JP2022088360A - 別個の実体におけるバーコード付加による核酸のシーケンシング - Google Patents
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Abstract
【課題】核酸バーコード配列のコピーを別個の実体中に導入する方法、および、該方法を実施するための系およびデバイスを提供する。【解決手段】核酸バーコード配列の複数のコピーを別個の実体中に導入する方法であって、別個の実体中に複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む細胞を導入するステップと、細胞を溶解して、別個の実体中に核酸バーコード配列の複数のコピーを放出するステップと、別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む方法であって、核酸標的分子のハイスループットシーケンシングならびに単細胞および単一ウイルスゲノムの、トランスクリプトームの、および/またはプロテオミクスの解析/プロファイリングを容易にする方法、並びに該方法を実施するための系およびデバイス。【選択図】図8
Description
相互参照
本出願は、参照によりその全文がすべての目的のために本明細書に組み込まれる2015年2月4日に出願された米国特許仮出願第62/112,075号の優先権の利益を主張する。
本出願は、参照によりその全文がすべての目的のために本明細書に組み込まれる2015年2月4日に出願された米国特許仮出願第62/112,075号の優先権の利益を主張する。
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって与えられた助成金番号1R21HG007233-02、1DP2AR068129-01および1R01EB019453-01、米国国防総省(Department of Defense)によって与えられた助成金番号HR0011-12-C-0065、N66001-12-C-4211およびHR0011-12-C-0066ならびに全米科学財団(National Science Foundation)によって与えられた助成金番号DBI-1253293に基づく政府支援を用いて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって与えられた助成金番号1R21HG007233-02、1DP2AR068129-01および1R01EB019453-01、米国国防総省(Department of Defense)によって与えられた助成金番号HR0011-12-C-0065、N66001-12-C-4211およびHR0011-12-C-0066ならびに全米科学財団(National Science Foundation)によって与えられた助成金番号DBI-1253293に基づく政府支援を用いて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
バーコードに相当する核酸配列が、分析されるべき分子標的と連結される核酸バーコード付加技術は、例えば、多数の個々のサンプルが並行してシーケンシングされるシーケンシング適用を含む種々の適用において有用である。核酸バーコードは、ハイスループットゲノム解析、トランスクリプトーム解析および/またはプロテオミクス解析および/または細胞のプロファイリングにおいて特定の使用を見出す。
本開示は、例えば、核酸シーケンシング技術によって、解析されるべき核酸標的分子にバーコード付加するためのマイクロ流体方法を提供する。また、種々のバーコード付加適用において使用するための核酸バーコードを調製する、マイクロ流体の小滴ベースの方法も提供する。本明細書に記載される方法は、核酸標的分子のハイスループットシーケンシングならびに単細胞および単一ウイルスゲノムの、トランスクリプトームの、および/またはプロテオミクスの解析/プロファイリングを容易にする。本方法を実施するための系およびデバイスも提供する。
本発明は、添付の図面とともに読まれた場合に、以下の詳細な説明から最良に理解され得る。図面には、以下の図が含まれる。
本開示は、例えば、核酸シーケンシング技術によって、解析されるべき核酸標的分子にバーコード付加するためのマイクロ流体方法を提供する。また、種々のバーコード付加適用において使用するための核酸バーコードを調製するマイクロ流体の、小滴ベースの方法も提供する。本明細書に記載される方法は、核酸標的分子のハイスループットシーケンシングならびに単細胞および単一ウイルスゲノムの、トランスクリプトームのおよび/またはプロテオミクスの解析/プロファイリングを容易にする。本方法を実施するための系およびデバイスも提供する。
本発明をより詳しく記載する前に、記載される特定の実施形態は変更が可能なものであるため、本発明はそれらに限定されないことが理解されるものとする。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を記載することを目的とし、限定であると意図されないことも理解されるものとする。
値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限の間のそれぞれの間の値は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、下限の単位の10分の1までも具体的に開示されることが理解される。任意の明記された値または明記された範囲の間の値と、任意のその他の明記された値またはその明記された範囲の間の値の間のより小さい範囲はそれぞれ、本発明内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、範囲中に独立に含まれる場合も排除される場合もあり、より小さい範囲中に限界のいずれかが含まれる、両方が含まれないまたは両方が含まれる各範囲も、本発明内に包含され、明記された範囲中の任意の具体的に排除される限界次第である。明記された範囲が限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界のうちいずれかまたは両方を排除する範囲も、本発明中に含まれる。
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を使用できるが、いくつかの可能性ある、例示的方法および材料をここで記載してもよい。本明細書に記載されるありとあらゆる刊行物が、刊行物が引用されるものと関連する方法および/または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある限り、本開示が、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先することは理解される。
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むということは注記しなければならない。したがって、例えば、「小滴(a droplet)」への言及は、複数のこのような小滴を含む。
特許請求の範囲を、いずれかの要素、例えば、いずれかの任意選択の要素を排除するように作成できることもさらに注記する。そのようなものとして、この記述は、特許請求要素の列挙と関連した「単に」、「唯一の」のような排他的な技術用語の使用のための、または「負の」限定の使用のための先行詞として働くように意図される。
本明細書に開示される刊行物は、単に、本願の出願日に先行するその開示のために提供される。さらに、提供された刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なることがあり、これは個別に確認される必要があり得る。本明細書における任意の用語の開示または定義または使用が、適用または参照によって本明細書に組み込まれる刊行物における任意の用語の開示または定義または使用と矛盾する場合、本適用を優先させるものとする。
当業者には明らかと予想されるが、本開示を読むと、本明細書において記載され、例示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、その他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分けたりまたは組み合わせたりすることができる別個の成分および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順にまたは論理的に可能である任意のその他の順序で実施できる。
用語「核酸バーコード配列」、「核酸バーコード」、「バーコード」などは、本明細書において、核酸バーコードがコンジュゲートされる1種もしくは複数の第1の分子を同定する、および/または1種もしくは複数の第2の分子から区別するために使用できる配列を有する核酸を指す。核酸バーコード配列は、通常、短く、例えば、約5~20塩基の長さであり、1種もしくは複数の対象の標的分子またはその増幅産物とコンジュゲートしてもよい。核酸バーコード配列は、一本鎖である場合も二本鎖である場合もある。
用語「固有分子識別子(UMI)」または「UMI」とは、本明細書において、UMIがコンジュゲートされる1種もしくは複数の第1の分子を同定する、および/または1種もしくは複数の第2の分子から区別するために使用できる配列を有する核酸を指す。UMIは、通常、短く、例えば、約5~20塩基の長さであり、1種もしくは複数の対象の標的分子またはその増幅産物とコンジュゲートしてもよい。UMIは、一本鎖である場合も二本鎖である場合もある。いくつかの実施形態では、核酸バーコード配列およびUMIの両方が、核酸標的分子またはその増幅産物中に組み込まれる。一般に、UMIは、集団またはグループ内の同様の種類の分子間を区別するために使用されるが、核酸バーコード配列は、分子の集団またはグループ間を区別するために使用される。UMIおよび核酸バーコード配列の両方が利用されるいくつかの実施形態では、UMIは、配列長が核酸バーコード配列よりも短い。UMIおよび核酸バーコード配列の両方が利用されるいくつかの実施形態では、UMIは、標的核酸またはその増幅産物中に組み込まれ、その後、核酸バーコード配列が組み込まれる。UMIおよび核酸バーコード配列の両方が利用されるいくつかの実施形態では、UMIの標的核酸またはその増幅産物への組込み後に、核酸バーコード配列が、UMIまたはその増幅産物中に組み込まれる。
用語「コンジュゲートされた」とは、本明細書において、2種の実体、例えば、分子、化合物またはそれらの組合せ間の共有結合性またはイオン性相互作用を指す。
本明細書において同義的に使用される、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の重合体形態を指し、これは、コードされたおよびコードされないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、それだけには限らないが、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、N末端メチオニン残基を有するか、または有さない異種および天然リーダー配列との融合物;免疫学的にタグが付けられたタンパク質;検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば、融合パートナーとして、蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質などを含む融合タンパク質を含む。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、それだけには限らないが、Fab、Fv、scFvおよびFd断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含む抗原に対する特異的結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗体の断片を含む。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質、核酸バーコード配列などを用いて検出可能に標識できる。抗体を、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン(ビオチン-アビジン特異的結合対のメンバー)などのその他の部分とさらにコンジュゲートしてもよい。また、Fab’、Fv、F(ab’)2および抗原に対する特異的結合を保持するその他の抗体断片もこの用語によって包含される。
抗体は、例えば、Fv、Fabおよび(Fab’)2ならびに二機能性(すなわち、二重特異性)ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchiaら、Eur.J.Immunol.第17巻、105頁(1987年))を含む種々のその他の形態で、および一本鎖で(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、第85巻、5879~5883頁(1988年)およびBirdら、Science、第242巻、423~426頁(1988年))存在し得る。(全般的に、Hoodら、Immunology、Benjamin、N.Y.、第2版(1984年)ならびにHunkapillerおよびHood、Nature、第323巻、15~16頁(1986年)を参照のこと。
本明細書において「結合」とは、一般に、結合が、普通、特異的である2種の分子(本明細書において、「結合パートナー」と呼ばれる、例えば、基質および酵素または抗体およびエピトープ)間の共有結合性または非共有結合性相互作用を指す。
本明細書において、「特異的に結合する(specifically binds)」または「特異的に結合する(binds specifically)」は、結合パートナーが互いに結合するが、所与の条件のセット(例えば、生理学的条件)下で、十分なまたは実質的なレベルで環境中(例えば、生体サンプル中、組織中)に存在し得るその他の分子とは結合しないような、結合パートナー間の相互作用を指す。
用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、同義的に使用され、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかまたはその類似体の重合体形態を指す。この用語は、例えば、DNA、RNAおよびそれらの修飾された形態を包含する。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有し得、公知のまたは未知の任意の機能を発揮し得る。ポリヌクレオチドの限定されない例として、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、制御領域、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。核酸分子は、線形である場合も、環状である場合もある。
用語「核酸配列」または「オリゴヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド塩基の連続するストリングを指し、特定の文脈ではまた、オリゴヌクレオチド中に現れるような互いに関連するヌクレオチド塩基の特定の配置を指す。同様に、用語「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」とは、アミノ酸の連続するストリングを指し、特定の文脈ではまた、ポリペプチド中に現れるような互いに関連するアミノ酸の特定の配置を指す。
用語「相補的な」または「相補性」とは、塩基対合ルールによって関連しているポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)を指す。例えば、配列「5’-AGT-3’」は、配列「5’-ACT-3’」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが、塩基対形成ルールに従ってマッチしている「部分的」である場合も、核酸間の「完全な」または「全体的な」相補性である場合もある。核酸鎖間の相補性度は、規定の条件下での核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して相当な効果を有し得る。これは、核酸間の結合に応じて変わる方法にとって特に重要である。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補性核酸の対合に関連して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の会合の強度)は、核酸間の相補性度、関与する条件のストリンジェンシーおよび形成されるハイブリッドのTmのような因子によって影響を受ける。「ハイブリダイゼーション」法は、ある核酸の、別の相補性核酸、すなわち、相補性ヌクレオチド配列を有する核酸とのアニーリングを含む。
ハイブリダイゼーションは、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件で実施される。相補性配列の長さおよびGC含量は、標的部位の、標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションを得るために必要なハイブリダイゼーション条件の熱融点Tmに影響を及ぼす。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施され得る。語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、通常、核酸の複雑な混合物中で、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能なまたは相当なレベルでハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、約6~約8の間のpHで約0.001M~約1.0Mナトリウムイオン濃度(またはその他の塩)を含む約0.01M未満などの約1.0Mナトリウムイオン未満であり、温度が約20℃~約65℃の範囲であるものである。ストリンジェントな条件はまた、それだけには限らないが、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加を用いて達成され得る。
用語「熱融点」、「融解温度」または「Tm」とは、本明細書において、平衡で、標的と相補的であるプローブの50%が、標的配列とハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度下での)を指す(標的配列は、Tmで過剰で存在するので、プローブの50%が平衡で占められる)。いくつかの場合には、用語「Td」は、プローブの少なくとも半量が、完全にマッチしている標的核酸から解離する温度を規定するために使用される。
対応するヌクレオチド間のすべての完全に形成された水素結合を有する二本鎖分子の形成は、「マッチしている」または「完全にマッチしている」と呼ばれ、対応していないヌクレオチドの単一またはいくつかの対を有する二本鎖は、「ミスマッチしている」と呼ばれる。一本鎖RNAまたはDNA分子任意の組合せが、適当な実験条件下で二本鎖分子(DNA:DNA、DNA:RNA、RNA:DNAまたはRNA:RNA)を形成し得る。
語句「選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」とは、その配列が、複雑な混合物(例えば、総細胞またはライブラリーDNAまたはRNA)中に存在する場合の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、分子の特定のヌクレオチド配列とのみの結合、二本鎖形成またはハイブリダイゼーションを指す。
当業者ならば、代替ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件を提供できることを容易に認識するであろう、また、パラメータの組合せは、任意の単一パラメータの尺度よりもかなりより重要であるということは認識するであろう。
「置換」は、1個または複数のアミノ酸またはヌクレオチドの、ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる置き換えに起因する。置換が保存的である場合には、ポリペプチド中の置換されているアミノ酸は、置換しているアミノ酸と同様の構造的または化学的特性(例えば、電荷、極性、疎水性など)を有する。天然に存在するアミノ酸の保存的置換は、普通、第1のアミノ酸の、第1のアミノ酸と同一のグループに由来する第2のアミノ酸との置換をもたらし、ここで、例示的アミノ酸グループは、以下の通りである:(1)アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性(負電荷を有する)アミノ酸;(2)アルギニン、ヒスチジンおよびリシンなどの塩基性(正電荷を有する)アミノ酸;(3)グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンなどの中性極性アミノ酸ならびに(4)アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンなどの中性非極性アミノ酸。いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、「非保存的」変化を有し得、ここで、置換されたアミノ酸は、構造的および/または化学的特性において異なる。
「欠失」は、1個または複数のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化として定義される。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のとの関連で、欠失は、ポリペプチドの長さまたは修飾されているポリヌクレオチド配列を考慮して、2個、5個、10個、最大20個、最大30個または最大50個またはそれを超えるアミノ酸の欠失を含み得る。
「挿入」または「付加」は、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれ、1個または複数のアミノ酸またはヌクレオチド残基の付加をもたらしたアミノ酸またはヌクレオチド配列のその変化である。「挿入」は、一般に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の1個または複数のアミノ酸残基の付加を指すが「付加」は、挿入である場合も、またはN-もしくはC-末端に付加されたアミノ酸残基を指す場合もある。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列との関連で、挿入または付加は、最大10個、最大20個、最大30個または最大50個またはそれを超えるアミノ酸のものであり得る。
「非天然」、「非内因性」および「異種」は、ポリペプチドとの関連で、アミノ酸配列を有するポリペプチドを指すように本明細書において同義的に使用され、発現系またはウイルス粒子との関連では、天然に見られるものとは異なる環境中に存在する。
「外因性」とは、核酸またはポリペプチドとの関連で、宿主細胞中に導入されている核酸またはポリペプチドを指すように使用される。「外因性」核酸およびポリペプチドは、宿主細胞に対して天然である場合も、非天然である場合もあり、外因性、天然核酸またはポリペプチドは、外因性分子の導入前の宿主細胞において見られるものと比べて、組換え宿主細胞におけるコードされる遺伝子産物またはポリペプチドのレベルの上昇を提供する。
本明細書において、用語「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」および「アッセイすること」は、同義的に使用され、定量的および定性的定量の両方を含む。
本明細書において、用語「単離された」とは、単離された化合物との関連で使用される場合、化合物が天然に生じるものとは異なる環境中にある対象の化合物を指す。「単離された」とは、対象の化合物について実質的に濃縮されている、および/または対象の化合物が部分的にまたは実質的に精製されているサンプル内である化合物を含むものとする。
本明細書において、用語「実質的に純粋な」とは、その天然環境から回収されている、天然に関連しているその他の成分を少なくとも60%含まない、75%含まない、または90%含まない化合物を指す。
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、例えば、適当な調節配列(または「制御エレメント」)の制御下に置かれた場合にin-vivoで、転写され(DNAの場合には)、ポリペプチドに翻訳される(mRNAの場合には)核酸分子である。コード配列の境界は、通常、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、それだけには限らないが、ウイルス由来のcDNA、原核生物または真核生物のmRNA、ウイルス由来のゲノムのDNA配列または原核生物のDNAおよび合成DNA配列を含み得る。転写終結配列は、コード配列の3’に位置し得る。その他の「制御エレメント」はまた、コード配列と会合し得る。ポリペプチドをコードするDNA配列は、所望のポリペプチドコード配列のDNAコピーを発現するために選択された細胞によって好まれるコドンを使用することによって、選択された細胞における発現のために最適化され得る。
「によってコードされる」とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。遺伝子産物がポリペプチドである場合には、ポリペプチド配列またはその一部は、核酸配列によってコードされるポリペプチドに由来する少なくとも3~5個のアミノ酸、8~10個のアミノ酸または少なくとも15~20個のアミノ酸のアミノ酸配列を含有する。
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された成分が、その通常の機能を発揮するように構成されるエレメントの配置を指す。プロモーターの場合には、コード配列と作動可能に連結されているプロモーターは、コード配列の発現に対する効果を有する。プロモーターまたはその他の制御エレメントは、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在する場合もあり、プロモーター配列は依然として、コード配列と「作動可能に連結される」と考えられ得る。
「核酸構築物」によって、本来は一緒には見られない1つまたは複数の機能単位を含むように構築されている核酸配列を意味する。例として、環状、直鎖、二本鎖、染色体外DNA分子(プラスミド)、コスミド(λファージに由来するCOS配列を含有するプラスミド)、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが挙げられる。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移すことが可能である。通常、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」とは、対象の遺伝子の発現を指示可能な、遺伝子配列を標的細胞に移すことができる、ベクターのすべてまたは一部のゲノム組込みまたは染色体外エレメントとしてのベクターの一時的なもしくは遺伝性の維持によって達成され得る、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組込みベクターを含む。
「発現カセット」は、対象の遺伝子/コード配列の発現を指示可能な、発現カセットのプロモーターと作動可能に連結している任意の核酸構築物を含む。このようなカセットは、発現カセットを標的細胞中に移すために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」または「遺伝子導入ベクター」中に構築できる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびにウイルスベクターを含む。
核酸およびアミノ酸「配列同一性」を決定するための技術は、当技術分野で公知である。通常、このような技術は、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定することおよび/またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定することおよびこれらの配列を第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性」とは、それぞれ、2種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。それらの「同一性パーセント」を決定することによって、2種またはそれ以上の配列(ポリヌクレオチドまたはアミノ酸)を比較することもできる。2種の配列の同一性パーセントは、核酸であろうと、アミノ酸配列であろうと、短い方の配列の長さによって除され、100が乗じられた、2つのアラインされた配列間の正確なマッチの数である。核酸配列のおよそのアラインメントは、SmithおよびWaterman、Advances in Applied Mathematics、第2巻:482~489頁(1981年)の局所アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff、Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5巻、付録3:353~358頁、National Biomedical Research Foundation、Washington,D.C.、USAによって開発され、Gribskov、Nucl.Acids Res.第14巻(6号):6745~6763頁(1986年)によって正規化されたスコアリングマトリックスを使用することによってアミノ酸配列に適用することができる。
配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的実施は、Genetics Computer Group (Madison、WI)によって「BestFit」ユーティリティーアプリケーションにおいて提供される。この方法のデフォルトパラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual、バージョン8(1995年)(Genetics Computer Group、Madison、WIから入手可能)に記載されている。本発明との関連で同一性パーセントを確立する別の方法は、エジンバラ大学によって著作権で保護され、John F.CollinsおよびShane S.Sturrokによって開発され、IntelliGenetics、Inc.(Mountain View、CA)によって配布されたプログラムのMPSRCHパッケージを使用することである。パッケージのこのスイートから、スコアリングテーブルのためにデフォルトパラメータ(例えば、12のギャップオープンペナルティー、1のギャップ伸長ペナルティーおよび6のギャップ)が使用されるSmith-Watermanアルゴリズムを使用できる。作成されたデータから、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性パーセントを算出するためのその他の適したプログラムは、一般に、当技術分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムとして、BLASTがあり、デフォルトパラメータを用いて使用される。例えば、以下のデフォルトパラメータ:遺伝暗号=標準;フィルター=なし;ストランド=両方;カットオフ=60;予想=10;マトリックス=BLOSUM62;記載=50配列;選別されるもの=HIGH SCORE;データベース=非重複、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳+Swissタンパク質+Spupdate+PIR を使用して、BLASTNおよびBLASTPを使用できる。これらのプログラムの詳細は、http://in front of blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.を設置することによって位置付けられるインターネットアドレスにおいて見い出すことができる。
2種の核酸または2種のポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を使用して決定されるように、既定の長さの分子にわたって、少なくとも約80%~85%、少なくとも約85%~90%、少なくとも約90%~95%または少なくとも約95%~98%の配列同一性を示す場合に、互いに「実質的に同一である」。本明細書において、実質的に同一とはまた、特定の核酸またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列を指す。
本明細書において、用語「相同」、「相同性」および「相同性の領域」とは、2種の核酸が少なくとも部分的相補性を共有する領域(部位)を指す。相同性の領域が、配列の部分のみに広がる場合も、配列の全体に広がる場合もある。例えば、相同であるDNA配列は、例えば、その特定の系について規定されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定できる。適当なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内にある。例えば、SambrookおよびRussel、Molecular Cloning:A Laboratory Manual Third Edition、(2001年) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと。
第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチド、そのcDNA、その相補体の領域と同一もしくは実質的に同一のヌクレオチド配列を有する場合には、または上記のような配列同一性を示す場合には、第2のポリヌクレオチドに「由来する」。この用語は、引用される起源から得られるはずであるポリヌクレオチド(このようなものが包含されるが)を必要とするまたは暗示するものではなく、むしろ任意の適した方法によって作製できる。
第1のポリペプチド(またはペプチド)は、(i)第2のポリヌクレオチドに由来する第1のポリヌクレオチドによってコードされる場合に、または(ii)上記のように第2のポリペプチドに対して配列同一性を示す場合に、第2のポリペプチド(またはペプチド)「に由来する」。この用語は、引用される起源から得られるはずであるポリヌクレオチド(このようなものが包含されるが)を必要とするまたは暗示するものではなく、むしろ任意の適した方法によって作製できる。
用語「別個の実体(単数または複数)」などは、本明細書に記載されるような1種または複数の分子標的および/または本明細書に記載されるような1種または複数のバーコードもしくは固有分子識別子をカプセル封入および/または含有可能な、複数のエマルジョン(二重エマルジョンなど)、ウェル、コンパートメントおよび容器を含む、小滴などの物体を指すように本明細書において使用される。対象方法、デバイスおよび/または系に関連して使用されるまたは作製されるような別個の実体は、球の形態であり得る、または任意のその他の形状、例えば、卵形もしくは長円形の形状を有し得る。本明細書に記載されるような別個の実体は、液相および/または固相材料を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の別個の実体は、ゲル材料を含む。いくつかの実施形態では、対象の別個の実体は、寸法、例えば、1.0μm~750μm、1.0μm~500μm、1.0μm~100μm、1.0μm~10μmまたは1.0μm~5μm(端点を含む)などの1.0μm~1000μm(端点を含む)の直径を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような別個の実体は、寸法、例えば、1.0μm~5μm、5μm~10μm、10μm~100μm、100μm~500μm、500μm~750μmもしくは750μm~1000μm(端点を含む)の直径を有する。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような別個の実体は、1fL~100pL、1fL~10pL、1fL~1pL、1fL~100fLもしくは1fL~10fL(端点を含む)などの約1fL~1nL(端点を含む)の範囲の容量を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような別個の実体は、1fL~10fL、10fL~100fL、100fL~1pL、1pL~10pL、10pL~100pLまたは100pL~1nL(端点を含む)の容量を有する。さらに、本明細書に記載されるような別個の実体は、マイクロ流体デバイス中、マイクロ流体デバイス上もしくはマイクロ流体デバイスによって製造され得るような、および/またはマイクロ流体デバイスから流れる、もしくはマイクロ流体デバイスによって適用されるような大きさおよび/または形状を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような別個の実体は、小滴である。用語「液滴」、「小滴」および「微小滴」は、第1の流体相と非混和性の第2の流体相(例えば、オイル)によって境界される、少なくとも第1の流体相、例えば、水相(例えば、水)を含有する、小さい全体的に球状の構造体を指すように、本明細書において同義的に使用される。いくつかの実施形態では、本開示の小滴は、第2の非混和性流体相、例えば、水相流体(例えば、水)によって境界される、第1の流体相、例えば、オイルを含有し得る。いくつかの実施形態では、第2の流体相は、非混和相キャリアー流体となる。したがって、本開示の小滴は、油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョンとして提供され得る。小滴は別個の実体について本明細書に記載されたような大きさおよび/または形状であり得る。例えば、本開示の小滴は、一般に、直径1μm~1000μm(端点を含む)の範囲である。本開示の小滴を使用して、細胞、核酸(例えば、DNA)、酵素、試薬および種々のその他の成分をカプセル封入できる。用語小滴は、マイクロ流体デバイス中、マイクロ流体デバイス上もしくはマイクロ流体デバイスによって製造される、および/またはマイクロ流体デバイスから流れる、もしくはマイクロ流体デバイスによって適用される小滴を指すように使用され得る。
本明細書において、用語「キャリアー流体」とは、本明細書に記載されるような、1種または複数の別個の実体、例えば、小滴を含有するように構成または選択される流体を指す。キャリアー流体は、1種または複数の物質を含み得、1つまたは複数の特性、例えば、マイクロ流体デバイスまたは送達開口部などのその一部を通って流されることを可能にする粘度を有し得る。いくつかの実施形態では、キャリアー流体は、例えば、オイルまたは水を含み、液体またはガス相中であり得る。適したキャリアー流体は、本明細書においてより詳細に記載される。
特許請求の範囲において使用されるように、「含む(including)」、「含有する(containing)」および「特徴とする」と同義である用語「含む(comprising)」は、包括的であるかまたはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素および/または方法のステップを排除しない。「含む」は、指定された要素および/またはステップが存在するが、その他の要素および/またはステップが追加されていてもよく、さらに関連対象の範囲内に入ることを意味する当技術分野の用語である。
本明細書において、語句「からなる」は、具体的に列挙されていない、任意の要素、ステップおよび/または成分を排除する。例えば、語句「からなる」が、プリアンブルのすぐ後ではなく請求項のボディの箇条書きに現れる場合には、その箇条書きに示される要素のみを限定し、その他の要素は、全体としての特許請求の範囲から排除されない。
本明細書において、語句「から本質的になる」は、関連開示の範囲または特許請求の範囲を、特定の材料および/またはステップならびに開示されるおよび/または特許請求される対象の基本的な新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」に関して、これら3種の用語のうち1種が本明細書において使用される場合には、ここで開示される主題は、その他の2種の用語の何れかの使用を含み得る。
方法
上記で要約されるように、本開示は、例えば、核酸シーケンシング技術によって、解析されるべき核酸標的分子にバーコード付加するためのマイクロ流体方法を提供する。また、種々のバーコード付加適用において使用するための核酸バーコードを調製する、マイクロ流体の小滴ベースの方法も提供する。本明細書に記載される方法は、核酸標的分子のハイスループットシーケンシングならびに単細胞または単一ウイルスゲノムの、トランスクリプトームの、および/またはプロテオミクスの解析/プロファイリングを容易にする。
上記で要約されるように、本開示は、例えば、核酸シーケンシング技術によって、解析されるべき核酸標的分子にバーコード付加するためのマイクロ流体方法を提供する。また、種々のバーコード付加適用において使用するための核酸バーコードを調製する、マイクロ流体の小滴ベースの方法も提供する。本明細書に記載される方法は、核酸標的分子のハイスループットシーケンシングならびに単細胞または単一ウイルスゲノムの、トランスクリプトームの、および/またはプロテオミクスの解析/プロファイリングを容易にする。
バーコードを作製するための方法
本開示は、次いで、対象の1種または複数の分子標的、例えば、対象の1種または複数の核酸を標識するために使用できる、核酸バーコード配列および/または固有分子識別子(UMI)を調製するための種々の方法を提供する。
本開示は、次いで、対象の1種または複数の分子標的、例えば、対象の1種または複数の核酸を標識するために使用できる、核酸バーコード配列および/または固有分子識別子(UMI)を調製するための種々の方法を提供する。
細胞バーコード:本開示のいくつかの実施形態では、細胞を使用して、別個の実体、例えば、小滴にバーコードを送達できる。例えば、本開示のいくつかの方法では、細胞可溶化液を含有する複数の別個の実体を提供する。可溶化液中の核酸にバーコード付加し、どの核酸が、どの小滴に、ひいては、単細胞に由来するかを同定することを可能にしながら、そのシーケンシングを可能にし得る。これを達成するために、各細胞にとって独特であるバーコードを、別個の実体中に導入してもよい。この目的を達成するために使用してもよい種々の方法がある。1つのこのような方法は、細胞を小滴中に導入することであり、これでは、バーコードは、例えば、高コピー数プラスミドとして細胞中で発現される。これは、細胞核酸の配列中により容易に組み込まれ得るように、バーコードの出発濃度を増大するように働く。適したプラスミドは、約1kb~約3kbの大きさであり得る。
バーコードを送達するために細胞を使用することは、いくつかの利点を有する。例えば、使用のためにより多くのバーコードを含有する細胞を製造するためには、集団の大きさを増大するようにバーコード含有細胞のライブラリーを増殖させることだけが必要である。バーコード含有細胞を作製するために、単一分子ランドマー(randomer)としてバーコードのライブラリーを合成的に作製し、次いで、これらを例えば、プラスミド中にクローニングすることができる。次いで、プラスミドを、大腸菌などの宿主細胞中に導入し、細胞を増殖させることによって増幅できる。
細胞バーコードの別の利点は、別個の物体である細胞を、例えば、慣性秩序化を使用して別個の実体、例えば、小滴中に制御可能にカプセル封入できることである。例えば、酵母または大腸菌などの細胞を、高速でチャネルを通して流すことができ、慣性効果を重要にし、チャネル中での細胞の慣性秩序化を引き起こし、それによって、細胞の周期的な間隔をもたらす。細胞の流れの周期性を、小滴メーカーの小滴生成の周期性とマッチさせることができ、小滴へのバーコード含有細胞の効率的なカプセル封入が可能となる。このプロセスを、可溶化液を含有する小滴のペアード合体と組み合わせて、例えば、細胞可溶化液を含有する小滴に高効率でバーコードを付加できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、(a)別個の実体中に複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、(b)別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む細胞を導入するステップと、(c)細胞を溶解して、別個の実体中に核酸バーコード配列の複数のコピーを放出するステップと、(d)別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを導入する方法であって、(a)複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)細胞を第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、細胞が、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、ステップと、(c)第1および第2の別個の実体を併合するステップと、(d)併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
1つのこのような実施形態では、第2の別個の実体は、微小滴であり、細胞を第2の別個の実体中にカプセル封入するステップは、(e)複数の細胞をマイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスは、チャネル中で細胞の慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機への細胞の周期的注入を提供する、ステップと、(f)注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性とマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々の細胞を、個々の微小滴中にカプセル封入するステップとを含む。
ビーズバーコード:本開示のいくつかの実施形態では、固体ポリマービーズまたはヒドロゲルビーズなどのビーズの表面で、バーコードを別個の実体、例えば、微小滴中に導入することが有利であり得る。これらのビーズは、種々の技術を使用して合成できる。例えば、ミックス-スプリット技術を使用して、同一のランダムバーコード配列の多数のコピーを有するビーズを合成できる。これは、例えば、DNAが合成され得る部位を含む、複数のビーズを作製することによって達成できる。ビーズを、4つの収集物に分割し、それぞれを、それに、A、T、GまたはCなどの塩基を付加するバッファーと混合することができる。集団を4つの小集団に分割することによって、各小集団は、その表面に付加される塩基のうち1種を有し得る。この反応は、単一塩基のみが付加され、さらなる塩基は付加されないような方法で達成できる。2回目に、4つの小集団すべてに由来するビーズを、組合せ、一緒に混合し、4つの集団に分割できる。この分割ステップでは、先の4つの集団に由来するビーズを、無作為に一緒に混合してよい。次いで、それらに4種の異なる溶液を添加し、各ビーズの表面で別のランダム塩基を付加できる。このプロセスを反復して、集団が分割され、混合される回数にほぼ等しい長さのビーズの表面上の配列を作製できる。これが10回行われる場合には、例えば、結果は、各ビーズが、その表面上に合成された、同一のランダムな10塩基配列の多数のコピーを有するビーズの集団となる。各ビーズ上の配列は、最後には各ミックス-スプリットサイクルによる反応器の特定の順序によって決定される。
例えば、ランダムUMI配列を有するプライマーを用いるPCRハイブリダイゼーションおよび伸長によって、ビーズ表面上の分子に、固有分子識別子(UMI)も付加できる。これによって、所与のビーズの表面上のどの個々のバーコードも、固有識別子を有することが可能となり、その結果、定量化において重複UMIを無視し、および/または集約させることによって、シーケンシングライブラリーの作製の際に種々の分子が増幅される速度のバイアスが、部分的に補正され得る。
ポリスチレンビーズのようなハードビーズを用いると、オリゴ合成のほとんどは、ビーズの表面に限局される。しかし、ポリアクリルアミド、アガロース、アルギン酸などのようなヒドロゲルビーズも使用でき、オリゴが、ビーズの大部分内でさえ合成されることを可能にする多孔性であるという利点を有する。これらの多孔性ビーズは、はるかに多数のオリゴが、ビーズ上およびまたはビーズ中で合成されることを可能にするという利益を有し、これは、多数の標的分子が、バーコードを用いて標識されることを必要とする適用にとって、またはその後の反応におけるバーコード濃度の化学量論を制御するために有利であり得る。
ヒドロゲルおよびその他のポリマービーズの別の利点は、環境条件を変更することによって、融解または溶解するように誘導され得ることである。例えば、低融点アガロースで作製されたビーズを用いると、ヒドロゲルの融点を上回って加熱される小滴中のアガロースビーズを融解することが可能であり、これは、PCRの熱サイクルの際に起こり得る。これは、バーコードが小滴の大部分中に混合することを可能にするという利点を有し、これは、バーコード付加反応の効率を増強し得る。さらに、ビーズを含有する、別個の実体、例えば、小滴を、0、1、2つのビーズなどといった特定の数のビーズを含有するか否か選別できる。これは、例えば、ほぼどの別個の実体も、1つのビーズなどの正確な数の所望のビーズを含有する、複数の別個の実体を作製ために使用できるので有利である。例えば、細胞核酸にバーコード付加する場合には、1つのビーズが、別個の実体、例えば、小滴中の1つの細胞または細胞可溶化液と対形成され得る。
ランダムカプセル封入技術を使用して、細胞のカプセル封入が達成される場合には、同じことがビーズについても当てはまるので、特定の別個の実体のみが、単一ビーズを含有しながら、特定の別個の実体、例えば、小滴のみが、単細胞を含有する。正確に1つの細胞および1つのビーズを有する別個の実体を得る可能性は、その結果、同一の別個の実体中に1つの細胞および1つのビーズをカプセル封入する可能性となり、これは、低いものであることが多い。これは、バーコード付加された分子標的、例えば、細胞核酸を作製するプロセスの効率を大幅に低減し得る。ビーズを含有する別個の実体のみが、細胞をカプセル封入するために使用されることを確実にするように選別することによって、対形成の効率を大幅に増大することができる。
ビーズの使用の別の利点は、別個の実体、例えば、小滴からの特定の核酸の濃縮を可能にすることができる、または、例えば、PCRの細胞可溶化液阻害などの反応の阻害のために反応バッファーを変更する必要と関連する問題を避けることができることである。例えば、バーコードおよびまたmRNA転写物のポリAテールとアニーリングできるポリT配列などの、標的核酸とハイブリダイズできる配列を有するビーズを使用して、各細胞を起源とするすべての転写物を、単一の関連するビーズ上に維持しながら、転写物とハイブリダイズさせ、可溶化液からそれらを潜在的に回収することが可能である。ビーズは小さいので、このプロセスは、多数の単細胞で並行して実施できる。
あるいは、複数の反応に関与するビーズを用いてより複雑な反応を実施する場合には、その他は阻害しないまま、それらのうちいくつかを阻害してもよく、ビーズはまた、価値あるものであり得る。例えば、目的がRT-PCRを実施して、単細胞トランスクリプトームにバーコード付加することである場合には、ビーズを使用して、別個の実体、例えば、小滴中の細胞のmRNAとハイブリダイズできる。次いで、別個の実体中で逆転写酵素反応を実施して、ビーズ上のバーコードでmRNA配列を伸長し、それによって、それらをバーコードを用いて標識できる。高濃度の細胞可溶化液中で、別個の実体中での続くPCRが阻害される場合には、別個の実体を破壊し、可溶化液からビーズを集め、回収できる。ビーズと結合しているバーコード付加された転写物を、次いで、単一チューブ中でおよび最適バッファー中でさらなるPCRに供し、可溶化液はもはや存在しないので、阻害を克服でき、また、アンプリコンが、それらと結合しているバーコードを有するビーズ配列上のcDNA分子から生成するので、転写物産物がバーコード付加されることも確実にする。
このような方法でビーズを使用するさらに別の利点は、同一ビーズライブラリーを使用後に保存し、再度使用してシーケンシングのために別のライブラリーを製造できるということである。これは、ビーズは固体であり、例えば、ビーズおよびその結合している核酸を、保存するように設計された保存バッファーから回収し、シーケンシングのためにアンプリコンのPCR作製を可能にするために増幅バッファー中に入れるなど、それらが現在入っているバッファーから取り出し、別のバッファー中に入れることができるという事実によって促進される。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸バーコード配列の複数のコピーを別個の実体中に導入する方法であって、(a)複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む多孔性ビーズを導入するステップであって、核酸バーコード配列の複数のコピーが、多孔性ビーズの1個または複数の孔によって規定される表面上に少なくとも部分的に分配される、ステップと、(c)別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。この方法はまた、非多孔性ビーズを使用しても実施でき、これでは、核酸バーコード配列の複数のコピーが、非多孔性ビーズの表面上に分配される、例えば、核酸結合分子によって非多孔性ビーズと結合される。
その他の実施形態では、本開示は、核酸バーコード配列の複数のコピーを別個の実体中に導入する方法であって、(a)複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、ここで、第2の別個の実体は、微小滴であり、ビーズは、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップは、(i)複数のビーズをマイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネル中でビーズの慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機へのビーズの周期的注入を提供する、ステップと、(ii)注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性とマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々のビーズを、個々の微小滴中にカプセル封入するステップを含む、ステップと、(c)第1および第2の別個の実体を併合するステップと、(d)併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、核酸バーコード配列の複数のコピーを別個の実体中に導入する方法であって、(a)複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)別個の実体中に、その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズを導入するステップであって、核酸バーコード配列の各コピーがそれと結合している固有分子識別子(UMI)を含む、ステップと、(c)別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、核酸バーコード配列の複数のコピーを別個の実体中に導入する方法であって、(a)複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、ここで、第2の別個の実体は、微小滴であり、ビーズは、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップは、(i)複数のビーズをマイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含む、ステップと、(ii)1種または複数のビーズを、小滴生成機によって製造された1種または複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(iii)小滴生成機によって製造された1種または複数の別個の実体を選別して、1つまたは複数のビーズを含まない別個の実体を除去するステップとを含む、ステップと、(c)第1および第2の別個の実体を併合するステップと、(d)併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
一本鎖バーコード:いくつかの実施形態では、本開示は、一本鎖バーコードを作製および/または使用する方法を提供する。これらのバーコードは、いくつかの技術を使用して作製できる。例えば、種々の分子の配列が少なくとも部分的に異なっている複数のDNAバーコード分子を得ることによって、それらを作製できる。次いで、これらの分子を、例えば、非対称PCRを使用して増幅して、一本鎖コピーを製造できる。あるいは、バーコード分子を環状化し、次いで、ローリングサークル増幅に供することができる。これは、バーコード付加された元のDNAが、単一の長い分子として何度も連結されている生成物分子を生じさせる。この利益は、バーコードコピーの長いストリングが、デバイス、例えば、マイクロ流体デバイスを通って流され得る単一分子であり、これによって、別個の実体、例えば、小滴中に個別にカプセル封入されるが、バーコード配列は、単一コピーよりもかなり多く存在することが可能になるということである。
いくつかの実施形態では、線形DNAを環状化することによって、任意の数の一定配列が両端に位置するバーコード配列を含有する環状バーコードDNAを得ることができる。任意の一定配列とアニールするプライマーは、鎖置換ポリメラーゼ(Phi29ポリメラーゼなど)の使用によってローリングサークル増幅を開始でき、バーコードDNAの長い線形コンカテマーを生成する。線形コンカテマーは、同一バーコードの複数コピーを含有する単一分子を表し、高コピーバーコードを別個の実体、例えば、小滴中に導入するために使用できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、一本鎖バーコードを調製するための方法であって、(a)複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)核酸バーコード配列を含む環状核酸分子を、別個の実体中に導入するステップと、(c)別個の実体を、核酸バーコード配列のコンカテマーが製造されるように、核酸バーコード配列のローリングサークル増幅に十分な条件に供するステップと、(d)別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、一本鎖バーコードを調製するための方法であって、(a)複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)核酸バーコード配列を含むDNA分子を別個の実体中に導入するステップと、(c)別個の実体を、核酸バーコード配列の複数の一本鎖コピーが製造されるように、核酸バーコード配列の転写連鎖反応(TCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、(d)別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、一本鎖バーコードを調製するための方法であって、(a)複数の核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)核酸バーコード配列を含むDNA分子を、別個の実体中に導入するステップと、(c)核酸バーコード配列の複数の一本鎖コピーが製造されるように、別個の実体を、核酸バーコード配列のローリングサークル転写連鎖反応(rcTCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、(d)別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
デジタルPCR:反応、例えば、別個の実体、例えば、小滴において生じる反応において使用するためのバーコードを製造するための1つの方法は、デジタルPCRを使用することである。このアプローチでは、別個の実体の画分が、分子を含有せず、通常、より小さい画分が単一分子を含有するように、個々のDNAバーコード配列を、制限希釈で別個の実体中にカプセル封入する。増幅に十分な試薬も別個の実体中に含まれ、別個の実体を、例えば、PCRのための熱サイクルなどの増幅を誘導するのに十分な条件下でインキュベートする。増幅によって、各小滴が、元の分子の多数のコピーで満たされる。このライブラリーを、直接使用してもよく、必要に応じて、能動的または受動的手段を使用して選別して、空の別個の実体を廃棄してもよい。
図1には、バーコードライブラリー作製法の実施形態が、全般的に表されている。ランダム領域(NNNNNNNまたはランダム塩基の任意の変動)を有する合成されたバーコードのライブラリーを、ほとんどの液滴が、1つのバーコードを含有するか、または含有しないように液滴中にカプセル封入できる。プライミング部位としてユニバーサル配列を使用することによって液滴内に単一バーコードが増幅される。単一バーコードを増幅するために使用できる例示的核酸増幅法として、PCR、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ヘリカーゼ依存性等温増幅、リコンビナーゼベースのPCR(twistamp)およびループ媒介性増幅(LAMP)が挙げられる。
バーコード別個の実体ライブラリーを使用するために、ライブラリー中の別個の実体を、バーコード付加のために意図される分子標的、例えば、核酸と組み合わせ、バーコード付加反応に供することができる。分子標的にそれらを導入する前にバーコードを増幅する利益は、その濃度を大幅に増大し、いくつかの場合には、その後のバーコード付加反応をより効率的にすることができるということである。例えば、増幅していないバーコードを用いる場合、バーコードを増幅し、次いで、オーバーラップエクステンションアプローチによるスプライシングを使用する場合に、標的核酸とのその結合を可能にするために、PCRの多数のサイクルが必要である場合がある。この多量の増幅は、連結が生じる前に試薬を分解し、その結果、非効率となり、さらなる熱サイクルを必要とし得、これは、増幅バイアスを生じ得る。熱サイクルを必要とするPCRに加えて、例えば、ループ媒介性等温増幅(LAMP)、複数の置換増幅(MDA)、複数のアニーリングおよびルーピングベースの増幅サイクル(MALBAC)などといった等温法を使用してもよい。バーコードを含有する別個の実体、例えば、小滴を固形化して、バーコード分子で満たされたゲル粒子を作製できる。共有結合性または非共有結合性相互作用を使用して分子をゲルと結合することができ、これによって、ゲルビーズが水性溶媒中に分散されることが、または別個の実体中のビーズの表面に結合されることが可能となる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸バーコード配列の複数のコピーを別個の実体中に導入する方法であって、(a)別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの核酸バーコード配列のいずれかを統計的に含有するように、個々の核酸バーコード配列を、制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、(b)別個の実体の集団中の核酸バーコード配列を酵素的に増幅して、複数の別個の実体のうちの別個の実体がそれぞれ、その別個の実体の個々の核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、複数の別個の実体を提供するステップと、(c)複数の別個の実体のうち1種または複数中に、複数の核酸標的分子を導入するステップと、(d)1種または複数の、複数の別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
コンビナトリアルライブラリー作製:細胞のトランスクリプトームなどの対象の特定のサンプルにバーコード付加する場合の課題は、別個の実体、例えば、小滴におけるバーコード配列と一緒の細胞の単離である。これによって、バーコード配列が細胞と独特に関連付けられることが可能になり、その結果、バーコードを含有するすべてのシーケンシングリードが、細胞を起源とするとわかる。技術的には、課題は、制御可能に、効率的に、迅速に個々の細胞とバーコードの対を作製することである。例えば、本明細書において論じられるビーズベースの方法を使用すると、これは、1つビーズおよび1つの細胞をどの小滴中にもカプセル封入することを必要とする。しかし、分子、ビーズ、細胞などといった別個の物体は、一般に、ランダムにカプセル封入されるので、カプセル封入の統計学は、ポワソン分布をたどり、単一物体を含有する小滴の小セットを得るために、多数の空のおよび使用できない小滴の生成を必然的に伴う。細胞およびバーコードなどの2種の別個の物体の同時カプセル封入を達成しようとする場合には、生じた圧倒的に大部分の小滴は、空となるか、もしくは単細胞を含有してバーコードを含有しないか、または単一のバーコードを含有して細胞を含有せず、これらのいずれも所望のデータをもたらさず、微小な画分が、細胞およびバーコードの両方を含有する。
この非効率性を克服するための1つの方法は、別個の実体、例えば、小滴に過負荷をかけることであり、その結果、例えば、細胞を有するどの別個の実体も、複数のバーコード配列を含有し、したがって、より多くの、細胞を含有する別個の実体が、所望のデータをもたらす。しかし、このような戦略では、データの不正確性につながる、各固有のバーコード配列をちょうど1つの細胞と関連付けることがもはや可能でなくなるので、これは、その他の課題を作り出し得る。各バーコード配列を、もとの1つの細胞と関連付けることが同様に可能でありながら、バーコード配列を有する小滴に過負荷をかけるための1つの方法は、バーコードがまた同様にバーコード付加される、コンビナトリアルブレーシング(bracing)アプローチを使用することである。
例えば、ただ1つの配列を含むバーコードではなく、例えば、オーバーラップエクステンションによるスプライシングを使用して一緒に接続されなければならない2つ以上の部分配列を含み得る。次いで、バーコードライブラリーを、2、3種などの異なるバーコード部分配列にわけることができ、そのそれぞれは、最終の結合されるバーコード分子内に存在する。この戦略では、異なるバーコード部分配列の濃度は、小滴の大部分が、各部分配列のうち少なくとも1種を得るように設定され得る。次いで、部分配列のすべてを、増幅され、細胞の分子標的、例えば、核酸を標識するために使用され得る単一バーコード分子に連結することによって、最終バーコードを作製することができる。
このアプローチでは、細胞およびバーコードをカプセル封入する可能性は、かなり高くなる。例えば、別個の実体、例えば、小滴の約80%が、各部分配列の少なくとも1つを得る、従って、使用可能なバーコードをもたらすようにバーコード部分配列の濃度が設定される場合には、細胞のカプセル封入が、バーコードのカプセル封入と相関していないと仮定すると、細胞を含有する別個の実体の80%がまた、バーコードを得、所望のデータをもたらす。固有分子識別子が使用される場合には、これは、バーコードの異なる部分と一緒になったステッチを有さずに達成されるが、これは、UMIは、本質的には、異なる細胞バーコードを一緒に関連付けるために使用できる第2の種類のバーコードを提供するからである。
例えば、3種のバーコード配列が、単細胞を有する小滴カプセルに封入され、UMIがそのcDNA産物と結合されると仮定する。これらのcDNA産物は、小滴中で各cDNAが増幅され、そのアンプリコンが、バーコード分子の1種を用いて標識され、使用されるものは、ランダムに選択されるような連鎖反応を使用して、次のステップにおいて細胞バーコードを用いてバーコード付加されることが多い。すべての小滴から核酸をシーケンシングする場合には、データはUMIによってグループ化され、各UMIは、例えば、3種のバーコード配列、最初の小滴中に同時カプセル封入されたものを一緒にグループ化することがわかる。次いで、これは、データのアナライザーに、これら3種のバーコードは、固有のバーコード配列による簡単なグループ化ではなく1種の小滴/細胞に対応する単一バーコードグループとして扱われなければならず、データは、バーコード配列の拡大されたセットによってグループ化されることを通知する。したがって、このアプローチでは、まず、UMIグループ化を使用して、各細胞に対応するバーコードグループを同定し、次いで、バーコードグループを使用して、各細胞のすべての配列リードをグループ化する。いくつかのバーコードグループは、ただ1種のみのバーコードを含み得、その他のものは、いくつの固有のバーコード配列が、バーコード付加連鎖反応の前にカプセル化小滴中に導入されたかに応じて、例えば、1、2、3種などのバーコード配列を含み得る。バーコードが、一連の連結している部分配列を含み、1種の部分配列によってまずグループ化して、それと関連しているすべてのその他の部分配列を同定し、次いで、部分配列の拡大されたセットを使用して、単細胞または別個の実体データをグループ化する代替アプローチにおいて、同様のバイオインフォマティックアルゴリズムを使用できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸バーコードライブラリーを調製する方法を提供し、これでは、方法は、(a)別個の実体の集団中に、(i)それぞれ、第1の核酸バーコード部分配列および第1の連結配列を含む、複数の第1の核酸分子と、(i)それぞれ、第2の核酸バーコード部分配列および第2の連結配列を含む、複数の第2の核酸分子をカプセル封入するステップであって、カプセル封入が、別個の実体の集団の少なくとも約10%、例えば、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%またはそれ以上の別個の実体が、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含むように実施される、ステップと、(b)別個の実体を、酵素的連結および/または増幅に十分な条件に供し、その結果、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含む別個の実体について、第1および第2の核酸分子の両方の配列を含む連結および/または増幅産物が製造され、複合核酸バーコード分子を提供するステップとを含む。上記の連結および/または増幅が、複合核酸バーコード分子の標的核酸分子との連結または複合核酸バーコード分子の標的核酸分子の増幅産物中への組込みと同時に起こり得ることは注目すべきである。
その他の実施形態では、本開示は、核酸標的分子にバーコード付加する方法であって、(a)複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)複数の固有分子識別子(UMI)分子を別個の実体中に導入するステップと、(c)別個の実体を、固有のUMI分子配列の、複数の核酸標的分子のうち複数またはその増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップ(それによって、複数の独特に標識された核酸を提供するステップ)と、(d)複数の異なる核酸バーコード配列を、別個の実体中に導入するステップと、(e)別個の実体を、複数のバーコード配列のうち1種の、複数の核酸標的分子またはその増幅産物またはその増幅産物の増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、UMIを、複数の核酸標的分子のうち複数中に組み込み、その後、カプセル封入してもよい。いくつかの実施形態では、両方とも特定の核酸を標識するUMIおよび核酸バーコード配列は、互いに直接接続されない。例えば、UMIは、核酸の一方の末端を標識し得、他方、核酸バーコード配列は、核酸のもう一方の末端を標識する。いくつかの実施形態では、UMIおよび核酸バーコード配列を連続して導入するのではなく、例えば、別個の実体中への核酸標的分子のカプセル封入後に、それらを同時に添加してもよい。
バーコードを核酸標的と連結するための方法
本開示は、核酸バーコード配列を核酸標的分子および/またはその増幅産物と結合するための種々の方法を提供する。
本開示は、核酸バーコード配列を核酸標的分子および/またはその増幅産物と結合するための種々の方法を提供する。
バーコードを核酸標的と連結すること:本開示のバーコード付加戦略の1つの目的は、独立配列リードが、例えば同一小滴由来の同一細胞由来など、同一の別個の実体、例えば、小滴内に存在していた分子を起源とするリードを関連付けるバーコードによって互いに関連付けられることを可能にすることである。この概念にとって重要なのは、標的核酸が分子の断片、分子の増幅産物またはさらには細胞またはウイルスを起源とするかにかかわらず、小滴中でバーコードを標的核酸と結合するための方法論である。
別個の実体内でバーコードを核酸と結合するために使用できる多数の技術がある。例えば、標的核酸を、まず、増幅し、より小さい小片に断片化してもよいし、しなくてもよい。分子を、バーコードを含有する別個の実体、例えば、小滴と組み合わせることができる。次いで、例えば、オーバーラップエクステンションによるスプライシングを使用して、バーコードを分子と結合できる。このアプローチでは、最初の標的分子は、それに対してプライマーが合成され得る既知配列の分子である付加された「アダプター」配列を有し得る。
バーコードと組み合わせる場合に、アダプター配列およびバーコード配列と相補的であるプライマーを使用でき、その結果、標的核酸およびバーコードの両方の産物アンプリコンが、DNA重合などのエクテンション反応によって互いにアニールし、互いの上に伸長され、バーコード配列に結合された標的核酸を含む二本鎖産物を生成し得る。
あるいは、その標的を増幅するプライマーをそれ自体バーコード付加でき、その結果、標的上でアニーリングし、伸長する際に、生じたアンプリコンは、その中に組み込まれたバーコード配列を有する。これは、PCRを用いる特異的増幅または例えば、MDAを用いる非特異的増幅を含むいくつかの増幅戦略を用いて適用できる。
バーコードを核酸と結合するために使用できる代替酵素反応は、平滑または付着末端連結を含む連結である。このアプローチでは、DNAバーコードを核酸標的およびリガーゼ酵素とともにインキュベートし、バーコードの標的との連結をもたらす。分子の末端に付加されるバーコードの数を上回る大きな制御を可能にするために、リガーゼまたは断片とともに導入されるアダプターを使用することによってを含め、いくつかの技術によって、連結のために必要に応じて核酸の末端を修飾できる。
バーコードを標的に付加するためのさらに別のアプローチは、トランスポサーゼとともに、または非特異的エンドヌクレアーゼなどの酵素の組合せもしくは非特異的エンドヌクレアーゼ(例えば、フラグメンターゼ(登録商標))およびリガーゼの組合せとともにそれらを直接的に導入することである。例えば、このアプローチでは、トランスポサーゼと適合するバーコードを合成できる。次いで、トランスポサーゼが標的分子を断片化し、バーコードを断片分子の末端に付加し、これによって、1つの反応で反応のすべてのステップを実施できる。これは、優雅で直接的であるが、酵素と適合するバーコードの作製を必要とするという課題を有する。フラグメンターゼ(登録商標)が核酸をシーケンシングするのに適した大きさに断片化し、リガーゼがバーコードを断片末端に結合するために使用される、フラグメンターゼ(登録商標)およびリガーゼの組合せも使用できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、(a)別個の実体中に(i)核酸標的分子と、(ii)核酸バーコード配列と、(iii)核酸標的分子の配列を増幅するように構成されたプライマーの第1のセットと、(iv)核酸バーコード配列の配列を増幅するように構成されたプライマーの第2のセットであって、プライマーの第1のセットの1種が、プライマーの第2のセットの1種の配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含むセットと、(v)酵素的増幅試薬とを導入するステップと、(b)別個の実体を、核酸標的分子の配列および核酸バーコード配列の配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、(c)別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、核酸標的分子の増幅された配列および核酸バーコード配列の増幅された配列を含む生成物を提供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、(a)別個の実体中に、(i)複数の核酸標的分子と、(ii)複数の核酸バーコード配列と、(iii)複数の核酸標的分子の配列を増幅するように構成された第1のプライマーセットと、(iv)複数の核酸バーコード配列の配列を増幅するように構成された第2のプライマーセットであって、第1のプライマーセットおよび第2のプライマーセットが、少なくとも部分的に相補性である配列を含むセットと、(v)酵素的増幅試薬とを導入するステップと、(b)別個の実体を、複数の核酸標的分子の配列および複数の核酸バーコード配列の配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、(c)別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、複数の標的核酸分子のうちの1種の増幅された配列および複数の核酸バーコード配列のうちの1種の増幅された配列をそれぞれ含む複数の生成物を提供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、(a)核酸バーコードプライマーのライブラリーを作製するステップであって、ライブラリー中の各核酸バーコードプライマーが、核酸標的分子とアニールするのに十分な第1の配列と、核酸バーコード配列を含む第2の配列とを含む、ステップと、(b)複数の別個の実体のそれぞれにおいて、ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコードプライマーおよび1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップであって、各別個の実体中に含めるためにライブラリーから選択される1種または複数のプライマーが、別個の実体中の核酸標的分子のうちの1種または複数とアニールするのに十分な第1の配列を有する1種または複数のプライマーを含む、ステップと、(c)各別個の実体において1種または複数の核酸標的分子を、その別個の実体中の1種または複数の核酸バーコードプライマーを使用して酵素的に増幅するステップであって、その結果、1種または複数の核酸標的分子の配列および核酸バーコード配列を含む増幅産物が製造される、ステップを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、核酸標的分子にバーコード付加する方法であって、(a)核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、(b)複数の別個の実体のそれぞれにおいて、ライブラリーから選択された1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、(c)別個の実体のそれぞれにおいて1種または複数の核酸標的分子を酵素的に断片化し、別個の実体のそれぞれ中の1種または複数の核酸バーコード配列のうち1種または複数を、その別個の実体中の1種または複数の標的核酸分子またはその増幅産物の断片中に酵素的に組み込むステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、核酸標的分子にバーコード付加する方法であって、(a)核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、(b)複数の別個の実体のそれぞれにおいて、ライブラリーから選択された1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、(c)別個の実体のそれぞれ中の1種または複数の核酸標的分子を、その別個の実体中の1種または複数の核酸バーコード配列と酵素的に連結するステップとを含む、方法を提供する。
例示的実施形態をここで、単細胞バーコード付加デバイスおよび方法を表す図2~4を参照して説明する。(1)微小滴の第1のセットを調製するステップであって、各微小滴が、例えば、プロテイナーゼK(PK)を用いる処理の結果として単細胞に由来する細胞可溶化液を含む、ステップと、(2)微小滴の第2のセットを調製するステップであって、各微小滴が、固有の核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、ステップとを含む。(3)可溶化液を含有する微小滴およびバーコードを含有する微小滴の対を、RT-PCR試薬とともに併合するために使用できるマイクロ流体デバイスの模式図。マイクロ流体デバイスのより詳細な模式図が、図4に提供されている。図3に示されるように、微小滴を対形成し、キャリアー流体、例えば、オイルによって間隔をあけ、より大きなRT-PCR試薬を含有する液滴と併合する。連鎖RT-PCRを、最終併合液滴中で実施して、バーコードをcDNAに結合し、連結された産物を増幅する。図4にマイクロ流体デバイスの詳細な模式図が提供され、これでは、小滴再注入機構、液体電極、モートおよび間隔をあけるキャリアー流体、例えば、オイルのリザーバーおよびRT-PCR試薬が同定される。マイクロ流体デバイスは、モート(moat)塩溶液を利用する(誘電泳動偏向のために使用される場勾配を作製するためにおよび意図されない小滴併合を引き起こし得る漂游磁界を制限するために)。
微小滴を操作するための方法
スプリット-併合法:本開示の一態様は、別個の実体中での反応の実施も可能にしながら、別個の実体中で細胞をバーコードと組み合わせることを可能にするワークフローである。これを達成するための課題は、細胞可溶化液が、PCRなどの特定の反応の強力な阻害剤であり得、この阻害効果を克服するためのステップを必要とすることである。これを達成するための1つの方法は、細胞可溶化液を、プロテアーゼを用いて消化して、反応を干渉し得る化合物を分解し、希釈を使用して、化合物を受け入れられるレベルに希釈する2ステップ手順を使用することである。これは、いくつかの方法を使用して達成できる。例えば、1つの方法は、細胞可溶化液を含有する小滴を、大幅に大きな小滴と併合して、例えば、最終小滴における細胞可溶化液の大幅な希釈を達成することである。しかし、このアプローチを用いた場合の課題は、形成される大きな小滴が、PCRなどの下流反応に必要な取り扱いまたは温度循環に関してあまり安定ではない場合があることである。さらに、より大きな小滴を作製するのに必要な試薬の容量は、生じる小滴の数およびその容量に比例し、したがって、より大きな小滴は、より多くの総試薬を必要とし、プロセスを、利用可能な資源をより要求するものにする。
スプリット-併合法:本開示の一態様は、別個の実体中での反応の実施も可能にしながら、別個の実体中で細胞をバーコードと組み合わせることを可能にするワークフローである。これを達成するための課題は、細胞可溶化液が、PCRなどの特定の反応の強力な阻害剤であり得、この阻害効果を克服するためのステップを必要とすることである。これを達成するための1つの方法は、細胞可溶化液を、プロテアーゼを用いて消化して、反応を干渉し得る化合物を分解し、希釈を使用して、化合物を受け入れられるレベルに希釈する2ステップ手順を使用することである。これは、いくつかの方法を使用して達成できる。例えば、1つの方法は、細胞可溶化液を含有する小滴を、大幅に大きな小滴と併合して、例えば、最終小滴における細胞可溶化液の大幅な希釈を達成することである。しかし、このアプローチを用いた場合の課題は、形成される大きな小滴が、PCRなどの下流反応に必要な取り扱いまたは温度循環に関してあまり安定ではない場合があることである。さらに、より大きな小滴を作製するのに必要な試薬の容量は、生じる小滴の数およびその容量に比例し、したがって、より大きな小滴は、より多くの総試薬を必要とし、プロセスを、利用可能な資源をより要求するものにする。
安定性を増強する1つの方法は、可溶化液を含有する小滴をより大きな小滴と併合し、内容物を混和し、次いで、続くステップのために、大きな混和された小滴の一部を分割することである。しかし、このアプローチは、より大きな小滴を作製するために、依然として、多量の試薬を使用し得る。同一希釈を達成できるこのアプローチの代替法は、まず、可溶化液を含有する小滴(または任意のその他の適した材料を含有する小滴)を分割し、次いで、分割部分を、例えば、分割される前の可溶化液小滴とおよそ同一の大きさである試薬小滴と併合する。例として、可溶化液を含有する小滴を分割して、可溶化液を含有する小滴の容量のおよそ10%を有する複数の小滴を提供してもよい。次いで、これらの低減した容量の小滴を、元の可溶化液を含有する液滴の容量のおよそ90%を有する試薬小滴と併合して、およそ10×希釈を提供してもよい。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、微小滴を操作するための方法であって、(a)第1の複数の微小滴および第2の複数の微小滴を作製するステップと、(b)マイクロ流体デバイスのチャネル中に、第1の複数の微小滴を流すステップと、(c)第1の複数の微小滴のそれぞれを分割して、複数の低減された容量の微小滴を提供するステップと、(d)複数の低減された容量の微小滴のそれぞれを、第2の複数の微小滴の微小滴と併合するステップであって、第2の複数の微小滴の微小滴がそれぞれ、第1の複数の微小滴のものとおよそ同等またはそれより少ない容量を有する、ステップとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第1および/または第2の複数の微小滴は、約5μm~約200μm、例えば、約15μm~約150μmまたは約15μm~約50μmの直径を有する。
複数の微小滴を併合すること:本開示のいくつかの実施形態では、小滴の対のみとは対照的に、いくつかの小滴を一緒に併合することが望ましい場合がある。これは、小滴が、単一の接合されているチャネル中に流れるような方法で、別個の入口から異なる小滴の種類をマイクロ流体デバイス中に導入することによって成し遂げることができる。小滴は、異なる小滴の種類のグループとして流れるように導入され得る。これは、例えば、異なる種類が単一チャネル中に導入されるチャネルの出口を接合することによって達成でき、その結果、1つの小滴の流れが、隣接するチャネルにおける小滴の流れを部分的に妨害する。接合されているチャネル中に最初の小滴が入った後、第2の小滴が、その後に流入し、小滴が、代替流として接合されているチャネル中に注入されるようにできる。この概念は、3種またはそれ以上の小滴など、より大きな数の小滴に拡張することができる。また小滴を、異なる小滴の種類を異なる大きさにし、それによって、より小さい小滴がより大きな小滴に「追いつく」ようにさせ、自然にグループを形成することによってグループとして流れるように導入できる。次いで、電場をかけることまたは本明細書に記載される併合形状を使用することによって、それらを併合できる。あるいは、小滴の対を、より大きな小滴などの別の小滴と並行して流し、それと併合できる。また、それらを、液体噴射などの流と併合でき、次いで、必要な場合には、より小さい小滴中に押し入れるためにこれを導入できる。小滴流の併合および小滴の噴射併合は、以下でより詳細に論じる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、2種以上の微小滴を併合するための方法であって、(a)2種以上の微小滴の集団を、マイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップであって、(i)フローチャネルが、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけるように構成された、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連する、微小滴併合セクションを含み、(ii)微小滴の2種以上の集団が、それぞれ、2種以上の別個の入口チャネルから単一接合点でフローチャネル中に導入され、(iii)各入口チャネルからの微小滴投与量が、水力学的効果のために少なくとも部分的に同調し、微小滴の間隔がとられたグループの放出をもたらし、微小滴の間隔があげられたグループの少なくとも一部が、微小滴の2種以上の集団のそれぞれに由来する微小滴を含むように、微小滴の2種以上の集団が、フローチャネル中に導入される、ステップと、(b)微小滴の間隔があげられたグループを、微小滴併合セクション中に流すステップと、(c)1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分を使用して、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけることによって、間隔があげられたグループ内の微小滴を併合するステップとを含む、方法を提供する。
液滴流/液滴噴射組合せ:いくつかの実施形態では、本開示は、2種以上の液体を併合するための方法であって、(a)第1の液体を、非混和相液体と少なくとも部分的に接触する流としてマイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップと、(b)第2の液体を含む微小滴を、フローチャネル中に導入するステップと、(c)微小滴を流中に併合し、それによって第1および第2の液体を組み合わせるステップと、(d)組み合わされた第1および第2の液体を含む流を、組み合わされた第1および第2の液体を含む個々の微小滴中に押し入れるステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、フローチャネルは、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけるように構成される、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連する微小滴併合セクションを含み、方法は、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場を適用して、微小滴を流に併合するステップを含む。
上記の方法のいくつかの実施形態では、第1の液体を、滴下条件下でフローチャネル中に導入する。その他の実施形態では、第1の液体を、噴射条件下でフローチャネル中に導入する。これらの実施形態の例は、図5、パネルAおよびBにそれぞれ提供されている。
一般に、滴下-噴射移行は、適用可能な粘度比、キャピラリー数、ウェーバー数およびレイノルズ数によって決定される。例えば、およそ1の粘度比、<1のレイノルズ数、<1のウェーバー数および<1のキャピラリー数は、小滴形成条件を提供する。上記の条件からの逸脱は、噴射または安定なコーフローをもたらす傾向がある。例えば、それぞれの開示内容が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Nunesら J Phys D Appl Phys.2013年3月20日;第46巻(11号):114002頁およびUtadaら Phys.Rev.Lett.第99巻、094502を参照のこと。
小容量の液体を処理するために利用できるさらなる実施形態の一例が、図6に表わされている。示されるように、小滴を再注入し、例えば、電気合体によって、非混和相液体と少なくとも部分的に接触している液体噴射、例えば、油中水噴射と併合する。液滴液体は、ボーラスとしてのままであり、併合後に小滴として分割、希釈および/または再形成され得る。小滴-噴射併合の概念および実施は、バーコード付加に関連するもの以外の適用および本明細書において記載される関連解析法を含む液体取り扱いの分野において広い適用性を有することは注目すべきである。
単一細胞トランスクリプトーム解析およびシーケンシング
個々の細胞のトランスクリプトームをシーケンシングするために、種々のワークフローを使用できる。1つのワークフローでは、SMART(商標)試薬(Clontech Laboratories、Palo Alto、CAから入手可能、例えば、Zhuら、BioTechniques 第30巻:892~897頁(2001年)を参照のこと)などのcDNA合成および細胞トランスクリプトームの増幅に十分な試薬を、バーコード付加のための試薬と一緒に細胞可溶化液を含有する小滴中に導入することができる。次いで、小滴を熱サイクルすることによって、同一ステップで反応を実施し、mRNAトランスクリプトームのcDNA合成、その増幅および例えば、オーバーラップエクステンションPCR(SOEing PCR)によるスプライシングを使用する、バーコードを用いる増幅産物の末端のタギングをもたらすことができる。
個々の細胞のトランスクリプトームをシーケンシングするために、種々のワークフローを使用できる。1つのワークフローでは、SMART(商標)試薬(Clontech Laboratories、Palo Alto、CAから入手可能、例えば、Zhuら、BioTechniques 第30巻:892~897頁(2001年)を参照のこと)などのcDNA合成および細胞トランスクリプトームの増幅に十分な試薬を、バーコード付加のための試薬と一緒に細胞可溶化液を含有する小滴中に導入することができる。次いで、小滴を熱サイクルすることによって、同一ステップで反応を実施し、mRNAトランスクリプトームのcDNA合成、その増幅および例えば、オーバーラップエクステンションPCR(SOEing PCR)によるスプライシングを使用する、バーコードを用いる増幅産物の末端のタギングをもたらすことができる。
これは、少数のデバイスまたは潜在的には、単一のデバイスで実施できる比較的簡単なワークフローであり、トランスクリプトの末端についての情報を提供し、これは、発現プロファイリングにとって有用である。このアプローチは、cDNA合成、増幅およびバーコード付加のためのすべての反応が1ステップで実施されるので、本明細書において「SMARTOne」と呼ばれる。あるいは、逆転写酵素に頼るcDNA合成を、1ステップで実施でき、次いで、後のステップにおいて増幅およびバーコード付加を実施するために試薬を添加できる。これらの反応が、異なるステップで実施されることを可能にすることによって、個々のステップの後のバッファーの修飾が可能となり、これは、最も正確なデータを得るために反応を最適化するために価値あるものであり得る。この方法は、本明細書において「SMART-2Step」と呼ばれる。
記載される方法の両方とも、mRNAトランスクリプトの末端のシーケンシングリードを提供する。全長転写物配列を得ることが望ましい場合には、いくつかの選択肢もある。1つの選択肢は、これまでに記載されたアプローチからバーコード付加されたトランスクリプトを得、例えば、例えば、PACBIO RS IIシーケンサー、Pacific Biosciences、Menlo Park、CAなどの長い分子のシーケンシング技術を用いてそれらをシーケンシングすることである。あるいは、本明細書において記載される長い分子のシーケンシング法もまた、この目的のために使用できる。これらの方法の両方とも、スプライス変動に関するリードを提供するだけでなく、全長の個々の転写物分子の再構築を可能にするという利点を有する。
代替アプローチとして、断片化およびバーコード付加を以下の通りに実施することがある。細胞mRNAを、本明細書において「SMART-Tag」と呼ばれる1ステップで、または、本明細書において「SMART-Tag-2Step」と呼ばれる、最初にcDNA合成が起こり、第2のステップで増幅に十分な試薬を添加する2ステップでcDNAに逆転写し、増幅する。次いで、増幅された分子を、任意の適した方法/試薬、例えば、例えば、フラグメンターゼ(登録商標)またはトランスポサーゼを使用する断片化に供し、次いで、例えば、トランスポサーゼを用いる断片化の間に挿入されるアダプターを使用する連結またはSOEingなどのこれまでに記載された方法のいずれかを用いて、バーコードを導入する。さらに、cDNA合成ステップの前、その間またはその後に、固有分子識別子(UMI)を用いて標的分子を標識化できる。これらのUMIは、実質的に互いに異なっており、分子を標識し、UMI多様性を活用することによって、より正確な転写物カウントが可能となる。
さらに別のアプローチは、シーケンシングのために特定のトランスクリプトを標的とすることであり、これは、いくつかの技術を使用して達成できる。例えば、特異的プライマーを使用して、cDNA合成または増幅ステップの際に特定の配列のみを逆転写でき、次いで、これをバーコード付加に供することができる。これは、例えば、細胞集団においてシーケンシングのためにBまたはT細胞受容体遺伝子を標的とするために使用でき、これは、疾患バイオマーカーまたは治療用抗体を同定するために有用であり得る。例えば、複数の遺伝子の発現および順序を相互に関連付けるためにプライマーセットをマルチプレックス化することによってその他の組合せを選択することもできる。例えば、HIV感染においてウイルス遺伝子を、これらの遺伝子のみにバーコード付加するプライマーセットを設計することによって、宿主遺伝子の発現と相互に関連付けることができる。これは、より一層簡単なデータを提供し、また、本開示のいくつかの適用において有用である、シーケンシングが対象の遺伝子にターゲッティングされることを可能にするという利点を有する。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、単細胞由来のRNAにバーコード付加して増幅させる「SmartOne」法であって、(a)別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、(b)細胞を溶解して、別個の実体内のRNA標的分子を放出するステップと、(c)各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列ならびにcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、(d)各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列のcDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供し、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含む、複数の別個の実体を提供するステップとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、カプセル封入し、溶解し、cDNA合成するステップは、最初のマイクロ流体デバイスにおいて実施され、例えば、SOEing PCRによる、酵素的組込みは、第2のマイクロ流体デバイスにおいて実施され、「SMART-2Step」法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる「SmartOne」法であって、(a)別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、(b)各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列およびcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、(c)各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列のcDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップであって、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含む、ステップとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、cDNA合成ステップは、第1のマイクロ流体デバイスにおいて実施され、酵素的組込みは、第2のマイクロ流体デバイスにおいて実施され、「SMART-2Step」法を提供する。
いくつかの実施形態では、上記の方法は、各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬を導入するステップを含み、ここで、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列のcDNA増幅産物への酵素的組込みに十分な条件は、固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分である。このような試薬は、例えば、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含み得る。
これらの方法において使用される核酸バーコード配列および/またはUMIは、本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製および/または導入され得る。さらに、マイクロ流体デバイスのいずれかまたは本明細書に記載されるその特徴を、これらの方法に関連して使用できる。
その他の実施形態では、本開示は、単細胞由来のRNAにバーコード付加して増幅させる「SMART-Tag」法であって、(a)別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を、制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、(b)別個の実体内のRNA標的分子を放出するように細胞を溶解するステップと、(c)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体をcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、(d)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、(e)各別個の実体中に、その別個の実体に固有の核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を核酸バーコード配列の断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ステップ(c)は、2つの異なるステップにおいて、および/または2種の異なるデバイスを使用して実施され、cDNA合成に十分な試薬が導入され、各別個の実体が、cDNA合成に十分な条件に付される第1のステップおよび得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬が導入され、各別個の実体が、得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に付される第2のステップは、「SMART-Tag-2Step」を提供する。別の「SMART-Tag-2Step」法では、ステップ(e)は、ステップ(d)から得られた別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入するステップと、核酸バーコード配列を含む別個の実体をマイクロ流体デバイス中に導入するステップと、別個の実体を併合して、増大した容量の別個の実体を提供するステップとを含む。
その他の実施形態では、本開示は、単細胞由来のRNAにバーコード付加して増幅させる「SMART-Tag」法であって、(a)別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、(b)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、(c)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、(d)各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の断片化されたcDNA産物への酵素的組込みに十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を、核酸バーコード配列の断片化されたcDNA産物の酵素的組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ステップ(b)は、2つの異なるステップにおいて、および/または2種の異なるデバイスを使用して実施され、cDNA合成に十分な試薬が導入され、各別個の実体がcDNA合成に十分な条件に付される第1のステップおよび得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬が導入され、各別個の実体が、得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に付される第2のステップは、「SMART-Tag-2Step」を提供する。別の「SMART-Tag-2Step」法では、ステップ(d)は、ステップ(c)から得られた別個の実体をマイクロ流体デバイス中に導入するステップと、核酸バーコード配列を含む別個の実体をマイクロ流体デバイス中に導入するステップと、別個の実体を併合して、増大した容量の別個の実体を提供するステップとを含む。
細胞中で核酸にバーコード付加するためのこれまでに記載された方法は、大部分、反応物中のすべての成分が、小滴コンパートメント中で可溶性である均質な液相反応を利用する。しかし、特定の実施形態において価値あるものであり得る別のアプローチは、ビーズなどの固相支持体の使用である。例えば、1種または複数の固相支持体を、核酸標的分子とハイブリダイズするように設計されるオリゴを用いてコーティングでき、小滴中にカプセル封入し、核酸標的分子の固相支持体の表面とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートできる。固相支持体を小滴から回収することまたは固相支持体と結合しているオリゴ上でハイブリダイズされた分子の逆転写酵素もしくはポリメラーゼ伸長を実施することなどのさらなる反応は、実施される場合も実施されない場合もある。
小滴中の分子は、cDNA合成および/または断片化反応の結果であり得、ビーズとハイブリダイズする配列は、例えば、トランスポサーゼまたはリガーゼによって付加されるアダプターであり得る。あるいは、断片化を、ハイブリダイゼーションおよび/または伸長が起こった後に固相支持体上で実施し、標的核酸の結合している末端を除いてすべてを除去できる。
固相支持体はまた、核酸標的にバーコード付加するために使用できる。このアプローチでは、捕獲配列においてコーティングされることの代わりに、またはそれに加えて、核酸バーコード配列および/またはUMIでコーティングされ得るビーズを作製できる。次いで、ビーズをハイブリダイゼーションおよび/または伸長に十分な条件下で核酸標的とともにインキュベートし、それによって、小滴中の配列をビーズの表面に移すことができる。例えば、そのバーコードおよびUMIを含むビーズから核酸を増幅して出すことによってビーズからシーケンシングライブラリーを調製し、生成物でライブラリー調製反応を実施できる。必要に応じて、ビーズで断片化も実施し、ビーズから切断された生成物を放出できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、シーケンシングのためにcDNAを調製する方法であって、(a)cDNAを複数の断片に断片化するステップであって、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部断片を含む、ステップと、(b)固相支持体とともに1つまたは複数の別個の実体中に複数の断片をカプセル封入するステップと、(c)固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、(d)固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、(e)固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップとを含む、方法を提供する。cDNAを、単細胞を起源とするmRNAから作製でき、ここで、各cDNAは、mRNAが起源とする細胞に対して独特である5’末端および/または3’末端中に組み込まれている核酸バーコード配列を含む。さらに、各cDNAは、5’末端および/または3’末端中に組み込まれた固有分子識別子(UMI)を含み得る。
その他の実施形態では、本開示は、シーケンシングのためのバーコード付加された核酸を調製する方法であって、(a)別個の実体中に複数の核酸標的分子および複数のビーズをカプセル封入するステップであって、複数のビーズのそれぞれが、核酸バーコード配列、固有分子識別子(UMI)および複数の核酸標的分子のうちの1種とハイブリダイズするように設計された核酸捕獲配列を含む、ステップと、(b)別個の実体を、1種または複数の核酸標的分子および核酸捕獲配列のハイブリダイゼーションに十分な条件に供するステップと、(c)その後の解析のために別個の実体から複数のビーズを回収するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、核酸バーコード配列の1種またはその増幅産物を、複数の標的核酸分子またはその増幅産物のそれぞれ中に酵素的に組み込むステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、核酸バーコード配列の1種上で複数の核酸標的分子のそれぞれを酵素的に伸長して、核酸バーコード配列またはそれに相補的な配列および核酸標的分子の配列の少なくとも一部を含むキメラ分子を作製するステップを含む。
単一細胞ゲノム解析およびシーケンシング
核酸のディープシーケンシングのための増幅:いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して、単細胞の核酸を起源とする長い単一分子を含む分子をディープシーケンシングできる。これを達成するために、分子を増幅することが望ましいことであり得ることが多く、その結果、断片化およびバーコード付加の際に、断片化された産物中の元の分子の各領域の複数のコピーがあり、各領域の多種多様のシーケンシングが可能になり、ソースエラーを平均する正確なデータの収集を可能にし得る。
核酸のディープシーケンシングのための増幅:いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して、単細胞の核酸を起源とする長い単一分子を含む分子をディープシーケンシングできる。これを達成するために、分子を増幅することが望ましいことであり得ることが多く、その結果、断片化およびバーコード付加の際に、断片化された産物中の元の分子の各領域の複数のコピーがあり、各領域の多種多様のシーケンシングが可能になり、ソースエラーを平均する正確なデータの収集を可能にし得る。
標的核酸を増幅するためのアプローチは、マイクロ流体小滴などのコンパートメント中に、常にではないが、しばしば、個々の分子として標的をカプセル化することを含む。熱安定性ポリメラーゼを含む、熱サイクルされる増幅または多重置換増幅のためのポリメラーゼなどの等温増幅に必要な酵素などの、増幅に十分な試薬もまた、小滴中に含まれ得る。元のDNA標的からRNAの複数のコピーを作製するためにDNA依存性RNAポリメラーゼを使用し、RNAの複数のコピー自体をDNAに戻すことができ、本質的に標的の増幅をもたらす増幅などのその他のあまり一般的ではない形態の増幅を適用してもよい。例えば、標的を生物に形質転換し、次いで、生物が生物の複製を伴って、または伴わずに、標的をコピーすることを可能にされ得る、または誘導され得ることによって、生存生物を使用して標的を増幅できる。増幅の程度はまた、所望のレベルの増幅を成し遂げるように増幅試薬の濃度を調節することによって制御できる。いくつかの例では、これは、増幅産物が使用される反応の微調整にとって有用である。
開示された方法とともに使用するための適した増幅法として、例えば、DNAポリメラーゼPCR、RecA媒介性組換えPCR、ヘリカーゼ置換PCRならびに/またはそれだけには限らないが、多重置換増幅(MDA)、多重アニーリングおよびルーピングベースの増幅サイクル(MALBEC)、ローリングサークル増幅、ニック置換増幅およびループ媒介性等温増幅(LAMP)を含む鎖置換ベースの鋳型増幅法を挙げることができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、バーコードベースのシーケンシングの区画化された増幅された標的ライブラリーを製造するための方法であって、(a)核酸標的分子の酵素的増幅に十分な試薬とともに、複数の別個の実体中に、複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、(b)別個の実体を、核酸標的分子の酵素的増幅に十分な条件に供して、増幅産物を提供するステップと、(c)増幅産物を断片化するステップと、(d)核酸標的分子を断片化された増幅産物中に組み込むステップとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、複数の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの核酸バーコード配列のいずれかを統計的に含有するように、複数の核酸標的分子を、制限希釈で複数の別個の実体中にカプセル封入する。
これらの方法によって分析され得る標的核酸は、1kbを超える長さ、例えば、10kbを超える長さ、100kbを超える長さまたは1000kbを超える長さなどの比較的長いものであり得る。いくつかの実施形態では、これらの方法によって分析され得る標的核酸は、約1kbから1000kbの間、例えば、約10kbから500kbの間または約10kbから100kbの間の長さを有する。
小滴中での断片化:開示された方法による長い分子のディープシーケンシングにおける別の重要なステップは、制限されたリード長を有することが多い既存のプラットフォームを用いるそのシーケンシングを可能にする長さへの核酸の断片化であり得る。断片化は、種々の方法で成し遂げることができ、増幅された、または増幅されていない核酸標的のいずれかに適用することができる。例えば、フラグメンターゼ(登録商標)またはその他のヌクレアーゼなどのDNAの断片化を可能にする酵素を、別個の実体中に含めることができ、別個の実体を、断片化に十分な条件に供することができる。DNAを断片化可能な適した酵素として、例えば、DNアーゼI、小球菌ヌクレアーゼ、DNアーゼIIIおよび配列特異的触媒作用を有するヌクレアーゼを含む断片化されたDNAをもたらす任意のその他のヌクレアーゼを挙げることができる。あるいは、酸、反応性酸素種などを含めることといった化学的方法を使用できる。DNAを分解する生物も、それらを核酸とともにコンパートメント中に含めることによって使用できる。コンパートメント中に含有されるか、含有されない、または水力学的噴射中の核酸の流れによって生じるせん断などの物理的方法も使用できる。断片化を含む核酸での多数の作業を実施するその他の方法も使用できる。例えば、トランスポゾンを使用して、核酸中に配列を挿入または結合することもでき、そのプロセスでそれらを断片化することも多い。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸標的分子を断片化し、バーコード付加する方法であって、(a)複数の核酸標的分子またはその増幅産物を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)別個の実体を、核酸標的分子またはその増幅産物の断片化に十分な条件に供して、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物を提供するステップと、(c)核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列によって、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片が、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定される、ステップとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、供するステップは、UV光の適用によって核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、供するステップに先立って、1つまたは複数の酵素的切断部位、例えば、dUTPを含む1つまたは複数の酵素的切断部位を、核酸標的分子またはその増幅断片中に組み込むステップを含む。
いくつかの実施形態では、供するステップは、マイクロ流体チャネル、マイクロ流体噴射またはマイクロ流体デバイス中のマイクロ流体接合部を通る核酸標的分子またはその増幅産物の水力学的流れによって誘導されるせん断力などの力の適用によって、核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む。
いくつかの実施形態では、供するステップは、例えば、Tn5トランスポゾン、Muトランスポゾンまたは当技術分野で公知の任意のその他の適したトランスポゾンを使用するトランスポゾン挿入によって、核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む。
細胞におけるコピー数変動を特性決定すること:いくつかの実施形態では、本開示は、細胞におけるコピー数変動を特性決定する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、細胞におけるコピー数変動を特性決定するための方法であって、(a)別個の実体中の単細胞を単離するステップと、(b)別個の実体中の細胞性核酸を断片化するステップと、(c)固有分子識別子(UMI)を、断片化された細胞性核酸中に組み込むステップと、(d)断片化された細胞性核酸をシーケンシングするステップと、(e)UMIを使用して、細胞性核酸中の特定の配列のコピー数を推測するステップとを含む、方法を提供する。
ディープシーケンシングのためにバーコードを連結すること:ディープシーケンシングワークフローにおける重要なステップは、増幅されているか、断片化されているか否かにかかわらず、一時、同一の別個の実体、例えば、微小滴中にあった分子を、例えば、別個の染色体またはゲノムセグメントのように、同一分子、ウイルスまたは細胞を起源とするので、バーコードによってリードを計算的に選別することによって互いに関連付けることができるように、バーコードを核酸と連結することである。バーコード連結は、T4リガーゼ、T7リガーゼ、大腸菌リガーゼ、Taq DNAリガーゼ、RNAリガーゼなどといったリガーゼを使用することまたは直接トランスポゾン挿入および断片化を含む種々の技術を使用して達成できる。バーコード付加されたDNAと断片DNA間の鎖交換を達成できる、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リパーゼなどを用いる組換え法も使用できる。
強力であり得る別の方法として、オーバーラップエクステンションPCR(SOEing PCR)があり、これを使用して、増幅産物においてバーコードおよび断片を一緒にスプライシングすることができる。これは、例えば断片の配列を増幅するように構成された第1のセットのプライマーおよび核酸バーコード配列の配列を増幅するように構成された第2のセットのプライマーを使用することによって成し遂げることができ、ここで、第1のセットのプライマーの1種は、第2のセットのプライマーの1種の配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含む。次いで、プライマー、断片および核酸バーコード配列を、断片の配列および核酸バーコード配列の配列の酵素的増幅に十分な条件に供することができ、ここで、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される。次いで、反応混合物を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに十分な、ハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、断片の増幅された配列および核酸バーコード配列の増幅された配列を含む産物を提供できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、バーコードを、断片化された核酸またはその増幅産物に結合するための方法であって、(a)複数の別個の実体、例えば、微小滴中で、複数の断片化された核酸標的分子、核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、(b)複数の別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップであって、核酸バーコード配列が、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片またはその増幅産物を、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定する、ステップとを含む、方法を提供する。
単一細胞/単一分子次世代シーケンシング(NGS)ワークフロー:本明細書に記載された核酸ディープシーケンシング技術の目的は、特定の分子を起源とするシーケンシングリードが互いに関連付けられることを可能にする、別個の実体、例えば、微小滴または一連の別個の実体における標的核酸の、増幅、断片化およびバーコード付加を可能にすることである。このアプローチの態様は、本明細書に記載されるように、標的核酸の単離、増幅、断片化およびバーコード連結を含み得る。しかし、標的適用のプロセスを最適化するために必要に応じて、異なるステップを含めてもよく、省略してもよい。例えば、増幅ステップが省略される場合には、核酸はただ、その増幅されないコピー数で断片化ステップのために存在する。これは、断片化およびバーコード付加プロセスにおいて何らかの非効率がある場合には、バーコード付加されていない元の核酸の部分があり、これらの領域のシーケンシングにおいてギャップがあり得ることを意味する。
その他の実施形態では、断片化およびバーコード付加は、例えば、トランスポサーゼを使用して単一ステップで、または例えば、フラグメンターゼ(登録商標)を使用する断片化技術に、例えば、リガーゼを用いるバーコード付加またはオーバーラップエクステンションPCRが続く2ステップで実施できる。増幅は、PCRなどの物理的に結合していない産物をもたらす種々の技術を使用して別個の実体、例えば、微小滴中で実行できる。あるいは、コンパートメントにおける単離に先立って増幅を達成できるが、増幅産物が結合されたままであることを必要とし得る。これは、例えば、元の核酸の単一の長い連鎖状の分子をもたらすローリングサークル増幅または増幅された標的の単一のフラクタルのような核をもたらし得る単一の多重置換増幅のような技術を実施することによって達成できる。
増幅はまた、エマルジョンPCRのような技術を用いて成し遂げることができ、これを使用して、増幅産物を用いてビーズをコーティングできる。次いで、ビーズを、同一セットの核酸標的の多数のコピーを含む単一の実体として、別個の実体、例えば、微小滴中にカプセル封入し、バーコード付加反応における次のステップが起こることを可能にしてもよい。
これらの操作を実施するマイクロ流体デバイスは、小滴作製、小滴併合、流の併合、ピコインジェクション、選別などのうち1種または複数を容易にするアーキテクチャを含み得る。バーコードは、次いで増幅され得る単一分子をカプセル封入することによって、分子の出発セットの多数のコピーを含有する小滴を併合することによって、および/またはバーコードでコーティングされたもしくは含浸された、細胞またはプラスチックもしくはゲル製のビーズなどのバーコードを含む実体をカプセル封入することによって導入してもよい。バーコードは、断片化が利用される場合には、断片化に先立って、それと同時に、またはその後に鋳型を用いて単離できる。
次いで、バーコード付加は、スプライシングPCR、連結などを含む、任意の数の技術を使用して成し遂げることができる。アプローチは、例えば、単一細胞から得られたウイルスゲノムまたは染色体のセグメントなどの、同一の別個の実体、例えば、微小滴中の単一分子または分子の収集物に適用してもよい。また、本明細書に記載されるコンビナトリアルバーコード付加戦略を使用して、バーコードの効率的なローディングを成し遂げることができる。
能動的または受動的手段を使用して、選別を使用して、標的またはバーコードを欠く別個の実体、例えば、小滴を廃棄してもよい。例えば、標的核酸の増幅は、その大きさ、形状、粘度、表面張力などといったカプセル封入コンパートメントの物理的特性を変更し得、それらのうちいずれも、空の小滴からの充填された小滴の受動的分離を可能にし得る。あるいは、またはさらに、挿入色素、例えば、SYBR(登録商標)グリーンを用いる染色によって生じた蛍光シグナルなどの増幅後のコンパートメントの測定可能な特性の変化に基づく選別を誘発することによって、能動的選別を適用してもよい。
上記の方法のいずれが使用されるか、増幅、選別、断片化およびバーコード付加のステップが実行されるか、またはこれらのステップのうち1つもしくは複数が省略される否かに関わらず、開示される方法のいくつかの実施形態の重要な態様は、単細胞、ウイルス、分子などのデータの回収を可能にするための、分析を簡単にするための利用可能なシーケンシング技術を使用する短いバーコード付加されたリードのシーケンシングおよびバーコードによるその後のリードの集約である。これは、同一の別個の実体、例えば、微小滴内にカプセル封入された、したがって、核酸の同一収集物を起源とするすべての配列を集約する。特定の例では、これは、特に、サンプル中の核酸が、シーケンサーのリード長より長い領域について配列類似性を含有し、出発分子の固有の構築を妨げる場合に、核酸の操作、組み立ておよび解析を容易にし得る。
本明細書に記載される方法を用いると、リード自体は、短い距離に広がることもあるが、バーコードを使用して、極めて長い距離に広がる多数のリードを集約して、従来の方法が失敗する固有の再構成を可能にすることができる。さらに、これを使用して、互いに関連しているが物理的に接続していない分子を関連付けることができる。例えば、特定のウイルスは、物理的に接続していない分子を含むセグメント型ゲノムを有するが、サンプル中の異なるウイルスに由来するセグメントは、シーケンシング調製の間のウイルスの溶解の際に混合し得るので、これが、従来の短いリードシーケンシングを用いて、これらの接続していない分子のセットを一緒に関連付けることを困難にする。しかし、本明細書に記載される方法を使用して、ウイルスを、単離し、溶解し、物理的に離れている場合でさえ、それらを一緒に関連付けることができるようにそのゲノムセグメントにバーコード付加することができる。これは、集団多様性および進化などのウイルス生物学の種々の態様を研究するのに役立つ。同様の戦略が、微生物、幹細胞、癌細胞などを含む、変動を有するその他の生物系の核酸を解析することに当てはまる。
鋳型DNAにバーコード付加し、解析するための例示的方法を、図7を参照してここで記載する。鋳型DNAを、物理的に単離し、増幅し、次いで、アンプリコンの各グループを断片化し、独特にバーコード付加する。断片を、ショートリードシーケンサーでシーケンシングし、次いで、そのバーコードに基づいてバイオインフォマティクス的に選別できる。同一バーコードを含有する短いリードから長いリードを再構築する。
図8は、単一核酸分子が、ハイスループットで単離され、バーコード付加される方法を例示する。単一分子を、小滴中へのカプセル封入によって単離する。次いで、それらを、これらの小滴内で増幅して、これらの分子のクローン集団を作製できる。次いで、これらの小滴内でそれらを断片化し、バーコード付加し、その結果、各小滴は、同一単一分子に由来し、独特にバーコード付加された断片を含有する。
DNAの断片化は、フラグメンターゼ(登録商標)(NEB)、トランスポゾン挿入(Nextera)、DNAseIなどの非特異的DNAエンドヌクレアーゼまたはEndoVおよびウラシルグリコシラーゼを使用する増幅および特異的切断の際のdUTP組込みなどの、DNA修復酵素を使用する増幅および切断の際の修飾された塩基の組込みを使用して成し遂げることができる。水力学的せん断を使用して、DNAを断片化することもできる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、増幅および断片化ステップの両方を含む核酸をシーケンシングする方法であって、(a)複数の核酸標的分子を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、(c)第1の増幅産物を断片化して、断片化された第1の増幅産物を提供するステップと、(d)核酸バーコード配列を、断片化された第1の増幅産物または断片化された第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、(e)組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、(f)核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、断片化ステップを含む核酸をシーケンシングする方法であって、(a)複数の核酸標的分子を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)複数の核酸標的分子を断片化して、断片化された核酸標的分子を提供するステップと、(c)核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子または断片化された核酸標的分子から増幅された増幅産物中に組み込むステップと、(d)組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された核酸標的分子または組み込まれた核酸バーコード配列を有する増幅産物をシーケンシングするステップと、(e)核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された核酸標的分子のメンバーまたは増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、増幅ステップを含む、核酸をシーケンシングする方法であって、(a)複数の核酸標的分子を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(b)複数の別個の実体において核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、(c)核酸バーコード配列を、第1の増幅産物または第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、(d)組み込まれた核酸バーコード配列を有する第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、(e)核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップとを含む、方法を提供する。
2ステップ単一分子ディープシーケンシングワークフロー:上記で論じたように、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および/またはデバイスを使用して、複数の「長い」DNA分子、例えば、約1kb~約1000kbの長さ、例えば、約1kb~約500kbまたは約10kb~約100kbであるDNA分子をディープシーケンシングできる。いくつかの実施形態では、これは、1つのマイクロ流体ステップにおいて標的分子を、小滴中にカプセル封入し、それらを増幅することによって成し遂げられる。次いで、第2のマイクロ流体ステップにおいて、断片化およびバーコード付加に十分な試薬を、それらの小滴に付加し、インキュベートする。第3のステップにおいて、バーコードを断片中に組み込み、断片を増幅するのに十分なさらなる試薬を添加する。したがって、このプロセスは、3つのマイクロ流体ステップおよび小滴中での標的分子の増幅の遂行を必要とする。
いくつかの例では、小滴における増幅を実施せずに、同様の目的を成し遂げるために必要なステップの数を低減することが望ましいものであり得る。これは、標的分子をまず、UMI配列を用いて標識し、まとめて増幅し、その後、任意の小滴またはマイクロ流体カプセル封入する代替ワークフローを使用して達成できる。これによって、コピーされた親分子の同一の固有のUMIを含有する各標的分子の多数のコピーが生じる。次いで、この複数の配列を、例えば、コンパートメントあたり10分子があるように、小滴などの別個の実体中にカプセル封入できる。標的分子のカプセル封入前に、それと同時に、またはその後に、別個の実体に断片化およびアダプター付加に十分な試薬を添加できる。標的分子のカプセル封入後に、別個の実体をインキュベートして、断片化およびアダプター付加反応が起こることを可能にできる。
例示的試薬として、Illumina、Inc.、San Diego、CAから入手可能なNextera DNA Sample Prepキットにおいて提供されるものならびに/またはフラグメンターゼ(登録商標)およびリガーゼなどの酵素が挙げられる。例えば、各別個の実体、例えば、小滴は、平均で10種の異なる標的分子を含むことができ、そのそれぞれは、個別の配列であり、異なるUMIを用いて標識できる。これらの分子のそれぞれはまた、UMIが結合していた元の分子のコピーであり得、その他のコピーは、異なる別個の実体、例えば、小滴中にカプセル封入される。断片化およびアダプター連結後、断片にバーコードを付加し、バーコード付加された産物を増幅するのに必要なように、小滴バーコード付加および増幅に十分な試薬を添加し、別個の実体をインキュベートできる。次いで、すべての分子を回収し、プールし、必要に応じてさらなる処理に供し、シーケンシングすることができる。
配列ライブラリーのバイオインフォマティック解析の間に、以下の例示的アルゴリズムを使用して元の標的の配列を再構成できる。最初に、特定のUMIを含有するすべての配列を、1セットの配列に構成できる。このセット内に、元のUMIを有していた標的分子の断片化された配列がある。これらの標的配列のコピーは、一般に、異なる小滴中にカプセル封入されるので、これらの配列は、異なる小滴バーコードを有し得る。このセット中のその他の配列は、図らずも標的配列と同時カプセル封入された分子の断片ものであろう。しかし、同時カプセル封入はランダムであるので、これらの配列は、UMIによってグループ化された場合にセット中に稀に現れるのに対し、より頻繁に現れ、異なる小滴中にあったと示すバーコードを有する配列は、同一の元の標的の異なるコピーに対応する可能性が高い。ライブラリー中の最も頻繁な配列を使用して、標的配列を再構成できる。次いで、このプロセスをその他のUMIについて繰り返し、最終的に個々の標的それぞれを再構成できる。
この技術は、いくつかの強度を有する。極めて同様の配列でさえ、互いに区別され、再構成されることを可能にしなければならない。例えば、2種の配列AおよびA’が、3kb離れた2個の塩基によって異なり、標的が10kb長であると仮定する。Aに対応するすべての配列を回収するために、配列がUMIによってグループ化される場合には、グループ化された配列のセット中でほとんどが、この位置にAに対応する塩基を含有する。小滴あたりに多数の標的がカプセル封入される場合には、このプロセスは、AおよびA’が、ライブラリー中の配列の大きな部分を含む場合には失敗し得るが、AおよびA’の同時カプセル封入が、多様な標的配列の大きなライブラリー中でランダムであり、稀な事象であるので、ライブラリーが多様である限り、このグループ化は、標的配列に対応する配列を回収するはずである。ライブラリーが低い多様性を有する場合には、可能性ある解決策は、小滴あたりにカプセル封入される分子の数を1未満に低下させることであり、その結果、小滴の大部分が、1または0個の分子を含有する。この場合には、同時カプセル封入が稀であるので、UMIによるグループ化は、Aの配列を主に回収し、明確な再構成につながる。
このアプローチはまたハイスループットである。これまでに記載された方法のいくつかの実施形態では、標的分子は、小滴あたり1個未満の分子を用いてカプセル封入され、これは、ほとんどの小滴が空であることを意味する。これは、そのすべてが、処理されなければならない、したがって、機器のランタイムを必要とするほとんどの小滴が、有用なデータをもたらさないことを意味する。対照的に、この方法では、UMIの使用によって、例えば、平均で小滴あたり10個の分子をカプセル封入する標的カプセル封入ステップの間に、小滴が「過負荷される」ことが可能になる。これによって、ほぼどの小滴も使用可能な配列データを提供し、より効率的なスループットを提供することが確実になる。ただ2つのマイクロ流体ステップ、分子カプセル封入および断片化のステップならびにバーコード付加およびバーコード付加された産物の増幅のステップを使用して達成できる。その他のバルク増幅法の使用を用いると、この方法によって解析され得る分子の長さは、メガベースほど大きな長さであり得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、(a)複数の核酸標的分子のそれぞれに固有分子識別子(UMI)分子を結合して、UMI標識された核酸標的分子を提供するステップと、(b)UMI標識された核酸標的分子を酵素的に増幅して、UMI標識された核酸標的分子の配列を含む増幅産物を提供するステップと、(c)例えば別個の実体あたり1個の分子またはそれ未満で増幅産物を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(d)複数の別個の実体中で増幅産物を断片化するステップと、(e)核酸バーコード配列を、断片化された増幅産物に結合するステップであって、各別個の実体中の核酸バーコード配列が、断片化された増幅産物を、断片化された増幅産物がカプセル封入されている別個の実体と関連付ける、ステップと、(f)別個の実体から、結合している核酸バーコード配列を含む断片化された増幅産物を放出するステップと、(g)断片化された増幅産物をシーケンシングするステップと、(h)UMIの配列および核酸バーコード配列を使用して断片化された増幅産物をバイオインフォマティクス的に再構成して、増幅産物が起源とする核酸標的分子の配列を提供するステップとを含む、方法を提供する。再構成の際に、バーコードを含むが、UMIを含有しない断片またはその増幅産物を、同一バーコードを有し、UMIを含有する断片と関連付けて、同一小滴を、従って、同一分子を起源とする断片を同定できることは注目すべきである。
したがって、例えば、それぞれが異なっており、そのすべてがその全体でシーケンシングされるべきである複数の5kbのDNA分子を含有する反応容器で開始する場合に、UMIを、反応容器中の複数の5kbの分子のそれぞれの末端と結合することができる。これは、小滴中へのカプセル封入に先立ってバルクステップで行うことができる。次いで、DNA分子をバルクで増幅し、それによって、先に作製された各標的-UMIハイブリッドの多数のコピーを作製することができる。これは、各5kbの分子がUMIを有し、それらの分子のそれぞれが反応容器中で多数のコピーで存在する、複数の5kb分子を含有する反応容器をもたらす。
ここで、それらの分子のそれぞれを、小滴中に個別にカプセル封入できる。次いで、カプセル封入された小滴を断片化でき、アダプターを各小滴中の各分子の断片の末端と結合できる。これは、例えば、各5kbの標的が、各50bpの100片に断片化されると、各小滴中に100片のDNAを有することを意味する。
ここで、核酸バーコード配列を、所与の小滴中の100断片すべてについて核酸バーコード配列は同一であるが、小滴間では異なるように、アダプターによって各小滴中の100断片と結合することができる。
次いで、小滴に由来する核酸をプールし、シーケンシングし、バイオインフォマティクス的に再構成できる。所与の小滴が、再構成された配列に関してギャップを含有する場合には、すべてのギャップが埋められた新規のコンセンサス配列を構築するために、異なる小滴に由来する配列を、UMIに基づいて一緒にスプライスすることができる。
ディープシーケンシングによるプロテオミクス
いくつかの実施形態では、本開示は、1種または複数の生体サンプル中に存在するタンパク質および/またはエピトープを特性決定するために使用できるバーコード付加する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、1種または複数の生体サンプル中に存在するタンパク質および/またはエピトープを特性決定するために使用できるバーコード付加する方法を提供する。
オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬:いくつかの実施形態では、例えば、個々の細胞が、別個の実体、例えば、小滴中に単離される。これらの細胞は溶解され、その核酸はバーコード付加され得る。このプロセスは、単細胞情報を得るためのバーコードによる、混合された配列リードのその後の逆重畳を可能にする固有のバーコード配列を用いて、別個の実体中の多数の単細胞で実施できる。この戦略は、本質的には、多数の単細胞を起源とする核酸を一緒にグループ化する方法を提供する。一般に、これまでに記載された実施形態では、核酸は、細胞自体を起源とすると想定されたが、代替実施形態は、細胞にとって外来であるが、それにもかかわらず、細胞と機能的に関連し得る核酸のバーコード付加を可能にする。
例えば、抗体などのアフィニティー試薬を、抗体の種類、例えば、抗体の標的特異性を同定するために使用できる核酸標識、例えば、バーコードを含むオリゴヌクレオチドとコンジュゲートできる。次いで、これらの試薬を使用して、細胞内のまたは細胞上のタンパク質と結合し、それによって、アフィニティー試薬によって保持される核酸を、それらの結合している細胞と関連付けることができる。次いで、これらの細胞を、本明細書に記載されるようなバーコード付加ワークフローによって処理して、バーコードを、アフィニティー試薬上の核酸標識と結合することができる。次いで、ライブラリー調製、シーケンシングおよびバイオインフォマティクスの技術を使用して、細胞/別個の実体バーコードにしたがって配列をグループ化できる。生体サンプルまたはその一部または成分、例えばタンパク質、分子またはそれらの複合物と結合または認識できる任意の適したアフィニティー試薬を、これらの方法に関連して利用してもよい。
アフィニティー試薬を、その同一性、例えば、抗体の標的特異性と関連する核酸配列を用いて標識してもよく、本明細書に記載されるバーコード付加およびシーケンシング法を使用するその検出および定量化が可能になる。適した核酸標識として、DNA、RNAおよび例えば、LNA、XNAなどといった核酸類似体を挙げることができる。
アフィニティー試薬として、例えば、抗体、抗体断片、Fab、scFv、ペプチド、薬物などまたはそれらの組合せを挙げることができる。アフィニティー試薬、例えば、抗体を、1種もしくは複数の生物によって発現させることができ、またはファージ、mRNAまたはリボソームディスプレイなどの生物学的合成技術を使用して提供できる。アフィニティー試薬はまた、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を使用する化学的連結、クリックケミストリーまたはストレプトアビジン-ビオチン相互作用によってなど、化学的または生化学的手段によって作製できる。
オリゴ-アフィニティー試薬コンジュゲートはまた、オリゴをアフィニティー試薬に結合させハイブリダイズさせること、連結することおよび/またはポリメラーゼなどによって、先にコンジュゲートしているオリゴにさらなるオリゴを伸長することによって作製することができる。核酸を標識するアフィニティー試薬の利点は、生体サンプルの高度にマルチプレックス化された解析を可能にすることである。例えば、サンプル中の種々の標的を認識する抗体または結合性試薬の大きな混合物を、一緒に混合し、その自身の核酸配列を用いてそれぞれ標識することができる。次いで、このカクテルをサンプルと反応させ、本明細書に記載されるようなバーコード付加ワークフローに供し、どの試薬が結合しているか、その量、およびこれが単細胞の間など、サンプル中の異なる実体の間でどのように変わるかについての情報を回収することができる。
上記のアプローチは、1種または複数の細胞、ペプチド、タンパク質、高分子、高分子複合体を含むサンプルを含む、種々の分子標的に適用することができる。サンプルを、固定および透過処理、アフィニティー試薬の結合の補助などの、解析のための従来の処理に供することができる。高度に正確な定量化を得るために、アフィニティー試薬分子が正確にカウントされるように、本明細書に記載される固有分子識別子(UMI)技術も使用できる。これは、コンジュゲーションの前、その間またはその後に各アフィニティー試薬と結合している標識上にUMIを合成することによって、または試薬が使用される時に、マイクロ流体的にUMIを結合することによってを含む、いくつかの方法で達成できる。
例えば、単細胞シーケンシングに適用され、本明細書に記載されるようなコンビナトリアルバーコード技術を使用してバーコードを作製する同様の方法が、アフィニティー試薬技術に適用可能である。これらの技術によって、例えば、エピトープのマッピングまたはタンパク質およびその他の実体中の翻訳後修飾または単細胞プロテオミクスを実施するために、種々の生体サンプル中のタンパク質および/またはエピトープの解析が可能となる。例えば、本明細書に記載される方法を使用して、生物のプロテオーム中のすべてのタンパク質中のエピトープを検出する標識されたアフィニティー試薬のライブラリーを作製し、それらのエピトープを試薬を用いて標識し、本明細書に記載されるバーコード付加およびシーケンシング技術を適用して、これらのエピトープと会合している標識を検出し、正確に定量化することが可能である。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、標的分子を検出するための方法であって、(a)分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬のそれぞれを、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて標識するステップであって、第1の核酸バーコード配列が、オリゴヌクレオチドによって標識されたアフィニティー試薬の標的特異性を同定する、ステップと、(b)複数のアフィニティー試薬の、存在する場合にはその特異的分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数のアフィニティー試薬を、複数の分子標的と接触させるステップと、(c)存在する場合にはその特異的分子標的と結合している複数のアフィニティー試薬を、複数の第2の核酸バーコード配列とともに複数の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、各別個の実体中にカプセル封入された第2の核酸バーコード配列が、それらがカプセル封入される別個の実体を独特に同定する、ステップと、(d)第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に組み込むステップと、(e)第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチドをシーケンシングするステップと、(f)第1および第2の核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していたアフィニティー試薬を同定および/または定量化するステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、複数のアフィニティー試薬のそれぞれおよび/または第1の核酸バーコード配列を含む各オリゴヌクレオチドは、固有分子識別子(UMI)を含み、これらは、それぞれ、アフィニティー試薬のそれぞれおよび/または第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドのそれぞれを独特に同定する。
単細胞プロテオミクス:本明細書に記載される方法の極端なハイスループット性によって、プロテオミクス解析が何千から何百万個の単細胞で実施されることが可能となり、それによって多数の単細胞のプロテオームを特性決定する、スケーラブルな手段を提供する。例えば、マススペクトロメトリーによって読み取り可能なタグを用いて標識されたアフィニティー試薬を使用するマスサイトメトリーなどのその他の方法は、マススペクトロメトリーの読み取り情報は、低レベルで存在するタンパク質を検出できないので、作製できるタグの数および方法の感受性で制限される。フローサイトメトリーおよび蛍光法は、いくつかの場合には、より高い感受性を提供し得るが、これらは、蛍光色素を用いて数十またはせいぜい数百種のアフィニティー試薬プローブを独特に標識することしか可能ではないので、マルチプレックス化に関して著しく制限される。対照的に、本明細書に記載される方法は、生成され得る固有の核酸標識数に関して実質的に制限されない。例えば、15マーについて、標識の可能性ある順列の数は、4^15であり、これは、ほとんどの生命体のプロテオーム中のどのタンパク質も標的とするアフィニティー試薬を標識するのに十二分な配列を提供する。さらに、配列解析および検出に十分な核酸コピーを製造するために、単一のアフィニティー試薬およびその付随する標識であっても、例えば、PCRを使用して増幅され得るので、特に、UMIの実施を用いると、方法の感受性は、前例がないものである。UMI情報を使用して、増幅の際に生じたバイアスが補正され得るので、UMIの使用によって、正確な定量化を可能にしたまま、稀な試薬の大量増幅が可能となる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬にバーコード付加して増幅させる方法であって、(a)生体材料中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、生体材料、例えば、固定された細胞の生成物を、分子標的にそれぞれ特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、(b)生体材料を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(c)核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、(d)マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬またはその増幅産物とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、(e)複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬またはその増幅産物とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうち1種中への組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、方法は、固有分子識別子(UMI)をオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬中に組み込むステップを含む。
その他の実施形態では、本開示は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬にバーコード付加して増幅させる方法であって、(a)細胞中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数の細胞を、それぞれ、分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、(b)細胞を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入し、溶解するステップと、(c)核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、(d)マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬およびその増幅産物とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、(e)複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種への組込みおよびその増幅に十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、方法は、固有分子識別子(UMI)を、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬中に組み込むステップを含む。
タンパク質-タンパク質相互作用:本明細書に記載されるアフィニティー試薬バーコード付加技術を使用して、タンパク質-タンパク質相互作用を検出および定量化できる。例えば、相互作用するタンパク質を、核酸配列を用いて標識し、互いに反応させることができる。タンパク質が、例えば、互いの結合によって相互作用する場合には、その関連している標識は、結合している複合体に局在化されるのに対し、相互作用しないタンパク質は、互いに結合していないままとなる。次いで、サンプルをマイクロ流体小滴などの別個の実体中に単離し、融合PCRまたは核酸標識のバーコード付加に供することができる。タンパク質が相互作用する場合には、所与のバーコードグループは、両方の相互作用性タンパク質の標識を含む核酸を含有するが、これは、それらの核酸は、最終的に同一コンパートメント中になり、同一バーコード配列によってバーコード付加されるからである。
対照的に、相互作用しないタンパク質は、統計的に最終的に異なるコンパートメント中になり、従って、シーケンシング後に同一バーコードグループ中に集まらない。これは、バーコードに従ってデータを集めることおよびグループ中のすべてのアフィニティー試薬標識を検出することによって、どのタンパク質が相互作用するかを同定することを可能にする。別個の実体中への単離に先立って、結合していないアフィニティー試薬を除去するために、相互作用データをもたらさない配列を廃棄する精製ステップも実行できる。あるいは、カプセル封入後ペアワイズ融合などの融合アプローチを使用して、増幅を使用して、融合している産物を選択的に増幅し、融合していない分子を効率的に希釈して取り除き、融合物を濃縮し、相互作用タンパク質を検出するためにシーケンシングをより効率的にできる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質とコンジュゲートしている核酸を連結し、増幅するための方法であって、(a)複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、(b)相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(c)マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物および存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な試薬を組み合わせるステップと、(d)別個の実体を、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、バーコード付加を用いてタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための方法であって、(a)複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、(b)相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列-複合タンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(c)マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうち1種の内容物および第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、(d)別個の実体を、第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には、相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法において利用される核酸バーコード配列-複合タンパク質の集団は、当技術分野で公知の任意の適した方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよび/またはmRNAディスプレイを使用して作製できる。
免疫沈降に代わるエピトープおよびPTMマッピング:本明細書において開示される方法によって、タンパク質、例えば、単一分子およびタンパク質複合体において、エピトープ、翻訳後修飾(PTM)、スプライシング変動の検出などが可能となる。例えば、本明細書に記載される方法を使用して、試薬が、分子上のPTMまたはエピトープと結合するように、異なるPTMまたはエピトープを有するタンパク質を含むサンプルを、核酸標識されたアフィニティー試薬とともにインキュベートできる。これは、分子上に存在するエピトープと関連するアフィニティー試薬の収集物を用いてサンプル中の分子を標識する。次いで、結合している複合体を、本明細書に記載される単離、バーコード付加およびシーケンシングプロセスに供して、どのエピトープまたはPTMが、サンプル中の個々の分子それぞれ上に存在するかをマッピングできる。
個々のタンパク質に加えて、これらの方法は、例えば、リボソームなどの高分子複合体に適用して、複合体中にどのエピトープが存在するかを検出できる。また、このような方法を使用して同様と称される複合体における変動を決定することができる。これを達成するための1つの方法は、免疫沈降「プルダウン」戦略を使用し、これでは、複合体が、抗体などのアフィニティー試薬による結合に付され、抗体が、それらを固相支持体に結合し、結合しているサンプルを回収することによってサンプルから複合体を濃縮するために使用される。しかし、このプルダウンプロセスを種々のエピトープについて繰り返し実施することは、労働集約的であり、材料の必然的な喪失を伴う。対照的に、本明細書に記載される技術を使用して、複合体を、実体中に存在すると疑われる種々のエピトープを検出するアフィニティー試薬のカクテルと反応させ、次いで、本明細書において記載されるバーコード付加ワークフローに供して、どのエピトープが各単一物中に存在するかを決定することができる。シーケンシングに先立って、プルダウンなどの精製戦略を使用して、複合体および結合しているアフィニティー試薬を濃縮することもできる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、分子、分子複合体および/または構造中に存在するエピトープを決定する方法であって、(a)アフィニティー試薬の、分子、分子複合体および/または構造体中に存在する場合には、そのそれぞれのエピトープとの特異的結合に十分な条件下で、複数の分子、分子複合体および/または構造体を、それぞれ、エピトープに特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、アフィニティー試薬のエピトープ特異性を同定する、コンジュゲートしている第1の核酸バーコード配列を含む、ステップと、(b)別個の実体中に、1種または複数のアフィニティー試薬と特異的に結合される分子、分子複合体および/または構造体をカプセル封入するステップと、(c)第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、別個の実体を独特に同定する、ステップと、(d)第2の核酸バーコード配列を含む第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物をシーケンシングして、分子、分子複合物および/または構造体上に存在するエピトープを同定するステップとを含む、方法を提供する。
プロテオミクスのためのUMI:本明細書に記載される方法に関連した固有分子識別子(UMI)の力は、それらが、核酸を含むサンプルが大幅な増幅に付されることを可能にし、これは、各種類の元の割合を正確に評価することが可能でありながら、増幅後サンプル中の各種類の得られた分子の割合においてバイアスを誘導し得るということである。例えば、単細胞のトランスクリプトームは、一般に、シーケンシングに十分な核酸をもたらすのに大幅な増幅を必要とし、このような増幅は偏り、それによって、トランスクリプトーム数を歪める可能性が高いので、これは、トランスクリプトーム増幅にとって重要であり得る。しかし、UMIを組み込むことによって、偏った数が補正され得る。
同様の戦略を、本明細書に記載されるアフィニティー試薬法に適用することができる。この場合には、UMIを、細胞のゲノム断片またはmRNA転写物などの細胞を起源とする核酸に結合することよりも、UMIをアフィニティー試薬の標識と結合し、それによって、どのアフィニティー試薬複合体も、大幅に増幅されるが、依然として1回のみカウントされることを可能にする固有の識別子を用いて標識することができる。UMIをアフィニティー試薬中に導入することは、コンジュゲーションもしくは発現ステップの際に、またはマイクロ流体処理の際にアフィニティー試薬標識が行われ、その結果、アフィニティー試薬中に自然に組み込まれる場合を含む、プロセスにおいて複数ステップで達成できる。例えば、アフィニティー試薬を、サンプル中の実体と結合し、単離することができ、単離後に、各分子のUMIおよび各別個の実体のバーコードを、アフィニティー試薬上のバーコード標識と結合することができ、その結果、アフィニティー試薬上のほとんどの標識分子が、個別の配列のUMIを用いて標識され、所与の別個の実体内のすべてのアフィニティー試薬が、同一または同様の核酸バーコード配列を用いて標識される。UMIが有用であるその他の例にあるように、この場合には、それらを使用して、例えば、シーケンシングまたはライブラリー調製手順によって歪められ得る各アフィニティー試薬の種類の定量化データを補正できる。これは、プロテオーム中の細胞性タンパク質の高度に正確な定量化を可能にするのに、特に、少量の総核酸をもたらし、相当な増幅を必要とする単細胞プロテオームを定量化するのに有用である。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、サンプル中のアフィニティー試薬の数を決定するための方法であって、(a)1種または複数の分子標的を含有すると疑われるサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、アフィニティー試薬およびオリゴヌクレオチドの一方または両方が、複数のアフィニティー試薬のそれぞれを独特に同定する固有分子識別子(UMI)を含む、ステップと、(b)UMIを使用して、サンプル中のアフィニティー試薬の数を決定するステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、方法は、核酸バーコード配列を増幅するステップを含み、ここで、UMIは増幅バイアスについて補正するために使用される。
FACS、抗体標識された細胞のフリューダイム(Fluidigm)ベースのバーコード付加:シーケンシングリードアウトが、大きな集団から単細胞情報を得ることを可能にするために、細胞などの生体サンプル中の実体と関連している核酸にバーコード付加するためのプロセスが本明細書に記載される。本明細書に記載されるように、同様の概念を、タンパク質およびタンパク質複合体などの実体に当てはめることができる。本明細書に記載されるプロセスは、一般に、小滴ベースのマイクロ流体技術などの比較的ハイスループットなマイクロ流体技術を対象とするが、より低いスループット法にも適用可能であり得る。例えば、単細胞トランスクリプトームまたは単細胞プロテオミクスの核酸にバーコード付加するためのアプローチを、ウェル中で細胞が単離され、バーコード付加およびシーケンシング調製に付されるFACSベースの単離アプローチに適用することができる。
あるいは、フリューダイム(Fluidigm)C1(商標)プラットフォームのようなマイクロ流体系を使用して、バーコード付加およびシーケンシング解析のために単細胞から核酸を捕獲、単離および調製できる。最終的に、細胞操作の方法は、重要であるが、選択して、実験の必要性に最良に適合させることができ、ハイスループット小滴法は、トランスクリプトームの、ゲノムのおよび/またはプロテオミクスの解析のために複数の(数千から数百万個)の単細胞を解析するのに特によく適合している。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、標識されたアフィニティー試薬にバーコード付加する方法であって、(a)1種または複数の分子標的を含有するサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、(b)サンプルから1種または複数の分子標的を単離するステップと、(c)第2の核酸バーコード配列を、オリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、1種または複数の分子標的を用いて単離されたアフィニティー試薬を独特に同定する、ステップと、(d)組み込まれている第2の核酸バーコード配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物をシーケンシングして、複数のアフィニティー試薬のどれがサンプル中の1種または複数の分子標的のうち1種と結合しているかを同定するステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、単離するステップは、個々の細胞を個々のウェル中に分配するステップを含む。上記の方法のその他の実施形態では、単離ステップは、マイクロ流体細胞捕獲デバイスを使用して個々の細胞を単離するステップを含む。
単細胞遺伝子修飾/相互作用プロファイリング
本明細書に記載される技術の価値ある適用は、遺伝子修飾を同定し、遺伝子修飾/相互作用の効果を決定するためのその使用である。
本明細書に記載される技術の価値ある適用は、遺伝子修飾を同定し、遺伝子修飾/相互作用の効果を決定するためのその使用である。
遺伝子修飾/相互作用:この適用では、遺伝子が、例えば、細胞のゲノム中に断片を挿入するためにトランスポサーゼを使用して、または遺伝子の発現を編集または調節するために、例えば、CRISPR-Cas系を使用してなど、種々の方法で操作されている細胞の集団を作製できる。これらの技術を使用して、例えば、バーコードなどの配列を、例えば、細胞内の複数の遺伝子の機能に影響を及ぼすように、編集または調節および反復されるべき遺伝子中または遺伝子の付近に挿入できる。これらの遺伝子の相互作用および細胞プロセスに対するその影響に応じて、集団中のいくつかの細胞はその他のものとは異なって挙動し得、例えば、特定の環境または培地において程度の差はあるが迅速に増殖する。次いで、課題は、細胞においてどの修飾が行われているかを決定して、それらを細胞特性と関連付けることであり、これは、本明細書に記載される方法を使用して達成できる。例えば、修飾されたサンプルに由来する細胞を本明細書に記載されるバーコード付加および/または融合ワークフローに供して、細胞核酸および/またはゲノム中に挿入されている配列を選択的に増幅できる。次いで、修飾の種類および位置と関連し得るこれらのアンプリコンを、固有の細胞バーコードを用いて融合し、および/またはバーコード付加できる。このプロセスを、各細胞にとって独特である、異なるバーコードまたは融合物を使用して、マイクロ流体小滴などの異なる別個の実体中の単離された複数の細胞で反復できる。次いで、すべての別個の実体から核酸を回収し、配列解析に供して、どの修飾が特定の細胞中に存在するかを決定するための情報を得ることができる。例えば、特定の環境中で迅速に増殖する細胞を回収するために、このステップに先立ってサンプルが選別されるか、そうでなければ、濃縮される場合には、方法の使用から得られる配列は、この環境において細胞特性に影響を与えることがわかり、これらの遺伝子が細胞特性に寄与する方法についての情報を提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、1種または複数の細胞中で遺伝子修飾を同定するための方法であって、(a)1つまたは複数の遺伝子修飾を、複数の細胞中に導入するステップと、(b)複数の細胞への1つまたは複数の遺伝子修飾の導入に起因する1種または複数の細胞表現型を同定するステップと、(c)別個の実体中の細胞のそれぞれを単離して、1つまたは複数の遺伝子修飾を含むDNAの1つまたは複数の領域を選択的に増幅するステップと、(d)核酸バーコード配列を、1つまたは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列が、単細胞を起源とするような1つまたは複数の遺伝子修飾を同定する、ステップと、(e)1つもしくは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物をシーケンシングして、1種または複数の細胞表現型を有する細胞中で1つまたは複数の遺伝子修飾を同定するステップとを含む、方法を提供する。
単細胞のゲノム、トランスクリプトームおよびプロテオーム解析のマルチプレックス化:単細胞ゲノムの、トランスクリプトームの、およびプロテオミクスのシーケンシング法などの本明細書に記載される方法を組み合わせて使用して、各細胞から複数の種類の情報を得ることができる。例えば、限定されない例として、複数の細胞を、核酸で標識されたアフィニティー試薬を用いて標識できる。次いで、これらの細胞を、それらが、小滴中で単離され、溶解され、そのmRNAが、cDNAにコピーされ、バーコード付加され、および/または増幅されるバーコード付加ワークフローに供することができる。このステップと同時に、その前にまたはその後に、アフィニティー試薬と結合している核酸標識をまた、同一または異なるバーコードを使用してバーコード付加できる。cDNAおよびアフィニティー試薬標識のために同一バーコードが使用される場合には、1種のバーコードによってすべてのデータを選別でき、転写物配列およびアフィニティー試薬配列に対応する所与の細胞のすべてのリードを集約する。さらに、アフィニティー試薬配列を、必要に応じて、設計し、合成的に構築できるので、トランスクリプトームに属するリードを、アフィニティー試薬に属するリードから容易に区別することが可能である。この特定の実施形態は、例えば、単細胞のトランスクリプトームおよびプロテオームについての高度に詳細な情報を同時に提供し、広範囲の生物学的研究にとって価値あるものであるはずである。さらに、核酸の両形態でのUMIの使用は、サンプル中の転写物およびアフィニティー試薬のそれぞれのレベルの高度に正確な定量化を可能にし、これも大きな価値がある。
例えば、本明細書に記載される単細胞ゲノムシーケンシング法を使用することによって、単細胞ゲノム情報も、データに付加できる。例えば、限定されない実施形態では、アフィニティー試薬を用いて標識された細胞を、細胞が単離され、溶解され、そのゲノムが増幅に付されるワークフローに供することができる。細胞トランスクリプトームはまた、ゲノム増幅ステップに先立って、それと同時に、その後に、例えば、cDNA合成および増幅に供することができる。断片化ステップを使用して、ゲノムのおよびcDNA材料を、例えば、アフィニティー試薬配列の増幅に使用されるものと同一配列であり得る末端上にアダプター配列を有するより小さい断片に断片化できる。次いで、バーコードを、3種の異なる種類の材料の核酸中に組み込み、同時にまたは異なる反応ステップで、異なる種類の核酸を標識できる。得られた材料を、ライブラリー調製、精製などに供し、シーケンシングできる。これは、複数の細胞で並行して実施でき、データは、所与の細胞と関連しているすべてのリードを集約するためにバーコードクラスター化に付される。このような方法論では、このようなプロセスは、各細胞の多量の配列情報を生成し、多数の総細胞が分析され得るので、異なる形態の情報の配列深度の低下したレベルが依然として有用なデータをもたらすことを可能にするために、正しいシーケンシング能力を選択することが重要であり得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬および単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させるための方法であって、(a)複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、(b)複数の細胞を、各別個の実体が多くて1個の細胞を含むように、別個の実体中にカプセル封入するステップと、(c)別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、(d)溶解した細胞を含有する別個の実体中に、第2の核酸バーコード配列ならびにRNAの逆転写、バーコード付加およびcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に第2の核酸バーコード配列を組み込むステップとを含む、方法を提供する。
その他の実施形態では、本開示は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬および単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させるための方法であって、(a)複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬を接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、(b)複数の細胞を、各第1の別個の実体が、多くて1個の細胞を含むように、複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、(c)第1の別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、(d)複数の第2の別個の実体中の複数の第2の核酸バーコード配列を提供するステップと、(e)第1の別個の実体のそれぞれを、第2の別個の実体のうちの1種と組み合わせて、第1のマイクロ流体デバイスにおいて第3の別個の実体を形成するステップであって、第3の別個の実体が、RNAのcDNA産物への逆転写に十分な試薬を含む、ステップと、(f)第2のマイクロ流体デバイスを利用して、第3の別個の実体中に、cDNA産物のバーコード付加および増幅に十分な試薬を導入し、第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、方法は、固有分子識別子(UMI)を、溶解した細胞のRNA分子中に組み込むステップを含む。あるいは、またはさらに、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、それぞれ、UMIを含む。
マイクロ流体自己免疫プロファイリング:単一実体内の情報を関連付けることに加えて、本明細書に記載される方法を使用して、実体内の情報を、実体にとって外来であるものを起源とする情報と関連付けることができる。例えば、一実施形態では、本発明を使用して、BまたはT細胞などの免疫細胞によって結合されるエピトープを同定できる。この実施形態では、例えば、B細胞によって結合され得る複数のエピトープを、リボソーム、mRNAまたはファージディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して発現させることができる。次いで、特定のB細胞受容体が、1種または複数のエピトープと結合する場合には、2つが結合されるように、エピトープをB細胞と反応させることができる。次いで、結合している複合体を、別個の実体、例えば、微小滴中にカプセル封入し、例えば、本明細書に記載される融合またはバーコード付加方法に供することができる。これを使用して、例えば、エピトープをコードする配列を、B細胞受容体をコードする配列と連結できる、またはそれらのそれぞれを、相互バーコード配列と連結できる。
どの方法が使用されても、分子をシーケンシングでき、一緒に融合している配列を読み出すことによって、あるいは、バーコードによってリードをクラスター化することによって、次いで、エピトープをコードするリードおよび受容体をコードするリードを含有する、相互作用する対を検出できる。これは、その他の大きなライブラリーの分子と相互作用し得る大きなライブラリーの分子をスクリーニングして、相互作用の大きなセットを検出するために極めて有用である。このような相互作用は、それらが、種々の可能性ある相互作用性分子のそれぞれが、試験のために単一反応器中に単離されることを必要とすることが多いので、現在検出するのに費用がかかる。対照的に、本明細書に記載される方法を使用すると、必要に応じて、すべての相互作用を単一反応器中で試験することができ、相互作用情報を検出するためにバーコード付加/シーケンシング法が使用される。必要に応じて、洗浄も組み込んで、弱く結合しているエピトープを除去し、全般的に、得られる相互作用の強度について制御することができる。また、同様のアプローチを適用して、例えば、宿主細胞中にあるウイルス配列などの細胞またはウイルスにとって外来であるその他の実体も検出できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、1個または複数の細胞によって結合されるエピトープを検出するための方法であって、(a)複数の細胞を、複数のエピトープと接触させるステップであって、エピトープがエピトープを同定する核酸バーコード配列および/またはUMIを用いて標識される、ステップと、(b)別個の実体中に細胞および任意の結合されたエピトープを単離するステップと、(c)エピトープによって結合される細胞性ポリペプチドをコードする核酸を、ポリペプチドが結合されるエピトープをコードする核酸を融合するステップと、(d)融合している核酸の配列を検出することによって、どのエピトープがどのポリペプチドによって結合されるかを同定するステップとを含む、方法を提供する。
標識されたエピトープは、mRNA、リボソーム、ファージまたはその他のディスプレイ技術によって発現されるポリペプチドまたはその他の生体分子を含み得る。
エピトープをコードする配列を、エピトープが結合する細胞性ポリペプチドをコードする配列と融合することの代替法として、2種の配列を核酸バーコード配列と連結して、核酸バーコード配列にしたがって配列データをクラスター化することによって、相互作用性エピトープおよびポリペプチドの検出を可能にしてもよい。
エピトープ-ポリペプチド相互作用のより正確な定量化を得るために、1種または複数のUMIを組み込んでもよい。
1つまたは複数の精製ステップを利用して、単離および融合ならびに/またはバーコード付加に先立って、結合していないエピトープを除去してもよい。
ライブラリー調製、解析、保存および再利用
ビーズベースのライブラリー調製:いくつかの実施形態では、本開示は、シーケンシングのためにバーコード付加されたDNAを調製する方法であって、(a)DNAを複数の断片に断片化し、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部の断片を含むステップと、(b)ビーズ(例えば、磁性ビーズ)などの固相支持体とともに、1つまたは複数の別個の実体、例えば、微小滴中に、複数の断片をカプセル封入するステップと、(c)固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、(d)固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、(e)固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップとを含む、方法を提供する。
ビーズベースのライブラリー調製:いくつかの実施形態では、本開示は、シーケンシングのためにバーコード付加されたDNAを調製する方法であって、(a)DNAを複数の断片に断片化し、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部の断片を含むステップと、(b)ビーズ(例えば、磁性ビーズ)などの固相支持体とともに、1つまたは複数の別個の実体、例えば、微小滴中に、複数の断片をカプセル封入するステップと、(c)固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、(d)固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、(e)固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップとを含む、方法を提供する。
断片化は、物理的せん断および/または1種もしくは複数の酵素を用いる酵素的断片化などの任意の適した方法を使用して達成してもよく、固相支持体上にDNAの5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化する前に行っても、後に行ってもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、固相支持体上に可逆的に固定化された5’末端および/または3’末端を、制限消化、連結および/またはポリアデニル化などの酵素的修飾に供するステップを含む。
リードのコンピュータによる選別:いくつかの実施形態では、本開示は、バーコードを使用してシーケンシングリードをグループ化するための方法であって、(a)核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子をシーケンシングして、シーケンシングリードを提供するステップであって、複数の核酸分子が、同一および異なる別個の実体を起源とする核酸分子を含む、ステップと、(b)ハミングまたはレーベンシュタイン距離基準を使用して核酸バーコード配列によってシーケンシングリードをグループ化するステップと、(c)シーケンシングリード中に組み込まれた1種または複数のさらなるバーコードまたは固有分子識別子(UMI)の配列を使用して、同一の別個の実体を起源とするバーコードグループを統計的に決定するステップと、(d)同一の別個の実体を起源としたバーコードグループのリードを組み合わせるステップと、(e)各シーケンシングリードのバーコード部分を除去して、さらなる解析のために残りの部分を使用するステップとを含む、方法を提供する。
ライブラリーの再利用および保存:本明細書に記載されるバーコード付加された分子のライブラリー、例えば、本明細書に記載される方法を使用して製造されたバーコード付加されたcDNAライブラリーを使用して、シーケンシングのためのいくつかの核酸サンプルを作製できる。例えば、単細胞ゲノムから、トランスクリプトームからまたは結合しているアフィニティー試薬から得られるものであろうと、バーコード付加された分子は、バーコードを用いて標識された核酸配列を含み得る。これらのバーコード配列のそれぞれの両端に位置する既知プライマー配列が提供され得る。これは、例えば、PCRによって、サンプルが増幅され、シーケンシングのためにより多くのサンプルを継続的に製造することを可能にする。この利点は、構築されたライブラリーを保存し、後に回収して、さらなるシーケンシングライブラリーを作製できることである。これは、より詳細な情報を得るために、サンプルが再検討されなければならない場合または第1の解析が、さらなる、後続解析を動機づけする新規知識をもたらす場合に価値あるものであり得る。本発明に記載される濃縮戦略と組み合わされると、これは、大きな不均一集団中の興味深い小集団を深く解析するために価値あるものであり得る。
さらに、本明細書に記載されるようなビーズベースの方法を使用して、必要に応じて洗浄ステップも組み込むことができる。例えば、本明細書に記載される方法のうち1つまたは複数を使用して、ビーズに結合されたバーコード付加された核酸を、例えば、磁力を使用してビーズについて選択して、磁性ビーズを単離することによって溶液から精製できる。これによって、サンプルを洗浄して、精製された核酸を回収すること、さらなる処理において補助することが可能となる。さらに、ビオチンなどの分子を用いて標識されたプライマーを使用して、付加された生成物中にビオチンが組み込まれるようにバーコード付加された核酸を増幅できる。得られたアンプリコンを、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた精製ビーズとの結合によって単離できる。サイズ選択をベースとする精製などのさらなるステップを実施してもよい。これによって、次いで、精製目的でビーズと結合することができる、バーコード付加された核酸ライブラリーを作製するために、ビーズベースではないアプローチが使用されることが可能となる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、バーコード付加された核酸のライブラリーから配列ライブラリーを調製するための方法であって、(a)バーコード付加された核酸の第1のライブラリーを作製するステップと、(b)第1のライブラリーからシーケンシングライブラリーを調製するステップと、(c)第1のライブラリーを保存するステップと、(d)第1のライブラリーから第2のシーケンシングライブラリーを調製するステップとを含む、方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、第1のライブラリーは、固相支持体、例えば、1種または複数のビーズに結合された核酸を含み、これは、蛍光活性化細胞選別(FACS)、PCR活性化細胞選別(PACS)または磁性活性化細胞選別(MACS)のうち1種以上によって選別され得る。
いくつかの実施形態では、第1のライブラリーを、標識されたプライマー、例えば、ビオチン標識されたプライマーを用いてライブラリーの核酸を増幅して、標識されたプライマーの標識に対して特異的結合親和性を有するアフィニティー試薬、例えば、ストレプトアビジンを用いて増幅産物を単離することによって、保存および/またはさらなる処理のために精製する。
MACS、PACS、PASまたはダイアルアウトPCRを使用する標的化される配列ライブラリーの作製:本開示の特定の適用では、特定のバーコードグループに対応する核酸の特定の小集団を、その他のものよりもより深くシーケンシングすることが望ましい。これは、例えば、シーケンシングが特定の核酸に標的化されない、ライブラリーの第1の配列解析を実施するために、本明細書に記載される方法を使用して達成できる。複数のバーコードグループが存在し得るので、所与のバーコードグループのカバー率は、そのグループの核酸を所望の深度でシーケンシングするのに十分ではないことがある。そこで、ライブラリーの広く浅いシーケンシングを、バーコードによってクラスター化し、バーコードグループを、興味深い小集団およびそのバーコードを検出するように解析できる。
例えば、浅いトランスクリプトームシーケンシングを使用して、異なる細胞表現型の混合集団において、異なる細胞の表現型をいくつかの確実度で同定できる。次いで、興味深い細胞のバーコード配列を、ディープシーケンシングのためにこのグループから核酸を選択的に濃縮するための手段として使用し、それによって対象のグループにシーケンシングを集めることができる。これは、いくつかの方法で達成できる。例えば、標的バーコードの核酸とハイブリダイズし、それらを蛍光にする、バーコードと相補的である配列を有する蛍光プローブを作製できる。次いで、例えば、フローサイトメトリーを使用してそれらを選別できる。これは、各ビーズが、同一バーコードの多数のコピーを有し、フローサイトメーターを用いて検出することをより容易にするようにビーズに結合されたバーコードを有することによって大きく補助される。
あるいは、マイクロ流体小滴におけるPCR活性化選別のような方法を使用して、所望のバーコード配列を有する単一分子またはビーズを選別できる。別の代替法として、例えば、ビオチンを用いて、標的バーコードと相補的である配列を有するプローブを標識することがあり、その結果、それらを、例えば、ストレプトアビジンによってコーティングされた磁性ビーズを用いて濃縮できる。さらに別のアプローチは、対象のバーコードグループに対して特異的なプライマーが作製され、増幅のためのプライミング配列として使用されるダイアルアウトPCRとして公知の技術を適用することである。次いで、それらを使用して、混合しているバーコード付加されたライブラリーから標的グループを選択的に増幅できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、バーコード付加された核酸のライブラリーから配列ライブラリーを調製するための方法であって、(a)バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップであって、ライブラリーが複数の細胞を起源とする核酸分子の配列を含む、ステップと、(b)ライブラリーから配列情報を得るステップと、(c)配列情報を使用して、特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅可能なプライマーを設計するステップと、(d)特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅し、解析するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅可能なプライマーは、バーコード付加された核酸またはそれに相補的な配列のライブラリーのこれまでの解析から得られた核酸バーコード配列を含む。
その他の実施形態では、本開示は、バーコード付加された配列ライブラリーを解析するための方法であって、(a)バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップと、(b)ライブラリーを第1のカバー深度でシーケンシングして、ライブラリー中の多数のバーコードグループについての情報を得るステップと、(c)ライブラリー中の多数のバーコードグループについての情報を解析して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのためにバーコードグループのサブセットを同定するステップと、(d)バーコードグループのサブセットの核酸について濃縮して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのために、標的化されるライブラリーを製造するステップとを含む、方法を提供する。
上記の方法のいくつかの実施形態では、バーコードグループのサブセットは、1種または複数のビーズと結合され、濃縮は、バーコードグループのサブセットのうちの1つの既知バーコードと相補的である標識されたプローブとハイブリダイズして、標識されたプローブを使用してビーズを選別するステップを含む。上記の方法のその他の実施形態では、濃縮は、バーコードグループのサブセット中の特定のバーコード配列とハイブリダイズするプライマーを利用して、マイクロ流体小滴においてPCR活性化選別を実施し、それによって、バーコードグループのサブセットの核酸を選別するステップを含む。
適用
本明細書に記載される方法を使用して、多数の細胞のゲノム、トランスクリプトームおよびプロテオームを別個にまたは同時に解析する能力は、広範囲の適用にとって価値がある。方法は、組織または幹細胞の集団のような不均一な実体から構成される系を解析するために特に有用である。
本明細書に記載される方法を使用して、多数の細胞のゲノム、トランスクリプトームおよびプロテオームを別個にまたは同時に解析する能力は、広範囲の適用にとって価値がある。方法は、組織または幹細胞の集団のような不均一な実体から構成される系を解析するために特に有用である。
組織解析:本明細書に記載される方法を使用して、不均一な血液細胞または健常な組織、例えば、腎臓、肝臓、脳などを構成する種々の細胞を解析できる。それらはまた、腫瘍などの罹患組織を研究するために有用である。例えば、方法を、血液癌を含む細胞などのいわゆる「液体腫瘍」または固形腫瘍に適用でき、これでは、腫瘍は、酵素技術を使用して脱凝集され、次いで、腫瘍の細胞は、本明細書に記載される方法を用いて、ゲノムの、トランスクリプトームの、および/またはプロテオミクスの解析に付され得る。
本開示の方法を使用して、単一癌細胞からゲノム配列またはハプロタイプを得ることができ、関連トランスクリプトームのおよびプロテオミクスの解析法を使用して、コーディングゲノムから表現型におけるその修飾および癌細胞の経路の調節不全まで情報の流れをたどることができる。数百万個の単細胞を解析することを可能にする本発明の本質的にハイスループットな性質のために、開示された方法は、腫瘍における不均一性ならびに癌の性質および機序の理解を補助するのに特に適合している。
同様の技術はまた、抗体およびT細胞受容体レパートリーならびに多様性を示す生物におけるその他のレパートリーの研究に適用できる。例えば、本明細書に記載されるスプライシングおよび/またはバーコード付加方法を使用して、抗体またはT細胞受容体鎖をコードする核酸を連結またはグループ化でき、その結果、それらは、対としてシーケンシングされ得る。これは、ウイルス感染および細菌感染から関節リウマチなどの自己免疫障害にわたる疾患のための療法の供給源または標的であり得る強力な抗体を同定するために価値があるものとなる。
開示される方法に関連して使用するためのステップ、成分および手順
開示される方法の種々の態様を実行するために、種々のステップ、成分、試薬および手順を使用してもよい。このようなステップ、成分、試薬および手順の限定されない例を以下に提供する。
開示される方法の種々の態様を実行するために、種々のステップ、成分、試薬および手順を使用してもよい。このようなステップ、成分、試薬および手順の限定されない例を以下に提供する。
別個の実体の種類:開示される方法に関連して調製およびまたは利用される別個の実体、例えば、微小滴の組成および性質は、変わり得る。例えば、いくつかの実施形態では、別個の実体は、1個の細胞および多くて1個の細胞を含み得る。その他の実施形態では、別個の実体は、多数の細胞、すなわち、2個以上の細胞を含み得る。いくつかの態様では、本開示の別個の実体は、核酸または多数の核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書において論じられるように、別個の実体は、1種もしくは複数の固体および/または1種または複数のポリマーなどゲル材料を含み得る。
いくつかの実施形態では、別個の実体、例えば、微小滴を安定化するために界面活性剤を使用してもよい。したがって、微小滴は、界面活性剤によって安定化されたエマルジョンを含み得る。別個の実体、例えば、微小滴中で所望の反応が実施されることを可能にする任意の簡便な界面活性剤を使用してもよい。その他の態様では、別個の実体、例えば、微小滴は、界面活性剤または粒子によって安定化されない。
使用される界面活性剤は、エマルジョンに使用される油相および水相(またはその他の適した非混和性相、例えば、任意の適した疎水性および親水性相)などのいくつかの因子に応じて変わる。例えば、フッ化炭素オイル中の水性小滴を使用する場合には、界面活性剤は、親水性ブロック(PEG-PPO)および疎水性フッ化ブロック(Krytox(登録商標)FSH)を有し得る。しかし、オイルが、炭化水素オイルであるように交換された場合には、例えば、界面活性剤ABIL EM90のように疎水性炭化水素ブロックを有するように、界面活性剤が代わりに選択される。界面活性剤の選択では、界面活性剤の選択において考えられ得る望ましい特性として、以下のうち1つまたは複数を挙げることができる:(1)界面活性剤が低粘度を有する、(2)界面活性剤が、デバイスを構築するために使用されるポリマーと非混和性であり、したがって、デバイスを膨張させない、(3)生体適合性、(4)アッセイ試薬は、界面活性剤に可溶性ではない、(5)界面活性剤は、ガスが入り、出ることを可能にする点で好都合なガス溶解度を示す、(6)界面活性剤が、PCRに使用される温度より高い沸点(例えば、95℃)を有する、(7)エマルジョン安定性、(8)界面活性剤が所望の大きさの液滴を安定化する、(9)界面活性剤が、キャリアー相に可溶性であり、小滴相には可溶性ではない、(10)界面活性剤が限定された蛍光特性を有する、(11)界面活性剤が、温度のある範囲にわたってキャリアー相に可能性のままである。
イオン性界面活性剤を含むその他の界面活性剤も想定できる。別個の実体、例えば、微小滴を安定化するために、35℃を上回る温度での別個の実体、例えば、小滴安定性を増大するポリマーを含むその他の添加物をオイル中に含めることができる。
本明細書に記載される別個の実体、例えば、微小滴を、エマルジョンとして、例えば、非混和相キャリアー流体(例えば、フッ化炭素オイルまたは炭化水素オイル)中に分散された水相流体またはその逆として調製してもよい。マイクロ流体チャネル(またはその上のコーティング)の性質、例えば、親水性または疎水性は、マイクロ流体ワークフローの特定の点で利用されているエマルジョンの種類と適合するように選択してもよい。
エマルジョンは、以下により詳細に記載されるようなマイクロ流体デバイスを使用して作製してもよい。マイクロ流体デバイスは、大きさが極めて均一である小滴で構成されているエマルジョンを形成し得る。微小滴作製プロセスは、オイルおよび水などの2種の非混和性流体をポンプで接合部に入れることによって達成してもよい。接合部の形状、流体特性(粘度、界面張力など)および流速は、生成される微小滴の特性に影響を及ぼすが、T接合およびフロー集束のような方法を使用して、比較的広い範囲の特性について、制御された均一な大きさの微小滴を作製できる。特定の範囲の特性にわたるT接合およびフロー集束戦略のために、微小滴の大きさは、総流速および2種の流体の流速の割合に応じて変わるので、微小滴の大きさを変えるために、非混和性液体の流速を変えてもよい。マイクロ流体方法を用いてエマルジョンを作製するために、通常、2種の流体を、2種の入口リザーバー(シリンジ、圧力チューブ)中に詰め、次いで、必要に応じて加圧して、所望の流速を生じさせる(シリンジポンプ、圧力調節器、重力などを使用して)。これは、流体を、所望の流速でデバイスを通して送り出し、このようにして、所望の大きさおよび速度の微小滴を作製する。
いくつかの実施形態では、その開示内容が参照によってその全文ですべての目的のために本明細書に組み込まれるPCT公開番号WO2014/028378に記載されるような小滴製造機を使用して微小滴を作製する。
別個の実体に試薬を添加すること:本方法の実施では、1つまたは複数のステップ(例えば、約2、約3、約4または約5またはそれ以上のステップ)で、いくつかの試薬を、別個の実体、例えば、微小滴に添加してもよい、すなわち、それに組み込んでもよく、および/またはそれによってカプセル封入してもよい。このような試薬は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬などの増幅試薬を含み得る。別個の実体、例えば、微小滴に試薬を添加する方法は、いくつかの点で変わり得る。対象のアプローチとして、それだけには限らないが、その開示内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Ahnら、Appl.Phys.Lett.第88巻、264105頁(2006年);Priestら、Appl.Phys.Lett.第89巻、134101頁(2006年);Abateら、PNAS、2010年11月9日、第107巻、第45号19163~19166頁;およびSongら、Anal.Chem.、2006年、第78巻(14号)、4839~4849頁によって記載されるものが挙げられる。
例えば、試薬を、別個の実体、例えば、微小滴を、試薬(複数可)を含有する第2の別個の実体、例えば、微小滴と混合することを含む方法によって、別個の実体、例えば、微小滴に添加してもよい。第2の別個の実体中に含有される試薬(複数可)は、具体的に、本明細書に記載されるものを含む任意の従来法によって添加してもよい。この第2の別個の実体を、第1の別個の実体と混合して、第1の別個の実体および第2の別個の実体の両方の内容物を含む別個の実体、例えば、微小滴を作製してもよい。
いくつかの実施形態では、別個の実体、例えば、小滴の併合を、以下により詳細に記載されるようなコンカテマー化された併合アーキテクチャを含むマイクロ流体デバイスを使用して達成する。
また、または代わりに、1種または複数の試薬を、小滴合体またはピコインジェクションなどの技術を使用して添加してもよい。小滴合体では、標的液滴(すなわち、微小滴)を、微小滴に添加されるべき試薬(複数可)を含有する微小滴と並行して流してもよい。2種の微小滴を、それらが互いに接触するが、その他の微小滴に触れないように流してもよい。次いで、電場をかけるために、これらの液滴を電極またはその他の特徴を通して通過させてもよく、ここで、電場は、微小滴を不安定化し得、その結果、それらは一緒に併合される。
また、または代わりに、ピコインジェクションを使用して試薬を添加してもよい。このアプローチでは、標的液滴(すなわち、微小滴)を、添加されるべき試薬(複数可)を含有するチャネルを通して流してもよく、ここで、試薬(複数可)は高圧である。しかし、微小滴を界面活性剤がコーティングすることが、流体が入るのを妨げ得るので、電場の不在下では、界面活性剤の存在のために、微小滴は、注入されずに流れる。しかし、インジェクターを通過するときに電場が微小滴にかけられると、試薬(複数可)を含有する流体が、微小滴中に注入される。微小滴中に添加される試薬の量は、注入圧力および流動液滴の速度を調整することによって、電場オンおよびオフを切り替えることによってなどといった、いくつかの異なるパラメータによって制御できる。
種々の態様ではまた、または代わりに、2種の小滴を一緒に併合することまたは液体を液滴中に注入することに頼らない方法によって1種または複数の試薬を、微小滴に添加してもよい。むしろ、1種または複数の試薬を、試薬を極めて小さい液滴の流れの中に乳化するステップおよびこれらの小さい液滴を標的微小滴と併合するステップを含む方法によって微小滴に添加してもよい。このような方法は、本明細書において「複数液滴合体による試薬添加」と呼ばれなければならない。これらの方法は、標的液滴のものと比較して、添加されるべき液滴の小さい大きさのために、小さい液滴は、標的液滴よりも速く流れ、それらの後ろに集まるという事実を利用する。次いで、例えば、電場をかけることによって収集物を併合できる。また、または代わりに、このアプローチを使用して、異なる流体の小さい液滴のいくつかのコーフロー流を使用することによって微小滴に複数の試薬を添加できる。小さい、標的液滴の効果的な併合を可能にするために、標的液滴を含有するチャネルよりも小さい、小さい液滴を作製すること、およびまた小さい液滴に、標的液滴に「追いつく」ための時間を与えるように十分に長い、電場をかける電極から標的液滴を注入するチャネルの間の距離をとることが重要である。このチャネルが短すぎると、すべてではない小さい液滴が、標的液滴と併合し、望まれるものよりも少ない試薬を添加する。これは、さらに離れている液滴が併合することを可能にする傾向がある、電場の強度を増大することによって、ある程度まで、埋め合わせることができる。同一マイクロ流体デバイス上で小さい液滴を作製することに加えて、また、または代わりに、それらを別のマイクロ流体小滴併合を使用して、または均質化し、次いで、標的液滴を含有するデバイス中に注入することによってオフラインにできる。
したがって、いくつかの実施形態では、試薬を小滴の流中に乳化するステップであって、小滴が、微小滴の大きさよりも小さい、ステップと、小滴を微小滴と一緒に流すステップと、小滴を微小滴と併合するステップとを含む方法によって、試薬を微小滴に添加する。小滴の流中に含有される小滴の直径は、微小滴の直径のものの約75%以下の範囲で変わり得、例えば、流動小滴の直径は、微小滴の直径のものの約75%以下、微小滴の直径のものの約50%以下、微小滴の直径のものの約25%以下、微小滴の直径のものの約15%以下、微小滴の直径のものの約10%以下、微小滴の直径のものの約5%以下または微小滴の直径のものの約2%以下である。特定の態様では、2種以上の小滴、3種以上、4種以上または5種以上など、複数の流動小滴を、微小滴と併合してもよい。このような併合は、それだけには限らないが、電場をかけることによってを含む、種々の方法で成し遂げてもよく、ここで、電場は、流動小滴を微小滴と併合するのに有効である。
別の態様では、試薬を、試薬が添加されるべき液滴(すなわち、「標的液滴」)を、添加されるべき試薬(「標的試薬」)を含有する液滴内に包むことによってより早い時間に形成される液滴(例えば、微小滴)に添加する。特定の実施形態では、このような方法は、標的液滴を、適した疎水性相、例えば、オイルのシェル中に最初にカプセル封入し、二重エマルジョンを形成することによって実施される。次いで、二重エマルジョンを、標的試薬を含有する液滴によってカプセル封入して、三重エマルジョンを形成する。標的液滴を、標的試薬を含有する液滴と組み合わせるために、次いで、それだけには限らないが、電場をかけること、小滴界面を脱安定化する化学物質を添加すること、狭窄およびその他のマイクロ流体形状によって三重エマルジョンを流すこと、機械的撹拌もしくは超音波を適用すること、温度を上げるもしくは下げることを含む任意の適した方法を使用して、または磁場によって引っ張られた場合に二重エマルジョン界面を破裂させ得る磁性粒子を液滴中にカプセル封入することによって二重エマルジョンを押し開く。
選別:本開示の方法の実施では、1つまたは複数の選別ステップを使用してもよい。対象の選別アプローチとして、1種または複数の選別機、例えば、マイクロ流体バルブ、メンブレンバルブ、分岐チャネル、表面音響波および/または誘電泳動を使用するマイクロ流体デバイスの選別機の使用を含むアプローチが挙げられるが、必ずしもそれに制限されない。開示される方法、系およびデバイスに関連して利用され得る選別アプローチとしてまた、それぞれの開示内容が参照によりその全文ですべての目的のために本明細書に組み込まれる、Agrestiら、PNAS 第107巻、第9号、4004~4009頁によって記載されたものおよびPCT公開番号WO2014/028378に記載されたものが挙げられる。選別によって、集団、例えば、別個の実体の集団を濃縮してもよい、すなわち、所望の特性を有さないメンバーを除去し、それによって、所望の特性を有する濃縮された集団を製造することによって、所望の特性を有するか、または有さないメンバーのミックスを含有する集団を濃縮してもよい。
種々の実施形態では、本方法は、1種または複数の別個の実体、例えば、微小滴をスキャンして、例えば、光学的にスキャンして、別個の実体の選別を容易にすることを含む。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスまたはその一部、例えば、選別機は、1つまたは複数の検出器、例えば、光学スキャナを含む。種々の適した光学スキャナが、当技術分野で公知である。このような光学スキャナは、例えば、1つまたは複数の別個の実体に励起エネルギーを適用するために1つまたは複数の光ファイバーを含み得る。いくつかの実施形態では、適した光学スキャナは、例えば、1つまたは複数の別個の実体内の蛍光色素を励起するために、対物レンズの後ろに向けられ、小滴が流れるマイクロ流体チャネル上に集束されるレーザー光供給源を利用する。もう1つの複数の別個の実体をスキャンすることは、スキャンされた実体の1つまたは複数の特性、例えば、大きさ、形状、組成が決定されることを可能にし得る。順に、1つまたは複数の特性に基づいて選別を実施してもよい。例えば、選別は、1つまたは複数の別個の実体の光学スキャンから得られた結果に基づき得る。
検出され得る別個の実体の特性として、それだけには限らないが、大きさ、粘度、質量、浮力、表面張力、電気伝導度、電荷、磁性および/または1種もしくは複数の成分、例えば、1種もしくは複数の検出可能な標識(例えば、1種もしくは複数の蛍光標識)の有無が挙げられる。特定の態様では、選別は、少なくとも部分的には、微小滴における1種または複数の細胞、例えば、1種または複数の検出可能に標識された細胞の有無に基づき得る。特定の態様では、選別は、少なくとも部分的には、PCR増幅産物の有無の検出に基づき得る。
選別は、開示された方法において任意の適した点で適用してよい。さらに、別個の実体またはその種類、例えば、微小滴の集団に、2以上の選別ステップ、例えば、約2以上の選別ステップ、約3以上の、約4以上のまたは約5以上のなどを適用してもよい。複数の選別ステップが適用される場合には、ステップは、実質的に同一であっても、1つまたは複数の点で異なっていてもよい(例えば、異なる特性に基づく選別、異なる技術を使用する選別など)。
さらに、任意の選別ステップに先立って、またはその後に、別個の実体、例えば、小滴を精製してもよい。一実施形態では、小滴を、以下のように精製してもよい:細胞またはビーズのような液滴中にカプセル封入され得る任意の別個の試薬を除去せずに、液滴中の流体の大部分が、精製された溶液で置き換えられる。まず、微小滴に、溶液を注入して、その中の任意の不純物を希釈する。次いで、希釈された微小滴を、電極を使用してそれに電場がかけられるマイクロ流体チャネルを通す。電場によって生じた誘電泳動力のために、細胞またはその他の別個の試薬は電場を通過するときに、流れの中で動かされる。次いで、すべての物体が、最後に1つの微小滴中になるように、液滴を分ける。したがって、最初の微小滴が精製される、すなわち、得られた微小滴において、小滴内にカプセル封入され得る、ビーズまたは細胞などの別個の試薬の存在および/または濃度が維持されながら、夾雑物が除去される。
微小滴を、1つまたは複数の特性に基づいて選別してもよい。対象の特性として、それだけには限らないが、大きさ、粘度、質量、浮力、表面張力、電気伝導度、電荷、磁性および/または1種もしくは複数の成分、例えば、1種もしくは複数の検出可能な標識の有無が挙げられる。特定の態様では、選別は、少なくとも部分的には、微小滴における1種または複数の細胞、例えば、1種または複数の検出可能に標識された細胞の有無に基づき得る。特定の態様では、選別は、少なくとも部分的には、PCR増幅産物の有無の検出に基づき得る。
選別を、例えば、細胞が存在しない別個の実体、例えば、微小滴を除去するために使用してもよい。カプセル封入は、細胞が存在しない、別個の実体、例えば、微小滴の大部分を含む、1つまたは複数の別個の実体、例えば、微小滴をもたらし得る。このような空の液滴が系中に残された場合、それらは任意のその他の液滴と同様に処理され、その際、試薬および時間が浪費される。最高速度および効率を成し遂げるために、小滴選別を用いてこれらの空の液滴を除去してもよい。例えば、滴下から噴射移行に近接して小滴併合が作動してもよく、その結果、細胞の不在下で、第1の大きさ、例えば、8μmの液滴が形成され、対照的に、細胞が存在する場合には、流れの中で生じた撹乱が、噴射の分裂を引き起こし、第2の大きさ、例えば、直径25μmの液滴を形成する。したがって、デバイスは、第1の大きさ、例えば、8μmの空の液滴および第2の大きさ、例えば、25μmの単一細胞を含有する液滴の二分散集団を製造し得、次いで、これを、例えば、水力学的選別機を使用して大きさによって選別し、第2の、例えば、より大きい大きさの単一細胞を含有する液滴のみを回収してもよい。
本実施形態の選別機は、能動的選別機であっても、受動的選別機であってもよい。対象の受動的選別機として、小さいおよび大きい液滴がマイクロ流体チャネルを通って移動する種々の方法に基づいて、大きさに従って別個の実体、例えば、微小滴を異なるチャネル中に選別する水力学的選別機が挙げられる。また、バルク選別機も対象とし、その簡単な例として、重力場において異なる質量の液滴を含有するチューブがある。チューブを遠心分離、撹拌および/または振盪することによって、より浮力のあるより軽い液滴は、容器の上部に自然に移動する。磁性特性を有する液滴は、磁性特性を有する液滴が、それらの特性の大きさに従って自然に移動する容器に磁場を適用することを除いて、同様のプロセスで選別できる。本方法において使用されるような受動的選別機はまた、その流動特性に基づいて多数の液滴を同時に選別する比較的大きなチャネルを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、選別を、1つまたは複数のバルブ、例えば、マイクロ流体バルブの活性化によって実施する。
ピコインジェクションも、液滴の電気的特性を変更するために使用できる。これは、例えば、イオンを添加することによって液滴の伝導度を変更するために使用でき、次いで、これを使用して、例えば、誘電泳動を使用してそれらを選別できる。あるいは、ピコインジェクションを使用してまた、液滴を帯電させることができる。これは、流体を、帯電される液滴中に注入することによって成し遂げられ、その結果、注入後に、液滴は、帯電される。これは、一部が帯電しており、その他のものは帯電していない液滴の収集物を製造し、次いで、それらを、その電荷量に基づいてそれらを偏向させる電場の領域を通して流すことによって帯電された液滴を抽出できる。ピコインジェクションを調節することによって異なる量の液体を注入することによって、または付加される注入容量に対して異なる電荷を注入するために電圧を調節することによって、液滴での最終電荷を調整して、異なる電荷を有する液滴を製造できる。次いで、これらは、電場領域において異なる量で偏向され、これによって、それらが異なる容器中に選別されることが可能になる。
細胞のカプセル封入および/または溶解:本方法のいくつかの実施形態によれば、任意の従来法を使用して、例えば、ニードルおよび/またはシリンジを適用することによって、細胞を対象から回収してもよい。次いで、例えば、遠心分離、濾過などといった処理ステップを使用して、生体サンプルを処理して、細胞以外の成分を除去してもよい。
次いで、生体サンプルまたはそのサブセット中の各細胞を、マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体、例えば、小滴中にカプセル封入してもよい。生体サンプルに由来する成分のカプセル封入に利用され得る方法およびデバイスは、その開示内容がその全文ですべての目的のために参照により本明細書に組み込まれるPCT公開番号WO2014/028378に記載されている。対象のカプセル封入アプローチとしてまた、それだけには限らないが、水力学的に誘発される液滴形成およびその開示内容が参照により本明細書に組み込まれるLinkら、Phys.Rev.Lett.第92巻、054503頁(2004年)によって記載されるものが挙げられる。細胞を小滴中にカプセル封入するその他の方法も適用してよい。望まれる場合には、細胞を、それらを液滴中にカプセル封入する前に1種または複数の抗体および/またはプローブを用いて染色してもよい。
細胞(複数可)を破裂させ得、それによってそのゲノムを放出する条件下で、1種または複数の溶解剤も、細胞を含有する別個の実体、例えば、小滴中に添加してよい。溶解剤は、細胞が、別個の実体、例えば、微小滴中にカプセル封入された後に添加してもよい。プロテイナーゼKまたは細胞毒などの任意の従来の溶解剤を使用してもよい。特定の実施形態では、細胞を、Triton X100および/またはプロテイナーゼKなどの洗剤を含む溶解バッファーとともに液滴中に同時カプセル封入してもよい。細胞(複数可)を破裂させ得る特定の条件は、使用される特定の溶解剤に応じて変わる。例えば、プロテイナーゼKが、溶解剤として組み込まれる場合には、別個の実体、例えば、小滴を、約37~60℃に約20分間加熱して、細胞を溶解し、プロテイナーゼKが細胞性タンパク質を消化することを可能にしてもよく、その後、それを約95℃に約5~10分間加熱して、プロテイナーゼKを不活性化してもよい。
特定の態様では、細胞溶解はまた、または代わりに、溶解剤の添加を含まない技術に頼ることもある。例えば、細胞の穿孔、せん断、研磨などを達成するために種々の形状の機構を使用し得る機械的技術によって、溶解を成し遂げてもよい。音響技術などのその他の種類の機械的破損も使用してよい。さらに、熱エネルギーを使用しても細胞を溶解できる。本明細書に記載される方法において、細胞溶解を達成する任意の簡便な方法を使用してよい。
PCR:上記のように、本方法の実施では、PCRベースのアッセイ、例えば、定量的PCR(qPCR)を使用して、別個の実体またはその1種もしくは複数の成分、例えば、それにカプセル封入された細胞中に存在する、特定の核酸、例えば、対象の遺伝子の存在を検出してもよい。このようなアッセイを、マイクロ流体デバイスまたはその一部または任意のその他の適した位置内の別個の実体に適用できる。このようなPCRベースのアッセイの条件は、核酸増幅を経時的に検出することを含み得、1つまたは複数の点で変わり得る。
例えば、微小滴中に付加してもよいPCRプライマーの数は、変わり得る。用語「プライマー」は、精製された制限消化物中にあるように天然に生じるか、または合成によって製造されるかに関わらず、核酸鎖と相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれた場合に、相補鎖に沿う合成の開始点として作用可能である、2種以上のプライマーを指す場合もあり、オリゴヌクレオチドを指す場合もある。このような条件として、例えば、適したバッファー(補助因子であるか、またはpH、イオン強度などに影響を及ぼす置換成分を含む「バッファー」)中、適した温度での、4種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合誘導剤の存在が挙げられる。プライマーは、増幅における最大効率のために一本鎖であり得る。
本明細書において使用されるような核酸配列の相補体は、一方の配列の5’末端が、他方の3’末端と対形成されるように、核酸配列とアラインされた場合に、「逆平行関係」にあるオリゴヌクレオチドを指し得る。相補性は、完全である必要はなく、安定な二本鎖は、ミスマッチしている塩基対または非対応の塩基を含有し得る。二本鎖安定性は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチド中のシトシンおよびグアニン塩基の濃度パーセント、イオン強度およびミスマッチしている塩基対の出現率を含むいくつかの変数を経験的に考慮することによって決定することができる。
微小滴中に添加してもよいPCRプライマーの数は、約1~約500個もしくはそれ以上、例えば、約2~100個のプライマー、約2~10個のプライマー、約10~20個のプライマー、約20~30個のプライマー、約30~40個のプライマー、約40~50個のプライマー、約50~60個のプライマー、約60~70個のプライマー、約70~80個のプライマー、約80~90個のプライマー、約90~100個のプライマー、約100~150個のプライマー、約150~200個のプライマー、約200~250個のプライマー、約250~300個のプライマー、約300~350個のプライマー、約350~400個のプライマー、約400~450個のプライマー、約450~500個のプライマーまたは約500個のプライマーまたはそれ以上の範囲であり得る。
このようなプライマーは、対象の1種または複数の核酸、例えば、対象の1種または複数の遺伝子のプライマーを含有し得る。添加される対象の遺伝子のプライマーの数は、約1~500個、例えば、約1~10個のプライマー、約10~20個のプライマー、約20~30個のプライマー、約30~40個のプライマー、約40~50個のプライマー、約50~60個のプライマー、約60~70個のプライマー、約70~80個のプライマー、約80~90個のプライマー、約90~100個のプライマー、約100~150個のプライマー、約150~200個のプライマー、約200~250個のプライマー、約250~300個のプライマー、約300~350個のプライマー、約350~400個のプライマー、約400~450個のプライマー、約450~500個のプライマーまたは約500個のプライマーまたはそれ以上であり得る。
このようなプライマーおよび/または試薬を、1ステップで、または2以上のステップで別個の実体、例えば、微小滴に添加してもよい。例えば、プライマーを、2以上のステップ、3以上のステップ、4以上のステップまたは5以上のステップで添加してもよい。プライマーが、1ステップで添加されるか、または2以上のステップで添加されるかに関わらず、それらを、溶解剤の添加の後に、溶解剤の添加の前に、溶解剤の添加と同時に添加してもよい。溶解剤の添加の前または後に添加される場合には、PCRプライマーを、溶解剤の添加とは別個のステップで添加してもよい。いくつかの実施形態では、別個の実体、例えば、微小滴を、PCR試薬の添加の前に希釈ステップおよび/または酵素不活性化ステップに供してもよい。このような方法の例示的実施形態は、その開示内容が参照によりその全文ですべての目的のために本明細書に組み込まれるPCT公開番号WO2014/028378に記載されている。
ひとたび、プライマーが別個の実体、例えば、微小滴に添加されると、別個の実体、例えば、微小滴を、PCRを可能にする条件下でインキュベートしてもよい。別個の実体、例えば、微小滴を、プライマー(複数可)を添加するために使用したものと同一マイクロ流体デバイス上でインキュベートしてもよい、または別個のデバイスでインキュベートしてもよい。特定の実施形態では、PCR増幅を可能にする条件下で別個の実体、例えば、微小滴をインキュベートすることを、細胞をカプセル封入するために、および/または細胞を溶解するために使用した同一マイクロ流体デバイスで実施する。微小滴をインキュベートすることは、種々の形態をとり得る。特定の態様では、PCRミックスを含有する液滴を、PCRに有効な条件下で、小滴をインキュベートするチャネルを通して流してもよい。微小滴をチャネルを通して流すことは、PCRに有効な温度で維持される種々の温度帯にわたってくねるように進むチャネルを含み得る。このようなチャネルは、例えば、2以上の温度帯にわたって循環し得、ここで、少なくとも1つの帯域は約65℃で維持され、少なくとも1つの帯域は、約95℃で維持される。液滴がこのような帯域を移動するときに、その温度はPCRに必要とされるように循環する。帯域の正確な数および各帯域のそれぞれの温度は、所望のPCR増幅を成し遂げるように決定してもよい。
その他の実施形態では、微小滴をインキュベートすることは、例えば、その開示内容が参照によりその全文ですべての目的のために本明細書に組み込まれるPCT公開番号WO2014/028378に記載されるような「メガドロップレット(Megadroplet)アレイ」の使用を含み得る。このようなデバイスでは、チャネル(例えば、PDMSチャネル)へとくぼみがつけられた数百、数千または数百万のアレイのトラップが、熱系の上にある。チャネルを加圧し、それによってガスが逃げるのを防いでもよい。マイクロ流体チャネルの高さは、別個の実体、例えば、液滴の直径よりも小さく、別個の実体に、平らにされたパンケーキの形状をとるようにさせる。別個の実体が、占有されていないくぼみにわたって流れる時に、より低いよりエネルギー的に好都合な曲率半径をとり、これが、別個の実体をトラップ中に完全に引き込む力につながる。密集したものとして別個の実体を流すことによって、アレイ上のすべてのトラップが占有されることが確実にされる。ヒーターを使用して、全デバイスが熱循環され得る。
特定の態様では、ヒーターは、ペルチェプレート、ヒートシンクおよび制御コンピュータを含む。かけられる電流を制御することによって、ペルチェプレートによって、室温を上回ってまたは下回ってチップを加熱することまたは冷却することが可能となる。制御されたおよび再現性のある温度を確実にするために、コンピュータは、統合された温度プローブを使用してアレイの温度をモニタリングし得、必要に応じて加熱および冷却するように、かけられる電流を調整し得る。金属製(例えば、銅)プレートによって、熱の均一な適用および冷却サイクルの際の過剰な熱の放散が可能となり、これによって、約1分未満で約95℃から約60℃に冷却することが可能となる。
本開示の方法はまた、1種または複数のプローブを微小滴中に導入するステップを含み得る。本明細書において使用されるように、核酸に関して、用語「プローブ」とは、プローブ中の少なくとも一方の配列の、標的領域中の配列との相補性のために、標的核酸中の配列と二本鎖構造を形成する標識されたオリゴヌクレオチドを指す。対象のプローブとして、それだけには限らないが、TaqMan(登録商標)プローブ(例えば、Holland、P.M.;Abramson、R.D.;Watson,R.;Gelfand、D.H.(1991年)「Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’----3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase」PNAS、第88巻(16号):7276~7280頁に記載されるような)が挙げられる。
本方法のいくつかの実施形態では、細胞中に存在する対象の特定の転写物、例えば、癌遺伝子(複数可)の存在を検出するためにRT-PCRベースのアッセイを使用する。このような実施形態では、別個の実体、例えば、微小滴に、本明細書に記載されるPCRを実施するために使用される試薬(まとめて、「RT-PCR試薬」と呼ばれる)に加えて、逆転写酵素およびcDNA合成に必要な任意のその他の試薬を添加する。本明細書に記載される方法のいずれかを使用して、RT-PCR試薬を別個の実体、例えば、微小滴に添加する。ひとたび、別個の実体、例えば、微小滴にRT-PCRの試薬が添加されると、微小滴を、逆転写を可能にする条件と、それに続く、本明細書に記載されるようなPCRを可能にする条件下でインキュベートしてもよい。微小滴を、RT-PCR試薬を添加するために使用したものと同一マイクロ流体デバイス上でインキュベートしてもよい、または別個のデバイスでインキュベートしてもよい。特定の実施形態では、微小滴を、RT-PCRを可能にする条件下でインキュベートすることを、細胞をカプセル封入するために、および細胞を溶解するために使用した同一マイクロ流体デバイスで実施する。
特定の実施形態では、RT-PCRまたはPCRのために微小滴に添加される試薬は、リアルタイムRT-PCRまたはPCR産物を検出可能な蛍光DNAプローブをさらに含む。それだけには限らないが、SYBRグリーン、TaqMan(登録商標)、Molecular BeaconsおよびScorpionプローブを含む任意の適した蛍光DNAプローブを使用できる。特定の実施形態では、微小滴に添加される試薬は、2種以上のDNAプローブ、例えば、2種の蛍光DNAプローブ、3種の蛍光DNAプローブまたは4種の蛍光DNAプローブを含む。複数の蛍光DNAプローブの使用によって、単一反応におけるRT-PCRまたはPCR産物の同時測定が可能となる。
さらに、実施形態に従って使用してもよい対象のPCRベースのアッセイの例として、それだけには限らないが、定量的PCR(qPCR)、定量的蛍光PCR(QF-PCR)、マルチプレックス蛍光PCR(MF-PCR)、リアルタイムPCR(RT-PCR)、単細胞PCR、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、ホットスタートPCR、ネステッドPCR、インサイツコロニーPCR、インサイツローリングサークル増幅(RCA)、ブリッジPCR、ピコタイター(picotiter)PCRおよびエマルジョンPCRが挙げられる。その他の適した増幅方法として、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応(CP-PCR)、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応(AP-PCR)、縮重オリゴヌクレオチドプライムドPCR(DOP-PCR)および核酸ベースの配列増幅(NABSA)が挙げられる。
マルチプレックス化:本方法の種々の態様では、特定の別個の実体またはその1種もしくは複数の成分、例えば、それにカプセル封入された細胞(複数可)について、複数のバイオマーカーを検出し、解析してもよい。検出されるバイオマーカーとして、それだけには限らないが、1種または複数のタンパク質、転写物および/または細胞のゲノム中の遺伝子痕跡またはそれらの組合せを挙げることができる。標準的な蛍光ベースの検出を用いて、同時に調べることができるバイオマーカーの数は、各別個の実体、例えば、微小滴内で独立に可視化できる蛍光色素の数に制限され得る。したがって、本明細書に記載されるような核酸バーコードの使用は、開示される方法を使用して成し遂げられるマルチプレックス化のレベルを大きく増大する。
特定の実施形態では、バーコードベースではない方法または本明細書に記載された1種もしくは複数のバーコードベースの方法と組み合わせたバーコードベースではない方法を使用して、特定の別個の実体、例えば、微小滴内で個別に検出できるバイオマーカーの数を増大できる。例えば、これは、別個の実体、例えば、微小滴の異なる部分への色素の分離によって達成してもよい。特定の実施形態では、色素およびプローブ(例えば、核酸または抗体プローブ)とコンジュゲートしているビーズ(例えば、LUMINEX(登録商標)ビーズ)を、別個の実体、例えば、微小滴中にカプセル封入して、解析されるバイオマーカーの数を増大してもよい。別の実施形態では、蛍光分極化を使用して、単細胞の異なるバイオマーカーのより多数の検出可能なシグナルを成し遂げてもよい。例えば、蛍光色素を種々のプローブと結合してもよく、異なる分極化条件下で別個の実体、例えば、微小滴を可視化してもよい。このように、同一に着色された色素を利用して、単細胞の異なるプローブ標的のシグナルを提供できる。固定されたおよび/または透過処理された細胞の使用も、マルチプレックス化のレベルの増大を可能にし得る。例えば、標識された抗体を使用して、細胞成分に局在化されたタンパク質標的を標的化してもよく、一方で、標識されたPCRおよび/またはRT-PCR産物は、別個の実体、例えば、微小滴内で遊離している。これによって、抗体のためにおよびRT-PCRによって製造されたアンプリコンのために同色の色素が使用されることが可能となる。
PCR産物を検出すること:本方法に従ってPCR産物を検出できる方法は変わり得る。本明細書に論じられるように、核酸バーコード配列およびUMIを使用して、シーケンシングによってPCR産物を同定し、必要に応じて増幅バイアスを補正できる。バーコードを含有する核酸のシーケンシングによる検出に加えて、例えば1種または複数の蛍光色素の使用を含む、種々のバーコードをベースとしない検出方法を、開示される方法に関連して利用してもよい。このような蛍光色素を、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体、クマリンおよびその誘導体、Cascade Blueおよびその誘導体;Lucifer Yellowおよびその誘導体、BODIPYおよびその誘導体などといったファミリーにわけてもよい。例示的フルオロフォアとして、インドカルボシアニン(C3)、インドジカルボシアニン(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Texas Red、Pacific Blue、Oregon Green 488、Alexa fluor-355、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor-555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、JOE、Lissamine、ローダミン Green、BODIPY、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、カルボキシ-フルオレセイン(FAM)、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン(dRhodamine)、カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreenなどが挙げられる。フルオロフォアおよびその使用の説明は、その他の場所の中でも、R.Haugland、Handbook of Fluorescent Probes and Research Products、第9版(2002年)、Molecular Probes,Eugene,Oreg.;M.Schena、Microarray Analysis(2003年)、John Wiley & Sons、Hoboken,N.J.;Synthetic Medicinal Chemistry 2003/2004年カタログ、Berry and Associates,Ann Arbor,Mich.;G.Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996年);およびGlen Research 2002年カタログ、Sterling,VAに見出すことができる。
したがって、本方法の実施では、成分を、例えば、蛍光の変化に基づいて検出してもよい。特定の態様では、蛍光の変化は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるものである。このアプローチでは、5’プライマーがクエンチャー色素を有し、3’プライマーが、蛍光色素を有する特別なプライマーのセットを使用してもよい。これらの色素を、プライマー上のどこにでも、末端のいずれか、または中間に配置できる。プライマーは、相補性であるので、それらは溶液中で二本鎖として存在し、その結果、それらが互いに極めて近接するので、蛍光色素の発光が、クエンチャー色素によってクエンチされ、溶液を暗く現れるようにする。PCR後、これらのプライマーは、長いPCR産物中に組み込まれ、したがって、互いに離れることとなる。これは蛍光色素が光を発することを可能にし、溶液を蛍光になるようにする。したがって、特定の標的遺伝子が存在するか否かを検出するために、蛍光色素の波長での別個の実体、例えば、小滴の強度を測定してもよい。異なる標的遺伝子、例えば、癌遺伝子が存在するか否かを検出するために、異なるプライマーについて異なる色の色素を用いてこれを行う。これは、別個の実体、例えば、小滴を、細胞中に存在する標的遺伝子のプライマーに対応するすべての波長で蛍光になるようにする。
デバイスおよび系
上記で示したように、開示された主題の実施形態は、マイクロ流体デバイスを含む系および/またはデバイスを使用する。本開示のデバイスは、本方法と関連するすべての上記で記載されるもの含む。本開示のマイクロ流体デバイスは、種々の方法で特性決定してもよい。
上記で示したように、開示された主題の実施形態は、マイクロ流体デバイスを含む系および/またはデバイスを使用する。本開示のデバイスは、本方法と関連するすべての上記で記載されるもの含む。本開示のマイクロ流体デバイスは、種々の方法で特性決定してもよい。
いくつかの態様では、例えば、本明細書に記載されるような別個の実体、例えば、小滴を作製するように構成された1種もしくは複数の別個の実体作製機、例えば、小滴作製機および/または1種もしくは複数のフローチャネルを含むマイクロ流体系および/またはデバイスが提供される。いくつかの態様では、1種もしくは複数のフローチャネルは、1種もしくは複数の小滴作製機に作動可能に接続される、例えば、流体的に接続される、および/またはそれから1つまたは複数の小滴を受け取るように構成される。「作動可能に接続される」および「作動可能に結合される」とは、本明細書において、開示される系またはデバイスおよびその種々の成分が、本明細書に記載される方法において効果的に作動することを可能にする特定の方法で(例えば、流体、例えば、水が移動する、および/または電力が送られることを可能にする方法で)接続されることを意味する。
上記のように、マイクロ流体デバイスは、1種または複数のフローチャネル、例えば、別個の実体が、それに入り、それから出て、および/またはそれを通るフローチャネルを含み得る。特定の実施形態では、フローチャネルは、1種または複数の「マイクロ」チャネルである。このようなチャネルは、およそミリメートルまたはそれより小さい(例えば、約1ミリメートル以下の)少なくとも1つの断面寸法を有し得る。特定の適用のために、この寸法を調整してもよく、いくつかの実施形態では、少なくとも1つの断面寸法は、約500マイクロメートル以下である。いくつかの実施形態では、断面寸法は、約100マイクロメートル以下または約10マイクロメートル以下であり、時には、約1マイクロメートル以下である。断面寸法は、一般に、中心線の流れの方向に対して垂直であるものであるが、屈曲部または流れの方向を変更する傾向があるその他の機構を通る流れと遭遇する場合には、働いている断面寸法は、流れに対して厳密に垂直である必要はないということは理解されるものとする。いくつかの実施形態では、マイクロチャネルは、矩形断面の高さおよび幅または楕円断面の長軸および短軸などの2以上の断面寸法を有し得ることは理解されるものとする。これらの寸法のいずれかを、本明細書に提示される大きさに対して比較してもよい。本開示において使用されるマイクロチャネルは、大幅に不均衡である2つの寸法、例えば、約100~200マイクロメートルの高さおよびおよそセンチメートル以上の幅を有する矩形断面を有し得るということは留意されたい。もちろん、特定のデバイスは、2以上の軸が、大きさが極めて同様であるか、同一でさえあるチャネルを使用し得る(例えば、方形または環状断面を有するチャネル)。
本開示のいくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、微細加工技術を使用して製作される。このような技術を使用して、集積回路(IC)、微小電気機械デバイス(MEMS)、ディスプレイデバイスなどを製作してもよい。マイクロ流体デバイス製作において小さい寸法パターンを製造するために使用され得る微細加工プロセスの種類の中に、フォトリソグラフィー(X線リソグラフィー、e-ビームリソグラフィーなどを含む)、自己整合堆積およびエッチング技術、異方性堆積およびエッチングプロセス、自己集合性マスク形成(例えば、疎水性-親水性コポリマーの層を形成する)などがある。
上記を考慮して、本明細書において記載される原則および設計の特徴の一部は、ミリメートルスケール、またはさらにはセンチメートルスケールものチャネル断面に達するチャネルを使用するデバイスおよび系を含む、より大きなデバイスおよび系に拡大できることが理解されるものとする。したがって、「マイクロ流体の」としていくつかのデバイスおよび系を記載する場合には、説明は、特定の実施形態において、いくつかのより大きいスケールのデバイスに等しく当てはまると意図される。
マイクロ流体「デバイス」に言及する場合には、一般に、1つまたは複数のチャネル、リザーバー、ステーションなどが、一体化していても、していなくともよい連続基板を共有する単一実体を表すものとする。マイクロ流体デバイスの態様は、本明細書において論じられたような寸法を有する、1つまたは複数の流体流路、例えば、チャネルの存在を含む。マイクロ流体技術「系」は、1つまたは複数のマイクロ流体デバイスおよび関連する流体接続、電気的接続、制御/論理の特徴などを含み得る。
系はまた、(a)本デバイスの1つまたは複数の部分および/またはその中の別個の実体の温度を制御するための、マイクロ流体デバイス(複数可)と作動可能に接続している温度制御モジュール、(b)マイクロ流体デバイス(複数可)と作動可能に接続している検出手段、すなわち、検出器、例えば、光学的結像器、(c)マイクロ流体デバイス(複数可)と作動可能に接続している、インキュベーター、例えば、細胞インキュベーターおよび(d)マイクロ流体デバイス(複数可)と作動可能に接続しているシーケンサーのうち1つまたは複数を含み得る。本系はまた、第1の別個の実体、例えば、小滴から基板を移動する、例えば、運ぶように構成され、(a)~(d)のうち1つまたは複数に対して位置を受け取る1つまたは複数のコンベヤーを含み得る。
本デバイスおよび系は、別個の実体、例えば、小滴を1つまたは複数のフローチャネル中に選別するための1つまたは複数の選別機を含む。このような選別機は、組成、大きさ、形状、浮力またはその他の特徴を含む別個の実体の1種または複数の特徴に基づいて、別個の実体、例えば、小滴を選別し、分配し得る。
デバイスの態様はまた、1つもしくは複数の別個の実体、例えば、小滴またはその組成を含む、その1つもしくは複数の特徴の存在を検出するために構成された、1つまたは複数の検出手段、すなわち、検出器、例えば、光学的結像器を含む。いくつかの実施形態では、検出手段は、1つまたは複数の別個の実体、例えば、1つまたは複数のフローチャネル中の別個の実体の1つまたは複数の成分を認識するように構成される。
種々の実施形態では、本開示のマイクロ流体デバイスは、液状媒体の連続流を提供する。マイクロ流体デバイス中のチャネルを通って流れる流体は、多数の固有の特性を示す。通常、無次元レイノルズ数は、極端に低く、常に層状のままである流れをもたらす。さらに、この体制では、2種の流体接合は、容易に混合せず、拡散単独が、2種の化合物の混合を駆動し得る。
さらに、対象デバイスは、いくつかの実施形態では、1つまたは複数の温度および/または圧力制御モジュールを含む。このようなモジュールは、デバイスの1つまたは複数のフローチャネルのキャリアー流体の温度および/または圧力を調節可能であり得る。より詳しくは、温度制御モジュールは、1種または複数のサーマルサイクラーであり得る。
開示された方法、デバイスおよび系に関連して使用するのに適した、種々の機構およびマイクロ流体デバイス成分の例を、ここで、記載する。
基板:本開示によれば、マイクロ流体デバイスおよび/または系において使用される基板は、流体輸送のために必要な要素が提供される支持体である。基板の基本アーキテクチャは、一体化した、層状の、またはそうでなければ区分されたものであり得る。基板は、分子ライブラリーおよび/または試薬の導管として働くマイクロチャネルなどの1つまたは複数のフローチャネルを含み得る。それらはまた、入力ポート、出力ポートおよび/または流れの制御を補助するための機構を含み得る。
特定の実施形態では、基板選択は、デバイスの適用および設計に応じて変わり得る。基板材料は、種々の作動条件とのその適合性について選択され得る。所与の材料の微細加工プロセスにおける制限もまた、適した基板の選択における関連検討事項である。本開示とともに使用され得る有用な基板材料として、例えば、ガラス、ポリマー、シリコン、金属、セラミックおよび/またはそれらの組合せが挙げられる。
本デバイスは、いくつかの実施形態では、1種または複数のポリマーを含む。ポリマーは、それらが、費用効率の高いおよび高容量製造の両方を受け入れられるので、マイクロ流体デバイスにとって有用な材料である。本開示に従って使用するためのポリマーを含むポリマーを、その成形挙動に従って3つのカテゴリーに分類できる:熱可塑性ポリマー、弾性ポリマーおよびデュロプラスチックポリマー。熱可塑性ポリマーは、ガラス転移温度より上で形状に成形でき、ガラス転移温度未満に冷却した後に、これらの形状を保持する。弾性ポリマーは、外力の適用の際に伸ばすことができるが、ひとたび、外力が除去されると、元の状態に戻る。エラストマーは、その分解温度に到達する前には融解しない。デュロプラスチックポリマーは、温度がその分解温度に到達する前にわずかに軟化するので、その最終形状に成形されなくてはならない。
本開示の微細加工されたデバイスにおいて使用され得るポリマーの中に、ポリアミド(PA)、ポリブチレンテレフタレート(PBT)、ポリカーボネート(PC)、ポリエチレン(PE)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリオキシメチレン(POM)、ポリプロピレン(PP)、ポリフェニレンエーテル(PPE)、ポリスチレン(PS)およびポリスルホン(PSU)がある。ポリマーの化学的および物理的特性が、マイクロ流体デバイスにおけるその使用を制限し得る。具体的には、ガラスと比較して、化学物質、経年劣化、機械的安定性およびUV安定性に対するより低い耐性が、特定の適用のためのポリマーの使用を制限し得る。
基板材料として同様に使用され得るガラスは、特定の作動条件下で特別な利点を有する。ガラスは、ほとんどの液体およびガスに対して化学的に不活性であるのでの、プラスチックを溶解する傾向を有する特定の溶媒を使用する適用にとって特に適当である。さらに、その透明な特性が、ガラスを光学的またはUV検出にとって特に有用なものにする。
表面処理およびコーティング:表面修飾は、マイクロ流体デバイスの機能的機構を制御するのに有用であり得(例えば、フロー制御)、本開示に従って適用してもよい。例えば、流体種がチャネル壁に吸着するのを避けるのに、または抗体が生体成分の検出のために表面と結合するのに有用であり得る。
ポリマーデバイスは、特に、疎水性である傾向があり、したがって、チャネルのローディングが困難であり得る。ポリマー表面の疎水性はまた、電気浸透流(EOF)を制御することを困難にし得る。本開示に従ってポリマー表面をコーティングするための1つの技術は、チャネル表面へのポリ高分子電解質多層(PEM)の適用である。PEMは、チャネルを正および負の高分子電解質の交互溶液で逐次的に満たし、多層が静電結合形成するのを可能にすることを含む。層は、通常、チャネル表面と結合しないが、それらは長期間保存した後でさえチャネルを完全に覆い得る。本開示に従うポリマー表面に親水性層を適用するための別の技術は、チャネルの表面へのポリマーのUVグラフト化を含む。第1のグラフト化部位、ラジカルは、同時にデバイスをモノマー溶液に曝露しながら、表面をUV照射に曝露することによって表面に作製される。モノマーが反応して、反応部位で共有結合によって結合されるポリマーを形成する。
いくつかの実施形態では、本開示のガラスチャネルは、一般に、高レベルの表面電荷を有し、それによって、タンパク質を吸着させて、分離プロセスを妨げる可能性がある。いくつかの状況では、本開示は、ガラスチャネルにポリジメチルシロキサン(PDMS)および/または界面活性剤コーティングを適用することを含む。表面吸着を妨害するために使用してもよいその他のポリマーとして、ポリアクリルアミド、グリコール群、ポリシロキサン、グリセログリシドキシプロピル、ポリ(エチレングリコール)およびヒドロキシエチル化ポリ(エチレンイミン)が挙げられる。さらに、本電気浸透性デバイスは、デバイスの内側の条件(例えば、pH)を操作することによって、大きさを調整可能である電荷を有するコーティングを含み得る。コーティングは、正または負電荷を有し得るので、コーティングに基づいて流れの方向も選択できる。
特殊化されたコーティングもまた、本開示に従って適用して、チャネル表面上に特定の種を固定化でき、このプロセスは、「表面の官能基付与」と呼ばれる。例えば、ポリメチルメタクリレート(PMMA)表面を、アミンを用いてコーティングして、種々の官能基または標的の結合を容易にすることもできる。あるいは、PMMA表面を、酸素プラズマ処理プロセスによって親水性にできる。
マイクロ流体要素:本開示のマイクロ流体系およびデバイスは、1つまたは複数のフローチャネル(マイクロチャネルなど)、バルブ、ポンプ、反応器、ミキサーおよびその他の/または成分を含有し得る。これらの成分のいくつかおよびその一般的な構造および寸法を、以下に論じる。
本開示のマイクロ流体デバイスにおけるフロー制御のために種々の種類のバルブを適用できる。これらとして、それだけには限らないが、受動バルブおよびチェックバルブ(膜、フラップ、二弁式、漏出など)が挙げられる。これらのバルブを通るフロー速度は、表面積、フローチャネルの大きさ、バルブ材料などといったバルブの種々の物理的機構に左右される。バルブはまた、マイクロ流体デバイスの設計の際に考慮され得る関連する作動上のおよび製造上の利点/不利点を有する。
本デバイスの実施形態は、1つまたは複数のマイクロポンプを含む。マイクロポンプは、その他のマイクロ流体成分と同様に、製造上の制約を受ける。ポンプ設計における通常の検討事項として、気泡の処理、障害物および耐久性が挙げられる。本デバイス中に含まれ得るマイクロポンプとして、それだけには限らないが、電気的等価ポンプ、一定ストロークの微小変位、蠕動性マイクロ膜および/またはチェックバルブが組み込まれたポンプが挙げられる。
マクロデバイスは、試薬を混ぜるための振盪および撹拌などの乱流の力を当てにする。比較すると、本開示のものなどのマイクロデバイスでは、このような乱流の力は、実際に得ることができず、代わりに、マイクロ流体デバイスにおける混和は、一般に拡散によって達成される。拡散による混和は、遅く、非効率であり得るので、開示される対象とともに使用されるものなどのマイクロ構造は、混和プロセスを増強するように設計されることが多い。これらの構造は、流体領域間の界面表面積を増大し、それによって拡散を加速する方法で流体を操る。特定の実施形態では、マイクロ流体ミキサーが使用される。このようなミキサーは、本開示のマイクロ流体分離デバイスおよび/または選別機から上流に、いくつかの場合には、それと一体化して提供され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のデバイスおよび系は、マイクロミキサーを含む。マイクロミキサーは、2つの一般的なカテゴリーに分類され得る:能動ミキサーおよび受動ミキサー。能動ミキサーは、フロー領域にわたる能動制御を発揮すること(例えば、変動する圧力勾配、電荷など)によって働く。受動ミキサーは、入力されるエネルギーを必要とせず、「流体動力学」(例えば、圧力)のみを使用して、一定速度で流体フローを駆動する。受動ミキサーの1つの例は、プレートで分けられた互いの頂部に2つのフロー流を積み重ねることを含む。分離プレートが除去されると、フロー流が互いに接触される。2種の液体の積み重ねが接触面積を増大し、拡散の長さを低減し、それによって核酸プロセスを増強する。加熱管理が必要とされる場合には、混和および反応デバイスを熱伝達系に接続することができる。マクロ熱交換器と同様に、マイクロ熱交換器は、並流、対向流または直交流フロースキームのいずれかを有し得る。マイクロ流体デバイスは、約10μmから約10cmの間のチャネル幅および深度を有し得る。1つのチャネル構造は、長い主な分離チャネルおよびバッファー、サンプルまたは廃棄物リザーバーのいずれかで終わる、3つのより短い「派生物」サイドチャネルを含む。分離チャネルは、数センチメートルの長さであり得、3つのサイドチャネルは、通常、わずか2~3ミリメートルの長さである。もちろん、マイクロ流体デバイスの実際の長さ、断面積、形状および分枝設計は、スループット(フロー抵抗に応じて変わる)、速度プロフィール、滞留時間などといったその他の設計検討事項と同様、適用に応じて変わる。
本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスは、それだけには限らないが、ピコインジェクション、小滴合体、選択的小滴融合および小滴選別を含む本明細書に記載される方法の特定のステップを実施するために、1つまたは複数の電場生成機を含み得る。特定の実施形態では、電場は、金属電極を使用して生成される。特定の実施形態では、電場は、液体電極を使用して生成される。特定の実施形態では、液体電極は、伝導性液体(例えば、塩水またはバッファー)で満たされ、電場が望まれるマイクロ流体デバイス中の位置に置かれた液体電極チャネルを含む。特定の実施形態では、液体電極は、パワーサプライまたは高電圧増幅器を使用して通電される。いくつかの実施形態では、液体電極チャネルは、伝導性液体が液体電極チャネルに添加され得るように入口ポートを含む。例えば、液体で満たされたチューブを、入口ポートに接続して圧力をかけることによって、このような伝導性液体を、液体電極チャネルに添加してもよい。特定の実施形態では、液体電極チャネルはまた、チャネルから伝導性液体を放出するための出口ポートも含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されたマイクロ流体デバイスのピコインジェクション、小滴合体、選択的小滴融合および/または小滴選別態様において、液体電極が使用される。液体電極は、例えば、電場の適用によって注入される材料が帯電されない場合に用途を見出すことができる。
特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの1つまたは複数のマイクロチャネル(例えば、インプットマイクロチャネル、対合マイクロチャネル、ピコインジェクションマイクロチャネルおよび/またはこれらのチャネルのうち1つまたは複数の上流または下流のフローチャネル)の幅は、100ミクロン以下、例えば、90ミクロン以下、80ミクロン以下、70ミクロン以下、60ミクロン以下、50ミクロン以下、例えば、45ミクロン以下、40ミクロン以下、39ミクロン以下、38ミクロン以下、37ミクロン以下、36ミクロン以下、35ミクロン以下、34ミクロン以下、33ミクロン以下、32ミクロン以下、31ミクロン以下、30ミクロン以下、29ミクロン以下、28ミクロン以下、27ミクロン以下、26ミクロン以下、25ミクロン以下、20ミクロン以下、15ミクロン以下または10ミクロン以下である。いくつかの実施形態では、上記のマイクロチャネルのうち1つまたは複数の幅は、約10ミクロン~約15ミクロン、約15ミクロン~約20ミクロン、約20ミクロン~約25ミクロン、約25ミクロン~約30ミクロン、約30ミクロン~約35ミクロン、約35ミクロン~約40ミクロン、約40ミクロン~約45ミクロンまたは約45ミクロン~約50ミクロン、約50ミクロン~約60ミクロン、約60ミクロン~約70ミクロン、約70ミクロン~約80ミクロン、約80ミクロン~約90ミクロンまたは約90ミクロン~約100ミクロンである。
開示される方法およびデバイスに関連して利用され得る種々のマイクロチャネル構造および機構のさらなる説明は、参照によりその全文ですべての目的のために本明細書に組み込まれる、PCT公開番号WO2014/028378に提供されている。
コンカテマー化された併合構造:いくつかの実施形態では、分子標的、例えば、核酸のバーコード付加に関連する開示される方法において、小滴併合を利用してもよい。例えば、単細胞のトランスクリプトームにバーコード付加する場合には、細胞可溶化液を含有する小滴を、試薬およびバーコードを含有する小滴と併合してもよい。通常、小滴併合は、併合するべき小滴を、それらが対形成するようにチャネル中に流すこと、次いで、電場をかけて、対を併合して、組み合わされた小滴にすることによって成し遂げられる。しかし、対が併合する確率は、1未満であることが多く、その結果、単一併合の試みについては、いくつかの小滴が併合されない。
この課題に対応するために、小滴を、収縮および拡大を有するチャネル中に流すことによってそれらを併合するデバイスを利用してもよい。収縮は、小滴よりも小さいものであるように設計され、これが、液滴がチャネルの広い部分から収縮へ流れる時に、それらに形状を変化させ、圧縮されるようにし、これが併合の可能性を増大すると思われる。さらに、これらの拡大圧縮形状のいくつかを連続して利用して、小滴に複数の併合機会を提供することができる。金属電極、はんだ電極および/または伝導性液体で満たされたチャネルを含む液体電極などの種々の種類の電極を使用して電場をかけることができる。図9には、連続して接続された10の小滴併合構造体を含むコンカテマー化された併合アーキテクチャを含む例示的マイクロ流体デバイスが提供されている。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、複数のチャネル形状の機構を連続して含む微小滴併合セクションを含むフローチャネルを含むマイクロ流体デバイスを提供し、ここで、各チャネル形状の機構は、チャネル形状の機構に近接したチャネルにおいて電場をかけるように構成された、1つもしくは複数の電極または1つもしくは複数の電極の1つまたは複数の部分と関連している。いくつかの実施形態では、複数のチャネル形状の機構のそれぞれは、チャネルの収縮、拡大、屈曲またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、複数のチャネル形状の機構のそれぞれは、チャネルの収縮を含み、これでは、チャネルの収縮のそれぞれに、チャネル拡大が続くか、チャネル拡大が先行する。本明細書に記載されるようなチャネルの収縮は、小滴併合セクションの上流または下流のチャネル幅または高さと比較した、チャネル幅または高さの低減であり得る。チャネル拡大は、上記のような収縮と比較した、チャネル幅または高さの増大であり得る。
上記のような小滴併合セクションは、任意の適した数のチャネル形状の機構、例えば、収縮および/または拡大を連続して含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、併合セクションは、2~5、2~10、2~20、2~30、2~40、2~50、2~60、2~70、2~80または2~90など、2~100のチャネル形状の機構、例えば、収縮および/または拡大を連続して含む。いくつかの実施形態では、併合セクションは、2~5、5~10、10~20、20~30、30~40、40~50、50~60、60~70、70~80、80~90または90~100のチャネル形状の機構、例えば、収縮および/または拡大を連続して含む。
いくつかの実施形態では、各チャネル形状の機構は、第1の電極またはその一部および第2の電極またはその一部に近接して配置され、ここで、第1の電極またはその一部および第2の電極またはその一部は、フローチャネルのいずれかの側に対向関係で配置される。
ファンブレードミキサー:1つまたは複数の小滴の内容物を混和することが望ましいことが多い。例えば、小滴のグループを併合した後に、併合された小滴の内容物を混和することが望ましいことが多い。例えば、可溶化液小滴を試薬と併合する場合には、流体を混和し、その後小滴を分割することが望ましい場合があり、そうでなければ、作製される娘小滴は異なる濃度の流体を有することとなる。混和は、小滴をジグザグのチャネルに迅速に流し落とすことによって成し遂げることができる。しかし、特定の流体および粘度については、このアプローチは、小滴上の壁の摩擦が小滴における大きな流れにつながらず、その結果、流体が混和しないので非効率であり得る。
小滴における混和を増強するための別の方法は、本明細書において「ファンブレードミキサー」と呼ばれる、派生物を有するチャネルを通して小滴を流すことである。このデバイスでは、チャネルは、チャネルの高さよりも短い派生物が取り付けられている。派生物は、小滴よりも長いものであるように設計されることが多いが、小滴にとって短すぎると、中を流れることができない。小滴がブレードを通るときに、遮られていないキャリアー媒体、例えば、オイルが、ファンブレード中に流れ、小滴を含有するチャネル中のキャリアー流体中に逆流を作製する。この逆流が、小滴内に同様の流れを引き起こし、混和につながり得る。小滴がブレードの末端を通過するときに、ブレード中に流れたキャリアー媒体がチャネル中に戻って流れ、反対の方向の別の直交流を作製し、これが、やはり混和を増強する。小滴は、ブレード中に流れることを妨げられ、るが、これは、そうするためには、小滴が、変形し、エネルギー的に好都合ではない形状をとる必要があるからである。特定のフロー様式および流体特性について、例えば、1未満の(例えば、0.1未満の)キャピラリー数で、これは、小滴に、主に、主チャネル中のままであるようにさせ、その結果、主に、オイルがブレード中に流れる。混和を増強するために、さらに多数のファンブレードを、チャネルの長さの下に加え、小滴の内容物を混和する効果のための多数の機会を提供できる。いずれか特定の理論に捉われようとは思わないが、液滴がファンブレードを通過するときに、ファンブレードへのキャリアー媒体、例えば、オイルの流入によって生じたせん断力を受けると考えられる。キャピラリー数が小さい場合には、小滴の界面張力は、このせん断に抵抗することができ、液滴がファンブレード中に大きく移動するのを防ぐことができる。しかし、キャピラリー数が大きい場合には、粘性効果が界面張力を克服でき、キャリアー媒体の流入によって生じたせん断は、小滴の大きな部分をファンブレード中に引っ張るのに十分であり得る。
適した作動のために、キャピラリー数は、高すぎであっても、低すぎであってもならない。高すぎる場合には、小滴は、ファンブレード中に流れ、おそらくは、壊れて小片になり得る。低すぎる場合には、小滴の内部の内容物が適切に混和されないことがある。いくつかの実施形態では、およそ0.01のキャピラリー数が好ましい。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、マイクロ流体デバイスを提供し、ここで、マイクロ流体デバイスは、(a)フローチャネルと流体連絡した1つまたは複数の派生チャネルを含む微小滴混和セクションを含むフローチャネルを含み、1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中央線に対して10°から170°の間の角度であり、1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの高さより小さい、フローチャネルを通って流されるべき小滴の直径(例えば、本明細書に記載されるような別個の実体または微小滴の直径)未満である高さを有し、微小滴が、キャリアー流体中のフローチャネルを通って流れた場合に、キャリアー流体が1つまたは複数の派生チャネル中に流れて入るおよびそれから流れて出るときに生じる直交流に曝露されるように、1つまたは複数の派生チャネルが構成され、直交流が、微小滴の内容物を混和する微小滴中の流れを生成するのに十分である。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の派生チャネルは、フローチャネルの中心線に対して45°から135°の間、例えば、約50°から約130°の間、約55°から約125°の間、約60°から約120°の間、約65°から約115°の間、約70°から約110°の間、約75°から約100°の間、約80°から約95°の間、例えば、約90°の角度である。
いくつかの実施形態では、微小滴混和セクションは、微小滴が、キャリアー流体中のフローチャネルを通って流れた場合に、複数の直交流に曝露されるように、フローチャネルの長さに沿って配置される複数の派生チャネルを含む。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の派生チャネルの幅は、フローチャネルを通って流れるべき微小滴の直径(本明細書に記載されるような別個の実体または微小滴の直径)より大きい。ファンブレードミキサーの例示的実施形態は、図15に示されている。図15に示されるように、マイクロ流体デバイスチャネルを、主フローチャネルから広がる複数の「ファンブレード」を含むように構成してもよい。さらに、図15に示されるように、このような「ファンブレード」は、チャネルの一方の側の最初の「ファンブレード」と、チャネルの反対側の第2の「ファンブレード」を間隔のあいた関係で交代に現れ得る。このような「ファンブレード」は、フローチャネルの長さに沿って、例えば、S型の混和チャネルの長さに沿って交代に現れ得る。
製作の方法:開示された実施形態によれば、微細加工プロセスは、基板において使用される材料の種類および/または所望の生成物容量に応じて異なる。少容量製造またはプロトタイプのための製作技術として、LIGA、パウダーブラスト、レーザーアブレーション、機械加工、放電機械加工、フォトフォーミングなどが挙げられる。マイクロ流体デバイスの大量製造のための技術は、リソグラフィーまたはマスターベースの複製プロセスのいずれかを使用し得る。シリコン/ガラスから基板を製作するためのリソグラフィープロセスとして、半導体デバイスの製作においてよく使用される湿式および乾式エッチング技術の両方が挙げられる。プラスチック基板の大量製造のために、射出成形および熱エンボス加工が、通常、使用される。
ガラス、シリコンおよびその他の「硬い」材料(リソグラフィー、エッチング、蒸着):開示される対象の実施形態によれば、リソグラフィー、エッチングおよび/または蒸着技術の組合せを使用して、ガラス、シリコンおよびその他の「硬い」材料からマイクロ管およびマイクロキャビティを作製してもよい。上記の技術に基づくテクノロジーを、0.1~500マイクロメートルの規模でデバイスの製作に適用してもよい。
半導体製作プロセスに基づく微細加工技術は、一般に、クリーンルーム中で実施される。クリーンルームの質は、立方インチの大きさ中の<4μmの粒子の数によって分類される。MEMS微細加工のための通常のクリーンルームクラスは、1000~10000であり得る。
特定の実施形態では、微細加工においてフォトリソグラフィーを使用してもよい。フォトリソグラフィーでは、基板上に蒸着されているフォトレジストが、光マスクを通って光供給源に曝露される。従来のフォトレジスト法は、最大10~40μmの構造の高さを可能にする。より高い構造体が必要とされる場合には、最大1mmの高さをもたらす、SU-8またはポリイミドなどのより厚いフォトレジストを使用できる。
マスク上のパターンを、フォトレジストによって覆われた基板に移した後に、次いで、湿式または乾式プロセスのいずれかを使用して基板をエッチングする。湿式エッチングでは、マスクによって保護されない基板面積が、液相中で化学攻撃を受ける。エッチングプロセスにおいて使用される液体試薬は、エッチングが、等方性または異方性であるかに応じて変わる。等方性エッチングは、一般に、酸を使用して、ガラスまたはシリコン中に球形キャビティなどの3次元構造体を形成する。異方性エッチングは、高度に塩基性の溶媒を使用してウェルおよび管などの平坦な表面を形成する。シリコンでの湿式異方性エッチングは、斜位のチャネルプロフィールを作製する。
乾式エッチングは、ガス相またはプラズマ相のいずれかにおいてイオンによって基板を攻撃することを含む。乾式エッチング技術を使用して、矩形チャネル横断面および任意のチャネル経路を作製できる。物理的、化学的、物理化学的(例えば、RIE)および阻害剤を用いる物理化学的を含む、種々の種類の乾式エッチングが使用され得る。物理的エッチングは、基板の表面に衝撃を与え、構造体を「エッチングする」ために、電場によって加速されたイオンを使用する。化学的エッチングは、電場を使用して化学種を基板の表面に移動し得る。次いで、化学種は、基板の表面と反応して、空隙および揮発性種をもたらす。
特定の実施形態では、微細加工において蒸着が使用される。蒸着技術を使用して、金属、絶縁体、半導体、ポリマー、タンパク質およびその他の有機物質の層を作製できる。ほとんどの蒸着技術は、2つの主なカテゴリーのうちの一方に入る:物理蒸着(PVD)および化学蒸着(CVD)。PVDのための1つのアプローチでは、基板標的を、保持ガス(例えば、蒸発によって製造され得る)と接触させる。ガス中の特定の種は、標的の表面に吸着し、被膜を構成する層を形成する。マイクロエレクトロニクス製作産業においてよく使用される別のアプローチでは、蒸着されるべき材料を含有する標的を、アルゴンイオンビームまたはその他の適切なエネルギー供給源を使用してスパッタリングする。次いで、スパッタリングされた材料は、マイクロ流体デバイスの表面上に蒸着する。CVDでは、標的と接触している種が、表面と反応し、物体と化学的に結合している成分を形成する。その他の蒸着技術として、スピンコーティング、プラズマ溶射、プラズマ重合、ディップコーティング、キャスティングおよびラングミュア-ブロジェット膜析出が挙げられる。プラズマ溶射では、直径最大100μmの粒子を含有する微粉を、キャリアーガスに懸濁する。粒子を含有する混合物をプラズマジェットによって加速し、加熱する。溶融した粒子が基板上にはね散り、凍結して、高密度のコーティングを形成する。プラズマ重合が、有機蒸気を含有するプラズマからポリマー膜(例えば、PMMA)を製造する。
マイクロチャネル、マイクロキャビティおよびその他の機構が、ガラスまたはシリコン基板中にエッチングされたら、エッチングされた機構は通常、マイクロ流体デバイスが確実に「防水」になるように密閉される。密閉する場合、すべての表面に密着力をかけ、互いに接触させることができる。密閉プロセスは、ガラス-シリコン、ガラス-ガラスまたはシリコン-シリコン間を結合するために開発されたものなどの融合技術を含み得る。
ガラスをシリコンと結合するために、陽極結合を使用できる。ガラスおよびシリコンの間に電圧をかけ、系の温度を高めて、表面の密閉を誘導する。電場および高温が、ガラス中のナトリウムイオンのガラス-シリコン界面への移動を誘導する。ガラス-シリコン界面中のナトリウムイオンは、シリコン表面と高度に反応性であり、表面間に固体化学結合を形成する。使用されるガラスの種類は、シリコンのものに近い熱膨張係数を有し得る(例えば、Pyrex Corning 7740)。
ガラス-ガラスまたはシリコン-シリコン密閉に融合結合を使用できる。基板をまず、高い接触力をかけることによって、力をかけ、一緒に整列させる。ひとたび、接触すると、原子の引力(主に、ファンデルワールス力)が基板を一緒に維持し、そして、それらを炉に入れ、高温で焼きなますことができる。材料に応じて、使用される温度は、約600から1100℃の間の範囲である。
ポリマー/プラスチック:本実施形態と一致してプラスチック基板をマイクロマシニングするために種々の技術を使用してもよい。これらの中に、レーザーアブレーション、ステレオリソグラフィー、酸素プラズマエッチング、粒子ジェットアブレーションおよびマイクロエレクトロエロージョンがある。これらの技術のいくつかを使用して、その他の材料(ガラス、シリコン、セラミックスなど)を同様に形作ることができる。
複数のマイクロ流体デバイスを製造するために、複製技術を使用する。このような技術は、複製されるべきパターンを含有するマスターまたは金型インサートを製作することを含む。次いで、マスターを使用して、ポリマー複製プロセスによってポリマー基板を大量製造する。
複製プロセスでは、金型中に含有されるマスターパターンを、ポリマー構造上に複製する。特定の実施形態では、高温下でポリマーおよび硬化剤ミックスを、金型上に注ぐ。ミックスを冷却した後、ポリマーは、金型のパターンを含有し、次いで、金型から回収する。あるいは、金型インサートを含有する構造中にプラスチックを注入することもできる。マイクロインジェクションでは、液体状態に加熱したプラスチックを、金型中に注入する。分離および冷却した後、プラスチックは、金型の形状を保持する。
成形プロセスにおいて、PDMS(ポリジメチルシロキサン)、シリコンベースの有機ポリマーを使用して、マイクロ流体構造を形成してもよい。PDMSは、その弾性特性のために、約5μmから500μmの間のマイクロチャネルに適している。PDMSの特定の特性のために、マイクロ流体目的に適したものとなる。このような特性として以下が挙げられる:
1)光学的に透明であり、流れの可視化を可能にする。
2)PDMSは、適切な量の網状化剤(reticulating agent)と混合した場合に、マイクロ流体接続「防水」を維持することを容易にする弾性品質を有する。
3)その弾性のために、PDMSを用いて、膜を使用するバルブおよびポンプを製造できる。
4)未処理のPDMSは、疎水性であり、酸素プラズマによる表面の酸化後、または強塩基に浸漬した後に一時的に親水性になり、酸化されたPDMSは、それらの表面がそれ自体が酸素プラズマに曝露される限り、ガラス、シリコンまたはポリエチレンと自然に接着する。
5)PDMSは、ガス透過性である。気泡が材料から押し出されるので、管中に気泡がある場合でさえ、チャネルの液体での充填が促進される。さらに、PDMSは、非極性有機溶媒に対して透過性である。
1)光学的に透明であり、流れの可視化を可能にする。
2)PDMSは、適切な量の網状化剤(reticulating agent)と混合した場合に、マイクロ流体接続「防水」を維持することを容易にする弾性品質を有する。
3)その弾性のために、PDMSを用いて、膜を使用するバルブおよびポンプを製造できる。
4)未処理のPDMSは、疎水性であり、酸素プラズマによる表面の酸化後、または強塩基に浸漬した後に一時的に親水性になり、酸化されたPDMSは、それらの表面がそれ自体が酸素プラズマに曝露される限り、ガラス、シリコンまたはポリエチレンと自然に接着する。
5)PDMSは、ガス透過性である。気泡が材料から押し出されるので、管中に気泡がある場合でさえ、チャネルの液体での充填が促進される。さらに、PDMSは、非極性有機溶媒に対して透過性である。
マイクロインジェクションを使用して、幅広いマイクロ流体設計に使用されるプラスチック基板を形成できる。このプロセスでは、液体プラスチック物質をまず、真空および圧力下、プラスチックのガラス転移温度よりも高い温度で金型中に注入する。次いで、プラスチックをガラス転移温度未満に冷却する。金型を除去した後、得られるプラスチック構造は、金型のパターンのネガティブである。
さらに別の複製技術として、熱エンボス加工があり、これでは、ポリマー基板およびマスターを、ポリマーのガラス転移温度、Tg(PMMAまたはPCのものは、およそ100~180℃である)よりも高く加熱する。次いで、エンボス加工マスターを予めセットされた圧縮力で基板に対して押しつける。次いで、系をTg未満に冷却し、次いで、金型および基板を分離する。
通常、ポリマーは、金型ツールからの分離の際に、特に、微細構造が高いアスペクト比および垂直壁を含有する場合に、最高の物理的力を受ける。ポリマー微細構造への損傷を避けるために、基板および金型ツールの材料特性が考慮され得る。これらの特性として、側壁粗さ、側壁角、エンボス加工マスターと基板の間の化学界面および温度係数が挙げられる。エンボス加工ツールの高い側壁粗さは、分離プロセスの際に、粗さがツールと構造の間の摩擦力に寄与するので、ポリマー微細構造に損傷を与え得る。摩擦力が、ポリマーの局所引張強度より大きい場合には、微細構造は破壊され得る。ツールおよび基板の間の摩擦は、垂直壁を有する微細構造において重要であり得る。マスターと基板の間の化学界面もまた、関心事であり得る。エンボス加工プロセスは、系を高温にさらすので、化学結合は、マスター-基板界面を形成し得る。これらの界面結合は、分離プロセスに干渉し得る。ツールと基板の熱膨張係数の相違が、さらなる摩擦力をもたらし得る。
種々の技術を使用して、金型、エンボス加工マスターおよび上記の複製プロセスによってプラスチック構造体を複製するために使用されるパターンを含有するその他のマスターを形成できる。このような技術の例として、LIGA(下記)、アブレーション技術および種々のその他の機械加工技術が挙げられる。マスク、プロトタイプおよびマイクロ流体構造を小容量で作製するためにも、同様の技術を使用できる。金型ツールのために使用される材料として、金属、金属合金、シリコンおよびその他の硬い材料が挙げられる。
レーザーアブレーションを使用して、基板上に直接、またはマスクの使用によって微細構造を形成してもよい。この技術は、通常、赤外および紫外の間の波長を有する、正確にガイドされるレーザーを使用する。ガラスおよび金属基板上ならびにポリマー基板上で、レーザーアブレーションを実施してもよい。レーザーアブレーションは、固定されたレーザービームに対して基板表面を移動することによって、または固定された基板に対してビームを移動することによって実施できる。レーザーアブレーションを用いて種々のマイクロウェル、管および高アスペクト構造体を製造できる。
ステンレス鋼などの特定の材料は、耐久性のある金型インサートを製造し、マイクロマシニングして、10μmの範囲まで構造体を形成できる。μ-Electro Discharge Machining(μ-EDM)、μ-ミリング、集束イオンビームミリングを含む、微細加工のための種々のその他のマイクロマシニング技術が存在する。μ-EDMは、導電性材料での3次元構造体の製作を可能にする。μ-EDMでは、材料を電極(陰極ツール)およびワークピース(陽極)の間で生じた高周波放電によって回収する。ワークピースおよびツールの両方とも、誘電性流体中に浸す。この技術によって、比較的粗い表面が生じるが、材料および形状の点で柔軟性を提供する。
例えば、ニッケル合金から複製金型ツール/マスターを製造するために、電気メッキを使用してもよい。プロセスは、電気メッキのために既定の構造体にフォトレジストが使用されるフォトリソグラフィーステップで始まる。電気メッキされるべき面積は、レジストを含まない。高アスペクト比を有し、粗さの必要が低い構造体には、電気メッキ型を製造するためにLIGAを使用できる。LIGAは、Lithographic(リソグラフィー)、Galvanoformung(電気メッキ)、Abformung(成形)のドイツ語の頭字語である。LIGAへの1つのアプローチでは、厚いPMMA層を、シンクロトロン供給源からのX線に曝露する。LIGAによって作製された表面は、低い粗さ(およそ10nm RMS)を有し、得られるニッケルツールは、ほとんどのポリマーにとって良好な表面化学を有する。
ガラスおよびシリコンデバイスと同様に、ポリマーマイクロ流体デバイスを閉じなければならず、その後、それらが機能的になることができる。マイクロ流体デバイスのための結合プロセスにおける一般的な問題として、チャネルの遮断およびチャネルの物理的パラメータの変化が挙げられる。積層は、プラスチックマイクロ流体デバイスを密閉するために使用される1つの方法である。ある積層プロセスでは、融解接着層(通常、5μm~10μm)でコーティングされたPETホイル(約30μm)が、微細構造上に加熱ローラーを用いて巻かれる。このプロセスによって、蓋のホイルがチャネルプレート上に密閉される。いくつかの研究グループが、界面での重合による結合を報告しており、それによって、構造体が加熱され、チャネルを閉鎖するために反対側に力がかけられる。過度の力がかけられると、微細構造に損傷を与え得る。プラスチック-プラスチックおよびプラスチック-ガラス界面のための、可逆的および不可逆的結合技術の両方が存在する。可逆的密閉の1つの方法は、まず、メタノールを用いてPDMS基板およびガラスプレート(またはPDMSの第2の小片)を完全にすすぐことおよび表面を互いに接触させることその後乾燥させることを含む。次いで、微細構造を、65℃のオーブン中で10分間乾燥する。このプロセスにはクリーンルームは必要ではない。不可逆的密閉は、まず、メタノールを用いて小片を完全にすすぐこと、次いで、それらを窒素流を用いて別個に乾燥することによって達成する。次いで、2つの小片をエアプラズマクリーナー中に入れ、ハイパワーで約45秒間酸化する。次いで、基板を互いに接触させ、不可逆的密閉が自発的に形成される。
その他の利用可能な技術として、レーザーおよび超音波溶接が挙げられる。レーザー溶接では、レーザーによって生じた熱によって、ポリマーを一緒に接合する。この方法は、マイクロポンプの製作において使用されてきた。超音波溶接は、いくつかの適用において使用してもよい別の結合技術である。
本明細書に記載される1つの核酸増幅技術として、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)がある。しかし、特定の実施形態では、種々の等温核酸増幅技術、例えば、リアルタイム鎖置換増幅(SDA)、ローリングサークル増幅(RCA)および多重置換増幅(MDA)などの非PCR増幅技術を使用してもよい。
PCR増幅モジュールに関して、このようなモジュールに、少なくとも核酸を増幅するためのビルディングブロック(例えば、4種のヌクレオチドのアンプル濃縮物)、プライマー、ポリメラーゼ(例えば、Taq)および適当な温度制御プログラムを提供することが必要であろう。ポリメラーゼおよびヌクレオチドビルディングブロックは、外部ポートによって提供されるバッファー溶液中で増幅モジュールへ提供してもよく、または上流供給源から提供してもよい。特定の実施形態では、選別モジュールに提供されるバッファー流は、核酸増幅のためのすべての原材料のうち一部を含有する。PCRのためには、特に、反応混合物の正確な温度制御が、高い反応効率を成し遂げるために極めて重要である。オンチップ熱制御の1つの方法として、電極を使用して、規定の位置のモジュールの内側の流体を加熱するジュール加熱がある。流体伝導度を電力制御のための温度フィードバックとして使用してもよい。
特定の態様では、PCRミックスを含有する別個の実体、例えば、微小滴を、別個の実体をPCRに有効な条件下でインキュベートするチャネルを通して流してもよい。別個の実体をチャネルを通して流すことは、PCRに有効な温度で維持される種々の温度帯にわたってくねるように進むチャネルを含み得る。このようなチャネルは、例えば、2以上の温度帯にわたって循環し得、ここで、少なくとも1つの帯域は約65℃で維持され、少なくとも1つの帯域は、約95℃で維持される。別個の実体がこのような帯域を移動するときに、その温度はPCRに必要とされるように循環する。帯域の正確な数および各帯域のそれぞれの温度は、所望のPCR増幅を成し遂げるように当業者が容易に決定してよい。
本開示の例示的な非限定的態様
上記の本主題の実施形態を含む態様は、有益な単独である場合も、その他の態様または実施形態と組み合わさる場合もある。前記の説明を制限することなく、1~443の番号が付けられた本開示の特定の非限定的態様を以下に提供する。当業者には明らかであろうが、この開示を読む際に、個々に番号づけられた態様のそれぞれを使用してもよく、または前記のもしくは以下の個々に番号づけられた態様のいずれかと組み合わせてもよい。これは、態様のすべてのこのような組合せの支援を提供するものであって、以下に明確に提供される態様の組合せに制限されない。
上記の本主題の実施形態を含む態様は、有益な単独である場合も、その他の態様または実施形態と組み合わさる場合もある。前記の説明を制限することなく、1~443の番号が付けられた本開示の特定の非限定的態様を以下に提供する。当業者には明らかであろうが、この開示を読む際に、個々に番号づけられた態様のそれぞれを使用してもよく、または前記のもしくは以下の個々に番号づけられた態様のいずれかと組み合わせてもよい。これは、態様のすべてのこのような組合せの支援を提供するものであって、以下に明確に提供される態様の組合せに制限されない。
1.核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
別個の実体中に複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む細胞を導入するステップと、
細胞を溶解して、別個の実体中に核酸バーコード配列の複数のコピーを放出するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
別個の実体中に複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む細胞を導入するステップと、
細胞を溶解して、別個の実体中に核酸バーコード配列の複数のコピーを放出するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
2.細胞が細菌細胞である、1の方法。
3.細胞が真菌細胞である、1の方法。
4.細胞が、複数のプラスミドを含み、各プラスミドが、核酸バーコード配列を含む、1~3のいずれか1つの方法。
5.供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、1~4のいずれか1つの方法。
6.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、1~5のいずれか1つの方法。
7.核酸バーコード配列の複数のコピーを含む細胞が、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーから選択される、1~6のいずれか1つの方法。
8.ライブラリー中の各細胞が、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、7の方法。
9.核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
核酸バーコード配列のライブラリーから得た個々の核酸バーコード配列を、個々の細胞中に組み込むステップと、
個々の細胞を、個々の細胞における個々の核酸バーコード配列の複数のコピーの生成に十分な条件に供するステップと
によって、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーを調製することを含む、1~8のいずれか1つの方法。
核酸バーコード配列のライブラリーから得た個々の核酸バーコード配列を、個々の細胞中に組み込むステップと、
個々の細胞を、個々の細胞における個々の核酸バーコード配列の複数のコピーの生成に十分な条件に供するステップと
によって、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーを調製することを含む、1~8のいずれか1つの方法。
10.別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸標的分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、1~9のいずれか1つの方法。
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、1~9のいずれか1つの方法。
11.別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、1~10のいずれか1つの方法。
12.別個の実体が、微小滴である、1~11のいずれか1つの方法。
13.核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
細胞を第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、細胞が、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
細胞を第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、細胞が、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
14.細胞が細菌細胞である、13の方法。
15.細胞が真菌細胞である、13の方法。
16.細胞が、複数のプラスミドを含み、各プラスミドが、核酸バーコード配列を含む、13~15のいずれか1つの方法。
17.供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、第1の別個の実体中に導入するステップを含む、13~16のいずれか1つの方法。
18.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、13~17のいずれか1つの方法。
19.第2の別個の実体が、微小滴であり、細胞を第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数の細胞をマイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネル中で細胞の慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機への細胞の周期的注入を提供する、ステップと、
注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性とマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々の細胞を、個々の微小滴中にカプセル封入するステップと
を含む、13~18のいずれか1つの方法。
複数の細胞をマイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネル中で細胞の慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機への細胞の周期的注入を提供する、ステップと、
注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性とマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々の細胞を、個々の微小滴中にカプセル封入するステップと
を含む、13~18のいずれか1つの方法。
20.核酸バーコード配列の複数のコピーを含む細胞が、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーから選択される、13~19のいずれか1つの方法。
21.ライブラリー中の各細胞が、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、20の方法。
22.核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
核酸バーコード配列のライブラリーから得た個々の核酸バーコード配列を、個々の細胞中に組み込むステップと、
個々の細胞を、個々の細胞における個々の核酸バーコード配列の複数のコピーの生成に十分な条件に供するステップと
によって、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーを調製することを含む、20~21のいずれか1つの方法。
核酸バーコード配列のライブラリーから得た個々の核酸バーコード配列を、個々の細胞中に組み込むステップと、
個々の細胞を、個々の細胞における個々の核酸バーコード配列の複数のコピーの生成に十分な条件に供するステップと
によって、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーを調製することを含む、20~21のいずれか1つの方法。
23.第1の別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子のうち複数またはその増幅産物を放出するステップと、
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、13~22のいずれか1つの方法。
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、13~22のいずれか1つの方法。
24.第1の別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、13~23のいずれか1つの方法。
25.第1および第2の別個の実体が、微小滴である、13~24のいずれか1つの方法。
26.核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む多孔性ビーズを導入するステップであって、核酸バーコード配列の複数のコピーが、多孔性ビーズの1個または複数の孔によって規定される表面上に少なくとも部分的に分配される、ステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む多孔性ビーズを導入するステップであって、核酸バーコード配列の複数のコピーが、多孔性ビーズの1個または複数の孔によって規定される表面上に少なくとも部分的に分配される、ステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
27.供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、26の方法。
28.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、26または27の方法。
29.核酸バーコード配列の複数のコピーを含む多孔性ビーズが、核酸バーコードを含有する多孔性ビーズのライブラリーから選択される、26~28のいずれか1つの方法。
30.ライブラリー中の各多孔性ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、29の方法。
31.別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、26~30のいずれか1つの方法。
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、26~30のいずれか1つの方法。
32.別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、26~31のいずれか1つの方法。
33.多孔性ビーズを、ビーズの融点を上回る温度に、多孔性ビーズの融解および核酸バーコード配列の複数のコピーの放出をもたらすのに十分な時間、曝露することを含む、26~32のいずれか1つの方法。
34.別個の実体が、微小滴である、26~33のいずれか1つの方法。
35.核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、第2の別個の実体が微小滴であり、ビーズが、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数のビーズを、マイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネル中のビーズの慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機へのビーズの周期的注入を概ね提供する、ステップと、
注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性と概ねマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々のビーズを、個々の微小滴中にカプセル封入するステップと
を含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、第2の別個の実体が微小滴であり、ビーズが、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数のビーズを、マイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネル中のビーズの慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機へのビーズの周期的注入を概ね提供する、ステップと、
注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性と概ねマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々のビーズを、個々の微小滴中にカプセル封入するステップと
を含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
36.供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、第1の別個の実体中に導入するステップを含む、35の方法。
37.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、35または36の方法。
38.その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズが、核酸バーコードを含有するビーズのライブラリーから選択される、35~37のいずれか1つの方法。
39.ライブラリー中の各ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、38の方法。
40.第1の別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、35~39のいずれか1つの方法。
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、35~39のいずれか1つの方法。
41.第1の別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、35~40のいずれか1つの方法。
42.第1および第2の別個の実体が、微小滴である、35~41のいずれか1つの方法。
43.核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
カプセル封入に先立って、またはその後に、固有分子識別子(UMI)を、複数の核酸標的分子のそれぞれ中に組み込むステップと、
別個の実体中に、その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズを導入するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
カプセル封入に先立って、またはその後に、固有分子識別子(UMI)を、複数の核酸標的分子のそれぞれ中に組み込むステップと、
別個の実体中に、その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズを導入するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
44.供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、43の方法。
45.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、43または44の方法。
46.核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズが、核酸バーコードを含有するビーズのライブラリーから選択される、43~45のいずれか1つの方法。
47.ライブラリー中の各ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、46の方法。
48.核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子を増幅するステップと、
別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
重複UMIについてシーケンシングリードを集約させることによって増幅バイアスについて補正するステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、43~47のいずれか1つの方法。
別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
重複UMIについてシーケンシングリードを集約させることによって増幅バイアスについて補正するステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、43~47のいずれか1つの方法。
49.別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、43~48のいずれか1つの方法。
50.ビーズが、多孔性ビーズであり、核酸バーコード配列の複数のコピーが、多孔性ビーズの1個または複数の孔によって規定される表面上に少なくとも部分的に分配される、43~49のいずれか1つの方法。
51.別個の実体が、微小滴である、43~50のいずれか1つの方法。
52.核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、第2の別個の実体が微小滴であり、ビーズが、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数のビーズを、マイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含む、ステップと、
1つまたは複数のビーズを、小滴生成機によって製造された1つまたは複数の別個の実体中に、カプセル封入するステップと、
小滴生成機によって製造された1つまたは複数の別個の実体を選別して、1つまたは複数のビーズを含まない別個の実体を除去するステップと
を含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、第2の別個の実体が微小滴であり、ビーズが、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数のビーズを、マイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含む、ステップと、
1つまたは複数のビーズを、小滴生成機によって製造された1つまたは複数の別個の実体中に、カプセル封入するステップと、
小滴生成機によって製造された1つまたは複数の別個の実体を選別して、1つまたは複数のビーズを含まない別個の実体を除去するステップと
を含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
53.供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、第1の別個の実体中に導入するステップを含む、52の方法。
54.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、52または53の方法。
55.その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズが、核酸バーコードを含有するビーズのライブラリーから選択される、52~54のいずれか1つの方法。
56.ライブラリー中の各ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、55の方法。
57.第1の別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、52~56のいずれか1つの方法。
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、52~56のいずれか1つの方法。
58.第1の別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、52~57のいずれか1つの方法。
59.第1および第2の別個の実体が、微小滴である、52~58のいずれか1つの方法。
60.一本鎖バーコードを調製するための方法であって、
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含む環状核酸分子を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、核酸バーコード配列のコンカテマーが製造されるように、核酸バーコード配列のローリングサークル増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
60.一本鎖バーコードを調製するための方法であって、
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含む環状核酸分子を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、核酸バーコード配列のコンカテマーが製造されるように、核酸バーコード配列のローリングサークル増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
61.別個の実体を、多数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、60の方法。
62.標的細胞を溶解して、多数の核酸標的分子を提供するステップを含む、60または61の方法。
63.核酸バーコード配列を含む環状核酸分子が、核酸バーコード配列を含む環状核酸分子のライブラリーから選択される、60~62のいずれか1つの方法。
64.別個の実体が、微小滴である、60~63のいずれか1つの方法。
65.一本鎖バーコードを調製するための方法であって、
多数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含むDNA分子を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、核酸バーコード配列の多数の一本鎖コピーが製造されるように、核酸バーコード配列の転写連鎖反応(TCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、多数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
多数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含むDNA分子を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、核酸バーコード配列の多数の一本鎖コピーが製造されるように、核酸バーコード配列の転写連鎖反応(TCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、多数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
66.別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、65の方法。
67.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、65または66の方法。
68.別個の実体が、微小滴である、65~67のいずれか1つの方法。
69.一本鎖バーコードを調製するための方法であって、
複数の核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含むDNA分子を、別個の実体中に導入するステップと、
核酸バーコード配列の複数の一本鎖コピーが製造されるように、別個の実体を、核酸バーコード配列のローリングサークル転写連鎖反応(rcTCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含むDNA分子を、別個の実体中に導入するステップと、
核酸バーコード配列の複数の一本鎖コピーが製造されるように、別個の実体を、核酸バーコード配列のローリングサークル転写連鎖反応(rcTCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
70.別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、69の方法。
71.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、69または70の方法。
72.別個の実体が、微小滴である、69~71のいずれか1つの方法。
73.核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの核酸バーコード配列のいずれかを統計的に含有するように、個々の核酸バーコード配列を、制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
別個の実体の集団中の核酸バーコード配列を酵素的に増幅して、複数の別個の実体のうちの別個の実体がそれぞれ、その別個の実体の個々の核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、複数の別個の実体を提供するステップと、
1種または複数の、複数の別個の実体中に、複数の核酸標的分子を導入するステップと、
1種または複数の、複数の別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの核酸バーコード配列のいずれかを統計的に含有するように、個々の核酸バーコード配列を、制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
別個の実体の集団中の核酸バーコード配列を酵素的に増幅して、複数の別個の実体のうちの別個の実体がそれぞれ、その別個の実体の個々の核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、複数の別個の実体を提供するステップと、
1種または複数の、複数の別個の実体中に、複数の核酸標的分子を導入するステップと、
1種または複数の、複数の別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
74.核酸バーコード配列を含まない別個の実体を除去するために、導入に先立って別個の実体の集団を選別することを含む、73の方法。
75.供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、73または74の方法。
76.標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、73~75のいずれか1つの方法。
77.別個の実体が、微小滴である、73~76のいずれか1つの方法。
78.核酸バーコードライブラリーを調製する方法であって、
別個の実体の集団中に、
それぞれ、第1の核酸バーコード部分配列および第1の連結配列を含む、複数の第1の核酸分子と、
それぞれ、第2の核酸バーコード部分配列および第2の連結配列を含む、複数の第2の核酸分子をカプセル封入するステップであって、カプセル封入が、別個の実体の集団の少なくとも約50%の別個の実体が、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含むように実施される、ステップと、
別個の実体を、酵素的連結および/または増幅に十分な条件に供し、その結果、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含む別個の実体について、第1および第2の核酸分子の両方の配列を含む連結および/または増幅産物が製造され、複合核酸バーコード分子を提供するステップと
を含む、方法。
別個の実体の集団中に、
それぞれ、第1の核酸バーコード部分配列および第1の連結配列を含む、複数の第1の核酸分子と、
それぞれ、第2の核酸バーコード部分配列および第2の連結配列を含む、複数の第2の核酸分子をカプセル封入するステップであって、カプセル封入が、別個の実体の集団の少なくとも約50%の別個の実体が、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含むように実施される、ステップと、
別個の実体を、酵素的連結および/または増幅に十分な条件に供し、その結果、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含む別個の実体について、第1および第2の核酸分子の両方の配列を含む連結および/または増幅産物が製造され、複合核酸バーコード分子を提供するステップと
を含む、方法。
79.供するステップが、別個の実体を、第1および第2の連結配列の酵素的連結に十分な条件に供するステップを含む、78の方法。
80.第1および第2の連結配列が、少なくとも部分的に相補的である、78の方法。
81.少なくとも1種の複合核酸バーコード分子を含む別個の実体中に、複数の核酸標的分子を導入するステップと、
複数の核酸標的分子および少なくとも1種の複合核酸バーコード分子を含む別個の実体を、複合核酸バーコード分子の配列の、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、78の方法。
82.別個の実体から、複合核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
シーケンシングされた核酸分子を、複合核酸バーコード配列の配列に基づいて、特定の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、81の方法。
複数の核酸標的分子および少なくとも1種の複合核酸バーコード分子を含む別個の実体を、複合核酸バーコード分子の配列の、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、78の方法。
82.別個の実体から、複合核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
シーケンシングされた核酸分子を、複合核酸バーコード配列の配列に基づいて、特定の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、81の方法。
83.酵素的連結および/または増幅に十分な条件が、連結PCRに十分な条件である、78~82のいずれか1つの方法。
84.別個の実体が、微小滴である、78~83のいずれか1つの方法。
85.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
複数の核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の固有分子識別子(UMI)分子を別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、固有のUMI分子配列の、複数の核酸標的分子のうち複数またはその増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと、
複数の異なる核酸バーコード配列を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、複数のバーコード配列のうち1種の、複数の核酸標的分子またはその増幅産物またはその増幅産物の増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の固有分子識別子(UMI)分子を別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、固有のUMI分子配列の、複数の核酸標的分子のうち複数またはその増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと、
複数の異なる核酸バーコード配列を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、複数のバーコード配列のうち1種の、複数の核酸標的分子またはその増幅産物またはその増幅産物の増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
86.別個の実体から、UMIの1種およびバーコードの1種の配列を含む、複数の核酸分子またはその増幅産物またはその増幅産物の増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
シーケンシングされた核酸分子を、UMIおよびバーコードの配列の組合せに基づいて、特定の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、85の方法。
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
シーケンシングされた核酸分子を、UMIおよびバーコードの配列の組合せに基づいて、特定の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、85の方法。
87.別個の実体が、微小滴である、85または86の方法。
88.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
複数の核酸標的分子のそれぞれに固有分子識別子(UMI)分子を結合して、UMI標識された核酸標的分子を提供するステップと、
UMI標識された核酸標的分子を酵素的に増幅して、UMI標識された核酸標的分子の配列を含む増幅産物を提供するステップと、
増幅産物を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の別個の実体中で増幅産物を断片化するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された増幅産物に結合するステップであって、各別個の実体中の核酸バーコード配列が、断片化された増幅産物を、断片化された増幅産物がカプセル封入されている別個の実体と関連付ける、ステップと、
別個の実体から、結合している核酸バーコード配列を含む断片化された増幅産物を放出するステップと、
断片化された増幅産物をシーケンシングするステップと、
UMIの配列および核酸バーコード配列を使用して断片化された増幅産物をバイオインフォマティクス的に再構成して、増幅産物が起源とする核酸標的分子の配列を提供するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子のそれぞれに固有分子識別子(UMI)分子を結合して、UMI標識された核酸標的分子を提供するステップと、
UMI標識された核酸標的分子を酵素的に増幅して、UMI標識された核酸標的分子の配列を含む増幅産物を提供するステップと、
増幅産物を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の別個の実体中で増幅産物を断片化するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された増幅産物に結合するステップであって、各別個の実体中の核酸バーコード配列が、断片化された増幅産物を、断片化された増幅産物がカプセル封入されている別個の実体と関連付ける、ステップと、
別個の実体から、結合している核酸バーコード配列を含む断片化された増幅産物を放出するステップと、
断片化された増幅産物をシーケンシングするステップと、
UMIの配列および核酸バーコード配列を使用して断片化された増幅産物をバイオインフォマティクス的に再構成して、増幅産物が起源とする核酸標的分子の配列を提供するステップと
を含む、方法。
89.増幅産物を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップが、別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの増幅産物のいずれかを含有するように、増幅産物を、制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップを含む、88の方法。
90.2種以上の核酸標的分子を起源とする増幅産物が、複数の別個の実体中にカプセル封入される、88の方法。
91.核酸バーコード配列が、78~80のうち1つに記載されるような方法に従って作製される、88~90のいずれか1つの方法。
92.酵素的に増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、多重置換増幅(MDA)または多重アニーリングおよびルーピングベースの増幅サイクル(MALBEC)によって酵素的に増幅するステップを含む、88~91のいずれか1つの方法。
93.バイオインフォマティクス的に再構成するステップが、UMI、シーケンシングから得られた配列リードによってコンピュータによってグループ化して、異なる別個の実体中で同様の配列を有して生じる分子のサブセットを同定し、それによって、標的分子の1Xより大きいカバー率を作り出すために使用され得る配列の拡大されたセットを作製するステップを含む、88~92のいずれか1つの方法。
94.UMI分子の、複数の核酸標的分子のそれぞれとの結合および酵素的増幅が反応器中で起こり、増幅産物の、複数の別個の実体中へのカプセル封入が、第1のマイクロ流体デバイス中で起こり、核酸バーコード配列の、断片化された増幅産物との結合が、第2のマイクロ流体デバイス中で起こる、88~93のいずれか1つの方法。
95.別個の実体が、微小滴である、88~90のいずれか1つの方法。
96.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
別個の実体中に、
核酸標的分子と、
核酸バーコード配列と、
核酸標的分子の配列を増幅するように構成されたプライマーの第1のセットと、
核酸バーコード配列の配列を増幅するように構成されたプライマーの第2のセットであって、プライマーの第1のセットのうち1種が、プライマーの第2のセットのうち1種の配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含むセットと、
酵素的増幅試薬と、
を導入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子および核酸バーコード配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、
別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、核酸標的分子の増幅された配列および核酸バーコード配列の増幅された配列を含む生成物を提供するステップと
を含む、方法。
96.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
別個の実体中に、
核酸標的分子と、
核酸バーコード配列と、
核酸標的分子の配列を増幅するように構成されたプライマーの第1のセットと、
核酸バーコード配列の配列を増幅するように構成されたプライマーの第2のセットであって、プライマーの第1のセットのうち1種が、プライマーの第2のセットのうち1種の配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含むセットと、
酵素的増幅試薬と、
を導入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子および核酸バーコード配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、
別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、核酸標的分子の増幅された配列および核酸バーコード配列の増幅された配列を含む生成物を提供するステップと
を含む、方法。
97.導入することが、複数の核酸標的分子を、別個の実体中に導入するステップを含む、96の方法。
98.複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む核酸標的分子を含む、97の方法。
99.導入することが、複数の核酸バーコード配列を、別個の実体中に導入するステップを含む、96の方法。
100.複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、99の方法。
101.別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を熱サイクルに供するステップを含む、96~100のいずれか1つの方法。
102.別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を等温増幅条件に供するステップを含む、96~100のいずれか1つの方法。
103.アダプター配列を、核酸標的分子中に組み込むステップを含み、プライマーの第1のセットが、アダプター配列と少なくとも部分的に相補的である、96~102のいずれか1つの方法。
104.別個の実体が、微小滴である、96~103のいずれか1つの方法。
105.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
別個の実体中に、
複数の核酸標的分子と、
複数の核酸バーコード配列と、
複数の核酸標的分子の配列を増幅するように構成された第1のプライマーセットと、
複数の核酸バーコード分子の配列を増幅するように構成された第2のプライマーセットであって、第1のプライマーセットおよび第2のプライマーセットが、少なくとも部分的に相補的である配列を含むセットと、
酵素的増幅試薬と、
を導入するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子の配列および複数の核酸バーコード配列の配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、
別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、複数の核酸標的分子の1種の増幅された配列および複数の核酸バーコード配列の1種の増幅された配列をそれぞれ含む複数の生成物を提供するステップと
を含む、方法。
別個の実体中に、
複数の核酸標的分子と、
複数の核酸バーコード配列と、
複数の核酸標的分子の配列を増幅するように構成された第1のプライマーセットと、
複数の核酸バーコード分子の配列を増幅するように構成された第2のプライマーセットであって、第1のプライマーセットおよび第2のプライマーセットが、少なくとも部分的に相補的である配列を含むセットと、
酵素的増幅試薬と、
を導入するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子の配列および複数の核酸バーコード配列の配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、
別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、複数の核酸標的分子の1種の増幅された配列および複数の核酸バーコード配列の1種の増幅された配列をそれぞれ含む複数の生成物を提供するステップと
を含む、方法。
106.複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む核酸標的分子を含む、105の方法。
107.複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、105または106の方法。
108.別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を熱サイクルに供するステップを含む、105~107のいずれか1つの方法。
109.別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を等温増幅条件に供するステップを含む、105~107のいずれか1つの方法。
110.アダプター配列を、核酸標的分子中のそれぞれに組み込むステップを含み、第1のプライマーセットのプライマーのそれぞれが、アダプター配列の1種と少なくとも部分的に相補的である、105~109のいずれか1つの方法。
111.別個の実体が、微小滴である、105~110のいずれか1つの方法。
112.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
核酸バーコードプライマーのライブラリーを作製するステップであって、ライブラリー中の各核酸バーコードプライマーが、核酸標的分子とアニールするのに十分な第1の配列および核酸バーコード配列を含む第2の配列とを含む、ステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、1種または複数の核酸バーコード、ライブラリーから選択されるプライマーおよび1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップであって、各別個の実体中に含めるためのライブラリーから選択される1種または複数のプライマーが、その別個の実体中の核酸標的分子のうち1種または複数とアニールするのに十分な第1の配列を有する1種または複数のプライマーを含む、ステップと、
1種または複数の核酸標的分子および核酸バーコード配列のうち一方の配列を含む増幅産物が製造されるように、その別個の実体中の核酸バーコードプライマーのうち1種または複数を使用して、各別個の実体中で核酸標的分子のうち1種または複数を酵素的に増幅するステップと
を含む、方法。
核酸バーコードプライマーのライブラリーを作製するステップであって、ライブラリー中の各核酸バーコードプライマーが、核酸標的分子とアニールするのに十分な第1の配列および核酸バーコード配列を含む第2の配列とを含む、ステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、1種または複数の核酸バーコード、ライブラリーから選択されるプライマーおよび1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップであって、各別個の実体中に含めるためのライブラリーから選択される1種または複数のプライマーが、その別個の実体中の核酸標的分子のうち1種または複数とアニールするのに十分な第1の配列を有する1種または複数のプライマーを含む、ステップと、
1種または複数の核酸標的分子および核酸バーコード配列のうち一方の配列を含む増幅産物が製造されるように、その別個の実体中の核酸バーコードプライマーのうち1種または複数を使用して、各別個の実体中で核酸標的分子のうち1種または複数を酵素的に増幅するステップと
を含む、方法。
113.アダプター配列を1種または複数の核酸標的分子中に組み込むステップを含み、各別個の実体中に含むためのライブラリーから選択される1種または複数のプライマーが、アダプター配列のうち1種または複数とアニールするのに十分な第1の配列を有する1種または複数のプライマーを含む、112の方法。
114.1種または複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む複数の核酸標的分子である、112または113の方法。
115.複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して異なる配列を含む核酸標的分子を含む、112~114のいずれか1つの方法。
116.ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコードプライマーが、異なる配列を含む複数の核酸バーコードプライマーである、112~115のいずれか1つの方法。
117.複数の別個の実体のそれぞれが、複数のもののうちその他の別個の実体に対して異なる配列を含む核酸バーコードプライマーを含む、112~116のいずれか1つの方法。
118.酵素的に増幅するステップが、複数の別個の実体を熱サイクルに供するステップを含む、112~117のいずれか1つの方法。
119.酵素的に増幅するステップが、複数の別個の実体を等温増幅条件に供するステップを含む、112~117のいずれか1つの方法。
120.別個の実体が、微小滴である、112~119のいずれか1つの方法。
121.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、
各別個の実体中で1種または複数の核酸標的分子を酵素的に断片化し、各別個の実体中の1種または複数の核酸バーコード配列のうち1種または複数を、その別個の実体中の1種または複数の標的核酸分子の断片またはその増幅産物中に酵素的に組み込むステップと
を含む、方法。
核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、
各別個の実体中で1種または複数の核酸標的分子を酵素的に断片化し、各別個の実体中の1種または複数の核酸バーコード配列のうち1種または複数を、その別個の実体中の1種または複数の標的核酸分子の断片またはその増幅産物中に酵素的に組み込むステップと
を含む、方法。
122.アダプター配列を、1種または複数の核酸標的分子中に組み込むステップを含む、121の方法。
123.1種または複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む複数の核酸標的分子である、121または122の方法。
124.複数の別個の実体のそれぞれが、複数のその他の別個の実体に対して異なる配列を含む核酸標的分子を含む、121~123のいずれか1つの方法。
125.ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む複数の核酸バーコード配列である、121~124のいずれか1つの方法。
126.複数の別個の実体のそれぞれが、複数のその他の別個の実体に対して異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、121~125のいずれか1つの方法。
127.酵素的断片化および/または組込みステップが、以下の酵素:トランスポサーゼ、フラグメンターゼ(登録商標)、リガーゼ、ポリメラーゼおよび逆転写酵素のうち1種または複数を利用する、121~125のいずれか1つの方法。
128.酵素的断片化および/または組込みステップが、インテグラーゼまたはリコンビナーゼを利用する、121~125のいずれか1つの方法。
129.別個の実体が、微小滴である、121~128のいずれか1つの方法。
130.核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、ライブラリーから選択された1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、
別個の実体のそれぞれ中の1種または複数の核酸標的分子を、その別個の実体中の1種または複数の核酸バーコード配列と酵素的に連結するステップと
を含む、方法。
核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、ライブラリーから選択された1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、
別個の実体のそれぞれ中の1種または複数の核酸標的分子を、その別個の実体中の1種または複数の核酸バーコード配列と酵素的に連結するステップと
を含む、方法。
131.酵素的連結に先立って、アダプター配列を1種または複数の核酸標的分子中に組み込むステップを含む、130の方法。
132.1種または複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む複数の核酸標的分子である、130または131の方法。
133.複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して異なる配列を含む核酸標的分子を含む、130~132のいずれか1つの方法。
134.ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む複数の核酸バーコード配列である、130~132のいずれか1つの方法。
135.複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、130~132のいずれか1つの方法。
136.別個の実体が、微小滴である、130~135のいずれか1つの方法。
137.微小滴を操作するための方法であって、
第1の複数の微小滴および第2の複数の微小滴を作製するステップと、
マイクロ流体デバイスのチャネル中に、第1の複数の微小滴を流すステップと、
第1の複数の微小滴のそれぞれを分割して、複数の低減された容量の微小滴を提供するステップと、
複数の低減された容量の微小滴のそれぞれを、第2の複数の微小滴の微小滴と併合するステップであって、第2の複数の微小滴の微小滴がそれぞれ、第1の複数の微小滴のものとおよそ同等またはそれより少ない容量を有する、ステップと
を含む、方法。
第1の複数の微小滴および第2の複数の微小滴を作製するステップと、
マイクロ流体デバイスのチャネル中に、第1の複数の微小滴を流すステップと、
第1の複数の微小滴のそれぞれを分割して、複数の低減された容量の微小滴を提供するステップと、
複数の低減された容量の微小滴のそれぞれを、第2の複数の微小滴の微小滴と併合するステップであって、第2の複数の微小滴の微小滴がそれぞれ、第1の複数の微小滴のものとおよそ同等またはそれより少ない容量を有する、ステップと
を含む、方法。
138.マイクロ流体デバイスのチャネルが、小滴分割アーキテクチャを含む、137の方法。
139.小滴分割アーキテクチャが、一連の二分アーキテクチャを含む、138の方法。
140.第1の複数の微小滴のそれぞれが、細胞可溶化液を含む、137~139のいずれか1つの方法。
141.第1の複数の微小滴のそれぞれ中の細胞を溶解して、細胞可溶化液を提供するステップを含む、140の方法。
142.第2の複数の微小滴の微小滴がそれぞれ、細胞可溶化液の1種または複数の成分との1種または複数の反応を促進するように構成された、1種または複数の試薬を含む、137~141のいずれか1つの方法。
143.1種または複数の試薬が、1種または複数のPCR試薬および/または1種または複数のRT-PCR試薬を含む、142の方法。
144.マイクロ流体デバイスであって、
複数のチャネル形状の機構を連続して含む微小滴併合セクションを含むフローチャネルであって、各チャネル形状の機構が、チャネル形状の機構に近接したチャネルにおいて電場をかけるように構成された、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連しているフローチャネルを含む、デバイス。
複数のチャネル形状の機構を連続して含む微小滴併合セクションを含むフローチャネルであって、各チャネル形状の機構が、チャネル形状の機構に近接したチャネルにおいて電場をかけるように構成された、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連しているフローチャネルを含む、デバイス。
145.複数のチャネル形状の機構のそれぞれが、チャネルの収縮、拡大、屈曲またはそれらの組合せを含む、144のマイクロ流体デバイス。
146.複数のチャネル形状の機構のそれぞれが、チャネルの収縮を含み、チャネルの収縮のそれぞれに、チャネル拡大が続くか、チャネル拡大が先行する、145のマイクロ流体デバイス。
147.各収縮が、小滴併合セクションの上流または下流のチャネル幅または高さに対する、チャネル幅または高さの低減である、145または146のマイクロ流体デバイス。
148.各チャネル拡大が、148に示されるような収縮に対する、チャネル幅または高さの増大である、147のマイクロ流体デバイス。
149.小滴併合セクションが、2~20のチャネル形状の機構を連続して含む、144~148のいずれか1つのマイクロ流体デバイス。
150.小滴併合セクションが、2~10のチャネル形状の機構を連続して含む、149のマイクロ流体デバイス。
151.小滴併合セクションが、2~5のチャネル形状の機構を連続して含む、150のマイクロ流体デバイス。
152.1つまたは複数の電極が、液体電極である、144~151のいずれか1つのマイクロ流体デバイス。
153.各チャネル形状の機構が、第1の電極またはその一部および第2の電極またはその一部と関連しており、第1の電極またはその一部および第2の電極またはその一部が、フローチャネルのいずれかの側に対向関係で配置される、144~152のいずれか1つのマイクロ流体デバイス。
154.144~153のいずれか1つのマイクロ流体デバイスを使用して微小滴を併合する方法であって、
2つ以上の微小滴が、チャネル形状の機構のうち1つと近接して配置されるように、2個以上の微小滴を、144~153のいずれか1つのマイクロ流体デバイスのフローチャネルの微小滴併合セクションを通して流すステップと、
チャネル形状の機構と関連している1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分を使用して電場をかけることによって、チャネル形状の機構のうちの1つと近接している2つ以上の微小滴を併合するステップと
を含む、方法。
2つ以上の微小滴が、チャネル形状の機構のうち1つと近接して配置されるように、2個以上の微小滴を、144~153のいずれか1つのマイクロ流体デバイスのフローチャネルの微小滴併合セクションを通して流すステップと、
チャネル形状の機構と関連している1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分を使用して電場をかけることによって、チャネル形状の機構のうちの1つと近接している2つ以上の微小滴を併合するステップと
を含む、方法。
155.2種以上の微小滴のうち1種が、細胞可溶化液を含む、154の方法。
156.2種以上の微小滴のうち1種が、1種または複数の核酸バーコード配列を含む、154の方法。
157.2種以上の微小滴を併合するための方法であって、
2種以上の微小滴の集団を、マイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップであって、
フローチャネルが、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけるように構成された、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連する微小滴併合セクションを含み
微小滴の2種以上の集団が、それぞれ、2種以上の別個の入口チャネルから単一接合点でフローチャネル中に導入され、
各入口チャネルからの微小滴投与量が、水力学的効果のために少なくとも部分的に同調し、微小滴の間隔がとられたグループの放出をもたらし、微小滴の間隔があげられたグループの少なくとも一部が、微小滴の2種以上の集団のそれぞれに由来する微小滴を含むように、微小滴の2種以上の集団が、フローチャネル中に導入される、ステップと、
微小滴の間隔があげられたグループを、微小滴併合セクション中に流すステップと、
1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分を使用して、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけることによって、間隔があげられたグループ内の微小滴を併合するステップと
を含む、方法。
2種以上の微小滴の集団を、マイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップであって、
フローチャネルが、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけるように構成された、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連する微小滴併合セクションを含み
微小滴の2種以上の集団が、それぞれ、2種以上の別個の入口チャネルから単一接合点でフローチャネル中に導入され、
各入口チャネルからの微小滴投与量が、水力学的効果のために少なくとも部分的に同調し、微小滴の間隔がとられたグループの放出をもたらし、微小滴の間隔があげられたグループの少なくとも一部が、微小滴の2種以上の集団のそれぞれに由来する微小滴を含むように、微小滴の2種以上の集団が、フローチャネル中に導入される、ステップと、
微小滴の間隔があげられたグループを、微小滴併合セクション中に流すステップと、
1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分を使用して、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけることによって、間隔があげられたグループ内の微小滴を併合するステップと
を含む、方法。
158.微小滴の3種以上の集団が、それぞれ、3種以上の別個の入口チャネルから単一接合点でフローチャネル中に導入され、各入口チャネルからの微小滴投与量が、水力学的効果のために少なくとも部分的に同調し、微小滴の間隔がとられたグループの放出をもたらし、微小滴の間隔があげられたグループの少なくとも一部が、微小滴の3種以上の集団のそれぞれに由来する微小滴を含むように、微小滴の3種以上の集団が、フローチャネル中に導入される、157の方法。
159.2種以上の液体を併合するための方法であって、
第1の液体を、非混和相液体と少なくとも部分的に接触する流としてマイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップと、
第2の液体を含む微小滴を、フローチャネル中に導入するステップと、
微小滴を流中に併合し、それによって第1および第2の液体を組み合わせるステップと、
組み合わされた第1および第2の液体を含む流を、組み合わされた第1および第2の液体を含む個々の微小滴中に押し入れるステップと
を含む、方法。
第1の液体を、非混和相液体と少なくとも部分的に接触する流としてマイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップと、
第2の液体を含む微小滴を、フローチャネル中に導入するステップと、
微小滴を流中に併合し、それによって第1および第2の液体を組み合わせるステップと、
組み合わされた第1および第2の液体を含む流を、組み合わされた第1および第2の液体を含む個々の微小滴中に押し入れるステップと
を含む、方法。
160.フローチャネルが、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけるように構成される、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連する微小滴併合セクションを含み、方法が、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけて、微小滴を流に併合するステップを含む、159の方法。
161.第1の液体を、滴下条件下でフローチャネル中に導入する、159または160の方法。
162.第1の液体を、噴射条件下でフローチャネル中に導入する、159または160の方法。
163.複数の微小滴を流中に併合し、その後、流を、個々の微小滴中に押し入れるステップを含む、159~162のいずれか1つの方法。
164.第3の液体を含む第2の微小滴を、フローチャネル中に導入するステップであって、導入するステップが、複数の個々の微小滴中に押し入れ、その後、第2の微小滴を流に併合する、ステップを含む、159~162のいずれか1つの方法。
165.第2および第3の液体が、同一である、164の方法。
166.1種または複数のさらなる液体を、流または小滴のいずれかとしてフローチャネル中に導入するステップを含む、159~162のいずれか1つの方法。
167.マイクロ流体デバイスであって、
フローチャネルと流体連絡した1つまたは複数の派生チャネルを含む微小滴混和セクションを含むフローチャネルを含み、
ここで、1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中央線に対して10°から170°の間の角度であり、
1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの高さより小さい、フローチャネルを通って流されるべき小滴の直径未満である高さを有し、
微小滴が、キャリアー流体中のフローチャネルを通って流れた場合に、キャリアー流体が1つまたは複数の派生チャネル中に流れて入るおよびそれから流れて出るときに生じる直交流に曝露されるように、1つまたは複数の派生チャネルが構成され、
直交流が、微小滴の内容物を混和する微小滴中の流れを生成するのに十分である、デバイス。
フローチャネルと流体連絡した1つまたは複数の派生チャネルを含む微小滴混和セクションを含むフローチャネルを含み、
ここで、1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中央線に対して10°から170°の間の角度であり、
1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの高さより小さい、フローチャネルを通って流されるべき小滴の直径未満である高さを有し、
微小滴が、キャリアー流体中のフローチャネルを通って流れた場合に、キャリアー流体が1つまたは複数の派生チャネル中に流れて入るおよびそれから流れて出るときに生じる直交流に曝露されるように、1つまたは複数の派生チャネルが構成され、
直交流が、微小滴の内容物を混和する微小滴中の流れを生成するのに十分である、デバイス。
168.1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中心線に対して45°から135°の間の角度である、167のマイクロ流体デバイス。
169.1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中心線に対して約90°の角度である、168のマイクロ流体デバイス。
170.微小滴混和セクションが、微小滴が、キャリアー流体中のフローチャネルを通って流れた場合に、複数の直交流に曝露されるように、フローチャネルの長さに沿って配置される複数の派生チャネルを含む、167~169のいずれか1つのマイクロ流体デバイス。
171.1つまたは複数の派生チャネルの幅が、フローチャネルを通って流れるべき微小滴の直径より大きい、167~170のいずれか1つのマイクロ流体デバイス。
172.167~171のいずれか1つのマイクロ流体デバイスを使用する1種または複数の微小滴の内容物を混和する方法であって、
キャリアー流体中の1種または複数の微小滴を、167~171のいずれか1つのマイクロ流体デバイスのフローチャネルの微小滴混和セクションを通って流すステップを含み、
1種または複数の微小滴が、キャリアー流体が1つまたは複数の派生チャネル中に流れて入るおよびそれから流れて出るときに生じる直交流に曝露され、
直交流が、1種または複数の微小滴の内容物を混和する微小滴中の流れを生成するのに十分である、方法。
キャリアー流体中の1種または複数の微小滴を、167~171のいずれか1つのマイクロ流体デバイスのフローチャネルの微小滴混和セクションを通って流すステップを含み、
1種または複数の微小滴が、キャリアー流体が1つまたは複数の派生チャネル中に流れて入るおよびそれから流れて出るときに生じる直交流に曝露され、
直交流が、1種または複数の微小滴の内容物を混和する微小滴中の流れを生成するのに十分である、方法。
173.単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
細胞を溶解して、別個の実体内のRNA標的分子を放出するステップと、
各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列ならびにcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、
各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列のcDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供し、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含む、複数の別個の実体を提供するステップと
を含む、方法。
別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
細胞を溶解して、別個の実体内のRNA標的分子を放出するステップと、
各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列ならびにcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、
各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列のcDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供し、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含む、複数の別個の実体を提供するステップと
を含む、方法。
174.各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬を導入するステップを含み、ここで、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列の、cDNA増幅産物への酵素的組込みに十分な条件が、固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分である、173の方法。
175.固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、174の方法。
176.別個の実体が、微小滴である、173~175のいずれか1つの方法。
177.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、173~176のいずれか1つの方法。
178.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、173~176のいずれか1つの方法。
179.導入が137~139または154~166のいずれか1つに従う、173~176のいずれか1つの方法。
180.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、173~176のいずれか1つの方法。
181.別個の実体の成分を、167~172のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、173~176のいずれか1つの方法。
182.導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、173~181のいずれか1つの方法。
183.増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、173~182のいずれか1つの方法。
184.カプセル封入、溶解およびcDNA合成ステップを、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、酵素的組込みを、第2のマイクロ流体デバイスで実施する、173~183のいずれか1つの方法。
185.酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、184の方法。
186.単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、
各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列ならびにcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、
各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列の、cDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供し、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含むステップと
を含む、方法。
別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、
各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列ならびにcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、
各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列の、cDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供し、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含むステップと
を含む、方法。
187.各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬を導入するステップを含み、ここで、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列の、cDNA増幅産物への酵素的組込みに十分な条件は、固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分である、186の方法。
188.固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、187の方法。
189.別個の実体が、微小滴である、186~188のいずれか1つの方法。
190.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、186~189のいずれか1つの方法。
189.別個の実体が、微小滴である、186~188のいずれか1つの方法。
190.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、186~189のいずれか1つの方法。
191.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、186~189のいずれか1つの方法。
192.導入が137~139または154~166のいずれか1つに従う、186~189のいずれか1つの方法。
193.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、186~189のいずれか1つの方法。
194.別個の実体の成分を、167~172のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、186~189のいずれか1つの方法。
195.導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、186~194のいずれか1つの方法。
196.増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、186~195のいずれか1つの方法。
197.cDNA合成ステップを、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、酵素的組込みを、第2のマイクロ流体デバイスで実施する、186~196のいずれか1つの方法。
198.酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、197の方法。
199.単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
(a)別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
(b)細胞を溶解して、別個の実体内のRNA標的分子を放出するステップと、
(c)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、
(d)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、
(e)各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物の酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
(a)別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
(b)細胞を溶解して、別個の実体内のRNA標的分子を放出するステップと、
(c)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、
(d)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、
(e)各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物の酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
200.ステップ(a)、(b)および/または(c)を、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(d)を、第2のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(e)を、第3のマイクロ流体デバイスで実施する、199の方法。
201.ステップ(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を、単一マイクロ流体デバイスで実施する、199の方法。
202.各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な条件に供するステップを含む、199~201のいずれか1つの方法。
203.固有分子識別子を含む核酸分子の酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、202の方法。
204.別個の実体が、微小滴である、199~203のいずれか1つの方法。
205.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、199~204のいずれか1つの方法。
206.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、199~204のいずれか1つの方法。
207.導入ステップが137~139または154~166のいずれか1つに従う、199~204のいずれか1つの方法。
208.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、199~204のいずれか1つの方法。
209.別個の実体の成分を、167~172のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、199~204のいずれか1つの方法。
210.核酸バーコード配列を断片化し、導入し、酵素的に組み込むのに十分な試薬を導入するステップを、121~129のいずれか1つに示される方法に従って実施する、199~204のいずれか1つの方法。
211.導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、199~210のいずれか1つの方法。
212.ステップ(c)を、2つの異なるステップ、cDNA合成に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成に十分な条件に供する第1のステップおよび得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供する第2のステップで実施する、199~211のいずれか1つの方法。
213.ステップ(e)が、ステップ(d)から得られた別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入するステップと、核酸バーコード配列を含む別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入し、別個の実体を併合して、増大した容量の別個の実体を提供するステップとを含む、199~211のいずれか1つの方法。
214.酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、199~212のいずれか1つの方法。
215.単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
(a)別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、
(b)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、
(c)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、
(d)各別個の実体中に、その別個の実体に固有の核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
(a)別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、
(b)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、
(c)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、
(d)各別個の実体中に、その別個の実体に固有の核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
216.ステップ(a)および/または(b)を、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(c)を、第2のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(d)を、第3のマイクロ流体デバイスで実施する、215の方法。
217.ステップ(a)、(b)、(c)および(d)を、単一マイクロ流体デバイスで実施する、215の方法。
218.各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な条件に供するステップを含む、215~217のいずれか1つの方法。
219.固有分子識別子を含む核酸分子の酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、218の方法。
220.別個の実体が、微小滴である、215~219のいずれか1つの方法。
221.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、215~220のいずれか1つの方法。
222.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、215~220のいずれか1つの方法。
223.導入ステップのうち1つまたは複数が、137~139または154~166のいずれか1つに従う、215~220のいずれか1つの方法。
224.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、215~220のいずれか1つの方法。
225.別個の実体の成分を、167~172のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、215~220のいずれか1つの方法。
226.核酸バーコード配列を断片化し、導入し、酵素的に組み込むのに十分な試薬を導入するステップを、121~129のいずれか1つに示される方法に従って実施する、215~220のいずれか1つの方法。
227.導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、215~216のいずれか1つの方法。
228.ステップ(b)を、2つの異なるステップ、cDNA合成に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成に十分な条件に供する第1のステップおよび得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供する第2のステップで実施する、199~227のいずれか1つの方法。
229.ステップ(d)が、ステップ(c)から得られた別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入するステップと、核酸バーコード配列を含む別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入し、別個の実体を併合して、増大した容量の別個の実体を提供するステップとを含む、199~227のいずれか1つの方法。
230.酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、199~228のいずれか1つの方法。
231.シーケンシングのためにcDNAを調製する方法であって、
cDNAを複数の断片に断片化するステップであって、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部断片を含む、ステップと、
固相支持体とともに1つまたは複数の別個の実体中に複数の断片をカプセル封入するステップと、
固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップと
を含む、方法。
cDNAを複数の断片に断片化するステップであって、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部断片を含む、ステップと、
固相支持体とともに1つまたは複数の別個の実体中に複数の断片をカプセル封入するステップと、
固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップと
を含む、方法。
232.cDNAを、単細胞を起源とするmRNAから作製し、ここで、各cDNAが、mRNAが起源とする細胞に対して独特である5’末端および/または3’末端中に組み込まれている核酸バーコード配列を含む、231の方法。
233.各cDNAが、5’末端および/または3’末端中に組み込まれた固有分子識別子(UMI)を含む、231または232の方法。
234.cDNAが、173~197のいずれか1つの方法の産物である、231の方法。
235.断片化が、物理的せん断を含む、231~234のいずれか1つの方法。
236.断片化が、1種または複数の酵素を用いる酵素的断片化を含む、231~235のいずれか1つの方法。
237.5’末端および/または3’末端が、リガンドを含み、固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定するステップが、リガンドを、固相支持体上に固定化されているリガンドの受容体と特異的に結合するステップを含む、231~236のいずれか1つの方法。
238.固相支持体が、ビーズである、231~237のいずれか1つの方法。
239.ビーズが、磁性ビーズである、238の方法。
240.固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を、酵素的修飾に供するステップを含む、231~239のいずれか1つの方法。
241.酵素的修飾が、制限消化、連結およびポリアデニル化から選択される、240の方法。
242.断片化が、cDNAの5’末端および/または3’末端を固相支持体上に可逆的に固定化することの後に起こる、231~241のいずれか1つの方法。
243.1種または複数の別個の実体が、微小滴である、231~242のいずれか1つの方法。
244.シーケンシングのためのバーコード付加された核酸を調製する方法であって、
別個の実体中に、複数の核酸標的分子および複数のビーズをカプセル封入するステップであって、複数のビーズのそれぞれが、核酸バーコード配列、固有分子識別子(UMI)および複数の核酸標的分子のうちの1種とハイブリダイズするように設計された核酸捕獲配列を含む、ステップと、
別個の実体を、1種または複数の核酸標的分子および核酸捕獲配列のハイブリダイゼーションに十分な条件に供するステップと、
その後の解析のために別個の実体から複数のビーズを回収するステップと
を含む、方法。
別個の実体中に、複数の核酸標的分子および複数のビーズをカプセル封入するステップであって、複数のビーズのそれぞれが、核酸バーコード配列、固有分子識別子(UMI)および複数の核酸標的分子のうちの1種とハイブリダイズするように設計された核酸捕獲配列を含む、ステップと、
別個の実体を、1種または複数の核酸標的分子および核酸捕獲配列のハイブリダイゼーションに十分な条件に供するステップと、
その後の解析のために別個の実体から複数のビーズを回収するステップと
を含む、方法。
245.核酸バーコード配列の1種またはその増幅産物を、複数の標的核酸分子またはその増幅産物のそれぞれ中に酵素的に組み込むステップを含む、244の方法。
246.核酸バーコード配列の1種上で複数の核酸標的分子のそれぞれを酵素的に伸長して、核酸バーコード配列またはそれに相補的な配列および核酸標的分子の配列の少なくとも一部を含むキメラ分子を作製するステップを含む、244の方法。
247.回収するステップが、蛍光活性化細胞選別(FACS)、PCR活性化細胞選別(PACS)または磁性活性化細胞選別(MACS)のうち1種以上によってビーズを選別するステップを含む、244~246のいずれか1つの方法。
248.核酸標的分子が、細胞性DNA、RNAまたはアフィニティー試薬によって細胞と関連付けられた核酸を含む、244~247のいずれか1つの方法。
249.ビーズから得られた核酸標的分子を酵素的に増幅するステップを含む、244~248のいずれか1つの方法。
250.ビーズから核酸標的分子を回収するステップを含む、244~249のいずれか1つの方法。
251.核酸標的分子もしくはその一部をシーケンシングすることまたは核酸標的分子の増幅産物もしくはその一部をシーケンシングするステップを含む、244~250のいずれか1つの方法。
252.別個の実体が、微小滴である、244~251のいずれか1つの方法。
253.バーコードベースのシーケンシングの区画化された増幅された標的ライブラリーを製造するための方法であって、
核酸標的分子の酵素的増幅に十分な試薬とともに、複数の別個の実体中に、複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子の酵素的増幅に十分な条件に供して、増幅産物を提供するステップと、
増幅産物を断片化するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された増幅産物中に組み込むステップと
を含む、方法。
核酸標的分子の酵素的増幅に十分な試薬とともに、複数の別個の実体中に、複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子の酵素的増幅に十分な条件に供して、増幅産物を提供するステップと、
増幅産物を断片化するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された増幅産物中に組み込むステップと
を含む、方法。
254.別個の実体が、微小滴である、253の方法。
255.核酸標的分子の酵素的増幅に十分な試薬が、DNAポリメラーゼ、RecAタンパク質およびヘリカーゼから選択される1種または複数の酵素を含む、253または254の方法。
256.別個の実体を、核酸標的分子の酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を熱サイクルするステップを含む、253~255のいずれか1つの方法。
257.核酸標的分子が、DNA分子であり、RNA中間体が、核酸標的分子を増幅するために使用される、253~256のいずれか1つの方法。
258.核酸標的分子が、1種または複数の生物において増幅される、253~257のいずれか1つの方法。
259.試薬または条件を調節して、核酸標的分子の増幅の程度を調節するステップを含む、253~258のいずれか1つの方法。
260.複数のもののうち個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの核酸標的分子のいずれかを統計的に含有するように、複数の核酸標的分子を、制限希釈で複数の別個の実体中にカプセル封入する、253~259のいずれか1つの方法。
261.増幅産物を、断片化の前または後に、1種または複数の固相支持体と結合するステップを含む、253~260のいずれか1つの方法。
262.1種または複数の固相支持体が、1種または複数のビーズである、261の方法。
263.核酸標的分子が、10キロベースより長い長さである、253~262のいずれか1つの方法。
264.核酸標的分子が、100キロベースより長い長さである、263の方法。
265.核酸標的分子が、1メガベースより長い長さである、264の方法。
265.核酸標的分子が、1メガベースより長い長さである、264の方法。
266.核酸標的分子を断片化し、バーコード付加する方法であって、
複数の核酸標的分子またはその増幅産物を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子またはその増幅産物の断片化に十分な条件に供して、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列によって、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片が、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定される、ステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子またはその増幅産物を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子またはその増幅産物の断片化に十分な条件に供して、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列によって、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片が、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定される、ステップと
を含む、方法。
267.供するステップが、核酸標的分子またはその増幅産物を酵素的に断片化するステップを含む、266の方法。
268.供するステップが、物理的または化学的手段を使用して核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、266の方法。
269.供するステップが、UV光の適用によって核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、266の方法。
270.供するステップに先立って、1つまたは複数の酵素的切断部位を、核酸標的分子またはその増幅断片中に組み込むステップを含む、266の方法。
271.1種または複数の酵素的切断部位が、dUTPを含む、270の方法。
272.供するステップが、力の適用によって核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、266の方法。
273.力が、マイクロ流体デバイスにおけるマイクロ流体チャネル、マイクロ流体噴射またはマイクロ流体デバイス中のマイクロ流体接合部を通る核酸標的分子またはその増幅産物の水力学的流れによって誘導されるせん断力である、272の方法。
274.供するステップが、トランスポゾン挿入によって、核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、266の方法。
275.供するステップが、核酸断片化微生物を使用して核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、266の方法。
276.別個の実体が、微小滴である、266~275のいずれか1つの方法。
277.核酸標的分子が、10キロベースよりも長い長さである、266~276のいずれか1つの方法。
278.核酸標的分子が、100キロベースより長い長さである、277の方法。
279.核酸標的分子が、1メガベースより長い長さである、278の方法。
280.細胞におけるコピー数変動を特性決定するための方法であって、
別個の実体中の単細胞を単離するステップと、
別個の実体中の細胞性核酸を断片化するステップと、
固有分子識別子(UMI)を、断片化された細胞性核酸中に組み込むステップと、
断片化された細胞性核酸をシーケンシングするステップと、
UMIを使用して、細胞性核酸中の特定の配列のコピー数を推測するステップと
を含む、方法。
別個の実体中の単細胞を単離するステップと、
別個の実体中の細胞性核酸を断片化するステップと、
固有分子識別子(UMI)を、断片化された細胞性核酸中に組み込むステップと、
断片化された細胞性核酸をシーケンシングするステップと、
UMIを使用して、細胞性核酸中の特定の配列のコピー数を推測するステップと
を含む、方法。
281.細胞性核酸が、ゲノムDNAを含む、280の方法。
282.細胞性核酸が、RNAを含む、280または281の方法。
283.細胞の集団を、単離、断片化、組み込むことおよびシーケンシングステップに供する、280~282のいずれか1つの方法。
284.別個の実体が、微小滴である、280~283のいずれか1つの方法。
285.細胞性核酸中に、各細胞および/または各別個の実体に固有な核酸バーコード配列を組み込むステップを含む、280~284のいずれか1つの方法。
286.シーケンシングが、UMIおよび/または核酸バーコード配列を含むシーケンシングリードを製造する、280~285のいずれか1つの方法。
287.バーコードを、断片化された核酸またはその増幅産物と結合するための方法であって、
複数の別個の実体中で、複数の断片化された核酸標的分子、核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップであって、核酸バーコード配列が、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片またはその増幅産物を、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定する、ステップと
を含む、方法。
複数の別個の実体中で、複数の断片化された核酸標的分子、核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップであって、核酸バーコード配列が、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片またはその増幅産物を、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定する、ステップと
を含む、方法。
288.供するステップが、ビーズの存在下で起こらない、287の方法。
289.試薬がリガーゼを含む、287または288の方法。
290.試薬が、インテグラーゼ、リコンビナーゼおよびフリッパーゼから選択される1種または複数の酵素を含む、287または288の方法。
291.組み込むステップが、SOEing PCRを含む、287または288の方法。
292.別個の実体が、微小滴である、287~291のいずれか1つの方法。
293.核酸をシーケンシングする方法であって、
複数の核酸標的分子を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、
第1の増幅産物を断片化して、断片化された第1の増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された第1の増幅産物または断片化された第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、
第1の増幅産物を断片化して、断片化された第1の増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された第1の増幅産物または断片化された第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。
294.酵素的に増幅するステップが、カプセル封入に先立って起こる、293の方法。
295.別個の実体が、微小滴である、293または294の方法。
296.組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれを、核酸バーコード配列を含む微小滴と併合するステップを含む、295の方法。
297.組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれ中に、核酸バーコード配列を含む細胞をカプセル封入するステップを含む、295の方法。
298.断片化および組み込むステップを、トランスポゾンを使用して単一ステップとして実施する、293~297のいずれか1つの方法。
299.別個の実体のうち1種または複数が、複数の異なる核酸標的分子および/または複数の異なる核酸バーコード配列を含み、方法が、シーケンシングに起因する混和されたシーケンシングリードをバイオインフォマティクス的に解析して、個々の核酸標的分子の配列情報を得るステップを含む、293~298のいずれか1つの方法。
300.1種または複数の細胞またはウイルスを溶解して、複数の核酸標的分子を得るステップを含む、293~299のいずれか1つの方法。
301.溶解が、複数の別個の実体において起こる、300の方法。
302.複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、293~301のいずれか1つの方法。
303.複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単一分子を起源とする、293~301のいずれか1つの方法。
304.固有分子識別子(UMI)を、核酸標的分子、第1の増幅産物、断片化された第1の増幅産物および第2の増幅産物のうち1種または複数中に組み込むステップを含む、293~303のいずれか1つの方法。
305.核酸をシーケンシングする方法であって、
複数の核酸標的分子を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の核酸標的分子を断片化して、断片化された核酸標的分子を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子または断片化された核酸標的分子から増幅された増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された核酸標的分子または組み込まれた核酸バーコード配列を有する増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された核酸標的分子のメンバーまたは増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の核酸標的分子を断片化して、断片化された核酸標的分子を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子または断片化された核酸標的分子から増幅された増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された核酸標的分子または組み込まれた核酸バーコード配列を有する増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された核酸標的分子のメンバーまたは増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。
306.別個の実体が、微小滴である、305の方法。
307.組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれを、核酸バーコード配列を含む微小滴と併合するステップを含む、306の方法。
308.別個の実体が、微小滴であり、組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれ中に、核酸バーコード配列を含む細胞をカプセル封入するステップを含む、306の方法。
308.別個の実体が、微小滴であり、組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれ中に、核酸バーコード配列を含む細胞をカプセル封入するステップを含む、306の方法。
309.断片化および組み込むステップを、トランスポゾンを使用して単一ステップとして実施する、305~308のいずれか1つの方法。
310.別個の実体のうち1種または複数が、複数の異なる核酸標的分子および/または複数の異なる核酸バーコード配列を含み、方法が、シーケンシングに起因する混和されたシーケンシングリードをバイオインフォマティクス的に解析して、個々の核酸標的分子の配列情報を得るステップを含む、305~309のいずれか1つの方法。
311.1種または複数の細胞またはウイルスを溶解して、複数の核酸標的分子を得るステップを含む、305~310のいずれか1つの方法。
312.溶解が、複数の別個の実体において起こる、311の方法。
313.複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、305~312のいずれか1つの方法。
314.複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単一分子を起源とする、305~312のいずれか1つの方法。
315.固有分子識別子(UMI)を、核酸標的分子、断片化された核酸標的分子および増幅産物のうち1種または複数中に組み込むステップを含む、305~314のいずれか1つの方法。
316.核酸をシーケンシングする方法であって、
複数の核酸標的分子を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の別個の実体において核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、第1の増幅産物または第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。
複数の核酸標的分子を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の別個の実体において核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、第1の増幅産物または第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。
317.酵素的に増幅するステップが、カプセル封入に先立って起こる、316の方法。
318.別個の実体が、微小滴である、316または317の方法。
319.組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれを、核酸バーコード配列を含む微小滴と併合するステップを含む、318の方法。
320.組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれ中に、核酸バーコード配列を含む細胞をカプセル封入するステップを含む、318の方法。
321.別個の実体のうち1種または複数が、複数の異なる核酸標的分子および/または複数の異なる核酸バーコード配列を含み、方法が、シーケンシングに起因する混和されたシーケンシングリードをバイオインフォマティクス的に解析して、個々の核酸標的分子の配列情報を得るステップを含む、316~320のいずれか1つの方法。
322.1種または複数の細胞またはウイルスを溶解して、複数の核酸標的分子を得るステップを含む、316~321のいずれか1つの方法。
323.溶解が、複数の別個の実体において起こる、322の方法。
324.複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、316~323のいずれか1つの方法。
325.複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単一分子を起源とする、316~323のいずれか1つの方法。
326.固有分子識別子(UMI)を、核酸標的分子、第1の増幅産物および第2の増幅産物のうち1種または複数中に組み込むステップを含む、316~325のいずれか1つの方法。
327.標的分子を検出するための方法であって、
分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬のそれぞれを、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて標識するステップであって、第1の核酸バーコード配列が、オリゴヌクレオチドによって標識されたアフィニティー試薬の標的特異性を同定する、ステップと、
複数のアフィニティー試薬の、存在する場合にはその特異的分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数のアフィニティー試薬を、複数の分子標的と接触させるステップと、
存在する場合にはその特異的分子標的と結合している複数のアフィニティー試薬を、複数の第2の核酸バーコード配列とともに複数の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、各別個の実体中にカプセル封入された第2の核酸バーコード配列が、それらがカプセル封入される別個の実体を独特に同定する、ステップと、
第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に組み込むステップと、
第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチドをシーケンシングするステップと、
第1および第2の核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していたアフィニティー試薬を同定および/または定量化するステップと
を含む、方法。
分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬のそれぞれを、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて標識するステップであって、第1の核酸バーコード配列が、オリゴヌクレオチドによって標識されたアフィニティー試薬の標的特異性を同定する、ステップと、
複数のアフィニティー試薬の、存在する場合にはその特異的分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数のアフィニティー試薬を、複数の分子標的と接触させるステップと、
存在する場合にはその特異的分子標的と結合している複数のアフィニティー試薬を、複数の第2の核酸バーコード配列とともに複数の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、各別個の実体中にカプセル封入された第2の核酸バーコード配列が、それらがカプセル封入される別個の実体を独特に同定する、ステップと、
第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に組み込むステップと、
第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチドをシーケンシングするステップと、
第1および第2の核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していたアフィニティー試薬を同定および/または定量化するステップと
を含む、方法。
328.複数のアフィニティー試薬が、異なる分子標的に特異的なアフィニティー試薬を含む、327の方法。
329.分子標的が、細胞によって含まれる、327または328の方法。
330.複数の別個の実体の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、細胞を制限希釈で別個の実体中にカプセル封入する、329の方法。
331.分子標的が、細胞のうち1個または複数の表面と結合している、またはそれと会合している、329または330の方法。
332.アフィニティー試薬が、抗体である、327~331のいずれか1つの方法。
333.オリゴヌクレオチドが、DNAまたはその類似体を含む、327~332のいずれか1つの方法。
334.オリゴヌクレオチドが、RNAまたはその類似体を含む、327~332のいずれか1つの方法。
335.複数のアフィニティー試薬のそれぞれおよび/または第1の核酸バーコード配列を含む各オリゴヌクレオチドが、固有分子識別子(UMI)を含み、これらは、それぞれ、アフィニティー試薬のそれぞれおよび/または第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドのそれぞれを独特に同定する、327~332のいずれか1つの方法。
336.複数のアフィニティー試薬を、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよび/またはmRNAディスプレイのうち1種または複数を使用して作製する、327~335のいずれか1つの方法。
337.複数のアフィニティー薬剤を標識するために使用されるオリゴヌクレオチドを、共有結合性、イオン性および疎水性相互作用のうち1種または複数によってアフィニティー薬剤を結合させる、327~336のいずれか1つの方法。
338.別個の実体が、微小滴である、327~336のいずれか1つの方法。
339.オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬にバーコード付加して増幅させる方法であって、
生体材料中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、生体材料を、それぞれ、分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
生体材料を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種またはその増幅産物中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
生体材料中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、生体材料を、それぞれ、分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
生体材料を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種またはその増幅産物中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
340.生体材料が、固定された細胞の生成物である、339の方法。
341.アフィニティー試薬が、抗体である、339または340の方法。
342.固有分子識別子(UMI)をオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬中に組み込むステップを含む、339~341のいずれか1つの方法。
343.別個の実体が、微小滴である、339~342のいずれか1つの方法。
344.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、339~343のいずれか1つの方法。
345.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、339~343のいずれか1つの方法。
346.導入が137~139または154~166のいずれか1つに従う、339~343のいずれか1つの方法。
347.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、339~343のいずれか1つの方法。
348.オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬にバーコード付加して増幅させる方法であって、
細胞中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数の細胞を、それぞれ、分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
細胞を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入し、溶解するステップと、
核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅産物中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
細胞中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数の細胞を、それぞれ、分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
細胞を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入し、溶解するステップと、
核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅産物中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
349.多くて1個の細胞が、第1の別個の実体のそれぞれ中に存在するように、細胞を、第1の別個の実体中にカプセル封入する、348の方法。
350.アフィニティー試薬が、抗体である、348または349の方法。
351.固有分子識別子(UMI)を、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬中に組み込むステップを含む、348~350のいずれか1つの方法。
352.別個の実体が、微小滴である、348~351のいずれか1つの方法。
353.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、348~352のいずれか1つの方法。
354.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、348~352のいずれか1つの方法。
355.導入が137~139または154~166のいずれか1つに従う、348~352のいずれか1つの方法。
356.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、348~352のいずれか1つの方法。
357.タンパク質とコンジュゲートしている核酸を連結し、増幅するための方法であって、
複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、
相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物および存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な試薬を組み合わせるステップと、
別個の実体を、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、
相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物および存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な試薬を組み合わせるステップと、
別個の実体を、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
358.集団を、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイのうち1種または複数を使用して調製する、357の方法。
359.別個の実体が、微小滴である、357~358のいずれか1つの方法。
360.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、357~359のいずれか1つの方法。
361.精製ステップを使用して、カプセル封入に先立って非相互作用性タンパク質を除去する、357~360のいずれか1つの方法。
362.別個の実体中に存在する固有の増幅産物の数に基づいて、非相互作用性タンパク質に対して、相互作用性タンパク質を同定するステップを含む、357~361のいずれか1つの方法。
363.相互作用が特異的結合相互作用である、357~362のいずれか1つの方法。
364.バーコード付加を用いてタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための方法であって、
複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、
相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物および第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
別個の実体を、第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、
相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物および第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
別個の実体を、第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。
365.集団を、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイのうち1種または複数を使用して調製する、364の方法。
366.別個の実体が、微小滴である、364~365のいずれか1つの方法。
367.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、364~366のいずれか1つの方法。
368.精製ステップを使用して、カプセル封入に先立って非相互作用性タンパク質を除去する、364~367のいずれか1つの方法。
369.別個の実体中の固有の第2の核酸バーコード配列またはその増幅産物の数に基づいて、非相互作用性タンパク質に対して、相互作用性タンパク質を同定するステップを含む、364~368のいずれか1つの方法。
370.相互作用が特異的結合相互作用である、364~369のいずれか1つの方法。
371.分子、分子複合体および/または構造体中に存在するエピトープを決定する方法であって、
アフィニティー試薬の、分子、分子複合体および/または構造体中に存在する場合には、そのそれぞれのエピトープとの特異的結合に十分な条件下で、複数の分子、分子複合体および/または構造体を、それぞれ、エピトープに特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、アフィニティー試薬のエピトープ特異性を同定する、コンジュゲートしている第1の核酸バーコード配列を含む、ステップと、
別個の実体中に、1種または複数のアフィニティー試薬と特異的に結合される分子、分子複合体および/または構造体をカプセル封入するステップと、
第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、別個の実体を独特に同定する、ステップと、
第2の核酸バーコード配列を含む第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物をシーケンシングして、分子、分子複合物および/または構造体上に存在するエピトープを同定するステップと
を含む、方法。
アフィニティー試薬の、分子、分子複合体および/または構造体中に存在する場合には、そのそれぞれのエピトープとの特異的結合に十分な条件下で、複数の分子、分子複合体および/または構造体を、それぞれ、エピトープに特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、アフィニティー試薬のエピトープ特異性を同定する、コンジュゲートしている第1の核酸バーコード配列を含む、ステップと、
別個の実体中に、1種または複数のアフィニティー試薬と特異的に結合される分子、分子複合体および/または構造体をカプセル封入するステップと、
第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、別個の実体を独特に同定する、ステップと、
第2の核酸バーコード配列を含む第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物をシーケンシングして、分子、分子複合物および/または構造体上に存在するエピトープを同定するステップと
を含む、方法。
372.エピトープが、翻訳後修飾またはスプライシング変動を含む、371の方法。
373.バーコード付加またはシーケンシングに先立って、免疫沈降を使用して、1種または複数のエピトープと特異的に結合しているアフィニティー試薬を濃縮することを含む、371または372の方法。
374.アフィニティー試薬が、抗体である、371~373のいずれか1つの方法。
375.別個の実体が、微小滴である、371~374のいずれか1つの方法。
376.サンプル中のアフィニティー試薬の数を決定するための方法であって、
1種または複数の分子標的を含有すると疑われるサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、アフィニティー試薬およびオリゴヌクレオチドの一方または両方が、複数のアフィニティー試薬のそれぞれを独特に同定する固有分子識別子(UMI)を含む、ステップと、
UMIを使用して、サンプル中のアフィニティー試薬の数を決定するステップと
を含む、方法。
1種または複数の分子標的を含有すると疑われるサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、アフィニティー試薬およびオリゴヌクレオチドの一方または両方が、複数のアフィニティー試薬のそれぞれを独特に同定する固有分子識別子(UMI)を含む、ステップと、
UMIを使用して、サンプル中のアフィニティー試薬の数を決定するステップと
を含む、方法。
377.核酸バーコード配列を増幅するステップを含み、UMIが増幅バイアスについて補正するために使用される、376の方法。
378.増幅することを、1つまたは複数の微小滴中で実施する、377の方法。
379.アフィニティー試薬が、抗体ではない、376~378のいずれか1つの方法。
380.標識されたアフィニティー試薬にバーコード付加する方法であって、
1種または複数の分子標的を含有するサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
サンプルから1種または複数の分子標的を単離するステップと、
第2の核酸バーコード配列を、オリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、1種または複数の分子標的を用いて単離されたアフィニティー試薬を独特に同定する、ステップと、
組み込まれている第2の核酸バーコード配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物をシーケンシングして、サンプル中の1種または複数の分子標的のうち1種と結合している複数のアフィニティー試薬を同定するステップと
を含む、方法。
1種または複数の分子標的を含有するサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
サンプルから1種または複数の分子標的を単離するステップと、
第2の核酸バーコード配列を、オリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、1種または複数の分子標的を用いて単離されたアフィニティー試薬を独特に同定する、ステップと、
組み込まれている第2の核酸バーコード配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物をシーケンシングして、サンプル中の1種または複数の分子標的のうち1種と結合している複数のアフィニティー試薬を同定するステップと
を含む、方法。
381.1種または複数の分子標的が、1個または複数の細胞によって含まれる、380の方法。
382.単離するステップが、個々の細胞を個々のウェル中に分配するステップを含む、381の方法。
383.単離するステップが、マイクロ流体細胞捕獲デバイスを使用して個々の細胞を単離するステップを含む、381の方法。
384.1種または複数の細胞中で遺伝子修飾を同定するための方法であって、
1つまたは複数の遺伝子修飾を、複数の細胞中に導入するステップと、
複数の細胞への1つまたは複数の遺伝子修飾の導入に起因する1種または複数の細胞表現型を同定するステップと、
別個の実体中の細胞のそれぞれを単離し、1つまたは複数の遺伝子修飾を含むDNAの1つまたは複数の領域を選択的に増幅するステップと、
核酸バーコード配列を、1つまたは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列が、単細胞を起源とするような1つまたは複数の遺伝子修飾を同定する、ステップと、
1つもしくは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物をシーケンシングして、1種または複数の細胞表現型を有する細胞中で1つまたは複数の遺伝子修飾を同定するステップと
を含む、方法。
1つまたは複数の遺伝子修飾を、複数の細胞中に導入するステップと、
複数の細胞への1つまたは複数の遺伝子修飾の導入に起因する1種または複数の細胞表現型を同定するステップと、
別個の実体中の細胞のそれぞれを単離し、1つまたは複数の遺伝子修飾を含むDNAの1つまたは複数の領域を選択的に増幅するステップと、
核酸バーコード配列を、1つまたは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列が、単細胞を起源とするような1つまたは複数の遺伝子修飾を同定する、ステップと、
1つもしくは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物をシーケンシングして、1種または複数の細胞表現型を有する細胞中で1つまたは複数の遺伝子修飾を同定するステップと
を含む、方法。
385.選択的に増幅することおよび組み込むことを、SOEing PCRを使用して実施する、384の方法。
386.別個の実体が、微小滴である、384~385のいずれか1つの方法。
387.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、384~386のいずれか1つの方法。
388.オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬および単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させるための方法であって、
複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
複数の細胞を、各別個の実体が多くて1個の細胞を含むように、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、
溶解した細胞を含有する別個の実体中に、第2の核酸バーコード配列ならびにRNAの逆転写、バーコード付加およびcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に第2の核酸バーコード配列を組み込むステップと
を含む、方法。
複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
複数の細胞を、各別個の実体が多くて1個の細胞を含むように、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、
溶解した細胞を含有する別個の実体中に、第2の核酸バーコード配列ならびにRNAの逆転写、バーコード付加およびcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に第2の核酸バーコード配列を組み込むステップと
を含む、方法。
389.固有分子識別子(UMI)を、溶解された細胞のRNA分子中に組み込むステップを含む、388の方法。
390.第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドがそれぞれ、固有分子識別子(UMI)を含む、388または389の方法。
391.別個の実体が、微小滴である、388~390のいずれか1つの方法。
392.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、388~391のいずれか1つの方法。
393.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、388~391のいずれか1つの方法。
394.導入が137~139または154~166のいずれか1つに従う、388~391のいずれか1つの方法。
395.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、388~391のいずれか1つの方法。
396.別個の実体の成分を、167~172のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、388~391のいずれか1つの方法。
397.増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、388~391のいずれか1つの方法。
398.アフィニティー試薬が、抗体である、388~397のいずれか1つの方法。
399.オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬および単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させるための方法であって、
複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
複数の細胞を、各第1の別個の実体が多くて1個の細胞を含むように、複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
第1の別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、
複数の第2の別個の実体中の複数の第2の核酸バーコード配列を提供するステップと、
第1の別個の実体のそれぞれを、第2の別個の実体のうちの1種と組み合わせて、第1のマイクロ流体デバイスにおいて第3の別個の実体を形成するステップであって、第3の別個の実体が、RNAのcDNA産物への逆転写に十分な試薬を含む、ステップと、
第2のマイクロ流体デバイスを利用して、第3の別個の実体中に、cDNA産物のバーコード付加および増幅に十分な試薬を導入し、第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップと
を含む、方法。
複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
複数の細胞を、各第1の別個の実体が多くて1個の細胞を含むように、複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
第1の別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、
複数の第2の別個の実体中の複数の第2の核酸バーコード配列を提供するステップと、
第1の別個の実体のそれぞれを、第2の別個の実体のうちの1種と組み合わせて、第1のマイクロ流体デバイスにおいて第3の別個の実体を形成するステップであって、第3の別個の実体が、RNAのcDNA産物への逆転写に十分な試薬を含む、ステップと、
第2のマイクロ流体デバイスを利用して、第3の別個の実体中に、cDNA産物のバーコード付加および増幅に十分な試薬を導入し、第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップと
を含む、方法。
400.固有分子識別子(UMI)を、溶解された細胞のRNA分子中に組み込むステップを含む、399の方法。
401.第1および第2マイクロ流体デバイスが異なっている、399または400の方法。
402.第1および第2マイクロ流体デバイスが異なっている、399または400の方法。
403.第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドがそれぞれ、固有分子識別子(UMI)を含む、399または400の方法。
404.別個の実体が、微小滴である、399~390のいずれか1つの方法。
405.核酸バーコード配列またはUMIを、1~95のいずれか1つに従って、調製または導入する、399~404のいずれか1つの方法。
406.核酸バーコード配列またはUMIを、96~120または130~136のいずれか1つに従って、調製または導入する、399~404のいずれか1つの方法。
407.導入が137~139または154~166のいずれか1つに従う、399~404のいずれか1つの方法。
408.144~153のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、399~404のいずれか1つの方法。
409.別個の実体の成分を、167~172のいずれか1つに示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、399~404のいずれか1つの方法。
410.増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、399~404のいずれか1つの方法。
410.増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、399~404のいずれか1つの方法。
411.アフィニティー試薬が、抗体である、399~410のいずれか1つの方法。
412.シーケンシングのためにバーコード付加されたDNAを調製する方法であって、
DNAを複数の断片に断片化し、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部の断片を含むステップと、
固相支持体とともに、1つまたは複数の別個の実体中に、複数の断片をカプセル封入するステップと、
固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップと
を含む、方法。
DNAを複数の断片に断片化し、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部の断片を含むステップと、
固相支持体とともに、1つまたは複数の別個の実体中に、複数の断片をカプセル封入するステップと、
固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップと
を含む、方法。
413.断片化が、物理的せん断を含む、412の方法。
414.断片化が、1種または複数の酵素を用いる酵素的断片化を含む、412の方法。
415.固相支持体が、ビーズである、412~414のいずれか1つの方法。
416.ビーズが、磁性ビーズである、415の方法。
417.固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を、酵素的修飾に供するステップを含む、412~416のいずれか1つの方法。
418.酵素的修飾が、制限消化、連結およびポリアデニル化から選択される、417の方法。
419.断片化が、DNAの5’末端および/または3’末端を固相支持体上に可逆的に固定化することの後に起こる、412~418のいずれか1つの方法。
420.1種または複数の別個の実体が、微小滴である、412~419のいずれか1つの方法。
421.バーコードを使用してシーケンシングリードをグループ化するための方法であって、
核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子をシーケンシングして、シーケンシングリードを提供するステップであって、複数の核酸分子が、同一および異なる別個の実体を起源とする核酸分子を含む、ステップと、
ハミングまたはレーベンシュタイン距離基準を使用して核酸バーコード配列によってシーケンシングリードをグループ化するステップと、
シーケンシングリード中に組み込まれた1種または複数のさらなるバーコードまたは固有分子識別子(UMI)の配列を使用して、同一の別個の実体を起源とするバーコードグループを統計的に決定するステップと、
同一の別個の実体を起源としたバーコードグループのリードを組み合わせるステップと、
各シーケンシングリードのバーコード部分を除去して、さらなる解析のために残りの部分を使用するステップと
を含む、方法。
核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子をシーケンシングして、シーケンシングリードを提供するステップであって、複数の核酸分子が、同一および異なる別個の実体を起源とする核酸分子を含む、ステップと、
ハミングまたはレーベンシュタイン距離基準を使用して核酸バーコード配列によってシーケンシングリードをグループ化するステップと、
シーケンシングリード中に組み込まれた1種または複数のさらなるバーコードまたは固有分子識別子(UMI)の配列を使用して、同一の別個の実体を起源とするバーコードグループを統計的に決定するステップと、
同一の別個の実体を起源としたバーコードグループのリードを組み合わせるステップと、
各シーケンシングリードのバーコード部分を除去して、さらなる解析のために残りの部分を使用するステップと
を含む、方法。
422.バーコード付加された核酸のライブラリーから配列ライブラリーを調製するための方法であって、
バーコード付加された核酸の第1のライブラリーを作製するステップと、
第1のライブラリーからシーケンシングライブラリーを調製するステップと、
第1のライブラリーを保存するステップと、
第1のライブラリーから第2のシーケンシングライブラリーを調製するステップと
を含む、方法。
バーコード付加された核酸の第1のライブラリーを作製するステップと、
第1のライブラリーからシーケンシングライブラリーを調製するステップと、
第1のライブラリーを保存するステップと、
第1のライブラリーから第2のシーケンシングライブラリーを調製するステップと
を含む、方法。
423.第1のライブラリーが、可溶性核酸を含む、422の方法。
424.第1のライブラリーが、固相支持体と結合している核酸を含む、422の方法。
425.固相支持体が、1種または複数のビーズを含む、424の方法。
426.蛍光活性化細胞選別(FACS)、PCR活性化細胞選別(PACS)または磁性活性化細胞選別(MACS)のうち1種または複数によってビーズを選別するステップを含む、422~425のいずれか1つの方法。
427.第1のライブラリーを、標識されたプライマーを用いてライブラリーの核酸を増幅して標識されたプライマーの標識に対して特異的結合親和性を有するアフィニティー試薬を用いて増幅産物を単離することによって、保存および/またはさらなる処理のために精製する、422~426のいずれか1つの方法。
428.標識がビオチンであり、アフィニティー試薬がストレプトアビジンである、427の方法。
429.1種または複数のビーズ上に、ストレプトアビジンをコーティングする、428の方法。
430.バーコード付加された核酸のライブラリーから配列ライブラリーを調製するための方法であって、
バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップであって、ライブラリーが、複数の細胞を起源とする核酸分子の配列を含む、ステップと、
ライブラリーから配列情報を得るステップと、
配列情報を使用して、特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅可能なプライマーを設計するステップと、
特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅し、解析するステップと
を含む、方法。
430.バーコード付加された核酸のライブラリーから配列ライブラリーを調製するための方法であって、
バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップであって、ライブラリーが、複数の細胞を起源とする核酸分子の配列を含む、ステップと、
ライブラリーから配列情報を得るステップと、
配列情報を使用して、特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅可能なプライマーを設計するステップと、
特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅し、解析するステップと
を含む、方法。
431.特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅可能なプライマーが、バーコード付加された核酸またはそれに相補的な配列のライブラリーのこれまでの解析から得られた核酸バーコード配列を含む、430の方法。
432.バーコード付加された配列ライブラリーを解析するための方法であって、
バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップと、
ライブラリーを第1のカバー深度でシーケンシングして、ライブラリー中の複数のバーコードグループについての情報を得るステップと、
ライブラリー中の複数のバーコードグループについての情報を解析して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのためにバーコードグループのサブセットを同定するステップと、
バーコードグループのサブセットの核酸について濃縮して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのために、標的化されるライブラリーを製造するステップと
を含む、方法。
バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップと、
ライブラリーを第1のカバー深度でシーケンシングして、ライブラリー中の複数のバーコードグループについての情報を得るステップと、
ライブラリー中の複数のバーコードグループについての情報を解析して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのためにバーコードグループのサブセットを同定するステップと、
バーコードグループのサブセットの核酸について濃縮して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのために、標的化されるライブラリーを製造するステップと
を含む、方法。
433.バーコードグループのサブセットの核酸が、1種または複数のビーズと結合され、濃縮が、バーコードグループのサブセットのうちの1つの既知バーコードと相補的である標識されたプローブとハイブリダイズして、標識されたプローブを使用してビーズを選別するステップを含む、432の方法。
434.選別が、蛍光活性化セルソーター(FACS)による、433の方法。
435.濃縮が、バーコードグループのサブセット中の特定のバーコード配列とハイブリダイズするプライマーを利用して、マイクロ流体小滴においてPCR活性化選別を実施し、それによって、バーコードグループのサブセットの核酸を選別するステップを含む、432の方法。
436.バーコードグループのサブセットの核酸が、1種または複数のビーズと結合している、435の方法。
437.濃縮が、バーコードグループのサブセット中の特定のバーコード配列とハイブリダイズするプライマーを利用して、プライマーを使用してバーコードグループのサブセットの核酸を増幅するステップを含む、432の方法。
438.組織を解析するための方法であって、
組織を複数の細胞または細胞凝集塊に脱凝集するステップを含み、
1~437の方法およびまたはデバイスのうち1つまたは複数を使用して、複数の細胞または細胞凝集塊のゲノム、トランスクリプトームおよび/またはプロテオームを解析して、組織の不均一性または均一性に関する情報を得る、方法。
組織を複数の細胞または細胞凝集塊に脱凝集するステップを含み、
1~437の方法およびまたはデバイスのうち1つまたは複数を使用して、複数の細胞または細胞凝集塊のゲノム、トランスクリプトームおよび/またはプロテオームを解析して、組織の不均一性または均一性に関する情報を得る、方法。
439.組織が、固体組織を含む、438の方法。
440.固体組織が、肺、心臓、腎臓および腫瘍組織から選択される、439の方法。
441.組織が、懸濁細胞または細胞凝集塊を含む、439の方法。
441.組織が、懸濁細胞または細胞凝集塊を含む、439の方法。
442.懸濁細胞または細胞凝集塊が、血液細胞、細胞培養細胞および/または幹細胞を含む、441の方法。
443.核酸をコンビナトリアルバーコード付加するための方法であって、
核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸標的分子の断片化および核酸バーコード配列の、断片への組込みに十分な試薬を導入するステップであって、試薬が、複数の固有な核酸バーコード配列を含む、ステップと、
別個の実体をインキュベートして、核酸標的分子を断片化し、複数の固有の核酸バーコード配列のうち第1のものを、第1の断片中に、また固有の核酸バーコード配列のうち第2のものを、第2の断片中に組み込むステップと
を含む、方法。
核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸標的分子の断片化および核酸バーコード配列の、断片への組込みに十分な試薬を導入するステップであって、試薬が、複数の固有な核酸バーコード配列を含む、ステップと、
別個の実体をインキュベートして、核酸標的分子を断片化し、複数の固有の核酸バーコード配列のうち第1のものを、第1の断片中に、また固有の核酸バーコード配列のうち第2のものを、第2の断片中に組み込むステップと
を含む、方法。
実施例1(仮想例):小滴におけるデジタルローリングサークル増幅(RCA)によるssDNAバーコードの製造
保存された配列に加えて連続または非連続縮重塩基の部分を含有するssDNAオリゴヌクレオチドのプールを、Circリガーゼによってまず環状化し、エキソヌクレアーゼを用いて消化して、環状化されていないオリゴを除去する。次いで、環状化されたオリゴ(CO)を、Phi29X(または同様のもの)などのDNAポリメラーゼおよびローリングサークル増幅(RCA)に必要な試薬とともに、制限希釈によって小滴中にカプセル封入する。オリゴの、RCA産物とのハイブリダイゼーションが、制限酵素によって認識されるdsDNA構造を再構成するように、RCA試薬に加えて、制限酵素およびCOに対して既知相同性の3’がブロックされたオリゴを含める。小滴中でのインキュベーションの間に、増幅および消化が同時および/または逐次起こり、その結果、産物は、主に線形の、COに対して配列相同性を有するssDNAのプールである。このプロセスは、図10に模式的に表されている。
保存された配列に加えて連続または非連続縮重塩基の部分を含有するssDNAオリゴヌクレオチドのプールを、Circリガーゼによってまず環状化し、エキソヌクレアーゼを用いて消化して、環状化されていないオリゴを除去する。次いで、環状化されたオリゴ(CO)を、Phi29X(または同様のもの)などのDNAポリメラーゼおよびローリングサークル増幅(RCA)に必要な試薬とともに、制限希釈によって小滴中にカプセル封入する。オリゴの、RCA産物とのハイブリダイゼーションが、制限酵素によって認識されるdsDNA構造を再構成するように、RCA試薬に加えて、制限酵素およびCOに対して既知相同性の3’がブロックされたオリゴを含める。小滴中でのインキュベーションの間に、増幅および消化が同時および/または逐次起こり、その結果、産物は、主に線形の、COに対して配列相同性を有するssDNAのプールである。このプロセスは、図10に模式的に表されている。
材料/方法:最大150bpのssDNAオリゴを、商業的に合成し、以下:
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用できるようなポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分、
c.Tn5トランスポサーゼ中のロードするための認識配列として使用される既知相同性の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、少なくとも、RCAのプライマー結合部位として働く配列を含有する。
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用できるようなポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分、
c.Tn5トランスポサーゼ中のロードするための認識配列として使用される既知相同性の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、少なくとも、RCAのプライマー結合部位として働く配列を含有する。
ssDNAオリゴを、標準反応バッファー中でEpicentre製のCircリガーゼIIとともにインキュベートして、オリゴを環状化する。環状化されていないオリゴをエキソヌクレアーゼ処理によって消化し、環状化されたオリゴを標準法によって精製する。環状化されたssDNAを、ローリングサークル増幅および制限消化に必要な試薬とともに小滴中にカプセル封入する。試薬として、
(a)Phi29反応バッファー(NEB)またはCutSmartバッファー(NEB)などの適したバッファー、
(b)ウシ血清アルブミン(BSA)、
(c)等温RCAに適した、Phi29または同様のポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ、
(d)dNTP、
(e)制限エンドヌクレアーゼ、
(f)DNA合成のプライマーとして働く環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(g)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、および
(h)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。
(a)Phi29反応バッファー(NEB)またはCutSmartバッファー(NEB)などの適したバッファー、
(b)ウシ血清アルブミン(BSA)、
(c)等温RCAに適した、Phi29または同様のポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ、
(d)dNTP、
(e)制限エンドヌクレアーゼ、
(f)DNA合成のプライマーとして働く環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(g)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、および
(h)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。
反応物を、30℃で少なくとも60分間インキュベートし、続いて、37℃以上で少なくとも15分間インキュベートする。任意選択で、2回のインキュベーションの間に温度を65℃に10分間高めて、Phi29ポリメラーゼを不活性化できる。
あるいは、まず、RCAを行い、次いで、第2に、制限切断を行う2つの別個のステップで、プロセスを行うことができる:
(a)環状化されたssDNAおよびRCAに必要な試薬のみを含有する液滴を作製する。液滴を、30℃で少なくとも60分間インキュベートし、続いて、65℃で10分間加熱する。
(b)切断部位を再構成するための制限エンドヌクレアーゼおよびオリゴならびに/またはTn5ローディング部位を再構成するためのオリゴを、各小滴中にピコインジェクションし、37℃で少なくとも15分間インキュベートする。
(a)環状化されたssDNAおよびRCAに必要な試薬のみを含有する液滴を作製する。液滴を、30℃で少なくとも60分間インキュベートし、続いて、65℃で10分間加熱する。
(b)切断部位を再構成するための制限エンドヌクレアーゼおよびオリゴならびに/またはTn5ローディング部位を再構成するためのオリゴを、各小滴中にピコインジェクションし、37℃で少なくとも15分間インキュベートする。
実施例2(仮想例):小滴におけるデジタルPCRによるdsDNAバーコードの製造および連結-PCRにおけるその使用
少なくとも1種の保存された配列に加えて連続または非連続縮重塩基の部分を含有するssDNAオリゴヌクレオチド(バーコード)のプールを、制限希釈で小滴中にカプセル封入し、PCRによって増幅して、dsDNAバーコードを作製する。次いで、液滴を、DNAまたはRNA核酸を含有する別の液滴と併合し、dsDNAバーコードを、dsDNAバーコードに対する相同性を有するプライマーを使用する連結-PCRまたは連鎖RT-PCRによって、対象のDNA/RNA上にスプライスする。このプロセスは、図11に模式的に表されている。
少なくとも1種の保存された配列に加えて連続または非連続縮重塩基の部分を含有するssDNAオリゴヌクレオチド(バーコード)のプールを、制限希釈で小滴中にカプセル封入し、PCRによって増幅して、dsDNAバーコードを作製する。次いで、液滴を、DNAまたはRNA核酸を含有する別の液滴と併合し、dsDNAバーコードを、dsDNAバーコードに対する相同性を有するプライマーを使用する連結-PCRまたは連鎖RT-PCRによって、対象のDNA/RNA上にスプライスする。このプロセスは、図11に模式的に表されている。
材料/方法:最大100bpのssDNAオリゴを、商業的に合成し、以下:
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(f)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用できるようなポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、PCRのプライマー結合部位として働く少なくとも1種または複数の配列を含有する。
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(f)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用できるようなポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、PCRのプライマー結合部位として働く少なくとも1種または複数の配列を含有する。
ssDNAオリゴを、プライマーとして働くもう1つのオリゴを含むPCRに必要な試薬とともに小滴中にカプセル封入する。プライマーは、以下のうち1種または複数を含有し得る:
(a)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(b)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(c)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(d)5’ビオチン化。
(a)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(b)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(c)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(d)5’ビオチン化。
このPCR反応の産物は、バーコードと呼ばれるdsDNA断片を含有する小滴である。
PCR増幅されたバーコードを含有する小滴を、まず、マイクロ流体操作によって、単一哺乳類細胞に由来し得るDNAまたはRNAを含有する液滴の別個の集団と対形成する。「対形成」は、バーコードを含有する液滴ならびにDNAおよび/またはRNAを含有する液滴の集団を、マイクロ流体デバイスを通して流し、マイクロ流体デバイスが、液滴を指定の割合のバーコードおよびDNA/RNA液滴を含有するグループに整理することを意味する。
次いで、対形成された液滴のこれらのグループを、以下のもの:PCRのプライマーとして働き、dsDNAバーコードとの配列相同性を含有する少なくとも1種のオリゴに加えて、逆転写およびPCRに必要な標準試薬を含有する別個の液滴と電場によって併合する。相同性は、プライマー標的によって増幅された配列のバーコードとの連結-PCRを可能にするのに十分でなくてはならない。
これまでのステップから得た小滴を、連結-PCRによって、各液滴内のDNA/RNA産物が増幅され、各液滴中に存在するdsDNAバーコードと連結されるように、標準条件下で熱サイクルする。
実施例3(仮想例):全トランスクリプトーム増幅のためのOneStep SMARTer+PCR(SMARTONE)およびmRNA分子バーコード付加
全トランスクリプトーム増幅およびmRNA分子バーコード付加のための方法を、図12を参照して、以下に記載する。SMARTer技術は、いくつかの逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性を利用し、これでは、いくつかのシトシンヌクレオチドが、cDNAの3’末端に付加され、dCテールと呼ばれる(1)。逆転写反応物中に、3’末端にリボグアンシンまたはLNA-グアノシンを含有する特異的鋳型交換オリゴ(TSO)が含まれる場合には、オリゴは、dCテールとハイブリダイズし、逆転写のさらなる鋳型として働き、cDNAを伸長させ、相補性TSO配列を3’末端に付加する。さらに、6つの塩基対縮重配列が、TSOオリゴの設計に組み込まれ、その結果、各cDNAが、鋳型交換機序(2)の結果として固有のバーコードを含有し、これらのバーコードは、固有分子識別子(UMI)と呼ばれる。UMIは、下流解析においてmRNAコピー数を正確に定量するために使用し、転写プロファイリングにとって極めて重要である。重要なことに、TSOオリゴ中の保存された配列は、すべてのcDNAに付加され、PCRによる全トランスクリプトーム増幅の共通のプライミング部位として使用できる(4)。
全トランスクリプトーム増幅およびmRNA分子バーコード付加のための方法を、図12を参照して、以下に記載する。SMARTer技術は、いくつかの逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性を利用し、これでは、いくつかのシトシンヌクレオチドが、cDNAの3’末端に付加され、dCテールと呼ばれる(1)。逆転写反応物中に、3’末端にリボグアンシンまたはLNA-グアノシンを含有する特異的鋳型交換オリゴ(TSO)が含まれる場合には、オリゴは、dCテールとハイブリダイズし、逆転写のさらなる鋳型として働き、cDNAを伸長させ、相補性TSO配列を3’末端に付加する。さらに、6つの塩基対縮重配列が、TSOオリゴの設計に組み込まれ、その結果、各cDNAが、鋳型交換機序(2)の結果として固有のバーコードを含有し、これらのバーコードは、固有分子識別子(UMI)と呼ばれる。UMIは、下流解析においてmRNAコピー数を正確に定量するために使用し、転写プロファイリングにとって極めて重要である。重要なことに、TSOオリゴ中の保存された配列は、すべてのcDNAに付加され、PCRによる全トランスクリプトーム増幅の共通のプライミング部位として使用できる(4)。
本明細書に記載されるアプローチは、SMARTONEと呼ばれる、1ステップ、1チューブ反応でのSMARTおよびPCRの統合されたプロセスである。統合された1ステッププロトコールはまた、マイクロ流体液滴の内側で実施して、単細胞トランスクリプトームの1ステップ増幅を可能にできる。
材料/方法:1個または複数の細胞から得た細胞可溶化液または精製された全RNAを、以下:
(a)連続または非連続縮重塩基の部分、
(b)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(c)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(d)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(e)5’ビオチン化
(f)a.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、dNTPおよび少なくともポリT配列を含有するプライマーと混和する。
(a)連続または非連続縮重塩基の部分、
(b)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(c)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(d)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(e)5’ビオチン化
(f)a.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、dNTPおよび少なくともポリT配列を含有するプライマーと混和する。
溶液を、少なくとも72℃に少なくとも3分間加熱する。
SMARTONE試薬を、溶液中に導入する。
(a)10mMから100mMの間の濃度の、Tris-HCL、Tris-Acetateなどといった共通のPCRバッファーからなるpH7.0~8.0の緩衝溶液、
(b)100U~300U SuperScriptII逆転写酵素(Invitrogen)、
(c)ハイフィデリティーDNAポリメラーゼ、
(d)50から100mMの間の濃度のKCl、
(e)6から12mMの間の濃度のMgCl2、
(f)0.2から0.4μMの間のdNTP
(g)2.5から7.5mMの間のDTT
(h)10U RNアーゼOUT(Invitrogen)、
(i)1Mのベタイン
(j)以下の特徴:
のうち1種または複数に加えて、3個以上のグアノシン塩基で終わる既知配列を含む、1μMの鋳型交換オリゴ(TSO)
a.固有分子識別子を含む連続または非連続縮重塩基の部分、
b.メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
c.ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、特に、最も3’のグアノシン塩基、
d.リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
e.5’ビオチン化
f.i.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
(k)1μMの、鋳型交換オリゴおよび/またはポリT逆転写プライマーに対して相同性を有する多くのオリゴプライマーのうちの1種。
(a)10mMから100mMの間の濃度の、Tris-HCL、Tris-Acetateなどといった共通のPCRバッファーからなるpH7.0~8.0の緩衝溶液、
(b)100U~300U SuperScriptII逆転写酵素(Invitrogen)、
(c)ハイフィデリティーDNAポリメラーゼ、
(d)50から100mMの間の濃度のKCl、
(e)6から12mMの間の濃度のMgCl2、
(f)0.2から0.4μMの間のdNTP
(g)2.5から7.5mMの間のDTT
(h)10U RNアーゼOUT(Invitrogen)、
(i)1Mのベタイン
(j)以下の特徴:
のうち1種または複数に加えて、3個以上のグアノシン塩基で終わる既知配列を含む、1μMの鋳型交換オリゴ(TSO)
a.固有分子識別子を含む連続または非連続縮重塩基の部分、
b.メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
c.ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、特に、最も3’のグアノシン塩基、
d.リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
e.5’ビオチン化
f.i.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
(k)1μMの、鋳型交換オリゴおよび/またはポリT逆転写プライマーに対して相同性を有する多くのオリゴプライマーのうちの1種。
したがって、反応物に、
(a)0.1%~最大5%w/vの濃度のPEG MW 6000、
(b)0.1%~最大5%v/vの濃度のTween 20、
(c)最大250μg/mLの濃度のBSA
を含む、性能向上剤を添加できる。
(a)0.1%~最大5%w/vの濃度のPEG MW 6000、
(b)0.1%~最大5%v/vの濃度のTween 20、
(c)最大250μg/mLの濃度のBSA
を含む、性能向上剤を添加できる。
反応物を、以下の条件を用いて熱サイクルする:
実施例4(仮想例):小滴におけるタグメンテーション小滴ライブラリーの製造
この方法では、実施例1、5または6の方法を使用して、液滴中のバーコードを製造する。しかし、この実施では、生成物は、ssDNAではなく、むしろTn5トランスポサーゼ中にロードするのに適したトランスポゾンである。各トランスポゾンは、任意選択の配列に加えて、少なくとも縮重バーコードおよび転位に必要な19塩基対の保存された領域を含有する。次いで、増幅された、消化されたトランスポゾンを含有する小滴を、トランスポサーゼへのトランスポゾンのローディングに適したバッファー中にTn5トランスポサーゼを含有する小滴と併合する。次いで、小滴の集団を、下流適用において使用して、断片化し、その他の小滴中に含有されるDNAにバーコード付与する。
この方法では、実施例1、5または6の方法を使用して、液滴中のバーコードを製造する。しかし、この実施では、生成物は、ssDNAではなく、むしろTn5トランスポサーゼ中にロードするのに適したトランスポゾンである。各トランスポゾンは、任意選択の配列に加えて、少なくとも縮重バーコードおよび転位に必要な19塩基対の保存された領域を含有する。次いで、増幅された、消化されたトランスポゾンを含有する小滴を、トランスポサーゼへのトランスポゾンのローディングに適したバッファー中にTn5トランスポサーゼを含有する小滴と併合する。次いで、小滴の集団を、下流適用において使用して、断片化し、その他の小滴中に含有されるDNAにバーコード付与する。
材料/方法:最大150bpのssDNAオリゴを、商業的に合成し、以下:
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構築するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、少なくとも、RCAのプライマー結合部位としては働く配列およびTn5トランスポサーゼ中にロードするための認識配列として使用される既知配列を含有する。
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構築するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、少なくとも、RCAのプライマー結合部位としては働く配列およびTn5トランスポサーゼ中にロードするための認識配列として使用される既知配列を含有する。
ssDNAオリゴを、標準反応バッファー中でEpicentre製のCircリガーゼIIとともにインキュベートして、オリゴを環状化する。環状化されていないオリゴをエキソヌクレアーゼ処理によって消化し、環状化されたオリゴを標準法によって精製する。
環状化されたssDNAを、ローリングサークル増幅および制限消化に必要な試薬とともに小滴中にカプセル封入する。試薬として、
(a)Phi29反応バッファー(NEB)またはCutSmartバッファー(NEB)などの適したバッファー、
(b)BSA、
(c)等温RCAに適した、Phi29または同様のポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ、
(d)dNTP、
(e)制限エンドヌクレアーゼ、
(f)DNA合成のプライマー結合部位として働く環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(g)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、
(h)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。
(a)Phi29反応バッファー(NEB)またはCutSmartバッファー(NEB)などの適したバッファー、
(b)BSA、
(c)等温RCAに適した、Phi29または同様のポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ、
(d)dNTP、
(e)制限エンドヌクレアーゼ、
(f)DNA合成のプライマー結合部位として働く環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(g)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、
(h)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
が挙げられる。
反応物を、30℃で少なくとも60分間インキュベートし、続いて、37℃以上で少なくとも15分間インキュベートする。任意選択で、2回のインキュベーションの間に温度を65℃に10分間高めて、Phi29ポリメラーゼを不活性化できる。
あるいは、まず、RCAを行い、次いで、第2に、制限切断を行う2つの別個のステップで、プロセスを行うことができる:
(a)環状化されたssDNAおよびRCAに必要な試薬のみを含有する液滴を作製する。液滴を、30℃で少なくとも60分間インキュベートし、続いて、65℃で10分間加熱する。
(b)切断部位を再構築するための制限エンドヌクレアーゼおよびオリゴならびに/またはTn5ローディング部位を再構築するためのオリゴを、各小滴中にピコインジェクションし、37℃で少なくとも15分間インキュベートする。
(a)環状化されたssDNAおよびRCAに必要な試薬のみを含有する液滴を作製する。液滴を、30℃で少なくとも60分間インキュベートし、続いて、65℃で10分間加熱する。
(b)切断部位を再構築するための制限エンドヌクレアーゼおよびオリゴならびに/またはTn5ローディング部位を再構築するためのオリゴを、各小滴中にピコインジェクションし、37℃で少なくとも15分間インキュベートする。
これらの液滴をピコインジェクションする、または
(a)6uM Tn5トランスポサーゼ、
(b)PEG MW 6000最大5%w/v、
(c)Tween 20最大5%v/v、
(d)最大250μg/mLの濃度のBSA、
(e)最大40%v/vの濃度のグリセロール
を含有する溶液と併合する。
(a)6uM Tn5トランスポサーゼ、
(b)PEG MW 6000最大5%w/v、
(c)Tween 20最大5%v/v、
(d)最大250μg/mLの濃度のBSA、
(e)最大40%v/vの濃度のグリセロール
を含有する溶液と併合する。
実施例5(仮想例):小滴における転写連鎖反応(TCR)によるssDNAバーコードの製造
小滴におけるTCRによるssDNAバーコードの製造のための方法を、図13を参照して以下に記載する。T7 RNAポリメラーゼプロモーター領域を含む保存された配列に加えて、連続または非連続縮重塩基の部分を含有するssDNAオリゴヌクレオチドのプールを、TCR試薬とともに、制限希釈によって液滴中にカプセル封入する(1)。T7 RNAポリメラーゼは、まず、ssDNAオリゴの相補体を数千コピーに転写する(2)。次いで、逆転写酵素および特異的逆転写プライマーが、各RNAコピーをcDNAに変換し、これは、元のバーコードのssDNAコピーである。上記の実施例3に記載したSMART技術を使用して、T7プロモーター配列を、各cDNAの末端と結合し(3)、その結果、T7 RNAポリメラーゼ媒介性転写のさらなる鋳型として働くことが可能となる。プロセスの最後に、熱またはRNアーゼを使用して、RNA成分を分解し、元のオリゴのssDNAコピーのみを残す(4)。
小滴におけるTCRによるssDNAバーコードの製造のための方法を、図13を参照して以下に記載する。T7 RNAポリメラーゼプロモーター領域を含む保存された配列に加えて、連続または非連続縮重塩基の部分を含有するssDNAオリゴヌクレオチドのプールを、TCR試薬とともに、制限希釈によって液滴中にカプセル封入する(1)。T7 RNAポリメラーゼは、まず、ssDNAオリゴの相補体を数千コピーに転写する(2)。次いで、逆転写酵素および特異的逆転写プライマーが、各RNAコピーをcDNAに変換し、これは、元のバーコードのssDNAコピーである。上記の実施例3に記載したSMART技術を使用して、T7プロモーター配列を、各cDNAの末端と結合し(3)、その結果、T7 RNAポリメラーゼ媒介性転写のさらなる鋳型として働くことが可能となる。プロセスの最後に、熱またはRNアーゼを使用して、RNA成分を分解し、元のオリゴのssDNAコピーのみを残す(4)。
材料/方法:最大100bpのssDNAオリゴを、商業的に合成し、以下:
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1種、
(f)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用することをもたらすポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、転写開始部位として働く少なくとも1種または複数の配列を含有する。
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1種、
(f)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用することをもたらすポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、転写開始部位として働く少なくとも1種または複数の配列を含有する。
(a)以下:
a.メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
b.ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、特に、最も3’のグアノシン塩基、
c.リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、特に、第2および第3の最も3’のグアノシン塩基
d.5’ビオチン化
のうち1種または複数を含有し得る、dsDNA T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)プロモーターを再構成し、また、鋳型交換オリゴ(TSO)として働くオリゴ、
(b)T7 RNAポリメラーゼ、
(c)スーパースクリプトIIなどの逆転写酵素、
(d)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)、
(e)リボヌクレオチド(rNTP)、
(f)ハイブリダーゼ(熱安定性RNアーゼH)、
(g)制限エンドヌクレアーゼ、
(h)逆転写酵素によるcDNA合成のプライマーとして働くssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(i)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成するssDNAに対して相同性を有するオリゴ。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、
(j)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成するssDNAに対して相同性を有するオリゴ
を含む、TCRに必要な試薬とともに、ssDNAオリゴを小滴中にカプセル封入する。
a.メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
b.ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、特に、最も3’のグアノシン塩基、
c.リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、特に、第2および第3の最も3’のグアノシン塩基
d.5’ビオチン化
のうち1種または複数を含有し得る、dsDNA T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)プロモーターを再構成し、また、鋳型交換オリゴ(TSO)として働くオリゴ、
(b)T7 RNAポリメラーゼ、
(c)スーパースクリプトIIなどの逆転写酵素、
(d)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)、
(e)リボヌクレオチド(rNTP)、
(f)ハイブリダーゼ(熱安定性RNアーゼH)、
(g)制限エンドヌクレアーゼ、
(h)逆転写酵素によるcDNA合成のプライマーとして働くssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(i)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成するssDNAに対して相同性を有するオリゴ。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、
(j)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成するssDNAに対して相同性を有するオリゴ
を含む、TCRに必要な試薬とともに、ssDNAオリゴを小滴中にカプセル封入する。
反応物を42℃で少なくとも60分間インキュベートする。あるいは、反応物を以下のように熱サイクルできる:
最後に、反応温度を65℃に上げて、RNA分解を可能にする。このTCR反応の産物は、バーコードと呼ばれるdsDNA断片を含有する小滴である。あるいは、まず、TCRを行い、次いで、第2に、制限切断を行う2つの別個のステップで、プロセスを行うことができる。
実施例6(仮想例):小滴におけるローリングサークル転写連鎖反応(rcTCR)によるssDNAバーコードの製造
小滴におけるローリングサークル転写連鎖反応(rcTCR)によるssDNAバーコードの製造の方法を、図14を参照して、以下に記載する。
小滴におけるローリングサークル転写連鎖反応(rcTCR)によるssDNAバーコードの製造の方法を、図14を参照して、以下に記載する。
T7 RNAポリメラーゼプロモーター領域を含む保存された配列に加えて連続または非連続縮重塩基の部分を含有するssDNAオリゴヌクレオチドのプールを、Circリガーゼによってまず環状化し、エキソヌクレアーゼを用いて消化して、環状化されていないオリゴを除去する(1)。次いで、環状化されたオリゴ(CO)を、rcTCR試薬とともに、制限希釈によって小滴中にカプセル封入する。T7 RNAポリメラーゼは、まず、COの相補体を転写し、CO逆相補配列の数百~数千リピートを含む長い線形コンカテマーを作製する(2)。次いで、逆転写酵素および特異的逆転写プライマーが、RNAコンカテマー(concatmer)に沿っていくつかの部位から逆転写して、ssDNAの長い鎖を製造する(3)。さらなるプライマーを使用して、これらの線形ssDNA産物の内側にT7 プロモーターを再構成して、転写を開始し、多くのssRNA鋳型を製造する(5)。最後に、熱またはRNアーゼHを使用して、RNA成分を分解し、並行して、または逐次、制限消化を使用して、長いssDNAを単一ssDNAバーコードに切断する(6)。
材料/方法:最大100bpのssDNAオリゴを、商業的に合成し、以下:
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(f)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用できるようなポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分、
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、転写開始部位として働く、少なくとも1種または複数の配列を含有する。
(a)連続または非連続縮重塩基(バーコード)の部分、
(b)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA構造を再構成するプライマー結合部位として働く配列、
(c)メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
(d)ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
(e)リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
(f)a.逆転写プライマーとしてポリTバーコードを使用できるようなポリA配列、
b.PCRまたは連結連鎖反応(LCR)のプライマー結合に適した既知配列の部分、
を含む、分子生物学アッセイにとって重要なその他の配列
のうち1種または複数に加えて、転写開始部位として働く、少なくとも1種または複数の配列を含有する。
ssDNAオリゴを、標準反応バッファー中でEpicentre製のCircリガーゼIIとともにインキュベートして、オリゴを環状化する。環状化されていないオリゴをエキソヌクレアーゼ処理によって消化し、環状化されたオリゴを標準法によって精製する。
(a)以下:
a.メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
b.ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
c.リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
d.5’ビオチン化
のうち1種または複数を含有し得る、dsDNA T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)プロモーターを再構成するオリゴ、
(b)T7 RNAポリメラーゼ、
(c)スーパースクリプトIIなどの逆転写酵素、
(d)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)、
(e)リボヌクレオチド(rNTP)、
(f)ハイブリダーゼ(熱安定性RNアーゼH)、
(g)制限エンドヌクレアーゼ、
(h)逆転写酵素によるcDNA合成のプライマーとして働く、環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(i)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、
(j)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
を含む、TCRに必要な試薬とともに、環状化されたssDNAを小滴中にカプセル封入する。
a.メチル化によって修飾された1つまたは複数の塩基、
b.ロックド核酸である1つまたは複数の塩基、
c.リボヌクレオチドである多くの塩基のうちの1つ、
d.5’ビオチン化
のうち1種または複数を含有し得る、dsDNA T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)プロモーターを再構成するオリゴ、
(b)T7 RNAポリメラーゼ、
(c)スーパースクリプトIIなどの逆転写酵素、
(d)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)、
(e)リボヌクレオチド(rNTP)、
(f)ハイブリダーゼ(熱安定性RNアーゼH)、
(g)制限エンドヌクレアーゼ、
(h)逆転写酵素によるcDNA合成のプライマーとして働く、環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ、
(i)制限エンドヌクレアーゼによって認識されるdsDNA配列を再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ。このオリゴを以下の方法で修飾できる:
a.ジデオキシ塩基、3’スペーサーまたはロックド核酸などの、DNA合成を遮断するための3’修飾の組込み、
b.切断をモニタリングするための3’/5’フルオロフォアおよび/または3’/5’クエンチャーの組込み、
(j)Tn5トランスポサーゼ中にロードするための機能的dsDNAエレメントを再構成する環状化されたssDNAに対して相同性を有するオリゴ
を含む、TCRに必要な試薬とともに、環状化されたssDNAを小滴中にカプセル封入する。
反応物を、42℃で少なくとも60分間インキュベートする。あるいは、反応物を以下のように熱サイクルできる:
最後に、反応温度を65℃に上げて、RNA分解を可能にする。このTCR反応の産物は、バーコードと呼ばれるdsDNA断片を含有する小滴である。あるいは、まず、rcTCRを行い、次いで、第2に、制限切断を行う2つの別個のステップで、プロセスを行うことができる。
実施例7(仮想例):実行
SMARTONE連結-PCR:この方法では、実施例1または2に従って細胞性バーコードを製造し、SMARTONE(実施例3)のPCRステップによってcDNAの5’および3’末端上にスプライスする。この実施では、TSOオリゴ中へのUMIの組込みを使用して、分子レベルでmRNAにバーコード付加する。
SMARTONE連結-PCR:この方法では、実施例1または2に従って細胞性バーコードを製造し、SMARTONE(実施例3)のPCRステップによってcDNAの5’および3’末端上にスプライスする。この実施では、TSOオリゴ中へのUMIの組込みを使用して、分子レベルでmRNAにバーコード付加する。
cDNA末端タグおよび捕獲(DEToCs):この方法では、細胞性DNAバーコードをローリングサークル増幅(RCA)によって製造し、逆転写プライマーとして使用し、その結果、単一ステップでDNAバーコードを、各cDNAと結合する。
DeToCs+SMARTONE:この方法では、細胞性DNAバーコードを、ローリングサークル増幅(RCA)によって製造し、逆転写プライマーとして使用し、その結果、単一ステップでDNAバーコードを各cDNAと結合する。さらに、SMARTONE(実施例3)を使用し、UMIを含めて、または含めずに、バーコード付加されたトランスクリプトームを増殖する。
SMARTONE+トランスクリプトームタグおよび捕獲:この方法では、SMARTONEを使用して、全トランスクリプトーム(UMI任意選択)を増幅する。次いで、全トランスクリプトームを含有する小滴を、NextEra試薬を含有する液滴と併合し、タグメンテーションする。次いで、これらの液滴を、実施例1または2に従って製造した細胞性バーコードを含有する液滴と併合し、連結-PCRを使用して、タグメンテーションされたトランスクリプトームを、プライマーとしてバーコードを使用して増幅する。
1ステップ全トランスクリプトームタグおよび捕獲:この方法では、実施例4に従ってタグメンテーション小滴ライブラリーを作製し、SMARTONE(実施例3)を使用して行われた全トランスクリプトーム増幅を含有する液滴と併合する。
前記の発明を、理解の明確さのために例示および例によって幾分か詳細に記載したが、本開示の教示を鑑みて、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱せずに、特定の変更および修飾を行ってもよいということは当業者には容易に明らかである。
実施例8:次世代シーケンシングのための単一DNA鋳型の断片化およびバーコード付加
ほとんどのゲノムは、核酸の数百万から数十億の塩基対を含み、一般に、ゲノムについて情報の最大量を得ることは、ゲノム規模で、どの塩基対もシーケンシングすることおよび塩基が一緒に接続している方法を知ることを必要とする。しかし、塩基あたり最低コストを提供する既存のシーケンシング技術も、数十~数百の塩基対の長さの「短い」リードの形態の配列を獲得する。結果として、短いリードの技術を使用して、長い分子または全ゲノムをシーケンシングする場合に、短いリードを長いリードにステッチするために、相当なバイオインフォマティック解析が必要である。
ほとんどのゲノムは、核酸の数百万から数十億の塩基対を含み、一般に、ゲノムについて情報の最大量を得ることは、ゲノム規模で、どの塩基対もシーケンシングすることおよび塩基が一緒に接続している方法を知ることを必要とする。しかし、塩基あたり最低コストを提供する既存のシーケンシング技術も、数十~数百の塩基対の長さの「短い」リードの形態の配列を獲得する。結果として、短いリードの技術を使用して、長い分子または全ゲノムをシーケンシングする場合に、短いリードを長いリードにステッチするために、相当なバイオインフォマティック解析が必要である。
短いリードの収集物から長い分子またはゲノムを組み立てる場合には、一般に、最良の組み立てを決定することは、各反復において、ライブラリー中のどのリードも調べることによってのみ可能であるので、組み立ての複雑性は、ライブラリー中のリードの数につれて指数関数的に上がる。アルゴリズムを使用して、このプロセスをできる限り賢明に、効率的に実施できるが、リードが小さいほど、試験するリード数が大きいほど、組み立てはより困難である。結果として、リード長を増大するための技術が、再組み立てのタスクを大幅に簡略化し、ハプロタイプなどの短いリード技術には到達できない情報の回収を可能にする。
最大100kbの長さの分子のディープシーケンシングを可能にする技術が本明細書において記載される。単一分子ディープシーケンシング(SMDS)と呼ばれるこの技術では、最大100kbの長い個々の分子を、小滴中にカプセル封入し、増幅し、断片化し、バーコード付加する(図1)。PCRまたはMDAを使用して、小滴中の各分子を増幅することによって、本発明者らは、単一分子の多数のコピーを作り出し、これをシーケンシングして、PCRまたはシーケンシングにおけるエラーを平均する「ディープシークエンス」クラスターを作り出すことができる。さらに、小滴中の分子を断片化し、バーコード付加することによって、本発明者らは、入手可能な、低コストである、一方で、長い単一分子に対応するリードを集約する能力を依然として有し、失敗する傾向がある組み立てアルゴリズムに頼らない技術を使用して、シーケンシング可能な短いリードを作製する(図21)。
SMDSは、3つの主な分子生物学ステップ:(1)単一分子のデジタル増幅(図22、ステップ1)、(2)分子を断片化し、ユニバーサル増幅アダプターを結合するタグメンテーション(図22、ステップ2)および(3)オーバーラップエクステンションPCR(SOE-PCR)によるスプライシングを用いるバーコード付加を使用して、バーコードを、タグメンテーションされた断片と結合する(図22、ステップ3)。別個のマイクロ流体デバイス、ステップ1のための小滴生成機、ステップ2のためのスプリット-併合デバイスおよびステップ3のための二重小滴併合デバイスを使用して、これらのステップのそれぞれを実施する。さらに、出発小滴、その分割部分および併合される小滴の容量を、注意深く制御して、核酸、必要な試薬および酵素の濃度が、最高品質のデータを提供する効率的な反応を生じさせるのに必要されるレベルであることを確実にする。
SMDSプラットフォームによって提供されるデータは、断片分子、アダプターなどの配列に加えて、小滴中の単一分子に対応するすべてのリードの曖昧でないクラスター化を可能にする、小滴中の分子に付加されるバーコードの配列もある点を除いて、正常な配列データの形態になる。バーコードは、リードを単一分子グループに正確にクラスター化するために使用されるので、バーコード構造は重要である。バーコードを、ユニバーサルなプライミング部位がその両端に位置するランダマーの収集物として化学的(IDT)に合成する。バーコード核酸分布は、塩基対組成においてかなり均一であり、化学合成技術に特有である、図23、上部左。バーコード配列は、約15bpを含み、約109の固有の順列がある。SMDSでは、全部で約100,000分子が現在シーケンシングされ、その結果、この空間の約0.001%がサンプリングされる。この数は、実質的に増大するが、埋め合わせるためにバーコードの長さを増大できる。そのようなものとして、バーコードが2回使用される可能性は小さいが、大きな数の分子をシーケンシングする場合には起こり得る。さらに、それで順列空間がサンプリングされる低密度によって、互いに最大ハミング距離を有する配列の選択が可能となる、図23、上部右。これによって、特定のバーコード配列が、その中にエラーを有する場合でさえ、別のバーコードグループ中に「突然変異する」可能性は低く、そうではなく、突然変異したバーコードを有する1つのリードだけを含む新規グループを作製する可能性がかなり高いことが確実となる。さらに、突然変異体バーコードを、すべてのその他のバーコードグループと比較して、属する可能性が最も高い、それに対して最大の配列相同性を有するものを同定することによってクラスター中にこれらの「オーファン」バーコードを「採用する」ことが可能である。
系を試験するために、SMDSを、2種のβグルコシダーゼ変異体の多数のコピーを含むサンプルで実施した。
材料/方法:出発材料-固定された長さの既知PCR産物。
ステップI.カプセル封入およびPCRによる増幅
(1)PCRカクテル(合計100μL)
50μL Phusion 2x hotstart MM(NEB:M0536)
2μLプライマー(10μm)
XμL鋳型(0.003pMの最終濃度まで)
4μL PEG6000(50%W/V)
4μL Tween-20(50%V/V)
XμL 100μLの最終容量までのH2O
(2)PCRカクテルを、30μm×35μmフロー集束小滴併合中にロードした。オイルポンプを600μL/時で実行し、水性ポンプを500μL/時で約10分間実行した。PCRチューブ中にエマルジョンを集め、熱サイクルした:35サイクルについて、98℃ 3分、(98℃ 15秒、60℃ 20秒、72℃ 4分)。
ステップI.カプセル封入およびPCRによる増幅
(1)PCRカクテル(合計100μL)
50μL Phusion 2x hotstart MM(NEB:M0536)
2μLプライマー(10μm)
XμL鋳型(0.003pMの最終濃度まで)
4μL PEG6000(50%W/V)
4μL Tween-20(50%V/V)
XμL 100μLの最終容量までのH2O
(2)PCRカクテルを、30μm×35μmフロー集束小滴併合中にロードした。オイルポンプを600μL/時で実行し、水性ポンプを500μL/時で約10分間実行した。PCRチューブ中にエマルジョンを集め、熱サイクルした:35サイクルについて、98℃ 3分、(98℃ 15秒、60℃ 20秒、72℃ 4分)。
ステップI(代替法)。MDAによる増幅(以下のプロトコールを、上記のステップ1の代替法として使用できる。
(1)MDAミックス(Repli-G単細胞キットからの試薬-Qiagenカタログ150343)を調製する
3μL D2バッファー(1:11 DTTおよびDLB)
4μL H2Oおよび鋳型DNA
65℃に10分間加熱、次いで
3μl μL停止バッファー
14.5μLポリメラーゼバッファー
1μLポリメラーゼ
4.5μL H20
を加える。
(1)MDAミックス(Repli-G単細胞キットからの試薬-Qiagenカタログ150343)を調製する
3μL D2バッファー(1:11 DTTおよびDLB)
4μL H2Oおよび鋳型DNA
65℃に10分間加熱、次いで
3μl μL停止バッファー
14.5μLポリメラーゼバッファー
1μLポリメラーゼ
4.5μL H20
を加える。
(2)カクテルを30μm×35μmフロー集束小滴併合中にロードする。オイルポンプを600μL/時で実行し、水性ポンプを500μL/時で約10分間実施する。PCRチューブ中にエマルジョンを集め、30℃で6時間インキュベートし、続いて、70℃で10分間加熱して死滅させる。
ステップII.液滴における鋳型の断片化(このステップは、NEBnext Ion Torrentライブラリー調製キット(E6285)に由来する酵素を使用する)であり、図16に模式的に表されている。
(1)断片化カクテル(90μL)を調製する
10μLフラグメンターゼバッファー
7.5μLフラグメンターゼ酵素ミックス
72.5μL H2O
(1)断片化カクテル(90μL)を調製する
10μLフラグメンターゼバッファー
7.5μLフラグメンターゼ酵素ミックス
72.5μL H2O
(2)断片化カクテルおよび熱サイクルされた液滴を、液滴併合デバイス中にロードし、オイル:100μL/時、スペーサー:300μL/時、液滴:100μL/時、フラグメンターゼカクテル:100μL/時で実行する。実行は、約50分かかった。PCRチューブ中にエマルジョンを集め、25℃で15分間、次いで、70℃で10分間インキュベートする。
液滴併合デバイスは、同一の大きさの新しい液滴が得られるように、注入された液滴の1/10をとり、注入された液滴の9/10の大きさの新しい液滴と併合する。
実行時間は、流速を増大することによって短縮できる。
集められる液滴は、注入された液滴とおよそ同一の大きさでなくてはならず、総エマルジョン容量は、元のものの約80~90%でなくてはならない。
ステップIII.液滴中でのユニバーサルアダプターの連結(このステップ中の酵素は、ステップIIと同一キットに由来するものであった)。このステップは、図17に模式的に表される。
(1)アダプター連結カクテル(90μL)を調製する
10μL リガーゼバッファー
4μL ユニバーサルアダプター(80μmストック)
10μL T4リガーゼ(キットに由来する酵素、濃度不明)
2.5μL Bst Pol(キットに由来する酵素、濃度不明)
73.5μL H2O
(1)アダプター連結カクテル(90μL)を調製する
10μL リガーゼバッファー
4μL ユニバーサルアダプター(80μmストック)
10μL T4リガーゼ(キットに由来する酵素、濃度不明)
2.5μL Bst Pol(キットに由来する酵素、濃度不明)
73.5μL H2O
(2)ステップIIから得られた液滴を、シリンジ中にロードし、アダプター連結カクテルを用いてステップII(2)を反復した。得られたエマルジョンを25℃で15分間および65℃で5分間インキュベートした。アダプターは、2個のホスホリルチオエート化塩基の3’オーバーハングを含んでいた。
ステップII~III。(代替法)Tn5トランスポゾンを使用するタグメンテーション。この代替ステップ/複数のステップは、図18に表わされている。
このステップは、超活性Tn5トランスポゾンを使用して、同時に、DNAを断片化し、アダプターを付加する。Tn5トランスポゾンおよびアダプターは、Illumina Nexteraキットから得ることができる、またはその開示内容が参照によりその全文がすべての目的のために組み込まれるAdeyら、「Rapid,Low-Input,Low-Bias Construction of Shotgun Fragment Libraries by High-Density in VitroTranssposition」Genome Biology.2010年、第11巻:R119に記載されるように作製できる。
(1)タグメンテーションマスターミックス(50μL)を調製する
25μL TDバッファー
2μL PEG6000(50%W/V)
2μL Tween-20(50%V/V)
16μL H2O
5μL 酵素
25μL TDバッファー
2μL PEG6000(50%W/V)
2μL Tween-20(50%V/V)
16μL H2O
5μL 酵素
(2)タグメンテーションカクテルおよび熱サイクルされる液滴を液滴併合デバイス中にロードし、デバイスを、オイル:100μL/時、スペーサー:300μL/時、液滴:100μL/時、フラグメンターゼカクテル:100μL/時で実行する。実行には、約50分かかる。PCRチューブ中にエマルジョンを集め、55℃で10分間、次いで、70℃で20分間インキュベートする。
液滴併合は、同一の大きさの新しい液滴が得られるように、注入された液滴の1/10をとり、注入された液滴の9/10の大きさの新しい液滴と併合する。
実行時間は、流速を増大することによって短縮できる。
集められる液滴は、注入された液滴と同一の大きさでなくてはならず、総エマルジョン容量は、元のものの約80~90%でなくてはならない。
ステップIV.バーコードEcoliまたはバーコードプラスミドを使用するバーコードのSOE-PCR。このステップは、図19に模式的に表されている。
(1)SOE-PCRカクテル(90μl)を調製する
50μL Platinum Multiplex PCRマスターミックス(Invitrogen 4464268)
2μL プライマーA(10μm)
2μL プライマーB(10μm)
4μL プライマーC(0.1μm)(任意選択)
XμL バーコード保持大腸菌(2×106/mL最終濃度に)
4μL PEG6000(50%W/V)
4μL Tween-20(50%V/V)
XμL 90μL総容量までのH2O
(1)SOE-PCRカクテル(90μl)を調製する
50μL Platinum Multiplex PCRマスターミックス(Invitrogen 4464268)
2μL プライマーA(10μm)
2μL プライマーB(10μm)
4μL プライマーC(0.1μm)(任意選択)
XμL バーコード保持大腸菌(2×106/mL最終濃度に)
4μL PEG6000(50%W/V)
4μL Tween-20(50%V/V)
XμL 90μL総容量までのH2O
バーコードライブラリーは、大腸菌中の高コピー数プラスミドにある。これを使用して、1よりも多いコピーのバーコードを各液滴中に導入して、より高い鋳型数でPCRを勢いよく開始する。プラスミド上のバーコードを使用することは、ただ単一コピーのバーコードを使用することに対して任意選択であり得る。
(2)ステップIIIから得られた液滴を、液滴併合デバイス中にロードし、SOE-PCRカクテルを用いてステップIII(2)を反復した。反応物を、95℃ 5分、(95℃ 15秒、60℃ 60秒、72℃ 60秒)、サイクル22×、72℃ 5分で熱サイクルした。
(3)25μLの2,2-ペルフルオロオクタノールを添加することによってエマルジョンを破壊した。
(4)DNAクリーンアップカラムを使用して、DNAを精製した。
(4)DNAクリーンアップカラムを使用して、DNAを精製した。
この時点で、DNAは、断片、アダプターが連結した断片およびバーコードが付加された断片の混合物であった。バーコードが付加された断片は、Illuminaフローセルでクラスターを作製するのに必要な配列を含有する。このDNA混合物をシーケンサーに直接送ることができる。
ステップIV(代替法):増幅されたバーコード液滴を使用するバーコードのSOE-PCR
(1)SOE-PCRマスターミックスを調製する
125μL Platinum Multiplex PCRマスターミックス(Invitrogen 4464268)
5μL プライマーA+C(10μm)
Illuminaカタログからの5μL バッファーNT(FC-131-1024)
5μL PEG6000(50%W/V)
5μL Tween-20(50%V/V)
5μL Bst2.0ポリメラーゼ(NEBカタログM0538)
100μL H2O
(1)SOE-PCRマスターミックスを調製する
125μL Platinum Multiplex PCRマスターミックス(Invitrogen 4464268)
5μL プライマーA+C(10μm)
Illuminaカタログからの5μL バッファーNT(FC-131-1024)
5μL PEG6000(50%W/V)
5μL Tween-20(50%V/V)
5μL Bst2.0ポリメラーゼ(NEBカタログM0538)
100μL H2O
(2)SOE PCRマスターミックス、バーコード液滴およびステップIIIから得られた液滴を、二重液滴併合デバイス中にロードし、デバイスを、オイル:700μL/時、スペーサー:150μL/時、バーコード液滴:35μL/時、断片化されたDNA液滴:70μL/時、SOE PCRマスターミックスカクテル:600μL/時で実行する。実行には、約50分かかる。PCRチューブ中にエマルジョンを集め、65℃ 5分、95℃ 2分、(95℃ 15秒、60℃ 60秒、72℃ 60秒)、サイクル8×、72℃ 5分で熱サイクルする。
(3)25μLの2,2-ペルフルオロオクタノールを添加することによってエマルジョンを破壊する。
(4)DNAクリーンアップカラムを使用して、DNAを精製する。
この時点で、DNAは、断片、アダプターが連結した断片およびバーコードが付加された断片の混合物である。バーコードが付加された断片は、Illuminaフローセルでクラスターを作製するのに必要な配列を含有する。このDNA混合物をシーケンサーに直接送ることができる。
ステップV.断片-バーコードについてのPCR濃縮およびシーケンシングのためのサイズ選択
(1)濃縮PCRカクテル(100μL)を調製する
50μL Kapa 2× Hotstart Readymix(KapaBiosystems KK2601)
1μL プライマーP5(10μm)
1μL プライマーP7(10μm)(これらは、Illumina製のP5およびP7配列である)
XμL ステップIVから得たDNA(合計1ng)
XμL 100μLまでのH2O
(1)濃縮PCRカクテル(100μL)を調製する
50μL Kapa 2× Hotstart Readymix(KapaBiosystems KK2601)
1μL プライマーP5(10μm)
1μL プライマーP7(10μm)(これらは、Illumina製のP5およびP7配列である)
XμL ステップIVから得たDNA(合計1ng)
XμL 100μLまでのH2O
98℃ 3分、(98℃ 10秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒)、14サイクル、72℃ 5分で熱サイクルした。
(2)アガロースゲル、AmpureXPビーズ(または代わりに、Pippin Prep)を使用して、400~1000bpの断片を大きさ選択して、シーケンシングの準備のできたライブラリーを提供する。図20は、バーコード付加された断片の模式図を提供する。
結果:SMDSによって生成したデータを特性決定するために、それに対する特定のバーコードグループの大きさが観察される、リード数のヒストグラムをプロットした。例えば、オーファンバーコードのために、採用が実施されない場合には、1つのリードに対応する大きな数のバーコードグループとなる。図23において、これらの1リードバーコードグループが観察される回数は、1のx軸値に対するプロットのy軸値である。このプロットから、実際、比較的大きな数の1リードバーコードグループがあり、ヒストグラムが、1~50の大きさのバーコードグループから鋭く落ちることがわかる。50~250の間では、これらのグループに属する観察されるリードの数は、比較的一定であり、次いで、大きなバーコードグループについては落ちる。これは、飽和状態までサンプリングされていない多数の大きなバーコードグループがあり、より多くのシーケンシングが実施される場合には、これらの大きなグループに関してより有用なデータを得ることができることを示唆する。図23挿入図においてバーコードグループ番号の関数としてのリードの数がプロットされており、バーコードグループの間で、それから得られたリードの数において比較的大きな変動があるということを示す。これは、一部は、自然なサンプリングノイズによるものであり、さらに、プロセスの際に生じたバイアスによるものであり得、その結果、いくつかのバーコードグループが、その他のものよりもサンプル中に、より大きな割合の総リードを含み、したがって、常により頻繁に観察される。
バーコードグループから得られた配列を正確に再構築する方法の能力を評価するために、新規アセンブラーを使用して、各バーコードグループについてコンティグを組み立てた。組み立てたのち、いくつかの分子が鋳型の両方にマッピングされることがわかり、これは、図24上部に示されるように、それらが中で処理された小滴が両方の鋳型を含有していた可能性が高いことを意味する。これは、二重カプセル封入またはその間に合体が起こり得る、マイクロ流体ワークフローまたは熱ステップの際の断片の移動によるものであり得る。データのおよそ3分の1は、鋳型の一方のみに確信をもってマッピングされ、これは、ただ1つの分子を含有していた小滴を示す。時に、複数の分子が、最終的に単一小滴中に行くことがあるが、これが起こる割合は、カプセル封入ステップの際に標的を希釈することによって任意に低減でき、その結果、どの満たされた小滴についても、より多くの空の小滴が生成する。これは、試薬を浪費するが、どの小滴についても真に単一分子配列が望まれる場合には望ましい取引であり得る。それにもかかわらず、複数の分子が処理される場合であっても、リードは、依然としてバーコードによってグループ化され得、所与のバーコードグループについて、少数の個別のコンティグに再組み立てされることを必要とする短いリードのサンプルを提供する。これは、必ずしも望ましいわけではないが、短いリードの収集物が、巨大な数の元の断片を含む単一「クラスター」に由来するシーケンシングにおいて現在基準であるものと同様である。しかし、現在利用可能なシーケンシング法との関連でコンティグを組み立てることは、現在記載されている小滴バーコード付加が使用される場合よりもより困難である。したがって、これらの場合でさえ、区画化された用量において反応を実施することは、再組み立てを大きく単純化するはずである。
各バーコードグループに新規アセンブラーが適用された後、得られたコンティグの収集物が得られ、図24、下側左にその長さのヒストグラムがプロットされている。ヒストグラムにおいて、既知鋳型分子の長さを軸とする2つの鋭いピークが、明確に見られ、標的よりも小さいまたは大きいコンティグを表す肩も同様である。これらのコンティグは、シーケンシングエラーまたは完全な組み立てを妨げた不完全なデータのいずれかによる不正確な組み立てに対応する。これは、新規組み立てを実施する場合の既知課題-これらのアルゴリズムが失敗することが多い-であり、バーコード付加を使用して単一分子を深くシーケンシングする力を強調する。ライブラリーの、より深いシーケンシングを用いれば、このヒストグラムが進化し、おそらくはより鋭いピークを生じる。
出発分子の配列が公知であったので、それらを公知の参照と直接比較することによって、図24、下部右において塩基位置の関数としてPhredスコアとしてプロットされる、組み立ての正確性を評価することが可能であった。すべての再構成について高い平均Phredスコアが得られ、これは、各(reach)分子について得られた多種多様のカバー率による可能性が高く、これによって、増幅およびシーケンシングエラーの補正が可能となる。
実施例9:ゲノム断片のSMDS
現実的なシーケンシングタスクを実施するためのSMDSの有用性を実証するために、大腸菌ゲノムDNAの多様な断片をシーケンシングするために使用した、図25。
現実的なシーケンシングタスクを実施するためのSMDSの有用性を実証するために、大腸菌ゲノムDNAの多様な断片をシーケンシングするために使用した、図25。
材料/方法:DNAを約5~10kbの長さに断片化し、次いで、SMDSを用いて処理した。実施例9に記載される試験系とは対照的に、この実験では、バーコード付加ステップに先立って、複数の置換増幅を使用して標的を増幅した。MDAは、SMDSの強力なツールであり、分子を非特異的に増幅できる、熱サイクルを必要としないので、PCRに対して利点を有する。さらに、10kbの長さ上回る分子では、PCRの効率は急速に落ちるが、MDAは、>10kb塩基の長さの分子を増幅できる。SMDSでは、「リードの長さ」を制限する主要な因子は、一般に、増幅ステップであり、PCRからMDAに切り替えることによって、アプローチのリードの長さを効果的に増大できる。
SMDSプロセスを、大腸菌DNAで実施し、同様のバイオインフォマティック解析を、実施例8の2鋳型実験におけるように実施し、バーコードグループをクラスター化し、あまりもの低密度にサンプリングされているグループを除去し、十分なサンプリングを有するグループで新規組み立てを実施した。
結果:得られた断片の長さ分布のヒストグラムが、図25、左に提供されている。ヒストグラムは、比較的広がっており、5~8kbで一定であり、これらの長さは十分に表されていることを実証する。しかし、データ中に、多数回観察されたコンティグに対応するいくつかの鋭いピークがある。これらのコンティグは、これらのコンティグが、そうではなく予測されるものよりも多く存在する偏ったライブラリーをもたらす、プロセスの間のライブラリーの調製または小滴の併合におけるバイアスによる場合がある。それにもかかわらず、ヒストグラムは、方法を用いて多数の長い分子がシーケンシングされたことを示す。配列が正確であるか否かを決定するために、それらを、大腸菌ゲノムと参照と比較して、配列類似性算出を実施した。約400分子がゲノムにマッピングされず、これは、おそらくは、その他の供給源からの汚染DNAを表し、約1000分子が大腸菌に対するマッチであったことがわかった。これは、SMDSを用いるMDAは、PCRを用いて作製できないより長い分子を正確にシーケンシングするための有効な、強力な方法であることを実証した。
実施例10:単細胞小滴バーコード付加を用いる、ペアード抗体重鎖および軽鎖のシーケンシング
単細胞内の特定の配列を相互に関連付ける実施例は、抗体またはT細胞レパートリーのシーケンシングにおいて重要である。抗体およびT細胞受容体は、それぞれ、別個に翻訳される、一緒に結合している2種のタンパク質から構成される。抗体では、重鎖および軽鎖は、抗体の結合ポケットが、2鎖を接合するフォールディングにあるように、一緒に組み立てられる。人のレパートリーを特性決定することは、自己免疫疾患を研究し、抗体ベースの療法を同定するために重要であるが、レパートリー中にそれぞれ固有の抗体を発現する巨大な数のB細胞があるために、また、各抗体について詳細な情報を得ることが、各細胞について重鎖および軽鎖両方をシーケンシングすることを必要とするので困難である。これは、細胞が溶解される場合には、その転写物が拡散し、その他の細胞のものと混和し得、やはり、対形成情報の喪失をもたらすので、既存の方法を用いて行うのは困難である。これは、単細胞をウェルまたはマイクロ流体チャンバー中に単離することによって克服できるが、このような方法は、数十または数百個の細胞にしか拡大可能ではない。
単細胞内の特定の配列を相互に関連付ける実施例は、抗体またはT細胞レパートリーのシーケンシングにおいて重要である。抗体およびT細胞受容体は、それぞれ、別個に翻訳される、一緒に結合している2種のタンパク質から構成される。抗体では、重鎖および軽鎖は、抗体の結合ポケットが、2鎖を接合するフォールディングにあるように、一緒に組み立てられる。人のレパートリーを特性決定することは、自己免疫疾患を研究し、抗体ベースの療法を同定するために重要であるが、レパートリー中にそれぞれ固有の抗体を発現する巨大な数のB細胞があるために、また、各抗体について詳細な情報を得ることが、各細胞について重鎖および軽鎖両方をシーケンシングすることを必要とするので困難である。これは、細胞が溶解される場合には、その転写物が拡散し、その他の細胞のものと混和し得、やはり、対形成情報の喪失をもたらすので、既存の方法を用いて行うのは困難である。これは、単細胞をウェルまたはマイクロ流体チャンバー中に単離することによって克服できるが、このような方法は、数十または数百個の細胞にしか拡大可能ではない。
小滴SOEing技術は、単細胞中で個別の配列を一緒に連結する能力および小滴バーコード付加を使用して数百万個の単細胞でこれを実施する能力を提供する、図26。このアプローチでは、B細胞を、溶解試薬とともに小滴中にロードし、溶解する。次いで、それらを、バーコード小滴およびSOE-PCRのために必要な試薬を含有する小滴と併合する。SMDSにおけるように、バーコード小滴は、固有のバーコードの多数のコピーを含有する。これによって、バーコードを、細胞の重鎖および軽鎖と結合するために、PCR反応が使用されることが可能となり、その結果、リードが別個にシーケンシングされるが、バーコードに基づいてコンピュータによってクラスター化される。
この有用性を実証するために、小滴SOEing技術を使用して、体細胞高頻度突然変異を起こすRaji細胞株の抗体レパートリーをシーケンシングした。
細胞を、図26に示されるワークフローによって処理し、次いで、SMDSプロセスにおいて記載されるものと同様のバイオインフォマティック法を利用して、低品質のバーコードグループを廃棄した。これから、これらの遺伝子の重鎖および軽鎖の突然変異頻度を測定し、図27、図に示されるように、突然変異が、高頻度突然変異について知られるホットスポットの周囲に集まることを確立することが可能であった。突然変異は、細胞複製の時に蓄積するので、突然変異分布は、子孫の樹を作製するために使用できる情報を提供する、図27下部。さらに、重鎖および軽鎖の両方を使用して、特定の突然変異体、L177が、軽鎖で2つの系統、L301およびL303にどのように二股に分かれるかを追跡することが可能である。
実施例11:小滴バーコード付加を用いて単細胞トランスクリプトームをシーケンシングすること
抗体の重鎖および軽鎖をシーケンシングするために適用されたバーコード付加戦略を、全トランスクリプトームをシーケンシングするために拡大できる。これを達成するために、2種の抗体遺伝子のみでRT-PCRを標的化するのではなく、鋳型交換SMARTのような非特異的、全トランスクリプトーム増幅法を使用できる。オリゴ-dTプライマーを使用して、真核細胞中のすべてのmRNA転写物のポリアデニル化されたテールとハイブリダイズすることが可能である。図28、上部左に示されるように、鋳型交換機序を使用して、UMIをcDNA鋳型と結合でき、cDNA鋳型を増幅できる。図28下部に示されるように、この時点で、cDNA合成の間に付加される既知プライマーを使用し、SOE-PCRを使用してバーコードを結合できる。これは、図28、右に示されるように、単細胞を小滴中にカプセル封入すること、それらを溶解して、それらの小滴を、バーコード配列およびRT-PCR試薬を含有するものと併合することによって達成できる。
抗体の重鎖および軽鎖をシーケンシングするために適用されたバーコード付加戦略を、全トランスクリプトームをシーケンシングするために拡大できる。これを達成するために、2種の抗体遺伝子のみでRT-PCRを標的化するのではなく、鋳型交換SMARTのような非特異的、全トランスクリプトーム増幅法を使用できる。オリゴ-dTプライマーを使用して、真核細胞中のすべてのmRNA転写物のポリアデニル化されたテールとハイブリダイズすることが可能である。図28、上部左に示されるように、鋳型交換機序を使用して、UMIをcDNA鋳型と結合でき、cDNA鋳型を増幅できる。図28下部に示されるように、この時点で、cDNA合成の間に付加される既知プライマーを使用し、SOE-PCRを使用してバーコードを結合できる。これは、図28、右に示されるように、単細胞を小滴中にカプセル封入すること、それらを溶解して、それらの小滴を、バーコード配列およびRT-PCR試薬を含有するものと併合することによって達成できる。
哺乳動物細胞の可溶化液が、プロテアーゼを用いて消化され、適した濃度に希釈されるので、ほとんどの酵素反応は小滴中で効率的である。小滴中でSMARTバーコード付加が実施された場合には、広い、1500塩基対の周囲に集まる、cDNA産物のバイオアナライザートレースによって例示されるように、効率的な反応が観察される、図29。さらに、図29、下部に示されるように、遺伝子数が、マッピングされた100万個の断片あたりのエキソン1キロベースあたりの断片(FPKM)の関数としてプロットされると、この哺乳動物細胞型の予測される健全な分布をたどり、これは、mRNAが正しい長さのcDNAに効率的に合成されることを示す。
前記は、単に、本発明の原理を例示する。当業者ならば、本明細書において明確に記載されない、または示されないが、本発明の原理を具体化し、趣旨および範囲内に含まれる種々の配置を考案することが可能であろうということが認められよう。さらに、本明細書に列挙されるすべての実施例および条件付きの文言は、このような具体的に列挙された実施例および条件を制限することなく、主に読者の本発明の原理の理解を補助するものとする。さらに、本発明の原理、態様および実施形態ならびにその具体例を列挙するすべての陳述書は、その構造的および機能的等価物を包含するものとする。さらに、このような等価物が、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関わらず、同一機能を果たす開発される任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、示され、本明細書に記載される例示的実施形態に制限されるよう意図されない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
Claims (443)
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
別個の実体中に複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む細胞を導入するステップと、
細胞を溶解して、別個の実体中に核酸バーコード配列の複数のコピーを放出するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 前記細胞が細菌細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が真菌細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、複数のプラスミドを含み、各プラスミドが、核酸バーコード配列を含む、請求項1から3のいずれか一に記載の方法。
- 前記の供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項1から4のいずれか一に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項1から5のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを含む前記細胞が、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーから選択される、請求項1から6のいずれか一に記載の方法。
- ライブラリー中の各細胞が、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、請求項7に記載の方法。
- 核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
核酸バーコード配列のライブラリーから得た個々の核酸バーコード配列を、個々の細胞中に組み込むステップと、
個々の細胞を、個々の細胞における個々の核酸バーコード配列の複数のコピーの生成に十分な条件に供するステップと
によって、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーを調製することを含む、請求項1から8のいずれか一に記載の方法。 - 別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸標的分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項1から9のいずれか一に記載の方法。 - 前記別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項1から10のいずれか一に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項1から11のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
細胞を第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、前記細胞が、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 前記細胞が細菌細胞である、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が真菌細胞である、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が、複数のプラスミドを含み、各プラスミドが、核酸バーコード配列を含む、請求項13から15のいずれか一に記載の方法。
- 前記の供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、第1の別個の実体中に導入するステップを含む、請求項13から16のいずれか一に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項13から17のいずれか一に記載の方法。
- 第2の別個の実体が、微小滴であり、細胞を第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数の細胞をマイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネル中で細胞の慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機への細胞の周期的注入を提供する、ステップと、
注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性とマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々の細胞を、個々の微小滴中にカプセル封入するステップと
を含む、請求項13から18のいずれか一に記載の方法。 - 核酸バーコード配列の複数のコピーを含む前記細胞が、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーから選択される、請求項13から19のいずれか一に記載の方法。
- 前記ライブラリー中の各細胞が、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、請求項20に記載の方法。
- 核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
核酸バーコード配列のライブラリーから得た個々の核酸バーコード配列を、個々の細胞中に組み込むステップと、
個々の細胞を、個々の細胞における個々の核酸バーコード配列の複数のコピーの生成に十分な条件に供するステップと
によって、核酸バーコードを含有する細胞のライブラリーを調製することを含む、請求項20から21のいずれか一に記載の方法。 - 第1の別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子のうち複数またはその増幅産物を放出するステップと、
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項13から22のいずれか一に記載の方法。 - 前記第1の別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項13から23のいずれか一に記載の方法。
- 前記第1および第2の別個の実体が、微小滴である、請求項13から24のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸バーコード配列の複数のコピーを含む多孔性ビーズを導入するステップであって、核酸バーコード配列の複数のコピーが、多孔性ビーズの1個または複数の孔によって規定される表面上に少なくとも部分的に分配される、ステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 前記の供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項26に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項26または27に記載の方法。
- 前記核酸バーコード配列の複数のコピーを含む多孔性ビーズが、核酸バーコードを含有する多孔性ビーズのライブラリーから選択される、請求項26から28のいずれか一に記載の方法。
- 前記ライブラリー中の各多孔性ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、請求項29に記載の方法。
- 別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項26から30のいずれか一に記載の方法。 - 別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項26から31のいずれか一に記載の方法。
- 多孔性ビーズを、ビーズの融点を上回る温度に、多孔性ビーズの融解および核酸バーコード配列の複数のコピーの放出をもたらすのに十分な時間、曝露することを含む、請求項26から32のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項26から33のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、第2の別個の実体が微小滴であり、ビーズが、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数のビーズを、マイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネル中のビーズの慣性秩序化を達成するのに十分な条件下で、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含み、それによって、小滴生成機へのビーズの周期的注入を概ね提供する、ステップと、
注入の周期性を、小滴生成機の小滴生成の周期性と概ねマッチさせ、それによって、小滴生成機を使用して個々のビーズを、個々の微小滴中にカプセル封入するステップと
を含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 前記の供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、第1の別個の実体中に導入するステップを含む、請求項35に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項35または36の方法。
- その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズが、核酸バーコードを含有するビーズのライブラリーから選択される、請求項35から37のいずれか一に記載の方法。
- 前記ライブラリー中の各ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、請求項38に記載の方法。
- 第1の別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項35から39のいずれか一に記載の方法。 - 前記第1の別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項35から40のいずれか一に記載の方法。
- 前記第1および第2の別個の実体が、微小滴である、請求項35から41のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
カプセル封入に先立って、またはその後に、固有分子識別子(UMI)を、複数の核酸標的分子のそれぞれ中に組み込むステップと、
別個の実体中に、その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズを導入するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 前記の供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項43に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項43または44に記載の方法。
- 前記核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズが、核酸バーコードを含有するビーズのライブラリーから選択される、請求項43から45のいずれか一に記載の方法。
- 前記ライブラリー中の各ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、請求項46に記載の方法。
- 核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子を増幅するステップと、
別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
重複UMIについてシーケンシングリードを集約させることによって増幅バイアスについて補正するステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項43から47のいずれか一に記載の方法。 - 前記別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項43から48のいずれか一に記載の方法。
- 前記ビーズが、多孔性ビーズであり、核酸バーコード配列の複数のコピーが、多孔性ビーズの1個または複数の孔によって規定される表面上に少なくとも部分的に分配される、請求項43から49のいずれか一に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項43から50のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
複数の核酸標的分子を第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、第2の別個の実体が微小滴であり、ビーズが、その表面上に核酸バーコード配列の複数のコピーを含み、ビーズを第2の別個の実体中にカプセル封入するステップが、
複数のビーズを、マイクロ流体デバイスのチャネルを通して流すステップであって、マイクロ流体デバイスが、チャネルと流体連絡した小滴生成機を含む、ステップと、
1つまたは複数のビーズを、小滴生成機によって製造された1つまたは複数の別個の実体中に、カプセル封入するステップと、
小滴生成機によって製造された1つまたは複数の別個の実体を選別して、1つまたは複数のビーズを含まない別個の実体を除去するステップと
を含む、ステップと、
第1および第2の別個の実体を併合するステップと、
併合された別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 前記の供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、第1の別個の実体中に導入するステップを含む、請求項52に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項52または53の方法。
- その表面に核酸バーコード配列の複数のコピーを含むビーズが、核酸バーコードを含有するビーズのライブラリーから選択される、請求項52から54のいずれか一に記載の方法。
- 前記ライブラリー中の各ビーズが、単一核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、請求項55の方法。
- 第1の別個の実体から、核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
第1の別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列の存在に基づいて、シーケンシングされた核酸分子を、第1の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項52から56のいずれか一に記載の方法。 - 前記第1の別個の実体中の複数の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項52から57のいずれか一に記載の方法。
- 前記第1および第2の別個の実体が、微小滴である、請求項52から58のいずれか一に記載の方法。
- 一本鎖バーコードを調製するための方法であって、
複数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含む環状核酸分子を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、核酸バーコード配列のコンカテマーが製造されるように、核酸バーコード配列のローリングサークル増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 別個の実体を、多数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項60に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、多数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項60または61に記載の方法。
- 核酸バーコード配列を含む環状核酸分子が、核酸バーコード配列を含む環状核酸分子のライブラリーから選択される、請求項60から62のいずれか一に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項60から63のいずれか一に記載の方法。
- 一本鎖バーコードを調製するための方法であって、
多数の核酸標的分子を別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含むDNA分子を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、核酸バーコード配列の多数の一本鎖コピーが製造されるように、核酸バーコード配列の転写連鎖反応(TCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、多数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項65に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項65または66に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項65から67のいずれか一に記載の方法。
- 一本鎖バーコードを調製するための方法であって、
複数の核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含むDNA分子を、別個の実体中に導入するステップと、
核酸バーコード配列の複数の一本鎖コピーが製造されるように、別個の実体を、核酸バーコード配列のローリングサークル転写連鎖反応(rcTCR)による増幅に十分な条件に供するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項69に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項69または70に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項69から71のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の複数のコピーを、別個の実体中に導入する方法であって、
別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの核酸バーコード配列のいずれかを統計的に含有するように、個々の核酸バーコード配列を、制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
別個の実体の集団中の核酸バーコード配列を酵素的に増幅して、複数の別個の実体のうちの別個の実体がそれぞれ、その別個の実体の個々の核酸バーコード配列の複数のコピーを含む、複数の別個の実体を提供するステップと、
1種または複数の、複数の別個の実体中に、複数の核酸標的分子を導入するステップと、
1種または複数の、複数の別個の実体を、複数の核酸標的分子またはその増幅産物中への核酸バーコード配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 核酸バーコード配列を含まない別個の実体を除去するために、導入に先立って別個の実体の集団を選別することを含む、請求項73に記載の方法。
- 前記の供するステップが、ポリメラーゼ伸長試薬および/またはポリメラーゼ増幅試薬を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項73または74に記載の方法。
- 標的細胞を溶解して、複数の核酸標的分子を提供するステップを含む、請求項73から75のいずれか一に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項73から76のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコードライブラリーを調製する方法であって、
別個の実体の集団中に、
それぞれ、第1の核酸バーコード部分配列および第1の連結配列を含む、複数の第1の核酸分子と、
それぞれ、第2の核酸バーコード部分配列および第2の連結配列を含む、複数の第2の核酸分子をカプセル封入するステップであって、カプセル封入が、別個の実体の集団の少なくとも約50%の別個の実体が、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含むように実施される、ステップと、
別個の実体を、酵素的連結および/または増幅に十分な条件に供し、その結果、第1の核酸分子の少なくとも1種および第2の核酸分子の少なくとも1種を含む別個の実体について、第1および第2の核酸分子の両方の配列を含む連結および/または増幅産物が製造され、複合核酸バーコード分子を提供するステップと
を含む、方法。 - 前記の供するステップが、別個の実体を、第1および第2の連結配列の酵素的連結に十分な条件に供するステップを含む、請求項78に記載の方法。
- 前記第1および第2の連結配列が、少なくとも部分的に相補的である、請求項78に記載の方法。
- 少なくとも1種の複合核酸バーコード分子を含む別個の実体中に、複数の核酸標的分子を導入するステップと、
複数の核酸標的分子および少なくとも1種の複合核酸バーコード分子を含む別個の実体を、複合核酸バーコード分子の配列の、複数の核酸標的分子またはその増幅産物への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、請求項78に記載の方法。 - 別個の実体から、複合核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子またはその増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
シーケンシングされた核酸分子を、複合核酸バーコード配列の配列に基づいて、特定の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項81に記載の方法。 - 酵素的連結および/または増幅に十分な条件が、連結PCRに十分な条件である、請求項78から82のいずれか一に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項78から83のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
複数の核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の固有分子識別子(UMI)分子を別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、固有のUMI分子配列の、複数の核酸標的分子のうち複数またはその増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと、
複数の異なる核酸バーコード配列を、別個の実体中に導入するステップと、
別個の実体を、複数のバーコード配列のうち1種の、複数の核酸標的分子またはその増幅産物またはその増幅産物の増幅産物のそれぞれ中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 別個の実体から、UMIの1種およびバーコードの1種の配列を含む、複数の核酸分子またはその増幅産物またはその増幅産物の増幅産物を放出するステップと、
別個の実体から放出された核酸分子をシーケンシングするステップと、
シーケンシングされた核酸分子を、UMIおよびバーコードの配列の組合せに基づいて、特定の別個の実体を起源とすると同定するステップと
を含む、請求項85に記載の方法。 - 前記別個の実体が、微小滴である、請求項85または86に記載の方法。
- 核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
複数の核酸標的分子のそれぞれに固有分子識別子(UMI)分子を結合して、UMI標識された核酸標的分子を提供するステップと、
UMI標識された核酸標的分子を酵素的に増幅して、UMI標識された核酸標的分子の配列を含む増幅産物を提供するステップと、
増幅産物を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の別個の実体中で増幅産物を断片化するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された増幅産物に結合するステップであって、各別個の実体中の核酸バーコード配列が、断片化された増幅産物を、断片化された増幅産物がカプセル封入されている別個の実体と関連付ける、ステップと、
別個の実体から、結合している核酸バーコード配列を含む断片化された増幅産物を放出するステップと、
断片化された増幅産物をシーケンシングするステップと、
UMIの配列および核酸バーコード配列を使用して断片化された増幅産物をバイオインフォマティクス的に再構成して、増幅産物が起源とする核酸標的分子の配列を提供するステップと
を含む、方法。 - 増幅産物を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップが、別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの増幅産物のいずれかを含有するように、増幅産物を、制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップを含む、請求項88に記載の方法。
- 2種以上の核酸標的分子を起源とする増幅産物が、複数の別個の実体中にカプセル封入される、請求項88に記載の方法。
- 核酸バーコード配列が、請求項78から80のうち1つに記載される方法に従って作製される、請求項88から90のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的に増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、多重置換増幅(MDA)または多重アニーリングおよびルーピングベースの増幅サイクル(MALBEC)によって酵素的に増幅するステップを含む、請求項88から91のいずれか一に記載の方法。
- バイオインフォマティクス的に再構成するステップが、UMI、シーケンシングから得られた配列リードによってコンピュータによってグループ化して、異なる別個の実体中で同様の配列を有して生じる分子のサブセットを同定し、それによって、標的分子の1Xより大きいカバー率を作り出すために使用され得る配列の拡大されたセットを作製するステップを含む、請求項88から92のいずれか一に記載の方法。
- UMI分子の、複数の核酸標的分子のそれぞれとの結合および酵素的増幅が反応器中で起こり、増幅産物の、複数の別個の実体中へのカプセル封入が、第1のマイクロ流体デバイス中で起こり、核酸バーコード配列の、断片化された増幅産物との結合が、第2のマイクロ流体デバイス中で起こる、請求項88から93のいずれか一に記載の方法。
- 前記別個の実体が、微小滴である、請求項88から90のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
別個の実体中に、
核酸標的分子と、
核酸バーコード配列と、
核酸標的分子の配列を増幅するように構成されたプライマーの第1のセットと、
核酸バーコード配列の配列を増幅するように構成されたプライマーの第2のセットであって、プライマーの第1のセットのうち1種が、プライマーの第2のセットのうち1種の配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含むセットと、
酵素的増幅試薬と、
を導入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子および核酸バーコード配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、
別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、核酸標的分子の増幅された配列および核酸バーコード配列の増幅された配列を含む生成物を提供するステップと
を含む、方法。 - 前記の導入することが、複数の核酸標的分子を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項96の方法。
- 前記複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む核酸標的分子を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記の導入することが、複数の核酸バーコード配列を、別個の実体中に導入するステップを含む、請求項96に記載の方法。
- 前記複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、請求項99に記載の方法。
- 別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を熱サイクルに供するステップを含む、請求項96から100のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を等温増幅条件に供するステップを含む、請求項96から100のいずれか一に記載の方法。
- アダプター配列を、核酸標的分子中に組み込むステップを含み、プライマーの第1のセットが、アダプター配列と少なくとも部分的に相補的である、請求項96から102のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項96から103のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
別個の実体中に、
複数の核酸標的分子と、
複数の核酸バーコード配列と、
複数の核酸標的分子の配列を増幅するように構成された第1のプライマーセットと、
複数の核酸バーコード分子の配列を増幅するように構成された第2のプライマーセットであって、第1のプライマーセットおよび第2のプライマーセットが、少なくとも部分的に相補的である配列を含むセットと、
酵素的増幅試薬と、
を導入するステップと、
別個の実体を、複数の核酸標的分子の配列および複数の核酸バーコード配列の配列の酵素的増幅に十分な条件に供するステップであって、部分的配列相同性の領域を有する増幅産物が製造される、ステップと、
別個の実体を、増幅産物の配列の相補性領域がハイブリダイズするのに、およびハイブリダイズされた配列が酵素的に伸長されるのに十分な条件に供し、それによって、複数の核酸標的分子の1種の増幅された配列および複数の核酸バーコード配列の1種の増幅された配列をそれぞれ含む複数の生成物を提供するステップと
を含む、方法。 - 複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む核酸標的分子を含む、請求項105に記載の方法。
- 複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、請求項105または106に記載の方法。
- 別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を熱サイクルに供するステップを含む、請求項105から107のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体を、酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を等温増幅条件に供するステップを含む、105から107のいずれか一に記載の方法。
- アダプター配列を、核酸標的分子中のそれぞれに組み込むステップを含み、第1のプライマーセットのプライマーのそれぞれが、アダプター配列の1種と少なくとも部分的に相補的である、請求項105から109のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項105から110のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
核酸バーコードプライマーのライブラリーを作製するステップであって、ライブラリー中の各核酸バーコードプライマーが、核酸標的分子とアニールするのに十分な第1の配列および核酸バーコード配列を含む第2の配列とを含む、ステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、1種または複数の核酸バーコード、ライブラリーから選択されるプライマーおよび1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップであって、各別個の実体中に含めるためのライブラリーから選択される1種または複数のプライマーが、その別個の実体中の核酸標的分子のうち1種または複数とアニールするのに十分な第1の配列を有する1種または複数のプライマーを含む、ステップと、
1種または複数の核酸標的分子および核酸バーコード配列のうち一方の配列を含む増幅産物が製造されるように、その別個の実体中の核酸バーコードプライマーのうち1種または複数を使用して、各別個の実体中で核酸標的分子のうち1種または複数を酵素的に増幅するステップと
を含む、方法。 - アダプター配列を1種または複数の核酸標的分子中に組み込むステップを含み、各別個の実体中に含むためのライブラリーから選択される1種または複数のプライマーが、アダプター配列のうち1種または複数とアニールするのに十分な第1の配列を有する1種または複数のプライマーを含む、請求項112に記載の方法。
- 1種または複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む複数の核酸標的分子である、請求項112または113に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して異なる配列を含む核酸標的分子を含む、請求項112から114のいずれか一に記載の方法。
- ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコードプライマーが、異なる配列を含む複数の核酸バーコードプライマーである、請求項112から115のいずれか一に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれが、複数のもののうちその他の別個の実体に対して異なる配列を含む核酸バーコードプライマーを含む、請求項112から116に記載のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的に増幅するステップが、複数の別個の実体を熱サイクルに供するステップを含む、請求項112から117のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的に増幅するステップが、複数の別個の実体を等温増幅条件に供するステップを含む、請求項112から117のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項112から119のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、
各別個の実体中で1種または複数の核酸標的分子を酵素的に断片化し、各別個の実体中の1種または複数の核酸バーコード配列のうち1種または複数を、その別個の実体中の1種または複数の標的核酸分子の断片またはその増幅産物中に酵素的に組み込むステップと
を含む、方法。 - アダプター配列を、1種または複数の核酸標的分子中に組み込むステップを含む、請求項121の方法。
- 1種または複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む複数の核酸標的分子である、請求項121または122に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれが、複数のその他の別個の実体に対して異なる配列を含む核酸標的分子を含む、請求項121から123のいずれか一に記載の方法。
- ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む複数の核酸バーコード配列である、請求項121から124のいずれか一に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれが、複数のその他の別個の実体に対して異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、請求項121から125のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的断片化および/または組込みステップが、以下の酵素:トランスポサーゼ、フラグメンターゼ(登録商標)、リガーゼ、ポリメラーゼおよび逆転写酵素のうち1種または複数を利用する、請求項121から125のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的断片化および/または組込みステップが、インテグラーゼまたはリコンビナーゼを利用する、請求項121から125のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項121から128のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子にバーコード付加するための方法であって、
核酸バーコード配列のライブラリーを作製するステップと、
複数の別個の実体のそれぞれ中で、ライブラリーから選択された1種または複数の核酸バーコード配列および1種または複数の核酸標的分子を組み合わせるステップと、
別個の実体のそれぞれ中の1種または複数の核酸標的分子を、その別個の実体中の1種または複数の核酸バーコード配列と酵素的に連結するステップと
を含む、方法。 - 酵素的連結に先立って、アダプター配列を1種または複数の核酸標的分子中に組み込むステップを含む、請求項130に記載の方法。
- 1種または複数の核酸標的分子が、異なる配列を含む複数の核酸標的分子である、130または131に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して異なる配列を含む核酸標的分子を含む、請求項130から132のいずれか一に記載の方法。
- 請求項ライブラリーから選択される1種または複数の核酸バーコード配列が、異なる配列を含む複数の核酸バーコード配列である、請求項130から132のいずれか一に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して異なる配列を含む核酸バーコード配列を含む、130から132のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項130から135のいずれか一に記載の方法。
- 微小滴を操作するための方法であって、
第1の複数の微小滴および第2の複数の微小滴を作製するステップと、
マイクロ流体デバイスのチャネル中に、第1の複数の微小滴を流すステップと、
第1の複数の微小滴のそれぞれを分割して、複数の低減された容量の微小滴を提供するステップと、
複数の低減された容量の微小滴のそれぞれを、第2の複数の微小滴の微小滴と併合するステップであって、第2の複数の微小滴の微小滴がそれぞれ、第1の複数の微小滴のものとおよそ同等またはそれより少ない容量を有する、ステップと
を含む、方法。 - マイクロ流体デバイスのチャネルが、小滴分割アーキテクチャを含む、請求項137に記載の方法。
- 小滴分割アーキテクチャが、一連の二分アーキテクチャを含む、請求項138に記載の方法。
- 第1の複数の微小滴のそれぞれが、細胞可溶化液を含む、請求項137から139のいずれか一に記載の方法。
- 第1の複数の微小滴のそれぞれ中の細胞を溶解して、細胞可溶化液を提供するステップを含む、請求項140に記載の方法。
- 第2の複数の微小滴の微小滴がそれぞれ、細胞可溶化液の1種または複数の成分との1種または複数の反応を促進するように構成された、1種または複数の試薬を含む、請求項137から141のいずれか一に記載の方法。
- 1種または複数の試薬が、1種または複数のPCR試薬および/または1種または複数のRT-PCR試薬を含む、請求項142に記載の方法。
- マイクロ流体デバイスであって、
複数のチャネル形状の機構を連続して含む微小滴併合セクションを含むフローチャネルであって、各チャネル形状の機構が、チャネル形状の機構に近接したチャネルにおいて電場をかけるように構成された、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連しているフローチャネルを含む、デバイス。 - 複数のチャネル形状の機構のそれぞれが、チャネルの収縮、拡大、屈曲またはそれらの組合せを含む、請求項144に記載のマイクロ流体デバイス。
- 複数のチャネル形状の機構のそれぞれが、チャネルの収縮を含み、チャネルの収縮のそれぞれに、チャネル拡大が続くか、チャネル拡大が先行する、請求項145に記載のマイクロ流体デバイス。
- 各収縮が、小滴併合セクションの上流または下流のチャネル幅または高さに対する、チャネル幅または高さの低減である、請求項145または146に記載のマイクロ流体デバイス。
- 各チャネル拡大が、請求項148に示されるような収縮に対する、チャネル幅または高さの増大である、請求項147に記載のマイクロ流体デバイス。
- 小滴併合セクションが、2~20のチャネル形状の機構を連続して含む、請求項144から148のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイス。
- 小滴併合セクションが、2~10のチャネル形状の機構を連続して含む、請求項149に記載のマイクロ流体デバイス。
- 小滴併合セクションが、2~5のチャネル形状の機構を連続して含む、請求項150に記載のマイクロ流体デバイス。
- 1つまたは複数の電極が、液体電極である、請求項144から151に記載のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイス。
- 各チャネル形状の機構が、第1の電極またはその一部および第2の電極またはその一部と関連しており、第1の電極またはその一部および第2の電極またはその一部が、フローチャネルのいずれかの側に対向関係で配置される、請求項144から152のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイス。
- 請求項144から153のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイスを使用して微小滴を併合する方法であって、
2つ以上の微小滴が、チャネル形状の機構のうち1つと近接して配置されるように、2個以上の微小滴を、請求項144から153のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイスのフローチャネルの微小滴併合セクションを通して流すステップと、
チャネル形状の機構と関連している1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分を使用して電場をかけることによって、チャネル形状の機構のうちの1つと近接している2つ以上の微小滴を併合するステップと
を含む、方法。 - 2種以上の微小滴のうち1種が、細胞可溶化液を含む、請求項154に記載の方法。
- 2種以上の微小滴のうち1種が、1種または複数の核酸バーコード配列を含む、請求項154に記載の方法。
- 2種以上の微小滴を併合するための方法であって、
2種以上の微小滴の集団を、マイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップであって、
フローチャネルが、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけるように構成された、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連する微小滴併合セクションを含み
微小滴の2種以上の集団が、それぞれ、2種以上の別個の入口チャネルから単一接合点でフローチャネル中に導入され、
各入口チャネルからの微小滴投与量が、水力学的効果のために少なくとも部分的に同調し、微小滴の間隔がとられたグループの放出をもたらし、微小滴の間隔があげられたグループの少なくとも一部が、微小滴の2種以上の集団のそれぞれに由来する微小滴を含むように、微小滴の2種以上の集団が、フローチャネル中に導入される、ステップと、
微小滴の間隔があげられたグループを、微小滴併合セクション中に流すステップと、
1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分を使用して、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけることによって、間隔があげられたグループ内の微小滴を併合するステップと
を含む、方法。 - 微小滴の3種以上の集団が、それぞれ、3種以上の別個の入口チャネルから単一接合点でフローチャネル中に導入され、各入口チャネルからの微小滴投与量が、水力学的効果のために少なくとも部分的に同調し、微小滴の間隔がとられたグループの放出をもたらし、微小滴の間隔があげられたグループの少なくとも一部が、微小滴の3種以上の集団のそれぞれに由来する微小滴を含むように、微小滴の3種以上の集団が、フローチャネル中に導入される、請求項157に記載の方法。
- 2種以上の液体を併合するための方法であって、
第1の液体を、非混和相液体と少なくとも部分的に接触する流としてマイクロ流体デバイスのフローチャネル中に導入するステップと、
第2の液体を含む微小滴を、フローチャネル中に導入するステップと、
微小滴を流中に併合し、それによって第1および第2の液体を組み合わせるステップと、
組み合わされた第1および第2の液体を含む流を、組み合わされた第1および第2の液体を含む個々の微小滴中に押し入れるステップと
を含む、方法。 - フローチャネルが、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけるように構成される、1種もしくは複数の電極または1種もしくは複数の電極の1種もしくは複数の部分と関連する微小滴併合セクションを含み、方法が、フローチャネルの微小滴併合セクションにおいて電場をかけて、微小滴を流に併合するステップを含む、請求項159に記載の方法。
- 第1の液体を、滴下条件下でフローチャネル中に導入する、請求項159または160に記載の方法。
- 第1の液体を、噴射条件下でフローチャネル中に導入する、請求項159または160に記載の方法。
- 複数の微小滴を流中に併合し、その後、流を、個々の微小滴中に押し入れるステップを含む、請求項159から162のいずれか一に記載の方法。
- 第3の液体を含む第2の微小滴を、フローチャネル中に導入するステップであって、導入するステップが、複数の個々の微小滴中に押し入れ、その後、第2の微小滴を流に併合する、ステップを含む、請求項159から162のいずれか一に記載の方法。
- 第2および第3の液体が、同一である、請求項164に記載の方法。
- 1種または複数のさらなる液体を、流または小滴のいずれかとしてフローチャネル中に導入するステップを含む、請求項159から162のいずれか一に記載の方法。
- マイクロ流体デバイスであって、
フローチャネルと流体連絡した1つまたは複数の派生チャネルを含む微小滴混和セクションを含むフローチャネルを含み、
ここで、1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中央線に対して10°から170°の間の角度であり、
1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの高さより小さい、フローチャネルを通って流されるべき小滴の直径未満である高さを有し、
微小滴が、キャリアー流体中のフローチャネルを通って流れた場合に、キャリアー流体が1つまたは複数の派生チャネル中に流れて入るおよびそれから流れて出るときに生じる直交流に曝露されるように、1つまたは複数の派生チャネルが構成され、
直交流が、微小滴の内容物を混和する微小滴中の流れを生成するのに十分である、デバイス。 - 1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中心線に対して45°から135°の間の角度である、請求項167に記載のマイクロ流体デバイス。
- 1つまたは複数の派生チャネルが、フローチャネルの中心線に対して約90°の角度である、請求項168に記載のマイクロ流体デバイス。
- 微小滴混和セクションが、微小滴が、キャリアー流体中のフローチャネルを通って流れた場合に、複数の直交流に曝露されるように、フローチャネルの長さに沿って配置される複数の派生チャネルを含む、請求項167から169のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイス。
- 1つまたは複数の派生チャネルの幅が、フローチャネルを通って流れるべき微小滴の直径より大きい、請求項167から170のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイス。
- 請求項167から171のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイスを使用する1種または複数の微小滴の内容物を混和する方法であって、
キャリアー流体中の1種または複数の微小滴を、請求項167から171のいずれか一に記載のマイクロ流体デバイスのフローチャネルの微小滴混和セクションを通って流すステップを含み、
1種または複数の微小滴が、キャリアー流体が1つまたは複数の派生チャネル中に流れて入るおよびそれから流れて出るときに生じる直交流に曝露され、
直交流が、1種または複数の微小滴の内容物を混和する微小滴中の流れを生成するのに十分である、方法。 - 単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
細胞を溶解して、別個の実体内のRNA標的分子を放出するステップと、
各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列ならびにcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、
各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列のcDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供し、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含む、複数の別個の実体を提供するステップと
を含む、方法。 - 各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬を導入するステップを含み、ここで、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列の、cDNA増幅産物への酵素的組込みに十分な条件が、固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分である、請求項173に記載の方法。
- 固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、請求項174に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項173から175のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項173から176のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項173から176のいずれか一に記載の方法。
- 導入が請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項173から176のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項173から176のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体の成分を、請求項167から172のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、請求項173から176のいずれか一に記載の方法。
- 導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、請求項173から181のいずれか一に記載の方法。
- 増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、請求項173から182のいずれか一に記載の方法。
- カプセル封入、溶解およびcDNA合成ステップを、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、酵素的組込みを、第2のマイクロ流体デバイスで実施する、請求項173から183のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、請求項184に記載の方法。
- 単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、
各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列ならびにcDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入するステップと、
各別個の実体を、cDNA合成およびその別個の実体に固有な核酸バーコード配列の、cDNA増幅産物中への酵素的組込みに十分な条件に供し、それによって、複数の別個の実体のそれぞれが、複数の別個の実体のその他のものに対して固有の核酸バーコード配列で標識されたcDNA増幅産物を含むステップと
を含む、方法。 - 各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬を導入するステップを含み、ここで、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列の、cDNA増幅産物への酵素的組込みに十分な条件は、固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分である、請求項186に記載の方法。
- 固有分子識別子を含む核酸分子の各cDNA配列中への酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、請求項187に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項186から188のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項186から189のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項186から189のいずれか一に記載の方法。
- 導入が請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項186から189のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項186から189のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体の成分を、請求項167から172のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、請求項186から189のいずれか一に記載の方法。
- 導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、請求項186から194のいずれか一に記載の方法。
- 増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、請求項186から195のいずれか一に記載の方法。
- cDNA合成ステップを、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、酵素的組込みを、第2のマイクロ流体デバイスで実施する、請求項186から196のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、請求項197に記載の方法。
- 単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
(a)別個の実体の集団の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、個々の細胞を制限希釈で別個の実体の集団中にカプセル封入するステップと、
(b)細胞を溶解して、別個の実体内のRNA標的分子を放出するステップと、
(c)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、
(d)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、
(e)各別個の実体中に、その別個の実体に固有な核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物の酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA配列の酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - ステップ(a)、(b)および/または(c)を、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(d)を、第2のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(e)を、第3のマイクロ流体デバイスで実施する、請求項199に記載の方法。
- ステップ(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を、単一マイクロ流体デバイスで実施する、請求項199に記載の方法。
- 各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な条件に供するステップを含む、請求項199から201のいずれか一に記載の方法。
- 固有分子識別子を含む核酸分子の酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、請求項202に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項199から203のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項199から204のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項199から204のいずれか一に記載の方法。
- 導入ステップが請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項199から204のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項199から204のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体の成分を、請求項167から172のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、請求項199から204のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列を断片化し、導入し、酵素的に組み込むのに十分な試薬を導入するステップを、請求項121から129のいずれか一に示される方法に従って実施する、請求項199から204のいずれか一に記載の方法。
- 導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、請求項199から210のいずれか一に記載の方法。
- ステップ(c)を、2つの異なるステップ、cDNA合成に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成に十分な条件に供する第1のステップおよび得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供する第2のステップで実施する、請求項199から211のいずれか一に記載の方法。
- ステップ(e)が、ステップ(d)から得られた別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入するステップと、核酸バーコード配列を含む別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入し、別個の実体を併合して、増大した容量の別個の実体を提供するステップとを含む、請求項199から211のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、請求項199から212のいずれか一に記載の方法。
- 単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させる方法であって、
(a)別個の実体の集団を提供するステップであって、別個の実体の集団の別個の実体のそれぞれが、単細胞を起源とする細胞可溶化液を含む、ステップと、
(b)各別個の実体中に、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成および得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供するステップと、
(c)各別個の実体中に、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な試薬を導入するステップと、各別個の実体を、増幅されたcDNA産物の断片化に十分な条件に供するステップと、
(d)各別個の実体中に、その別個の実体に固有の核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化されたcDNA産物中への酵素的組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - ステップ(a)および/または(b)を、第1のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(c)を、第2のマイクロ流体デバイスで実施し、ステップ(d)を、第3のマイクロ流体デバイスで実施する、請求項215に記載の方法。
- ステップ(a)、(b)、(c)および(d)を、単一マイクロ流体デバイスで実施する、請求項215に記載の方法。
- 各別個の実体中に、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な試薬を導入し、各別個の実体を、固有分子識別子(UMI)を含む核酸分子の各mRNA、cDNAまたはその増幅産物への酵素的組込みに十分な条件に供するステップを含む、請求項215から217のいずれか一に記載の方法。
- 固有分子識別子を含む核酸分子の酵素的組込みに十分な試薬が、縮重配列を含む鋳型交換オリゴを含む、請求項218に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項215から219のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項215から220のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項215から220のいずれか一に記載の方法。
- 導入ステップのうち1つまたは複数が、請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項215から220のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項215から220のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体の成分を、請求項167から172のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、請求項215から220のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列を断片化し、導入し、酵素的に組み込むのに十分な試薬を導入するステップを、請求項121から129のいずれか一に示される方法に従って実施する、請求項215から220のいずれか一に記載の方法。
- 導入するステップも供するステップも、ビーズの存在下で起こらない、請求項215から216のいずれか一に記載の方法。
- ステップ(b)を、2つの異なるステップ、cDNA合成に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、cDNA合成に十分な条件に供する第1のステップおよび得られたcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、各別個の実体を、得られたcDNA産物の増幅に十分な条件に供する第2のステップで実施する、請求項199から227のいずれか一に記載の方法。
- ステップ(d)が、ステップ(c)から得られた別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入するステップと、核酸バーコード配列を含む別個の実体を、マイクロ流体デバイス中に導入し、別個の実体を併合して、増大した容量の別個の実体を提供するステップとを含む、請求項199から227のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的組込みが、SOEing PCRを含む、請求項199から228のいずれか一に記載の方法。
- シーケンシングのためにcDNAを調製する方法であって、
cDNAを複数の断片に断片化するステップであって、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部断片を含む、ステップと、
固相支持体とともに1つまたは複数の別個の実体中に複数の断片をカプセル封入するステップと、
固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップと
を含む、方法。 - cDNAを、単細胞を起源とするmRNAから作製し、ここで、各cDNAが、mRNAが起源とする細胞に対して独特である5’末端および/または3’末端中に組み込まれている核酸バーコード配列を含む、請求項231に記載の方法。
- 各cDNAが、5’末端および/または3’末端中に組み込まれた固有分子識別子(UMI)を含む、請求項231または232に記載の方法。
- cDNAが、請求項173から197のいずれか一に記載の方法の産物である、請求項231の方法。
- 断片化が、物理的せん断を含む、請求項231から234のいずれか一に記載の方法。
- 断片化が、1種または複数の酵素を用いる酵素的断片化を含む、請求項231から235のいずれか一に記載の方法。
- 5’末端および/または3’末端が、リガンドを含み、固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定するステップが、リガンドを、固相支持体上に固定化されているリガンドの受容体と特異的に結合するステップを含む、請求項231から236のいずれか一に記載の方法。
- 固相支持体が、ビーズである、請求項231から237のいずれか一に記載の方法。
- ビーズが、磁性ビーズである、請求項238に記載の方法。
- 固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を、酵素的修飾に供するステップを含む、請求項231から239のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的修飾が、制限消化、連結およびポリアデニル化から選択される、請求項240に記載の方法。
- 断片化が、cDNAの5’末端および/または3’末端を固相支持体上に可逆的に固定化することの後に起こる、請求項231から241のいずれか一に記載の方法。
- 1種または複数の別個の実体が、微小滴である、請求項231から242のいずれか一に記載の方法。
- シーケンシングのためのバーコード付加された核酸を調製する方法であって、
別個の実体中に、複数の核酸標的分子および複数のビーズをカプセル封入するステップであって、複数のビーズのそれぞれが、核酸バーコード配列、固有分子識別子(UMI)および複数の核酸標的分子のうちの1種とハイブリダイズするように設計された核酸捕獲配列を含む、ステップと、
別個の実体を、1種または複数の核酸標的分子および核酸捕獲配列のハイブリダイゼーションに十分な条件に供するステップと、
その後の解析のために別個の実体から複数のビーズを回収するステップと
を含む、方法。 - 核酸バーコード配列の1種またはその増幅産物を、複数の標的核酸分子またはその増幅産物のそれぞれ中に酵素的に組み込むステップを含む、請求項244に記載の方法。
- 核酸バーコード配列の1種上で複数の核酸標的分子のそれぞれを酵素的に伸長して、核酸バーコード配列またはそれに相補的な配列および核酸標的分子の配列の少なくとも一部を含むキメラ分子を作製するステップを含む、請求項244に記載の方法。
- 回収するステップが、蛍光活性化細胞選別(FACS)、PCR活性化細胞選別(PACS)または磁性活性化細胞選別(MACS)のうち1種以上によってビーズを選別するステップを含む、請求項244から246のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子が、細胞性DNA、RNAまたはアフィニティー試薬によって細胞と関連付けられた核酸を含む、請求項244から247のいずれか一に記載の方法。
- ビーズから得られた核酸標的分子を酵素的に増幅するステップを含む、請求項244から248のいずれか一に記載の方法。
- ビーズから核酸標的分子を回収するステップを含む、請求項244から249のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子もしくはその一部をシーケンシングすることまたは核酸標的分子の増幅産物もしくはその一部をシーケンシングするステップを含む、請求項244から250のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項244から251のいずれか一に記載の方法。
- バーコードベースのシーケンシングの区画化された増幅された標的ライブラリーを製造するための方法であって、
核酸標的分子の酵素的増幅に十分な試薬とともに、複数の別個の実体中に、複数の核酸標的分子をカプセル封入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子の酵素的増幅に十分な条件に供して、増幅産物を提供するステップと、
増幅産物を断片化するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された増幅産物中に組み込むステップと
を含む、方法。 - 別個の実体が、微小滴である、請求項253に記載の方法。
- 核酸標的分子の酵素的増幅に十分な試薬が、DNAポリメラーゼ、RecAタンパク質およびヘリカーゼから選択される1種または複数の酵素を含む、請求項253または254に記載の方法。
- 別個の実体を、核酸標的分子の酵素的増幅に十分な条件に供するステップが、別個の実体を熱サイクルするステップを含む、請求項253から255のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子が、DNA分子であり、RNA中間体が、核酸標的分子を増幅するために使用される、請求項253から256のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子が、1種または複数の生物において増幅される、請求項253から257のいずれか一に記載の方法。
- 試薬または条件を調節して、核酸標的分子の増幅の程度を調節するステップを含む、請求項253から258のいずれか一に記載の方法。
- 複数のもののうち個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの核酸標的分子のいずれかを統計的に含有するように、複数の核酸標的分子を、制限希釈で複数の別個の実体中にカプセル封入する、請求項253から259のいずれか一に記載の方法。
- 増幅産物を、断片化の前または後に、1種または複数の固相支持体と結合するステップを含む、請求項253から260のいずれか一に記載の方法。
- 1種または複数の固相支持体が、1種または複数のビーズである、請求項261に記載の方法。
- 核酸標的分子が、10キロベースより長い長さである、請求項253から262のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子が、100キロベースより長い長さである、請求項263に記載の方法。
- 核酸標的分子が、1メガベースより長い長さである、請求項264に記載の方法。
- 核酸標的分子を断片化し、バーコード付加する方法であって、
複数の核酸標的分子またはその増幅産物を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体を、核酸標的分子またはその増幅産物の断片化に十分な条件に供して、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列によって、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片が、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定される、ステップと
を含む、方法。 - 供するステップが、核酸標的分子またはその増幅産物を酵素的に断片化するステップを含む、請求項266に記載の方法。
- 供するステップが、物理的または化学的手段を使用して核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、請求項266に記載の方法。
- 供するステップが、UV光の適用によって核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、請求項266に記載の方法。
- 供するステップに先立って、1つまたは複数の酵素的切断部位を、核酸標的分子またはその増幅断片中に組み込むステップを含む、請求項266に記載の方法。
- 1種または複数の酵素的切断部位が、dUTPを含む、請求項270に記載の方法。
- 供するステップが、力の適用によって核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、請求項266に記載の方法。
- 力が、マイクロ流体デバイスにおけるマイクロ流体チャネル、マイクロ流体噴射またはマイクロ流体デバイス中のマイクロ流体接合部を通る核酸標的分子またはその増幅産物の水力学的流れによって誘導されるせん断力である、請求項272に記載の方法。
- 供するステップが、トランスポゾン挿入によって、核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、請求項266に記載の方法。
- 供するステップが、核酸断片化微生物を使用して核酸標的分子またはその増幅産物を断片化するステップを含む、請求項266に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項266から275のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子が、10キロベースよりも長い長さである、請求項266から276のいずれか一に記載の方法。
- 核酸標的分子が、100キロベースより長い長さである、請求項277に記載の方法。
- 核酸標的分子が、1メガベースより長い長さである、請求項278に記載の方法。
- 細胞におけるコピー数変動を特性決定するための方法であって、
別個の実体中の単細胞を単離するステップと、
別個の実体中の細胞性核酸を断片化するステップと、
固有分子識別子(UMI)を、断片化された細胞性核酸中に組み込むステップと、
断片化された細胞性核酸をシーケンシングするステップと、
UMIを使用して、細胞性核酸中の特定の配列のコピー数を推測するステップと
を含む、方法。 - 細胞性核酸が、ゲノムDNAを含む、請求項280に記載の方法。
- 細胞性核酸が、RNAを含む、請求項280または281に記載の方法。
- 細胞の集団を、単離、断片化、組み込むことおよびシーケンシングステップに供する、請求項280から282のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項280から283のいずれか一に記載の方法。
- 細胞性核酸中に、各細胞および/または各別個の実体に固有な核酸バーコード配列を組み込むステップを含む、請求項280から284のいずれか一に記載の方法。
- シーケンシングが、UMIおよび/または核酸バーコード配列を含むシーケンシングリードを製造する、請求項280から285のいずれか一に記載の方法。
- バーコードを、断片化された核酸またはその増幅産物と結合するための方法であって、
複数の別個の実体中で、複数の断片化された核酸標的分子、核酸バーコード配列および核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の別個の実体を、核酸バーコード配列の、断片化された核酸標的分子またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップであって、核酸バーコード配列が、核酸バーコード配列が組み込まれる各断片またはその増幅産物を、単一の別個の実体、単細胞または単一の生物を起源とすると同定する、ステップと
を含む、方法。 - 供するステップが、ビーズの存在下で起こらない、請求項287に記載の方法。
- 試薬がリガーゼを含む、請求項287または288に記載の方法。
- 試薬が、インテグラーゼ、リコンビナーゼおよびフリッパーゼから選択される1種または複数の酵素を含む、請求項287または288に記載の方法。
- 組み込むステップが、SOEing PCRを含む、請求項287または288に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項287から291のいずれか一に記載の方法。
- 核酸をシーケンシングする方法であって、
複数の核酸標的分子を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、
第1の増幅産物を断片化して、断片化された第1の増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された第1の増幅産物または断片化された第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。 - 酵素的に増幅するステップが、カプセル封入に先立って起こる、請求項293に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項293または294に記載の方法。
- 組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれを、核酸バーコード配列を含む微小滴と併合するステップを含む、請求項295に記載の方法。
- 組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれ中に、核酸バーコード配列を含む細胞をカプセル封入するステップを含む、請求項295に記載の方法。
- 断片化および組み込むステップを、トランスポゾンを使用して単一ステップとして実施する、請求項293から297のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体のうち1種または複数が、複数の異なる核酸標的分子および/または複数の異なる核酸バーコード配列を含み、方法が、シーケンシングに起因する混和されたシーケンシングリードをバイオインフォマティクス的に解析して、個々の核酸標的分子の配列情報を得るステップを含む、請求項293から298のいずれか一に記載の方法。
- 1種または複数の細胞またはウイルスを溶解して、複数の核酸標的分子を得るステップを含む、請求項293から299のいずれか一に記載の方法。
- 溶解が、複数の別個の実体において起こる、請求項300に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項293から301のいずれか一に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単一分子を起源とする、請求項293から301のいずれか一に記載の方法。
- 固有分子識別子(UMI)を、核酸標的分子、第1の増幅産物、断片化された第1の増幅産物および第2の増幅産物のうち1種または複数中に組み込むステップを含む、請求項293から303のいずれか一に記載の方法。
- 核酸をシーケンシングする方法であって、
複数の核酸標的分子を複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の核酸標的分子を断片化して、断片化された核酸標的分子を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、断片化された核酸標的分子または断片化された核酸標的分子から増幅された増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する断片化された核酸標的分子または組み込まれた核酸バーコード配列を有する増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、断片化された核酸標的分子のメンバーまたは増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。 - 別個の実体が、微小滴である、請求項305に記載の方法。
- 組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれを、核酸バーコード配列を含む微小滴と併合するステップを含む、請求項306に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴であり、組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれ中に、核酸バーコード配列を含む細胞をカプセル封入するステップを含む、請求項306に記載の方法。
- 断片化および組み込むステップを、トランスポゾンを使用して単一ステップとして実施する、請求項305から308のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体のうち1種または複数が、複数の異なる核酸標的分子および/または複数の異なる核酸バーコード配列を含み、方法が、シーケンシングに起因する混和されたシーケンシングリードをバイオインフォマティクス的に解析して、個々の核酸標的分子の配列情報を得るステップを含む、請求項305から309のいずれか一に記載の方法。
- 1種または複数の細胞またはウイルスを溶解して、複数の核酸標的分子を得るステップを含む、請求項305から310のいずれか一に記載の方法。
- 溶解が、複数の別個の実体において起こる、請求項311に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項305から312のいずれか一に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単一分子を起源とする、請求項305から312のいずれか一に記載の方法。
- 固有分子識別子(UMI)を、核酸標的分子、断片化された核酸標的分子および増幅産物のうち1種または複数中に組み込むステップを含む、請求項305から314のいずれか一に記載の方法。
- 核酸をシーケンシングする方法であって、
複数の核酸標的分子を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
複数の別個の実体において核酸標的分子を酵素的に増幅して、第1の増幅産物を提供するステップと、
核酸バーコード配列を、第1の増幅産物または第1の増幅産物から増幅された第2の増幅産物中に組み込むステップと、
組み込まれた核酸バーコード配列を有する第1の増幅産物または組み込まれた核酸バーコード配列を有する第2の増幅産物をシーケンシングするステップと、
核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していた、第1の増幅産物のメンバーまたは第2の増幅産物のメンバーのシーケンシングリードをグループ化するステップと
を含む、方法。 - 酵素的に増幅するステップが、カプセル封入に先立って起こる、請求項316に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項316または317に記載の方法。
- 組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれを、核酸バーコード配列を含む微小滴と併合するステップを含む、請求項318に記載の方法。
- 組み込むステップが、複数の別個の実体のそれぞれ中に、核酸バーコード配列を含む細胞をカプセル封入するステップを含む、請求項318に記載の方法。
- 別個の実体のうち1種または複数が、複数の異なる核酸標的分子および/または複数の異なる核酸バーコード配列を含み、方法が、シーケンシングに起因する混和されたシーケンシングリードをバイオインフォマティクス的に解析して、個々の核酸標的分子の配列情報を得るステップを含む、請求項316から320のいずれか一に記載の方法。
- 1種または複数の細胞またはウイルスを溶解して、複数の核酸標的分子を得るステップを含む、請求項316から321のいずれか一に記載の方法。
- 溶解が、複数の別個の実体において起こる、請求項322に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単細胞を起源とする、請求項316から323のいずれか一に記載の方法。
- 複数の別個の実体のそれぞれ中の核酸標的分子が、単一分子を起源とする、請求項316から323のいずれか一に記載の方法。
- 固有分子識別子(UMI)を、核酸標的分子、第1の増幅産物および第2の増幅産物のうち1種または複数中に組み込むステップを含む、請求項316から325のいずれか一に記載の方法。
- 標的分子を検出するための方法であって、
分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬のそれぞれを、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて標識するステップであって、第1の核酸バーコード配列が、オリゴヌクレオチドによって標識されたアフィニティー試薬の標的特異性を同定する、ステップと、
複数のアフィニティー試薬の、存在する場合にはその特異的分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数のアフィニティー試薬を、複数の分子標的と接触させるステップと、
存在する場合にはその特異的分子標的と結合している複数のアフィニティー試薬を、複数の第2の核酸バーコード配列とともに複数の別個の実体中にカプセル封入するステップであって、各別個の実体中にカプセル封入された第2の核酸バーコード配列が、それらがカプセル封入される別個の実体を独特に同定する、ステップと、
第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に組み込むステップと、
第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチドをシーケンシングするステップと、
第1および第2の核酸バーコード配列を使用して、同一の別個の実体中に同時に存在していたアフィニティー試薬を同定および/または定量化するステップと
を含む、方法。 - 複数のアフィニティー試薬が、異なる分子標的に特異的なアフィニティー試薬を含む、請求項327に記載の方法。
- 分子標的が、細胞によって含まれる、請求項327または328に記載の方法。
- 複数の別個の実体の個別の実体のそれぞれが、ゼロまたは1つの細胞のいずれかを統計的に含有するように、細胞を制限希釈で別個の実体中にカプセル封入する、請求項329に記載の方法。
- 分子標的が、細胞のうち1個または複数の表面と結合している、またはそれと会合している、請求項329または330に記載の方法。
- アフィニティー試薬が、抗体である、請求項327から331のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、DNAまたはその類似体を含む、請求項327から332のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、RNAまたはその類似体を含む、請求項327から332のいずれか一に記載の方法。
- 複数のアフィニティー試薬のそれぞれおよび/または第1の核酸バーコード配列を含む各オリゴヌクレオチドが、固有分子識別子(UMI)を含み、これらは、それぞれ、アフィニティー試薬のそれぞれおよび/または第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドのそれぞれを独特に同定する、請求項327から332のいずれか一に記載の方法。
- 複数のアフィニティー試薬を、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよび/またはmRNAディスプレイのうち1種または複数を使用して作製する、請求項327から335のいずれか一に記載の方法。
- 複数のアフィニティー薬剤を標識するために使用されるオリゴヌクレオチドを、共有結合性、イオン性および疎水性相互作用のうち1種または複数によってアフィニティー薬剤を結合させる、請求項327から336のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項327から336のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬にバーコード付加して増幅させる方法であって、
生体材料中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、生体材料を、それぞれ、分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
生体材料を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種またはその増幅産物中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 生体材料が、固定された細胞の生成物である、請求項339に記載の方法。
- アフィニティー試薬が、抗体である、請求項339または340に記載の方法。
- 固有分子識別子(UMI)をオリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬中に組み込むステップを含む、請求項339から341のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項339から342のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項339から343のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項339から343のいずれか一に記載の方法。
- 導入が請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項339から343のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項339から343のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬にバーコード付加して増幅させる方法であって、
細胞中に存在する場合には、アフィニティー試薬のそのそれぞれの分子標的との特異的結合に十分な条件下で、複数の細胞を、それぞれ、分子標的に特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、それとコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
細胞を複数の第1の別個の実体中にカプセル封入し、溶解するステップと、
核酸バーコード配列を含む複数の第2の別個の実体を提供するステップと、
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物、複数の第2の別個の実体のうちの1種の内容物ならびに核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅産物中への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
複数の第1の別個の実体のうちの1種および複数の第2の別個の実体のうちの1種の組み合わされた内容物を含む別個の実体を、核酸バーコード配列のうちの1種の、アフィニティー試薬とコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドのうちの1種およびその増幅への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 多くて1個の細胞が、第1の別個の実体のそれぞれ中に存在するように、細胞を、第1の別個の実体中にカプセル封入する、請求項348に記載の方法。
- アフィニティー試薬が、抗体である、請求項348または349に記載の方法。
- 固有分子識別子(UMI)を、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬中に組み込むステップを含む、請求項348から350のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項348から351のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項348から352のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項348から352のいずれか一に記載の方法。
- 導入が請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項348から352のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項348から352のいずれか一に記載の方法。
- タンパク質とコンジュゲートしている核酸を連結し、増幅するための方法であって、
複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、
相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物および存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な試薬を組み合わせるステップと、
別個の実体を、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列の増幅および連結に十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 集団を、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイのうち1種または複数を使用して調製する、請求項357の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項357から358のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項357から359のいずれか一に記載の方法。
- 精製ステップを使用して、カプセル封入に先立って非相互作用性タンパク質を除去する、請求項357から360のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体中に存在する固有の増幅産物の数に基づいて、非相互作用性タンパク質に対して、相互作用性タンパク質を同定するステップを含む、請求項357から361のいずれか一に記載の方法。
- 相互作用が特異的結合相互作用である、請求項357から362のいずれか一に記載の方法。
- バーコード付加を用いてタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための方法であって、
複数のタンパク質が相互作用するのに十分な条件下で核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団をインキュベートして、核酸バーコード配列を相互作用性タンパク質と互いに近接させるステップと、
相互作用性タンパク質が、存在する場合には同時カプセル封入されるように、核酸バーコード配列がコンジュゲートしているタンパク質の集団を、複数の別個の実体中にカプセル封入するステップと
マイクロ流体デバイスを使用して、別個の実体中で、複数の第1の別個の実体のうちの1種の内容物および第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な試薬を組み合わせるステップと、
別個の実体を、第2の核酸バーコード配列の、存在する場合には相互作用性タンパク質上の核酸バーコード配列またはその増幅産物への組込みに十分な条件に供するステップと
を含む、方法。 - 集団を、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイのうち1種または複数を使用して調製する、請求項364に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項364から365のいずれか一に記載の方法。
- 144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項364から366のいずれか一に記載の方法。
- 精製ステップを使用して、カプセル封入に先立って非相互作用性タンパク質を除去する、請求項364から367のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体中の固有の第2の核酸バーコード配列またはその増幅産物の数に基づいて、非相互作用性タンパク質に対して、相互作用性タンパク質を同定するステップを含む、請求項364から368のいずれか一に記載の方法。
- 相互作用が特異的結合相互作用である、請求項364から369のいずれか一に記載の方法。
- 分子、分子複合体および/または構造体中に存在するエピトープを決定する方法であって、
アフィニティー試薬の、分子、分子複合体および/または構造体中に存在する場合には、そのそれぞれのエピトープとの特異的結合に十分な条件下で、複数の分子、分子複合体および/または構造体を、それぞれ、エピトープに特異的な複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、アフィニティー試薬のエピトープ特異性を同定する、コンジュゲートしている第1の核酸バーコード配列を含む、ステップと、
別個の実体中に、1種または複数のアフィニティー試薬と特異的に結合される分子、分子複合体および/または構造体をカプセル封入するステップと、
第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、別個の実体を独特に同定する、ステップと、
第2の核酸バーコード配列を含む第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物をシーケンシングして、分子、分子複合物および/または構造体上に存在するエピトープを同定するステップと
を含む、方法。 - エピトープが、翻訳後修飾またはスプライシング変動を含む、請求項371に記載の方法。
- バーコード付加またはシーケンシングに先立って、免疫沈降を使用して、1種または複数のエピトープと特異的に結合しているアフィニティー試薬を濃縮することを含む、請求項371または372に記載の方法。
- アフィニティー試薬が、抗体である、請求項371から373のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項371から374のいずれか一に記載の方法。
- サンプル中のアフィニティー試薬の数を決定するための方法であって、
1種または複数の分子標的を含有すると疑われるサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、アフィニティー試薬およびオリゴヌクレオチドの一方または両方が、複数のアフィニティー試薬のそれぞれを独特に同定する固有分子識別子(UMI)を含む、ステップと、
UMIを使用して、サンプル中のアフィニティー試薬の数を決定するステップと
を含む、方法。 - 核酸バーコード配列を増幅するステップを含み、UMIが増幅バイアスについて補正するために使用される、請求項376に記載の方法。
- 増幅することを、1つまたは複数の微小滴中で実施する、請求項377に記載の方法。
- アフィニティー試薬が、抗体ではない、請求項376から378のいずれか一に記載の方法。
- 標識されたアフィニティー試薬にバーコード付加する方法であって、
1種または複数の分子標的を含有するサンプルを、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
サンプルから1種または複数の分子標的を単離するステップと、
第2の核酸バーコード配列を、オリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、第2の核酸バーコード配列が、1種または複数の分子標的を用いて単離されたアフィニティー試薬を独特に同定する、ステップと、
組み込まれている第2の核酸バーコード配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物をシーケンシングして、サンプル中の1種または複数の分子標的のうち1種と結合している複数のアフィニティー試薬を同定するステップと
を含む、方法。 - 1種または複数の分子標的が、1個または複数の細胞によって含まれる、請求項380に記載の方法。
- 単離するステップが、個々の細胞を個々のウェル中に分配するステップを含む、請求項381に記載の方法。
- 単離するステップが、マイクロ流体細胞捕獲デバイスを使用して個々の細胞を単離するステップを含む、請求項381に記載の方法。
- 1種または複数の細胞中で遺伝子修飾を同定するための方法であって、
1つまたは複数の遺伝子修飾を、複数の細胞中に導入するステップと、
複数の細胞への1つまたは複数の遺伝子修飾の導入に起因する1種または複数の細胞表現型を同定するステップと、
別個の実体中の細胞のそれぞれを単離し、1つまたは複数の遺伝子修飾を含むDNAの1つまたは複数の領域を選択的に増幅するステップと、
核酸バーコード配列を、1つまたは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物中に組み込むステップであって、核酸バーコード配列が、単細胞を起源とするような1つまたは複数の遺伝子修飾を同定する、ステップと、
1つもしくは複数の遺伝子修飾を含む増幅されたDNAまたはその増幅産物をシーケンシングして、1種または複数の細胞表現型を有する細胞中で1つまたは複数の遺伝子修飾を同定するステップと
を含む、方法。 - 選択的に増幅することおよび組み込むことを、SOEing PCRを使用して実施する、請求項384に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項384から385のいずれか一に記載の方法。
- 144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項384から386のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬および単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させるための方法であって、
複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
複数の細胞を、各別個の実体が多くて1個の細胞を含むように、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、
溶解した細胞を含有する別個の実体中に、第2の核酸バーコード配列ならびにRNAの逆転写、バーコード付加およびcDNA産物の増幅に十分な試薬を導入し、第1の核酸バーコード配列またはその増幅産物を含むオリゴヌクレオチド中に第2の核酸バーコード配列を組み込むステップと
を含む、方法。 - 固有分子識別子(UMI)を、溶解された細胞のRNA分子中に組み込むステップを含む、請求項388に記載の方法。
- 第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドがそれぞれ、固有分子識別子(UMI)を含む、請求項388または389に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項388から390のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項388から391のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項388から391のいずれか一に記載の方法。
- 導入が請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項388から391のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項388から391のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体の成分を、請求項167から172のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、請求項388から391のいずれか一に記載の方法。
- 増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、請求項388から391のいずれか一に記載の方法。
- アフィニティー試薬が、抗体である、請求項388から397のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしているアフィニティー試薬および単細胞に由来するRNAにバーコード付加して増幅させるための方法であって、
複数の細胞を、複数のアフィニティー試薬と接触させるステップであって、アフィニティー試薬のそれぞれが、分子標的に特異的であり、アフィニティー試薬の特異性を同定する第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ステップと、
複数の細胞を、各第1の別個の実体が多くて1個の細胞を含むように、複数の第1の別個の実体中にカプセル封入するステップと、
第1の別個の実体中で複数の細胞を溶解するステップと、
複数の第2の別個の実体中の複数の第2の核酸バーコード配列を提供するステップと、
第1の別個の実体のそれぞれを、第2の別個の実体のうちの1種と組み合わせて、第1のマイクロ流体デバイスにおいて第3の別個の実体を形成するステップであって、第3の別個の実体が、RNAのcDNA産物への逆転写に十分な試薬を含む、ステップと、
第2のマイクロ流体デバイスを利用して、第3の別個の実体中に、cDNA産物のバーコード付加および増幅に十分な試薬を導入し、第2の核酸バーコード配列を、第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその増幅産物中に組み込むステップと
を含む、方法。 - 固有分子識別子(UMI)を、溶解された細胞のRNA分子中に組み込むステップを含む、請求項399に記載の方法。
- 第1および第2マイクロ流体デバイスが異なっている、請求項399または400に記載の方法。
- 第1および第2マイクロ流体デバイスが異なっている、請求項399または400に記載の方法。
- 第1の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドがそれぞれ、固有分子識別子(UMI)を含む、請求項399または400に記載の方法。
- 別個の実体が、微小滴である、請求項399から390のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項1から95のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項399から404のいずれか一に記載の方法。
- 核酸バーコード配列またはUMIを、請求項96から120または130から136のいずれか一に従って、調製または導入する、請求項399から404のいずれか一に記載の方法。
- 導入が請求項137から139または154から166のいずれか一に従う、請求項399から404のいずれか一に記載の方法。
- 請求項144から153のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを少なくとも部分的に使用して実施する、請求項399から404のいずれか一に記載の方法。
- 別個の実体の成分を、請求項167から172のいずれか一に示されるようなマイクロ流体デバイスを使用して混和する、請求項399から404のいずれか一に記載の方法。
- 増幅を、リガンド、例えば、ビオチンまたはチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施する、請求項399から404のいずれか一に記載の方法。
- アフィニティー試薬が、抗体である、請求項399から410のいずれか一に記載の方法。
- シーケンシングのためにバーコード付加されたDNAを調製する方法であって、
DNAを複数の断片に断片化し、複数の断片が、5’末端、3’末端および内部の断片を含むステップと、
固相支持体とともに、1つまたは複数の別個の実体中に、複数の断片をカプセル封入するステップと、
固相支持体上に5’末端および/または3’末端を可逆的に固定化するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端から内部断片を分離するステップと、
固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を放出するステップと
を含む、方法。 - 断片化が、物理的せん断を含む、請求項412に記載の方法。
- 断片化が、1種または複数の酵素を用いる酵素的断片化を含む、請求項412に記載の方法。
- 固相支持体が、ビーズである、請求項412から414のいずれか一に記載の方法。
- ビーズが、磁性ビーズである、請求項415に記載の方法。
- 固相支持体上に可逆的に固定化されている5’末端および/または3’末端を、酵素的修飾に供するステップを含む、請求項412から416のいずれか一に記載の方法。
- 酵素的修飾が、制限消化、連結およびポリアデニル化から選択される、請求項417に記載の方法。
- 断片化が、DNAの5’末端および/または3’末端を固相支持体上に可逆的に固定化することの後に起こる、請求項412から418のいずれか一に記載の方法。
- 1種または複数の別個の実体が、微小滴である、請求項412から419のいずれか一に記載の方法。
- バーコードを使用してシーケンシングリードをグループ化するための方法であって、
核酸バーコード配列を含む複数の核酸分子をシーケンシングして、シーケンシングリードを提供するステップであって、複数の核酸分子が、同一および異なる別個の実体を起源とする核酸分子を含む、ステップと、
ハミングまたはレーベンシュタイン距離基準を使用して核酸バーコード配列によってシーケンシングリードをグループ化するステップと、
シーケンシングリード中に組み込まれた1種または複数のさらなるバーコードまたは固有分子識別子(UMI)の配列を使用して、同一の別個の実体を起源とするバーコードグループを統計的に決定するステップと、
同一の別個の実体を起源としたバーコードグループのリードを組み合わせるステップと、
各シーケンシングリードのバーコード部分を除去して、さらなる解析のために残りの部分を使用するステップと
を含む、方法。 - バーコード付加された核酸のライブラリーから配列ライブラリーを調製するための方法であって、
バーコード付加された核酸の第1のライブラリーを作製するステップと、
第1のライブラリーからシーケンシングライブラリーを調製するステップと、
第1のライブラリーを保存するステップと、
第1のライブラリーから第2のシーケンシングライブラリーを調製するステップと
を含む、方法。 - 第1のライブラリーが、可溶性核酸を含む、請求項422に記載の方法。
- 第1のライブラリーが、固相支持体と結合している核酸を含む、請求項422に記載の方法。
- 固相支持体が、1種または複数のビーズを含む、請求項424に記載の方法。
- 蛍光活性化細胞選別(FACS)、PCR活性化細胞選別(PACS)または磁性活性化細胞選別(MACS)のうち1種または複数によってビーズを選別するステップを含む、請求項422から425のいずれか一に記載の方法。
- 第1のライブラリーを、標識されたプライマーを用いてライブラリーの核酸を増幅して標識されたプライマーの標識に対して特異的結合親和性を有するアフィニティー試薬を用いて増幅産物を単離することによって、保存および/またはさらなる処理のために精製する、請求項422から426のいずれか一に記載の方法。
- 標識がビオチンであり、アフィニティー試薬がストレプトアビジンである、請求項427に記載の方法。
- 1種または複数のビーズ上に、ストレプトアビジンをコーティングする、請求項428に記載の方法。
- バーコード付加された核酸のライブラリーから配列ライブラリーを調製するための方法であって、
バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップであって、ライブラリーが、複数の細胞を起源とする核酸分子の配列を含む、ステップと、
ライブラリーから配列情報を得るステップと、
配列情報を使用して、特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅可能なプライマーを設計するステップと、
特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅し、解析するステップと
を含む、方法。 - 特定の細胞を起源とする配列を含むバーコード付加された核酸を選択的に増幅可能なプライマーが、バーコード付加された核酸またはそれに相補的な配列のライブラリーのこれまでの解析から得られた核酸バーコード配列を含む、請求項430に記載の方法。
- バーコード付加された配列ライブラリーを解析するための方法であって、
バーコード付加された核酸のライブラリーを作製するステップと、
ライブラリーを第1のカバー深度でシーケンシングして、ライブラリー中の複数のバーコードグループについての情報を得るステップと、
ライブラリー中の複数のバーコードグループについての情報を解析して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのためにバーコードグループのサブセットを同定するステップと、
バーコードグループのサブセットの核酸について濃縮して、第2のより深いカバー深度でのシーケンシングのために、標的化されるライブラリーを製造するステップと
を含む、方法。 - バーコードグループのサブセットの核酸が、1種または複数のビーズと結合され、濃縮が、バーコードグループのサブセットのうちの1つの既知バーコードと相補的である標識されたプローブとハイブリダイズして、標識されたプローブを使用してビーズを選別するステップを含む、請求項432に記載の方法。
- 選別が、蛍光活性化セルソーター(FACS)による、請求項433に記載の方法。
- 濃縮が、バーコードグループのサブセット中の特定のバーコード配列とハイブリダイズするプライマーを利用して、マイクロ流体小滴においてPCR活性化選別を実施し、それによって、バーコードグループのサブセットの核酸を選別するステップを含む、請求項432に記載の方法。
- バーコードグループのサブセットの核酸が、1種または複数のビーズと結合している、請求項435に記載の方法。
- 濃縮が、バーコードグループのサブセット中の特定のバーコード配列とハイブリダイズするプライマーを利用して、プライマーを使用してバーコードグループのサブセットの核酸を増幅するステップを含む、請求項432に記載の方法。
- 組織を解析するための方法であって、
組織を複数の細胞または細胞凝集塊に脱凝集するステップを含み、
1から437の方法およびまたはデバイスのうち1つまたは複数を使用して、複数の細胞または細胞凝集塊のゲノム、トランスクリプトームおよび/またはプロテオームを解析して、組織の不均一性または均一性に関する情報を得る、方法。 - 組織が、固体組織を含む、請求項438に記載の方法。
- 固体組織が、肺、心臓、腎臓および腫瘍組織から選択される、請求項439に記載の方法。
- 組織が、懸濁細胞または細胞凝集塊を含む、請求項439に記載の方法。
- 懸濁細胞または細胞凝集塊が、血液細胞、細胞培養細胞および/または幹細胞を含む、請求項441に記載の方法。
- 核酸をコンビナトリアルバーコード付加するための方法であって、
核酸標的分子を、別個の実体中にカプセル封入するステップと、
別個の実体中に、核酸標的分子の断片化および核酸バーコード配列の、断片への組込みに十分な試薬を導入するステップであって、試薬が、複数の固有な核酸バーコード配列を含む、ステップと、
別個の実体をインキュベートして、核酸標的分子を断片化し、複数の固有の核酸バーコード配列のうち第1のものを、第1の断片中に、また固有の核酸バーコード配列のうち第2のものを、第2の断片中に組み込むステップと
を含む、方法。
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