入するステップ；ＭＤＡ試薬およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬および複数の適切なプライマーを、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに導入するステップ；ＭＤＡ増幅に十分な条件とＰＣＲ増幅に十分な条件下で単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶをインキュベートして、ＭＤＡ増幅産物およびＰＣＲ増幅産物のそれぞれを生成するステップ（ここで、適切なＰＣＲプライマーは、標的核酸配列を組み込む１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにそれぞれハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含んでもよく、かつＰＣＲ増幅産物は、完全な標的核酸配列を含まない）；インキュベーションの前または後のいずれかに、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに検出成分を導入するステップ；検出成分の検出によりＰＣＲ増幅産物の存在または非存在を検出するステップ（ここで、検出成分の検出は、ＰＣＲ増幅産物および標的核酸配列の存在を示す）；ならびに検出成分の検出に基づいて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶをソートするステップ（ここで、ソーティングは、ＰＣＲ増幅産物および標的核酸配列を含む単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、存在する場合、ＰＣＲ増幅産物および標的核酸配列を含まない単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶから分離する）；ならびに、存在する場合、ソートされた単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶから核酸配列をプールして、標的核酸配列の濃縮されたプールを提供するステップを含む。これらのステップの１つまたは複数が、マイクロ流体制御下で行われ得る。
上記の方法により、たとえば、ＰＣＲで検出可能な部分配列の存在に基づいて、不均一系からのＤＮＡ分子の濃縮が可能になる。ＤＮＡ分子は、短くてもよいし（たとえば数百塩基）、長くてもよい（たとえばメガベース以上）。サンプルは、標的分子が単分散ドロップレット内でデジタル的に検出される（すなわち、各ドロップレットが０または１の標的分子を含有する）ように、ドロップレットに封入され得る。次いで、単分散ドロップレットは、たとえば、蛍光に基づいてソートされて、標的分子が回収され得る。この方法を用いて、ＤＮＡフラグメントの異質サンプルにおいて、たとえば長さがメガベースのオーダーの大きなゲノム領域を濃縮できる。
上記の方法により、ＰＣＲを行って配列用のＤＮＡを増幅する必要なく、シーケンシングに十分な量のＤＮＡの回収が可能になる。たとえば、ＰＣＲが、目的の配列またはエピジェネティック因子を保存しないか、または必要とされる長さ（たとえば、ロングレンジＰＣＲの実用限界は、約１０ｋｂ超である）の配列を回収することができない場合に、増幅フリーのＤＮＡサンプル調製物が有用である。
上記の方法の別の用途は、エピジェネティックシーケンシング用にＤＮＡを濃縮することである。ＤＮＡ上のエピジェネティックマークはＰＣＲにより保存されないので、それらをシーケンシングするには宿主核酸に由来する非増幅ＤＮＡが必要とされる。上記の方法により、ＰＣＲを行う必要なく、シーケンシングに十分な量のＤＮＡが得られ、ひいてはエピジェネティックマークを保存できる。
上記の方法は、標的核酸の長さがロングレンジＰＣＲの実用限界を超える場合、たとえば、核酸が約１０ｋｂよりも大きい場合に、および／またはＤＮＡ上のエピジェネティックマークを保存することが所望される場合に、特に有用である。一部の実施形態では、濃縮されることになる標的核酸は、長さが約１００ｋｂよりも大きく、たとえば、長さが約１メガベースよりも大きい。一部の実施形態では、濃縮されることになる標的核酸は、長さが約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約５００ｋｂ〜約１メガベースである。
増幅および／または精製後、今後の分析用に、化学的手段および浸透圧手段の双方を用いてエマルションを破壊してよい。たとえば、等容量の１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノールを精製サンプルに加え、ピペッティングまたはボルテックスにより混合してよい。次いで、得られた混合物を平衡化させ、水層を更なる分析用に溶出してよい。同様に、大過剰の精製水を、ソート後のサンプル加え、混合し、室温で数時間インキュベートさせてよい。次いで、得られた混合物は、目的の精製サンプルについて、直接分析され得る。
多置換増幅
上記で要約されるように、本発明の方法を実行する際に、ＭＤＡは、たとえば次世代シーケンシングを介した下流解析のための一般にバイアスのない非特異的な方法で、核酸、たとえばゲノムＤＮＡを増幅するために用いられ得る。
本明細書に記載される方法の例示的な実施形態には、生体サンプルから得られた核酸テンプレート分子を単分散ドロップレット（たとえば、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルション単分散ドロップレット）に封入するステップ、ＭＤＡ試薬および複数のＭＤＡプライマーを単分散ドロップレットに導入するステップ、ならびにＭＤＡ増幅産物の生成に有効な条件下で単分散ドロップレットをインキュベートするステップが含まれ、ここで、インキュベーションは、核酸テンプレート分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに有効である。一部の実施形態では、封入および導入ステップは、たとえば、核酸テンプレート分子がＭＤＡ試薬および複数のＭＤＡプライマーと混合され、たとえば、マイクロ流体デバイスのフローフォーカシング要素を用いて乳化される単一のステップとして行われる。
本明細書に記載されるＭＤＡベースのアッセイの条件は、１つまたは複数の方法において変化してよい。例として、単分散ドロップレットに添加（または封入）され得るＭＤＡプライマーの数は変化し得る。「プライマー」という用語は、精製された制限消化物において見られるように天然に発生するか、または合成的に生成されるかにかかわらず、１つまたは複数のプライマーを指し、オリゴヌクレオチドを指し、これは、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれた場合に、相補鎖に沿う合成開始点として機能することができる。そのような条件には、適切なバッファー（「バッファー」は、補因子であるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含む）中で、かつ適切な温度にて、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および重合誘導剤、たとえば適切なＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼもしくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）の存在が含まれる。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のために一本鎖である。ＭＤＡにおいては、ランダムヘキサマープライマーが規則的に利用される。
本明細書で用いられる核酸配列の相補体は、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対になるように核酸配列と整列したときに「逆平行会合」の状態にあるオリゴヌクレオチドを指す。相補性が完全である必要はない；安定した二本鎖が、ミスマッチした塩基対またはマッチしない塩基を含有してよい。核酸技術の当業者であれば、たとえば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチド中のシトシン塩基およびグアニン塩基のパーセント濃度、イオン強度、ならびにミスマッチした塩基対の出現率を含むいくつかの変数を考慮して、二本鎖安定性を経験的に決定することができる。
単分散ドロップレットに添加（または封入）され得るＭＤＡプライマーの数は、約１〜約５００プライマー以上、たとえば、約２〜１００プライマー、約２〜１０プライマー、約１０〜２０プライマー、約２０〜３０プライマー、約３０〜４０プライマー、約４０〜５０プライマー、約５０〜６０プライマー、約６０〜７０プライマー、約７０〜８０プライマー、約８０〜９０プライマー、約９０〜１００プライマー、約１００〜１５０プライマー、約１５０〜２００プライマー、約２００〜２５０プライマー、約２５０〜３００プライマー、約３００〜３５０プライマー、約３５０〜４００プライマー、約４００〜４５０プライマー、約４５０〜５００プライマー、または約５００プライマー以上に及び得る。
そのようなプライマーおよび／または試薬は、１つのステップで、または１つより多くのステップで単分散ドロップレットに加えられてよい。例として、プライマーは、２つ以上のステップ、３つ以上のステップ、４つ以上のステップ、または５つ以上のステップで加えられてよい。溶解剤が利用される場合、プライマーが１つのステップで加えられるか、または１つより多くステップで加えられるかどうかに関係なく、プライマーは、溶解剤の添加後、溶解剤の添加前、または溶解剤の添加と同時に加えられてよい。溶解剤の添加の前または後に加えられる場合、ＭＤＡプライマーは、溶解剤の添加とは別個のステップで加えられてよい。
プライマーが単分散ドロップレットに加えられたら、単分散ドロップレットは、ＭＤＡに十分な条件下でインキュベートされ得る。単分散ドロップレットは、プライマーを加えるために用いられたのと同じマイクロ流体デバイスでインキュベートされてもよいし、別個のデバイスでインキュベートされてもよい。ある実施形態では、ＭＤＡ増幅に十分な条件下での単分散ドロップレットのインキュベーションは、細胞溶解に用いられるのと同じマイクロ流体デバイスで行われる。単分散ドロップレットのインキュベーションは、さまざまな形態をとってよく、たとえば、単分散ドロップレットは、一定温度、たとえば、３０℃で、たとえば、約８〜約１６時間インキュベートされ得る。あるいは、２５℃で５分間、続いて４２℃で２５分間のサイクルを利用してよい。
本明細書に記載されるＭＤＡ増幅産物を生成する方法は、特定のプローブの使用を必要としないが、本発明の方法はまた、単分散ドロップレットに１つまたは複数のプローブを導入することを含み得る。核酸に関して本明細書で用いられる場合、「プローブ」という用語は、一般に、プローブ中の少なくとも１つの配列の、標的領域中の配列との相補性に起因して、標的核酸の配列と二本鎖構造を形成する標識オリゴヌクレオチドを指す。プローブは、好ましくは、ＭＤＡ反応を開始させるために用いられる配列に相補的な配列を含まない。加えられるプローブの数は、約１〜５００、たとえば、約１〜１０プローブ、約１０〜２０プローブ、約２０〜３０プローブ、約３０〜４０プローブ、約４０〜５０プローブ、約５０〜６０プローブ、約６０〜７０プローブ、約７０〜８０プローブ、約８０〜９０プローブ、約９０〜１００プローブ、約１００〜１５０プローブ、約１５０〜２００プローブ、約２００〜２５０プローブ、約２５０〜３００プローブ、約３００〜３５０プローブ、約３５０〜４００プローブ、約４００〜４５０プローブ、約４５０〜５００プローブ、または約５００プローブ以上であってよい。プローブは、１つまたは複数のプライマーの添加の前、添加に続いて、または添加の後に単分散ドロップレットに導入されてよい。
ある実施形態では、ＭＤＡベースのアッセイを用いて、細胞に存在する特定のＲＮＡ転写産物の存在を検出するか、または１つまたは複数のＲＮＡウイルスのゲノムをシーケンシングすることができる。そのような実施形態では、ＭＤＡ試薬は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて単分散ドロップレットに加えられてよい。ＭＤＡ試薬の添加（または封入）の前または後に、単分散ドロップレットは、逆転写を可能にする条件に続いて本明細書に記載されるＭＤＡを可能にする条件下でインキュベートされてよい。単分散ドロップレットは、ＭＤＡ試薬を加えるために用いられるのと同じマイクロ流体デバイス上でインキュベートされてもよく、または別のデバイス上でインキュベートされてよい。ある実施形態では、ＭＤＡを可能にする条件下での単分散ドロップレットのインキュベーションは、１つまたは複数の細胞を封入および／または溶解するために用いられるのと同じマイクロ流体デバイスで行われる。
ある実施形態では、ＭＤＡ用の単分散ドロップレットに加えられる試薬はさらに、ＭＤＡ増幅産物を検出することができる蛍光ＤＮＡプローブを含む。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ、およびＳｃｏｒｐｉｏｎプローブを含むがこれらに限定されない、任意の適切な蛍光ＤＮＡプローブが用いられ得る。ある実施形態では、単分散ドロップレットに加えられる試薬として、１つより多くのＤＮＡプローブ、たとえば、２つの蛍光ＤＮＡプローブ、３つの蛍光ＤＮＡプローブ、または４つの蛍光ＤＮＡプローブが挙げられる。複数の蛍光ＤＮＡプローブの使用により、１回の反応でＭＤＡ増幅産物の同時測定が可能になる。
ＰＣＲ
上記で要約されるように、本発明の方法を実行する際に、ＰＣＲベースのアッセイを用いて、細胞中、または核酸の異質サンプルに存在する、目的の特定の核酸、たとえば目的の遺伝子および／または遺伝子マーカー、たとえばオンコジーンの存在が検出され得る。そのようなＰＣＲベースのアッセイは、先行するまたは後続のＭＤＡ増幅ステップと同じ単分散ドロップレット、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルション単分散ドロップレット中で行われ得る。他の実施形態では、ＰＣＲ反応は、独立して単分散ドロップレット中で行われ得る。そのようなＰＣＲベースのアッセイの条件は、１つまたは複数の方法において変化してよい。
例として、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加えられてよいＰＣＲプライマーの数はさまざまに変化し得る。「プライマー」という用語は、精製された制限消化物において見られるように天然に存在するか、または合成的に生成されるかにかかわらず、１つまたは複数のプライマーを指し、オリゴヌクレオチドを指し、これは、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれた場合に、相補鎖に沿う合成開始点として機能することができる。そのような条件には、適切なバッファー（「バッファー」は、補因子であるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含む）中で、かつ適切な温度にて、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および重合誘導剤、たとえばＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在が含まれる。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のために一本鎖である。
本明細書で用いられる核酸配列の相補体は、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対になるように核酸配列と整列したときに「逆平行会合」の状態にあるオリゴヌクレオチドを指す。相補性が完全である必要はない；安定した二本鎖が、ミスマッチした塩基対またはマッチしない塩基を含有してよい。核酸技術の当業者であれば、たとえば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチド中のシトシン塩基およびグアニン塩基のパーセント濃度、イオン強度、ならびにミスマッチした塩基対の出現率を含むいくつかの変数を考慮して、二本鎖安定性を経験的に決定することができる。
単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに添加（または封入）され得るＰＣＲプライマーの数は、約１〜約５００プライマー以上、たとえば、約２〜１００プライマー、約２〜１０プライマー、約１０〜２０プライマー、約２０〜３０プライマー、約３０〜４０プライマー、約４０〜５０プライマー、約５０〜６０プライマー、約６０〜７０プライマー、約７０〜８０プライマー、約８０〜９０プライマー、約９０〜１００プライマー、約１００〜１５０プライマー、約１５０〜２００プライマー、約２００〜２５０プライマー、約２５０〜３００プライマー、約３００〜３５０プライマー、約３５０〜４００プライマー、約４００〜４５０プライマー、約４５０〜５００プライマー、または約５００プライマー以上に及び得る。
これらのプライマーは、１つまたは複数の目的の遺伝子、たとえばオンコジーンのプライマーを含有してよい。添加される目的の遺伝子用のプライマーの数は、約１〜約５００プライマー以上、たとえば、約１〜１０プライマー、約１０〜２０プライマー、約２０〜３０プライマー、約３０〜４０プライマー、約４０〜５０プライマー、約５０〜６０プライマー、約６０〜７０プライマー、約７０〜８０プライマー、約８０〜９０プライマー、約９０〜１００プライマー、約１００〜１５０プライマー、約１５０〜２００プライマー、約２００〜２５０プライマー、約２５０〜３００プライマー、約３００〜３５０プライマー、約３５０〜４００プライマー、約４００〜４５０プライマー、約４５０〜５００プライマー、または約５００プライマー以上に及び得る。目的の遺伝子およびオンコジーンとして、ＢＡＸ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＡＳＰ８、ＣＤＫ４、ＥＬＫ１、ＥＴＳ１、ＨＧＦ、ＪＡＫ２、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＭＣＬ１、ＭＥＴ、ＭＯＳ、ＭＹＢ、ＮＦＫＢＩＡ、ＥＧＦＲ、Ｍｙｃ、ＥｐＣＡＭ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＭＬ、ＰＲＫＣＡ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＬ、ＲＯＳ１、ＲＵＮＸ１、ＳＲＣ、ＳＴＡＴ３、ＣＤ４５、サイトケラチン、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、ＨＥＲ２、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１４６、ＭＵＣ１／２、およびＺＨＸ２が挙げられるが、これらに限定されない。
そのようなプライマーおよび／または試薬は、１つのステップで、または１つより多くのステップで単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに加えられてよい。例として、プライマーは、２つ以上のステップ、３つ以上のステップ、４つ以上のステップ、または５つ以上のステップで加えられてよい。溶解剤が利用される場合、プライマーが１つのステップで加えられるか、または１つより多くのステップで加えられるかどうかに関係なく、プライマーは、溶解剤の添加後、溶解剤の添加前、または溶解剤の添加と同時に加えられてよい。溶解剤の添加の前または後に加えられる場合、ＰＣＲプライマーは、溶解剤の添加とは別個のステップで加えられてよい。
プライマーが単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションのドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに加えられたら、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションの単分散ドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、ＰＣＲを可能にする条件下でインキュベートされ得る。単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、プライマーを加えるために用いられるのと同じマイクロ流体デバイスでインキュベートされてもよいし、別個のデバイスでインキュベートされてもよい。ある実施形態では、ＰＣＲ増幅を可能にする条件下での単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶのインキュベーションは、細胞を封入および溶解するために用いられるのと同じマイクロ流体デバイスで行われる。単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶのインキュベーションは、さまざまな形態をとり得る。ある態様では、ＰＣＲミックスを含む単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、ＰＣＲに有効な条件下で単分散ドロップレットをインキュベートするチャネルを通して流されてよい。一部の実施形態では、ＰＣＲ反応は、マイクロ流体デバイスおよび／またはシステムを使用せずに行われる。チャネルを通して単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶを流すことには、ＰＣＲに有効な温度に維持されるさまざまな温度ゾーンを蛇行するチャネルが伴ってよい。そのようなチャネルは、たとえば、２つ以上の温度ゾーンにわたり循環してよく、ここで、少なくとも１つのゾーンは、約６５℃に維持され、少なくとも１つのゾーンは約９５℃に維持される。あるいは、８６℃、６０℃、２０℃のゾーンが利用され得る。単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションおよび／もしくはＧＵＶがそのようなゾーンを通過するとき、ＰＣＲに必要とされる温度が繰り返される。ゾーンの正確な数、および各ゾーンのそれぞれの温度は、所望のＰＣＲ増幅を達成するために当業者によって容易に決定され得る。
他の実施形態では、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶのインキュベーションには、Ｍｅｇａｄｒｏｐｌｅｔアレイの使用を伴ってよい。そのようなデバイスでは、チャネル（たとえば、ＰＤＭＳチャネル）中にインデントされた数百、数千、または数百万ものトラップのアレイがサーマルシステム上に置かれる。チャネルは加圧され、それによりガスが逃げるのを妨げることができる。マイクロ流体チャネルの高さは、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションのドロップレットおよび／もしくはＧＵＶの直径よりも小さく、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションのドロップレットおよび／またはＧＵＶに平らなパンケーキ形状をとらせる。単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶが占有されていないインデント上を流れるとき、より下位の、よりエネルギー的に有利な曲率半径をとって、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶをトラップ内に完全に引き込む力が生じる。単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶを最密に充填して流すことにより、アレイ上のすべてのトラップが確実に占有される。デバイス全体は、ヒーターを用いてサーマルサイクルにかけられてよい。
ある態様では、ヒーターは、ペルチェプレート、ヒートシンク、および制御コンピューターを含む。ペルチェプレートは、印加電流を制御することにより、室温を上回るか、もしくは下回るチップの加熱または冷却を可能にする。制御された再現性のある温度を保証するために、コンピューターが、内蔵温度プローブを用いてアレイの温度を監視することができ、必要に応じて印加電流を調節して加熱および冷却することができる。金属（たとえば銅）プレートにより、均一な加熱と冷却サイクル中の余熱を放散が可能となり、約１分未満で約９５℃〜約６０℃に冷却することができる。
本発明の方法はまた、１つまたは複数のプローブを単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに導入することを含み得る。核酸に関して本明細書で用いられる場合、「プローブ」という用語は、プローブ中の少なくとも１つの配列の、標的領域中の配列との相補性に起因して、標的核酸の配列と二本鎖構造を形成する標識オリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応を開始させるために用いられる配列に相補的な配列を含まない。加えられるプローブの数は、約１〜５００、たとえば、約１〜１０プローブ、約１０〜２０プローブ、約２０〜３０プローブ、約３０〜４０プローブ、約４０〜５０プローブ、約５０〜６０プローブ、約６０〜７０プローブ、約７０〜８０プローブ、約８０〜９０プローブ、約９０〜１００プローブ、約１００〜１５０プローブ、約１５０〜２００プローブ、約２００〜２５０プローブ、約２５０〜３００プローブ、約３００〜３５０プローブ、約３５０〜４００プローブ、約４００〜４５０プローブ、約４５０〜５００プローブ、または約５００プローブ以上であってよい。プローブは、１つまたは複数のプライマーの添加の前、添加に続いて、または添加の後に単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに導入されてよい。目的のプローブとして、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（たとえば、Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．；Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．；Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．；Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．（１９９１），「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｂｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ５’−３’ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」，ＰＮＡＳ，８８（１６）：７２７６〜７２８０に記載される）が挙げられるが、これに限定されない。
ある実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイを用いて、細胞に存在する目的の特定の転写産物、たとえばオンコジーンの存在を検出することができる。そのような実施形態では、本明細書に記載されるＰＣＲを行うために用いられる試薬に加えて、ｃＤＮＡ合成に必要な逆転写酵素および他の任意の試薬（まとめて「ＲＴ−ＰＣＲ試薬」と呼ばれる）が、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに加えられる。ＲＴ−ＰＣＲ試薬は、本明細書に記載される適切な方法のいずれかを用いて、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに加えられる。ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬が単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションのドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに加えられた、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、本明細書に記載される逆転写を可能にする条件に続いてＰＣＲを可能にする条件下でインキュベートされてよい。単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、ＲＴ−ＰＣＲ試薬を加えるために用いられるのと同じマイクロ流体デバイスでインキュベートされてもよいし、別個のデバイスでインキュベートされてもよい。ある実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲを可能にする条件下での単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶのインキュベーションは、細胞を封入および溶解するために用いられるのと同じマイクロ流体デバイスで行われる。
ある実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ用に単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに加えられる試薬としてさらに、ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ産物を検出することができる蛍光ＤＮＡプローブが挙げられる。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ、およびＳｃｏｒｐｉｏｎプローブを含むがこれらに限定されない、任意の適切な蛍光ＤＮＡプローブが用いられ得る。ある実施形態では、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに加えられる試薬として、１つより多くのＤＮＡプローブ、たとえば、２つの蛍光ＤＮＡプローブ、３つの蛍光ＤＮＡプローブ、または４つの蛍光ＤＮＡプローブが挙げられる。複数の蛍光ＤＮＡプローブの使用により、１回の反応でＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ産物の同時測定が可能になる。
ダブルＰＣＲ
稀な転写産物を増幅するために、本明細書に記載される第１のステップのＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ反応を受けた単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを、第２のステップのＰＣＲ反応にさらに供してよい。一部の実施形態では、第１のステップのＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ反応を受けた第１の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが、酵素（たとえばＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡプローブ（たとえば蛍光ＤＮＡプローブ）およびプライマー含むがこれらに限定されない追加のＰＣＲ試薬を含有する第２の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入され、続いて第１の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが破裂される。ある実施形態では、追加のＰＣＲ試薬を含有する第２の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、第１のステップのＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ反応を受けた単分散ドロップレットよりも大きい。こうしたことは有益であり得る。なぜなら、たとえば、それにより第２のステップのＰＣＲに対して阻害的となり得る細胞成分の希釈が可能となるからである。第２のステップのＰＣＲ反応は、第１のステップの反応を行うために用いられるのと同じマイクロ流体デバイスで行われてもよいし、異なるマイクロ流体デバイスで行われてもよいし、または、マイクロ流体デバイスを使用することなく行われてもよい。
一部の実施形態では、第２のステップのＰＣＲ反応で用いられるプライマーは、第１のステップのＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ反応で用いられるのと同じプライマーである。他の実施形態では、第２のステップのＰＣＲ反応で用いられるプライマーは、第１のステップの反応で用いられるプライマーとは異なる。
デジタルＰＣＲ
本明細書に記載される方法は、たとえばデジタルＰＣＲを用いて核酸を定量化するために用いられ得る。デジタルＰＣＲでは、サンプルが区画内に隔離される場合に、ほとんどの区画が０または１つの標的分子を封入するように、溶液由来の標的核酸が希釈される。ただし、モデル化され得ることを前提として、より高いローディング率がしばしば用いられ得る。標的核酸の増幅に十分な試薬がまた区画内に含まれ、区画は増幅に適した条件に供される。区画は、基質内に作製されるマイクロウェルまたは単相エマルションドロップレットを含む、さまざまな構造を有することができる。それらはまた、たとえば、本明細書に記載される単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションの単分散ドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶとして形成されてもよい。一部の実施形態では、サンプルは、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションの単分散ドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶ内に区画化され、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションの単分散ドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶは増幅条件に供される。標的を含有するドロップレットは増幅を受ける一方で、標的を含有しないドロップレットは増幅を受けないので、核酸増幅産物を産出しない。検出成分が含まれるならば、標的を含む単相または多相エマルションは、検出可能なシグナルで満たされて、たとえば、イメージングドロポメトリー（ｉｍａｇｉｎｇ ｄｒｏｐｏｍｅｔｒｙ）またはフロードロポメトリー（ｆｒｏｗ ｄｒｏｐｏｍｅｔｒｙ）により同定され得る。そのようなデジタルＰＣＲを行うために二相エマルションを使用する強力な利点は、二相エマルションが、分配されたサンプルと混和性である水性キャリア相中に懸濁され得ることから、市販のフローサイトメーターおよび蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を用いて容易に検出され得、かつ／またはソートされ得ることである。これにより、ソーティングが簡単に達成されない他の方法では不可能な、サンプルからの標的実体の濃縮が可能になる。
一部の実施形態では、開示される方法は、ほとんどの場合、蛍光性であり、増幅を受けることで少なくとも単一の標的核酸を含有する単相または多相エマルションの分画を計数することにより、溶液中の核酸を定量化するために用いられ得る；確率論的な理由で、または、たとえば、増幅反応の特異性に干渉する塵埃または他の混入物の封入のために、偽増幅が生じることがある。ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコン、ＳＹＢＲ、および他の種類の検出成分も含まれてよく、これにより、標的内の異なる核酸配列の増幅を同時に検出するための多重光学スペクトルを使用することが可能となり、または、複数の標的が、同じ単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションの単分散ドロップレット、たとえば二相エマルションドロップレット、および／またはＧＵＶに封入されるために、場合によっては有利となり得る。
他のＰＣＲ解析法のように、ｄＰＣＲは異なる蛍光色素で標識されたプローブを用いて多重化され得る。ｄＰＣＲはドロップレット中の分子に作用するため、これは、異なる配列の物理的な会合のように、一般的な方法では不可能な独自の測定機会を提供する。これは、ウイルスの多様性の特徴付け、微生物ゲノムのフェージング、癌ゲノムのハプロタイピング、ｍＲＮＡスプライスフォームの測定、および溶液中の標的分子の長さ分布の特徴付けを含む、ゲノム生物学におけるさまざまな重要な用途にとって価値がある。
ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）
本明細書に開示される方法は、単一細胞封入およびＲＮＡｓｅｑに用いられ得る。ＲＮＡｓｅｑは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジーにより可能になった大規模な並列シーケンシングを利用し、これは、組織サンプル内のＲＮＡ転写産物の作成にアプローチする別の方法である。具体的には、ＲＮＡｓｅｑを用いて、遺伝子発現の変化、選択的スプライシングイベント、対立遺伝子特異的な遺伝子発現、ならびに遺伝子融合イベント、新規転写産物およびＲＮＡ編集を含むキメラ転写産物などの現象を研究できる。相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が単分散エマルションから回収され得、ＮＧＳのための標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写とライブラリー調製が単一細胞の遺伝子発現プロファイル解析のデータを収集するために行われる。
単一細胞のＲＮＡシーケンシング法が本明細書で提供され、この方法は、複数の単分散テンプレート粒子を、複数の細胞を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップ；第１の混合物を、第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；および第２の混合物を剪断することで、複数の単分散テンプレート粒子を第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させ、それにより第１の流体、単分散テンプレート粒子の１つ、および複数の細胞の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップを含む。そのような方法は、本明細書に記載される細胞溶解ステップ、たとえば、本明細書に記載されるプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ溶解ステップ、たとえば、本明細書に記載されるプロテイナーゼＫ溶解ステップを含み得る。例として、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ、たとえば、広範な基質特異性を有するプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ、たとえば、非特異的セリンプロテアーゼ、たとえば、プロテイナーゼＫ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼ（たとえば、ＣＡＳ番号９０１４−０１−１））、またはＯＢプロテアーゼ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｔｅｋから入手可能）が、たとえば、界面活性剤の非存在下で、細胞を単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入する前または同時に細胞に加えられてよい。プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼは、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼが細胞の封入前または封入中に活性化状態にないことを保証するのに十分な低い温度、たとえば、約１℃〜約５℃、約１℃〜約１０℃、約１℃〜約１５℃、約１℃〜約２０℃、または約１℃〜約２５℃を含む、約０℃〜約２５℃の温度で加えられてよい。一部の実施形態では、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼは、約４℃で加えられてよい。続いて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの温度は、プロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼの活性化を保証するのに十分な温度、たとえば、３７〜８０℃、たとえば３０〜５０℃、３７〜５５、４０〜６０℃、５０〜６０℃、６０〜７０℃または７０〜８０℃の温度に増加されて、はプロテイナーゼＫ活性化と溶解細胞を促進できる。プロテイナーゼＫのインキュベーションは、細胞溶解をもたらすのに十分な時間、たとえば１５〜６０分（または必要に応じてそれ以上）、たとえば１５〜２０分であってよい。次いで、エマルションを破壊し、必要に応じてプロテアーゼおよび／またはプロテイナーゼ、たとえばプロテイナーゼＫを洗い流してよい。溶解された細胞からのＲＮＡは、たとえば、エマルションを破壊する前に、任意の適切な方法および単分散ドロップレット中の試薬を用いて、その後のシーケンシングのために捕捉され得る。たとえば、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＤｒｏｐ−ｓｅｑビーズなどの官能化ＲＮＡ捕捉ビーズは、単分散ドロップレット中の細胞と共に封入され得る。一部の実施形態では、そのような官能化されたＲＮＡ捕捉ビーズは、テンプレート粒子に直接組み込まれ得る。たとえば、官能化されたＲＮＡ捕捉ビーズは、ビス（アクリロイル）シスタミンをポリアクリルアミドビーズ合成の架橋剤として使用して、適切なポリマー（ヒドロゲルなど）材料、たとえばＢＡＣポリアクリルアミドヒドロゲルに封入され得る。
核酸の長さの測定
本明細書に記載される方法は、溶液中の核酸の長さ分布を測定するために用いられ得る。これは、標的核酸の長さに沿った既知の距離の異なる領域にて、標的核酸にアニールするプローブ配列を設計することにより達成され得る。次いで、プローブは標的核酸と混合されて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、および／またはＧＵＶ中に区画化されてよい。各単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、たとえば、既知の距離だけ離れた標的上の２つの異なる領域の存在のシグナルを出す２つのプライマーとプローブのセットを含有してよい。これは、プローブの異なる組合せについて、異なる対が、標的の異なる距離と異なる領域をプロービングするように繰り返されてよい。サンプルは、必要に応じて、増幅、分析、およびソーティングに供されてよい。分析において、当業者であれば、一部の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが、プローブの一方のみで増幅を受けるのに対して、たとえば、他方のプローブのみで増幅を受ける一部の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶもあることを見出すであろう。このことは、これらの単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶにおいて、一方のタイプがプローブのまさに一方の領域を含むのに対して、他方のタイプが他方のプローブの領域を含むことを示唆している。この集団において、単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶはまた、双方のプローブで増幅を受けている場合もあり得、これは、その中の標的核酸が双方の領域を含んでいたことを示す。同懸濁液中には、当然のことながら、増幅を受けないことから、おそらく標的領域を含まないものに加えて、それぞれ３つのタイプのドロップレットの測定可能な分画を含む、多数の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶがあることになる。このデータは、溶液中の核酸の長さを推測するために用いられ得る。
たとえば、溶液中の核酸が、分子全体として大部分が無傷であるならば、増幅を受けたドロップレットの大部分は、プローブとプライマーの双方のセットで増幅を示すことになるので、混合シグナルを示すことになるであろう。対照的に、核酸標的が高度にフラグメント化されているならば、ほとんどの検出事象は、一方または他方のプローブによることになり、双方のプローブによる例はごく稀なものになるであろう。プローブ間の距離は既知であり得るので、当業者であれば、溶液中の分子の長さとフラグメント化を推定することができる。このプロセスが、異なる領域を標的とし、かつ／またはそれらの間の距離が異なるさまざまなプローブセットで繰り返されて、標的核酸のフラグメント化をより完全に特徴付けることができる。
単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中の配列分析（ＭＥＳＡ）のためのマイクロ流体濃縮
本明細書に記載される方法は、標的核酸の配列分析のためのマイクロ流体濃縮（ＭＥＳＡ）を行うために用いられ得る。これは、標的核酸を単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入して、それらのドロップレット中で増幅を行うことで、ドロップレットが標的配列を含有する場合に蛍光シグナルを発する方法を使用することにより達成される。次いで、これらのドロップレットがソートされることにより、ソートされたプールにおいて核酸が濃縮され得る。反応はまた、必要に応じて、複数の異なる部分配列を含有する分子を区別するように多重化されてよい。増幅はまた、シーケンシングを可能にするように、ソーティングの前に、ソーティングと同時に、またはソーティングの後に、ソートされる核酸を増幅するために用いられてよい。
このアプローチの重要な利点は、ドロップレット中で増幅される領域が「検出領域」として単純に用いられ得ることであり、アンプリコンは、シーケンシングに供される分子を含んでいる必要はない。その代わりに、標的分子がドロップレットに存在する場合に、それらの領域はシグナルを出すので、分子全体が下流解析のために回収され得る。これは強力である。なぜなら、効率的に増幅されるにはあまりに大きな核酸ですら、大きな核酸が下流解析のために回収され得るからである。たとえば、これまでのところまだ発見されていない微生物において、重要な生物学的経路、たとえばシグナル伝達カスケードの一部と考えられる遺伝子が存在すると仮定する。目的は、この経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子を回収して、それらをシーケンシングし、かつ研究することができるようにすることである。これは、既存の濃縮方法を用いて容易に達成されることができない。なぜなら、知られていない微生物は、特異的に培養することができず、加えて、配列の大部分が知られていない経路は、経路全体を引き抜くにはあまりに小さくあり得る個々の遺伝子は考慮から外して、プローブがハイブリダイズする配列を知ることができないために、ハイブリダイゼーションプローブを用いて精製され得ないからである。しかしながら、これは本明細書に記載されるＭＥＳＡ法を用いて達成され得る。
一部の実施形態では、標的由来の核酸は、経路全体を封入するほど十分に大きなサイズ、たとえば、数十もしくは数百キロベース、またはメガベース以上の長さのフラグメントにフラグメント化されてよい。経路がフラグメント内に存在するならば、既知の遺伝子を含有する可能性がある。ほとんどが標的を含有しないフラグメント化された核酸は、本明細書に記載される技術に供されて、大部分が経路を含有しないことから増幅を示さない単分散の単相エマルションドロップレットが生じるのに対して、経路を含有する稀なドロップが増幅を受ける。次いで、ポジティブなドロップレットは、たとえば、蛍光により明るい二相エマルションをＦＡＣＳソーティングすることにより回収され得る。次いで、これらは、更なる操作、たとえば、必要に応じて、特異的増幅および非特異的増幅、デジタルＰＣＲまたは定量ＰＣＲによる定量化、ならびにＤＮＡシーケンシングに供され得る。他の濃縮戦略に勝るＭＥＳＡの強力な利点は、最大で全ゲノムのサイズですらある、非常に大きな核酸が、数百もの塩基対のうちほんの数十と短い既知の配列に基づいて検出および回収され得ることである。他の濃縮方法論はほとんど、配列についてのそのような限られた情報量を用いて、異質プールからそのような大きな核酸配列を濃縮する能力を有していない。
この方法はまた、個々のゲノムのＤＮＡ配列を同定するために用いられ得る。この実施形態では、標的由来の核酸は、フラグメント化されて、ＰＣＲ試薬および目的のＤＮＡ配列に特異的なプライマーと共に、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されてよい。増幅の後、ポジティブな単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを用いて、個々の区画、たとえばウェルプレートアレイ中にソートされ得る。次いで、個々の区画が、更なる操作、たとえば特異的増幅または非特異的増幅に供されてよい。次いで、生じたアンプリコンは、次世代シーケンシング技術用の、またはサンガーシーケンシングに直接用いられる材料としてのライブラリーを作成するために用いられてよい。本技術は、たとえば、個々の患者において見出されるレトロウイルス集団、たとえばＨＩＶにおける遺伝的差異を同定するように設計された方法に有用である。
上記で考察されるように、本明細書に記載される方法は、デジタルＰＣＲ、および関連するシーケンシング分析のためのマイクロ流体濃縮（ＭＥＳＡ）に用いられ得る。一部の実施形態では、核酸、ウイルス、細胞、粒子などを含むサンプルが、本明細書に記載される単相エマルションまたは多相エマルション中に分配される。ドロップレットは、リザーバー、たとえばＰＣＲチューブ中に収集されて、サーマルサイクリングなどの増幅に適した条件下でインキュベートされる。等温法、たとえばＭＤＡ、ＭＡＬＢＡＣ、ＬＡＭＰその他が用いられてもよい。蛍光リポーターが、標的核酸を含有するドロップレットと、標的核酸を含有しないドロップレットとの間で蛍光の差異を誘導するために、ドロップレット中に含まれてもよいし、キャリア相に加えられてもよい。
たとえば、Ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎが、単相エマルションまたは多相エマルション中に分配されるように、キャリア相に加えられてよい。Ｓｙｂｒは二本鎖ＤＮＡの存在下でかなり蛍光を発するので、増幅を受けるドロップレットは、増幅を受けないドロップレットよりも蛍光でより明るくなるであろう。サンプル中の標的分子の数を定量化するために、ドロップレットは、フローサイトメトリー分析に供されてもよいし、さらに蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）に供されてもよい。
フローサイトメーターにドロップレットが流れることで、それらのサイズと蛍光に関する情報が記録され得る。標的分子が限界希釈にてロードされる例では、標的分子を含有することで蛍光性であると検出されることになるドロップレットもあれば、標的分子を含有しないことで薄暗いと検出されることになるドロップレットもあるであろう。明るい〜薄暗いドロップレットの分画は、ポアソン分布に従って、元のサンプルにおける標的分子の出発濃度を推定するために用いられ得る。蛍光に基づいてドロップレットをソートするためにＦＡＣＳを用いることにより、標的分子を含有する二相エマルションを回収することが可能であり、二相エマルションを破壊することにより、標的分子を回収することが可能である。これは、核酸の大きな異質集団をスクリーニングして、標的配列を選択的に回収するために用いられ得る。上記の方法はまた、複数のエマルションドロップレットの代わりに、適切な場合、ＧＵＶを用いて行うことができる。
単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中のＰＣＲ活性化細胞ソーティング（ＰＡＣＳ）
ＭＥＳＡ技術は、溶液からの裸の核酸の濃縮を可能にするが、類似のアプローチが、実体の内部、たとえば、細胞、ウイルス、胞子、粒子などの内部に含有される核酸に適用されてよく、ここで、プロセスは大部分が同じである。たとえば、標的核酸を含む実体は、上記に記載される記載される単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されて、標的核酸を増幅するのに十分な条件に供され得る。次いで、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、増幅に基づいてソートされて、標的を有する実体が回収され得る。
この技術を、実体、特に膜または保護シェルを有する生物学的実体、たとえば細胞に適用する場合の重要な留意点は、特異的検出が生じるには核酸が増幅試薬にアクセス可能でなければならないことであり、これは特殊な手順を必要とする場合がある。たとえば、実体は、核酸を放出する試剤、たとえばプロテアーゼ、リゾチーム、界面活性剤、強塩基などと共に、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されてよい。実体はまた、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されてから、溶解剤を含有する溶液中に浸漬されてよく、これにより、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを通してシェルが分割されて溶解が誘導され得る。実体はまた、たとえば、溶解剤中に浸漬され得るゲル粒子に封入されてもよい。次いで、実体の核酸を含有するであろうこれらのゲル粒子は、増幅手順を介して、検出のために単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されてよい。ゲルは、たとえば、核酸をトラップする一方で試薬がゲルを通して拡散することを可能にするほど孔径が十分に大きいことを保証することによるか、またはアガロースを使用する場合のように、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの加熱直後に溶融するのを可能とすることにより、溶解または増幅反応を阻害しないように選択されてよい。ゲルはまた、必要に応じて、官能化され得、通常であればゲルから漏出して検出不能となり得る所望の細胞化合物、たとえばＲＮＡ分子に付着する。標的核酸への合成試薬のアクセスを可能にするために実施され得るさらに別の手順は、電流を用いて、細胞、ウイルス、粒子などを溶解させることである。というのも、それらは単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されているからである。これは、例として、電流が流れるチャネル中に細胞を流すことにより達成され得、これにより、細胞膜中に孔が生じて、たとえば、細胞溶解を促進することができる。
生細胞ＰＣＲ活性化細胞ソーティング（ＰＡＣＳ）
本明細書に記載される、細胞へのエマルションＰＣＲおよびソーティングの適用には、溶解、およびほとんどの場合で生物の死が含まれていた。しかしながら、アプローチに変更を加え、本明細書に記載される方法を使用することにより、生きた無傷の細胞を回収することも可能である。これは、たとえば、封入する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中に細胞内容物が漏出するような条件下で、封入する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションの単分散ドロップレットおよび／またはＧＵＶに生細胞を封入しつつ、細胞の生存率を維持することにより達成され得る。これは、たとえば、電流も流れるチャネル中に細胞を流すことにより可能であり、これにより、細胞膜中に孔形成が誘導され得、細胞溶解物の漏出が可能となる。細胞がこのチャネルから出て行くと、漏出した溶解物は依然として細胞の周りに存在したまま、細胞の膜は、裏側を密閉し得る。層流条件について、これは、細胞の周りの溶解物が細胞と共に流れて、同じ区画、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されるように行われ得る。細胞核酸の増幅または他の細胞成分の検出に適した試薬も含まれて、そうすることで細胞の周りの溶解物は、ドロップレット中にある場合、試薬と相互作用することができる。反応は、蛍光シグナルを発するように設計されてよく、これにより、標的細胞を含有するドロップレットが、ソーティングを介して回収できるようになり、細胞の生きた回収が可能となる。これは技術の強力な使用方法である。なぜなら、ＰＡＣＳの利益（配列バイオマーカー、たとえば分子およびＲＮＡに基づいて、細胞を区別する能力）を提供しつつ、細胞寿命を維持して、他の反応および分析を行えるからである。
質量分析活性化細胞ソーティング（ＭＳ−ＡＣＳ）
本明細書に記載される方法は、一部の実施形態では、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内に反応を区画化し、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内の反応産物を検出し、ドロップレットおよび／またはＧＵＶをソートする能力に依拠し、それらの産物に基づいて特定の実体を回収し、適切な分析を実行する。酵素によるアッセイ、たとえばＰＣＲなどの多くのアッセイタイプが、異なる実体、たとえば細胞およびウイルスを区別するように実行され得る。しかしながら、場合によっては、酵素による技術は、目的の分析物を検出することができない場合がある。この場合、他の方法、たとえば分光法が実施され得る。非常に強力な検出法が質量分析法であり、これは、高感度かつ一般的であるためである。しかしながら、質量分析法の限界は、それが、分析するサンプルを破壊する破壊技術であることである。目的が情報の回収のみであるならば、これは許容可能であり得るが、場合によっては、通常、質量スペクトロメーターにより破壊されることになるシステムからさらに物質を回収することが所望される。
本明細書に記載される方法を用いて、質量分析法が、サンプルを分析する一方で、なおサンプルの回収を可能にするために用いられ得る。たとえば、経路に関与するタンパク質を発現する細胞を同定することが目的であると仮定する。細胞は、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶにロードされ培養されることで、各単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中に多く存在することができ、かつ／または経路の産物、たとえば、分子、化合物などを生成することが可能であり、それらは、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを満たすことになるであろう。次いで、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの一部を分割することになるデバイス中に流されて、細胞または細胞分泌物から物質の一部が捕捉され得、これは破壊的質量分析法に供され得る。次いで、他の部分はソートされ得る。質量スペクトロメーターは、サンプリングされた一部における化合物を分析するために使用され得、この情報は、ドロップレットの姉妹部分をソートする方法を決定するために用いられ得る。この方法を用いて、非常に高感度かつ一般的な質量分析法を用いて細胞を特異的にソートする一方で、全細胞または全細胞溶解物を回収することが可能である。
コロニーの増殖と溶解
細胞を、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶに封入する能力は、生体、たとえば細胞およびウイルスを培養するのに有用である。たとえば、細胞が単一の、共有される容量内で増殖されるならば、細胞間の競合により、集団を引き継ぐ特定の細胞が生じ得ることで、それらはいくらかの培養時間後に大部分の細胞を含める。単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中に細胞を区画化して、それらを培養することにより、競合が制御および／または軽減され得る。さらに、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの透過性は、特定の分子が通過することができる一方で、他のものは通過できないようにセットされ得る。これにより、たとえば、増殖のために重要なシグナリング分子または他の分子が、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶのシェルを自由に通過して、培養条件をより良好に制御することができる。
多重化
主題の方法のある実施形態では、複数のバイオマーカーが、特定の細胞について検出および分析され得る。検出されるバイオマーカーとして、１つまたは複数のタンパク質、転写産物、および／もしくは細胞のゲノム中の遺伝的サイン、またはそれらの組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。標準的な蛍光ベースの検出により、同時に調べられ得るバイオマーカーの数は、各単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内で独立して視覚化され得る蛍光色素の数に制限され得る。ある実施形態では、特定の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内で個々に検出され得るバイオマーカーの数は増大され得る。たとえば、これは、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの異なる部分への色素の分離により達成され得る。特定の実施形態では、色素およびプローブ（たとえば、核酸または抗体プローブ）が結合したビーズ（たとえばＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズ）が、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入されて、分析されるバイオマーカーの数が増大され得る。別の実施形態では、蛍光偏光が、単一細胞用の異なるバイオマーカーについて、より多くの検出可能シグナルを達成するために用いられ得る。たとえば、蛍光色素が、さまざまなプローブに付着されてよく、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが、異なる偏光条件下で視覚化されてよい。このように、同じ着色色素が、単一細胞について異なるプローブ標的にシグナルを提供するように利用され得る。固定細胞および／または透過性細胞（以下でより詳細に考察される）の使用もまた、多重化のレベルの増大を可能にする。たとえば、標識抗体は、細胞成分に局所的なタンパク質標的を標的とするために用いられ得る一方で、標識ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲ産物は、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内に遊離している。これにより、同じ色の色素が、抗体に、そしてＲＴ−ＰＣＲにより生成されるアンプリコンに用いられ得る。
デジタル酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
一部の実施形態では、開示される方法およびデバイスは、デジタルＥＬＩＳＡ手順を用いてサンプル中のエピトープを定量化するために用いられ得る。一部の実施形態では、たとえば、固形基質、たとえば平らな基質表面またはビーズの表面に結合されたエピトープが、酵素触媒で標識された親和性試薬と追加的に結合し得る。サンプルは、結合していない親和性試薬と酵素を除去するために、洗浄されてよい。次いで、標識エピトープまたはその部分は、さまざまな方法で溶液中に放出され得る。簡略化のために、酵素触媒は、化学的に、または、たとえば熱もしくは光を適用することにより分解され得る結合を介して、親和性試薬に結合されてよい。あるいは、親和性試薬とエピトープとの相互作用が破壊されてもよいし、エピトープと基質との相互作用が破壊されてもよい。結合がビーズ上で生じるならば、ビーズは、洗浄ステップの後に溶液中に懸濁され、それにより酵素触媒が懸濁されてよい。次いで、懸濁された酵素触媒は、酵素触媒を検出するのに十分な試薬、たとえば酵素触媒が蛍光産物に変換し得る基質と共に、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶに封入され得る。次いで、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、触媒反応に適した条件下でインキュベートされて、触媒が存在する場合は、大量の反応産物を含有する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが、そして触媒が存在しない場合は、少量の反応産物を含有する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが生じ得る。次いで、蛍光を発する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの数は、薄暗い単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶと比較して定量化されて、サンプルに存在する触媒分子の数の測定が実現され得る。次いで、この情報は、元のサンプル中のエピトープの濃度を推測するために用いられ得る。
これはまた、本明細書に記載される多重化法を用いて、結合後のサンプルを洗浄する必要なく達成され得る。たとえば、同じ標的を検出する２つの抗体が、サンプルに導入されてよく、それぞれが異なる触媒で標識されている。次いで、サンプルは、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶに封入されてよい。標的が存在する場合には、標的は、多くの場合、典型的な「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡで生じるように、双方の抗体により結合されることになるが、この場合を除いて、分子は基質に結合するのではなく溶液中に自由に拡散する。この結果、時には抗体の１つのみを含有するか、または双方の抗体を含有する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが生じることになり、それらは、ドロップレット中の触媒反応の存在を監視することにより検出され得る。ほとんどのドロップレットが空となるように希釈が適切に制御されるならば、双方の触媒産物の存在が、ドロップレットに存在する標的に帰せられる一方で、触媒産物の１つのみの存在は、結合していない抗体におそらく対応させることが可能であるはずである。ダブルポジティブドロップレットの分画を定量化することにより、洗浄手順を実行する必要なく、溶液中の標的の分画を推定することが可能である。
デジタルオリゴ結合免疫吸着検定法（ｄＯＬＩＳＡ）
本明細書に記載される方法は、ＲＮＡ分子の高感度検出と絶対定量に用いられ得る。目的のアッセイアプローチとして、以下のものに限定されないが、Ｃｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ． ３７８ （１ −２ ）， １０２ −１５ （２０１２）が挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。この用途は非常に低濃度の検体に適用され、結合特性は、典型的なイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡプラットフォームから逸脱する可能性がある。理論的解析により、一連の実験パラメーターから期待され得るパフォーマンス測定基準（検出感度、アッセイ速度など）が明らかになる。
この方法は、ビーズ表面に結合した抗体への標的タンパク質分子の結合を含む。平衡状態での結合タンパク質の量（捕捉効率）は、解離定数ＫＤにより決定され、捕捉効率の上限が設定される。結合反応はオンとオフの速度（ｋｏｎとｋｏｆｆ）により制御される動的プロセスであり、システムの時間依存の進化は、反応速度を記述する微分方程式を数値的に解くことによりシミュレートされ得る。何れの理論にも縛られることを意図するものではないが、結合反応速度は主にｋｏｎ値に依存する一方で、ＫＤ値はそれにほとんど影響を与えない。より高い濃度の抗体が結合のために提供され得るならば、遅い反応速度は救済され得る。
一部の実施形態では、ｋｏｎ速度が、所望の検出効率を達成するために必要なインキュベーション期間を規定する。ｄＯＬＩＳＡの場合、二次抗体はＤＮＡオリゴと結合される。三元複合体（Ａｂ−Ｌｉｇａｎｄ−ｏｌｉｇｏＡｂ）は、ドロップレットあたり単一のＤＮＡテンプレート分子が存在するように、１０〜１０００万のドロップレット、たとえば単分散の単相エマルションドロップレット（容量はそれぞれ５〜５０ｐＬ）に封入され、蛍光発生試薬の存在下でドロップレットＰＣＲ増幅が行われ、蛍光ドロップレットが計数される。
ＰＴＥによるコアシェルマイクロゲルの形成
本明細書で提供されるのは、ＰＴＥを用いてコア−シェルマイクロゲルを作製する方法である。そのような方法は、一般に、複数の単分散テンプレート粒子を、複数の標的粒子およびポリマー成分を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップ；第１の混合物を、第１の流体およびポリマー成分と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；および第２の混合物を剪断することで、複数の単分散テンプレート粒子を第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させ、それにより第１の流体、ポリマー成分のシェルに囲まれる単分散テンプレート粒子の１つ、および複数の標的粒子を含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップを含む。
新しく形成された外側シェルは、生体材料と試薬を保持するために使用されて、本エマルション技術の用途の範囲を広げることができる。一部の実施形態では、シェルは、剪断後に形成されてよい。一部の実施形態では、ポリマー成分のシェルは、適切な温度として、たとえば、約１℃〜約５℃、約１℃〜約１０℃、約１℃〜約１５℃、約１℃〜約２０℃を含む、約０℃〜約２５℃の温度でインキュベートすることにより固化され得る。一部の実施形態では、４℃のインキュベーション温度が用いられる。
そのような方法は、本明細書に記載される親和性ベースの粒子テンプレート乳化によるターゲット解析と組み合わせられ得る。たとえば、一部の実施形態では、単分散テンプレート粒子は、捕捉剤、たとえば抗体または核酸捕捉試薬、たとえばオリゴで官能化される。
ソーティング
本開示の方法を実行する際に、１つまたは複数のソーティングステップが用いられてよい。目的のソーティングアプローチとして、膜バルブ、分岐チャネル、表面音響波、選択的合一、誘電泳動偏向、フロー制御、および／または単分散ドロップレットを選択的に偏向するために用いられる他の刺激を含むアプローチが挙げられるが、これらに必ずしも限定されない。目的のソーティングアプローチとしてさらに、Ａｇｒｅｓｔｉ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０７，ｎｏ ９，４００４〜４００９に記載されるものが挙げられ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。ソーティングによる集団の濃縮は、所望の特性を有するか、または有していないメンバーのミックスを含有する集団が、所望の特性を有していないメンバーを除去することにより濃縮され、それにより所望の特性を有する濃縮集団を生成できるということから行われ得る。
ソーティングは、本明細書に記載されるいずれかのステップの前または後に適用され得る。さらに、２回以上のソーティングステップが、ドロップレット、たとえば、単分散ドロップレットおよび／またはＧＵＶに適用されてよく、たとえば、約２回以上、約３回以上、約４回以上、または約５回以上などのソーティングステップである。複数のソーティングステップが適用される場合、ステップは、１つまたは複数の方法（たとえば、異なる特性に基づくソーティング、異なる技術を使用するソーティングなど）において、実質的に同一であっても異なっていてもよい。
１つまたは複数の特性に基づいて、本明細書に記載されるように調製された単分散ドロップレットを含むドロップレットがソートされ得る。目的の特性として、サイズ、粘度、質量、浮力、表面張力、導電率、電荷、磁気、蛍光、および／または１つもしくは複数の成分の有無が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様では、ソーティングは、単分散ドロップレット中の細胞の有無に少なくとも部分的に基づき得る。ある態様では、ソーティングは、たとえば、蛍光増幅産物の検出により示されるか、または増幅産物の表面抗原の検出により示されるように、増幅または合成産物などの核酸増幅産物の有無の検出に少なくとも部分的に基づき得る。
単分散ドロップレットソーティングは、たとえば、細胞が存在しない単分散ドロップレットを除去するために用いられ得る。封入は、細胞が存在しない大多数の単分散ドロップレットを含む、１つまたは複数の単分散ドロップレットをもたらし得る。そのような空の単分散ドロップレットがシステム中に残っているならば、他の何れかの単分散ドロップレットとして処理されることになり、その間、試薬と時間が無駄になる。最高の速度と効率を達成するために、これらの空の単分散ドロップレットは、単分散ドロップレットソーティングにより除去され得る。たとえば、ドロップ生成器は、細胞の非存在下で８μｍのドロップが形成されるように、ドリッピングからジェット噴射への移行に近づくように作動し得る；対照的に、細胞が存在する場合、フロー中で生じる撹乱は、噴流の崩壊を誘発して、直径２５μｍのドロップを形成することになる。したがって、デバイスは、空の８μｍのドロップレットと、単一細胞を含有する２５μｍのドロップの二分散集団を生成することができ、これは、次いで、たとえば流体式ソーターを用いて、サイズ別にソートされて、より大きな、単一細胞を含有するドロップのみが回収され得る。
目的のパッシブソーターとして、流体式ソーターが挙げられ、これは、小さな単分散ドロップレットと大きな単分散ドロップレットとのマイクロ流体チャネル中におけるさまざまな移動の仕方に基づき、サイズに従って、異なるチャネル内にドロップレットをソートする。バルクソーターにも関心が持たれ、この単純な例として、重力場での異なる質量の単分散ドロップレットを含有するチューブがある。チューブを遠心分離し、撹拌し、かつ／または振とうすることにより、より浮揚性のあるより軽い単分散ドロップレットが、コンテナの上部に向けて自然に移動することになる。磁気特性を有する単分散ドロップレットは、磁気特性を有する単分散ドロップレットが、特性の大きさに従って自然に移動することになる磁界をコンテナに印加することによる点を除き、類似したプロセスでソートされ得る。主題の方法に用いられるパッシブソーターはまた、フロー特性に基づき多数の単分散ドロップレットを同時にソートすることになる比較的大きなチャネルを伴ってもよい。
ピコインジェクションがまた、単分散ドロップレットの電気特性を変えるために用いられ得る。これは、たとえば、イオンを加えることにより単分散ドロップレットの導電率を変えるために使用され得、これは、次いで、たとえば誘電泳動を用いてドロップレットをソートするために用いられ得る。あるいは、ピコインジェクションはまた、単分散ドロップレットを帯電させるために用いられ得る。これは、帯電される単分散ドロップレット中に流体を注入して、注入後、単分散ドロップレットが帯電することにより達成され得る。これは、帯電していたり帯電していなかったりする単分散ドロップレットのコレクションを生成することになり、帯電した単分散ドロップレットは、次いで、帯電量に基づいてそれらを偏向させる電界の領域を通って流れることにより抽出され得る。異なる量の液体を注入することにより、ピコインジェクションを調整することにより、または固定された注入容量に対して異なる電荷を注入するように電圧を調整することにより、単分散ドロップレット上の最終電荷は調節されて、電荷が異なる単分散ドロップレットが生成され得る。これらは、次いで、電界領域において量が異なることにより偏向され、異なるコンテナ中へのソートが可能になる。
フローサイトメトリー（ＦＣ）が、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、オンチップ単分散ドロップレットソーティングに代わるものとして利用されてよい。そのような方法が、この方法の実行に利用され得るデバイスと共に、Ｌｉｍ ａｎｄ Ａｂａｔｅ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１３，１３，４５６３〜４５７２に記載されている；この開示は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。簡潔に言うと、単分散ドロップレットは、たとえば、本明細書に記載される分裂およびピコインジェクションのような技術を用いて、形成および操作されて、単相エマルションが生じ得る。次いで、これらの単相エマルションは、たとえば、本明細書またはＬｉｍ ａｎｄ Ａｂａｔｅ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１３，１３，４５６３〜４５７２に記載される１つまたは複数のデバイスを用いて、二重乳化されて、たとえば、本明細書に記載される多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが提供され得る。次いで、二相エマルションは、ＦＣ、たとえばＦＡＣＳを介して解析され得る。
本明細書に記載される方法およびデバイスを用いて生成されたドロップレット、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレットまたは二相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、たとえば、酵素を伴う反応、たとえばＰＣＲを含む、さまざまな内包型の化学的反応および生物学的反応を行うために用いられ得る。多くの場合、反応の結果は、検出に関心が持たれ得る産物であり得る。さらに、異なるレベルの産物、または複数の産物の組合せを有する単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを回収することにも関心が持たれ得る。これは、本発明を用いて、さまざまな方法で達成され得る。たとえば、異なる単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが異なるレベルに反応して、異なる最終産物濃度を有し得るように、反応物が、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶリアクター内に分配され得る。次いで、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、たとえば、分光技術、たとえば、光学イメージングまたは蛍光イメージング、フローサイトメトリー、ラマン分光法、質量分析などを用いて調べられ得る。これらの方法、またはそれらの組合せは、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中のさまざまな化合物の濃度を判定するために用いられ得る。これらの方法は、たとえば、二相エマルションの場合にマイクロ流体ベースのソーティングまたはフローサイトメトリーを用いて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶをソートする機構と組み合わされ得る。ポジティブとネガティブにソートされた単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶの内容物は、これらのソートされたプールの異なる特性を同定するために分析され得る。
さらに、場合によっては、たとえば、ポジティブにソートされた各ドロップレットの更なる詳細な個々の分析を可能にする更なる研究のために、個々のポジティブにソートされたドロップレットを、隔離されたウェル内にロードすることが所望され得る。非限定的な例として、本明細書に記載される方法およびデバイスは、特定の核酸配列を含有するウイルスを調べるために用いられ得る。異質集団由来のウイルスが、たとえば、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／またはＧＵＶ内に、標的核酸の溶解および増幅に十分な試薬と共にロードされ得る。次いで、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、たとえば、二相エマルションのためのフローサイトメトリーにより分析およびソートされて、標的核酸の増幅を受けたすべてのドロップレットが検出および回収され得る。これらのドロップレットは、たとえば、単一のポジティブプール内にソートされ得るか、またはウェルプレートアレイ上のウェル内に個々にソートされ得る。それらは、必要に応じて、特定のグループ中にロードされてもよく、アレイ上の各ウェルが、すべて同じであってもよいし、異なる増幅標的を示してもよいポジティブ事象の所望の組合せを有することになる。次いで、ソートされたドロップレットは、更なる分析、たとえば質量分析法または次世代シーケンシングなどに供され得る。
プール解析の場合、ポジティブコンテナ中にロードされた全細胞由来の核酸は、一緒に混合されて、全体として解析されることになる。しかしながら、単一ドロップレットをウェル中にロードすることにより、各ウェルの内容物は、たとえば、プールまたはシーケンシングの前に各ウェル内で核酸をバーコード化することなどにより個々に解析され得る。これにより、たとえば、標的種の単一ウイルスゲノムの溶解が、標的種を検出するだけでなく、個々のゲノムを回収することも可能にするので、同じ種の異なるメンバー間の比較を得ることができる。そのような分析は、メタゲノミクスなどのさまざまな用途に、またはウイルス多様性を研究するのに有用である。
本発明の一部の実施形態では、検出に用いられる増幅に加えて、標的分子を増幅して、たとえば、ソートされた標的核酸への更なる解析を可能にすることが所望される。たとえば、一部の用途では、標的は、シーケンシングに所望される核酸を含むであろうが、標的により提供される核酸の量は、シーケンシングを可能にするには小さ過ぎるであろう。この場合には、特異的ＰＣＲおよび／または非特異的多置換増幅などの増幅手順が、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶのソーティング前または後に適用され得る。たとえば、比較的小さな線状ゲノムを有するウイルス、たとえば、ポリオまたはＨＩＶの場合、ソーティング前または後にＰＣＲが実行されて、ソーティング後に各ゲノムの十分なコピーが提供され得、シーケンシング解析が可能になる。たとえば、個々のゲノムが、ドロップレットに封入され、ゲノムの全体または一部の増幅に供され得る。この反応と同時に、または続いて、更なる増幅が実行されて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中のゲノムが同定され得、そしてこの情報に基づいて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶがソートされ得る。今や標的核酸の多数のコピーを含有する、これらのソートされた単相または多相エマルションは、次いで、後続の解析に、より容易に供され得る。
あるいは、例として、各ポジティブな単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションの単分散ドロップレットおよび／またはＧＵＶが、完全長の標的核酸の１コピーのみと、多数の小さな検出領域アンプリコンを含有し得るように、個々のゲノムが封入され、検出増幅に供され得る。これらのアンプリコンに基づいて、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、各ポジティブソーティング事象について、標的ゲノムの１つの完全長コピーを提供するプールとして回収され得る。次いで、シーケンシングライブラリーを調製するために、これらのポジティブゲノムは、特異的であり、かつ所望の領域に隣接するプライマーを有するＰＣＲ、あるいは、ゲノムの全体を増幅する非特異的な方法、たとえば多置換増幅法（ＭＤＡ）または複数アニーリングとループベース増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）を用いて増幅され得る。さらに、ポジティブな単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶがプールされないのであれば、たとえば、ポジティブな単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶが、ウェルプレートアレイ中にソートされてから、特異的であり、かつ所望の領域に隣接するプライマーを有するＰＣＲを使用した増幅に供される場合、生じた個々のアンプリコンは、サンガーシーケンシング用の材料として直接用いられ得る。
開示される方法およびデバイスの強力な利点は、多数の独立した、隔離された反応を行ってから、さまざまな分光技術を適用して反応産物を検出し、所望の反応を受けた特定のリアクターを回収するためにソートする能力である。開示される方法の性能に起因し得る課題は、場合によっては、更なる分析に所望されるポジティブ事象が、非常に稀であり得ることである。たとえば、開示される方法が、所望のウイルスが非常に低いレベルで存在する、大きな、多様なウイルスのプールにおいて、特定のウイルスを検出するために用いられるのであれば、特定のウイルスを回収するために、多数の個々のウイルスが分析される必要があり得る。そして、種の複数の例を回収することが所望されるならば、より一層多数の総ウイルスが分析される必要があり得る。開示される方法で行われ、かつソートされ得る反応の数は有限であるので、確実に検出するには標的があまりに稀である例が存在することもある。
ある例では、本明細書に記載される方法は、極端に稀な事象を回収する階層化ソーティングプロセスに使用され得、各ソーティングラウンドが濃縮係数を与える。サンプルにソーティングを繰り返し行うことにより、サンプルは標的について濃縮され得るので、総濃縮は、個々の濃縮のすべての乗法の積になる。たとえば、本明細書に記載されるシステムが多くとも１００万個の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶを生成、分析およびソーティングすることができると仮定する。理想的な条件下で、これは、たとえば、１０億個中１個で存在する事象が、システムの単純な使用では検出される可能性が低いことを意味する。しかしながら、階層化ソーティングを行い、かつ各ソーティングラウンドで標的を濃縮することにより、そのような稀な事象は回収され得る。
たとえば、第１のラウンドでは、各ドロップレットおよび／またはＧＵＶが、約１０，０００個の実体を含有するよう、試験用の１００億個の実体が、１００万個の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ中に隔離され得る。標的実体が１０億個中に１個で存在するならば、そのようなサンプルにおいて、標的を含有することからポジティブであるのは、多くとも１０個の単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶであろう。これらはソートされることになり、それぞれが１０，０００個の実体を提供して、所望される１０個が混合されている総数１００，０００個の実体が得られる。場合によっては、この濃縮は十分であり得るが、１００％の純度にさえもさらに濃縮することが所望される場合もあり得る。この場合、階層化ソーティングアプローチが使用され得、たとえば、１０個のドロップレット中の１個が１つの実体を含有するように、１００，０００個の実体が１００万個のドロップレット中にロードされ、ローディングはポアソン分布に従う。この例では、標的についてポジティブであると判定される大部分のドロップレットは、その標的実体のみを含有することになるが、ポアソンローディングのランダムな性質に起因して、ポジティブなものと偶然共封入されたネガティブなオフターゲット実体を含有するものも一部あるであろう。
１００万個のドロップレットが分析およびソートされる場合、ここでも１０個が標的実体を含有すると判定され、ソーティングにより回収されることになり、標的についてほぼ完全に純粋である、高度に濃縮された集団が提供される。さらに濃縮するために、ソーティングの更なるラウンドが行われ得る。階層化ソーティングの倍率は、この場合、最終濃縮が個々の濃縮の乗法の積となることである。たとえば、方法が１ラウンドで最大１０３濃縮することができるならば、同サンプルに２回ソーティングを行うことにより、最終濃縮は１０３×１０３＝１０６となり、もう１回のラウンドにより、たとえば１０９の最終濃縮が実現されることになる。さらに、濃縮は、ユーザーの所望に応じて、各ラウンドで類似しても異なってよい。たとえば、関係が少数である第１のラウンドが、例として１０３の濃縮を実現するために用いられ得ることから、より集約的なラウンドが１０６の濃縮を行うのために用いられ得ると、ここでも１０９の最終濃縮が得られる。これらの値は、必要に応じて、特定の用途について最適化するように調節され得るが、階層化ソーティング法は、一般に、濃縮倍率が有限であっても、大規模な集団から極端に稀な事象を濃縮することができる非常に強力な利点を提供する。
開示されるＰＣＲ活性化ソーティングによる濃縮法を使用する場合、各濃縮が成功し、かつ溶液中の標的の濃度が増大することを保証することを特別に考慮する必要もあり得る。たとえば、大きな集団中の非常に稀なウイルスを検出することが目的であるならば、第１のラウンドでは、ウイルスゲノム中の特定の配列に対して増幅プライマーが生じ得る。これらが、ソートされたチャンバー内に収集されることになる領域の多くのコピーを産出することになる。この同領域が更なるソーティングラウンドに用いられるならば、より初期のラウンドの産物アンプリコンが検出およびソートされることになり、多数のポジティブ事象が、大きな濃縮を達成する方法の倍率を衰退させることになる。この例では、後のラウンドにおけるプライマーは、より初期のラウンド由来の増幅産物を検出しないように修飾され得る。これは、たとえば、後のラウンドにおけるプライマーが、初期のラウンドにおいて用いられる領域を越えたところから増幅することで、初期のラウンド由来の産物が後のラウンドで増幅できないネステッドＰＣＲアプローチを使用することを含むいくつかの方法で達成され得る。あるいは、完全に異なった領域、たとえば同じ遺伝子の異なる部分、または異なる遺伝子の全体が後のラウンドで標的とされ得る。これらの方法の組合せもまた、高度に濃縮されたサンプルを達成するために用いられ得る。
適切な対象および／またはサンプル
主題の方法は、さまざまな異なる対象から取得される生体サンプルに適用され得る。多くの実施形態では、対象は「哺乳類」または「哺乳綱」であり、これらの用語は、食肉目（たとえば、イヌおよびネコ）、齧歯目（たとえば、マウス、モルモットおよびラット）、ならびに霊長目（たとえば、ヒト、チンパンジーおよびサル）を含む、哺乳綱に属する生物を記載するのに広く用いられる。多くの実施形態では、対象はヒトである。主題の方法は、双方の性別の、そしてあらゆる成長ステージ（すなわち、新生児、乳児、少年少女、青年、成人）のヒト対象に適用され得、ある実施形態では、ヒト対象は、少年少女、青年または成人である。本発明は、ヒト対象に適用され得る一方で、主題の方法はまた、他の動物対象（すなわち、「非ヒト対象」）、たとえば、以下のものに限定されないが、鳥類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜およびウマに実行され得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書に記載される評価が必要なあらゆる対象が適していることが理解されるべきである。
さらに、適切な対象として、症状、たとえば癌と診断された対象、およびそのように診断されなかった対象が挙げられる。適切な対象として、１つまたは複数の癌の臨床像を示している対象、および示していない対象が挙げられる。ある態様では、対象は、１つまたは複数の因子、たとえば家族歴、化学物質曝露および／または環境曝露、遺伝子変異（たとえば、ＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２変異）、ホルモン、感染因子、放射線曝露、ライフスタイル（たとえば、食事および／または喫煙）、１つまたは複数の他の疾患症状の存在などにより、癌を発病するリスクがあり得る対象であってよい。
上記でより完全に記載されるように、生体サンプルのさまざまな異なるタイプを、そのような対象から得ることができる。ある実施形態では、全血が対象から抽出される。所望される場合、全血は、主題の方法を実行する前に、たとえば遠心分離、分別、精製などにより処理されてよい。対象から抽出される全血サンプルの容量は、１００ｍＬ以下であってよく、たとえば、約１００ｍＬ以下、約５０ｍＬ以下、約３０ｍＬ以下、約１５ｍＬ以下、約１０ｍＬ以下、約５ｍＬ以下、または約１ｍＬ以下である。
本明細書に記載される主題の方法およびデバイスは、固定細胞および生きた細胞の双方と適合する。ある実施形態では、主題の方法およびデバイスは、生きた細胞で実行される。他の実施形態では、主題の方法およびデバイスは、固定細胞で実行される。細胞サンプルの固定により、サンプルは、下流解析に干渉し得る小さな分子および脂質を抽出するために洗浄され得る。さらに、細胞の固定および透過化処理により、細胞は、表面タンパク質および細胞内タンパク質用の抗体で染色され得る。本明細書に記載される核増幅法と組み合わされて、そのような染色は、高いレベルの多重化を達成するために用いられ得る。なぜなら、抗体は細胞サンプルに局在化する一方で、核増幅産物は単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションの単分散ドロップレットおよび／またはＧＵＶ内に遊離しているからである。そのような構成により、同じ色の色素が、抗体に、および核酸増幅により生成されるアンプリコンに用いられ得る。細胞を固定するために用いられ得る任意の適切な方法として、これにはホルムアルデヒド、メタノール、および／またはアセトンを使用した固定が挙げられるが、これらに限定されない。
酵素結合プローブを用いたタンパク質またはＤＮＡの検出
本明細書に記載される方法およびデバイスは、異質溶液中の実体を検出およびソートするさまざまな方法に用いられ得る。これまで記載された実施形態のいくつかは、これを、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレット、たとえば二相エマルションおよび／もしくはＧＵＶにおいて行われる核酸増幅を用いて達成するが、本明細書に記載されるように可能とされる他の方法もある。たとえば、開示される方法およびデバイスが核酸を検出するために用いられる場合、これは、たとえば、個々の核酸実体を単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入してから、それらを標的核酸に特異的なプライマーによる増幅に供して、標的アンプリコンを検出してから、増幅に基づいてソートすることにより達成され得る。しかしながら、他の検出可能なシグナルが、他の手段を用いて、たとえば親和性試薬を標的に結合することにより生じ得る。たとえば、標的が核酸であるならば、標的に特異的であり、存在する場合、標的にハイブリダイズし得るプローブが合成され得、これらのプローブは、色素で、または場合によっては、触媒、たとえば酵素ベースの触媒または非酵素ベースの触媒で標識され得る。今やそれらのプローブにより結合された標的は、結合していないプローブを除去するために精製に供され得、残る物質は、本明細書に記載される方法を用いて、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに封入され得る。
触媒結合プローブの場合、触媒用の基質もまた、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶ内に含まれ得る。この例では、標的を含有する単分散の単相エマルションまたは多相エマルションが、プローブと結合することになるので、触媒を含むことになり、基質の触媒反応および産物の生成が起こり、これは、たとえば蛍光性であり得る。これにより、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶは、蛍光産物で経時的に満たされることになる。対照的に、空であるか、またはオフターゲット分子を含有する単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、触媒を含有することとはならず、産物が生成しないので、検出可能なシグナルを発しない。そのようなアプローチの結果生じるのは、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶの大きなコレクションであり、これらは、蛍光性であるものもあれば薄暗いものもあるので、蛍光を発し封入する単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶをソートすることにより標的の回収が可能になる。この手順はまた、親和性試薬、たとえば抗体と結合し得る、他の種類の標的、たとえば生体分子、ウイルス、細胞などに適用され得る。この場合、親和性試薬は、たとえば、触媒と結合して、核酸プローブにより結合された核酸標的について上記で記載される手順が行われる。
これらの双方の例では、洗浄が実施されて、結合していない触媒が除去され得、この触媒は、洗浄されかった場合、単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶに封入されて、偽ポジティブをもたらすことになる。しかしながら、結合していない触媒を除去するための洗浄が所望されないか、または可能でない場合、代わりのアプローチとして、たとえば、ポジティブ事象を同定するために２つのシグナルの局在化が用いられる多重化アッセイが用いられることになる。たとえば、溶液中にある核酸標的を検出することが目的であるならば、標的上の２つの異なる配列用のプローブが合成され得、それぞれに異なる触媒が結合しており、これがたとえば、蛍光産物をもたらす反応を実行する。一実施形態では、異なる触媒用の蛍光産物は、色が異なり得、たとえば、一方が緑色の蛍光産物を、他方が赤色の蛍光産物をもたらす。プローブは、通常どおり、標的に結合し得る。この場合、多くの結合していないプローブが溶液に存在することになる一方、大部分の例では、第１のタイプの触媒に相当するプローブは、触媒が異なる第２のプローブに、これら双方が同じ標的核酸に結合しない限り、物理的に結合することはない。
溶液はまた、必要に応じて、高濃度でのハイブリダイゼーションを実行するために希釈され得る。次いで、任意の所定のドロップレット等容量の溶液が、１つのプローブのみか、または双方のプローブが結合した標的を含有することになるように濃度が低下され得る。次いで、この溶液は、触媒用の基質と共に封入され、インキュベートされ、検出され、かつソートされ得る。この実施形態では、多くの単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶが、赤色の触媒または緑色の触媒のみを含有することになるが、他のものは、赤色および緑色の双方（標的に結合されている）を含有することになる。これにより、標的核酸を含有するドロップレットと触媒しか含有しないものとは、双方の波長にて蛍光ドロップレットを、洗浄する必要なく検出することにより、区別できるようになるだろう。
ここでも、双方の触媒の結合していないプローブが同じドロップレットに偶然共封入される場合に偽ポジティブが生じ得るが、これは、この事象が標的の存在よりも実質的に稀であることを保証するのに十分溶液を希釈することにより軽減され得るので、同定されるダブルポジティブな単分散の単相エマルションドロップレットまたは多相エマルションドロップレットおよび／もしくはＧＵＶは、ほとんどの場合、標的の存在を伴い得る。異なる種類の親和性試薬、たとえば抗体のような結合分子を用いる類似の技術が、細胞またはタンパク質のような他の種類の標的に適用され得、試薬はここでも、反応性が異なる触媒などに結合し得る。
癌の検出
本明細書に記載される方法はまた、癌を検出する方法に関する。そのような方法は、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに、対象由来の生体サンプルから得られたオリゴヌクレオチドを封入するステップであって、ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに存在するステップ；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、検出成分、および複数のＰＣＲプライマーを、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶに導入し、ＰＣＲ増幅がＰＣＲ増幅産物を生成し得る条件下で、単分散の単相エマルションドロップレット、多相エマルションドロップレットおよび／またはＧＵＶをインキュベートするステップであって、ここで、複数のＰＣＲプライマーは、それぞれが１つまたは複数のオンコジーンにハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含むステップ；ならびに検出成分の検出によりＰＣＲ増幅産物の有無を検出するステップであって、ここで、検出成分の検出は、ＰＣＲ増幅産物の存在を示すステップを含んでよい。
１つまたは複数のオンコジーンに相当する１つまたは複数のＰＣＲ増幅産物の検出は、対象が癌を有することを示し得る。ドロップレットに加えられる特定のオンコジーンは、さまざまであり得る。ある態様では、オンコジーンは、特定のタイプの癌、たとえば、乳癌、結腸癌等に特異的であり得る。
さらに、主題の方法を実行する際に、成分が検出されることになる生体サンプルは、さまざまであってよく、検出が試みられる特定のタイプの癌に、少なくとも部分的に基づいてよい。例として、対象が乳癌を有するかを判定することが所望されるならば、ある例では、乳房組織が生体サンプルとして用いられ得ることなどが挙げられる。癌を検出する方法を実行する際に、本明細書に記載される通常のステップへの何らかの変形がなされてもよく、たとえば、加えられてよいプライマーの数、試薬が加えられる方法、適切な対象等がある。上記の方法は、多相エマルションドロップレットの代わりに単相エマルションドロップレットを用いて行うこともできる。
本開示の例示的な非限定的態様
上記で記載される本主題の、実施形態を含む態様が、単独でも、１つもしくは複数の他の態様または実施形態と組み合わされても、有益であり得る。前述の記載を限定することなく、１〜７３の番号を付した本開示の特定の非限定的な態様が、以下に提供される。本開示を読めば当業者に明らかとなるように、個々に番号を付した各態様が用いられてもよいし、先行する、または後に続く、個々に番号を付した態様のいずれかと組み合わされてもよい。これは、態様のそのような全組合せを支持することが意図されており、以下に明示的に記載される態様の組合せに限定されない：
１． 単分散エマルションを生成する方法であって、上記方法は、以下：
複数の単分散テンプレート粒子を、複数の標的粒子を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップ；
上記第１の混合物を、上記第１の流体と混和しない第２の流体と組み合わせて第２の混合物を提供するステップ；および
上記第２の混合物を剪断することで、上記複数の単分散テンプレート粒子を上記第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させて、それにより上記第１の流体、上記単分散テンプレート粒子の１つ、および上記複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップ
を含む、方法。
２． 上記複数の単分散テンプレート粒子を上記第１の流体と組み合わせて上記第１の混合物を提供するステップが、上記第１の流体の一部を上記単分散テンプレート粒子に吸収させるステップを含む、１に記載の方法。
３． 上記第１の流体の一部を上記単分散テンプレート粒子に吸収させた後、上記第１の混合物から過剰な第１の流体を除去するステップを含む、１に記載の方法。
４． 上記複数の単分散テンプレート粒子を上記第１の流体と組み合わせて上記第１の混合物を提供するステップが、上記第１の流体の一部を単分散テンプレート粒子に流入させるステップを含む、１に記載の方法。
５． 上記単分散テンプレート粒子がヒドロゲルを含む、１から４のいずれか一つに記載の方法。
６． 上記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、およびそれらの組合せから選択される、５に記載の方法。
７． 上記第１の流体が水相流体を含む、１から６のいずれか一つに記載の方法。
８． 上記第２の流体が油を含む、１から７のいずれか一つに記載の方法。
９． 上記油が、フルオロカーボン油、ハイドロカーボン油、またはそれらの組合せを含む、８に記載の方法。
１０． 上記第２の流体が、上記第２の流体に溶解する界面活性剤を含む、１から９のいずれか一つに記載の方法。
１１． 上記第１の流体が、上記第１の流体に溶解する界面活性剤を含む、１から１０のいずれか一つに記載の方法。
１２． 上記第１の流体に溶解する上記界面活性剤が、オクチルフェノールエトキシレートおよび／またはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含む、１１に記載の方法。
１３． 上記方法がマイクロフルイディクスを利用しない、１から１２のいずれか一つに記載の方法。
１４． 剪断後、上記第２の流体が、上記単分散テンプレート粒子の１つを含まない複数のドロップレットを含む、１から１３のいずれか一つに記載の方法。
１５． 単分散テンプレート粒子を含む単分散ドロップレットを、上記単分散テンプレート粒子の１つを含まないドロップレットと比べて濃縮するステップを含む、１４に記載の方法。
１６． 上記単分散テンプレート粒子の１つを含まない１つまたは複数のドロップレットを、濾過または遠心分離により上記単分散エマルションから除去する、１５に記載の方法。
１７． 上記単分散ドロップレットが平均直径を有し、かつ上記単分散テンプレート粒子の１つを含まない上記複数のドロップレットが、上記単分散テンプレート粒子の平均直径よりも小さい平均直径を有する、１４から１６のいずれか一つに記載の方法。
１８． 上記剪断が、
上記第２の混合物をピペットチップに流すステップ、
上記第２の混合物をホモジナイザーで振とうするステップ、または
上記第２の混合物をビードビーターで振とうするステップ
を含む、１から１７のいずれか一つに記載の方法。
１９． 上記単分散ドロップレットに封入された上記単分散テンプレート粒子を膨潤させるステップを含む、１から１８のいずれか一つに記載の方法。
２０． 上記標的粒子がＤＮＡ分子である、１から１９のいずれか一項に記載の方法。
２１． 上記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡ分子である、２０に記載の方法。
２２． 上記標的粒子がＲＮＡ分子である、１から１９のいずれか一項に記載の方法。
２３． 上記標的粒子が細胞である、１から２２のいずれか一つに記載の方法。
２４． 上記単分散ドロップレットが、ドロップレットあたり１つまたは複数の細胞を含む、２３に記載の方法。
２５． 上記単分散ドロップレットが、ドロップレットあたり１つより多くの細胞を含まない、２３に記載の方法。
２６． 上記細胞溶解試薬を上記単分散ドロップレット中に組み込むステップをさらに含む、１から２５のいずれか一つに記載の方法。
２７． 上記複数の単分散テンプレート粒子を上記複数の単分散ドロップレットに封入する前に、上記細胞溶解試薬が上記第１の混合物に存在している、２６に記載の方法。
２８． 細胞溶解試薬が界面活性剤を含まない、２６または２７に記載の方法。
２９． 上記細胞溶解試薬がプロテイナーゼＫを含む、２６から２８のいずれか一つに記載の方法。
３０． 上記単分散ドロップレットをソーティングするステップをさらに含む、１から２９のいずれか一つに記載の方法。
３１． 上記ソーティングが、誘電泳動偏向、選択的合一、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、フロー制御、または単分散ドロップレットを選択的に偏向するために用いられる他の刺激により行われる、３０に記載の方法。
３２． 上記標的粒子が核酸であり、かつ上記複数の標的粒子を含む上記第１の流体がさらに核酸合成試薬を含み、かつ上記核酸合成試薬が上記単分散ドロップレットに封入されている、１から３１のいずれか一つに記載の方法。
３３． 上記第１の流体および上記複数の標的粒子の１つまたは複数を含む上記単分散ドロップレットの１つまたは複数を核酸合成条件に供するステップを含む、３２に記載の方法。
３４． 上記核酸合成試薬が核酸増幅試薬を含む、３２に記載の方法。
３５． 上記第１の流体および上記複数の標的粒子の１つまたは複数を含む上記単分散ドロップレットの１つまたは複数を核酸増幅条件に供するステップを含む、１から３４のいずれか一つに記載の方法。
３６． 上記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数から核酸を単離するステップを含む、１から３４のいずれか一つに記載の方法。
３７． 上記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数から核酸合成物および／または増幅産物を単離するステップを含む、３６に記載の方法。
３８． 上記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数から単離された核酸および／または核酸合成物および／または増幅産物をシーケンシングするステップを含む、１から３７のいずれか一つに記載の方法。
３９． 上記核酸増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬または多置換増幅（ＭＤＡ）試薬を含み、かつ上記核酸増幅条件が、それぞれＰＣＲ条件またはＭＤＡ条件を含む、３４に記載の方法。
４０． 上記核酸増幅試薬が等温核酸増幅試薬を含み、かつ上記核酸増幅条件が等温核酸増幅条件を含む、３４に記載の方法。
４１． 上記複数の標的粒子を含む上記第１の流体が、上記単分散ドロップレットに封入されている核酸検出試薬を含む、１から４０のいずれか一つに記載の方法。
４２． 上記検出試薬の１つまたは複数を検出することにより、上記標的粒子の１つまたは複数、その一部、その核酸合成産物、および／またはその核酸増幅産物を検出するステップを含む、４１に記載の方法。
４３． 上記標的粒子の１つまたは複数、上記核酸合成試薬、および上記核酸検出試薬を上記単分散テンプレート粒子の１つまたは複数に付着させるステップを含む、１から４２のいずれか一つに記載の方法。
４４． 上記標的粒子の１つまたは複数、上記核酸合成試薬、および上記核酸検出試薬が、上記単分散テンプレート粒子上または上記単分散テンプレート粒子中に配置された１つまたは複数の係留部分を介して単分散テンプレート粒子に付着させられる、４３に記載の方法。
４５． １つまたは複数の係留部分が、上記単分散テンプレート粒子上または上記単分散テンプレート粒子中に結合しているオリゴヌクレオチドである、４４に記載の方法。
４６． 上記１つまたは複数の係留部分が、上記単分散テンプレート粒子に封入されている官能化ビーズである、４４に記載の方法。
４７． 上記単分散ドロップレットのそれぞれが、試薬を含む別個の区画を含む、１から４６のいずれか一つに記載の方法。
４８． 上記別個の区画から上記試薬を放出するステップを含む、４７に記載の方法。
４９． 上記単分散テンプレート粒子が平均体積を有し、かつ上記方法が、上記単分散テンプレート粒子を収縮させて平均体積を減少させるステップを含む、１から４８のいずれか一つに記載の方法。
５０． 上記単分散テンプレート粒子が第１のタイプの粒子であり、かつ上記方法が、上記第１のタイプの粒子の１つまたは複数を有するドロップレット中に第２のタイプの粒子の１つまたは複数を封入するステップを含む、１から４９のいずれか一つに記載の方法。
５１． 上記第２の混合物の上記剪断に続いて、上記第２の混合物から過剰な第２の流体を除去するステップを含む、１から５０のいずれか一つに記載の方法。
５２． 上記第２の混合物から過剰な第２の流体を除去するステップが、上記混合物を遠心分離し、上清を除去するステップを含む、５１に記載の方法。
５３． 上記第２の混合物の上記剪断に続いて、第３の流体を上記第２の混合物と組み合わせて第３の混合物を生成するステップを含み、ここで、上記第３の流体は上記第２の流体と混和しない、１から５２のいずれか一つに記載の方法。
５４． 上記第２の混合物の上記剪断に続いて、上記第３の流体を上記第２の混合物と組み合わせて第３の混合物を生成するステップを含み、ここで、上記第３の流体は上記第１および第２の流体と混和しない、１から５２のいずれか一つに記載の方法。
５５． 上記第３の流体が水相流体を含む、５３に記載の方法。
５６． 上記第３の流体が油を含む、４９または５４に記載の方法。
５７． 上記第３の流体が、上記第３の流体に溶解する界面活性剤を含む、５３から５６のいずれか一つに記載の方法。
５８． 上記第３の混合物を剪断して、上記単分散テンプレート粒子を上記第３の流体中の二相エマルションドロップレットに封入するステップを含む、５３から５７のいずれか一つに記載の方法。
５９． 上記第３の混合物を剪断して、上記単分散テンプレート粒子の有無にかかわらず、上記単分散ドロップレットの１つまたは複数を上記第３の流体中の１つまたは複数のドロップレットに封入して、１つまたは複数の二相エマルションドロップレットを提供するステップを含む、５３から５３のいずれか一つに記載の方法。
６０． 上記第３の流体がゲル化剤を含む、５３から５９のいずれか一つに記載の方法。
６１． 上記単分散ドロップレットの７５％以上が、１つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む、１から６０のいずれか一つに記載の方法。
６２． 上記単分散ドロップレットの８５％以上が、１つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む、１から６０のいずれか一つに記載の方法。
６３． 上記単分散ドロップレットの９５％以上が、１つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む、１から６０のいずれか一つに記載の方法。
６４． 上記単分散テンプレート粒子の７５％以上が、上記第２の流体中の単分散ドロップレットに封入されている、１から６２のいずれか一つに記載の方法。
６５． 上記単分散テンプレート粒子の９０％以上が、上記第２の流体中の単分散ドロップレットに封入されている、１から６２のいずれか一つに記載の方法。
６６． 上記単分散テンプレート粒子が親油性ポリマーを含む、１から６５のいずれか一つに記載の方法。
６７． 複数の単分散テンプレート粒子を、複数の細胞および細胞溶解試薬を含む第１の流体と組み合わせて第１の混合物を提供するステップ；
上記第１の混合物を、上記第１の流体と混和しない上記第２の流体と組み合わせて上記第２の混合物を提供するステップ；
上記第２の混合物を剪断することで、上記複数の単分散テンプレート粒子を上記第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させて、それにより上記第１の流体、上記単分散テンプレート粒子の１つ、上記細胞溶解試薬、および上記複数の細胞の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供するステップ；
上記複数の単分散ドロップレットが提供されるまで、上記細胞溶解試薬の活性化を妨げるのに十分な温度で上記細胞溶解試薬を維持するステップ；ならびに
上記複数の単分散ドロップレットの提供に続いて、上記複数の単分散ドロップレットを、上記細胞溶解試薬の活性化および上記複数の細胞の１つの溶解に十分な温度でインキュベートするステップ
を含む、方法。
６８． 上記細胞溶解試薬がプロテイナーゼＫを含む、６７に記載の方法。
６９． 上記細胞溶解試薬が界面活性剤を含まない、６７または６８に記載の方法。
７０． 上記複数の単分散ドロップレットを破裂させるステップを含む、６７から６９のいずれか一つに記載の方法。
７１． 上記第１の流体が複数のＲＮＡ捕捉ビーズを含む、６７から７０のいずれか一つに記載の方法。
７２． 上記単分散テンプレート粒子が、その中に組み込まれた１つまたは複数のＲＮＡ捕捉ビーズを含む、６７から７０のいずれか一つに記載の方法。
７３． 上記ＲＮＡ捕捉ビーズにより捕捉されたＲＮＡ分子をシーケンシングするステップを含む、７１または７２に記載の方法。
以下の実施例は、当業者に、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために提示され、発明者らが発明とみなすものの範囲を制限することを意図するものでもなく、以下の実験が、行われたすべての実験または唯一の実験であると表すことを意図するものでもない。用いられる数字（たとえば、量、温度など）に関する精度を保証する努力がなされたが、実験の誤差および偏差がいくらか占めているはずである。特に明記しない限り、部および重量部、分子量は、重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力はほぼ気圧である。標準的な略語、たとえば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ、筋肉内；ｉ．ｐ、腹腔内、ｓ．ｃ、皮下などが用いられ得る。
材料および方法
以下の材料および方法は、明示している場合を除いて、本明細書に記載される実施例に提示された結果に一般に適用される。
単分散ヒドロゲル粒子の調製
単分散ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）粒子を、６．２％アクリルアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１８％Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．３％過硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて生成した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）粒子を、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３中１４％（ｗ／ｖ）の８アームＰＥＧＳＨ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓ）および１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３中ＰＥＧＤＡ（６ｋＤＡ）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓ）を用いて生成した。アガロース粒子を、１％の低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて生成した。固化を防ぐために、乳化中にアガロース懸濁液をスペースヒーターで温めた。アガロースとＰＥＧ溶液を、シリンジポンプ（Ｎｅｗ Ｅｒａ，ＮＥ−５０１）を用いて、油（５％（ｗ／ｗ）脱プロトン化Ｋｒｙｔｏｘ １５７ ＦＳＨが補充されたＨＦＥ−７５００フッ素化油）と共にドロップレット生成器デバイス（図１）に注入した。ＰＡＡ溶液は、１％テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）が補充されたフッ素化油と共にドロップレット生成デバイスに注入した。ヒドロゲル溶液と油を別々の１ｍＬシリンジ（ＢＤ）にロードし、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトで制御されたシリンジポンプを用いて、それぞれ３００および５００μｌでドロップレット生成デバイスに注入した（「ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＡｂａｔｅＬａｂ／Ｐｕｍｐ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｐｒｏｇｒａｍ」の前に「ｈｔｔｐｓ：／／」を配置してあるＷｅｂサイトの例を参照）。ＰＡＡおよびＰＥＧドロップレットを収集し、ゲル化のために室温で１時間インキュベートした。アガロースドロップレットをゲル化のために氷上でインキュベートした。ゲル化後、ゲル化したドロップレットを、ＨＦＥ−７５００に等容量の２０％（ｖ／ｖ）パーフルオロ−１−オクタノールを加えて油中で不安定化することにより、水性キャリアに移した。残留油を除去するために、２％Ｓｐａｎ−８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むヘキサンで粒子を２回洗浄した。ヘキサン洗浄の後、油が除去されるまで粒子を滅菌水で洗浄した。ドロップレットを、ＥＶＯＳセルイメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて画像化した。ＥＶＯＳ ＦＩＴＣ ＬＥＤ光源を用いて、４倍および１０倍の対物レンズの下で画像を撮影した。
デバイス製作
単分散ヒドロゲル粒子の作製に用いられるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）デバイスは、シリコンウエハー上のフォトリソグラフィーでパターン化されたフォトレジスト層（ＳＵ−８ ３０２５，ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）の一面に未硬化のＰＤＭＳ（１０：１のポリマーと架橋剤の比率）を注ぐことにより製作した。デバイスを８０℃のオーブンで１時間硬化させ、メスで切除し、０．７５ｍｍの生検パンチャー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，＃５０４５２９）を用いて注入口に穴を開けた。デバイスは、酸素プラズマを用いてガラススライドに結合し、チャネルの内面は、Ａｑｕａｐｅｌ（ＰＰＧ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で処理して疎水性にした。密封されたデバイスを８０℃で１０分間焼き付けた。
ｄＰＣＲ
単分散ＰＡＡ粒子または市販のＰＡＡ粒子（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、滅菌水中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄した。３３μＬの洗浄したＰＡＡ粒子を１７μＬのＰＣＲ試薬と混合して、総反応量を５０μＬにした。５０μＬの混合物には、１×ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ反応バッファー（ＮＥＢ）、２ユニットのＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、０．６μＭのフォワードとリバースのプライマー（ＩＤＴ）、０．６μＭのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ＩＤＴ）、３００μＭのｄＮＴＰ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および可変量の出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミケス・セレビシエ）ゲノムＤＮＡ（ミリポア）が含まれていた。多重化ｄｄＰＣＲでは、追加の０．６μＭのフォワードプライマーとリバースプライマー、およびラムダウイルスＤＮＡ用のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが含まれていた。使用したプライマーとプローブの配列は、酵母ＦＷＤ：５’−ＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡ−３’（配列番号：１）、酵母ＲＥＶ：５’−ＡＣＡＣＧＴＡＴＧＴＡＴＣＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＡＣ−３’（配列番号：２）、酵母プローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＡＴＡＴＧＴＴＧＴ／ＺＥＮ／ＴＣＡＣＴＣＧＣＧＣＣＴＧＧＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号：３）、ラムダＦＷＤ：５’−ＧＴＧＧＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＡＧ−３’（配列番号：４）、ラムダＲＥＶ：５’−ＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＡＴＴ−３’（配列番号：５）、ラムダプローブ：５’−／Ｃｙ５／ＴＡＴＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＡＴＣＧＡＣＣＧＴＴＧ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／−３’（配列番号：６）であった。混合物を１５分間インキュベートしてＰＣＲ試薬を粒子に拡散させ、６，０００ｇで１分間遠心分離した。マイクロピペットで過剰な水相を除去した。２０μＬの粒子と２％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤（００８−フッ素系界面活性剤、Ｒａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充された２５μＬのＨＦＥ−７５００油を、１．７ｍＬエッペンドルフチューブ内でタッピングすることでよく混合した。混合物をボルテクサー（ＶＷＲ）で２，３００ｒｐｍにて３０秒間撹拌した。エマルションをＰＣＲチューブに移した後、浮遊するドロップレットの下の油をピペットで除去し、５％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤を含むＦＣ−４０油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で置き換えた。この油／界面活性剤の組合せにより、ＰＣＲ中の熱安定性がより向上した。エマルションをＴ１００サーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、次のプログラムに供した：９４℃で３０秒、続いて４５回のサイクル数にて９４℃で３０秒、５３℃で６０秒および６５℃で５０秒、続いて最終伸張を６５℃で１０分および１２℃で保持。ドロップレットは、ＥＶＯＳ ＧＦＰおよびＦＩＴＣ ＬＥＤ光源を備えた１０倍および２０倍の対物レンズの下でＥＶＯＳセルイメージングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて画像化した。
細胞培養
黄色の蛍光タンパク質（ＹＳＰ）蛍光を発現する出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を３０℃にて標準リッチ培地（ＹＰＤ）中で増殖させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞密度を測定した。ＰＡＡ粒子をＹＰＤ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎで洗浄し、遠心分離して過剰の水を除去した。希釈された酵母懸濁液を、ドロップレットあたりのポアソン分布の細胞占有率を達成するために調製した。１μＬの酵母懸濁液、２０μＬの粒子および２５μＬの２％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤を含むＨＦＥ−７５００油を、１．７ｍＬのエッペンドルフチューブ内でタッピングすることでよく混合した。混合物を２，３００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスした。酵母細胞の酸素交換のためにチューブの蓋に穴を開け、１ｍＬのＹＰＤ培地を加えた。細胞を３０℃で１０時間インキュベートし、ＥＶＯＳ ＲＦＰおよびＦＩＴＣ ＬＥＤ光源を備えた２０倍の対物レンズの下でＥＶＯＳセルイメージングを用いて画像化した。
単分散エマルションの生成のスケールアップ
エマルションを、０．３％ＩＧＥＰＡＬに単分散ＰＡＡ粒子を再懸濁し、再懸濁したＰＡＡ粒子２０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加えることにより生成した。組み合わせた混合物を２９００ｒｐｍで１分間ボルテックスするか、あるいは３０回ピペッティングして９６個の単分散エマルションを得た。
ＰＴＥによる二相エマルション（リポソーム）の生成
単相エマルションを、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００の内水相中のポリアクリルアミドビーズを用いて、テーブルトップボルテクサー（ＶＷＲ製）で速度１０にて１分間ボルテックスすることにより形成した。リポソームを、５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８および０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００の外部水溶液を加え、続いてテーブルトップボルテクサー（ＶＷＲ製）で速度７にて２０秒間ボルテックスした。二相エマルションの一種であるリポソームを、５％（ｗ／ｖ）のモノオレイン酸グリセリルと５ｍｇ／ｍｌのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含有するスクアラン混合物の油相中に蛍光脂質を追加で含んで形成した。
ＰＴＥによるハイスループットｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ
新しい技術は、スループットを増加させ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅで説明されるプロトコルを簡略化することにより、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑの能力を拡張した（たとえば、ＣｈｅｍｇｅｎｅｓのＷｅｂサイトを参照）。Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズを、ビス（アクリロイル）シスタミンをポリアクリルアミドビーズ合成用の架橋剤として使用して、ＢＡＣポリアクリルアミドヒドロゲルに封入した。細胞、プロテイナーゼＫ、およびハイブリダイゼーションバッファーを、ＢＡＣポリアクリルアミドビーズと共に４℃で混合した。２−メルカプトエタノールで予め飽和させた油を加えた。混合物を乳化するためにボルテックスした。ドロップレットヒドロゲルの解離中に、２−Ｍｅがドロップレット中に拡散し、ＢＡＣポリアクリルアミド粒子の解離とＤｒｏｐ−ｓｅｑビーズの放出につながった。５５℃で１５分間のプロテイナーゼＫインキュベーションにより細胞溶解を行った。Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズ上にＲＮＡを捕捉した。Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズを回収した。逆転写酵素のシーケンシングとデータ分析を行った。
・種混合実験
マウス３Ｔ３細胞とヒトＨＥＫ２９３細胞を洗浄し、再懸濁し、１：１の比率で混合し、ＰＢＳバッファー中に保存した。Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズを含むポリアクリルアミド粒子を、以下により詳しく説明するように、Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズを溶液に加えて、ポリアクリルアミド粒子合成と同じプロトコルを用いて合成した。合成された粒子は直径１２５μｍであった。
ヒドロゲルビーズの合成
ヒドロゲル粒子の合成に使用したＢＡＣヒドロゲル混合物は、次のとおりである；Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＮａＣｌ １５ｍＭ、アクリルアミド６．２％、ＢＡＣ（２％のエタノールに溶解したビスアクロイルシスタミン（ＢＡＣ））０．５４％、過硫酸アンモニウム０．３％、および１％ＴＥＭＥＤと共にＨＦＥ２％（Ｗｅｉｔｚ）を含む油。
標準的なＤｒｏｐ−ｓｅｑデバイスをヒドロゲル合成に使用した（銀のはんだ片でセル入口チャネルをブロック）。Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズを、ＢＡＣヒドロゲル合成ミックスにおいて１０ドロップレットあたり１ビーズを達成する目的で、１００／μｌの濃度で再懸濁した。流量は２０００μｌ／ｈの水溶液および３２００μｌ／ｈの油であった。ドロップレット生成後、ドロップレットを、脱乳化前に室温で４時間放置した。ＴＢＥＳＴバッファーを使用した同じ洗浄プロトコルに従い、ＴＢＥＳＴバッファーで４℃にて保存した。
ビーズのサイズ（通常はほぼドロップレットのサイズ）とＤｒｏｐ−ｓｅｑのローディング効率を調べた。Ｄｒｏｐ−ｓｅｑをロードしたビーズの割合を増加させるために、４０％フィコールを用いてヒドロゲルを再懸濁し、続いて遠心分離（５００ｇで２分間）することができた。より優れたローディング効率を達成するために、必要に応じてこのステップを繰り返した。
本件エマルション生成
単一細胞懸濁液を調製し、適切な濃度に希釈した。ＢＡＣヒドロゲルビーズをＰＴＥ−ｓｅｑバッファー（サルコシルなし、ＤＴＴなし、５００ｍＭ ＮａＣｌありのＤｒｏｐ−ｓｅｑ溶解バッファー）で洗浄して、バッファーを完全に交換した。
ヒドロゲルビーズを遠心分離により最密に充填し、２０倍のプロテイナーゼＫ（ＮＥＢ社）を使用した。混合物を平衡化のために氷上で５分間インキュベートした。ｂＭＥ油を、５％のＷｅｉｔｚ ＨＦＥ油（０．２％）にｂＭＥを加えて調製した。混合物を最高速度で１分間ボルテックスし、十分に混合して、氷上で保存した。
最密充填されたビーズの濃度は、１μｌあたり約３００個のヒドロゲルビーズである。エマルションを振とうするのに必要な細胞の数は、ヒドロゲルビーズの数に基づいて計算した。細胞インプット量は、ヒドロゲルビーズ数の１０％に合わせた。細胞を最密充填されたヒドロゲルビーズに加え、穏やかに混合した。少なくとも２体積のｂＭＥ油ヒドロゲルビーズを加えて、続いて速度７で３０秒間ボルテックスした。顕微鏡を用いてエマルション品質を調べ、必要に応じて、エマルションをさらにボルテックスした。ヒドロゲルの解離を室温で１５分間行い、細胞を５５℃で２０分間溶解してから、氷上に２０分間置いてＲＮＡを捕捉した。
Ｄｒｏｐ−ｓｅｑプロトコル
３０ｍｌの６Ｘ ＳＳＣを加え、エマルションの上にさらに５０μｌの１０％サルコシルを追加し、エマルションを１ｍｌのＰＦＯで破壊した。Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズのクリーンアップ用のＤｒｏｐ−ｓｅｑのプロトコル、ならびにＲＴ反応およびシーケンシング解析を、「ｍｃｃａｒｒｏｌｌｌａｂ．ｃｏｍ／ｄｒｏｐｓｅｑ／」の前に「ｈｔｔｐ：／／」を配置してあるＷｅｂサイトに記載されているプロトコルに従って行った。
ＰＴＥとターゲット解析によるコアシェルマイクロゲルの形成
ポリアクリルアミドビーズを、ＰＣＲ中にプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドと結合させた。ビーズをＰＣＲ試薬に浸漬した。過剰な水溶液を除去した。アガロース、Ｔｒｉｔｏｎおよび細胞を加え、続いて油を加えた。本明細書に記載されるようにＰＴＥを実施した。油を移し、サーモサイクリングを行った。エマルションを破壊し、洗浄した。ＦＡＣＳを使用し、ゲノムを回収する前にポジティブビーズを収集した。
ポリアクリルアミドビーズをオリゴ（ＭＨ ０７５、最終２μＭ）修飾した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（１６８株）を捕捉し、ＭＨ １００および１０１をＰＣＲ用に使用した。蛍光ポジティブドロップレットを含む分画は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（１６８株）のテンプレート濃度に対応していた。ＢＤ社のＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを用いて蛍光ポジティブドロップレットをソートし、顕微鏡下で観察した。ソートされたビーズは蛍光を発し、ＦＡＣＳ後、アガロースシェルで囲まれていた。ｑＰＣＲを、アガロースシェル中のゲノム回収を確認するために行った。異なる遺伝子座の４つのプライマーセットを使用した。３５回のサイクル後にシグナルが観察され、ゲノムＤＮＡをアガロースシェルに封入した。
ＭＨ０７５：／５Ａｃｒｙｄ／／ｉＳｐＰＣ／ＡＴＡＴＴＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣ（配列番号７）
ＭＨ１００：ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＡＣＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡ（配列番号８）
ＭＨ１０１：／５６−ＦＡＭ／ＡＴＧＧＡＧＣＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡ（配列番号９）
実施例１：粒子テンプレート乳化（ＰＴＥ）を使用した単分散の単相エマルションの生成
結果
９５％を超える水性のヒドロゲル粒子をテンプレート用に使用することで、結果として得られるドロップレット中で生化学反応を行うために必要に応じて、最終的なドロップレットの大部分が水性になるようにした。封入されるべき溶液に、粒子を油と界面活性剤と共に加え、混合物をボルテックスした（図２のパネルＡ〜Ｃおよび図３のパネルＡ〜Ｅ）。ヒドロゲル粒子は、小分子のように孔径よりも小さい水力直径を持つ分子には透過性であるが、ドロップレット中の粒子を囲む水溶液の薄層内に残ったゲノムＤＮＡなどの大分子には不透過性であった。（図３のパネルＥ）に示されるように、ボルテックス中、各ドロップレットが１個だけの粒子と水溶液の薄いシェルを含むまで、粒子を継続的により小さいドロップレットに分散させた。これを超えると、固体粒子を破砕する必要があるので、更なるドロップレット崩壊を抑制した。結果は、ドロップレットが元の単分散粒子と同様のサイズであり、したがってそれ自体が単分散であるエマルションであった。
ＰＴＥにより、初期溶液に存在する任意の試薬がドロップレットに封入され、通常はマイクロフルイディクスで達成されるのと同様の区画化された反応が行えるようになった。ヒドロゲルの孔径よりも小さい化合物が、乳化前に吸収され、したがって、ヒドロゲルを含有する最終的なドロップレットに存在することになった。図３のパネルＥに示されるように、より大きな化合物が、ヒドロゲルを囲む水溶液の薄層になった。ピペッティングおよびチューブフリッキングのような他の撹拌技術が互換性を有しているものの、その再現性のためにＰＴＥ用のボルテックスを用いた。
実施例２：粒子テンプレート乳化の最適化
結果
テンプレート粒子の非存在下でボルテックスすることにより調製されたエマルションは容易に調製されたが、そのようなエマルションは多分散性であり、正確な生物学には限界があった（図４のパネルＡ）。図４のパネルＡ（左側）に示されるように、粒子なしのボルテックスされたエマルションは、さまざまなサイズ分布、直径８〜２１８μｍ（ｎ＝５６１）を有する多分散ドロップレットを生成し、ドロップレットの４．３％は３５〜４０μｍである。一方で、マイクロ流体エマルションは特殊なデバイスとスキルを必要としたが、優れた単分散性を示し、非常に価値があった（図４のパネルＡ）。図４のパネルＡ（右側）に示されるように、マイクロ流体エマルションが単分散ドロップレットを生成した：ドロップレットの９５．７％は直径３５〜３８μｍである（ｎ＝８１６）。したがって、サンプル封入のための改善された方法の場合、ボルテックスの簡略さとマイクロフルイディクスの品質を兼ね備えることになる。
ＰＴＥは、ボルテックスを使用した場合であっても、粒子サイズ未満へのドロップレットの崩壊に抵抗する粒子の剛性を利用することで、これを達成した。図４のパネルＣに示されるように、ＰＴＥは、元のＰＡＡ粒子と同様のサイズを生成し、ドロップレットの５８．２％は直径３５〜４０μｍ（ｎ＝１４２１）である。最終的なドロップレットサイズに達するまでの時間と、結果として得られるエマルションの単分散性は、流体と粒子の特性に依存していた。たとえば、サイズや自己親和性などの粒子特性、および粘度や界面張力などの溶液特性が、ドロップレットテンプレートプロセスに影響を及ぼした。エマルション品質に及ぼすこれらのパラメーターの影響を特徴付けるために、ＰＴＥは、異なるヒドロゲル材料と溶液界面張力を用いて行った（図４のパネルＢ）。粒子サイズ、キャリア油、および油溶性界面活性剤を固定した。なぜなら、これらの特性は、通常、生物学的反応の必要性により規定され、柔軟性が低いからである。
界面張力を調整するために、ほとんどの生化学反応と適合性のあるドロップレット相に水溶性界面活性剤を加えた。水相界面活性剤を省いた場合、ボルテックスされたドロップレットは、すべてのタイプのヒドロゲルについて多分散性であった（図４のパネルＢ）。何らかの特定の理論に縛られることを意図するものではないが、これは、粒子間の親和性と大きな界面張力のために、大きくて不均一なマルチコアドロップレットが崩壊しないためと考えられ得る。ボルテックスを最大２０分に増やしても、エマルションの品質は目立って変化しなかった。マルチコアエマルションが観察され、エマルションは多分散性であった（図５のパネルＡ）。対照的に、界面活性剤が水相に含まれている場合、粒子の親和性と界面張力は減少した；単分散の単一コアドロップレットは、３０秒間のボルテックスで生成され（図４のパネルＢ）、より長いボルテックス期間が、結果として得られるエマルションの外観を実質的に変えることはなかった（図６のパネルＡ〜Ｄ）。２％フッ素系界面活性剤を含むＨＦＥ油中に０．５％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＡＡ粒子を使用し、５秒間（図６のパネルＡ）、１５秒間（図６のパネルＢ）、１分間（図６のパネルＣ）および２分間（図６のパネルＤ）ボルテックスした。ヒストグラムは、ボルテックス時間の違いによるドロップレットサイズ分布を示した。
図４のパネルＢに示されるように、ＰＡＡ、ＰＥＧまたはアガロース粒子をテンプレートとして使用し、異なる界面活性剤で乳化した。単分散ドロップレットを、水相界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎおよびＩＧＥＰＡＬ）を用いて生成した。テストした粒子のうち、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）とポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧ）の粒子から形成されたドロップレットが、最も均一なエマルションを生成した（図４のパネルＢ）。アガロース粒子エマルションは、均一性が低かった。何らかの特定の理論に縛られることを意図するものではないが、これは、それらの自己親和性が原因である可能性がある。必要なボルテックスパラメーターとエマルション品質は異なるものの、他の水相界面活性剤も使用した（図５のパネルＢ〜Ｅ）。
エマルションの生成に必要な時間はエマルションの体積に依存しなかったため、ＰＴＥは拡張性を備えていた（図７のパネルＡおよびＢ）。ＰＴＥにより、マイクロリットルからミリリットル規模の単分散エマルションを迅速かつ簡単に生成できた。サンプルは、２％（２０μＬ）または５％（２００μＬおよび２ｍＬ）のフッ素系界面活性剤を含む１．２５体積のＨＦＥ油に０．５％Ｔｒｉｔｏｎが懸濁したＰＡＡ粒子で構成されていた（図７のパネルＡ）。総体積に関係なく、すべてのエマルションを３０秒間ボルテックスしてドロップレットを生成した。２００μＬおよび２ｍＬエマルションのドロップレットサイズ分布のヒストグラムは、同等の単分散性を実証した（図７のパネルＢ）。
これらの結果は、生成時間が体積に比例する従来のマイクロ流体乳化とは異なっていた。ＰＴＥとマイクロフルイディクスのドロップレット生成時間を、１ｋＨｚの典型的なドロップレット生成速度で比較した。ＰＴＥでは、２０μＬのエマルションの生成には２ｍＬのエマルションの生成と同じ時間が必要であったが（図７のパネルＣにおける上側）、２ｍＬのエマルションの生成には、マイクロフルイディクスを用いて約１１時間必要であった（図７のパネルＣにおける下）。ＰＴＥの拡張性は、大量のサンプルの乳化を必要とする用途にとって有利であった。さらに、エマルションの生成はサンプルリザーバー中で発生し、サンプルをマイクロ流体機器に往復させる必要がないので、ＰＴＥは多数のサンプルを乳化するための拡張性も備えていた。
約３０μｍ〜約８０μｍの直径を有するヒドロゲルを同様の結果で使用し、５０μｍのヒドロゲルのデータが示されているが、サイズ、ヒドロゲルの化学的性質、および多孔性を含む、他の粒子タイプも方法と適合性があり得る。フッ素化油と界面活性剤をキャリア相に使用したが、シリコンと炭化水素油と界面活性剤を含む他の配合物も適合性があり得る。他の極性相も、それらがコアシェル構造を生成するのに価値があり得る安定したエマルションを形成するならば使用してよい。これらの特性は、ＰＴＥを他の領域に拡張するために必要な適応性、たとえば、費用対効果が高く拡張性を備えた、二相エマルションへの化合物の封入を提供し得る。
ＰＴＥは、テンプレート粒子と同様のサイズを有する所望の単分散ドロップレットに加えて、粒子を含有しない極めて小さな「衛星ドロップレット」を生成した。衛星ドロップレットの数は、粒子を囲む過剰な水溶液の量、エマルションの界面張力、およびボルテックスの時間とパワーに依存していた。それらの数を減らすために、ボルテックスする前に粒子とサンプルの混合物から過剰な水溶液を除去してよい。それにもかかわらず、審美的には不快ではあるが、衛星ドロップレットは、通常、総サンプル体積の比較的小さな分画（＜３％）で構成されているので、エマルション中で行われる生物学的反応にほとんど寄与しなかった。
ボルテックス力、表面張力および粒子サイズなどを考慮した後、巻き込まれた体積を予測できた。ボルテックスによりサンプル内に速度分布が生じ、各ドロップレットは乳化中にこれらの速度のランダムなサンプルを受けた。ボルテックスは、流体を撹拌するための合理的に制御された方法であり、したがって、本明細書に示されるように、均一な巻込み体積を有する主に単一コアのドロップレットを生じる力を特定することが可能であった。
ドロップレットマイクロフルイディクスにおける共通の課題は、ビーズや細胞などの個別の実体を効率的に封入する必要性であった。マイクロ流体技術は、通常、これらの実体をランダムに封入し、その結果、ドロップレットのごく一部のみが適切にロードされた非効率的なポアソンローディングが発生した。ＰＴＥの独自で価値のある特性は、適切なサイズのすべてのドロップレットが１つのテンプレート粒子を含有していることであった（図４のパネルＢ）。これらの粒子が反応の必須成分であるならば、ほとんどのドロップレットは必要なものを含有していた。しかしながら、細胞、ビーズおよびＤＮＡ分子などの他の成分がランダムにロードされていた。実際、効率的なヒドロゲル封入は、最近報告された単一細胞シーケンシング技術の主要なステップであり、商用機器で活用されていた（Ｚｈｕ Ｚ，Ｙａｎｇ ＣＪ（２０１７），Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ／Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ５０（１）：２２−３１）。
実施例３：デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いたＰＴＥによる正確なＤＮＡ定量
結果
ＰＴＥにより、マイクロフルイディクスを用いない簡単なｄｄＰＣＲが可能になった。これを説明するために、ＰＴＥを用いて複数のＤＮＡサンプルを異なる濃度の標的分子で封入した（図８のパネルＡ）。マイクロ流体ｄｄＰＣＲと同じように、目標濃度を上げると、蛍光ドロップレットの数が増えた。これが濃度推定を可能にするかどうかを決定するために、従来のｄｄＰＣＲ解析に従い、イメージングを用いてドロップレットの蛍光を定量化し、結果を蛍光対直径としてプロットした（図８のパネルＢ）。低蛍光と小径（衛星ドロップレット）、予想される直径３０〜４０μｍと低蛍光（ＰＣＲネガティブ）、および同様のサイズ範囲で高蛍光（ＰＣＲポジティブ）の３つのドロップレット集団が見えた。衛星ドロップレットは無視し、ポアソン統計を介して適切なサイズのドロップレットの目標濃度をモデル化した。
λ＝−ｌｎ（１−ｐ）
式中、λは、ドロップレットごとのテンプレートコピー数であり、ｐはポジティブ分画である。
測定された濃度は、テストした３ディケード範囲にわたり予想されるスケーリングに従い、ＰＴＥベースのｄｄＰＣＲ（図８のパネルＣ）がマイクロフルイディクスベースのｄｄＰＣＲ（図９）のように機能することを実証した。ＰＴＥ法は、マイクロフルイディクスを用いて作製されたドロップレットをテンプレート化するヒドロゲル粒子を利用した。マイクロ流体で作製された粒子であっても、合成された粒子の１つの大きなバッチを多くの解析の実行に使用できるため、ＰＴＥはｄｄＰＣＲの実質的な簡素化を表していた。
さまざまな組成、サイズ、および均一性を有するヒドロゲルミクロスフェアを、商業ベンダーから購入できた。これらのスフェアは、通常、精製カラム用の成分として販売されていたため、品質管理されており、ドロップレット反応を妨げ得る汚染物質は含んでいなかった。ＰＴＥを市販の単分散テンプレート粒子（図１０Ａおよび１０Ｂ）で行えることを示すために、直径４５〜９０μｍの範囲の単分散ＰＡＡスフェアを購入した；このサイズ分布は、マイクロフルイディクスで作製された粒子よりも大きく、典型的には５％未満であるが、ｄｄＰＣＲを含むほとんどの用途で許容可能であった。これを実証するために、粒子を用いてＰＴＥでｄｄＰＣＲを行い、同様のドロップレット蛍光特性が観察された（図１０ＢのパネルＡ）。直径分布が大きくなると、サイズと蛍光の双方でプロットの分散がより広くなるが、それにもかかわらずＰＣＲのポジティブおよびネガティブ集団は識別可能であった（図１０ＢのパネルＢ）。目標濃度を変化させ、標準的なｄｄＰＣＲ解析を行い、同じ範囲にわたり正確な測定を実現した（図１０ＢのパネルＣ）。ドロップレット体積で重み付けされた複数のポアソン分布を用いてドロップレットサイズのばらつきが含まれる場合、推定されるコピー数の補正係数は０．１％（最低濃度の場合）〜４．５％（最高濃度の場合）の範囲で小さかった。
マイクロ流体で作製された粒子を、ＰＴＥを特徴付けるために使用した。なぜなら、それらは単分散であり、したがって、ドロップレットの体積変動の正確な測定を可能にするからである。しかしながら、本明細書に示されるように、比較的均一な市販のビーズが、多くの用途で間に合った。
実施例４：多重化ＰＴＥ−ｄｄＰＣＲ
結果
ＰＴＥベースのｄｄＰＣＲを多重化できることを実証するために、ラムダウイルスとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡとの混合物を分析した。ラムダウイルス（赤色）または酵母（緑色）のゲノムを標的とするＴａｑＭａｎプローブを使用した。双方の生物のＤＮＡを一緒に混合し、サンプルをＰＴＥで乳化した。多くのドロップレットは純粋な赤色または緑色であり、それらはそれぞれラムダまたは酵母のゲノムＤＮＡを含有していたことを示す（図１１のパネルＡ）。しかしながら、まれではあるが、ドロップレットが各標的の１つを含み、したがってダブルポジティブであり、黄色を呈していた（図１１のパネルＡにおける併合）。これらの核酸は物理的に会合しなかったため、ダブルポジティブの可能性は、ポアソン二重封入プロセスで説明できる。したがって、ポアソン統計からの偏差は、配列の会合を表していた。
実施例５：酵母細胞中で使用したＰＴＥ
結果
ＰＴＥを、ドロップレット生成をテンプレート化するために、ヒドロゲルスフェアを用いて単一酵母細胞を封入するために使用した。ＰＡＡ単分散テンプレート粒子を酵母の懸濁液に加え、混合物をボルテックスすることにより乳化した。細胞は低濃度で懸濁されたため、ほとんどのドロップレットは空であったが、マイクロ流体による細胞封入と同じように、小さな分画には単一細胞が含まれていた。ミクロンスケールの酵母は、単分散テンプレート粒子のナノメートルの細孔に拡散できなかったため、ドロップレットの周辺付近の水性シェルになった（図１１のパネルＢ）。ドロップレットごとに封入された酵母の数は、サンプル内の細胞濃度により調整できる。
ドロップレット環境は酵母の増殖と適合性があった。何らかの特定の理論に縛られることを意図するものではないが、これは、ＰＡＡが９５％を超える水を含む生物学的に不活性なヒドロゲルであることに起因すると考えられる。その結果、封入された酵母細胞が１０時間インキュベートされたとき、それらはクローン性ミクロコロニーに増殖した（図１１のパネルＢ）。
実施例６：ＲＮＡｓｅｑ（理論実験）
ポリアクリルアミドヒドロゲルビーズを、最初に１０９を超える一本鎖オリゴヌクレオチドが結合された状態で合成し、続いて洗浄および再懸濁を行った。ビーズ製作手順は、ビーズ上へのバーコード合成のための「スプリットアンドプール」法で行われる。完成したバーコードビーズは、一意にバーコード化された一本鎖ＤＮＡと、ｐｏｌｙＴテールおよびＴ７プロモーター配列を含む他の成分を含有している。これらの一本鎖ＤＮＡは、ＵＶ露光時にヒドロゲルビーズから放出され得る。ビーズ、細胞およびＲＴミックスを組み合わせ、ＰＥＴＥを本明細書に記載されるように行って、逆転写反応ミックスで単一細胞をドロップレットに封入する。エマルションをＵＶ露光し、続いて最大５０℃に加熱して逆転写反応を行う。プロセス中、ビーズ上の一本鎖ＤＮＡが放出されてＲＴプライマーとして機能し、細胞からのＲＮＡが放出されてテンプレートとして機能する。次いでエマルションを破壊し、ｃＤＮＡを回収した後、次世代シーケンシングのための標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写とライブラリー調製を行い、単一細胞の遺伝子発現プロファイル解析のデータを収集する。
実施例７：単分散エマルションの生成のスケールアップ
結果
単分散ポリアクリルアミド粒子を、最初に本明細書に開示される方法に従って合成してから、ＩＧＥＰＡＬで洗浄した。単分散粒子を９６ウェルプレートに加えた。ＰＴＥを開示に従って行い、９６個の均一な単一細胞エマルションを同時に作製した（図１２）。
実施例８：粒子テンプレート乳化（ＰＴＥ）を使用した二相エマルションの生成
結果
本明細書に記載される技術は、正確な制御で二相エマルションの一種であるリポソームの生成を可能にした。図１３のパネルＡに示されるように、ポリアクリルアミド粒子を内水相（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）中に提供し、ＰＴＥにより二相エマルション（またはリポソーム）を生成した。図１３のパネルＢに示されるように、最初に油相（５％（ｗ／ｖ）のモノオレイン酸グリセリルと５ｍｇ／ｍｌのＤＰＰＣを含有するスクアラン混合物）を加えて、単相エマルションを形成した。図１３のパネルＣに示されるように、二相エマルションを、５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８と０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有する外水相を加え、ボルテックスすることにより生成した。リポソームを相分離により形成した。図１３のパネルＤに示されるように、油相中に蛍光脂質を追加で含んで形成されたリポソームをＥＶＯＳ蛍光顕微鏡で画像化した。
実施例９：ＰＴＥによるハイスループットＲＮＡｓｅｑ
図１４Ａ〜１４Ｃに示されるように、マイクロフルイディクスを用いない単一細胞ＲＮＡｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を可能にするプロトコルを開発し、これにより単純な試薬で数千の単一細胞からのトランスクリプトームのプロファイリングが可能になった。プロテイナーゼベースの溶解アプローチ、化学的に引き起こされるヒドロゲル解重合およびバーコード化されたＲＮＡ捕捉ビーズの組合せを利用して、ドロップレット形成、細胞溶解およびＲＮＡ捕捉を１つのステップで達成した。この技術は、スループットを高め、従来のプロトコルを簡素化することにより、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑの能力を拡張した。
Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズ（図１４Ａ；図１５のパネルＡ）を、最初にポリアクリルアミドビーズ合成用の架橋剤としてビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣ）を用いてＢＡＣポリアクリルアミドヒドロゲルに封入し、続いて洗浄および再懸濁した。ビーズ、細胞、プロテイナーゼＫ、ハイブリダイゼーションバッファーを組み合わせた。２−メルカプトエタノール（２−Ｍｅ）で予め飽和させた油を加え、本明細書に記載されるようにＰＴＥを行って、単一細胞をドロップレットに封入した（図１４Ｂ；図１５のパネルＢ）。細胞はプロテイナーゼＫにより溶解された。ドロップレット形成前の溶解を回避するために、細胞溶解に界面活性剤を使用しなかった。プロテイナーゼＫは、細胞を効率的に溶解するためにより長い時間とより高い温度を必要とし、したがってこの方法に良く適していた。プロテイナーゼＫの添加とドロップレットの形成に続いて、プロテイナーゼＫの活性化と細胞溶解を促進するために、温度を４℃から５５℃に上昇させた。細胞溶解およびＲＮＡ捕捉後、エマルションを破壊し、プロテイナーゼＫを洗い流し、Ｄｒｏｐ−ｓｅｑビーズを回収した（図１４Ｃ）。
図１５では、顕微鏡画像が、溶解前（図１５のパネルＣ）および溶解後（図１５のパネルＤ）のドロップレットに封入されたカルセイングリーン染色細胞を示す。ヒト−マウス混合細胞実験からのデータは、本明細書に記載されるｓｃＲＮＡ−ｓｅｑワークフローの有効性を示した（図１５のパネルＥ）。
実施例１０：ＰＴＥとターゲット解析によるコアシェルマイクロゲルの形成
図１６に示されるように、親和性ベースのＰＴＥとターゲット解析とを兼ね備えた、本エマルション技術を用いてコアシェルマイクロゲルを作り出す方法が開発された。本エマルション技術を用いて作り出されたコアシェルマイクロゲルは、さまざまな生体材料および試薬を保持するために使用することができ、本エマルション技術の用途の範囲を広げると考えられる。ポリアクリルアミドビーズ（図１７のパネルＡ）を、ＰＣＲ中にプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドと結合させた。テンプレート粒子をＤＮＡで官能化することによる本エマルション技術によるそのようなターゲット解析により、異種細胞集団からのターゲット（特定の細胞タイプに向けた）ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑなどの幅広い用途が可能になる。この例では、オリゴで官能化されたビーズを利用したが、たとえば、抗体またはその結合フラグメントでの他の官能化は、当業者が容易に想定し得る。ビーズをＰＣＲ試薬に浸漬した。過剰な水溶液を除去した。アガロース、Ｔｒｉｔｏｎおよび細胞を加え、続いて油を加えた。本明細書に記載されるようにＰＴＥを実施した。油を移し、サーモサイクリングを行った。２つの希釈係数でのアガロースシェルを備えたポリアクリルアミドコアビーズのｄｄＰＣＲを示す（図１７のパネルＢ）。蛍光ポジティブドロップレットを含む分画は、テンプレート濃度に対応する。アガロースシェルを備えたポリアクリルアミドコアビーズの画像は、ドロップレットを破壊して洗浄した後のアガロースシェルに囲まれたポリアクリルアミドコアビーズを示していた。図１７のパネルＣに示されるように、ＦＡＣＳ後のドロップレットの画像を示し、蛍光ポジティブドロップレットをソートし、収集し、顕微鏡下で観察した。ソートされたビーズは蛍光を発し、ＦＡＣＳ後、アガロースシェルで囲まれていた。ｑＰＣＲを、アガロースシェル中のゲノム回収を確認するために行った（図１７のパネルＤ）。異なる遺伝子座の４つのプライマーセットを使用した。３５回のサイクル後にシグナルが観察され、ゲノムＤＮＡをアガロースシェルに封入した。
本発明をその特定の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行い、等価物を代用できることは、当業者に理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスのステップまたは複数のステップを、本発明の目的、精神および範囲に適合させるために、多くの変更を加えることができる。そのような変更はすべて、本明細書に添付された請求項の範囲内にあることが意図される。
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Claims (73)

  1. 単分散エマルションを生成する方法であって、前記方法は、
    複数の単分散テンプレート粒子を、複数の標的粒子を含む第１の流体と混合して第１の混合物を提供すること；
    前記第１の混合物を、前記第１の流体と混和しない第２の流体と混合して第２の混合物を提供すること；および
    前記第２の混合物を剪断し、前記複数の単分散テンプレート粒子を前記第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させ、それにより前記第１の流体、前記単分散テンプレート粒子の１つ、および前記複数の標的粒子の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供すること、を含む方法。
  2. 前記複数の単分散テンプレート粒子を前記第１の流体と混合して前記第１の混合物を提供することが、前記第１の流体の一部を前記複数の単分散テンプレート粒子により吸収させることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の流体の一部を前記複数の単分散テンプレート粒子により吸収させた後、前記第１の混合物から過剰な第１の流体を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記複数の単分散テンプレート粒子を前記第１の流体と混合して前記第１の混合物を提供することが、前記第１の流体の一部を前記複数の単分散テンプレート粒子に流入させることを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記複数の単分散テンプレート粒子がヒドロゲルを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、およびそれらの組合せから選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第１の流体が水相流体を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第２の流体が油を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記油が、フルオロカーボン油、ハイドロカーボン油、またはそれらの組合せを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記第２の流体が、前記第２の流体に溶解する界面活性剤を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１の流体が、前記第１の流体に溶解する界面活性剤を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１の流体に溶解する前記界面活性剤が、オクチルフェノールエトキシレートおよび／またはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記方法がマイクロフルイディクスを利用しない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記剪断の後、前記第２の流体が、前記複数の単分散テンプレート粒子の１つを含まない複数のドロップレットを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 複数の単分散テンプレート粒子を含む複数の単分散ドロップレットを、前記複数の単分散テンプレート粒子の１つを含まないドロップレットと比べて濃縮（豊富化）することを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記複数の単分散テンプレート粒子の１つを含まない１つまたは複数のドロップレットが、濾過または遠心分離により前記単分散エマルションから除去される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記複数の単分散ドロップレットが平均直径を有し、かつ前記複数の単分散テンプレート粒子の１つを含まない前記複数のドロップレットが、前記複数の単分散テンプレート粒子の平均直径よりも小さい平均直径を有する、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記剪断が、前記第２の混合物をピペットチップを通して流入すること、前記第２の混合物をホモジナイザーで振とうすること、または前記第２の混合物をビードビーターで振とうすること、を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記複数の単分散ドロップレットに封入された前記複数の単分散テンプレート粒子を膨潤させることを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記複数の標的粒子がＤＮＡ分子である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡ分子である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記複数の標的粒子がＲＮＡ分子である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記複数の標的粒子が細胞である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記複数の単分散ドロップレットが、ドロップレットあたり１つまたは複数の細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記複数の単分散ドロップレットが、ドロップレットあたり１つより多くの細胞を含まない、請求項２３に記載の方法。
  26. 細胞溶解試薬を前記複数の単分散ドロップレットに組み込むことをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記複数の単分散ドロップレットに前記複数の単分散テンプレート粒子を封入する前に、前記細胞溶解試薬が前記第１の混合物中に存在する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記細胞溶解試薬が界面活性剤を含まない、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. 前記細胞溶解試薬がプロテイナーゼＫを含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記複数の単分散ドロップレットをソーティングすることをさらに含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ソーティングが、誘電泳動偏向、選択的合一、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、フロー制御、または複数の単分散ドロップレットを選択的に偏向するために使用される他の刺激により行われる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記複数の標的粒子が核酸であり、かつ前記複数の標的粒子を含む前記第１の流体がさらに核酸合成試薬を含み、かつ前記核酸合成試薬が前記複数の単分散ドロップレットに封入されている、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記第１の流体および前記複数の標的粒子の１つまたは複数を含む前記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数を核酸合成条件に供することを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記核酸合成試薬が核酸増幅試薬を含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記第１の流体および前記複数の標的粒子の１つまたは複数を含む前記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数を核酸増幅条件に供することを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数から核酸を単離することを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数から核酸合成物および／または増幅産物を単離することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数から単離された核酸および／または核酸合成物および／または増幅産物をシーケンシングすることを含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記核酸増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬または多置換増幅（ＭＤＡ）試薬を含み、かつ前記核酸増幅条件が、それぞれＰＣＲ条件またはＭＤＡ条件を含む、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記核酸増幅試薬が等温核酸増幅試薬を含み、かつ前記核酸増幅条件が等温核酸増幅条件を含む、請求項３５に記載の方法。
  41. 前記複数の標的粒子を含む前記第１の流体が、前記複数の単分散ドロップレットに封入されている核酸検出試薬を含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記核酸検出試薬の１つまたは複数を検出することにより、前記複数の標的粒子の１つまたは複数、その一部、その核酸合成産物、および／またはその核酸増幅産物を検出することを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記複数の標的粒子の１つまたは複数、前記核酸合成試薬、および前記核酸検出試薬を前記複数の単分散テンプレート粒子の１つまたは複数に付着させることを含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記複数の標的粒子の１つまたは複数、前記核酸合成試薬、および前記核酸検出試薬が、前記複数の単分散テンプレート粒子上または前記複数の単分散テンプレート粒子中に配置された１つまたは複数の係留部分を介して前記複数の単分散テンプレート粒子に付着させられる、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記１つまたは複数の係留部分が、前記複数の単分散テンプレート粒子上または前記複数の単分散テンプレート粒子中に結合しているオリゴヌクレオチドである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記１つまたは複数の係留部分が、前記複数の単分散テンプレート粒子に封入されている官能化ビーズである、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記複数の単分散ドロップレットのそれぞれが、試薬を含む別個の区画を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記別個の区画から前記試薬を放出することを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記複数の単分散テンプレート粒子が平均体積を有し、かつ前記方法が、前記複数の単分散テンプレート粒子を収縮させて平均体積を減少させることを含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記複数の単分散テンプレート粒子が第１のタイプの粒子であり、かつ前記方法が、前記第１のタイプの粒子の１つまたは複数を有するドロップレットに第２のタイプの粒子の１つまたは複数を封入することを含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記第２の混合物の前記剪断に続いて、前記第２の混合物から過剰な第２の流体を除去することを含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記第２の混合物から過剰な第２の流体を除去することが、前記第２の混合物を遠心分離し、上清を除去することを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記第２の混合物の前記剪断に続いて、第３の流体を前記第２の混合物と組み合わせて第３の混合物を生成することを含み、ここで、前記第３の流体は前記第２の流体と混和しない、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記第２の混合物の前記剪断に続いて、第３の流体を前記第２の混合物と組み合わせて第３の混合物を生成することを含み、ここで、前記第３の流体は前記第１の流体および前記第２の流体と混和しない、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記第３の流体が水相流体を含む、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記第３の流体が油を含む、請求項４９または５４に記載の方法。
  57. 前記第３の流体が、前記第３の流体に溶解する界面活性剤を含む、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記第３の混合物を剪断して、前記複数の単分散テンプレート粒子を前記第３の流体中の二相エマルションドロップレットに封入することを含む、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記第３の混合物を剪断して、前記複数の単分散テンプレート粒子の有無にかかわらず、前記複数の単分散ドロップレットの１つまたは複数を前記第３の流体中の１つまたは複数のドロップレットに封入して、１つまたは複数の二相エマルションドロップレットを提供することを含む、請求項５３から５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記第３の流体がゲル化剤を含む、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記複数の単分散ドロップレットの７５％以上が、1つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記複数の単分散ドロップレットの８５％以上が、1つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記複数の単分散ドロップレットの９５％以上が、1つより多くない、１つの単分散テンプレート粒子を含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記複数の単分散テンプレート粒子の７５％以上が、前記第２の流体中の複数の単分散ドロップレット中に封入されている、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記複数の単分散テンプレート粒子の９０％以上が、前記第２の流体中の複数の単分散ドロップレット中に封入されている、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記複数の単分散テンプレート粒子が親油性ポリマーを含む、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 複数の単分散テンプレート粒子を、複数の細胞および細胞溶解試薬を含む第１の流体と混合して第１の混合物を提供すること；
    前記第１の混合物を、前記第１の流体と混和しない第２の流体と混合して第２の混合物を提供すること；
    前記第２の混合物を剪断して、前記複数の単分散テンプレート粒子を前記第２の流体中の複数の単分散ドロップレットに封入させ、それにより前記第１の流体、前記複数の単分散テンプレート粒子の１つ、前記細胞溶解試薬、および前記複数の細胞の１つを含む複数の単分散ドロップレットを提供すること；
    前記複数の単分散ドロップレットが提供されるまで、前記細胞溶解試薬の活性化を妨げるのに十分な温度で前記細胞溶解試薬を維持すること；および
    前記複数の単分散ドロップレットの前記提供に続いて、前記複数の単分散ドロップレットを、前記細胞溶解試薬の活性化および前記複数の細胞の１つの溶解に十分な温度でインキュベートすること、を含む方法。
  68. 前記細胞溶解試薬がプロテイナーゼＫを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記細胞溶解試薬が界面活性剤を含まない、請求項６７または６８に記載の方法。
  70. 前記複数の単分散ドロップレットを破裂させることを含む、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記第１の流体が複数のＲＮＡ捕捉ビーズを含む、請求項６７から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記複数の単分散テンプレート粒子が、その中に組み込まれた１つまたは複数のＲＮＡ捕捉ビーズを含む、請求項６７から７０のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記１つまたは複数のＲＮＡ捕捉ビーズにより捕捉されたＲＮＡ分子をシーケンシングすることを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
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