CN115011670A - 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序 - Google Patents

通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序 Download PDF

Info

Publication number
CN115011670A
CN115011670A CN202210828875.5A CN202210828875A CN115011670A CN 115011670 A CN115011670 A CN 115011670A CN 202210828875 A CN202210828875 A CN 202210828875A CN 115011670 A CN115011670 A CN 115011670A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
barcode
sequence
droplets
droplet
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210828875.5A
Other languages
English (en)
Inventor
A·R·阿贝特
J·哈里伯顿
F·兰
A·R·夏穆比
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN115011670A publication Critical patent/CN115011670A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1456—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F25/40—Static mixers
    • B01F25/42—Static mixers in which the mixing is affected by moving the components jointly in changing directions, e.g. in tubes provided with baffles or obstructions
    • B01F25/43—Mixing tubes, e.g. wherein the material is moved in a radial or partly reversed direction
    • B01F25/433—Mixing tubes wherein the shape of the tube influences the mixing, e.g. mixing tubes with varying cross-section or provided with inwardly extending profiles
    • B01F25/4338—Mixers with a succession of converging-diverging cross-sections, i.e. undulating cross-section
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B01F33/302—Micromixers the materials to be mixed flowing in the form of droplets
    • B01F33/3021—Micromixers the materials to be mixed flowing in the form of droplets the components to be mixed being combined in a single independent droplet, e.g. these droplets being divided by a non-miscible fluid or consisting of independent droplets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means, e.g. by light scattering, diffraction, holography or imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1404—Fluid conditioning in flow cytometers, e.g. flow cells; Supply; Control of flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1484—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers microstructural devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F21/00—Dissolving
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/02—Identification, exchange or storage of information
    • B01L2300/021—Identification, e.g. bar codes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B01L2300/123—Flexible; Elastomeric
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0409—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces centrifugal forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0424—Dielectrophoretic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • G01N15/149—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N2015/0288—Sorting the particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N2015/0294—Particle shape
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1493—Particle size
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1497—Particle shape

Abstract

本发明涉及通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序。提供了用于条形码化有待例如经由核酸测序技术分析的核酸靶分子的微流控方法。还提供了制备用于各种条形码化应用中的核酸条形码的基于液滴的微流控方法。本文描述的方法利于核酸靶分子的高通量测序以及单细胞和单病毒基因组、转录组和/或蛋白质组分析/剖析。还提供了用于实践所述主题方法的系统和装置。

Description

通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序
本申请是中国专利申请号201680020884.4的分案申请。
交叉引用
本申请要求2015年2月4日提交的美国临时申请第62/112,075号的优先权益，所述申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
政府资助
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的资助号1R21HG007233-02、1DP2AR068129-01和1R01EB019453-01、由国防部授予的资助号HR0011-12-C-0065、N66001-12-C-4211和HR0011-12-C-0066以及由国家科学基金会授予的资助号DBI-1253293下借助政府支持进行的。政府对本发明有一定的权利。
引言
其中使代表条形码的核酸序列与要分析的分子靶标连接的核酸条形码化技术在各种应用中有用，包括例如，其中要对许多单个样品进行并行测序的测序应用。核酸条形码在细胞的高通量基因组、转录组和/或蛋白质组分析和/或/剖析中特别有用。
发明内容
本公开提供了用于条形码化有待例如经由核酸测序技术分析的核酸靶分子的微流控方法。还提供了制备用于各种条形码化应用中的核酸条形码的基于液滴的微流控方法。本文描述的方法利于核酸靶分子的高通量测序以及单细胞和单病毒基因组、转录组和/或蛋白质组分析/剖析。还提供了用于实践所述主题方法的系统和装置。
附图简述
可从下面结合附图阅读的详细描述最好地理解本发明。包括在附图中的是以下图：
图1提供了描绘一种生成核酸条形码文库的方法的示意图。
图2提供了描绘一种条形码化从单个细胞分离的核酸的方法的示意图。
图3提供了配置为使含细胞裂解物的微滴和含核酸条形码的液滴配对并合并的微流控装置的示意图和图像。还描绘了与含PCR试剂的微滴的合并。图3(右)示意性描绘了核酸条形码向cDNA产物中的并入。
图4提供了图2-3中描绘的微流控装置及其各个特征件更详细的示意图。
图5提供了配置用于小滴-液流组合法的微流控装置的图像。(A)再注入的小滴沿对称流动聚焦小滴制造器(symmetric flow-focus drop-maker)的一个油侧通道向下行进并且在产生小滴之前与水相电聚结(electrocoalesce)。(B)小滴在喷射条件下类似地经喷射小滴制造器结合。
图6提供了配置用于使用基于射流的微流控技术处理小体积流体的微流控装置的图像。再注入小滴并且与油包水射流电聚结。滴液保持为一团并且可经分裂、稀释且稍后形成为小滴。
图7提供了描绘用于条形码化和分析模板DNA的示例性方法的示意图。模板DNA经物理分离并扩增，然后将每组扩增子片段化并独特地条形码化。可在短读段测序仪上对片段进行测序，然后基于其条形码进行生物信息学分选。由含有相同条形码的短读段(shortread)构建长读段(Long read)。
图8提供了描绘以高通量分离和条形码化单核酸分子的示例性方法的示意图。通过包封到液滴中来分离单分子。然后可以使单分子在这些液滴中扩增以生成这些分子的克隆群体。然后使其在这些液滴中片段化和条形码化，使得每个液滴含有源自相同单分子并且经独特条形码化的片段。
图9提供了示例性微流控装置的图像，其包括连环化合并架构，该架构包括10个串联的液滴合并结构。
图10提供了说明在液滴中通过数字滚环扩增(RCA)制备ssDNA条形码的方法中的步骤的示意图。
图11提供了说明通过数字PCR在液滴中制备dsDNA条形码的方法中的步骤及其在连接-PCR中的用途的示意图。
图12提供了说明在全转录组扩增和mRNA条形码化的方法中的步骤的示意图。
图13提供了说明在液滴中通过转录链式反应(TCR)制备ssDNA条形码的方法中的步骤的示意图。
图14提供了说明通过滚环转录链式反应(rcTCR)在液滴中制备ssDNA条形码的方法中的步骤的示意图。
图15提供了可连同本文描述的方法和装置一起使用的扇叶式混合器的图像。
图16提供了说明实施例8中采用的方法中的片段化步骤的示意图。
图17提供了说明实施例8中采用的方法中的连接步骤的示意图。
图18提供了相对于实施例8的步骤II和III的替代步骤的示意图。
图19提供了如实施例8中所用的SOE-PCR反应步骤的示意图。
图20提供了根据实施例8生成的条形码片段的示意图。
图21提供了根据本公开的一个实施方案的单分子深度测序工作流程的示意图。(A)将条形码分子包封在有限稀释的液滴中并扩增，生成可用于使液滴中的分子条形码化的乳液文库。(B)为使用本文描述的方法对单个长模板分子进行深度测序，将单独分子包封在液滴中并使用，例如PCR或MDA进行扩增。然后使用片段化酶(fragmentase)/连接酶或，例如标签化反应(tagmentation reaction)，使扩增的分子片段化并与接头连接。将条形码液滴添加到含片段化分子的液滴中，然后使用重叠延伸PCR将条形码剪接到片段上。对短读段进行测序并通过条形码分选以生成对应于原靶分子的集群(cluster)，然后可以重新组装集群。
图22提供了说明在本公开的一个实施方案中进行单分子深度测序的微流控步骤的示意图。(步骤1)使用微流控流动聚焦，接着进行乳液的热循环来实现靶分子的包封。(步骤2)使用分裂-合并装置(split-merger device)实现标签化反应，将扩增的靶标液滴引入所述装置，分裂出一小部分，并且使该部分与含有标签化试剂的液滴合并。分裂模板液滴允许回收需要量的DNA并且通过与靶标液滴合并而将其稀释成标签化反应的适当浓度。(步骤3)通过合并来自步骤2的液滴与新形成的含PCR试剂的液滴和先前步骤(未示出)中产生的含扩增条形码的液滴来使扩增的和标签化的分子条形码化。使乳液经热循环，从而使条形码连接至片段。
图23提供了显示SMDS中条形码组的表征的图。条形码分子经化学合成并且表现出相对均一的碱基组成(左上)。选择条形码长度，使得对于SMDS工作流程中所用的条形码数量而言，样品条形码之间的汉明距离(hamming distance)较大，如右上，汉明距离直方图所示。这样使得可以很简单地鉴定哪些条形码应聚集成一个组，即使由于扩增或测序误差而存在不完美匹配。下图显示了不同大小的条形码组的读段计数。例如，有一个与之对应的读段的条形码组将具有为1的大小，x-轴，而所有这种1个读段的条形码组的读段计数的数量构成y-轴。插图中提供了以升序分选的每个条形码组的读段数量。
图24提供了随条形码组数量变化而映射到单个模板，以升序分选的条形码组的百分比的图，上图。插图显示可以通过将来自两个模板分子的片段化读段随机分群为条形码集群而产生条形码组组成的p值。前3000个条形码具有相对高的p值，表明这些集群显示出来自两个起始分子的片段的随机混合，但较高的条形码集群数量具有无法用读段的随机组成来解释的组成，表明液滴内的区室化很可能是集群组成的来源。左下方显示对于每个条形码集群而言组装的重叠群(contig)长度的直方图。在这项实验中，对两个分子进行测序，其长度与直方图上的两个峰值相对应。右下方显示根据碱基位置的变化，基于Phred得分计算的组装重叠群的精确度的图。对每个分子进行深度测序产生高Phred得分，使得扩增和测序误差达到平均数。
图25提供了使用SMDS对大肠杆菌(E.coli)基因组进行测序获得的组装重叠群长度的直方图(左图)。使大肠杆菌细胞的基因组片段化并且使单分子片段经历SMDS工作流程，其中使用MDA进行初始靶标扩增而非PCR。这允许对比使用PCR进行首次扩增所可以实现的更长的分子进行深度测序。右图显示了映射到每个重叠群的参考大肠杆菌基因组，以升序分选的重叠群的百分比。
图26提供了用于对配对抗体或T细胞库进行测序的工作流程的示意图。将单独的B或T细胞包封在液滴中，裂解并与独特条形码液滴和RT-PCR试剂组合。使用逆转录酶和重叠延伸反应来由抗体转录物生成cDNA产物并用独特条形码对其进行标记，使得可以将其作为集合对其进行测序，并且根据条形码通过分选来恢复重链和轻链的配对。
图27提供了使用单细胞条形码化对在抗体基因中表现出超突变的Raji细胞系的抗体库进行测序获得的数据。在测序分析中回收的240,000个条形码集群中，11,800个具有＞64个读段并且被保留而其它的被丢弃。这些中，仅约1000个具有来自其中一条链的读段，并且被丢弃。这提供了10,800个条形码组，对应于可用于测量链内超突变的单细胞。上图显示了在重链(*中间)和轻链(右侧)的指定位置含有突变的条形码组的数量。下面提供了这两条链的基因的结构。从这个数据看，观察到不同的细胞谱系并且基于重链(下部、中间)和轻链的同源性生成了树状图(tree)。由于配对，可能追踪共有相同重链序列(L177，读段)的突变体并且观察这些链如何与不同的轻链突变体配对(L301和303，红色)。
图28提供了用于进行全转录组单细胞测序的液滴条形码化工作流程的示意图。左图显示了分子生物学步骤且右图显示了微流控处理步骤。包封单细胞、裂解并且与含有独特条形码和RT-PCR试剂的液滴合并；然后使液滴热循环以进行条形码化反应，之后使液滴破裂，回收核酸并将其准备用于测序。该过程使用用多聚胸苷酸引物的SMART/模板转换以由细胞中的所有mRNA生成cDNA产物。使UMI在这个步骤期间连接以使得扩增偏差的校正成为可能。然后使用SOE-PCR使条形码连接至cDNA产物，产生准备好进行测序准备的条形码化分子。
图29提供了用液滴条形码化制备的扩增转录组的生物分析数据。数据显示了正如对于健康转录组数据所预期的，集中在约1500bp的cDNA产物的广泛分布。下图显示了与哺乳动物细胞的预期分布同样显示出良好一致性的cDNA分子尺寸的直方图。
具体实施方式
本公开提供了用于条形码化有待例如经由核酸测序技术分析的核酸靶分子的微流控方法。还提供了制备用于各种条形码化应用中的核酸条形码的基于液滴的微流控方法。本文描述的方法利于核酸靶分子的高通量测序以及单细胞和单病毒基因组、转录组和/或蛋白质组分析/剖析。还提供了用于实践所述主题方法的系统和装置。
在更详细的描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因此可以变化。还应理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，而非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
提供值的范围时，应理解除非上下文另外明确指出，否则也明确地公开了介于该范围上限和下限之间的每个居中值，到下限单位的十分之一。介于规定范围内的任何规定值或居中值与该规定范围内的任何其它规定或居中值之间的每个较小范围涵盖在本发明内。在该范围内可独立地包括或排除这些较小范围的上限和下限，并且其中任一限值、两个限值都不或两个限值都包括在较小范围内的每个范围，也涵盖在本发明中，以规定范围内任何明确排除的限值为条件。规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在本发明的实践和试验中可以使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但现在可描述一些潜在和示例性的方法和材料。本文提到的任何及所有出版物以引用的方式并入本文以公开和描述连同出版物一起引用的方法和/或材料。应理解，就存在矛盾来说，本公开代替所并入的出版物的任何公开内容。
必须指出的是，如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个(种)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提到“一个液滴”包括多个此类液滴。
还应指出，权利要求可起草为排除任何要素，例如任何任选要素。同样，该声明旨在用作连同对权利要求要素的叙述一起使用诸如“只”、“仅”等专用术语，或使用“负面”限制的前置基础。
本文讨论的出版物只是为了其在本申请的提交日期之前公开而提供。进一步地，所提供的出版物的日期可以不同于实际出版日期，这可能需要单独确认。就本文的公开内容或任何术语的定义或使用与以引用的方式并入本文的申请或出版物中的公开内容或任何术语的定义或使用相矛盾来说，应以本申请为准。
正如在阅读本公开后本领域的技术人员将显而易见的，本文描述和说明的每个单独实施方案具有离散组成部分和特征，在不背离本发明的范围或精神的前提下，可以容易地与其它几个实施方案中的任一个的特征分开或组合。任何所述方法均可按所述事件的顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行。
如本文中所用的术语“核酸条形码序列”、“核酸条形码”、“条形码”等是指具有可用于鉴定和/或区别核酸条形码与之偶联的一个或多个第一分子与一个或多个第二分子的序列的核酸。核酸条形码序列通常较短，例如长度为约5至20个碱基，并且可与一个或多个所关注的靶分子或其扩增产物偶联。核酸条形码序列可为单链或双链。
如本文中所用的术语“独特分子标识符(UMI)”或“UMI”是指具有可用于鉴定和/或区别UMI与之偶联的一个或多个第一分子与一个或多个第二分子的序列的核酸。UMI通常较短，例如长度为约5至20个碱基，并且可与一个或多个所关注的靶分子或其扩增产物偶联。UMI可为单链或双链。在一些实施方案中，核酸条形码序列和UMI两者均并入核酸靶分子或其扩增产物中。通常UMI用于区别一个群体或组内相似类型的分子，而核酸条形码序列用于区别分子群体或组。在一些实施方案中，利用UMI和核酸条形码序列两者时，UMI序列长度比核酸条形码序列短。在一些实施方案中，利用UMI和核酸条形码序列两者时，在核酸条形码序列并入之前，将UMI并入到靶核酸或其扩增产物中。在一些实施方案中，利用UMI和核酸条形码序列两者时，在UMI并入靶核酸或其扩增产物之后，将核酸条形码序列并入到UMI或其扩增产物中。
如本文中所用的术语“偶联”是指两个实体，例如分子、化合物或其组合之间的共价或离子相互作用。
本文可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”，是指任何长度的氨基酸聚合形式，其可以包括编码和非编码氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸，及具有经修饰的肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和天然前导序列，有或无N端甲硫氨酸残基的融合物；免疫标记蛋白；具有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如包括作为融合伴侣的荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等的融合蛋白等。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保持与抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段，嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体，及包括抗体和非抗体蛋白的抗原结合部分的融合蛋白。抗体可经例如放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白、核酸条形码序列等可检测地标记。抗体可进一步与其它部分偶联，如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等。该术语还涵盖Fab’、Fv、F(ab’)2及保持与抗原的特异性结合的其它抗体片段。
抗体可呈各种其它形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab′)2，以及双功能(即双特异性)杂交抗体(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17，105(1987))及呈单链(例如，Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等人，Science，242，423-426(1988)，其以引用的方式并入本文)。(通常，参见，Hood等人，Immunology，Benjamin，N.Y.，第2版(1984)，及Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)。
如本文中所用的“结合”通常是指两个分子(本文称为“结合伴侣”，例如底物和酶或抗体和表位)之间的共价或非共价相互作用，所述结合通常是特异性的。
如本文中所用，“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合伴侣之间的相互作用，使得结合伴侣相互结合，但在一组给定条件(例如，生理条件)下不会在显著或实质性水平上结合环境中(例如，生物样品、组织中)可能存在的其它分子。
术语“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用并且是指任何长度的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物的聚合形式。该术语涵盖，例如DNA、RNA及其修饰形式。多核苷酸可具有三维结构，并且可执行已知或未知的任何功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、控制区、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸分子可为线性或环状。
术语“核酸序列”或“寡核苷酸序列”是指一串连续的核苷酸碱基并且在特定情况下也指核苷酸碱基在寡核苷酸中出现时彼此相对的特定布置。类似地，术语“多肽序列”或“氨基酸序列”是指一串连续的氨基酸并且在特定情况下也指氨基酸在多肽中出现时彼此相对的特定布置。
术语“互补”或“互补性”是指多核苷酸(即核苷酸序列)通过碱基配对原则相关联。例如，序列“5’-AGT-3”’与序列“5’-ACT-3”’互补。互补性可以是“局部的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配，或者在核酸之间可能存在“完全”或、“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间在限定条件下的杂交效率和强度具有显著影响。这对于依赖核酸之间的结合的方法而言特别重要。
如本文中所用，术语“杂交”在提到互补核酸的配对时使用。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受诸如核酸之间的互补程度、所涉条件的严格性及形成的杂交体的Tm等因素影响。“杂交”法涉及一种核酸与另一种互补核酸，即具有互补核苷酸序列的核酸退火。
杂交在容许特异性杂交的条件下进行。互补序列的长度和GC含量影响获得靶位点与靶核酸特异性杂交所必需的杂交条件的热解链温度Tm。杂交可在严格条件下进行。短语“严格杂交条件”是指探针会与通常在核酸的复杂混合物中的其靶标子序列杂交，但不会在可检测或显著水平上与其它序列杂交的条件。严格条件依赖于序列并且在不同情形下会不同。严格条件是在约6至约8的pH下盐浓度低于约1.0M钠离子，如低于约0.01M，包括约0.001M至约1.0M钠离子浓度(或其它盐)并且温度在约20℃至约65℃范围内的条件。严格条件也可经添加去稳定剂，例如但不限于甲酰胺来实现。
术语“热解链温度”、“解链温度”或“Tm”在本文中是指(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)在平衡状态下，与靶标互补的50％探针与靶序列杂交时的温度(靶序列过量存在时，在Tm下，在平衡状态下50％的探针被占用)。在一些情况下，术语“Td”用于定义至少一半的探针与完美匹配的靶核酸解离时的温度。
相应核苷酸之间形成具有所有完美形成的氢键的双链分子称为“匹配”或“完美匹配”，并且具有一对或几对不对应的核苷酸的双链体称为“错配”。单链RNA或DNA分子的任何组合在适当的实验条件下均可形成双链分子(DNA:DNA、DNA:RNA、RNA:DNA或RNA:RNA)。
短语“选择性(或特异性)杂交”是指特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如，总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与该序列结合、双链化或杂交。
本领域的普通技术人员将容易认识到可以利用替代性杂交和洗涤条件来提供相似严格性的条件并且将会认识到，参数的组合比任一单个参数的度量重要得多。
“取代”是分别与多肽的氨基酸或核苷酸序列相比，由一个或多个氨基酸或核苷酸被不同的氨基酸或核苷酸置换所产生。如果取代是保守性的，取代到多肽中的氨基酸具有与其所取代的氨基酸相似的结构或化学性质(例如，电荷、极性、疏水性等)。自然存在的氨基酸的保守性取代通常引起第一氨基酸被来自与第一氨基酸相同组的第二氨基酸取代，其中示例性氨基酸组如下：(1)酸性(带负电的)氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电的)氨基酸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；及(4)中性非极性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，多肽变体可具有“非保守性”变化，其中被取代的氨基酸在结构和/或化学性质上不同。
“缺失”定义为氨基酸或核苷酸序列的变化，其中一个或多个氨基酸或核苷酸残基，分别与自然存在的多肽的氨基酸序列或核苷酸序列相比不存在。在多肽或多核苷酸序列的情况下，考虑到被修饰的多肽或多核苷酸序列的长度，缺失可涉及2、5、10个，多达20个，多达30个或多达50个或更多个氨基酸的缺失。
“插入”或“添加”是氨基酸或核苷酸序列中与自然存在的多肽的氨基酸序列或核苷酸序列相比，已分别引起一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加的变化。“插入”通常是指添加到多肽的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸残基，而“添加”可以是插入或指在N-或C-端添加氨基酸残基。在多肽或多核苷酸序列的情况下，插入或添加可具有多达10个、多个20个、多达30个或多达50个或更多个氨基酸。
“非天然”、“非内源性”和“异源性”，在多肽的情况下，在本文中可互换用于指具有氨基酸序列的多肽或，在表达系统或病毒颗粒的情况下，存在于不同于在自然界中所发现的环境中。
“外源性”在核酸或多肽的情况下用于指已经引入宿主细胞的核酸或多肽。“外源性”核酸和多肽可以是宿主细胞天然或非天然的，其中相对于引入外源分子之前在宿主细胞中所发现的，在重组细胞中外源性、天然核酸或多肽提供了升高水平的编码基因产物或多肽。
如本文中所用，术语“测定(determining)”、“测量”、“评估”和“测定(assaying)”可互换使用并且包括定量和定性测定。
如本文中所用，术语“分离”在用于分离化合物的情况时，是指所关注化合物所处环境不同于化合物自然存在的环境。“分离”意在包括基本上富集所关注化合物和/或其中所关注化合物部分或基本上纯化的样品内的化合物。
如本文中所用，术语“基本上纯的”是指化合物从其自然环境中取出并且至少60％不含、75％不含或90％不含与之自然缔合的其它组分。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列，是例如，在体内置于适当调控序列(或“控制元件”)的控制下时，转录(在为DNA的情况下)和翻译(在为mRNA的情况下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界通常由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，及合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3′。其它“控制元件”也可与编码序列缔合。编码多肽的DNA序列可通过使用选定细胞优选为代表所需多肽编码序列的DNA拷贝的密码子优化以在选定细胞中表达。
“由......编码”是指编码基因产物，如多肽的核酸序列。在基因产物为多肽时，多肽序列或其一部分含有来自由核酸序列编码的多肽的至少3至5个氨基酸、8至10个氨基酸或至少15至20个氨基酸的氨基酸序列。
“可操作地连接”是指元件的排列，其中这样描述的组件配置为以便执行其常用功能。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将对编码序列的表达有影响。启动子或其它控制元件不需要与编码序列相邻，只要它们起到指导其表达的作用。例如，在启动子序列和编码序列之间可存在插入的未翻译但经转录的序列，并且仍可将启动子序列视为与编码序列“可操作地连接”。
用“核酸构建体”意指已经构建为包括在自然界中未一起发现的一个或多个功能单元的核酸序列。实例包括环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包括非天然核酸序列的病毒基因组等。
“载体”能够将基因序列转移到靶细胞中。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导所关注基因的表达并且可以将基因序列转移到靶细胞中的任何核酸构建体，这可以通过整个或部分载体的基因组整合，或作为染色体外元件的载体的瞬时或可遗传性保持来实现。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及整合载体。
“表达盒”包括能够指导与表达盒的启动子可操作地连接的所关注的基因/编码序列的表达的任何核酸构建体。此类盒可以构建成“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”，以便将表达盒转移到靶细胞中。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。
测定核酸和氨基酸“序列同一性”的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括测定基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定由此编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列做比较。一般而言，“同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列分别的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的准确对应性。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定其“百分比同一性”来做比较。两个序列(核酸或氨基酸序列)的百分比同一性，是两个比对序列之间准确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics，2：482-489(1981)的局部算法提供了对核酸序列的近似比对。通过使用Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff编辑，第5增刊3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA开发，并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化的评分矩阵，可将这种算法应用于氨基酸序列。
这种算法用于测定序列的百分比同一性的示例性实施由Genetics ComputerGroup(Madison，WI)在“BestFit”实用应用程序中提供。在Wisconsin Sequence AnalysisPackage Program Manual，第8版(1995)(可从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)中描述了这种方法的默认参数。在本发明的上下文中确定百分比同一性的另一种方法是使用版权归University of Edinburgh，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)经销的MPSRCH程序包。从这套包中，可以采用Smith-Waterman算法，其中对于评分表而言使用默认参数(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，并且空位为6)。从生成的数据看，“匹配”值反映了“序列同一性”。通常本领域已知其它适于计算序列间的百分比同一性或相似性的程序，例如，另一种比对程序是BLAST，和默认参数一起使用。例如，可以使用以下默认参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高分；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详情可以通过将http://放在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi前面定位的互联网网址上找到。
当如使用上述方法所测定，序列在分子的限定长度上表现出至少约80％-85％、至少约85％-90％、至少约90％-95％或至少约95％-98％序列同一性时，两个核酸或两个多肽序列彼此“基本上相同”。如本文中所用，基本上相同也指序列与指定核酸或多肽序列显示出完全同一性。
如本文中所用，术语“同源”、“同源性”和“同源区域”是指两个核酸共有至少部分互补性的区域(位点)。同源区域可跨越序列的仅一部分或整个序列。例如，可在Southern杂交实验中，在例如对于该特定系统定义限定的严格条件下，鉴定同源的DNA序列。限定适当杂交条件在本领域的技术范围之内。参见，例如，Sambrook和Russel，Molecular Cloning：ALaboratory Manual第三版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY.
第一多核苷酸，如果具有与第二多核苷酸的一个区域、其cDNA、其互补序列相同或基本上相同的核苷酸序列，或者如果如上所述展示出序列同一性，则“源自”第二多核苷酸。该术语并非意指需要或暗示多核苷酸必须从所述来源获得(虽然也涵盖这种情况)，而是可以通过任何合适的方法制备。
第一多肽(或肽)，如果(i)由源自第二多核苷酸的第一多核苷酸编码，或(ii)如上所述，与第二多肽展示出序列同一性，则“源自”第二多肽(或肽)。该术语并非意指需要或暗示多肽必须从所述来源获得(虽然也涵盖这种情况)，而是可以通过任何合适的方法制备。
术语“离散实体”等在本文中用于指物体，如液滴，包括能够包封和/或容纳如本文所述的一个或多个分子靶标和/或如本文所述的一个或多个条形码或独特分子标识符的多重乳液(如双重乳液)、孔、区室和容器。如连同主题方法、装置和/或系统一起使用或产生的离散实体可为球形或者它们可以具有任何其它合适的形状，例如卵形或长方形。如本文所述的离散实体可包括液相和/或固相材料。在一些实施方案中，根据本公开的离散实体包括凝胶材料。在一些实施方案中，主题离散实体具有一定尺寸，例如直径为约1.0μm至1000μm(包括边界值)，如1.0μm至750μm、1.0μm至500μm、1.0μm至100μm、1.0μm至10μm或1.0μm至5μm(包括边界值)。在一些实施方案中，如本文所述的离散实体具有一定尺寸，例如直径为约1.0μm至5μm、5μm至10μm、10μm至100μm、100μm至500μm、500μm至750μm或750μm至1000μm(包括边界值)。此外，在一些实施方案中，如本文所述的离散实体的体积范围为约1fL至1nL(包括边界值)，如1fL至100pL、1fL至10pL、1fL至1pL、1fL至100fL或1fL至10fL(包括边界值)。在一些实施方案中，如本文所述的离散实体的体积为1fL至10fL、10fL至100fL、100fL至1pL、1pL至10pL、10pL至100pL或100pL至1nL(包括边界值)。另外，如本文所述的离散实体可具有一定尺寸和/或形状，使其可以在微流控装置内部、上面或通过微流控装置产生和/或从微流控装置流出或通过微流控装置施加。
在一些实施方案中，如本文所述的离散实体为液滴。术语“小滴”、“液滴”和“微滴”在本文中可互换使用，指小的、通常为球形的结构，其至少含有第一流体相，例如水相(例如，水)，周围是不可与第一流体相混溶的第二流体相(例如，油)。在一些实施方案中，根据本公开的液滴可含有第一流体相，例如油，周围是第二流体相，例如水相流体(例如，水)。在一些实施方案中，第二流体相将是不混溶相载液。因此根据本公开的液滴可作为油包水乳液或水包油乳液提供。液滴的尺寸和/或形状可如本文对离散实体所述那样。例如，根据本公开的液滴直径范围通常为1μm至1000μm(包括边界值)。根据本公开的液滴可用于包封细胞、核酸(例如DNA)、酶、试剂和各种其它组分。术语液滴可用于指在微流控装置内部、上面或通过微流控装置产生的和/或从微流控装置流出或通过微流控装置施加的液滴。
如本文中所用，术语“载液”是指配置或选择为含有一个或多个离散实体，例如本文所述的液滴的流体。载液可包括一种或多种物质并且可具有一种或多种性质，例如粘性，这允许其流过微流控装置或其一部分，例如输送孔。在一些实施方案中，载液包括，例如：油或水，并且可呈液相或气相。合适的载液在本文中有更详细的描述。
如权利要求中所用，术语“包含”，与“包括”、“含有”和“特征在于”同义，是包括性或开放式的并且不排除另外的、未叙述的要素和/或方法步骤。“包含”是本领域的术语，其意指存在指定的要素和/或步骤，但可以添加其它要素和/或步骤并且仍然属于相关主题的范围之内。
如本文中所用，短语“由......组成”将未明确叙述的任何要素、步骤和/或成分都排除在外。例如，当短语“由......组成”出现在权利要求主体从句中，而不是紧跟着序言时，其仅限制该从句中列出的要素；其它要素并未排除在整体权利要求之外。
如本文中所用，短语“基本上由......组成”将相关公开或权利要求的范围限制为指定的材料和/或步骤，加上不实质性影响所公开和/或要求保护的主题的基本和新颖特征。
关于术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”，本文使用这三个术语之一时，当前公开的主题可以包括使用其它两个术语中的任一个。
方法
如以上所总结的，本公开提供了用于条形码化有待例如经由核酸测序技术分析的核酸靶分子的微流控方法。还提供了制备用于各种条形码化应用中的核酸条形码的基于液滴的微流控方法。本文描述的方法利于核酸靶分子的高通量测序以及单细胞和单病毒基因组、转录组和/或蛋白质组分析/剖析。
用于制备条形码的方法
本公开提供了各种用于制备核酸条形码序列和/或独特分子标识符(UMI)的方法，所述核酸条形码序列和/或独特分子标识符又可以用于标记一个或多个所关注的分子靶标，例如一个或多个所关注的核酸。
细胞条形码：在本公开的一些实施方案中，细胞可用于将条形码递送到离散实体，例如液滴中。例如，在本公开的一些方法中，提供了多个含有细胞裂解物的离散实体。裂解物中的核酸可经条形码化，以便使其测序成为可能，同时允许鉴定源于所述液滴的核酸并因此鉴定源于单细胞的核酸。为实现这一点，可将每个细胞独有的条形码引入到离散实体中。存在各种可用于实现这个目标的方法。一种此类方法是将细胞引入液滴中，其中条形码在该细胞中表达，例如作为高拷贝数质粒。这用于增加条形码的起始浓度，使其更易于整合到细胞核酸的序列中。合适的质粒可以是，例如尺寸为约1kb至约3kb。
使用细胞递送条形码具有许多优点。例如，为产生更多含条形码的细胞供使用，仅需培养含条形码的细胞文库以增大群体的大小。为产生含条形码的细胞，可以通过合成生成作为单分子随机体(randomer)的条形码文库，然后将这些克隆到例如质粒中。然后可将质粒引入宿主细胞，如大肠杆菌中并通过使细胞生长来扩增。
细胞条形码的另一个优点是，可以使用例如惯性排序，可控地将为离散目标的细胞包封到离散实体，例如液滴中。例如细胞，如酵母或大肠肝，可以高速流过通道，导致惯性效应变得重要并且通道中的细胞惯性排序，从而引起细胞的周期性间隔。然后细胞流的周期可以与液滴制造器的液滴生成周期相匹配，使得含条形码的细胞可能有效包封在液滴内。这个过程可以与含裂解物的液滴的配对聚结组合，例如以高效率将条形码添加到含细胞裂解物的液滴中。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在离散实体中；(b)向所述离散实体中引入包含多个拷贝的核酸条形码序列的细胞；(c)使所述细胞裂解以在所述离散实体中释放所述多个拷贝的核酸条形码序列；并且(d)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
在其它实施方案中，本公开提供了一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在第一离散实体中；(b)将细胞包封在第二离散实体中，其中所述细胞包含多个拷贝的核酸条形码序列；(c)合并所述第一和第二离散实体；并且(d)使合并的离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
在一个此类实施方案中，第二离散实体为微滴并且将细胞包封在第二离散实体中的步骤包括(e)在足以实现多个细胞在所述通道内的惯性排序的条件下，使所述细胞流过微流控装置的通道，所述微流控装置包括与所述通道流体连通的液滴发生器，从而向所述液滴发生器提供所述细胞的周期性注入；并且(f)使所述注入的周期与所述液滴发生器的液滴发生周期相匹配，从而使用所述液滴发生器将单个细胞包封在单个微滴中。
珠粒条形码：在本公开的一些实施方案中，可能有利的是将条形码引入到离散实体，例如，珠粒如固体聚合物珠粒或水凝胶珠粒的表面上的微滴中。这些珠粒可以使用各种技术合成。例如，使用混合-分离技术，可以合成具有许多拷贝的相同、随机条形码序列的珠粒。这可以例如通过产生多个珠粒来实现，所述珠粒包括在其上可以合成DNA的位点。可将珠粒分成四个集合并且各自与将为其添加碱基，例如A、T、G或C的缓冲液混合。通过将群体分成四个亚群，每个亚群可以有其中一个碱基添加到其表面。该反应可以按仅添加单个碱基并且不添加其它碱基的方式实现。来自所有四个亚群的珠粒可以组合并混合在一起，并且再次分成四个群体。在这个划分步骤中，来自先前四个群体的珠粒可以随机地混合在一起。然后可将其添加到四种不同溶液中，在每个珠粒的表面上添加另一、随机碱基。可以重复这个过程以在珠粒表面生成长度近似等于分离和混合该群体的次数的序列。如果这进行10次，例如，则结果将是珠粒群体中每个珠粒具有多个拷贝的在其表面上合成的相同随机的10个碱基的序列。每个珠粒上的序列将由在每个混合-分离循环中反应容器终止的特定顺序决定。
也可以用具有随机UMI序列的引物，通过例如PCR杂交和延伸将独特分子标识符(UMI)添加到珠粒表面的分子。这将容许给定珠粒表面上的每个单独条形码都具有独特标识符，使得在测序文库生成期间扩增不同分子的速率偏差可以通过在定量中忽略和/或合计重复UMI来部分校正。
用坚硬珠粒，如聚苯乙烯珠粒，大部分寡核苷酸合成将限于珠粒的表面。然而，也可以使用水凝胶珠粒，如聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐等，优点是它们多孔，容许寡核苷酸甚至在大多数珠粒内合成。这些多孔珠粒具有容许更大数量的寡核苷酸在珠粒上面和/或内部合成的益处，这对于需要用条形码标记大量靶分子或控制后续反应中条形码浓度的化学计量的应用而言可能有利。
水凝胶和其它聚合物珠粒的另一个优点是可以通过改变环境条件而诱导它们熔化或溶解。例如，用由低熔点琼脂糖制成的珠粒，可能使琼脂糖珠粒在加热到水凝胶熔点以上的液滴内融化，这可能在PCR的热循环期间发生。这具有允许条形码混入大多数液滴中的优点，这可以增强条形码化反应的效率。另外，含有珠粒的离散实体，例如液滴，可以根据其是否含有特定数量的珠粒，如0、1、2个珠粒等来进行分选。这是有利的，因其可用于，例如生成多个离散实体，其中几乎每个离散实体都含有准确数量的所需珠粒，如一个珠粒。例如，当条形码化细胞核酸时，一个珠粒可以与离散实体，例如液滴中的一个细胞或细胞裂解物配对。
在使用随机包封技术完成细胞的包封时，仅某些离散实体，例如液滴，将含有单个细胞，同时因为对于珠粒也是同样的道理，所以仅某些离散实体将含有单个珠粒。于是获得准确地具有一个细胞和一个珠粒的离散实体的可能性变成在相同离散实体中包封一个细胞和一个珠粒的可能性，这种可能性往往可能较低。这样可大大降低产生条形码化分子靶标，例如细胞核酸的过程的效率。通过分选以确保仅使用含一个珠粒的离散实体来包封细胞，可以显著提高配对效率。
使用珠粒的另一个优点是它们可以使特定核酸从离散实体例如液滴中富集出来，或避免由于抑制反应，例如细胞裂解物抑制PCR，而需要更换反应缓冲液相关的问题。例如，使用具有条形码并且也具有可以与靶核酸杂交的序列，如可以与mRNA转录物的多聚腺苷酸尾退火的多聚胸苷酸序列的珠粒，可能与转录物杂交并且可能将其从裂解物去除，同时将源于每个细胞的所有转录物保留在单个相关珠粒上。因为珠粒较小，所以这个过程可以对许多单细胞并行进行。
可选地，如果用珠粒进行更复杂的反应，涉及多个反应，其中一些反应可受抑制，而其它反应不受抑制，则珠粒也可以是有价值的。例如，如果目标是进行RT-PCR以条形码化单细胞转录组，则可以使用珠粒与离散实体例如液滴中的细胞的mRNA杂交。然后可在离散实体中进行逆转录酶反应以使mRNA序列延伸到珠粒上的条形码上，从而使其经条形码标记。如果随后的PCR在离散实体中的高浓度细胞裂解物中受抑制，则可以使离散实体破裂并且收集珠粒并从裂解物中取出。然后可以使连接至珠粒的条形码化转录物在单个管和最佳缓冲液内进行附加PCR，因为不再存在裂解物而克服了抑制，但也确保转录物被条形码化，因为扩增子是由具有条形码连接至其上的珠粒序列上的cDNA分子生成的。
以这种方式使用珠粒的另一个优点是相同的珠粒文库可以在使用后储存并再次用于产生用于测序的另一个文库。这通过以下事实而促进：珠粒是固体并且可以从它们当前所处的缓冲液中去除并引入另一缓冲液中，例如从设计成保存珠粒及其所连接核酸的储存缓冲液中去除，并引入扩增缓冲液中以使PCR能够产生用于测序的扩增子。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在离散实体中；(b)向所述离散实体中引入包含多个拷贝的核酸条形码序列的多孔珠粒，其中所述多个拷贝的核酸条形码序列至少部分分布在由所述多孔珠粒的一个或多个孔隙限定的表面上；并且(c)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。这种方法也可以使用非多孔珠粒进行，其中所述多个拷贝的核酸条形码序列分布在非多孔珠粒的表面上，例如经由核酸结合分子与非多孔珠粒结合。
在其它实施方案中，本公开提供了一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在第一离散实体中；(b)将珠粒包封在第二离散实体中，其中所述第二离散实体为微滴并且所述珠粒在其表面上包含多个拷贝的核酸条形码序列，并且其中将所述珠粒包封在所述第二离散实体中的步骤包括(i)在足以实现多个珠粒在所述通道内的惯性排序的条件下，使所述珠粒流过微流控装置的通道，所述微流控装置包括与所述通道流体连通的液滴发生器，从而提供所述珠粒向所述液滴发生器的周期性注入；并且(ii)使所述注入的周期与所述液滴发生器的液滴发生周期匹配，从而使用所述液滴发生器将单个珠粒包封在单个微滴中；(c)合并所述第一和第二离散实体；并且(d)使所述合并的离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
在其它实施方案中，本公开提供了一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在离散实体中；(b)向所述离散实体中引入在其表面上包括多个拷贝的核酸条形码序列的珠粒，其中每个拷贝的核酸条形码序列均包括与之连接的独特分子标识符(UMI)；并且(c)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
在其它实施方案中，本公开提供了一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在第一离散实体中；(b)将珠粒包封在第二离散实体中，其中所述第二离散实体为微滴并且所述珠粒在其表面上包括多个拷贝的核酸条形码序列，并且其中将所述珠粒包封在所述第二离散实体中的步骤包括(i)使多个珠粒流过微流控装置的通道，所述微流控装置包括与所述通道流体连通的液滴发生器，(ii)将一个或多个珠粒包封在所述液滴发生器产生的一个或多个离散实体中，并且(iii)分选所述液滴发生器产生的所述一个或多个离散实体以去除不包括一个或多个珠粒的离散实体；(c)合并所述第一和第二离散实体；并且(d)使所述合并的离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
单链条形码：在一些实施方案中，本公开提供了制备和/或使用单链条形码的方法。这些条形码可以使用许多技术生成。例如，它们可以通过获得多个DNA条形码分子而生成，其中不同分子的序列至少部分不同。然后可以使用例如不对称PCR扩增这些分子以便产生单链拷贝。可选地，条形码分子可环化，然后进行滚环扩增。这样会产生其中条形码化的原始DNA多次串联成单个长分子的产物分子。这样的益处是，长串条形码拷贝是可以流过装置，例如微流控装置的单分子，从而允许将其单独地包封在离散实体，例如液滴中，而存在远远大于单拷贝的条形码序列。
在一些实施方案中，可以通过使线性DNA环化来获得含有两侧为任意数量的恒定序列的条形码序列的环状条形码DNA。与任何恒定序列退火的引物可以通过使用链置换聚合酶(如Phi29聚合酶)引发滚环扩增，从而生成条形码DNA的长线性多联体。线性多联体表示含多个拷贝的相同条形码的单分子，并且可用于将高拷贝条形码引入离散实体，例如液滴中。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于制备单链条形码的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在离散实体中；(b)向所述离散实体中引入包括核酸条形码序列的环状核酸分子；(c)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列滚环扩增的条件，使得生成所述核酸条形码序列的多联体；并且(d)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于制备单链条形码的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在离散实体中；(b)向所述离散实体中引入包括核酸条形码序列的DNA分子；(c)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列经由转录链式反应(TCR)扩增的条件，使得生成多个单链拷贝的核酸条形码序列；并且(d)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于制备单链条形码的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在离散实体中；(b)向所述离散实体中引入包括核酸条形码序列的DNA分子；(c)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列经由滚环转录链式反应(rcTCR)扩增的条件，使得生成多个单链拷贝的核酸条形码序列；并且(d)使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
数字PCR：产生用于反应，例如在离散实体(例如液滴)中发生的反应的条形码的一种方法是使用数字PCR。在这种方法中，将单独的DNA条形码序列包封在有限稀释的离散实体中，使得一部分离散实体不含分子，并且通常小得多的一部分含有单个分子。离散实体中还包括足以扩增的试剂，并且在足以诱导扩增，例如PCR的热循环的条件下孵育离散实体。扩增为每个液滴填充许多拷贝的原始分子。该文库可以直接使用或者，若需要，可以使用主动或被动方式分选以弃去空的离散实体。
图1中总体上描绘了条形码文库生成方法的一个实施方案。可以将具有随机区域(NNNNNNN或随机碱基的任何变异)的合成条形码文库包封在小滴中，使得大多数小滴含有一个条形码或不含条形码。通过使用通用序列作为引发位点扩增小滴内的单条形码。可用于扩增单个条形码的示例性核酸扩增方法包括：PCR、链置换扩增、滚环扩增、解旋酶依赖性等温扩增、基于重组酶的PCR(twistamp)和环介导扩增(LAMP)。
为使用条形码离散实体文库，可以将文库中的离散实体与旨在用于条形码化的分子靶标例如核酸组合并且进行条形码化反应。在将条形码引入分子靶标之前扩增条形码的益处是，可以大大地增加其浓度，使得在一些情况下后续条形码化反应更有效。例如，用未扩增的条形码，可能必需许多个PCR循环才能扩增条形码，然后在使用重叠延伸剪接法时使其连接至靶核酸。这样大量的扩增可在进行连接之前使试剂降解，导致无效，并且还使附加热循环成为必要，这样可以产生扩增偏差。除需要热循环的PCR外，也可以使用等温法，例如环介导等温扩增(LAMP)、多重置换扩增(MDA)、多次退火环状扩增循环(MALBAC)等。含条形码的离散实体，例如液滴，也可以固化，产生填充有条形码分子的凝胶颗粒。可以使用共价或非共价相互作用使分子连接至凝胶，容许凝胶珠粒分散在水溶剂中，或连接至离散实体内珠粒的表面。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，其中所述方法包括：(a)将单个核酸条形码序列包封在有限稀释的离散实体群中，使得所述离散实体群的每个单个离散实体在统计上含有零或一个核酸条形码序列；(b)使所述离散实体群中的所述核酸条形码序列酶促扩增以提供多个离散实体，其中所述多个离散实体中的每个离散实体包括多个拷贝的对于该离散实体而言单一的核酸条形码序列；(c)向所述多个离散实体中的一个或多个引入多个核酸靶分子；并且(d)使所述多个离散实体中的所述一个或多个经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
组合文库生成：条形码化所关注的某些样品，如细胞转录组时的挑战是，连同离散实体例如液滴中的条形码序列一起分离细胞。这允许条形码序列与细胞独特地相关联，使得已知含有条形码的所有测序读段都源于该细胞。技术上，挑战是可控、高效且快速地产生成对的单个细胞和条形码。例如，使用本文所讨论的基于珠粒的方法；这样可能必须在每个液滴中包封一个珠粒和一个细胞。然而，因为离散目标如分子、珠粒、细胞等通常是随机包封的，所以包封静力学遵循泊松分布(Poisson distribution)，从而需要产生许多空的和不可用的液滴以获得含有单个目标的一小组液滴。当设法实现两个离散目标如细胞和条形码的共同包封时，产生的绝大多数液滴将为空或含单个细胞且不含条形码，或含单个条形码且不含细胞，其中任一种都未产生期望的数据，极小部分含有细胞和条形码。
克服这种无效的一种方法是使离散实体例如液滴过载，使得例如具有细胞的每个离散实体含多个条形码序列，并且因此含更多细胞的离散实体产生期望的数据。然而，这样可产生其它挑战，因为在此类策略中，不再可能使每个独特条形码序列与仅一个细胞相关联，导致数据不准确。使液滴过载条形码序列，同时也能够使每个条形码序列关联回到一个细胞的方式是使用组合支撑法，其中条形码也经条形码化。
例如，不是仅包括单个序列的条形码之外，它可以包括两个或更多个子序列，子序列必须使用例如重叠延伸剪接法连接在一起。然后将条形码文库分成两种、三种等不同的条形码子序列，每种子序列都将存在于最终、联合的条形码分子中。在这种策略中，可以设置不同条形码子序列的浓度，使得大多数液滴得到至少一个每种子序列。然后通过将所有子序列连接成可以扩增并用于标记分子靶标，例如细胞的核酸的单个条形码分子来生成最终的条形码。
在这种方法中，包封细胞和条形码的可能性变得高得多。例如，如果设置条形码子序列的浓度使得约80％的离散实体，例如液滴，得到至少一个每种子序列并因此产生可用条形码，则假定细胞的包封与条形码的包封不相关，80％含细胞的离散实体也将得到条形码并产生期望的数据。在使用独特分子标识符时，这无需将条形码的不同部分缝合在一起即可实现，因为实质上，UMI提供了第二种类型的条形码，其可用于将不同细胞条形码关联在一起。
例如，假设三个条形码序列包封在具有单细胞的液滴中并且UMI连接至其cDNA产物。往往会在下一步中使用连接反应用细胞条形码使这些cDNA产物条形码化，使得每个cDNA扩增并且其扩增子经液滴中的一个条形码分子标记，所用条形码分子随机选择。如果对来自所有液滴的核酸测序并且按UMI对数据分组，将发现每种UMI分组在一起，例如三个条形码序列，即共同包封在初始液滴中的条形码序列。然后这告知数据分析者，这三个条形码应作为对应于一个液滴/细胞的单个条形码组来处理并且，现在不是简单地按独特条形码序列分组，而是按条形码序列的扩展集合来为数据分组。因此，在这种方法中，首先将UMI分组用于鉴定对应于每个细胞的条形码组，然后将条形码组用于为每个细胞的所有序列读段分组。根据在条形码化连接反应之前将多少独特条形码序列引入包封液滴中，一些条形码组可包括仅一个条形码，而其它的可包括，例如一个、两个、三个等条形码。类似的生物信息学算法可用于替代性方法中，其中条形码包括一系列连接的子序列，首先按一个子序列分组以鉴定与之相关联的所有其它序列，然后使用子序列的的扩展集合来为单细胞或离散实体数据分组。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种制备核酸条形码文库的方法，其中所述方法包括：(a)在离散实体群中包封(i)多个第一核酸分子，所述第一核酸分子中的每一个均包含第一核酸条形码子序列和第一连接序列，及(i)多个第二核酸分子，所述第二核酸分子中的每一个均包含第二核酸条形码子序列和第二连接序列，其中进行所述包封使得所述离散实体群的至少约10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或更多的离散实体包含至少一个第一核酸分子和至少一个第二核酸分子；并且(b)使所述离散实体经受足以进行酶促连接和/或扩增的条件，使得对于包含至少一个第一核酸分子和至少一个第二核酸分子的离散实体而言，生成包含所述第一和第二核酸分子两者的序列的连接和/或扩增产物，从而提供复合核酸条形码分子。应当注意的是，上述连接和/或扩增可以在复合核酸条形码分子与靶核酸分子连接或复合核酸条形码分子并入靶核酸分子的扩增产物的同时进行。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在离散实体中；(b)向所述离散实体中引入多个独特分子标识符(UMI)分子；(c)使所述离散实体经受足以使独特UMI分子序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的每一个中的条件(从而提供多个经独特标记的核酸)；(d)向所述离散实体中引入多个不同的核酸条形码序列；并且(e)使所述离散实体经受足以使所述多个条形码序列之一酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物或其扩增产物的扩增产物中的每一个中的条件。在一些实施方案中，UMI可以在包封之前并入到所述多个核酸靶分子中的多个中。在一些实施方案中，均标记特定核酸的UMI和核酸条形码序列未相互直接连接。例如，UMI可标记核酸的一端而核酸条形码序列标记核酸的另一端。在一些实施方案中，不是连续引入UMI和核酸条形码序列，而是它们可同时添加，例如，在将核酸靶分子包封在离散实体中之后。
用于将条形码连接至核酸靶标的方法
本公开提供了各种使核酸条形码序列连接至核酸靶分子和/或其扩增产物的方法。
将条形码连接至核酸靶标：本公开的条形码化策略的一个目标是使独立的序列读段能够通过条形码彼此相关联，条形码涉及源于相同离散实体例如液滴内存在的分子，例如源于来自相同液滴的相同细胞的读段。对于这个概念来说重要的是使条形码连接至液滴中的靶核酸的方法，不管它们是源于分子的片段、分子的扩增产物或甚至是细胞或病毒。
有许多可用于使条形码连接至离散实体内的核酸的技术。例如，靶核酸可以或可以不先扩增并片段化为较短的碎片。可将分子与含有条形码的离散实体，例如液滴组合。然后使用，例如重叠延伸剪接法使条形码连接至分子。在这种方法中，初始靶分子可添加有“接头”序列，其是可为其合成引物的已知序列的分子。
与条形码组合时，可以使用与接头序列和条形码序列互补的引物，使得靶核酸和条形码两者的产物扩增子可相互退火，并且通过延伸反应如DNA聚合，延伸到彼此上，产生包括连接至条形码序列上的靶核酸的双链产物。
可选地，扩增该靶标的引物本身可经条形码化，使得在退火和延伸到靶标上之后，产生的扩增子有条形码序列并入其中。这可以随许多扩增策略一起应用，包括用PCR的特异性扩增或用例如MDA的非特异性扩增。
可用于使条形码连接至核酸的替代性酶促反应是连接，包括平端或粘性末端连接。在这种方法中，将DNA条形码与核酸靶标和连接酶一起孵育，导致条形码与靶标连接。核酸的末端可根据连接需要通过多种技术进行修饰，包括通过使用经连接酶或片段引入的接头以使得对添加到分子末端的条形码数量的更大控制成为可能。
用于向靶标添加条形码的再一种方法是用转座酶或诸如非特异性内切核酸酶等酶的组合或非特异性内切核酸酶(例如，
Figure BDA0003744850070000301
)和连接酶的组合直接将其引入。例如，在这种方法中，可以合成与转座酶相容的条形码。然后转座酶可以片段化靶分子并将条形码添加到片段分子的末端，在一个反应中进行该反应的所有步骤。这是简洁和直接的，但具有需要产生与酶相容的条形码的挑战。也可以使用
Figure BDA0003744850070000311
和连接酶的组合，其中
Figure BDA0003744850070000312
会使核酸片段化为适于测序的尺寸，并且连接酶用于使条形码连接至片段末端。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)向离散实体中引入(i)核酸靶分子，(ii)核酸条形码序列，(iii)配置为扩增所述核酸靶分子的序列的第一引物组，(iv)配置为扩增所述核酸条形码序列的序列的第二引物组，其中所述第一引物组中的一个包括与所述第二引物组中的一个的序列至少部分互补的序列，及(v)酶促扩增试剂；(b)使所述离散实体经受足以使所述核酸靶分子的序列和所述核酸条形码序列的序列酶促扩增的条件，其中产生具有部分序列同源性区域的扩增产物；并且(c)使所述离散实体经受足以使所述扩增产物的序列的互补区域杂交并且足以使所述杂交序列酶促延伸的条件，从而提供包括所述核酸靶分子的扩增序列和所述核酸条形码序列的扩增序列的产物。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)向离散实体中引入(i)多个核酸靶分子，(ii)多个核酸条形码序列，(iii)配置为扩增所述多个核酸靶分子的序列的第一引物组，(iv)配置为扩增所述多个核酸条形码序列的序列的第二引物组，其中所述第一引物组和所述第二引物组包括至少部分互补的序列，及(v)酶促扩增试剂；(b)使所述离散实体经受足以使所述多个核酸靶分子的序列和所述多个核酸条形码序列的序列酶促扩增的条件，其中产生具有部分序列同源性区域的扩增产物；并且(c)使所述离散实体经受足以使所述扩增产物的序列的互补区域杂交并且足以使所述杂交序列酶促延伸的条件，从而提供多种产物，每种产物包括所述多个核酸靶分子之一的扩增序列和所述多个核酸条形码序列之一的扩增序列。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)生成核酸条形码引物文库，其中所述文库中的每个核酸条形码引物均包括足以与核酸靶分子退火的第一序列和包括核酸条形码序列的第二序列；(b)将选自所述文库的一个或多个核酸条形码引物和一个或多个核酸靶分子组合在多个离散实体中的每一个中，其中选自所述文库的用于包括在每个离散实体中的所述一个或多个引物包括具有足以在该离散实体中与一个或多个核酸靶分子退火的第一序列的一个或多个引物；并且(c)使用该离散实体中的一个或多个核酸条形码引物酶促扩增每个离散实体中的一个或多个核酸靶分子，使得生成包括所述一个或多个核酸靶分子之一的序列和核酸条形码序列的扩增产物。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)生成核酸条形码序列文库；(b)将选自所述文库的一个或多个核酸条形码序列和一个或多个核酸靶分子组合在多个离散实体中的每一个中；并且(c)酶促片段化每个离散实体中的所述一个或多个核酸靶分子并将每个离散实体中所述一个或多个核酸条形码序列中的一个或多个酶促并入到该离散实体中所述一个或多个靶核酸分子或其扩增产物的片段中。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)生成核酸条形码序列文库；(b)将选自所述文库的一个或多个核酸条形码序列和一个或多个核酸靶分子组合在多个离散实体中的每一个中；并且(c)将每个离散实体中的所述一个或多个核酸靶分子酶促连接至该离散实体中的一个或多个核酸条形码序列。
现在参考描绘单细胞条形码化装置和方法的图2-4描述示例性实施方案。(1)制备第一组微滴，其中每个微滴包括源自单细胞的例如由用蛋白酶K(PK)处理而产生的细胞裂解物。(2)制备第二组微滴，其中每个微滴包括多个拷贝的独特核酸条形码序列。(3)可用于合并成对的含裂解物的微滴和含条形码的微滴连同RT-PCR试剂的微流控装置的示意图。图4中提供了微流控装置更详细的示意图。如图3所示，使微滴配对并被载液，例如油间隔开，并且与含有RT-PCR试剂的更大的小滴合并。在最终合并的小滴中进行连接RT-PCR以使条形码连接至cDNA并扩增连接产物。图4中提供了微流控装置的详细示意图，其中标识了液滴再注入特征件、液体电极、沟槽(moat)和用于间隔载液例如油和RT-PCR试剂的贮存器。微流控装置利用沟槽盐溶液(以产生用于介电电泳偏转的场梯度并且限制可引起非预期的液滴合并的杂散场)。
操纵微滴的方法
分裂-合并法：本公开的一个方面是允许细胞与条形码在离散实体中组合，同时也容许在离散实体中执行反应的工作流程。实现这一点的挑战是细胞裂解物可能是某些反应例如PCR的有效抑制剂，需要克服这种抑制作用的步骤。实现这一点的一种方法是使用两步程序，其中细胞裂解物用蛋白酶消化以降解可能干扰反应的化合物，并且用稀释法将化合物稀释至可接受的水平。这可以使用许多方法实现。例如，一种方法是将含有细胞裂解物的液滴与明显更大的液滴合并，以实现例如最终液滴中细胞裂解物的明显稀释。然而，用这种方法的挑战在于，对于下游反应如PCR所需的处理或温度循环而言，形成的大液滴可能不太稳定。另外，产生较大液滴所需的试剂体积与产生的液滴数量及其体积成正比；因此大液滴需要总计更多的试剂，使得该过程更加需要可用资源。
增强稳定性的一种方式是合并含裂解物的液滴与更大的液滴，混合内容物，然后分裂出大的、混合液滴的一部分用于后面的步骤。然而，这种方法可能仍使用大量的试剂以产生更大的液滴。这种方法的可以实现相同稀释的替代方案是首先分裂含裂解物的液滴(或含任何其它合适材料的液滴)，然后合并分裂部分与试剂液滴，例如试剂液滴与分裂之前裂解物液滴尺寸大致相同。举例而言，可分裂含裂解物的液滴以提供多个具有含裂解物的液滴的大致10％体积的液滴。然后可将这些体积减小的液滴与具有原始含裂解物的液滴的大致90％体积的试剂液滴合并以提供大致10X稀释。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于操纵微滴的方法，其中所述方法包括：(a)生成第一多个微滴和第二多个微滴；(b)使所述第一多个微滴在微流控装置的通道中流动；(c)使所述第一多个微滴中的每一个分裂以提供多个体积减小的微滴；(d)将所述多个体积减小的微滴中的每一个与所述第二多个微滴中的微滴合并，其中所述第二多个微滴中的微滴各自具有的体积大致等于或小于所述第一多个微滴的体积。
在一些实施方案中，所述第一和/或第二多个微滴的直径为约5μm至约200μm，例如约15μm至约150μm，或约15μm至约50μm。
合并多个微滴：在本公开的一些实施方案中，可能需要将几个液滴合并在一起，与仅仅成对的液滴完全不同。这可以通过按使得液滴流入单个连接通道的方式，将不同液滴类型从独立入口引入微流控装置来实现。可诱导液滴作为成组的不同液滴类型流动。这可以例如通过连接将不同类型引入单个通道的通道出口来实现，使得一个液滴的流动在一定程度上妨碍相邻通道中液滴的流动。在第一个液滴进入连接通道之后，第二个液滴能够在其后流动，使液滴作为交替流注入连接通道内。这个概念可以扩展到更大数量的液滴，例如三个或更多个液滴。也可以通过使不同液滴类型的尺寸不同，诱导液滴成组流动，使较小的液滴“赶上”较大的液滴并自然形成组。然后可以通过施加电场或使用本文描述的合并几何结构来将其合并。可选地，成对的液滴可以与另一个液滴，例如较大的液滴并排流动，并与其之合并。它们也可以与液流如液体射流合并，如果需要，然后可以使其破裂成更小的液滴。液滴-液流合并和液滴-射流合并将在下面更详细地讨论。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于合并两个或更多个微滴的方法，其中所述方法包括：(a)将两个或更多个微滴群引入到微流控装置的流动通道中，(i)其中所述流动通道包括微滴合并部分，其与配置为在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场的一个或多个电极或一个或多个电极的一个或多个部分联合，(ii)其中将所述两个或更多个微滴群分别引入到所述流动通道中的两个或更多个独立入口通道的单个接合点处，并且(iii)其中将所述两个或更多个微滴群引入到所述流动通道中，使得来自每个入口通道的所述微滴输入由于流体动力效应而至少部分同步，导致喷出间隔的成组微滴，其中至少一些所述间隔的成组微滴包括来自所述两个或更多个微滴群中的每一个的微滴；(b)使所述间隔的成组微滴流入所述微滴合并部分；并且(c)通过使用所述一个或多个电极或所述一个或多个电极的所述一个或多个部分在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场来合并间隔组内的微滴。
小滴-液流/小滴-射流组合：在一些实施方案中本公开提供了一种用于合并两种或更多种液体的方法，其中所述方法包括：(a)将第一液体作为液流引入到微流控装置的流动通道中至少部分与不混溶相液体接触；(b)将包含第二液体的微滴引入到所述流动通道中；(c)使所述微滴合并到所述液流中，从而使所述第一和第二液体组合；并且(d)诱导包括所述组合的第一和第二液体的所述液流破裂成包括所述组合的第一和第二液体的单个微滴。
在上述方法的一些实施方案中，所述流动通道包括微滴合并部分，其与配置为在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场的一个或多个电极或一个或多个电极的一个或多个部分联合，并且所述方法包括在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场以使所述微滴合并到所述液流中。
在上述方法的一些实施方案中，第一液体在滴落条件下被引入到流动通道中。在其它实施方案中，第一液体在喷射条件下被引入到流动通道中。图5中的图A和B分别提供了这些实施方案的实例。
通常，滴落-喷射转换可受适用的粘度比、毛细管数、韦伯数(Weber number)和雷诺数(Reynolds number)控制。例如，粘度比大约为1、雷诺数＜1、韦伯数＜1和毛细管数＜1将提供形成液滴的条件。与上述条件的偏差往往会导致喷射或稳定的同向流。参见，例如，Nunes等人J Phys D Appl Phys.2013年3月20日；46(11)：114002和Utada等人Phys.Rev.Lett.99，094502，其各自的公开内容以引用的方式并入本文用于所有目的。
图6中描绘了可用于处理小体积液体的附加实施方案的实例。如图所示，再注入液滴并且，例如经由电聚结与至少部分接触不混溶相液体的液体射流，例如油包水射流合并。滴液仍然是一团并且可经分裂、稀释和/或在合并之后重新形成为液滴。应当注意，液滴-射流合并的概念和实施方式在液体处理领域中具有广泛适用性，包括除了与条形码化以及本文所述的相关分析方法有关的应用以外的应用。
单细胞转录组分析和测序
为了对单个细胞的转录组测序，可以使用各种工作流程。在一种工作流程中，足以进行cDNA合成和细胞转录组扩增的试剂，如SMARTTM试剂(可从Clontech Laboratories，Palo Alto，CA获得-参见，例如，Zhu等人，BioTechniques 30：892-897(2001))，可以连同用于条形码化的试剂一起引入含细胞裂解物的液滴中。然后，通过使液滴热循环，可在相同步骤中进行所述反应，例如使用重叠延伸剪接PCR(SOEing PCR)，引起mRNA转录组的cDNA合成、其扩增及扩增产物末端经条形码标签化。
这是相对简单的工作流程，其可以在少量装置或可能在单个装置上进行，并提供有关用于表达谱分析的转录物末端的信息。本文将这种方法称为“SMARTOne”，因为cDNA合成、扩增和条形码化的所有反应都在一个步骤中进行。可选地，依赖于逆转录酶的cDNA合成可以在一个步骤中进行，然后可添加试剂以在稍后的步骤中进行扩增和条形码化。使这些反应在不同步骤中进行，允许在单独步骤之后改变缓冲液，这可对优化反应以获得最精确的数据有价值。本文将这种方法称为“SMART-2Step”。
描述的两种方法提供了mRNA转录物末端的测序读段。如果需要获得全转录物序列，则也有几种选择。一种选择是由先前描述的方法获得条形码化的转录物并用长分子测序技术对其测序，例如PACBIO RS II测序仪，Pacific Biosciences，Menlo Park，CA。可选地，本文描述的长分子测序技术也可用于这种目的。这两种方法都具有不但提供了涉及剪接变异的读段，而且允许全长单个转录物分子重组的优点。
替代方法是如下进行片段化和条形码化。在一个步骤中细胞mRNA逆转录为cDNA并且扩增，本文称为“SMART-Tag”，或分两步进行，其中首先进行cDNA合成并在第二步中添加足以进行扩增的试剂，本文称为“SMART-Tag-2Step”。然后使用任何合适的方法/试剂，例如
Figure BDA0003744850070000371
或转座酶使扩增的分子进行片段化，然后用先前描述的任一方法，如连接或SOEing，使用例如在用转座酶片段化期间插入的接头引入条形码。另外，可在cDNA合成步骤之前、期间或之后用独特分子标识符(UMI)标记靶分子。这些UMI基本上相互不同并且标记分子，从而允许利用UMI多样性进行更精确的转录物计数。
再一种方法是靶向特定转录物进行测序，这可以使用许多技术实现。例如，可以在cDNA合成或扩增步骤期间使用特定引物仅逆转录某些序列，然后可使其进行条形码化。这可用于，例如靶向细胞群中的B或T细胞受体基因进行测序，这可对鉴定疾病生物标志或治疗性抗体有用。也可通过多重化引物组来选择其它组合，以例如使多个基因的表达和序列相关。病毒基因，例如HIV感染中，可通过设计仅使这些基因条形码化的引物组使其与宿主基因的表达相关。这具有提供更简单的数据并且也允许测序靶向所关注的基因的优点，这在本公开的一些应用中有用。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的“SmartOne”方法，其中所述方法包括：(a)将单个细胞包封在有限稀释的离散实体群中，使得所述离散实体群的每个单个离散实体在统计上含有零或一个细胞；(b)裂解所述细胞以在所述离散实体内释放RNA靶分子；(c)向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂；并且(d)使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和使该离散实体独有的所述核酸条形码序列酶促并入到cDNA扩增产物中的条件，从而提供多个离散实体，其中所述多个中的每个离散实体均包括相对于所述多个中的其它离散实体经独特核酸条形码序列标记的cDNA扩增产物。
在一些实施方案中，所述包封、裂解和cDNA合成步骤在第一微流控装置中进行并且例如经由SOEing PCR的所述酶促并入在第二微流控装置中进行，提供了“SMART-2Step”方法。
在其它实施方案中，本公开提供了一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的“SmartOne”方法，其中所述方法包括：(a)提供离散实体群，所述离散实体群的每个离散实体均包括源于单个细胞的细胞裂解物；(b)向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂；并且(c)使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和使该离散实体独有的所述核酸条形码序列酶促并入到cDNA扩增产物中的条件，从而提供多个离散实体，其中所述多个中的每个离散实体均包括相对于所述多个中的其它离散实体经独特核酸条形码序列标记的cDNA扩增产物。
在一些实施方案中，所述cDNA合成步骤在第一微流控装置中进行并且所述酶促并入在第二微流控装置中进行，提供了“SMART-2Step”方法。
在一些实施方案中，上述方法包括向每个离散实体中引入足以使包括独特分子标识符(UMI)的核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中的试剂，其中足以使该离散实体独有的所述核酸条形码序列酶促并入到cDNA扩增产物中的条件足以使包括独特分子标识符的所述核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中。此类试剂可包括，例如包括简并序列的模板转换寡核苷酸。
这些方法中利用的核酸条形码序列和/或UMI可根据本文描述的任何方法制备和/或引入。另外，本文描述的任何微流控装置或其特征件均可连同这些方法一起使用。
在其它实施方案中，本公开提供了一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的“SMART-Tag”方法，其中所述方法包括：(a)将单个细胞包封在有限稀释的离散实体群中，使得所述离散实体群的每个单个离散实体在统计上含有零或一个细胞；(b)裂解所述细胞以在所述离散实体内释放RNA靶分子；(c)向每个离散实体中引入足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂，并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的条件；(d)向每个离散实体中引入足以使所述扩增的cDNA产物片段化的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述扩增的cDNA产物片段化的条件；并且(e)向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的条件。
在一些实施方案中，步骤(c)分两个不同的步骤和/或使用两个不同的装置进行，第一步引入足以进行cDNA合成的试剂并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成的条件，及第二步引入足以扩增所得cDNA产物的试剂并且使每个离散实体经受足以扩增所得cDNA产物的条件，提供了“SMART-Tag-2Step”。在另一种“SMART-Tag-2Step”方法中，步骤(e)包括将来自步骤(d)的所述离散实体引入到微流控装置中，将包括所述核酸条形码序列的离散实体引入到微流控装置中，并且合并所述离散实体以提供体积增大的离散实体。
在其它实施方案中，本公开提供了一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的“SMART-Tag”方法，其中所述方法包括：(a)提供离散实体群，所述离散实体群的每个离散实体包括源于单个细胞的细胞裂解物；(b)向每个离散实体中引入足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂，并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的条件；(c)向每个离散实体中引入足以使所述扩增的cDNA产物片段化的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述扩增的cDNA产物片段化的条件；并且(d)向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的条件。
在一些实施方案中，步骤(b)分两个不同的步骤和/或使用两个不同的装置进行，第一步引入足以进行cDNA合成的试剂并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成的条件，及第二步引入足以扩增所得cDNA产物的试剂并且使每个离散实体经受足以扩增所得cDNA产物的条件，提供了“SMART-Tag-2Step”。在另一种“SMART-Tag-2Step”方法中，步骤(d)包括将来自步骤(c)的所述离散实体引入到微流控装置中，将包括所述核酸条形码序列的离散实体引入到微流控装置中，并且合并所述离散实体以提供体积增大的离散实体。
到目前为止描述的用于条形码化细胞中的核酸的方法，多半利用同质液相反应，其中反应的所有组成部分均可溶于液滴区室内。然而，在某些实施方案中可能有价值的另一种方法是使用固相支持体，如珠粒。例如，一个或多个固体支持体可用设计为与核酸靶分子杂交的寡核苷酸涂布并且包封在液滴中并在允许核酸靶分子与固相支持体表面杂交的条件下孵育。可以或可以不进行附加反应，例如从液滴中去除固体支持体或进行杂交分子向连接至固相支持体的寡核苷酸上的逆转录酶或聚合酶延伸。
液滴中的分子可以是cDNA合成和/或片段化反应的结果，并且与珠粒杂交的序列可以是，例如通过转座酶或连接酶添加的接头。可选地，可以在进行杂交和/或延伸之后在固相支持体上进行片段化，去除靶核酸几乎所有结合的末端。
固相支持体也可用于条形码化核酸靶标。在这种方法中，可以生成可选地或除了包覆在捕获序列中的珠粒以外，也可生成可经核酸条形码序列和/或UMI涂布的珠粒。然后将珠粒与核酸靶标一起在足以进行杂交和/或延伸的条件下孵育，从而将液滴中的序列转移到珠粒表面。可由珠粒制备测序文库，例如通过扩增离开珠粒的核酸，包括其条形码和UMI，并且对产物进行文库制备反应。若需要，也可对珠粒进行片段化，以使裂解产物从珠粒释放。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种制备用于测序的cDNA的方法，其中所述方法包括：(a)使cDNA片段化为多个片段，所述多个片段包括5’末端、3’末端和内部片段；(b)将所述多个片段连同固相支持体一起包封在一个或多个离散实体中；(c)使所述5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上；(d)使所述内部片段与可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端分离；并且(e)释放可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端。所述cDNA可由源于单个细胞的mRNA生成，其中每个cDNA包括并入到所述mRNA所来源的所述细胞独有的5’末端和/或3’末端中的核酸条形码序列。另外，每个cDNA均可包括并入到5’末端和/或3’末端中的独特分子标识符(UMI)。
在其它实施方案中，本公开提供了一种制备用于测序的条形码化核酸的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子和多个珠粒包封在离散实体中，其中所述多个珠粒中的每一个均包括核酸条形码序列、独特分子标识符(UMI)和设计为与所述多个核酸靶分子之一杂交的核酸捕获序列；(b)使所述离散实体经受足以使所述一个或多个核酸靶分子和所述核酸捕获序列杂交的条件；并且(c)从所述离散实体回收所述多个珠粒用于后续分析。在一些实施方案中，所述方法包括将所述核酸条形码序列或其扩增产物之一酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的每一个中。在一些实施方案中，所述方法包括使所述多个核酸靶分子中的每一个酶促延伸到所述核酸条形码序列之一以便生成包括所述核酸条形码序列或与之互补的序列和所述核酸靶分子的至少一部分序列的嵌合分子。
单细胞基因组分析和测序
用于核酸深度测序的扩增：在一些实施方案中，本公开的方法可用于对分子，包括源于单细胞核酸的长单分子进行深度测序。为实现这一点，往往可能需要扩增该分子，使得在片段化和条形码化之后，在片段化产物中存在原分子每个区域的多个拷贝，从而容许对每个区域的进行多重测序，这可以使得能够收集达到源误差平均数的精确数据。
扩增靶核酸的方法包括将通常但非总是作为单独分子的靶标包封在区室如微流控液滴内。足以进行扩增的试剂也可包括在液滴内，所述试剂如热循环扩增所必需的酶，包括热稳定性聚合酶，或等温扩增所必需的酶，如用于多重置换扩增的聚合酶。也可以应用其它不太常见的扩增形式，例如使用DNA依赖性RNA聚合酶扩增以由原始DNA靶标产生本身可以转变回DNA的多个拷贝的RNA，本质上引起靶标扩增。活生物体也可用于扩增靶标，例如通过使靶标转化到生物体内，然后可以允许或诱导生物体复制靶标，而生物体复制或不复制。还可通过调节扩增试剂的浓度来控制扩增程度以达到所需扩增水平。在一些情况下，这对于其中使用扩增产物的反应的微调有用。
用于和公开方法一起使用的合适的扩增方法可包括，例如DNA聚合酶PCR、RecA介导的重组PCR、解旋酶置换PCR和/或基于链置换的模板扩增法，包括但不限于多重置换扩增(MDA)、多次退火环状循环扩增(MALBEC)、滚环扩增、缺口置换扩增和环介导等温扩增(LAMP)。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于生成用于基于条形码测序的区室化、扩增靶文库的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子与足以酶促扩增所述核酸靶分子的试剂一起包封在多个离散实体中；(b)使所述离散实体经受足以酶促扩增所述核酸靶分子的条件，从而提供扩增产物；(c)使所述扩增产物片段化；并且(d)将核酸条形码序列并入到所述片段化扩增产物中。
在一些实施方案中，将所述多个核酸靶分子包封在有限稀释的所述多个离散实体中，使得所述多个中的每个单个离散实体在统计上含有零或一个核酸靶分子。
可经由这些方法分析的靶核酸可相对较长，例如长度大于1kb，例如长度大于10kb，长度大于100kb或长度大于1000kb。在一些实施方案中，可经由这些方法分析的靶核酸长度可介于约1kb和1000kb之间，例如介于约10kb和500kb之间，或介于约10kb和100kb之间。
液滴内片段化：经由公开方法对长分子深度测序的另一个重要步骤可能是将核酸片段化为容许以现有平台对其测序的长度，其往往具有有限的读段长度。片段化可按各种方式实现并且可适用于扩增或非扩增的核酸靶标。例如，可以将能够使DNA片段化的酶如
Figure BDA0003744850070000431
或其它核酸酶包括在离散实体中并且使离散实体经受足以进行片段化的条件。能够使DNA片段化的合适的酶可包括，例如DNA酶I、微球菌核酸酶、DNA酶III及产生片段化DNA的任何其它核酸酶，包括具有序列特异性催化作用的核酸酶。可选地，可以使用化学方法，如酸、活性氧等的包括。降解DNA的生物体也可通过将其与核酸一起包括在区室内来使用。也可以使用物理方法，如通过含于或未含于区室内或流体动力喷口内的核酸流所产生的剪切力。也可以使用对核酸进行多种操作，包括片段化的其它方法。例如，可以使用转座子使序列插入或连接至核酸内，常常在该过程中使其片段化。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于片段化和条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子或其扩增产物包封在多个离散实体中；(b)使所述离散实体经受足以片段化所述核酸靶分子或其扩增产物的条件以提供片段化核酸靶分子或其扩增产物；(c)将核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或其扩增产物中，其中所述核酸条形码序列将并入了所述核酸条形码序列的每个片段标识为源于单个离散实体、单个细胞或单个生物体。
在一些实施方案中，所述经受包括通过施加紫外光来片段化所述核酸靶分子或其扩增产物。
在一些实施方案中，所述包括在所述经受之前，将一个或多个酶裂解位点并入到所述核酸靶分子或其扩增产物中，例如包括dUTP的一个或多个酶裂解位点。
在一些实施方案中，所述经受包括通过施加力来片段化所述核酸靶分子或其扩增产物，所述力例如由通过微流控装置内的微流控通道、微流控喷口或微流控接合点的核酸靶分子或其扩增产物的流体动力流所产生的剪切力。
在一些实施方案中，所述经受包括经由转座子插入来片段化所述核酸靶分子或其扩增产物，例如使用Tn5转座子、Mu转座子或本领域已知的任何其它合适的转座子。
表征细胞内的拷贝数变异：在一些实施方案中，本公开提供了一种表征细胞内的拷贝数变异的方法。例如，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于表征细胞内的拷贝数变异的方法，其中所述方法包括(a)分离离散实体中的单个细胞；(b)片段化所述离散实体中的细胞核酸；(c)将独特分子标识符(UMI)并入到所述片段化细胞核酸中；(d)对所述片段化细胞核酸测序；并且(e)使用所述UMI推断所述细胞核酸中特定序列的拷贝数。
连接用于深度测序的条形码：深度测序工作流程的一个重要步骤是将条形码连接至核酸(无论是否经扩增和片段化)，使得一度处于相同离散实体例如微滴中的分子，因其源于相同的分子、病毒或细胞，例如作为单独的染色体或基因组片段，所以可以通过按条形码用计算机分选读段而将其相互关联。条形码连接可以使用各种技术实现，包括使用连接酶如T4连接酶、T7连接酶、大肠杆菌连接酶、Taq DNA连接酶、RNA连接酶等，或直接转座子插入和片段化。也可以使用用整合酶、重组酶、脂肪酶等的重组法，其可以实现条形码化DNA和片段DNA之间的链交换。
另一种可能有力的方法是重叠延伸PCR(SOEing PCR)，其可用于一起剪接扩增产物中的条形码和片段。这可以，例如通过使用配置为扩增所述片段的序列的第一引物组和配置为扩增核酸条形码序列的序列的第二引物组来实现，其中第一引物组之一包括与第二引物组之一的序列至少部分互补的序列。然后可以使引物、片段和核酸条形码序列经受足以酶促扩增片段的序列和核酸条形码序列的序列的条件，其中产生具有部分序列同源性区域的扩增产物。然后可以使反应混合物经受足以使扩增产物的序列的互补区域杂交并且足以使杂交序列酶促延伸的条件，从而提供包括所述片段的扩增序列和所述核酸条形码序列的扩增序列的产物。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于使条形码连接至片段化核酸或其扩增产物的方法，其中所述方法包括(a)将多个片段化核酸靶分子、核酸条形码序列和足以使所述核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或其扩增产物中的试剂组合在多个离散实体中；并且(b)使所述多个离散实体经受足以使所述核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或其扩增产物中的条件，其中所述核酸条形码序列将并入了所述核酸条形码序列的每个片段或其扩增产物标识为源于单个离散实体、单个细胞或单个生物体。
单细胞/单分子下一代测序(NGS)工作流程：本文描述的核酸深度测序技术的目标是使得靶核酸能够在离散实体例如微滴，或容许将源于特定分子的测序读段相互关联的一系列离散实体中扩增、片段化和条形码化。这种方法的方方面面可涉及，如本文所述，靶核酸的分离、扩增、片段化和条形码连接。然而，可以根据需要包括或省略不同步骤以优化用于目标应用的方法。例如，如果省略扩增步骤，则对于片段化步骤而言核酸将仅以其未扩增的拷贝数存在。这意味着如果片段化和条形码化过程中存在任何无效，则可能部分原始核酸未得以条形码化并且，因此在这些区域的测序中存在空位。
在其它实施方案中，片段化和条形码添加可一步进行，例如使用转座酶，或分两步进行，其中片段化技术，例如使用
Figure BDA0003744850070000461
接着是条形码添加，例如用连接酶或重叠延伸PCR。可以使用各种产生未物理连接的产物的技术，如PCR，在离散实体例如微滴中执行扩增。可选地，扩增可以在分离之前在区室内实现，但可能需要扩增产物保持连接。这可以，例如通过进行滚环扩增或如同多重置换扩增的技术来实现，滚环扩增产生原始核酸的单个、长串联分子，置换扩增可以产生扩增靶标的单个类分形核(fractal-like nuclei)。
扩增也可以用如同乳液PCR的技术实现，乳液PCR可用于为珠粒涂布扩增产物。然后将珠粒作为单个包封到离散实体例如微滴中，实体包括同一组核酸靶标的许多拷贝，容许条形码化反应的下一步进行。
进行这些操作的微流控装置可包括促进液滴生成、液滴合并、液流合并、皮量注入(picoinjection)、分选等中的一项或多项的架构。可通过包封单个分子，然后可扩增单个分子，通过合并含有一组原始分子的许多拷贝的液滴，和/或通过包封包括条形码的实体，例如细胞或经条形码涂布或浸渍的塑料或凝胶制成的珠粒来引入条形码。如果利用片段化，则可以在片段化之前、同时或之后用模板分离条形码。
然后可以使用许多技术来实现条形码添加，包括剪接PCR、连接等。该方法可适用于相同离散实体例如微滴中的单个分子或分子集合，例如来自单个细胞的病毒基因组或染色体的片段。本文描述的组合条形码化策略也可用于实现条形码的有效负载。
分选可用于使用主动或被动方式弃去无靶标或条形码的离散实体，例如液滴。例如，靶核酸的扩增可以改变包封区室的物理性质，例如其尺寸、形状、粘度、表面张力等，其中任一种均可以使得能够将填充液滴与空液滴被动分离。可选地，或另外，可根据扩增后区室的可测量性质，例如用嵌入染料，例如
Figure BDA0003744850070000471
green染色产生的荧光信号的变化，通过触发分选来应用主动分选。
无论使用上述方法中的哪一种，并且无论是执行扩增、分选、片段化和条形码化步骤，还是省略这些步骤中的一个或多个，公开方法的一些实施方案的重要方面都是使用可用测序技术对条形码化短读段测序及随后按条形码聚集读段以简化分析并且使得单个细胞、病毒、分子等数据的回收成为可能。这样使包封在相同离散实体例如微滴内，并因此源于相同核酸集合的所有序列聚集。在某些情况下，这可以促进核酸的操纵、组装和分析，尤其是当样品中的核酸对长于测序仪的读段长度的区域含有序列相似性时，从而防止起始分子的独特组装。
用本文描述的方法，虽然读段本身可以跨越短距离，但可以使用条形码使跨越很长距离的大量读段聚集，容许其中常规方法失败的独特重组。而且，这可用于关联相互有关但未物理连接的分子。例如，某些病毒具有包括物理上不连接的分子的分段基因组，使得难以用常规短读段测序将多组这些不连接的分子关联在一起，因为样品中来自不同病毒的区段能够在测序准备期间在病毒裂解之后混合。然而，使用本文描述的方法，可以分离、裂解病毒，并条形码化其基因组区段，使得即使物理上分离，也可将其关联在一起。这对于研究病毒生物学的各个方面，例如种群多样性和进化有价值。相似的策略适用于分析具有变异的其它生物系统，包括微生物、干细胞、癌细胞等的核酸。
现参考图7描述用于条形码化和分析模板DNA的示例性方法。模板DNA经物理性分离和扩增，然后使每一组的扩增子片段化并独特地条形码化。可在短读段测序仪上对片段测序，然后基于其条形码进行生物信息学分选。由含有相同条形码的短读段重新构建长读段。
图8说明了以高通量分离和条形码化单个核酸分子的方法。通过包封到液滴中来分离单个分子。然后使其在这些液滴中扩增以产生这些分子的克隆群体。然后使其在这些液滴中片段化和条形码化，使得每个液滴均含有源自相同的单分子并独特地条形码化的片段。
可以使用
Figure BDA0003744850070000481
(NEB)、转座子插入(Nextera)、非特异性DNA内切核酸酶如DNA酶I，或在扩增和裂解期间使用DNA修复酶并入经修饰的碱基，例如在扩增和特异性裂解期间使用EndoV和尿嘧啶糖基化酶进行dUTP并入，实现DNA的片段化。流体动力剪切也可用于使DNA片段化。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种对核酸测序的方法，其包括扩增和片段化两个步骤，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在多个离散实体中；(b)酶促扩增所述核酸靶分子以提供第一扩增产物；(c)使所述第一扩增产物片段化以提供片段化的第一扩增产物；(d)将核酸条形码序列并入到所述片段化的第一扩增产物或由所述片段化的第一扩增产物扩增的第二扩增产物中；(e)对其中并入了核酸条形码序列的所述片段化的第一扩增产物或其中并入了核酸条形码序列的所述第二扩增产物测序；并且(f)使用所述核酸条形码序列为同时存在于相同离散实体中的所述片段化的第一扩增产物的成员或所述第二扩增产物的成员的测序读段分组。
在其它实施方案中，本公开提供了一种对核酸测序的方法，其包括片段化步骤，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在多个离散实体中；(b)使所述多个核酸靶分子片段化以提供片段化核酸靶分子；(c)将核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或由所述片段化核酸靶分子扩增的扩增产物中；(d)对其中并入了核酸条形码序列的所述片段化核酸靶分子或其中并入了核酸条形码序列的所述扩增产物测序；并且(e)使用所述核酸条形码序列为同时存在于相同离散实体中的所述片段化核酸靶分子的成员或所述扩增产物的成员的测序读段分组。
在其它实施方案中，本公开提供了一种对核酸测序的方法，其包括扩增步骤，其中所述方法包括：(a)将多个核酸靶分子包封在多个离散实体中；(b)酶促扩增所述多个离散实体中的所述核酸靶分子以提供第一扩增产物；(c)将核酸条形码序列并入到所述第一扩增产物或由所述第一扩增产物扩增的第二扩增产物中；(d)对其中并入了核酸条形码序列的所述第一扩增产物或其中并入了核酸条形码序列的所述第二扩增产物测序；并且(e)使用所述核酸条形码序列为同时存在于相同离散实体中的所述第一扩增产物的成员或所述第二扩增产物的成员的测序读段分组。
两步单分子深度测序工作流程：如以上所讨论，在一些实施方案中，本文描述的方法和/或装置可用于对多个“长”DNA分子，例如长度约1kb至约1000kb，例如约1kb至约500kb或约10kb至约100kb的DNA分子深度测序。在一些实施方案中，这通过在一个微流控步骤中将靶分子包封在液滴中并使其扩增来实现。然后在第二微流控步骤中向这些液滴中添加足以进行片段化和条形码化的试剂并孵育。在第三步中添加足以使条形码并入片段中并扩增所述片段的附加试剂。因此这个过程需要三个微流控步骤并执行靶分子的液滴内扩增。
在一些情况下，可能需要减少不进行液滴内扩增，实现类似目标所需的步骤数量。这可以使用替代工作流程来实现，其中首先用UMI序列标记靶分子并且在任何液滴或微流控包封之前批量扩增。这样产生每个靶分子的许多拷贝，靶分子含有由其拷贝靶分子的母体分子的相同、独特UMI。然后可将这多个序列包封在离散实体，如液滴中，使得例如每个区室存在10个分子。在靶分子包封之前、同时或之后，可以向离散实体中添加足以进行片段化和接头添加的试剂。在靶分子包封之后，可以孵育离散实体以便使得片段化和接头添加反应能够进行。
示例性试剂包括可从Illumina，Inc.，San Diego，CA获得的Nextera DNA SamplePrep Kit中提供的那些试剂，和/或酶如
Figure BDA0003744850070000501
和连接酶。例如，每个离散实体，例如液滴，平均可包括10个不同的靶分子，每个靶分子可以是不同的序列并且经不同的UMI标记。这些分子中的每一个也可以是已经与UMI连接的原始分子的拷贝，其它拷贝包封在不同离散实体，例如液滴中。片段化和接头连接之后，可以添加足以进行液滴条形码化和扩增的试剂并在必要时孵育离散实体以将条形码添加到片段上并扩增条形码化产物。然后回收、汇合所有分子，必要时进行附加处理并测序。
在序列文库的生物信息学分析期间，可以使用以下示例性算法重新组装原始靶标的序列。首先，可以将含有特定UMI的所有序列组装成一组序列。在这组中的是具有原始UMI的靶分子的片段化序列。因为这些靶序列的拷贝通常会被包封在不同液滴中，所以这些序列可具有不同的液滴条形码。这组中的其它序列将会是碰巧与靶序列共同包封的分子片段的序列。然而，因为共同包封是随机的，所以按UMI分组时这些序列将很少出现在该组中，而出现得更频繁并且具有表明它们处于不同液滴中的条形码的序列很可能与相同原始靶标的不同拷贝相对应。然后可以使用文库中最常见的序列重组靶序列。然后对于所有其它UMI可以重复这个过程，最终重新组装每个单独的靶标。
这种技术具有许多优点。应该允许甚至非常相似的序列彼此区分并重新组装。例如，假设两个序列A和A′因两个间隔3kb的碱基不同，并且靶标长度为10kb。按UMI为序列分组以回收对应A的所有序列，则在该组分组序列中大多数在这个位置将含有对应A的碱基。如果每个液滴包封许多靶标，如果A和A′包括文库的大部分序列，则这种方法可能失败，但条件是文库是多样性的，因为A和A′的共同包封是随机的并且是大的多样性靶序列文库中的罕见事件，所以这样分组应回收对应靶序列的序列。如果文库多样性低，则可能的解决方案是将每个液滴包封的分子数量减少到少于1，使得大多数液滴含有1或0个分子。在这种情况下，因为共同包封罕见，所以按UMI分组将主要回收A的序列，导致明确的重新组装。
这种方法也是高通量的。在先前描述的方法的一些实施方案中，按每个液滴少于1个分子来包封靶分子，意味着大多数液滴是空的。这意味着全部必须处理并因此需要仪器运行时间的大多数液滴，未产生有用数据。相比之下，在这种方法中，UMI的使用允许液滴在靶标包封步骤期间“过载”，例如，平均每个液滴包封10个分子。这确保几乎每个液滴都提供可用序列数据，从而提供更高的有效通量。也可以仅用两个微流控步骤实现，即分子包封和片段化的步骤，及条形码添加和条形码化产物扩增的步骤。使用其它批量扩增方法，可通过这种方法分析的分子的长度可长达兆碱基。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化核酸靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)使独特分子标识符(UMI)分子连接至多个核酸靶分子中的每一个以提供UMI标记的核酸靶分子；(b)使所述UMI标记的核酸靶分子酶促扩增以提供包括所述UMI标记的核酸靶分子的序列的扩增产物；(c)将所述扩增产物包封在多个离散实体中，例如按每个离散实体一个分子或更少；(d)使所述多个离散实体中的所述扩增产物片段化；(e)使核酸条形码序列连接至所述片段化扩增产物，其中每个离散实体中的所述核酸条形码序列将所述片段化扩增产物与其中包封所述片段化扩增产物的所述离散实体相关联；(f)使包括与之连接的核酸条形码序列的所述片段化扩增产物从所述离散实体中释放；(g)对所述片段化扩增产物测序；并且(h)使用所述UMI序列和所述核酸条形码序列使所述片段化扩增产物生物信息学重新组装以提供所述扩增产物源于其中的所述核酸靶分子的序列。应当注意的是在重新组装期间，包括条形码，但不含UMI的片段或其扩增产物，可以与具有相同条形码但含有UMI的片段相关联以鉴定源于相同液滴并因此源于相同分子的片段。
因此，例如，如果用含有多个5kb DNA分子的反应容器开始，每个DNA分子均不同并且全部要整体测序，则可以使UMI连接至反应容器中所述多个5kb分子中的每一个的末端。这可以在包封于液滴之前在批量步骤中进行。然后可以批量扩增DNA分子，从而产生先前所产生的每个靶标-UMI杂交体的许多拷贝。这样产生了含有多个5kb分子的反应容器，其中每个5kb分子均具有UMI，并且其中那些分子中的每一个均以许多拷贝存在于反应容器中。
那些分子中的每一个现在均可单独地包封在液滴中。然后可以使包封的液滴片段化并且使接头连接至每个液滴中的每个分子片段的末端。这意味着，例如，如果每个5kb靶标片段化成100个各50bp的碎片，则每个液滴中将具有100个DNA碎片。
现在可以经由接头使核酸条形码序列连接至每个液滴中的100个片段，使得核酸条形码序列对于指定液滴中的所有100个片段而言是相同的，但在液滴间是不同的。
然后可以汇合来自液滴的核酸，测序并生物信息学重新组装。指定液滴相对于重新组装序列含有空位时，可以根据UMI将来自不同液滴的序列剪接在一起以构造所有空位已填充的新的、共有序列。
通过深度测序的蛋白质组学分析
在一些实施方案中，本公开提供了可用于表征一个或多个生物样品中存在的蛋白质和/或表位的条形码化方法。
寡核苷酸偶联的亲和试剂：在一些实施方案中，单个细胞，例如在离散实体例如液滴中，是分离的。这些细胞可裂解并使其核酸条形码化。可以对离散实体中具有独特条形码序列的许多单细胞进行这个过程，独特条形码序列使得能够按条形码对混合序列读段进行后续解卷积以获得单细胞信息。这种策略本质上提供了将源于大量单细胞的核酸分组在一起的方式。通常，在到目前为止所描述的实施方案中，已假定核酸源于细胞本身，但替代方案容许条形码化细胞外源的但可按功能方式与细胞相关联的核酸。
例如，亲和试剂如抗体可与核酸标记偶联，例如包括条形码的寡核苷酸，其可用于鉴定抗体类型，例如抗体的靶特异性。然后这些试剂可用于结合细胞内或细胞上的蛋白质，从而使亲和试剂所携带的核酸和与之结合的细胞相关联。然后可以通过如本文所述的条形码化工作流程处理这些细胞以使条形码连接至亲和试剂上的核酸标记。然后可以使用文库制备、测序和生物信息学技术根据细胞/离散实体条形码为序列分组。可以结合或识别生物样品或其部分或组分，如蛋白质、分子或其复合物的任何合适的亲和试剂，均可连同这些方法一起使用。
亲和试剂可经涉及其同一性，例如抗体的靶特异性的核酸序列标记，从而容许使用本文描述的条形码化和测序方法对其进行检测和量化。合适的核酸标记可包括DNA、RNA和核酸类似物如LNA、XNA等。
亲和试剂可包括，例如抗体、抗体片段、Fab、scFv、肽、药物等或其组合。亲和试剂，例如抗体，可以由一种或多种生物体表达或使用生物合成技术，如噬菌体、mRNA或核糖体展示来提供。亲和试剂也可通过化学或生物化学方式生成，例如通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的化学连接、点击化学或链霉亲和素-生物素相互作用。
也可以通过使寡核苷酸连接至亲和试剂并且使附加寡核苷酸与先前偶联的寡核苷酸杂交、连接和/或通过聚合酶等延伸来生成寡核苷酸-亲和试剂偶联物。用核酸标记亲和试剂的优点是，容许对生物样品的高度多重化分析。例如，识别样品中的各种靶标的抗体或结合试剂的大量混合物可以混合在一起，各自经其自身的核酸序列标记。然后可以使这种混合物与样品反应并进行如本文所述的条形码化工作流程以恢复关于结合哪种试剂、其量及这在样品中不同实体间，例如在单个细胞间如何变化的信息。
上述方法可适用于各种分子靶标，包括含细胞、肽、蛋白质、大分子、大分子复合物等中的一种或多种的样品。可以使样品进行用于分析的常规处理，例如固定和渗透化，帮助亲和试剂结合。为获得高度精确的量化，也可以使用本文描述的独特分子标识符(UMI)技术，以便精确地为亲和试剂分子计数。这可以按许多方式实现，包括在偶联之前、期间或之后向连接至每种亲和试剂的标签上合成UMI，或在使用该试剂时微流控连接UMI。
例如，使用适用于单细胞测序和本文描述的组合条形码技术的生成条形码的类似方法，也可适用于亲和试剂技术。这些技术使得能够分析多种生物样品中的蛋白质和/或表位以进行，例如，表位定位或蛋白质和其它实体中的翻译后修饰或进行单细胞蛋白质组学分析。例如，使用本文描述的方法，可能生成检测生物体的蛋白质组中所有蛋白质内的表位的经标记亲和试剂的文库，用试剂标记那些表位，并应用本文描述的条形码化和测序技术检测并精确量化与这些表位相关联的标记。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于检测靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)用包括第一核酸条形码序列的寡核苷酸标记对分子靶标有特异性的多种亲和试剂中的每一种，其中所述第一核酸条形码序列标识被所述寡核苷酸标记的所述亲和试剂的靶特异性；(b)使所述多种亲和试剂与多个分子靶标在足以使所述多种亲和试剂与其特异性分子靶标(存在时)特异性结合的条件下接触；(c)将与其特异性分子靶标(存在时)结合的所述多种亲和试剂与多个第二核酸条形码序列一起包封在多个离散实体中，其中包封在每个离散实体中的所述第二核酸条形码序列独特地标识包封其的所述离散实体；(d)将所述第二核酸条形码序列并入到包括所述第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸中；(e)对包括所述第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸测序；并且(f)使用所述第一和第二核酸条形码序列标识和/或量化同时存在于相同离散实体中的亲和试剂。
在上述方法的在一些实施方案中，所述多种亲和试剂中的每一种和/或包括第一核酸条形码序列的每个寡核苷酸均包括独特分子标识符(UMI)，其分别独特地标识每种亲和试剂和/或每个包括第一核酸条形码序列的寡核苷酸。
单细胞蛋白质组学：本文描述的方法的极高通量特性允许对数千个至数百万个单细胞进行蛋白质组学分析，提供了表征大量单细胞的蛋白质组的可伸缩方式。其它方法，例如，使用经质谱可读标签标记的亲和试剂的质谱流式细胞术(mass cytometry)，在其可以产生的标签数量和该方法的灵敏度上有限，因为质谱读数无法检测以低水平存在的蛋白质。流式细胞术和荧光法在一些情况下，可以提供更高的灵敏度，但这些对于多重化受到严重限制，因为仅可能用荧光染料独特地标记数十个或最多数百个亲和试剂探针。相比之下，本文描述的方法对于可以产生的独特核酸标记的数量有效地无限制。例如，对于15mer，可能排列的数量为4^15，这提供了绰绰有余的序列来标记靶向大多数生物蛋白质组内的每种蛋白质的亲和试剂。而且，特别是在UMI的实现的情况下，该方法的灵敏度是空前的，因为可以使用例如PCR扩增甚至单一亲和试剂及其附随标记以产生足够的核酸拷贝用于序列分析和检测。UMI的使用允许大量扩增稀有试剂，同时仍然能够精确量化，因为可以使用UMI信息校正扩增期间产生的偏差。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂的方法，其中所述方法包括：(a)使生物材料，例如固定细胞的产物，与各自对分子靶标有特异性的多种亲和试剂，在足以使所述亲和试剂与其各自的分子靶标(存在于所述生物材料中时)特异性结合的条件下接触，其中所述亲和试剂中的每一种均包括与之偶联的寡核苷酸；(b)将所述生物材料包封在多个第一离散实体中；(c)提供多个包括核酸条形码序列的第二离散实体；(d)使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物、所述多个第二离散实体之一的内容物及足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸或其扩增产物之一中的试剂组合在离散实体中；并且(e)使包括所述多个第一离散实体之一和所述多个第二离散实体之一的所述组合内容物的所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸或其扩增产物之一中的条件。
在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括将独特分子标识符(UMI)并入到寡核苷酸偶联的亲和试剂中的步骤。
在其它实施方案中，本公开提供了一种条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂的方法，其中所述方法包括：(a)使多个细胞与各自对分子靶标有特异性的多种亲和试剂，在足以使所述亲和试剂与其各自的分子靶标(存在于所述细胞中时)特异性结合的条件下接触，其中所述亲和试剂中的每一种均包括与之偶联的寡核苷酸；(b)将所述细胞包封在多个第一离散实体中并裂解；(c)提供多个包括核酸条形码序列的第二离散实体；(d)使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物、所述多个第二离散实体之一的内容物及足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸及其扩增产物之一中的试剂组合在离散实体中；并且(e)使包括所述多个第一离散实体之一和所述多个第二离散实体之一的所述组合内容物的所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸及其扩增产物之一中的条件。
在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括将独特分子标识符(UMI)并入到寡核苷酸偶联的亲和试剂中的步骤。
蛋白质间相互作用：本文描述的亲和试剂条形码化技术可用于检测和量化蛋白质间相互作用。例如，可用核酸序列标记相互作用的蛋白质并使其相互反应。如果蛋白质通过(例如)相互结合而相互作用，则其相关标记定位于结合的复合物，而不相互作用的蛋白质将保持相互不结合。然后可以在离散实体，如微流控液滴中分离样品，并使其进行融合PCR或核酸标记的条形码化。在蛋白质相互作用的情况下，指定条形码组将含有包括两种相互作用蛋白的标记的核酸，因为那些核酸将会最终处于相同区室内并且被相同的条形码序列条形码化。
相反，不相互作用的蛋白质将在统计上最终处于不同区室内，并且因此在测序之后不会群集到相同条形码组中。这容许通过根据条形码群集数据并检测该组中的所有亲和试剂标记来鉴定哪些蛋白质相互作用。也可以进行纯化步骤以在离散实体中分离之前去除未结合的亲和试剂，这弃去未产生相互作用数据的序列。可选地，使用融合方法，如包封后成对融合，可以使用扩增法来选择性扩增融合产物，有效地稀释未融合的分子并富集融合物，使得测序更有效以检测相互作用蛋白。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种连接并扩增与蛋白质偶联的核酸的方法，其中所述方法包括：(a)使核酸条形码序列偶联的蛋白质群体在足以使多种所述蛋白质相互作用的条件下孵育，使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列相互靠近；(b)将所述核酸条形码序列偶联的蛋白质群体包封在多个离散实体中，使得相互作用蛋白(若存在)共同包封；(c)使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物与足以使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列(若存在)扩增并连接的试剂组合在离散实体中；并且(d)使所述离散实体经受足以使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列(若存在)扩增并连接的条件。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于经条形码化鉴定蛋白质间相互作用的方法，其中所述方法包括：(a)使核酸条形码序列偶联的蛋白质群体在足以使多种所述蛋白质相互作用的条件下孵育，从而使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列相互靠近；(b)将所述核酸条形码序列偶联的蛋白质群体包封在多个离散实体中，使得相互作用蛋白(若存在)共同包封；(c)使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物与足以使第二核酸条形码序列并入到所述相互作用蛋白(若存在)上的所述核酸条形码序列或其扩增产物中的试剂组合在离散实体中；并且(d)使所述离散实体经受足以使第二核酸条形码序列并入到所述相互作用蛋白(若存在)上的所述核酸条形码序列或其扩增产物中的条件。
上述方法中利用的核酸条形码序列偶联的蛋白质群体可以使用本领域已知的任何合适的方法生成，例如噬菌体展示、核糖体展示和/或mRNA展示。
替代免疫沉淀法的表位和PTM定位：本文公开的方法允许检测蛋白质，例如单分子和蛋白质复合物中的表位、翻译后修饰(PTM)、剪接变异等。例如，使用本文描述的方法，包括具有不同PTM或表位的蛋白质的样品可以与核酸标记的亲和试剂一起孵育，使得试剂与分子上的PTM或表位结合。这样用涉及分子上存在的表位的亲和试剂集合标记了样品中的分子。然后可以使结合复合物进行本文描述的分离、条形码化和测序过程，以定位哪些表位或PTM存在于样品中每个单独分子上。
除单独的蛋白质外，这些方法也适用于大分子复合物，例如核糖体，以检测哪些表位存在于复合物内。此类方法也可用于确定据称相似的复合物内的变异。实现这一点的一种方法使用免疫沉淀“下拉”策略，其中使复合物与亲和试剂如抗体结合，并且使用抗体通过使其与固相支持体结合并去除结合的样品来从样品中富集复合物。然而，对不同表位重复地进行这个下拉过程是劳动密集型的并且牵涉不可避免的材料损失。相反，使用本文描述的技术，可以使复合物与检测怀疑存在于实体中的不同表位的亲和试剂的混合物反应，然后进行如本文所述的条形码化工作流程以确定每个样品中存在哪些表位。纯化策略，如下拉，也可用于在测序之前富集复合物和结合的亲和试剂。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种确定分子、分子复合物和/或结构内存在的表位的方法，其中所述方法包括：(a)使多个分子、分子复合物和/或结构与各自对表位有特异性的多种亲和试剂，在足以使所述亲和试剂与其各自的表位(存在于所述分子、分子复合物和/或结构中时)特异性结合的条件下接触，其中每一种所述亲和试剂均包括与之偶联的标识所述亲和试剂的表位特异性的第一核酸条形码序列；(b)将与一种或多种所述亲和试剂特异性结合的分子、分子复合物和/或结构包封在离散实体中；(c)将第二核酸条形码序列并入到所述第一核酸条形码序列或其扩增产物中，其中所述第二核酸条形码序列独特地标识所述离散实体；并且(d)对包括所述第二核酸条形码序列的所述第一核酸条形码序列或其扩增产物测序以鉴定所述分子、分子复合物和/或结构上存在的所述表位。
用于蛋白质组学分析的UMI：独特分子标识符(UMI)连同本文描述的方法的作用在于，它们允许包括核酸的样品进行显著扩增，这可在扩增后在样品中所得每种类型的分子的分数上引起偏差，而仍然能够精确地评估每种类型的原始分数。这对于转录组扩增很重要，例如，因为单细胞的转录组通常需要显著扩增以得到足够的核酸用于测序，且此类扩增很可能使转录组计数有偏差并从而使其偏斜。然而，通过并入UMI，可校正有偏差的计数。
类似策略可适用于本文描述的亲和试剂法。在这种情况下，不是使UMI连接至源于细胞的核酸，如细胞的基因组片段或mRNA转录物，而是可以使UMI连接至亲和试剂的标记，从而用允许其显著扩增并且仍仅计数一次的独特标识符标记每种亲和试剂复合物。UMI向亲和试剂的并入可以在该过程中分多步实现，包括在制备亲和试剂标记时，使其在偶联或表达步骤期间，或在微流控处理期间自然并入到亲和试剂中。例如，亲和试剂可与样品中的实体结合并分离，并且在分离后，每个分子的UMI和每个离散实体的条形码可连接至亲和试剂上的条形码标记，使得亲和试剂上的大多数标记分子经不同序列的UMI标记，而指定离散实体中的所有亲和试剂经相同或相似的核酸条形码序列标记。正如其中UMI有用的其它情况下一样，它们在这种情况下可用于校正每种亲和试剂类型，可能因(例如)测序或文库制备程序而偏斜的量化数据。这对于使得能够高度精确量化蛋白质组中的细胞蛋白，特别是对于量化产生少量总核酸并且需要大幅扩增的单细胞蛋白质组而言有用。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于测定样品中亲和试剂的数量的方法，其中所述方法包括：(a)使怀疑含有一个或多个分子靶标的样品与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包括含核酸条形码序列的寡核苷酸，所述核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性，其中所述亲和试剂和所述寡核苷酸之一或两者包括独特地标识所述多种亲和试剂中的每一种的独特分子标识符(UMI)；并且(b)使用所述UMI确定所述样品中亲和试剂的数量。
在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括扩增所述核酸条形码序列的步骤，其中所述UMI用于校正扩增偏差。
抗体标记细胞的基于FACS、Fluidigm的条形码化：本文描述了用于条形码化与生物样品中的实体如细胞相关联的核酸，以使得测序读出成为可能以获得来自大群体的单细胞信息的方法。如本文所述，相似概念可适用于诸如蛋白质和蛋白质复合物等实体。本文描述的方法通常面向相对高通量的微流控技术，如基于液滴的微流控技术，但也可适用于低通量方法。例如，用于条形码化用于单细胞转录组学或单细胞蛋白质组学分析的核酸的方法，可适用于基于FACS的分离方法，其中在孔内分离细胞并进行条形码化和测序准备。
可选地，微流控系统，如Fluidigm C1TM平台，可用于捕获、分离和制备来自单个细胞的核酸用于条形码化和测序分析。最后，虽然很重要，但可以选择细胞操纵的方法以最适于实验需要，高通量液滴法尤其非常适于分析大量(数千个至数百万个)的单细胞以用于转录组、基因组和/或蛋白质组分析。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种条形码化经标记的亲和试剂的方法，其中所述方法包括：(a)使含有一个或多个分子靶标的样品与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包括含第一核酸条形码序列的寡核苷酸，所述第一核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性；(b)从所述样品中分离所述一个或多个分子靶标；(c)将第二核酸条形码序列并入到所述寡核苷酸或其扩增产物中，其中所述第二核酸条形码序列独特地标识随所述一个或多个分子靶标分离的亲和试剂；并且(d)对其中并入了所述第二核酸条形码序列的所述寡核苷酸或其扩增产物测序以鉴定所述多种亲和试剂中的哪一种与所述样品中的所述一个或多个分子靶标结合。
在上述方法的一些实施方案中，所述分离包括将单个细胞分配到单个孔中的步骤。在上述方法的其它实施方案中，所述分离步骤包括使用微流控细胞捕获装置分离单个细胞的步骤。
单细胞基因修饰/相互作用剖析
本文描述的技术有价值的应用是其用于鉴定基因修饰并测定基因修饰/相互作用的效应。
基因修饰/相互作用：在这种应用中，可以产生细胞群，其中已经以各种方式，例如，使用转座酶将片段插入细胞基因组中或使用，例如CRISPR-Cas系统编辑或调控基因表达来操纵基因。这些技术可用于，例如，将序列如条形码插入要编辑或调控的基因内或附近，并且重复，例如以影响细胞内多个基因的功能。根据这些基因的相互作用及其对细胞过程的影响，群体内的一些细胞可与其它细胞表现不同，例如，在特定环境或介质中生长更快或更慢。那么挑战是确定细胞中已经产生了哪些修饰并将其与细胞特性相互关联，这可以使用本文描述的方法实现。例如，来自经修饰样品的细胞可进行本文描述的条形码化和/或融合工作流程以选择性扩增插入细胞核酸和/或基因组内的序列。可与修饰的类型和位置有关的这些扩增子，然后可与独特细胞条形码融合和/或经其条形码化。可以使用每个细胞独有的不同条形码或融合物对不同离散实体，如微流控液滴中大量分离的细胞重复这个过程。然后可回收来自所有离散实体的核酸并进行序列分析以获得信息以确定特定细胞中存在哪些修饰。如果在这个步骤之前分选或以其它方式富集样品，例如，以回收在特定环境中生长迅速的细胞，则将知道使用所述方法获得的序列会影响在这种环境中的细胞特性，从而提供了关于这些基因如何有助于细胞特性的信息。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于鉴定一个或多个细胞中的基因修饰的方法，其中所述方法包括：(a)向多个细胞中引入一种或多种基因修饰；(b)鉴定由于向所述多个细胞中引入所述一种或多种基因修饰而产生的一种或多种细胞表型；(c)分离离散实体中的所述每个细胞并选择性扩增包括所述一种或多种基因修饰的DNA的一个或多个区域；(d)将核酸条形码序列并入到包括所述一种或多种基因修饰的所述扩增DNA或其扩增产物中，其中所述核酸条形码序列将所述一种或多种基因修饰标识为源于单个细胞；(e)对包括所述一种或多种基因修饰的所述扩增DNA或其扩增产物测序以鉴定具有所述一种或多种细胞表型的所述细胞中的所述一种或多种基因修饰。
单细胞的多重化基因组、转录组和蛋白质组分析：本文描述的方法，例如单细胞基因组、转录组和蛋白质组测序方法，可组合用于获得来自每个细胞的多种信息。例如，作为非限制性实例，可用核酸标记的亲和试剂标记多个细胞。然后使这些细胞进行条形码化工作流程，其中它们在液滴中分离、裂解并将其mRNA拷贝为cDNA并且经条形码化和/或扩增。在这个步骤的同时、之前或之后，也可以使用相同或不同条形码使连接至亲和试剂的核酸标记条形码化。如果将相同条形码用于eDNA和亲和试剂标记，则可按这个条形码分选所有数据，聚集指定细胞对应于转录物序列和亲和试剂序列的所有读段。而且，因为如果需要，可以设计并且合成构建亲和试剂序列，所以可能容易将与转录组有关的读段和与亲和试剂有关的读段区分开。这个特定实施方案同时提供了，例如，关于单细胞转录组和蛋白质组的非常详细的信息，这对于广泛的生物学研究而言应该有价值。而且，使用两种形式的核酸上的UMI容许高度精确量化样品中转录物和亲和试剂中的每一种的水平，这也具有重大价值。
也可以通过使用，例如，本文描述的单细胞基因组测序方法向数据中添加单细胞基因组信息。例如，在一个非限制性实施方案中，可以使用亲和试剂标记的细胞进行分离、裂解细胞并使其基因组扩增的工作流程。在基因组扩增步骤之前、同时或之后，也可以使细胞转录组进行(例如)cDNA合成和扩增。片段化步骤可用于使基因组和cDNA物质片段化成在末端具有接头序列的较小片段，接头序列可以，例如是与用于扩增亲和试剂序列的接头序列相同的序列。然后将条形码并入到三种不同类型的物质的核酸中，同时或在不同的反应步骤中，标记不同类型的核酸。所得物质可进行文库制备、纯化等，并测序。这可对大量细胞并行进行并且使数据进行条形码群集以聚集与指定细胞相关的所有读段。在此类方法中，可能重要的是选择正确的测序容量以便使得不同形式的信息的序列深度水平降低仍然能够得到有用的数据，因为此类过程产生每个细胞的大量序列信息并且因为可以分析大量的总细胞。
因此，在一些实施方案中本公开提供一种用于条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂和来自单个细胞的RNA的方法，其中所述方法包括：(a)使多个细胞与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包括含第一核酸条形码序列的寡核苷酸，所述第一核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性；(b)将所述多个细胞包封在离散实体中，使得每个离散实体包括不超过一个细胞；(c)裂解所述离散实体中的所述多个细胞；并且(d)向含有所述裂解细胞的所述离散实体中引入第二核酸条形码序列和足以使RNA逆转录、cDNA产物条形码化和扩增及所述第二核酸条形码序列并入到包括第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸中的试剂。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂和来自单个细胞的RNA的方法，其中所述方法包括：(a)使多个细胞与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包括含第一核酸条形码序列的寡核苷酸，所述第一核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性；(b)将所述多个细胞包封在多个第一离散实体中，使得每个第一离散实体包含不超过一个细胞；(c)裂解所述第一离散实体中的所述多个细胞；(d)在多个第二离散实体中提供多个第二核酸条形码序列；(e)将每个所述第一离散实体与一个所述第二离散实体组合以在第一微流控装置中形成第三离散实体，其中所述第三离散实体包括足以使RNA逆转录为cDNA产物的试剂；并且(f)利用第二微流控装置向所述第三离散实体中引入足以条形码化并扩增cDNA产物并且使所述第二核酸条形码序列并入到包括第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸中的试剂。
在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括将独特分子标识符(UMI)并入到裂解细胞的RNA分子中的步骤。可选地或另外，包括第一核酸条形码序列的寡核苷酸各自包括UMI。
微流控自动免疫分析：除关联单个实体中的信息外，本文描述的方法可用于将实体内的信息与实体外源的信息关联。例如，在一个实施方案中，本发明可用于鉴定免疫细胞，如B或T细胞结合的表位。在这个实施方案中，例如，可以使用展示技术，例如核糖体、mRNA或噬菌体展示来表达可被B细胞结合的多个表位。然后表位可以与B细胞反应，使得如果特定B细胞受体结合一个或多个表位，则两者结合。然后可以使结合的复合物包封在离散实体，例如微滴中，并且进行例如本文描述的融合或条形码化方法。这可用于，例如将编码表位的序列连接到编码B细胞受体的序列，或将其中每一个连接到共同的条形码序列。
无论使用哪种方法，均可对分子测序并且通过读取融合在一起的序列，或可选地，通过按条形码群集读段来检测相互作用的配对，读段则含有编码表位的读段和编码受体的读段。这对筛选可与其它大的分子文库相互作用的大的分子文库非常有用，以检测大量的相互作用。目前检测此类相互作用成本很高，因为它们常常需要不同的可能相互作用分子中的每一个在用于测试的单个反应容器中是分离的。相反，使用本文描述的方法，若需要可以在单个反应容器中测试所有相互作用，并且使用条形码化/测序方法检测相互作用信息。若需要，也可以掺入洗涤剂，以去除弱结合表位并且，通常，控制获得的相互作用的强度。类似方法也可适用于检测例如细胞或病毒外源的其它实体，例如留在宿主细胞内的病毒序列。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于检测被一个或多个细胞结合的表位的方法，其中所述方法包括：(a)使多个细胞与多个表位接触，其中所述表位经标识所述表位的核酸条形码序列和/或UMI标记，(b)分离离散实体中的细胞和任何结合的表位；(c)使编码表位结合的细胞多肽的核酸和编码与所述多肽结合的表位的核酸融合；(d)通过检测融合核酸的序列鉴定被哪些多肽结合哪些表位。
经标记的表位可包括通过mRNA、核糖体、噬菌体或其它展示技术表达的多肽或其它生物分子。
作为使表位编码序列和与表位结合的细胞多肽编码序列融合的替代方案，可以用核酸条形码序列连接两个序列，容许通过根据核酸条形码序列群集序列数据来检测相互作用的表位和多肽。
可并入一个或多个UMI以获得对表位-多肽相互作用更精确的量化。
可在分离和融合和/或条形码化之前利用一个或多个纯化步骤以去除未结合的表位。
文库制备、分析、储存和重复利用
基于珠粒的文库制备：在一些实施方案中本公开提供了一种制备用于测序的条形码化DNA的方法，其中所述方法包括：(a)使DNA片段化为多个片段，所述多个片段包括5’末端、3’末端和内部片段；(b)将所述多个片段连同固相支持体，如珠粒(例如，磁珠粒)一起包封在一个或多个离散实体，例如微滴中；(c)使所述5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上；(d)使所述内部片段与可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端分离；并且(e)释放可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端。
所述片段化可使用任何合适的方法实现，例如物理剪切和/或用一种或多种酶进行酶促片段化，并且可以发生在使所述DNA的5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上之前或之后。
在一些实施方案中，所述方法包括使可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端经受酶促修饰，如限制性酶切、连接和聚腺苷酸化的步骤。
读段的计算机分选：在一些实施方案中，本公开提供一种使用条形码为测序读段分组的方法，其中所述方法包括：(a)对包括核酸条形码序列的多个核酸分子测序以提供测序读段，其中所述多个核酸分子包括源于相同和不同离散实体的核酸分子；(b)使用汉明或莱文斯坦距离标准(Hamming or Levenshtein distance criterion)按核酸条形码序列为所述测序读段分组；(c)使用并入到所述测序读段中的一个或多个附加条形码或独特分子标识符(UMI)的序列在统计上确定源于相同离散实体的条形码组；(d)组合源于相同离散实体的条形码组的读段；并且(e)去除每个测序读段的条形码部分并使用剩余部分做进一步分析。
文库的重复利用和储存：本文描述的条形码化分子文库，例如使用本文描述的方法生成的条形码化cDNA文库，可用于产生几个核酸样品用于测序。例如，无论是从单细胞基因组、转录组还是结合的亲和试剂获得的条形码化分子，均可包括经条形码标记的核酸序列。可以在这些条形码序列的侧面提供已知引物序列。这样容许，例如经由PCR扩增样品，以不断产生更多样品用于测序。这样的优点是，构建的文库稍后可以储存和回收以生成附加测序文库。当必须重访样品以获得更详细的信息或第一次分析得到了推动另外的、后续分析的新知识时，这可能有价值。与本发明中描述的富集策略相结合，这对于以高深度分析大的、异源群体中感兴趣的亚群可能有价值。
而且，使用如本文所述的基于珠粒的方法，若需要，可以并入洗涤步骤。例如，可以通过选择珠粒，使用例如磁力分离磁珠，从溶液中纯化使用本文描述的一种或多种方法连接至珠粒上的条形码化核酸。这容许洗涤样品以回收纯化核酸，有助于附加处理。另外，经分子，如生物素标记的引物，可用于扩增条形码化核酸，使得生物素并入到固定产物中。所得扩增子可以通过连接到包覆在例如链霉亲和素中的纯化珠粒上而分离。可进行基于尺寸选择等的附加纯化步骤。这允许使用不基于珠粒的方法生成条形码化核酸文库，然后为了纯化目的可使其连接至珠粒上。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种由条形码化核酸文库制备序列文库的方法，其中所述方法包括：(a)生成条形码化核酸的第一文库；(b)由所述第一文库制备测序文库；(c)储存所述第一文库；并且(d)由所述第一文库制备第二测序文库。在所述方法的一些实施方案中，第一文库包括连接至固相支持体，例如一个或多个珠粒的核酸，可通过荧光激活细胞分选术(FACS)、PCR激活细胞分选术(PACS)或磁激活细胞分选术(MACS)中的一种或多种来分选所述珠粒。
在一些实施方案中，通过用标记引物，例如生物素标记的引物扩增该文库的核酸，并且用对标记引物的标记具有特异性结合亲和力的亲和试剂，例如链霉亲和素分离扩增产物，纯化第一文库以用于储存和/或附加处理。
使用MACS、PACS、PAS或dial-out PCR生成靶向序列文库：在本公开的某些应用中，需要比其它更深度地对对应于特定条形码组的特定核酸亚群测序。这可以使用本文描述的方法实现，例如，以进行文库的第一序列分析，其中测序未靶向特定核酸。因为可能存在大量的条形码组，所以指定条形码组的范围可能不足以在所需深度上对该组核酸测序。然后可按条形码群集该文库广而浅的测序并且分析条形码组以检测感兴趣的亚群及其条形码。
例如，使用浅转录组测序，可以用不同细胞表型混合群体中一定程度的确定性鉴定不同细胞的表型。感兴趣的细胞的条形码序列则可用作从该组中选择性富集核酸以用于深度测序的方式，从而将测序集中于所关注的组。这可以按许多方式实现。例如，可生成具有与条形码互补的序列的荧光探针，其与靶条形码的核酸杂交，使其为荧光性的。然后可以使用，例如流式细胞术对其进行分选。这通过使条形码与珠粒结合而受到大大帮助，使得每个珠粒具有相同条形码的多个拷贝，使得更易于用流式细胞仪检测。
可选地，如同在微流控液滴中的PCR激活分选术的方法可用于分选具有所需条形码序列的单个细胞或珠粒。另一种替代方案是用例如生物素标记具有与靶条形码互补的序列的探针，使其可以富集例如链霉亲和素涂布的磁珠粒。再一种方法是应用称为dial-outPCR的技术，其中生成对所关注的条形码组有特异性的引物并且用作扩增的启动序列。然后可将其用于选择性扩增混合、条形码化文库中的靶标组。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种用于由条形码化核酸文库制备序列文库的方法，其中所述方法包括：(a)生成条形码化核酸文库，其中所述文库包含源于多个细胞的核酸分子的序列；(b)由所述文库获得序列信息；(c)使用所述序列信息设计能够选择性扩增包括源于特定细胞的序列的条形码化核酸的引物；并且(d)选择性扩增和分析包括源于特定细胞的序列的所述条形码化核酸。在一些实施方案中，能够选择性扩增包括源于特定细胞的序列的条形码化核酸的引物包括由先前分析条形码化核酸或与之互补的序列的文库获得的核酸条形码序列。
在其它实施方案中，本公开提供了一种用于分析条形码化序列文库的方法，其中所述方法包括：(a)生成条形码化核酸文库；(b)以第一覆盖深度对所述文库测序以获得关于所述文库中的多个条形码组的信息；(c)分析关于所述文库中的所述多个条形码组的信息以鉴定用于以更深的第二覆盖深度测序的条形码组子集；并且(d)富集所述条形码组子集的所述核酸以生成用于以更深的第二覆盖深度测序的靶向文库。
在上述方法的一些实施方案中，条形码组子集与一个或多个珠粒结合，并且所述富集包括使与所述条形码组子集中的一个的已知条形码互补的标记探针杂交并且使用标记探针分选珠粒。在上述方法的其它实施方案中，所述富集包括利用与所述条形码组子集中的特定条形码序列杂交的引物在微流控液滴中进行PCR激活分选术，从而分选所述条形码组子集的核酸。
应用
能够使用本文描述的方法，单独地或同时分析大量细胞的基因组、转录组和蛋白质组，对于广泛的应用而言是有价值的。所述方法对于分析由异质性实体，如组织或干细胞群组成的系统尤其有用。
组织分析：本文描述的方法可用于分析异质性血细胞，或构成健康组织，例如肾脏、肝脏、脑等的不同细胞。它们对于研究患病组织，如肿瘤也有用。例如所述方法可适用于所谓的“液体肿瘤”，例如包括血癌的细胞，或实体瘤，其中可以使用酶促技术使肿瘤解聚，然后用本文描述的方法使肿瘤细胞进行基因组、转录组和/或蛋白质组分析。
本公开的方法可用于由单个癌细胞获得基因组序列或单倍体型，并且相关的转录组和蛋白质组分析方法可用于跟踪在癌细胞路径的表型和失调方面从编码基因组到其修饰的信息流。由于本发明固有地高通量特性，使得可能分析数百万个单细胞，公开的方法特别适于帮助理解肿瘤的异质性及癌症的特性和机理。
类似技术也可适用于研究抗体和T细胞受体库，以及生物体中表现出多样性的其它库。例如，本文描述的剪接和/或条形码化方法可用于连接编码抗体或T细胞受体链的核酸或为其分组，使其可以成对测序。这对于鉴定可能是疾病来源或疾病治疗靶标的强效抗体将是有价值的，所述疾病范围从病毒和细菌感染到自身免疫性病症，如类风湿性关节炎。
连同公开方法一起使用的步骤、组分和程序
各种步骤、组分、试剂和程序均可用于执行公开方法的各个方面。下面提供了此类步骤、组分、试剂和程序的非限制性实例。
离散实体的类型：连同公开方法一起制备或使用的离散实体例如微滴的组成和特性可以不同。例如，在一些实施方案中，离散实体可包括一个细胞且不超过一个细胞。在其它实施方案中，离散实体可包括多个细胞，即两个或更多个细胞。在一些方面中，根据本公开的离散实体可包括一种核酸或多种核酸。在一些实施方案中，如本文所讨论的，离散实体可包括一种或多种固体和/或凝胶材料，如一种或多种聚合物。
在一些实施方案中，可以使用表面活性剂稳定离散实体，例如微滴。因此，微滴可包括表面活性剂稳定的乳液。允许在离散实体例如微滴中进行所需反应的任何便利的表面活性剂均可使用。在其它方面中，未用表面活性剂或颗粒稳定离散实体，例如微滴。
使用的表面活性剂取决于许多因素诸如用于乳液的油相和水相(或其它合适的不混溶相，例如，任何合适的疏水相和亲水相)。例如，当在氟碳油中使用含水液滴时，表面活性剂可具有亲水性嵌段(PEG-PPO)和疏水性氟化嵌段(
Figure BDA0003744850070000711
FSH)。然而，如果将油转化为烃油，例如，代替地选择表面活性剂以使其具有疏水性烃嵌段，如表面活性剂ABIL EM90。在选择表面活性剂时，在选择表面活性剂时可考虑的所需性质可包括以下的一种或多种：(1)表面活性剂具有低粘度；(2)表面活性剂不与用于构建该装置的聚合物混溶，因此其不会使设备膨胀；(3)生物相容性；(4)测定试剂不溶于表面活性剂；(5)表面活性剂表现出良好的气体溶解度，因为其允许气体进出；(6)表面活性剂具有高于用于PCR的温度(例如95℃)的沸点；(7)乳液稳定性；(8)表面活性剂使具有所需尺寸的液滴稳定；(9)表面活性剂可溶于载体相中而不溶于液滴相中；(10)表面活性剂具有有限的荧光性质；和(11)表面活性剂在一定温度范围内保持溶于载体相中。
还可设想其它表面活性剂，包括离子型表面活性剂。也可以将其它添加剂包括在油中以稳定离散实体，例如微滴，包括增加离散实体例如液滴在高于35℃的温度下的稳定性的聚合物。
本文描述的离散实体，例如微滴，可制备成乳液，例如，分散于不混溶相载液(例如，氟碳油或烃油)中的水相流体或反之亦然。可以选择微流控通道(或其上的涂层)的特性，例如亲水性或疏水性，以便与在微流控工作流程中的特定点处所使用的乳液类型相容。
可以使用下面更加详细描述的微流控装置生成乳液。微流控装置可以形成由尺寸极其均匀的液滴构成的乳液。微滴生成过程可通过将两种不混溶的流体(诸如油和水)泵入接合点来实现。接合点的形状、流体性质(粘度、界面张力等)和流速影响所生成的微滴的性质，但是对于相对宽的性质范围，可使用方法诸如T形接合点和流动聚焦来生成具有受控均匀尺寸的微滴。为改变微滴尺寸，可以改变不混溶液体的流速，因为在一定性质范围内对于T形接合点和流动聚焦方法，微滴尺寸取决于两种流体流速的总流速和比率。为了利用微流控方法生成乳液，通常将两种流体加载至两个入口储存器(注射器、压力管)中，然后根据需要加压以产生所需的流速(使用注入泵、压力调节器、重力等)。这以所需的流速泵送流体通过装置，从而生成具有所需尺寸和速率的微滴。
在一些实施方案中，使用如PCT公开第WO 2014/028378号中描述的液滴制造器生成微滴，所述PCT公开的公开内容以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。
向离散实体中添加试剂：在实践主题方法时，可以在一个或多个步骤(例如，约2个、约3个、约4个或约5个或更多个步骤)中，添加许多试剂，即并入到离散实体例如微滴中和/或被其包封。此类试剂可包括，例如扩增试剂，如聚合酶链式反应(PCR)试剂。向离散实体例如微滴中添加试剂的方法可以在许多方面不同。所关注的方法包括但不限于Ahn等人，Appl.Phys.Lett.88，264105(2006)；Priest等人，Appl.Phys.Lett.89，134101(2006)；Abate等人，PNAS，2010年11月9日第107卷第45期19163-19166；及Song等人，Anal.Chem.，2006，78(14)，第4839-4849页描述的那些方法；所述文献的公开内容以引用的方式并入本文。
例如，可通过涉及合并离散实体例如微滴与含有试剂的第二离散实体例如微滴的方法，向离散实体例如微滴中添加试剂。第二离散实体中所含的试剂可通过任何便利的方法添加，特别是包括本文描述的那些方法。这种第二离散实体可以与第一离散实体合并以产生包括第一离散实体和第二离散实体两者的内容物的离散实体例如微滴。
在一些实施方案中，使用下面更加详细描述的包括连环化合并架构(concatemerized merger architecture)的微流控装置实现离散实体，例如液滴的合并。
也可以或者改为使用诸如液滴聚结或皮量注入等技术添加一种或多种试剂。在液滴聚结中，可以使靶滴(即，微滴)与含有要向所述微滴添加的试剂的微滴并排流动。可使两种微滴这样流动，以使得它们彼此接触，但不接触其它微滴。然后使这些小滴通过用于施加电场的电极或其它结构，其中所述电场可以使微滴不稳定，使其合并在一起。
也可以或者改为使用皮量注入添加试剂。在这种方法中，可以使靶滴(即，微滴)流过流过含有待添加的试剂的通道，其中试剂处于升高的压力下。然而，由于表面活性剂的存在，在电场不存在的情况下，微滴将流过而不被注入，因为涂覆微滴的表面活性剂可防止流体进入。然而，如果在微滴通过注射器时对所述微滴施加电场，则含有试剂的流体将被注入至微滴中。添加至微滴中的试剂的量可通过几个不同的参数来控制，诸如通过调整注入压力和流动滴的速度，通过接通和断开电场等来控制。
在各个方面中，也可以或者改为通过不依赖于将两个液滴合并在一起或将液体注入小滴中的方法将一种或多种试剂添加到微滴中。相反，可通过以下方法将一种或多种试剂添加至微滴中，所述方法涉及将试剂乳化成非常小的滴流，和使这些小滴与靶微滴合并的步骤。此类方法本文应称为“通过多滴聚结添加试剂”。这些方法利用这一事实，由于和靶滴相比，要添加的小滴的尺寸小，所以小滴将比靶滴更快地流动并且在它们后面聚集。然后可以通过例如施加电场来合并该聚集物。也可以或者替代地使用该方法，通过使用几个不同流体的小滴共流流，将多种试剂添加至微滴中。为使得微小靶滴有效合并，重要的是使微小滴比含有靶滴的通道更小，并且同样重要的是使注入靶滴的通道与施加电场的电极之间的距离足够长以便给予微小滴时间“赶上”靶滴。如果这个通道太短，则并非所有的微小滴都会与靶滴合并并且添加比预期更少的试剂。在一定程度上，这可以通过增加电场的大小来补偿，这倾向于允许相隔更远的液滴合并。除了在相同的微流控装置上制备微小滴以外，还可以，或替代地使用另一微流控液滴制造器或通过均质化来离线(offline)制备，然后将其注入至含有靶滴的装置中。
因此，在一些实施方案中，通过以下方法将试剂添加至微滴中，所述方法涉及将试剂乳化成液滴流，其中液滴小于微滴的尺寸；使液滴与微滴一起流动；以及使液滴与微滴合并。包含在液滴流中的液滴的直径可在为微滴直径的约75％或更小的范围内变化，例如，流动液滴的直径为微滴直径的约75％或更小，为微滴直径的约50％或更小，为微滴直径的约25％或更小，为微滴直径的约15％或更小，为微滴直径的约10％或更小，为微滴直径的约5％或更小，或为微滴直径的约2％或更小。在某些方面，多个流动液滴(诸如2个或更多个液滴，3个或更多个，4个或更多个，或5个或更多个)可与微滴合并。此类合并可通过各种方式实现，包括但不限于通过施加电场，其中电场有效地将流动液滴与微滴合并。
另一方面，通过将要向其中添加试剂的小滴(即，“靶滴”)包封在含有要添加的试剂(“靶试剂”)的小滴中，将试剂添加到先前形成的小滴(例如，微滴)中。在某些实施方案中，此类方法通过先将靶滴包封在合适疏水相的壳体，例如油中以形成双重乳液来进行。然后使双重乳液被含有靶试剂的小滴包封以重形成三重乳液。为了将靶滴与含有靶试剂的小滴组合，然后使用任何合适的方法使双重乳液猛然打开，包括但不限于施加电场，添加使液滴界面不稳定的化学物质，使三重乳液流过收缩部和其它微流控几何结构，施加机械搅拌或超声波，升高或降低温度，或通过将磁性粒子包封在可以使双重乳液界面在被磁场拉动时破裂的小滴中。
分选：在实践本公开的方法时，可采用一个或多个分选步骤。所关注的分选方法包括但不一定限于，涉及使用一个或多个分选机，例如微流控装置的分选机的方法，其采用微流控阀、薄膜阀、分叉通道、表面声波和/或介电电泳。可连同公开的方法、系统和装置一起使用的分选方法还包括Agresti等人，PNAS第107卷第9期，4004-4009描述的那些方法；和PCT公开第WO 2014/028378号中描述的那些方法，所述文献各自的公开内容以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。可通过分选富集群体，例如离散实体群，因为含具有或不具有所需特性的成员混合物的群体可通过去除不具有所需特性的那些成员来富集，从而产生具有所需特性的富集群体。
在各个实施方案中，主题方法包括扫描，例如光学扫描一个或多个离散实体，例如微滴，以促进离散实体的分选。同样，在一些实施方案中，微流控装置或其部分，例如分选机，包括一个或多个检测器，例如光学扫描仪。本领域中已知各种合适的光学扫描仪。此类光学扫描仪可包括，例如用于向一个或多个离散实体施加激发能的一根或多根光纤。在一些实施方案中，合适的光学扫描仪利用指向物镜背面，并聚焦到液滴所流过的微流控通道上的激光光源，例如以激发一个或多个离散实体内的荧光染料。扫描一个多个离散实体可允许测定所扫描的实体的一种或多种特性，例如尺寸、形状和组成。分选又可基于所述一种或多种特性进行。例如，分选可基于从一个或多个离散实体的光学扫描获得的结果。
可以检测的离散实体的特性包括但不限于尺寸、粘度、质量、浮力、表面张力、导电性、电荷、磁性和/或一种或多种组分，例如一种或多种可检测标记(例如，一种或多种荧光标记)的存在或不存在。在某些方面，分选可至少部分基于微滴中一个或多个细胞，例如一个或多个可检测标记细胞的存在或不存在。在某些方面，分选可至少部分基于对PCR扩增产物的存在或不存在的检测。
可以在公开方法中在任何合适的点应用分选。而且，可向离散实体群或其类型，例如微滴应用两个或更多个分选步骤，例如约2个或更多个分选步骤，约3个或更多个、约4个或更多个或约5个或更多个等。当应用多个分选步骤时，步骤可在一个或多个方式(例如，基于不同性质进行分选，使用不同技术进行分选等)方面基本上相同或不同。
而且，可以在任一分选步骤之前或之后纯化离散实体，例如液滴。在一个实施方案中液滴可如下进行纯化：用纯化溶液更换小滴中的大部分流体，而不去除可以包封在小滴内的任何离散试剂，如细胞或珠粒。首先为微滴注入溶液以稀释其内的所有杂质。然后使稀释的微滴流过微流控通道，使用电极在微流控通道上施加电场。由于电场所产生的介电泳力，当细胞或其它离散试剂经过电场时，它们将在流中位移。然后小滴分裂，使得所有物体最终在一个微滴内。因此，初始微滴已经纯化，因为在维持所得微滴中，可以包封在液滴内的离散试剂，如珠粒或细胞的存在和/或浓度的同时，可以去除污染物。
可基于一种或多种特性分选微滴。所关注的特性包括但不限于尺寸、粘度、质量、浮力、表面张力、导电性、电荷、磁性和/或一种或多种组分，例如一种或多种可检测标记的存在或不存在。在某些方面，分选可至少部分基于微滴中一个或多个细胞，例如一个或多个可检测标记细胞的存在或不存在。在某些方面，分选可至少部分基于对PCR扩增产物的存在或不存在的检测。
分选可用于，例如去除其中不存在细胞的离散实体，例如微滴。包封可产生一个或多个其中不存在细胞的离散实体，例如微滴，包括大多数离散实体，例如微滴。如果此类空滴留在系统内，将如同任何其它小滴一样对它们进行处理，期间将浪费试剂和时间。为达到最高速度和效率，可用液滴分选法去除这些空滴。例如，小滴制造器可以接近滴落-喷射过渡操作，使得在不存在细胞的情况下，形成第一尺寸(例如8μm)的小滴；相反，存在细胞时，流内产生的干扰将触发喷口的破裂，形成第二尺寸(例如直径为25μm)的小滴。因此该装置产生第一尺寸(例如8μm)的空滴和第二尺寸(例如25μm)的含单细胞的小滴的双分散群体，然后可以使用例如流体动力分选机按尺寸对其进行分选以仅仅回收第二(例如较大)尺寸的含单细胞的小滴。
主题实施方案的分选机可以是主动或被动分选机。所关注的被动分选机包括流体动力分选机，其根据尺寸，基于小滴和大滴通过微流控通道的不同方式，将离散实体，例如微滴，分选至不同通道内。同样关注的是批量分选机，其简单实例为在重力场含有不同质量的小滴的管。通过离心、搅拌和/或振荡该管，浮力更大的较轻小滴将自然地迁移到容器顶部。除通过向容器施加电场外，针对将会根据那些特性的幅度自然迁移的具有磁性的那些小滴，可按类似过程分选具有磁性的小滴。如主题方法中所用的被动分选机也可涉及相对较大的通道，所述通道基于小滴的流动特性同时分选大量小滴。另外，在一些实施方案中，通过一个或多个阀门，例如微流控阀的作用来进行分选。
皮量注入也可用于改变小滴的电气性质。这可用于，例如通过添加离子改变小滴的导电性，然后用于对其进行分选，例如，使用介电电泳。可选地，皮量注入也可用于使小滴带电。这可通过向小滴内注入带电流体来实现，使得在注入后，小滴将会带电。这样会产生小滴集合，其中一些带电而其它的不带电，然后通过使带电小滴流过将根据其电荷量使其偏转的电场区域提取带电小滴。通过调节皮量注入来注入不同量的液体，或对于固定注入体积而言通过调节电压以注入不同电荷，可以调整小滴上的最终电荷，以产生带不同电荷的小滴。然后这些在电场区域内偏转不同的量，允许将其分选到不同容器中。
细胞的包封和/或裂解：根据主题方法的一些实施方案，可以使用任何便利的方法，例如通过应用针和/或注射器从受试者中回收细胞。然后使用例如处理步骤，如离心、过滤等处理生物样品以去除细胞以外的组分。
生物样品或其子集中的每个细胞，然后均可使用微流控装置包封到离散实体，例如液滴中。可用于包封来自生物样品的组分的方法和装置在PCT公布第WO 2014/028378号中有描述，其公开内容以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。所关注的包封方法还包括但不限于流体动力触发的小滴形成和Link等人，Phys.Rev.Lett.92，054503(2004)描述的那些方法，其公开内容以引用的方式并入本文。也可以应用将细胞包封到液滴中的其它方法。需要时，可以在将细胞包封到小滴中之前用一种或多种抗体和/或探针为细胞染色。
在其中可导致细胞爆裂，从而释放它们的基因组的条件下，还可将一种或多种裂解剂添加至含细胞的离散实体，例如液滴中。在将细胞包封至离散实体例如微滴中后，可添加裂解剂。可使用任何便利的裂解剂，诸如蛋白酶K或细胞毒素。在具体实施方案中，可将细胞与含有清洁剂诸如Triton X100和/或蛋白酶K的裂解缓冲液共包封在小滴中。其中可引起细胞爆裂的特定条件将取决于所使用的特定裂解剂而变化。例如，如果将蛋白酶K作为裂解剂掺入，则可将离散实体，例如液滴加热至约37-60℃持续约20分钟以裂解细胞并使得蛋白酶K能够消化细胞蛋白，然后将它们加热至约95℃持续约5-10分钟以使蛋白酶K失活。
在某些方面，细胞裂解还可以或者替代地依赖不涉及添加裂解剂的技术。例如，裂解可通过机械技术来实现，所述机械技术可采用各种几何特征来实现细胞的刺孔、剪切、研磨等。还可使用其它类型的机械破裂，诸如声学技术。另外，还可使用热能来裂解细胞。可在本文所述的方法中使用实现细胞裂解的任何便利的方法。
PCR：如上所述，在实践主题方法时，基于PCR的测定，例如定量PCR(qPCR)，可用于检测离散实体或其一个或多个组分，例如其中包封的细胞中存在的所关注的某些核酸，例如基因的存在。此类测定可适于微流控装置或其部分或任何其它合适位置的离散实体。此类基于PCR的测定的条件可包括随时间推移检测核酸扩增并且可以在一个或多个方面不同。
例如，可被添加至微滴的PCR引物的数量可以变化。术语“引物”可指不止一个引物，并且可指寡核苷酸，无论是天然存在的(如在纯化的限制性消化中)还是合成产生的，所述寡核苷酸，当被置于其中催化与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，能够用作沿互补链合成的起始点。此类条件包括例如在合适的缓冲液(包括作为辅因子，或影响pH、离子强度等的取代物的“缓冲液”)中和在合适的温度下存在四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂诸如DNA聚合酶或逆转录酶。引物优选是单链的，以在扩增中获得最大效率。
如本文所用的核酸序列的互补序列可指当与所述核酸序列对齐以使得一个序列的5′末端与另一个序列的3′末端配对时，处于“反向平行缔合”的寡核苷酸。互补不需要是完全的；稳定的双链体可含有错配碱基对或不匹配的碱基。可根据经验考虑多种变量来确定双链体的稳定性，所述多种变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸中的胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的百分比浓度、离子强度和错配碱基对的发生率。
可添加到微滴中的PCR引物的数量范围可为约1个至约500个或更多个，例如约2个至100个引物，约2个至10个引物，约10个至20个引物，约20个至30个引物，约30个至40个引物，约40个至50个引物，约50个至60个引物，约60个至70个引物，约70个至80个引物，约80个至90个引物，约90个至100个引物，约100个至150个引物，约150个至200个引物，约200个至250个引物，约250个至300个引物，约300个至350个引物，约350个至400个引物，约400个至450个引物，约450个至500个引物，或约500个引物或更多个引物。
此类引物可含所关注的一个或多个核酸，例如所关注的一个或多个基因的引物。添加的所关注基因的引物数量可为约1至500个，例如约1至10个引物、约10至20个引物、约20至30个引物、约30至40个引物、约40至50个引物、约50至60个引物、约60至70个引物、约70至80个引物、约80至90个引物、约90至100个引物、约100至150个引物、约150至200个引物、约200至250个引物、约250至300个引物、约300至350个引物、约350至400个引物、约400至450个引物、约450至500个引物或约500个引物或更多。
可以在一个步骤或不止一个步骤中将此类引物和/或试剂添加至离散实体，例如微滴中。例如，可在两个或更多个步骤，三个或更多个步骤，四个或更多个步骤，或五个或更多个步骤中添加引物。无论是在一个步骤中还是在不止一个步骤中添加引物，可在添加裂解剂之后，在添加裂解剂之前，或在添加裂解剂的同时添加它们。当在添加裂解剂之前或之后添加时，可在与添加裂解剂分开的步骤中添加PCR引物。在一些实施方案中，可以使离散实体，例如微滴在添加PCR试剂之前经受稀释步骤和/或酶灭活步骤。在PCT公布第WO 2014/028378号中描述了此类方法的示例性实施方案，其公开内容以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。
一旦已将引物添加至离散实体，例如微滴中，就可在允许进行PCR的条件下孵育所述离散实体，例如微滴。可在用于添加引物的同一微流控装置上孵育离散实体，例如微滴，或者可在单独的装置上孵育离散实体，例如微滴。在某些实施方案中，在允许PCR扩增的条件下，在用于包封细胞和/或裂解细胞的同一微流控装置上孵育离散实体，例如微滴。孵育微滴可以采取多种形式。在某些方面中，含PCR混合物的小滴流过通道，该通道在有效进行PCR的条件下孵育液滴。使微滴流过通道可涉及蛇行分布在保持在对PCR有效的温度下的各种温度区上的通道。此类通道可以例如在两个或多个温度区上循环，其中至少一个区保持在约65℃，并且至少一个区保持在约95℃。当小滴移动通过此类区域时，它们的温度根据PCR的需要循环。可确定区域的精确数目和每个区域的各自温度，以实现所需的PCR扩增。
在其它实施方案中，孵育微滴可涉及“Megadroplet阵列”的使用。例如PCT公布第WO 2014/028378号中所述，其公开内容以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。在此类装置中，凹陷进通道(例如，PDMS通道)的数百、数千或数百万个捕集阱的阵列位于热系统的上方。可对通道加压，从而防止气体逸出。微流控通道的高度小于离散实体例如小滴的直径，从而导致离散实体采用扁平的煎饼形状。当离散实体在未占据的凹陷上方流过时，其采用较低的，能量上更有利的曲率半径，从而导致将离散实体完全拉入捕集阱的力。通过使多离散实体作为密集流水来流动，可以确保阵列上的所有捕集阱都被占据。整个装置可使用加热器来进行热循环。
在某些方面，加热器包括珀尔帖板，散热器和控制计算机。珀尔帖板允许通过控制施加的电流来加热或冷却芯片，使之高于或低于室温。为了确保受控和可重现的温度，计算机可使用集成的温度探针监测阵列的温度，并可根据需要调整施加的电流以加热和冷却。金属(例如铜)板允许在冷却循环期间均匀地施加热量和耗散多余的热量，使得能够在约1分钟内从约95℃冷却至约60℃。
本公开的方法还可包括将一个或多个探针引入微滴。如本文中关于核酸所用的，术语“探针”是指由于探针中的至少一个序列与靶区域中的序列的互补性而与靶核酸中的序列形成双链体结构的标记的寡核苷酸。所关注的探针包括但不限于
Figure BDA0003744850070000811
探针(例如，如Holland，P.M.；Abramson，R.D.；Watson，R.；Gelfand，D.H.(1991).“Detection ofspecific polymerase chain reaction product by utilizing the 5′----3′exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase”.PNAS，88(16)：7276-7280中所述)。
在主题方法的一些实施方案中，可使用基于RT-PCR的测定来检测存在于细胞中的某些目标转录物(例如，癌基因)的存在。在此类实施方案中，除了用于进行本文所述的PCR的试剂(统称为“RT-PCR试剂”)以外，还将逆转录酶和cDNA合成所需的任何其它试剂添加至离散实体，例如微滴中。使用本文所述的任何合适的方法将RT-PCR试剂添加至离散实体，例如微滴中。一旦将用于RT-PCR的试剂添加至离散实体，例如微滴中，就可在允许逆转录的条件下，随后在允许进行本文所述的PCR的条件下，孵育微滴。可在与用于添加RT-PCR试剂的同一微流控装置上孵育微滴，或可在单独的装置上孵育。在某些实施方案中，在允许RT-PCR的条件下，在用于包封细胞和裂解细胞的同一微流控装置上孵育微滴。
在某些实施方案中，添加到微滴中用于RT-PCR或PCR的试剂还包括能够检测实时RT-PCR或PCR产物的荧光DNA探针。可以使用任何合适的荧光DNA探针，包括但不限于SYBRGreen、
Figure BDA0003744850070000821
Molecular Beacons和Scorpion探针。在某些实施方案中，添加到微滴中的试剂包括一个以上的DNA探针，例如两个荧光DNA探针、三个荧光DNA探针或四个荧光DNA探针。使用多个荧光DNA探针允许在单个反应中同时测量RT-PCR或PCR产物。
此外，可以根据主题实施方案采用的所关注的基于PCR的测定的实例包括但不限于定量PCR(qPCR)、定量荧光PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、实时PCR(RT-PCR)、单细胞PCR、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、热启动PCR、巢式PCR、原原位聚合酶克隆PCR(in situpolony PCR)、原位滚环扩增(RCA)、桥式PCR、皮滴定PCR(picotiter PCR)和乳液PCR。其它合适的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录扩增、自我持续序列复制、靶多核苷酸序列的选择性扩增、共有序列引发的聚合酶链式反应(CP-PCR)、随机引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。
多重复用：在主题方法的各个方面中，可检测和分析特定离散实体或其一个或多个组分，例如包封在其中的细胞的多个生物标志物。检测到的生物标志物可包括但不限于细胞基因组中的一种或多种蛋白质、转录物和/或遗传标记或其组合。通过基于标准荧光的检测，可同时探测的生物标志物的数量可被限定于可在每一个离散实体，例如微滴内单独显现的荧光染料的数量。因此，使用如本文所述的核酸条形码大大提高了可以使用公开方法实现的多重复用水平。
在某些实施方案中，使用不基于条形码的方法或不基于条形码的方法结合本文描述的一种或多种基于条形码的方法，可以增加在特定离散实体，例如微滴内可以单独检测的生物标志物的数量。例如，这可以通过将染料分离到离散实体，例如微滴的不同部分来实现。在特定实施方案中，可以将与染料和探针(例如，核酸或抗体探针)偶联的珠粒(例如
Figure BDA0003744850070000831
珠粒)包封在离散实体，例如微滴中以增加分析的生物标志物的数量。在另一实施方案中，可以使用荧光偏振为单个细胞的不同生物标志物实现更大数量的可检测信号。例如，可以使荧光染料连接至各种探针并且可以在不同偏振条件下使离散实体，例如微滴可视化。这样，相同颜色的染料可用于提供单个细胞不同探针靶标的信号。使用固定和/或渗透化细胞也可以允许增加多重化水平。例如，经标记的抗体可用于靶向定位于细胞组分的蛋白质靶标，而经标记的PCR和/或RT-PCR产物在离散实体，例如微滴中是游离的。这允许相同颜色的染料用于抗体和通过RT-PCR产生的扩增子。
检测PCR产物：可以根据主题方法检测PCR产物的方式可以变化。如本文所讨论的，核酸条形码序列和UMI可用于通过测序鉴定PCR产物并根据需要校正扩增偏差。除了通过对含条形码的核酸测序来检测以外，各种不基于条形码的检测方法可以连同公开方法使用，包括例如，使用一种或多种荧光染料。此类荧光染料可分成几个家族，诸如荧光素及其衍生物；罗丹明及其衍生物；青色素及其衍生物；香豆素及其衍生物；Cascade蓝及其衍生物；Lucifer黄及其衍生物；BODIPY及其衍生物等。示例性荧光团包括吲哚羰花青(C3)、吲哚二羰花青(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红、太平洋蓝、俄勒冈绿488、Alexafluor-355、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor-555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor680、JOE、丽丝胺、罗丹明绿、BODIPY、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明(dRhodamine)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、羧基-X-罗丹明(ROX)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen等。荧光团及其用途的描述可见于其它地方，R.Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products，第9版(2002)，Molecular Probes，Eugene，Oreg.；M.Schena，Microarray Analysis(2003)，John Wiley&Sons，Hoboken，N.J.；Synthetic MedicinalChemistry 2003/2004 Catalog，Berry和Associates，Ann Arbor，Mich.；G.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996)；以及Glen Research2002 Catalog，Sterling，VA。
因此，在实践主题方法时，可基于例如荧光的变化来检测组分。在某些方面，荧光的变化是由荧光共振能量转移(FRET)导致的。在该方法中，可使用特殊的引物组，其中5′引物具有猝灭剂染料，并且3′引物具有荧光染料。这些染料可以布置在引物上的任何地方，无论是在末端还是在中间。因为引物是互补的，因此它们将作为双链体存在于溶液中，使得荧光染料的发射将被猝灭剂染料猝灭，因为它们将彼此靠近，从而导致溶液看起来变暗。PCR后，这些引物将被并入长PCR产物中，因此将彼此远远分开。这将使荧光染料发光，导致溶液变得发荧光。因此，为了检测是否存在特定的靶基因，可在荧光染料波长处测量离散实体，例如小滴的强度。为了检测是否存在不同的靶基因，例如癌基因，这可用不同的着色染料(针对不同的引物)来进行。这将导致离散实体，例如小滴在对应于存在于细胞中的靶基因的引物的所有波长处变得发荧光。
装置和系统
如上所示，公开的主题的实施方案采用包括微流控装置的系统和/或装置。本公开的装置包括上述与主题方法相关的所有装置。本公开的微流控装置可按各种方式表征。
在一些方面中，例如，提供了微流控系统和/或装置，其包括如本文所述，一个或多个配置为产生离散实体例如液滴的离散实体制造器，例如液滴制造器，和/或一个或多个流动通道。在一些方面中，所述一个或多个流动通道与所述一个或多个液滴制造器可操作地连接，例如流体连接，和/或配置为接收来自其中的一个或多个液滴。用“可操作地连接”和“可操作地耦合”，如本文中所用，意指以允许公开的系统或装置及其各个组件以本文所述的方式有效工作的特定方式(例如，以允许流体例如水移动和/或电力传输的方式)连接。
正如上面所提到的，微流控装置可包括一个或多个流动通道，例如离散实体可以进、出和/或穿过的流动通道。在某些实施方案中，流动通道是一个或多个“微”通道。此类通道可具有至少一个毫米级或更小(例如，小于或等于约1毫米)的横截面尺度。对于某些应用，可调整该尺度；在一些实施方案中，该至少一个横截面尺度为约500微米或更小。在一些实施方案中，该横截面尺度为约100微米或更小、或约10微米或更小，并且有时约1微米或更小。横截面尺度是通常垂直于中心线流动方向的横截面尺度，然而应当理解，当遇到流经弯管或易于改变流动方向的其它特征时，起作用的横截面尺度不必严格垂直于流动。还应当理解，在一些实施方案中，微通道可以具有两个或更多个横截面尺度，诸如矩形横截面的高度和宽度或椭圆形横截面的主轴和短轴。可将这些尺度中的任一个与此处给出的尺寸进行比较。注意，本公开中采用的微通道可具有非常不成比例的两个尺度，例如具有约100-200微米的高度和1厘米或更多厘米量级的宽度的矩形横截面。当然，某些装置可采用这样的通道，其中两个或更多个轴在尺寸上非常相似或甚至相同(例如，具有正方形或圆形横截面的通道)。
在本公开的一些实施方案中，使用微细制造技术制造本发明的微流控装置。此类技术可用于制造集成电路(IC)、微机电装置(MEMS)、显示装置等。在微流控装置制造中可用于生产小尺度图案的微细制造方法的类型有光刻(包括X射线光刻、电子束光刻等)、自对准沉积和蚀刻技术、各向异性沉积和蚀刻工艺、自组装掩模形成(例如，形成疏水-亲水共聚物层)等
鉴于上述内容，应当理解，本文所述的一些原理和设计特征可被缩放至更大的装置和系统，包括使用达到毫米或甚至厘米级的通道横截面的通道的装置和系统。因此，当将一些装置和系统描述为“微流控”时，意图是在某些实施方案中，描述等同地应用于一些更大尺度的装置。
当提及微流控“装置”时，通常旨在表示单个实体，其中一个或多个通道、储存器、站等共享连续的衬底，其可以是或不是单块的。微流控装置的方方面面包括存在一个或多个流体流动路径，例如具有如本文所讨论的尺寸的通道。微流控“系统”可包括一个或多个微流控装置和相关联的流体连接、电连接、控制/逻辑特征等。
系统还可包括以下的一种或多种：(a)温度控制模块，其用于控制主题装置的一个或多个部分和/或其中的离散实体的温度并且与微流控装置可操作地连接，(b)与微流控装置可操作地连接的检测工具，即检测器，例如光学成像仪，(c)与微流控装置可操作地连接的孵育器，例如细胞孵育器，和(d)与微流控装置可操作地连接的测序仪。主题系统还可包括一个或多个输送机，其配置为将衬底从第一离散实体例如小滴接收位置移动，例如输送到(a)-(d)中的一个或多个。
主题装置和系统包括用于将离散实体例如小滴分选到一个或多个流动通道中的一个或多个分选机。此类分选机可基于离散实体的一种或多种特征，包括组成、大小、形状、浮力或其它特征，分选和分配离散实体例如小滴。
所述装置的方方面面还包括一个或多个检测工具，即检测器，例如光学成像仪，其配置用于检测一个或多个离散实体例如小滴的存在或其一种或多种特征，包括其组成。在一些实施方案中，检测工具配置为识别一个或多个流动通道内的一个或多个离散实体，例如离散实体的一个或多个组分。
在各个实施方案中，本公开的微流控装置提供流体介质的连续流动。流经微流控装置中的通道的流体表现出许多独特性质。通常，无量纲的雷诺数极低，导致总是保持层状的流动。另外，在该方案中，两种流体接合将不容易混合，而单独扩散可驱使两种化合物的混合。
另外，在一些实施方案中，主题装置包括一个或多个温度和/或压力控制模块。此类模块可能能够调节装置的一个或多个流动通道内的载液的温度和/或压力。更具体地，温度控制模块可以是一个或多个热循环仪。
现将描述适于连同公开的方法、装置和系统使用的微流控装置组件的各种特征和实例。
衬底：根据本公开，微流控装置和/或系统中使用的衬底是在其中提供用于流体输送的必需元件的载体。衬底的基本结构可以是单块的、层压的或以其它方式切片的。衬底可包括用作分子文库和/或试剂的导管的一个或多个流动通道，诸如微通道。衬底还可包括输入口、输出口和/或特征以辅助流控制。
在某些实施方案中，衬底选择可取决于装置的应用和设计。衬底材料可被选择来与各种操作条件相容。给定材料的微细制造过程中的限制在选择合适的衬底中也是相关考虑因素。随本公开采用的有用的初底材料包括例如玻璃、聚合物、硅、金属、陶瓷和/或其组合。
在一些实施方案中，主题装置包括一种或多种聚合物。聚合物是用于微流控装置的有用材料，因为它们适于成本效益和大批量生产。聚合物，包括根据本公开使用的聚合物，可根据其模塑行为分为三类：热塑性聚合物、弹性体聚合物和硬塑性聚合物。热塑性聚合物可在高于玻璃化转变温度下被模制成形状，并且将在冷却至低于玻璃化转变温度后保持这些形状。弹性体聚合物可在施加外力时被拉伸，但一旦外力撤除就会恢复至初始状态。弹性体在达到它们的分解温度后才会熔化。必须将硬塑性聚合物浇铸成最终形状，因为它们在温度达到其分解温度之前稍微软化。
本公开的微细制造装置中可使用的聚合物有聚酰胺(PA)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚苯醚(PPE)、聚苯乙烯(PS)和聚砜(PSU)。聚合物的化学和物理性质可限制其在微流控装置中的用途。具体来说，与玻璃相比，对化学品的耐受性较差、老化、机械稳定性和紫外光稳定性可限制聚合物在某些应用中的使用。
也可以用作衬底材料的玻璃在某些操作条件下具有特定的有利方面。由于玻璃对大多数液体和气体具有化学惰性，因此特别适合用于采用某些具有溶解塑料的倾向的溶剂的应用。另外，其透明性质使玻璃对于光学或紫外线检测特别有用。
表面处理和涂层：表面改性可用于控制微流控装置的功能力学(例如，流控制)并且可根据本公开应用。例如，保持流体物质不被吸附至通道壁或用于将抗体附着至表面以检测生物组分是有用的。
聚合物装置特别倾向于是疏水性的，因此通道的加载可能是困难的。聚合物表面的疏水性也可使得难以控制电渗流(EOF)。根据本公开涂覆聚合物表面的一种技术是将聚电解质多层(PEM)施加于通道表面。PEM涉及用交替的正和负聚电解质溶液连续填充通道，从而允许多层形成静电键。虽然层通常不粘合至通道表面，但即使在长期贮存后它们也可完全覆盖通道。根据本公开在聚合物表面上施加亲水层的另一种技术涉及将聚合物紫外光接枝至通道的表面。通过将表面暴露于紫外线照射同时将该装置同时暴露于单体溶液而在表面上产生第一接枝部位，自由基。单体反应以形成在反应部位共价键合的聚合物。
在一些实施方案中，根据本公开的玻璃通道，通常具有高水平的表面电荷，从而导致蛋白质吸附并可能阻碍分离过程。在一些情况下，本公开包括将聚二甲基硅氧烷(PDMS)和/或表面活性剂涂层施加至玻璃通道。可用于阻止表面吸附的其它聚合物包括聚丙烯酰胺、二醇基团、聚硅氧烷、环氧丙氧基丙基甘油酯(glyceroglycidoxypropyl)、聚(乙二醇)和羟基乙基化的聚(乙烯亚胺)。此外，主题电渗装置可包括携带强度可通过操纵装置内部的条件(例如pH)来调节的电荷的涂层。流动的方向也可基于涂层来选择，因为涂层可以带正电或带负电。
根据本公开还可施加专用涂层来将某些物质固定在通道表面上-该方法被称为“使表面官能化”。例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)表面可用胺涂覆来促进各种官能团或靶标的连接。或者，可通过氧等离子体处理工艺使PMMA表面变得亲水。
微流控元件：根据本公开的微流控系统和装置可含一个或多个流动通道(如微通道)、阀、泵、反应器、混合器和其它/或组件。这些部件中的一些及其一般结构和尺度将在下面讨论。
各种类型的阀可适用于本公开的微流控装置中的流控制。这些阀包括但不限于被动阀和止回阀(膜、阀瓣、双瓣阀、泄漏阀等)。通过这些阀的流速取决于阀的各种物理特征，诸如表面积、流动通道的尺寸、阀材料等。阀还具有在微流控装置设计期间可能考虑的相关操作和制造有利方面/不利方面。
主题装置的实施方案包括一个或多个微泵。微泵与其它微流控组件一样受到制造限制。泵设计中的典型考虑因素包括气泡的处理、堵塞和耐久性。主题装置中可包括的微泵包括但不限于电动等效泵、固定行程微位移、蠕动微膜和/或具有集成止回阀的泵。
大型装置(Macrodevice)依赖于扰动力诸如振动和搅拌来混合试剂。相比之下，此类扰动力在微型装置(microdevice)如本公开的微型装置中实际上是不可实现的，而相反在微流控装置中的混合通常通过扩散来实现。由于通过扩散进行混合可以是缓慢且低效的，所以通常设计微结构，诸如随公开的主题采用的那些微结构来增强混合过程。这些结构以增加流体区域之间的界面表面积的方式操纵流体，从而加速扩散。在某些实施方案中，使用微流控混合器。此类混合器可以在本公开的微流控分离装置和/或分选机的上游提供，并且在一些情况下与之集成。
在一些实施方案中，本公开的装置和系统包括微混合器。微混合器可分为两大类：有源混合器和无源混合器。有源混合器通过对流动区域施加有源控制(例如变化的压力梯度、电荷等)来工作。无源混合器不需要输入的能量，并且仅使用“流体动力学”(例如压力)来以恒定速率驱动流体流动。无源混合器的一个实例涉及在由板隔开的彼此的顶部之上叠加两个流动流。一旦移除分离板，流动流就彼此接触。两种液体的叠加增加了接触面积并且减小了扩散长度，从而增强了扩散过程。如果需要进行热管理，则可将混合和反应装置连接至传热系统。与大型热交换器一样，微热交换可具有并流、逆流或错流流动方案。微流控装置可具有介于约10μm和约10cm之间的通道宽度和深度。一种通道结构包括长的主分离通道和终止于缓冲液、样品或废物储存器中的三个较短的“分支”侧通道。分离通道的长度可以为几厘米，并且3个侧通道的长度通常只有几毫米。当然，微流控装置的实际长度、横截面积、形状和分支设计取决于应用以及其它设计考虑因素，诸如通量(取决于流动阻力)、速度分布(velocity profile)、停留时间等。
本文描述的微流控装置可包括一个或多个电场发生器，以进行本文描述的方法的某些步骤，包括但不限于皮量注入、液滴聚结、选择性液滴融合和液滴分选。在某些实施方案中，使用金属电极产生电场。在具体实施方案中，使用液体电极生成电场。在某些实施方案中，液体电极包括填充有导电液体(例如盐水或缓冲液)并且位于微流控装置中需要电场的位置的液体电极通道。在特定实施方案中，使用电源或高压放大器对液体电极进行通电。在一些实施方案中，液体电极通道包括入口，使得可将导电液体添加至液体电极通道。可以例如通过将填充有液体的管连接至入口并施加压力来将此类导电液体添加至液体电极通道中。在特定实施方案中，液体电极通道还包括用于从通道释放导电液体的出口。在具体实施方案中，液体电极用于本文所述的微流控装置的皮量注入、液滴聚结、选择性液滴融合和/或液滴分选方面。液体电极可用于例如不对通过施加电场注入的材料进行充电的情况。
在某些实施方案中，微流控装置的一个或多个微通道(例如，输入微通道、配对微通道、皮量注入微通道和/或这些通道中的一个或多个的上游或下游的流动通道)的宽度为100微米或更小，例如90微米或更小、80微米或更小、70微米或更小、60微米或更小、50微米或更小，例如45微米或更小、40微米或更小、39微米或更小、38微米或更小、37微米或更小、36微米或更小、35微米或更小、34微米或更小、33微米或更小、32微米或更小、31微米或更小、30微米或更小、29微米或更小、28微米或更小、27微米或更小、26微米或更小、25微米或更小、20微米或更小、15微米或更小或10微米或更小。在一些实施方案中，上述一个或多个微通道的宽度为约10微米至约15微米、约15微米至约20微米、约20微米至约25微米、约25微米至约30微米、约30微米至约35微米、约35微米至约40微米、约40微米至约45微米或约45微米至约50微米、约50微米至约60微米、约60微米至约70微米、约70微米至约80微米、约80微米至约90微米或约90微米至约100微米。
可连同公开的方法和装置使用的各种微通道结构和特征的附加描述在PCT公布第WO 2014/028378号中提供，其公开内容以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。
连环化合并架构：在一些实施方案中，液滴合并可用于涉及分子靶标，例如核酸的条形码化的公开方法中。例如，在使单细胞的转录组条形码化时，含细胞裂解物的液滴可与含试剂和条形码的液滴合并。通常，液滴合并通过使要合并的液滴流入通道内使其配对，然后施加电场将配对合并成组合液滴来实现。然而，配对合并的可能性往往小于一，以致对于单次合并尝试而言，一些液滴不会合并。
为解决这种挑战，可以利用通过使液滴流入具有收缩部和扩展部的通道内来合并液滴的装置。收缩部设计为比液滴小，这样致使其在从通道的宽部流到收缩部时，改变形状并且被压缩，这样似乎会增加合并的可能性。另外，可以串联使用这些扩展压缩几何结构中的几个，从而为液滴提供多次合并机会。可以使用不同类型的电极，如金属电极、焊接电极和/或包括填充有导电液体的通道的液体电极来施加电场。图9中提供了包括连环化合并架构(包括串联连接的10个液滴合并结构)的示例性微流控装置。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种微流控装置，其包括：包括微滴合并部分的流动通道，微滴合并部分包括多个串联的通道几何结构特征件，其中每个通道几何结构特征件与配置为在通道中靠近通道几何结构特征件施加电场的一个或多个电极或一个或多个电极的一个或多个部分联合。在一些实施方案中，所述多个通道几何结构特征件中的每一个均包括通道收缩部、扩展部、弯曲部或其组合。在一些实施方案中，所述多个通道几何结构特征件中的每一个均包括通道收缩部，并且其中每个通道收缩部之前或之后是通道扩展部。如本文所述的通道收缩部可以是通道宽度或高度相对于所述液滴合并部分上游或下游的通道宽度或高度减小。通道扩展部是通道宽度或高度相对于如上所述的收缩部增大。
如上所述的液滴合并部分可以包括任意合适数量的串联通道几何结构特征件，例如收缩部和/或扩展部。例如，在一些实施方案中，合并部分包括2至100个，例如2至5个、2至10个、2至20个、2至30个、2至40个、2至50个、2至60个、2至70个、2至80个或2至90个串联通道几何结构特征件，例如收缩部和/或扩展部。在一些实施方案中，合并部分包括2至5个、5至10个、10至20个、20至30个、30至40个、40至50个、50至60个、60至70个、70至80个、80至90个或90至100个串联通道几何结构特征件，例如收缩部和/或扩展部。
在一些实施方案中，每个通道几何结构特征件位于第一电极或其部分和第二电极或其部分附近，其中所述第一电极或其部分和所述第二电极或其部分呈面向关系位于所述流动通道的任一侧。
扇叶式混合器：常常需要混合一个或多个液滴的内容物。例如，在合并多组液滴之后，常常需要混合合并液滴的内容物。例如，在合并裂解物液滴与试剂时，可能需要在液滴分裂之前混合流体，否则产生的子液滴将具有不同浓度的流体。混合可以通过使液滴快速流下Z字形通道来实现。然而，对于某些流体和粘度而言，这种方法可能无效，因为壁对液滴的摩擦不会导致液滴的更多流动，使得流体不会混合。
增强液滴内的混合的另一种方法是使液滴流过具有分支的通道，本文称为“扇叶式混合器”。在这种装置中，通道装备有比通道高度更短的分支。常常，将分支设计为比液滴长，但对于液滴而言太短而不能流入。当液滴通过叶片时，未受阻碍的载体媒介物，例如油，流入扇叶内，在含有液滴的通道内在载液中产生错流。这种错流可在液滴内产生类似的流，导致混合。当液滴通过叶片末端时，流入叶片的载体媒介物流回通道内，在相反方向上产生同样增强混合物的另一错流。防止液滴流入叶片内，这样做是因为它们将需要变形并且呈现能量上不利的形状。对于某些流动方案和流体性质而言，例如在小于1(例如小于0.1)的毛细管数下，这致使液滴主要留在主通道内，使得油主要流入叶片内。为进一步增强混合，可顺着通道的长度添加许多扇叶，从而为混合液滴的内容物的作用提供了许多机会。并非旨在受任何特定理论的约束，据信当小滴通过扇叶时，经历了因载体媒介物例如油流入扇叶而产生的剪切力。当毛细管数较低时，液滴的界面张力能够抵抗这种剪切力并防止小滴大量移入扇叶内。然而，当毛细管数较大时，粘滞效应可以克服界面张力并且因载体媒介物流入而产生的剪切力可足以将更大一部分的液滴拉入扇叶内。
为了适当的操作，毛细管数应既不太高也不太低。如果太高，则液滴可流入扇叶内并且可能破成碎片。如果太低，则液滴的内部内容物不能充分混合。在一些实施方案中，优选约0.01的毛细管数。
因此，在一些实施方案中本公开提供了一种微流控装置，其中所述微流控装置包括：(a)包括微滴混合部分的流动通道，微滴混合部分包括一个或多个与所述流动通道流体连通的分支通道，其中所述一个或多个分支通道相对于所述流动通道的中心线成10°至170°之间的角，其中所述一个或多个分支通道的高度小于所述流动通道的高度且小于要流过所述流动通道的液滴的直径(例如，如本文所述的离散实体或微滴的直径)，并且其中所述一个或多个分支通道被配置成使得微滴在载液中流过所述流动通道时，暴露于当所述载液流入和流出所述一个或多个分支通道时产生的错流，并且其中所述错流足以在所述微滴中产生混合所述微滴内容物的流动。
在一些实施方案中，所述一个或多个分支通道相对于所述流动通道的中心线成介于45°至135°之间的角，例如介于约50°至约130°之间，介于约55°至约125°之间，介于约60°至约120°之间，介于约65°至约115°之间，介于约70°至约110°之间，介于约75°至约100°之间，介于约80°至约95°之间，例如约90°。
在一些实施方案中，所述微滴混合部分包括沿着流动通道的长度定位的多个分支通道，使得微滴在载液中流过所述流动通道时，暴露于多个错流。
在一些实施方案中，所述一个或多个分支通道的宽度大于要流过所述流动通道的微滴的直径(例如，如本文所述的离散实体或微滴的直径)。图15中示出了扇叶式混合器的示例性实施方案。如图15所示，微流控装置通道可配置为包括从主流动通道延伸的多个“扇叶”。另外，如图15所示，此类“扇叶”可以呈间隔关系交替，其中第一“扇叶”在通道的一侧而第二“扇叶”在通道的对侧。此类“扇叶”可沿流动通道的长度，例如沿S形混合通道的长度交替。
制造方法：根据公开的实施方案，微细制造过程根据在衬底中使用的材料类型和/或所需的生产体积而不同。对于小批量生产或原型，制造技术包括LIGA、粉末爆破、激光烧蚀、机械加工、放电加工、光成形等。用于微流控装置的大量生产的技术可使用光刻或基于母版的复制工艺。用于从硅/玻璃制造衬底的光刻工艺包括通常用于制造半导体装置的湿式和干式蚀刻技术。注塑和热压印通常用于大量生产塑料衬底。
玻璃、硅和其它“硬”材料(光刻、蚀刻、沉积)：根据公开主题的实施方案，光刻、蚀刻和/或沉积技术的组合可用于将微槽和微腔从玻璃、硅和其它“硬”材料制成。基于上述技术的技术可用于制造尺度为0.1-500微米的装置。
基于半导体制造工艺的微细制造技术通常在洁净室中进行。洁净室的质量按照以立方英寸计尺寸＜4μm的颗粒的数目来分类。用于MEMS微细制造的典型洁净室级别可为1000至10000。
在某些实施方案中，光刻可用于微细制造。在光刻中，通过光学掩模将已沉积在衬底上的光致抗蚀剂暴露于光源。常规光致抗蚀剂方法允许高达10-40μm的结构高度。如果需要更高的结构，可使用产生高达1mm的高度的较厚的光致抗蚀剂诸如SU-8或聚酰亚胺。
在将掩模上的图案转印至光致抗蚀剂覆盖的衬底上后，然后使用湿法或干法对衬底进行蚀刻。在湿蚀刻中，使未被掩模保护的衬底区域在液相中经历化学侵蚀。蚀刻工艺中使用的液体试剂取决于蚀刻是各向同性还是各向异性。各向同性蚀刻通常使用酸来形成三维结构，诸如玻璃或硅中的球形腔。各向异性蚀刻使用高碱性溶剂来形成平坦表面诸如孔和通道。硅上的湿各向异性蚀刻产生倾斜的通道轮廓。
干蚀刻涉及由气相或等离子体相中的离子攻击衬底。干蚀刻技术可用于产生矩形通道横截面和任意通道路径。可使用各种类型的干蚀刻，包括物理、化学、物理化学(例如，RIE)以及利用抑制剂的物理化学干蚀刻。物理蚀刻使用通过电场加速的离子来轰击衬底表面以“蚀刻”结构。化学蚀刻可采用电场将化学品物质迁移到基底表面。然后化学品物质与基底表面反应以产生空隙和挥发性物质。
在某些实施方案中，沉积用于微细制造。沉积技术可用于产生金属层、绝缘体层、半导体层、聚合物层、蛋白质层和其它有机物质层。大多数沉积技术属于两个主要类别之一：物理气相沉积(PVD)和化学气相沉积(CVD)。在属于PVD的一种方法中，使衬底靶与容纳气体(其例如可通过蒸发产生)接触。气体中的某些物质吸附至靶标表面，形成构成沉积物的层。在微电子制造工业中通常使用的另一种方法中，使用氩离子束或其它适当的能量源来溅射含有待沉积的材料的靶标。然后溅射的材料沉积在微流控装置的表面上。在CVD中，与靶标接触的物质与表面反应，形成化学键合于物体上的组分。其它沉积技术包括：旋涂、等离子喷涂、等离子体聚合、浸涂、铸造和Langmuir-Blodgett膜沉积。在等离子喷涂中，将含有直径高达100μm的颗粒的细粉末悬浮在载气中。将含有颗粒的混合物通过等离子体射流加速并加热。熔化的颗粒溅至衬底上并冷冻以形成致密的涂层。等离子体聚合从含有有机蒸汽的等离子体产生聚合物薄膜(例如PMMA)。
一旦已将微通道、微腔和其它特征蚀刻至玻璃或硅衬底中，通常就密封蚀刻的特征，以确保微流控装置是“防水的”。当密封时，可在所有表面上施加粘附以使彼此接触。密封工艺可涉及融合技术，诸如开发用于玻璃与硅、玻璃与玻璃或硅与硅之间的键合的那些融合技术。
阳极键合可用于将玻璃键合至硅上。在玻璃与硅之间施加电压，并且升高系统的温度以引起表面的密封。电场和升高的温度诱导玻璃中的钠离子迁移至玻璃-硅界面。玻璃-硅界面中的钠离子与硅表面高度反应，在表面之间形成牢固的化学键。理想地，使用的玻璃的类型可具有接近硅的热膨胀系数的热膨胀系数(例如，Pyrex Corning 7740)。
融合键合可用于玻璃与玻璃之间或硅与硅之间的密封。首先通过施加高接触力来强制并对准衬底。一旦接触，原子吸引力(主要是范德华力)将衬底保持在一起，以使它们可被放置在炉中并在高温下退火。取决于材料，使用的温度范围介于约600℃与1100℃之间。
聚合物/塑料：根据主题实施方案，可采用各种技术来微加工塑料衬底。这些技术有激光烧蚀、光固化成型、氧等离子体蚀刻、粒子射流烧蚀(particle jet ablation)和微电蚀(microelectro-erosion)。这些技术中的一些也可用于将其它材料(玻璃、硅、陶瓷等)成型。
为了产生微流控装置的多个拷贝，采用复制技术。此类技术涉及首先制造包含要复制的图案的母版或模具插件。然后，将母版用于通过聚合物复制工艺大量生产聚合物衬底。
在复制过程中，将包含在模具中的母版图案复制至聚合物结构上。在某些实施方案中，将聚合物和固化剂混合物在高温下倒入模具中。冷却混合物后，聚合物含有模具的图案，然后将其从模具中取出。或者，可将塑料注入包含模具插件的结构中。在显微注入中，将加热至液态的塑料注入至模具中。分离并冷却后，塑料保持模具的形状。
在模制工艺中可使用PDMS(聚二甲基硅氧烷)(一种硅基有机聚合物)来形成微流控结构。由于其弹性特征，PDMS适用于介于约5μm和500μm之间的微通道。PDMS的特定特性使其适用于微流控目的。此类特性包括：
1)其是光学透明的，这允许流动的可视化。
2)当与适量的网状剂混合时，PDMS具有有利于保持微流体连接“防水”的弹性体性质。
3)使用膜的阀和泵可由PDMS制成，因为其具有弹性。
4)未处理的PDMS是疏水的，并且在通过氧等离子体氧化表面后或浸入强碱后变得暂时亲水；氧化的PDMS本身粘附至玻璃、硅或聚乙烯上，只要这些表面本身暴露于氧等离子体。
5)PDMS是可透气的。即使在管道中存在气泡(因为气泡被迫从材料中排出)，也容易用液体填充通道。另外，PDMS对非极性有机溶剂也是可渗透的。
显微注入可用于形成在广泛的微流体设计中使用的塑料衬底。在此过程中，首先在高于塑料的玻璃化转变温度的温度下，在真空和压力下，将液体塑料材料注入至模具中。然后将塑料冷却至低于玻璃化转变温度。去除模具后，所得的塑料结构是模具图案的反面图案。
另一种复制技术是热压印，其中将聚合物衬底和母版加热至高于聚合物的玻璃化转变温度Tg(对于PMMA或PC，其约为100-180℃)。然后以预设的挤压力将压印母版压在衬底上。然后将该体系冷却至低于Tg，然后分离模具和衬底。
通常，聚合物在与模具工具分离时经历最高的物理力，特别是当微结构包含高深宽比和垂直壁时。为了避免损坏聚合物微结构，可考虑衬底和模具工具的材料性质。这些性质包括：侧壁粗糙度、侧壁角度、压印母版与衬底之间的化学界面以及温度系数。压印工具的高侧壁粗糙度可损坏聚合物微结构，因为在分离过程中粗糙度促成工具与结构之间的摩擦力。如果摩擦力大于聚合物的局部拉伸强度，则微结构可被破坏。对于垂直壁，工具与衬底之间的摩擦在微结构上可以是重要的。母版与衬底之间的化学界面也受到观注。因为压印过程使系统温度升高，所以在母版与衬底的界面中可形成化学键。这些界面键可干扰分离过程。工具和衬底的热膨胀系数的差异可产生额外的摩擦力。
可使用各种技术来形成模具、压印母版和含有用于通过上述复制工艺复制塑料结构的图案的其它母版。此类技术的实例包括LIGA(下面所述的)、烧蚀技术和各种其它机械加工技术。类似的技术也可用于小批量生产掩模、原型和微流控结构。用于模具工具的材料包括金属、金属合金、硅和其它硬质材料。
可将激光烧蚀用于直接在衬底上或通过使用掩模形成微结构。该技术使用精确定向的激光器，通常具有介于红外线与紫外线之间的波长。激光烧蚀可在玻璃和金属衬体上以及聚合物衬底上进行。可通过相对于固定激光束移动衬底表面或相对于固定衬底移动光束来进行激光烧蚀。可利用激光烧蚀来制造各种微孔、槽和高深宽比结构。
某些材料诸如不锈钢制成非常耐用的模具插件，并且可被微加工以形成下至10μm范围的结构。存在用于微细制造的各种其它微加工技术，包括μ-放电加工(μ-EDM)、μ-铣削、聚焦离子束铣削。μ-EDM允许在导电材料中制造三维结构。在μ-EDM中，通过在电极(阴极工具)与工件(阳极)之间生成的高频放电来除去材料。将工件和工具均浸没在电介质流体中。该技术产生相对更粗糙的表面，但在材料和几何形状方面提供了灵活性。
可使用电镀来制造例如镍合金的复制模具工具/母版。该工艺始于光刻步骤，其中将光致抗蚀剂用于进行电镀的确定的结构。要电镀的区域没有抗蚀剂。对于具有高深宽比和低粗糙度要求的结构，可将LIGA用于产生电镀形式。LIGA是Lithographic(光刻)、Galvanoformung(电镀)、Abformung(成型)的德语首字母缩略词。在属于LIGA的一个方法中，将厚的PMMA层暴露于来自同步加速器源的x射线。由LIGA产生的表面具有较低的粗糙度(约10nm RMS)，并且所得镍工具对于大多数聚合物具有良好的表面化学性质。
与玻璃和硅装置一样，聚合物微流控装置必须密封起来才能起作用。用于微流控装置的键合方法中的常见问题包括通道的阻塞和通道的物理参数的变化。层合是用于密封塑料微流控装置的一种方法。在一个层合方法中，涂覆有熔化粘合剂层(通常5μm-10μm)的PET箔(约30μm)用加热辊滚动至微结构上。通过该过程，将盖箔密封在通道板上。几个研究组已经报道了通过在界面处聚合产生的键合，其中加热结构并且在相对侧施加力以封闭通道。但过大的施加的力可能损坏微结构。存在用于塑料与塑料之间和塑料与玻璃之间的界面的可逆和不可逆键合技术。一种可逆密封的方法涉及首先用甲醇充分漂洗PDMS衬底和玻璃板(或第二片PDMS)，并使所述表面彼此接触，然后进行干燥。然后将微结构在65℃下于烘箱中干燥10分钟。该过程不需要洁净室。通过首先用甲醇充分漂洗片，然后用氮气流分别干燥它们来完成不可逆密封。然后将两张片置于空气等离子体清洁器中并以高功率氧化约45秒。然后将衬底彼此接触，并且不可逆密封自发形成。
其它可用的技术包括激光和超声波焊接。在激光焊接中，聚合物通过激光产生的热量连接在一起。该方法已被用于制造微型泵。超声波焊接是可用于一些应用的另一种键合技术。
本文描述的一种核酸扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。然而，在某些实施方案中，可以采用非PCR扩增技术，如各种等温核酸扩增技术；例如实时链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和多重置换扩增(MDA)。
关于PCR扩增模块，有必要提供此类模块，至少用于扩增核酸的构建块(例如，充足浓度的四种核苷酸)、引物、聚合酶(例如，Taq)和适当的温度控制程序)。可在通过扩增模块的外部口提供的或来自上游来源的缓冲溶液中提供聚合酶和核苷酸构建块。在某些实施方案中，提供给分选模块的缓冲液流含有用于核酸扩增的所有原料中的一些。特别地对于PCR，反应混合物的精确温度控制对于实现高反应效率是非常重要的。芯片上热控制的一个方法是焦耳加热，其中将电极用于在确定的位置上加热模块内部的流体。流体电导率可用作用于功率控制的温度反馈。
在某些方面中，含PCR混合物的离散实体，例如微滴，可以流过通道，该通道在有效进行PCR的条件下孵育离散实体。使离散实体流过通道可涉及在维持在有效进行PCR的温度下的各个温区蛇行分布的通道。此类通道可以，例如在两个或更多个温区上循环，其中至少一个区域维持在约65℃并且至少一个区域维持在约95℃。当离散实体移动通过此类区域时，其温度根据PCR所需而循环。区域确切的数量及每个区域各自的温度，可以由本领域的技术人员容易地测定以实现所需的PCR扩增。
本公开的示例非限制性方面
上述本发明的主题的方面(包括实施方案)单独地或与一个或多个其它方面或实施方案的组合可能是有益的。在不限制前述描述的情况下，下面提供了编号为1-443的本公开的某些非限制性方面。在阅读本公开后对于本领域技术人员将显而易见的是，每个单独编号的方面可以与前述或后续单独编号的方面中的任一个一起使用或组合。这旨在为所有这些方面的组合提供支持，并且不限于下面明确提供的方面的组合：
1.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
向所述离散实体中引入包含多个拷贝的核酸条形码序列的细胞；
使所述细胞裂解以在所述离散实体中释放所述多个拷贝的核酸条形码序列；并且
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
2.根据1所述的方法，其中所述细胞为细菌细胞。
3.根据1所述的方法，其中所述细胞为真菌细胞。
4.根据1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞包含多个质粒，每个质粒均含所述核酸条形码序列。
5.根据1-4中任一项所述的方法，其中所述经受包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述离散实体中。
6.根据1-5中任一项所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
7.根据1-6中任一项所述的方法，其中包含多个拷贝的所述核酸条形码序列的所述细胞选自包含核酸条形码的细胞文库。
8.根据7所述的方法，其中所述文库中的每个细胞均含多个拷贝的单一核酸条形码序列。
9.根据1-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过以下方式制备含核酸条形码的细胞文库：
生成核酸条形码序列文库；
将来自所述核酸条形码序列文库的单个核酸条形码序列并入到单个细胞中；并且
使所述单个细胞经受足以在所述单个细胞内生成多个拷贝的所述单个核酸条形码序列的条件。
10.根据1-9中任一项所述的方法，其中所述方法包括
使包含所述核酸条形码序列的所述多个核酸靶分子或其扩增产物从所述离散实体释放；
对从所述离散实体释放的所述核酸分子测序；并且
基于所述核酸条形码序列的存在将所述测序的核酸分子鉴定为源于所述离散实体。
11.根据1-10中任一项所述的方法，其中所述离散实体中的所述多个核酸靶分子源于单个细胞。
12.根据1-11中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
13.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在第一离散实体中；
将细胞包封在第二离散实体中，其中所述细胞包含多个拷贝的核酸条形码序列；
合并所述第一和第二离散实体；并且
使所述合并的离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
14.根据13所述的方法，其中所述细胞为细菌细胞。
15.根据13所述的方法，其中所述细胞为真菌细胞。
16.根据13-15中任一项所述的方法，其中所述细胞包含多个质粒，每个质粒均含所述核酸条形码序列。
17.根据13-16中任一项所述的方法，其中所述经受包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述第一离散实体中。
18.根据13-17中任一项所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
19.根据13-18中任一项所述的方法，其中所述第二离散实体为微滴并且将所述细胞包封在所述第二离散实体中的步骤包括
在足以实现多个细胞在微流控装置的通道内的惯性排序的条件下，使所述细胞流过所述通道，所述微流控装置包括与所述通道流体连通的液滴发生器，从而向所述液滴发生器提供所述细胞的周期性注入；并且
使所述注入的周期与所述液滴发生器的液滴发生周期相匹配，从而使用所述液滴发生器将单个细胞包封在单个微滴中。
20.根据13-19中任一项所述的方法，其中包含多个拷贝的所述核酸条形码序列的所述细胞选自包含核酸条形码的细胞文库。
21.根据20所述的方法，其中所述文库中的每个细胞均含多个拷贝的单一核酸条形码序列。
22.根据20-21中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过以下方式制备含核酸条形码的细胞文库：
生成核酸条形码序列文库；
将来自所述核酸条形码序列文库的单个核酸条形码序列并入到单个细胞中；并且
使所述单个细胞经受足以在所述单个细胞内生成多个拷贝的所述单个核酸条形码序列的条件。
23.根据13-22中任一项所述的方法，其中所述方法包括
使包含所述核酸条形码序列的所述多个核酸分子或其扩增产物从所述第一离散实体释放；
对从所述第一离散实体释放的所述核酸分子测序；并且
基于所述核酸条形码序列的存在将所述测序的核酸分子鉴定为源于所述第一离散实体。
24.根据13-23中任一项所述的方法，其中所述第一离散实体中的所述多个核酸靶分子源于单个细胞。
25.根据13-24中任一项所述的方法，其中所述第一和第二离散实体为微滴。
26.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
向所述离散实体中引入包含多个拷贝的核酸条形码序列的多孔珠粒，其中所述多个拷贝的核酸条形码序列至少部分分布在由所述多孔珠粒的一个或多个孔隙限定的表面上；并且
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
27.根据26所述的方法，其中所述经受包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述离散实体中。
28.根据26或27所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
29.根据26-28中任一项所述的方法，其中包含多个拷贝的所述核酸条形码序列的所述多孔珠粒选自包含核酸条形码的多孔珠粒文库。
30.根据29所述的方法，其中所述文库中的每个多孔珠粒均含多个拷贝的单一核酸条形码序列。
31.根据26-30中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
使包含所述核酸条形码序列的所述多个核酸分子或其扩增产物从所述离散实体释放；
对从所述离散实体释放的所述核酸分子测序；并且
基于所述核酸条形码序列的存在将所述测序的核酸分子鉴定为源于所述离散实体。
32.根据26-31中任一项所述的方法，其中所述离散实体中的所述多个核酸靶分子源于单个细胞。
33.根据26-32中任一项所述的方法，其包括将所述多孔珠粒暴露于高于所述珠粒熔点的温度足够的时间，以引起所述多孔珠粒熔化并且所述多个拷贝的核酸条形码序列释放。
34.根据26-33中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
35.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在第一离散实体中；
将珠粒包封在第二离散实体中，其中所述第二离散实体为微滴并且所述珠粒在其表面上包含多个拷贝的核酸条形码序列，并且其中将所述珠粒包封在所述第二离散实体中的步骤包括
在足以实现多个珠粒在微流控装置的通道内的惯性排序的条件下，使所述珠粒流过所述通道，所述微流控装置包括与所述通道流体连通的液滴发生器，从而提供所述珠粒向所述液滴发生器大致周期性的注入；并且
使所述注入的周期与所述液滴发生器的液滴发生周期大致匹配，从而使用所述液滴发生器将单个珠粒包封在单个微滴中；
合并所述第一和第二离散实体；并且
使所述合并的离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
36.根据35所述的方法，其中所述经受包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述第一离散实体中。
37.根据35或36所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
38.根据35-37中任一项所述的方法，其中在其表面上包含多个拷贝的所述核酸条形码序列的所述珠粒选自包含核酸条形码的珠粒文库。
39.根据38所述的方法，其中所述文库中的每个珠粒均含多个拷贝的单一核酸条形码序列。
40.根据35-39中任一项所述的方法，其中所述方法包括
使包含所述核酸条形码序列的所述多个核酸靶分子或其扩增产物从所述第一离散实体释放；
对从所述第一离散实体释放的所述核酸分子测序；并且
基于所述核酸条形码序列的存在将所述测序的核酸分子鉴定为源于所述第一离散实体。
41.根据35-40中任一项所述的方法，其中所述第一离散实体中的所述多个核酸靶分子源于单个细胞。
42.根据35-41中任一项所述的方法，其中所述第一和第二离散实体为微滴。
43.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
在所述包封之前或之后向所述多个核酸靶分子中的每一个并入独特分子标识符(UMI)；
向所述离散实体中引入在其表面上包含多个拷贝的核酸条形码序列的珠粒；并且
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
44.根据43所述的方法，其中所述经受包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述离散实体中。
45.根据43或44所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
46.根据43-45中任一项所述的方法，其中包含多个拷贝的所述核酸条形码序列的所述珠粒选自包含核酸条形码的珠粒文库。
47.根据46所述的方法，其中所述文库中的每个珠粒均含多个拷贝的单一核酸条形码序列。
48.根据43-47中任一项所述的方法，其中所述方法包括
扩增包含所述核酸条形码序列的所述多个核酸分子；
使包含所述核酸条形码序列的所述多个核酸分子或其扩增产物从所述离散实体释放；
对从所述离散实体释放的所述核酸分子测序；
通过聚集重复UMI的测序读段来校正扩增偏差；并且
基于所述核酸条形码序列的存在将所述测序的核酸分子鉴定为源于所述离散实体。
49.根据43-48中任一项所述的方法，其中所述离散实体中的所述多个核酸靶分子源于单个细胞。
50.根据43-49中任一项所述的方法，其中所述珠粒为多孔珠粒并且所述多个拷贝的核酸条形码序列至少部分分布在由所述多孔珠粒的一个或多个孔隙限定的表面上。
51.根据43-50中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
52.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在第一离散实体中；
将珠粒包封在第二离散实体中，其中所述第二离散实体为微滴并且所述珠粒在其表面上包含多个拷贝的核酸条形码序列，并且其中将所述珠粒包封在所述第二离散实体中的步骤包括
使多个珠粒流过微流控装置的通道，所述微流控装置包括与所述通道流体连通的液滴发生器，
将一个或多个珠粒包封在所述液滴发生器产生的一个或多个离散实体中，并且
分选所述液滴发生器产生的所述一个或多个离散实体以去除不包含一个或多个珠粒的离散实体；
合并所述第一和第二离散实体；并且
使所述合并的离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
53.根据52所述的方法，其中所述经受包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述第一离散实体中。
54.根据52或53所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
55.根据52-54中任一项所述的方法，其中在其表面上包含多个拷贝的所述核酸条形码序列的所述珠粒选自包含核酸条形码的珠粒文库。
56.根据55所述的方法，其中所述文库中的每个珠粒均含多个拷贝的单一核酸条形码序列。
57.根据52-56中任一项所述的方法，其中所述方法包括
使包含所述核酸条形码序列的所述多个核酸分子或其扩增产物从所述第一离散实体释放；
对从所述第一离散实体释放的所述核酸分子测序；并且
基于所述核酸条形码序列的存在将所述测序的核酸分子鉴定为源于所述第一离散实体。
58.根据52-57中任一项所述的方法，其中所述第一离散实体中的所述多个核酸靶分子源于单个细胞。
59.根据52-58中任一项所述的方法，其中所述第一和第二离散实体为微滴。
60.一种用于制备单链条形码的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
向所述离散实体中引入包含核酸条形码序列的环状核酸分子；
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列滚环扩增的条件，使得生成所述核酸条形码序列的多联体；并且
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
61.根据60所述的方法，其中使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述离散实体中。
62.根据60或61所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
63.根据60-62中任一项所述的方法，其中包含核酸条形码序列的所述环状核酸分子选自包含核酸条形码序列的环状核酸分子文库。
64.根据60-63中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
65.一种用于制备单链条形码的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
向所述离散实体中引入包含核酸条形码序列的DNA分子；
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列经由转录链式反应(TCR)扩增的条件，使得生成多个单链拷贝的核酸条形码序列；并且
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
66.根据65所述的方法，其中使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述离散实体中。
67.根据65或66所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
68.根据65-67中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
69.一种用于制备单链条形码的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
向所述离散实体中引入包含核酸条形码序列的DNA分子；
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列经由滚环转录链式反应(rcTCR)扩增的条件，使得生成多个单链拷贝的核酸条形码序列；并且
使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
70.根据69所述的方法，其中使所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到所述离散实体中。
71.根据69或70所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
72.根据69-71中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
73.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将单个核酸条形码序列包封在有限稀释的离散实体群中，使得所述离散实体群的每个单个离散实体在统计上含有零或一个核酸条形码序列；
使所述离散实体群中的所述核酸条形码序列酶促扩增以提供多个离散实体，其中所述多个离散实体中的每个离散实体包含多个拷贝的对于该离散实体而言单一的核酸条形码序列；
向所述多个离散实体中的一个或多个引入多个核酸靶分子；并且
使所述多个离散实体中的所述一个或多个经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
74.根据73所述的方法，其包括在所述引入之前分选所述离散实体群以去除不包含核酸条形码序列的离散实体。
75.根据73或74所述的方法，其中所述经受包括将聚合酶延伸试剂和/或聚合酶扩增试剂引入到离散实体中。
76.根据73-75中任一项所述的方法，其包括使靶细胞裂解以提供所述多个核酸靶分子。
77.根据73-76中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
78.一种制备核酸条形码文库的方法，所述方法包括：
在离散实体群中包封
多个第一核酸分子，所述第一核酸分子中的每一个均包含第一核酸条形码子序列和第一连接序列，及
多个第二核酸分子，所述第二核酸分子中的每一个均包含第二核酸条形码子序列和第二连接序列，其中进行所述包封使得所述离散实体群的至少约50％离散实体包含至少一个第一核酸分子和至少一个第二核酸分子；并且
使所述离散实体经受足以进行酶促连接和/或扩增的条件，使得对于包含至少一个第一核酸分子和至少一个第二核酸分子的离散实体而言，生成包含所述第一和第二核酸分子两者的序列的连接和/或扩增产物，从而提供复合核酸条形码分子。
79.根据78所述的方法，其中所述经受包括使所述离散实体经受足以使所述第一和第二连接序列酶促连接的条件。
80.根据78所述的方法，其中所述第一和第二连接序列至少部分互补。
81.根据78所述的方法，其包括：
向包含至少一个复合核酸条形码分子的离散实体引入多个核酸靶分子；并且
使包含多个核酸靶分子和至少一个复合核酸条形码分子的离散实体经受足以使所述复合核酸条形码分子的序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的条件。
82.根据81所述的方法，其包括：
使包含所述复合核酸条形码序列的所述多个核酸分子或其扩增产物从所述离散实体中释放；
对从所述离散实体释放的所述核酸分子测序；并且
基于所述复合核酸条形码序列的序列将所述测序的核酸分子鉴定为源于特定离散实体。
83.根据78-82中任一项所述的方法，其中足以进行酶促连接和/或扩增的所述条件是足以进行连接PCR的条件。
84.根据78-83中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
85.一种用于条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
向所述离散实体中引入多个独特分子标识符(UMI)分子；
使所述离散实体经受足以使独特UMI分子序列酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的每一个中的条件；
向所述离散实体中引入多个不同的核酸条形码序列；并且
使所述离散实体经受足以使所述多个条形码序列之一酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物或其扩增产物的扩增产物的每一个中的条件。
86.根据85所述的方法，其包括：
使包含所述UMI之一和所述条形码之一的序列的所述多个核酸靶分子或其扩增产物或其扩增产物的扩增产物从所述离散实体释放；
对从所述离散实体释放的所述核酸分子测序；并且
基于所述UMI和所述条形码的序列组合将所述测序的核酸分子鉴定为源于特定离散实体。
87.根据85或86所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
88.一种用于条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
使独特分子标识符(UMI)分子连接至多个核酸靶分子中的每一个以提供UMI标记的核酸靶分子；
使所述UMI标记的核酸靶分子酶促扩增以提供包含所述UMI标记的核酸靶分子的序列的扩增产物；
将所述扩增产物包封在多个离散实体中；
使所述多个离散实体中的所述扩增产物片段化；
使核酸条形码序列连接至所述片段化扩增产物，
其中每个离散实体中的所述核酸条形码序列将所述片段化扩增产物与其中包封所述片段化扩增产物的所述离散实体相关联；
使包含与之连接的核酸条形码序列的所述片段化扩增产物从所述离散实体中释放；
为所述片段化扩增产物测序；并且
使用所述UMI序列和所述核酸条形码序列使所述片段化扩增产物生物信息学重新组装以提供所述扩增产物源于其中的所述核酸靶分子的序列。
89.根据88所述的方法，其中将所述扩增产物包封在多个离散实体中包括将有限稀释的所述扩增产物包封在离散实体群中，使得所述离散实体群的每个单个离散实体含有零或一个扩增产物。
90.根据88所述的方法，其中将源于两个或更多个核酸靶分子的扩增产物包封在所述多个离散实体中。
91.根据88-90中任一项所述的方法，其中根据78-80中的一项所描述的方法生成所述核酸条形码序列。
92.根据88-91中任一项所述的方法，其中所述酶促扩增包括经由聚合酶链式反应(PCR)、多重置换扩增(MDA)或多次退火环状循环扩增(MALBAC)进行酶促扩增。
93.根据88-92中任一项所述的方法，其中所述生物信息学重新组装包括按UMI对由所述测序获得的序列读段进行计算分组以鉴定不同离散实体中出现的具有相似序列的分子子集并由此产生可用于产生大于1X覆盖范围的靶分子的扩展序列集合。
94.根据88-93中任一项所述的方法，其中使UMI分子连接至所述多个核酸靶分子中的每一个及所述酶促扩增在反应容器中进行，将所述扩增产物包封在多个离散实体中在第一微流控装置中进行，并且使所述核酸条形码序列连接至所述片段化扩增产物在第二微流控装置中进行。
95.根据88-90中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
96.一种用于条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
向离散实体中引入
核酸靶分子，
核酸条形码序列，
配置为扩增所述核酸靶分子的序列的第一引物组，
配置为扩增所述核酸条形码序列的序列的第二引物组，其中所述第一引物组中的一个包含与所述第二引物组中的一个的序列至少部分互补的序列，及
酶促扩增试剂；
使所述离散实体经受足以使所述核酸靶分子的序列和所述核酸条形码序列的序列酶促扩增的条件，其中产生具有部分序列同源性区域的扩增产物；并且
使所述离散实体经受足以使所述扩增产物的序列的互补区域杂交并且足以使所述杂交序列酶促延伸的条件，从而提供包含所述核酸靶分子的扩增序列和所述核酸条形码序列的扩增序列的产物。
97.根据96所述的方法，其中所述引入包括向所述离散实体中引入多个核酸靶分子。
98.根据97所述的方法，其中所述多个核酸靶分子包括含不同序列的核酸靶分子。
99.根据96所述的方法，其中所述引入包括向所述离散实体中引入多个核酸条形码序列。
100.根据99所述的方法，其中所述多个核酸条形码序列包括含不同序列的核酸条形码序列。
101.根据96-100中任一项所述的方法，其中使所述离散实体经受足以酶促扩增的条件包括使所述离散实体经受热循环。
102.根据96-100中任一项所述的方法，其中使所述离散实体经受足以酶促扩增的条件包括使所述离散实体经受等温扩增条件。
103.根据96-102中任一项所述的方法，其中所述方法包括将接头序列并入到所述核酸靶分子中，并且其中所述第一引物组与所述接头序列至少部分互补。
104.根据96-103中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
105.一种用于条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
向离散实体中引入
多个核酸靶分子，
多个核酸条形码序列，
配置为扩增所述多个核酸靶分子的序列的第一引物组，
配置为扩增所述多个核酸条形码序列的序列的第二引物组，其中所述第一引物组和所述第二引物组包含至少部分互补的序列，及
酶促扩增试剂；
使所述离散实体经受足以使所述多个核酸靶分子的序列和所述多个核酸条形码序列的序列酶促扩增的条件，其中产生具有部分序列同源性区域的扩增产物；并且
使所述离散实体经受足以使所述扩增产物的序列的互补区域杂交并且足以使所述杂交序列酶促延伸的条件，从而提供多种产物，每种产物包含所述多个核酸靶分子之一的扩增序列和所述多个核酸条形码序列之一的扩增序列。
106.根据105所述的方法，其中所述多个核酸靶分子包括含不同序列的核酸靶分子。
107.根据105或106所述的方法，其中所述多个核酸条形码序列包括含不同序列的核酸条形码序列。
108.根据105-107中任一项所述的方法，其中使所述离散实体经受足以酶促扩增的条件包括使所述离散实体经受热循环。
109.根据105-107中任一项所述的方法，其中使所述离散实体经受足以酶促扩增的条件包括使所述离散实体经受等温扩增条件。
110.根据105-109中任一项所述的方法，其中所述方法包括将接头序列并入到所述每个核酸靶分子中，并且其中所述第一引物组的每个引物与所述接头序列之一至少部分互补。
111.根据105-110中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
112.一种条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
生成核酸条形码引物文库，其中所述文库中的每个核酸条形码引物均包含足以退火为核酸靶分子的第一序列和包含核酸条形码序列的第二序列；
将选自所述文库的一个或多个核酸条形码引物和一个或多个核酸靶分子组合在多个离散实体中的每一个中，其中选自所述文库的用于包括在每个离散实体中的所述一个或多个引物包括具有足以在该离散实体中退火为一个或多个所述核酸靶分子的第一序列的一个或多个引物；并且
使用该离散实体中的一个或多个所述核酸条形码引物酶促扩增每个离散实体中的一个或多个所述核酸靶分子，使得生成包含所述一个或多个核酸靶分子之一的序列和核酸条形码序列的扩增产物。
113.根据112所述的方法，其中所述方法包括将接头序列并入到所述一个或多个核酸靶分子中，并且其中选自所述文库的用于包括在每个离散实体中的所述一个或多个引物包括具有足以退火为一个或多个所述接头序列的第一序列的一个或多个引物。
114.根据112或113所述的方法，其中所述一个或多个核酸靶分子是多个包含不同序列的核酸靶分子。
115.根据112-114中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个包含相对于所述多个中的其它离散实体包含不同序列的核酸靶分子。
116.根据112-115中任一项所述的方法，其中选自所述文库的所述一个或多个核酸条形码引物是多个包含不同序列的核酸条形码引物。
117.根据112-116中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个包含相对于所述多个中的其它离散实体包含不同序列的核酸条形码引物。
118.根据112-117中任一项所述的方法，其中所述酶促扩增包括使所述多个离散实体经受热循环。
119.根据112-117中任一项所述的方法，其中所述酶促扩增包括使所述多个离散实体经受等温扩增条件。
120.根据112-119中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
121.一种用于条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
生成核酸条形码序列文库；
将选自所述文库的一个或多个核酸条形码序列和一个或多个核酸靶分子组合在多个离散实体中的每一个中；并且
酶促片段化每个离散实体中的所述一个或多个核酸靶分子并将每个离散实体中所述一个或多个核酸条形码序列中的一个或多个酶促并入到该离散实体中所述一个或多个靶核酸分子或其扩增产物的片段中。
122.根据121所述的方法，其中所述方法包括将接头序列并入到所述一个或多个核酸靶分子中。
123.根据121或122所述的方法，其中所述一个或多个核酸靶分子是多个包含不同序列的核酸靶分子。
124.根据121-123中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个包含相对于所述多个中的其它离散实体包含不同序列的核酸靶分子。
125.根据121-124中任一项所述的方法，其中选自所述文库的所述一个或多个核酸条形码序列是多个包含不同序列的核酸条形码序列。
126.根据121-125中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个包含相对于所述多个中的其它离散实体包含不同序列的核酸条形码序列。
127.根据121-125中任一项所述的方法，其中所述酶促片段化和/或并入步骤利用下列酶中的一种或多种：转座酶、
Figure BDA0003744850070001221
连接酶、聚合酶和逆转录酶。
128.根据121-125中任一项所述的方法，其中所述酶促片段化和/或并入步骤利用整合酶或重组酶。
129.根据121-128中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
130.一种条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
生成核酸条形码序列文库；
将选自所述文库的一个或多个核酸条形码序列和一个或多个核酸靶分子组合在多个离散实体中的每一个中；并且
酶促连接每个离散实体中的所述一个或多个核酸靶分子与该离散实体中的一个或多个核酸条形码序列。
131.根据130所述的方法，其中所述方法包括在酶促连接之前将接头序列并入到所述一个或多个核酸靶分子中。
132.根据130或131所述的方法，其中所述一个或多个核酸靶分子是多个包含不同序列的核酸靶分子。
133.根据130-132中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个包含相对于所述多个中的其它离散实体包含不同序列的核酸靶分子。
134.根据130-132中任一项所述的方法，其中选自所述文库的所述一个或多个核酸条形码序列是多个包含不同序列的核酸条形码序列。
135.根据130-132中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个包含相对于所述多个中的其它离散实体包含不同序列的核酸条形码序列。
136.根据130-135中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
137.一种用于操纵微滴的方法，所述方法包括：
生成第一多个微滴和第二多个微滴；
使所述第一多个微滴在微流控装置的通道中流动；
使所述第一多个微滴中的每一个分裂以提供多个体积减小的微滴；
将所述多个体积减小的微滴中的每一个与所述第二多个微滴中的微滴合并，其中所述第二多个微滴中的微滴各自具有的体积大致等于或小于所述第一多个微滴的体积。
138.根据137所述的方法，其中所述微流控装置的通道包括液滴分裂结构。
139.根据138所述的方法，其中所述液滴分裂结构包括串行二分结构(serialbisection architecture)。
140.根据137-139中任一项所述的方法，其中所述第一多个微滴中的每一个均包含细胞裂解物。
141.根据140所述的方法，其中所述方法包括使所述第一多个微滴中的每一个中的细胞裂解以提供细胞裂解物。
142.根据137-141中任一项所述的方法，其中所述第二多个微滴中的微滴各自包含配置为促进与所述细胞裂解物的一种或多种组分的一种或多种反应的一种或多种试剂。
143.根据142所述的方法，其中所述一种或多种试剂包括一种或多种PCR试剂和/或一种或多种RT-PCR试剂。
144.一种微流控装置，其包括：
包括微滴合并部分的流动通道，微滴合并部分包括多个串联的通道几何结构特征件，其中每个通道几何结构特征件与配置为在所述通道中靠近所述通道几何结构特征件施加电场的一个或多个电极或一个或多个电极的一个或多个部分联合。
145.根据144所述的微流控装置，其中所述多个通道几何结构特征件中的每一个均包括通道收缩部、扩展部、弯曲部或其组合。
146.根据145所述的微流控装置，其中所述多个通道几何结构特征件中的每一个均包括通道收缩部，并且其中所述每个通道收缩部之前或之后是通道扩展部。
147.根据145或146所述的微流控装置，其中每个收缩部是通道宽度或高度相对于所述液滴合并部分上游或下游的通道宽度或高度减小。
148.根据147所述的微流控装置，其中每个通道扩展部是通道宽度或高度相对于148所述的收缩部增大。
149.根据144-148中任一项所述的微流控装置，其中所述液滴合并部分包括2至20个串联的所述通道几何结构特征件。
150.根据149所述的微流控装置，其中所述液滴合并部分包括2至10个串联的所述通道几何结构特征件。
151.根据150所述的微流控装置，其中所述液滴合并部分包括2至5个串联的所述通道几何结构特征件。
152.根据144-151中任一项所述的微流控装置，其中所述一个或多个电极为液体电极。
153.根据144-152中任一项所述的微流控装置，其中每个通道几何结构特征件与第一电极或其部分和第二电极或其部分联合，其中所述第一电极或其部分和所述第二电极或其部分呈面向关系位于所述流动通道的任一侧。
154.一种使用根据144-153中任一项所述的微流控装置合并微滴的方法，其中所述方法包括
使两个或更多个微滴流过根据144-153中任一项所述的微流控装置的所述流动通道的所述微滴合并部分，使得所述两个或更多个微滴靠近所述通道几何结构特征件之一定位；并且
通过使用与所述通道几何结构特征件联合的所述一个或多个电极或所述一个或多个电极的所述一个或多个部分施加电场，合并靠近所述通道几何结构特征件之一的所述两个或更多个微滴。
155.根据154所述的方法，其中所述两个或更多个微滴中的每一个均包含细胞裂解物。
156.根据154所述的方法，其中所述两个或更多个微滴中的每一个均包含一个或多个核酸条形码序列。
157.一种用于合并两个或更多个微滴的方法，所述方法包括：
将两个或更多个微滴群引入到微流控装置的流动通道中，
其中所述流动通道包括微滴合并部分，其与配置为在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场的一个或多个电极或一个或多个电极的一个或多个部分联合，
其中将所述两个或更多个微滴群分别引入到所述流动通道中两个或更多个独立入口通道的单个接合点处，并且其中将所述两个或更多个微滴群引入到所述流动通道中，使得来自每个入口通道的所述微滴输入由于流体动力效应而至少部分同步，导致喷出间隔的成组微滴，其中至少一些所述间隔的成组微滴包括来自所述两个或更多个微滴群中的每一个的微滴；
使所述间隔的成组微滴流入所述微滴合并部分；并且
通过使用所述一个或多个电极或所述一个或多个电极的所述一个或多个部分在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场来合并间隔组内的微滴。
158.根据157所述的方法，其中将三个或更多个微滴群分别引入到所述流动通道中三个或更多个独立入口通道的单个接合点处，并且其中将所述三个或更多个微滴群引入到所述流动通道中，使得来自每个入口通道的所述微滴输入由于流体动力效应而至少部分同步，导致喷射间隔的成组微滴，其中至少一些所述间隔的成组微滴包括来自所述三个或更多个微滴群中的每一个的微滴。
159.一种用于合并两种或更多种液体的方法，所述方法包括：
将第一液体作为液流引入到微流控装置的流动通道中至少部分与不混溶相液体接触；
将包含第二液体的微滴引入到所述流动通道中；
使所述微滴合并到所述液流中，从而使所述第一和第二液体组合；并且
诱导包含所述组合的第一和第二液体的所述液流破裂成包含所述组合的第一和第二液体的单个微滴。
160.根据159所述的方法，其中所述流动通道包括微滴合并部分，其与配置为在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场的一个或多个电极或一个或多个电极的一个或多个部分联合，并且其中所述方法包括在所述流动通道的微滴合并部分中施加电场以使所述微滴合并到所述液流中。
161.根据159或160所述的方法，其中所述第一液体在滴落条件下引入到所述流动通道中。
162.根据159或160所述的方法，其中所述第一液体在喷射条件下引入到所述流动通道中。
163.根据159-162中任一项所述的方法，其中所述方法包括在诱导所述液流破裂成单个微滴之前将多个微滴合并到所述液流中。
164.根据159-162中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包含第三液体的第二微滴引入到所述流动通道中，并且其中所述诱导包括在将所述第二微滴合并到所述液流之前，诱导所述液流破裂成多个单个微滴。
165.根据164所述的方法，其中所述第二和第三液体相同。
166.根据159-162中任一项所述的方法，其中所述方法包括将一种或多种附加液体作为液流或液滴引入到所述流动通道中。
167.一种微流控装置，其包括：
包括微滴混合部分的流动通道，微滴混合部分包括一个或多个与所述流动通道流体连通的分支通道，
其中所述一个或多个分支通道相对于所述流动通道的中心线成10°至170°之间的角，
其中所述一个或多个分支通道的高度小于所述流动通道的高度且小于要流过所述流动通道的液滴的直径，并且
其中所述一个或多个分支通道配置成使得微滴在载液中流过所述流动通道时，暴露于当所述载液流入和流出所述一个或多个分支通道时产生的错流，并且
其中所述错流足以在所述微滴中产生混合所述微滴内容物的流动。
168.根据167所述的微流控装置，其中所述一个或多个分支通道相对于所述流动通道的中心线成45°至135°之间的角。
169.根据168所述的微流控装置，其中所述一个或多个分支通道相对于所述流动通道的中心线成约90°的角。
170.根据167-169中任一项所述的微流控装置，其中所述微滴混合部分包括沿着所述流动通道的长度定位的多个分支通道，使得微滴在载液中流过所述流动通道时，暴露于多个错流。
171.根据167-170中任一项所述的微流控装置，其中所述一个或多个分支通道的宽度大于要流过所述流动通道的微滴的直径。
172.一种使用根据167-171中任一项所述的微流控装置混合一个或多个微滴的内容物的方法，
其中所述方法包括使一个或多个微滴在载液中流过根据167-171中任一项所述的微流控装置的流动通道的微滴混合部分，
其中所述一个或多个微滴暴露于当所述载液流入和流出所述一个或多个分支通道时产生的错流，并且
其中所述错流足以在所述微滴中产生混合所述一个或多个微滴内容物的流动。
173.一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的方法，所述方法包括：
将单个细胞包封在有限稀释的离散实体群中，使得所述离散实体群的每个单个离散实体在统计上含有零或一个细胞；
裂解所述细胞以在所述离散实体内释放RNA靶分子；
向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂；并且
使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和使该离散实体独有的所述核酸条形码序列酶促并入到cDNA扩增产物中的条件，从而提供多个离散实体，其中所述多个中的每个离散实体均包含相对于所述多个中的其它离散实体经独特核酸条形码序列标记的cDNA扩增产物。
174.根据173所述的方法，其包括向每个离散实体中引入足以使包含独特分子标识符(UMI)的核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中的试剂，其中足以使该离散实体独有的所述核酸条形码序列酶促并入到cDNA扩增产物中的条件足以使包含独特分子标识符的所述核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中。
175.根据174所述的方法，其中足以使包含独特分子标识符的核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中的所述试剂包括含简并序列的模板转换寡核苷酸。
176.根据173-175中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
177.根据173-176中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或引入。
178.根据173-176中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或引入。
179.根据173-176中任一项所述的方法，其中所述引入是根据137-139或154-166中任一项。
180.根据173-176中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
181.根据173-176中任一项所述的方法，其中使用167-172中任一项所述的微流控装置混合所述离散实体的组分。
182.根据173-181中任一项所述的方法，其中所述引入和所述经受步骤都不是在珠粒的存在下进行。
183.根据173-182中任一项所述的方法，其中使用含配体，例如生物素或硫醇部分的寡核苷酸引物进行所述扩增。
184.根据173-183中任一项所述的方法，其中所述包封、裂解和cDNA合成步骤在第一微流控装置中进行并且所述酶促并入在第二微流控装置中进行。
185.根据184所述的方法，其中所述酶促并入包括SOEing PCR。
186.一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的方法，所述方法包括：
提供离散实体群，所述离散实体群的每个离散实体均包含源于单个细胞的细胞裂解物；
向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂；并且
使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和使该离散实体独有的所述核酸条形码序列酶促并入到cDNA扩增产物中的条件，从而提供多个离散实体，其中所述多个中的每个离散实体均包含相对于所述多个中的其它离散实体经独特核酸条形码序列标记的cDNA扩增产物。
187.根据186所述的方法，其包括向每个离散实体中引入足以使包含独特分子标识符(UMI)的核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中的试剂，其中足以使该离散实体独有的所述核酸条形码序列酶促并入到cDNA扩增产物中的条件足以使包含独特分子标识符的所述核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中。
188.根据187所述的方法，其中足以使包含独特分子标识符的核酸分子酶促并入到每个cDNA序列中的所述试剂包括含简并序列的模板转换寡核苷酸。
189.根据186-188中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
190.根据186-189中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或引入。
191.根据186-189中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或引入。
192.根据186-189中任一项所述的方法，其中所述引入是根据137-139或154-166中任一项。
193.根据186-189中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
194.根据186-189中任一项所述的方法，其中使用167-172中任一项所述的微流控装置混合所述离散实体的组分。
195.根据186-194中任一项所述的方法，其中所述引入和所述经受步骤都不是在珠粒的存在下进行。
196.根据186-195中任一项所述的方法，其中使用含配体，例如生物素或硫醇部分的寡核苷酸引物进行所述扩增。
197.根据186-196中任一项所述的方法，其中所述cDNA合成步骤在第一微流控装置中进行并且所述酶促并入在第二微流控装置中进行。
198.根据197所述的方法，其中所述酶促并入包括SOEing PCR。
199.一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的方法，所述方法包括：
(a)将单个细胞包封在有限稀释的离散实体群中，使得所述离散实体群的每个单个离散实体在统计上含有零或一个细胞；
(b)裂解所述细胞以在所述离散实体内释放RNA靶分子；
(c)向每个离散实体中引入足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂，并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的条件；
(d)向每个离散实体中引入足以使所述扩增的cDNA产物片段化的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述扩增的cDNA产物片段化的条件；并且
(e)向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的条件。
200.根据199所述的方法，其中步骤(a)、(b)和/或(c)在第一微流控装置中进行，步骤(d)在第二微流控装置中进行，并且步骤(e)在第三微流控装置中进行。
201.根据199所述的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)在单个微流控装置中进行。
202.根据199-201中任一项所述的方法，其包括向每个离散实体中引入足以使包含独特分子标识符(UMI)的核酸分子酶促并入到每个mRNA、cDNA或其扩增产物中的试剂，并且使每个离散实体经受足以使包含独特分子标识符(UMI)的核酸分子酶促并入到每个mRNA、cDNA或其扩增产物中的条件。
203.根据202所述的方法，其中足以使包含独特分子标识符的核酸分子酶促并入的所述试剂包括含简并序列的模板转换寡核苷酸。
204.根据199-203中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
205.根据199-204中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或引入。
206.根据199-204中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或引入。
207.根据199-204中任一项所述的方法，其中一个或多个所述引入步骤是根据137-139或154-166中任一项。
208.根据199-204中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
209.根据199-204中任一项所述的方法，其中使用167-172中任一项所述的微流控装置混合所述离散实体的组分。
210.根据199-204中任一项所述的方法，其中引入足以进行片段化的试剂及引入和酶促并入核酸条形码序列根据121-129中任一项所述的方法进行。
211.根据199-210中任一项所述的方法，其中所述引入和所述经受步骤都不是在珠粒的存在下进行。
212.根据199-211中任一项所述的方法，其中步骤(c)分两个不同的步骤进行，第一步引入足以进行cDNA合成的所述试剂并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成的条件，及第二步引入足以扩增所得cDNA产物的所述试剂并且使每个离散实体经受足以扩增所得cDNA产物的条件。
213.根据199-211中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括将来自步骤(d)的所述离散实体引入到微流控装置中，将包含所述核酸条形码序列的离散实体引入到微流控装置中，并且合并所述离散实体以提供体积增大的离散实体。
214.根据199-212中任一项所述的方法，其中所述酶促并入包括SOEing PCR。
215.一种条形码化并扩增来自单个细胞的RNA的方法，所述方法包括：
(a)提供离散实体群，所述离散实体群的每个离散实体包含源于单个细胞的细胞裂解物；
(b)向每个离散实体中引入足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的试剂，并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成和所得cDNA产物的扩增的条件；
(c)向每个离散实体中引入足以使所述扩增的cDNA产物片段化的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述扩增的cDNA产物片段化的条件；并且
(d)向每个离散实体中引入该离散实体独有的核酸条形码序列和足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的试剂，并且使每个离散实体经受足以使所述核酸条形码序列酶促并入到所述片段化cDNA产物中的条件。
216.根据215所述的方法，其中步骤(a)和/或(b)在第一微流控装置中进行，步骤(c)在第二微流控装置中进行，并且步骤(d)在第三微流控装置中进行。
217.根据215所述的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)和(d)在单个微流控装置中进行。
218.根据215-217中任一项所述的方法，其包括向每个离散实体中引入足以使包含独特分子标识符(UMI)的核酸分子酶促并入到每个mRNA、cDNA或其扩增产物中的试剂，并且使每个离散实体经受足以使包含独特分子标识符(UMI)的核酸分子酶促并入到每个mRNA、cDNA或其扩增产物中的条件。
219.根据218所述的方法，其中足以使包含独特分子标识符的核酸分子酶促并入的所述试剂包括含简并序列的模板转换寡核苷酸。
220.根据215-219中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
221.根据215-220中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或引入。
222.根据215-220中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或引入。
223.根据215-220中任一项所述的方法，其中一个或多个所述引入步骤是根据137-139或154-166中任一项。
224.根据215-220中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
225.根据215-220中任一项所述的方法，其中使用167-172中任一项所述的微流控装置混合所述离散实体的组分。
226.根据215-220中任一项所述的方法，其中引入足以进行片段化的试剂及引入和酶促并入核酸条形码序列根据121-129中任一项所述的方法进行。
227.根据215-226中任一项所述的方法，其中所述引入和所述经受步骤都不是在珠粒的存在下进行。
228.根据199-227中任一项所述的方法，其中步骤(b)分两个不同的步骤进行，第一步引入足以进行cDNA合成的所述试剂并且使每个离散实体经受足以进行cDNA合成的条件，及第二步引入足以扩增所得cDNA产物的所述试剂并且使每个离散实体经受足以扩增所得cDNA产物的条件。
229.根据199-227中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括将来自步骤(c)的所述离散实体引入到微流控装置中，将包含所述核酸条形码序列的离散实体引入到微流控装置中，并且合并所述离散实体以提供体积增大的离散实体。
230.根据199-228中任一项所述的方法，其中所述酶促并入包括SOEing PCR。
231.一种制备用于测序的cDNA的方法，所述方法包括：
使cDNA片段化为多个片段，所述多个片段包含5’末端、3’末端和内部片段；
将所述多个片段连同固相支持体一起包封在一个或多个离散实体中；
使所述5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上；
使所述内部片段与可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端分离；并且
释放可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端。
232.根据231所述的方法，其中所述cDNA由源于单个细胞的mRNA生成，并且其中每个cDNA包含并入到所述mRNA所来源的所述细胞独有的所述5’末端和/或3’末端中的核酸条形码序列。
233.根据231或232所述的方法，其中每个cDNA包含并入到所述5’末端和/或3’末端中的独特分子标识符(UMI)。
234.根据231所述的方法，其中所述cDNA是根据173-197中任一项所述的方法的产物。
235.根据231-234中任一项所述的方法，其中所述片段化包括物理剪切。
236.根据231-235中任一项所述的方法，其中所述片段化包括用一种或多种酶进行酶促片段化。
237.根据231-236中任一项所述的方法，其中所述5’末端和/或3’末端包含配体并且使所述5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上包括使所述配体与固定在所述固相支持体上的所述配体的受体特异性结合。
238.根据231-237中任一项所述的方法，其中所述固相支持体为珠粒。
239.根据238所述的方法，其中所述珠粒为磁珠。
240.根据231-239中任一项所述的方法，其包括使可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端经受酶促修饰。
241.根据240所述的方法，其中所述酶促修饰选自限制性酶切、连接和聚腺苷酸化。
242.根据231-241中任一项所述的方法，其中所述片段化发生在使所述cDNA的5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上之后。
243.根据231-242中任一项所述的方法，其中所述一个或多个离散实体为微滴。
244.一种制备用于测序的条形码化核酸的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子和多个珠粒包封在离散实体中，其中所述多个珠粒中的每一个均包含核酸条形码序列、独特分子标识符(UMI)和设计为与所述多个核酸靶分子之一杂交的核酸捕获序列；
使所述离散实体经受足以使所述一个或多个核酸靶分子和所述核酸捕获序列杂交的条件；并且
从所述离散实体回收所述多个珠粒用于后续分析。
245.根据244所述的方法，其包括将所述核酸条形码序列或其扩增产物之一酶促并入到所述多个核酸靶分子或其扩增产物中的每一个中。
246.根据244所述的方法，其包括使所述多个核酸靶分子中的每一个酶促延伸到所述核酸条形码序列之一以便生成包含所述核酸条形码序列或与之互补的序列和所述核酸靶分子的至少一部分序列的嵌合分子。
247.根据244-246中任一项所述的方法，其中回收包括通过荧光激活细胞分选术(FACS)、PCR激活细胞分选术(PACS)或磁激活细胞分选术(MACS)中的一种或多种来分选所述珠粒。
248.根据244-247中任一项所述的方法，其中所述核酸靶分子包含细胞DNA、RNA或经由亲和试剂与细胞缔合的核酸。
249.根据244-248中任一项所述的方法，其包括酶促扩增来自所述珠粒的所述核酸靶分子。
250.根据244-249中任一项所述的方法，其包括从所述珠粒中取出所述核酸靶分子。
251.根据244-250中任一项所述的方法，其包括对所述核酸靶分子或其部分测序，或对所述核酸靶分子或其部分的扩增产物测序。
252.根据244-251中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
253.一种用于生成用于基于条形码测序的区室化、扩增靶文库的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子与足以酶促扩增所述核酸靶分子的试剂一起包封在多个离散实体中；
使所述离散实体经受足以酶促扩增所述核酸靶分子的条件，从而提供扩增产物；
使所述扩增产物片段化；并且
将核酸条形码序列并入到所述片段化扩增产物中。
254.根据253所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
255.根据253或254所述的方法，其中足以酶促扩增所述核酸靶分子的所述试剂包括选自DNA聚合酶、RecA蛋白和解旋酶的一或多酶。
256.根据253-255中任一项所述的方法，其中使所述离散实体经受足以酶促扩增所述核酸靶分子的条件包括使所述离散实体进行热循环。
257.根据253-256中任一项所述的方法，其中所述核酸靶分子为DNA分子，并且其中使用RNA中间产物扩增所述核酸靶分子。
258.根据253-257中任一项所述的方法，其中所述核酸靶分子在一种或多种生物体中扩增。
259.根据253-258中任一项所述的方法，其包括调节所述试剂或条件以便调节所述核酸靶分子的扩增程度。
260.根据253-259中任一项所述的方法，其中所述多个核酸靶分子包封在有限稀释的所述多个离散实体中，使得所述多个中的每个单个离散实体在统计上含有零或一个核酸靶分子。
261.根据253-260中任一项所述的方法，其包括在所述片段化之前或之后使所述扩增产物连接至一个或多个固相支持体。
262.根据261所述的方法，其中所述一个或多个固相支持体为一个或多个珠粒。
263.根据253-262中任一项所述的方法，其中所述核酸靶分子长度大于10千碱基。
264.根据263所述的方法，其中所述核酸靶分子长度大于100千碱基。
265.根据264所述的方法，其中所述核酸靶分子长度大于1兆碱基。
266.一种片段化和条形码化核酸靶分子的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子或其扩增产物包封在多个离散实体中；
使所述离散实体经受足以片段化所述核酸靶分子或其扩增产物的条件以提供片段化核酸靶分子或其扩增产物；
将核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或其扩增产物中，其中所述核酸条形码序列将并入了所述核酸条形码序列的每个片段标识为源于单个离散实体、单个细胞或单个生物体。
267.根据266所述的方法，其中所述经受包括酶促片段化所述核酸靶分子或其扩增产物。
268.根据266所述的方法，其中所述经受包括使用物理或化学方式片段化所述核酸靶分子或其扩增产物。
269.根据266所述的方法，其中所述经受包括通过施加紫外光来片段化所述核酸靶分子或其扩增产物。
270.根据266所述的方法，其包括在所述经受之前，将一个或多个酶裂解位点并入到所述核酸靶分子或其扩增产物中。
271.根据270所述的方法，其中所述一个或多个酶裂解位点包含dUTP。
272.根据266所述的方法，其中所述经受包括通过施加力来片段化所述核酸靶分子或其扩增产物。
273.根据272所述的方法，其中所述力是由通过微流控装置内的微流控通道、微流控喷口或微流控接合点的所述核酸靶分子或其扩增产物的流体动力流所产生的剪切力。
274.根据266所述的方法，其中所述经受包括经由转座子插入来片段化所述核酸靶分子或其扩增产物。
275.根据266所述的方法，其中所述经受包括使用核酸片段化微生物来片段化所述核酸靶分子或其扩增产物。
276.根据266-275中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
277.根据266-276中任一项所述的方法，其中所述核酸靶分子长度大于10千碱基。
278.根据277所述的方法，其中所述核酸靶分子长度大于100千碱基。
279.根据278所述的方法，其中所述核酸靶分子长度大于1兆碱基。
280.一种表征细胞内的拷贝数变异的方法，所述方法包括：
分离离散实体中的单个细胞；
片段化所述离散实体中的细胞核酸；
将独特分子标识符(UMI)并入到所述片段化细胞核酸中；
对所述片段化细胞核酸测序；并且
使用所述UMI推断所述细胞核酸中特定序列的拷贝数。
281.根据280所述的方法，其中所述细胞核酸包括基因组DNA。
282.根据280或281所述的方法，其中所述细胞核酸包括RNA。
283.根据280-282中任一项所述的方法，其中使细胞群经受所述分离、片段化、并入和测序步骤。
284.根据280-283中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
285.根据280-284中任一项所述的方法，其包括向所述细胞核酸中并入每个细胞和/或每个离散实体独有的核酸条形码序列。
286.根据280-285中任一项所述的方法，其中所述测序产生了包含UMI和/或核酸条形码序列的测序读段。
287.一种用于使条形码连接至片段化核酸或其扩增产物的方法，所述方法包括：
将多个片段化核酸靶分子、核酸条形码序列和足以使所述核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或其扩增产物中的试剂组合在多个离散实体中；并且
使所述多个离散实体经受足以使所述核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或其扩增产物中的条件，其中所述核酸条形码序列将并入了所述核酸条形码序列的每个片段或其扩增产物标识为源于单个离散实体、单个细胞或单个生物体。
288.根据287所述的方法，其中所述经受不是在珠粒的存在下进行。
289.根据287或288所述的方法，其中所述试剂包括连接酶。
290.根据287或288所述的方法，其中所述试剂包括选自整合酶、重组酶和翻转酶的一种或多种酶。
291.根据287或288所述的方法，其中所述并入包括SOEing PCR。
292.根据287-291中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
293.一种对核酸测序的方法，其包括：
将多个核酸靶分子包封在多个离散实体中；
酶促扩增所述核酸靶分子以提供第一扩增产物；
使所述第一扩增产物片段化以提供片段化的第一扩增产物；
将核酸条形码序列并入到所述片段化的第一扩增产物或由所述片段化的第一扩增产物扩增的第二扩增产物中；
对其中并入了核酸条形码序列的所述片段化的第一扩增产物或其中并入了核酸条形码序列的所述第二扩增产物测序；并且
使用所述核酸条形码序列为同时存在于相同离散实体中的所述片段化的第一扩增产物的成员或所述第二扩增产物的成员的测序读段分组。
294.根据293所述的方法，其中所述酶促扩增发生在所述包封之前。
295.根据293或294所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
296.根据295所述的方法，其中所述并入包括将所述多个离散实体中的每一个与包含核酸条形码序列的微滴合并。
297.根据295所述的方法，其中所述并入包括将包含核酸条形码序列的细胞包封在所述多个离散实体中的每一个中。
298.根据293-297中任一项所述的方法，其中所述片段化和并入步骤作为单个步骤利用转座子进行。
299.根据293-298中任一项所述的方法，其中所述离散实体中的一个或多个包含多个不同的核酸靶分子和/或多个不同的核酸条形码序列，并且其中所述方法包括对由所述测序产生的混合测序读段进行生物信息学分析以获得所述单独核酸靶分子的序列信息。
300.根据293-299中任一项所述的方法，其包括裂解一个或多个细胞或病毒以获得所述多个核酸靶分子。
301.根据300所述的方法，其中所述裂解在所述多个离散实体中进行。
302.根据293-301中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个中的所述核酸靶分子源于单个细胞。
303.根据293-301中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个中的所述核酸靶分子源于单个分子。
304.根据293-303中任一项所述的方法，其包括将独特分子标识符(UMI)并入到所述核酸靶分子、第一扩增产物、片段化的第一扩增产物和第二扩增产物中的一个或多个中。
305.一种对核酸测序的方法，其包括：
将多个核酸靶分子包封在多个离散实体中；
使所述多个核酸靶分子片段化以提供片段化核酸靶分子；
将核酸条形码序列并入到所述片段化核酸靶分子或由所述片段化核酸靶分子扩增的扩增产物中；
对其中并入了核酸条形码序列的所述片段化核酸靶分子或其中并入了核酸条形码序列的所述扩增产物测序；并且
使用所述核酸条形码序列为同时存在于相同离散实体中的所述片段化核酸靶分子的成员或所述扩增产物的成员的测序读段分组。
306.根据305所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
307.根据306所述的方法，其中所述并入包括将所述多个离散实体中的每一个与包含核酸条形码序列的微滴合并。
308.根据306所述的方法，其中所述离散实体为微滴，并且所述并入包括将包含所述核酸条形码序列的细胞包封在所述多个离散实体中的每一个中。
309.根据305-308中任一项所述的方法，其中所述片段化和并入步骤作为单个步骤利用转座子进行。
310.根据305-309中任一项所述的方法，其中所述离散实体中的一个或多个包含多个不同的核酸靶分子和/或多个不同的核酸条形码序列，并且其中所述方法包括对由所述测序产生的混合测序读段进行生物信息学分析以获得所述单独核酸靶分子的序列信息。
311.根据305-310中任一项所述的方法，其包括裂解一个或多个细胞或病毒以获得所述多个核酸靶分子。
312.根据311所述的方法，其中所述裂解在所述多个离散实体中进行。
313.根据305-312中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个中的所述核酸靶分子源于单个细胞。
314.根据305-312中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个中的所述核酸靶分子源于单个分子。
315.根据305-314中任一项所述的方法，其包括将独特分子标识符(UMI)并入到所述核酸靶分子、所述片段化核酸靶分子和所述扩增产物中的一个或多个中。
316.一种对核酸测序的方法，其包括：
将多个核酸靶分子包封在多个离散实体中；
酶促扩增所述多个离散实体中的所述核酸靶分子以提供第一扩增产物；
将核酸条形码序列并入到所述第一扩增产物或由所述第一扩增产物扩增的第二扩增产物中；
为其中并入了核酸条形码序列的所述第一扩增产物或其中并入了核酸条形码序列的所述第二扩增产物测序；并且
使用所述核酸条形码序列为同时存在于相同离散实体中的所述第一扩增产物的成员或所述第二扩增产物的成员的测序读段分组。
317.根据316所述的方法，其中所述酶促扩增发生在所述包封之前。
318.根据316或317所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
319.根据318所述的方法，其中所述并入包括将所述多个离散实体中的每一个与包含核酸条形码序列的微滴合并。
320.根据318所述的方法，其中所述并入包括将包含所述核酸条形码序列的细胞包封在所述多个离散实体中的每一个中。
321.根据316-320中任一项所述的方法，其中所述离散实体中的一个或多个包含多个不同的核酸靶分子和/或多个不同的核酸条形码序列，并且其中所述方法包括对由所述测序产生的混合测序读段进行生物信息学分析以获得所述单独核酸靶分子的序列信息。
322.根据316-321中任一项所述的方法，其包括裂解一个或多个细胞或病毒以获得所述多个核酸靶分子。
323.根据322所述的方法，其中所述裂解在所述多个离散实体中进行。
324.根据316-323中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个中的所述核酸靶分子源于单个细胞。
325.根据316-323中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的每一个中的所述核酸靶分子源于单个分子。
326.根据316-325中任一项所述的方法，其包括将独特分子标识符(UMI)并入到所述核酸靶分子、第一扩增产物和第二扩增产物中的一个或多个中。
327.一种用于检测靶分子的方法，所述方法包括：
用包含第一核酸条形码序列的寡核苷酸标记对分子靶标有特异性的多种亲和试剂中的每一种，其中所述第一核酸条形码序列标识被所述寡核苷酸标记的所述亲和试剂的靶特异性；
使所述多种亲和试剂与多个分子靶标在足以使所述多种亲和试剂与其特异性分子靶标(存在时)特异性结合的条件下接触；
将与其特异性分子靶标(存在时)结合的所述多种亲和试剂与多个第二核酸条形码序列一起包封在多个离散实体中，其中包封在每个离散实体中的所述第二核酸条形码序列独特地标识包封其的所述离散实体；
将所述第二核酸条形码序列并入到包含所述第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸中；
为包含所述第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸测序；并且
使用所述第一和第二核酸条形码序列标识和/或量化同时存在于相同离散实体中的亲和试剂。
328.根据327所述的方法，其中所述多种亲和试剂包括对不同分子靶标有特异性的亲和试剂。
329.根据327或328所述的方法，其中所述分子靶标由细胞组成。
330.根据329所述的方法，其中将所述细胞包封在有限稀释的所述离散实体中，使得所述多个离散实体中的每个单个离散实体在统计上含有零或一个细胞。
331.根据329或330所述的方法，其中所述分子靶标与一个或多个所述细胞的表面结合或缔合。
332.根据327-331中任一项所述的方法，其中所述亲和试剂为抗体。
333.根据327-332中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包括DNA或其类似物。
334.根据327-332中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA或其类似物。
335.根据327-332中任一项所述的方法，其中所述多种亲和试剂中的每一种和/或包含第一核酸条形码序列的每个寡核苷酸均包括独特分子标识符(UMI)，其分别独特地标识所述亲和试剂中的每一种和/或包含第一核酸条形码序列的所述寡核苷酸中的每一个。
336.根据327-335中任一项所述的方法，其中所述多种亲和试剂使用噬菌体展示、核糖体展示和mRNA展示中的一种或多种生成。
337.根据327-336中任一项所述的方法，其中用于标记所述多种亲和试剂的所述寡核苷酸经由共价、离子和疏水性相互作用中的一种或多种连接至所述亲和试剂。
338.根据327-336中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
339.一种条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂的方法，所述方法包括：
使生物材料与各自对分子靶标有特异性的多种亲和试剂，在足以使所述亲和试剂与其各自的分子靶标(存在于所述生物材料中时)特异性结合的条件下接触，其中所述亲和试剂中的每一种均包含与之偶联的寡核苷酸；
将所述生物材料包封在多个第一离散实体中；
提供多个包含核酸条形码序列的第二离散实体；
使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物、所述多个第二离散实体之一的内容物及足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸或其扩增产物之一中的试剂组合在离散实体中；并且
使包含所述多个第一离散实体之一和所述多个第二离散实体之一的所述组合内容物的所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸或其扩增产物之一中的条件。
340.根据339所述的方法，其中所述生物材料是固定细胞的产物。
341.根据339或340所述的方法，其中所述亲和试剂为抗体。
342.根据339-341中任一项所述的方法，其包括将独特分子标识符(UMI)并入到所述寡核苷酸偶联的亲和试剂中。
343.根据339-342中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
344.根据339-343中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或并入。
345.根据339-343中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或并入。
346.根据339-343中任一项所述的方法，其中所述并入是根据137-139或154-166中任一项。
347.根据339-343中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
348.一种条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂的方法，所述方法包括：
使多个细胞与各自对分子靶标有特异性的多种亲和试剂，在足以使所述亲和试剂与其各自的分子靶标(存在于所述细胞中时)特异性结合的条件下接触，其中所述亲和试剂中的每一种均包含与之偶联的寡核苷酸；
将所述细胞包封在多个第一离散实体中并裂解；
提供多个包含核酸条形码序列的第二离散实体；
使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物、所述多个第二离散实体之一的内容物及足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸及其扩增产物之一中的试剂组合在离散实体中；并且
使包含所述多个第一离散实体之一和所述多个第二离散实体之一的所述组合内容物的所述离散实体经受足以使所述核酸条形码序列之一并入到与所述亲和试剂偶联的所述寡核苷酸及其扩增产物之一中的条件。
349.根据348所述的方法，其中所述细胞包封在所述第一离散实体中，使得在每个所述第一离散实体中存在不超过一个细胞。
350.根据348或349所述的方法，其中所述亲和试剂为抗体。
351.根据348-350中任一项所述的方法，其包括将独特分子标识符(UMI)并入到所述寡核苷酸偶联的亲和试剂中。
352.根据348-351中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
353.根据348-352中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或并入。
354.根据348-352中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或并入。
355.根据348-352中任一项所述的方法，其中所述并入是根据137-139或154-166中任一项。
356.根据348-352中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
357.一种用于连接并扩增与蛋白质偶联的核酸的方法，所述方法包括：
使核酸条形码序列偶联的蛋白质群体在足以使多种所述蛋白质相互作用的条件下孵育，使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列相互靠近；
将所述核酸条形码序列偶联的蛋白质群体包封在多个离散实体中，使得相互作用蛋白(若存在)共同包封；
使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物与足以使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列(若存在)扩增并连接的试剂组合在离散实体中；并且
使所述离散实体经受足以使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列(若存在)扩增并连接的条件。
358.根据357所述的方法，其中所述群体使用噬菌体展示、核糖体展示和mRNA展示中的一种或多种制备。
359.根据357-358中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
360.根据357-359中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
361.根据357-360中任一项所述的方法，其中纯化步骤用于在包封之前去除非相互作用蛋白。
362.根据357-361中任一项所述的方法，其包括基于离散实体内存在的独特扩增产物的数量，相对于非相互作用蛋白鉴定相互作用蛋白。
363.根据357-362中任一项所述的方法，其中所述相互作用是特异性结合相互作用。
364.一种经条形码化鉴定蛋白质间相互作用的方法，所述方法包括：
使核酸条形码序列偶联的蛋白质群体在足以使多种所述蛋白质相互作用的条件下孵育，使所述相互作用蛋白上的所述核酸条形码序列相互靠近；
将所述核酸条形码序列偶联的蛋白质群体包封在多个离散实体中，使得相互作用蛋白(若存在)共同包封；
使用微流控装置将所述多个第一离散实体之一的内容物与足以使第二核酸条形码序列并入到所述相互作用蛋白(若存在)上的所述核酸条形码序列或其扩增产物中的试剂组合在离散实体中；并且
使所述离散实体经受足以使第二核酸条形码序列并入到所述相互作用蛋白(若存在)上的所述核酸条形码序列或其扩增产物中的条件。
365.根据364所述的方法，其中所述群体使用噬菌体展示、核糖体展示和mRNA展示中的一种或多种制备。
366.根据364-365中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
367.根据364-366中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
368.根据364-367中任一项所述的方法，其中纯化步骤用于在包封之前去除非相互作用蛋白。
369.根据364-368中任一项所述的方法，其包括基于离散实体内的独特第二核酸条形码序列或其扩增产物的数量，相对于非相互作用蛋白鉴定相互作用蛋白。
370.根据364-369中任一项所述的方法，其中所述相互作用是特异性结合相互作用。
371.一种确定分子、分子复合物和/或结构内存在的表位的方法，所述方法包括：
使多个分子、分子复合物和/或结构与各自对表位有特异性的多种亲和试剂，在足以使所述亲和试剂与其各自的表位(存在于所述分子、分子复合物和/或结构中时)特异性结合的条件下接触，其中每一种所述亲和试剂均包含与之偶联的标识所述亲和试剂的表位特异性的第一核酸条形码序列；
将与一种或多种所述亲和试剂特异性结合的分子、分子复合物和/或结构包封在离散实体中；
将第二核酸条形码序列并入到所述第一核酸条形码序列或其扩增产物中，其中所述第二核酸条形码序列独特地标识所述离散实体；并且
对包含第二核酸条形码序列的所述第一核酸条形码序列或其扩增产物测序以鉴定所述分子、分子复合物和/或结构上存在的所述表位。
372.根据371所述的方法，其中所述表位包含翻译后修饰或剪接变异。
373.根据371或372所述的方法，其包括在条形码化或测序之前使用免疫沉淀富集与一个或多个表位特异性结合的亲和试剂。
374.根据371-373中任一项所述的方法，其中所述亲和试剂为抗体。
375.根据371-374中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
376.一种测定样品中亲和试剂的数量的方法，所述方法包括：
使怀疑含有一个或多个分子靶标的样品与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包含含核酸条形码序列的寡核苷酸，所述核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性，其中所述亲和试剂和所述寡核苷酸之一或两者包含独特地标识所述多种亲和试剂中的每一种的独特分子标识符(UMI)；并且
使用所述UMI测定所述样品中亲和试剂的数量。
377.根据376所述的方法，其包括扩增所述核酸条形码序列，其中所述UMI用于校正扩增偏差。
378.根据377所述的方法，其中所述扩增在一个或多个微滴中进行。
379.根据376-378中任一项所述的方法，其中所述亲和试剂不是抗体。
380.一种条形码化经标记的亲和试剂的方法，所述方法包括：
使含有一个或多个分子靶标的样品与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包括含第一核酸条形码序列的寡核苷酸，第一核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性；
从所述样品中分离所述一个或多个分子靶标；
将第二核酸条形码序列并入到所述寡核苷酸或其扩增产物中，其中所述第二核酸条形码序列独特地标识随所述一个或多个分子靶标分离的亲和试剂；并且
为其中并入了所述第二核酸条形码序列的所述寡核苷酸或其扩增产物测序以鉴定所述多种亲和试剂中的哪一种与所述样品中的所述一个或多个分子靶标结合。
381.根据380所述的方法，其中所述一个或多个分子靶标由一个或多个细胞组成。
382.根据381所述的方法，其中所述分离包括将单个细胞分配到单个孔中。
383.根据381所述的方法，其中所述分离包括使用微流控细胞捕获装置分离单个细胞。
384.一种用于鉴定一个或多个细胞中的基因修饰的方法，所述方法包括：
向多个细胞中引入一种或多种基因修饰；
鉴定由于向所述多个细胞中引入所述一种或多种基因修饰而产生的一种或多种细胞表型；
分离离散实体中的所述每个细胞并选择性扩增包含所述一种或多种基因修饰的DNA的一个或多个区域；
将核酸条形码序列并入到包含所述一种或多种基因修饰的所述扩增DNA或其扩增产物中，其中所述核酸条形码序列将所述一种或多种基因修饰标识为源于单个细胞；
对包含所述一种或多种基因修饰的所述扩增DNA或其扩增产物测序以鉴定具有所述一种或多种细胞表型的所述细胞中的所述一种或多种基因修饰。
385.根据384所述的方法，其中所述选择性扩增和并入使用SOEing PCR进行。
386.根据384-385中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
387.根据384-386中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
388.一种用于条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂和来自单个细胞的RNA的方法，所述方法包括：
使多个细胞与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包括含第一核酸条形码序列的寡核苷酸，所述第一核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性；
将所述多个细胞包封在离散实体中，使得每个离散实体包含不超过一个细胞；
裂解所述离散实体中的所述多个细胞；并且
向含有所述裂解细胞的所述离散实体中引入第二核酸条形码序列和足以使RNA逆转录、cDNA产物条形码化和扩增及所述第二核酸条形码序列并入到包含第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸中的试剂。
389.根据388所述的方法，其包括将独特分子标识符(UMI)并入到所述裂解细胞的RNA分子中。
390.根据388或389所述的方法，其中包含第一核酸条形码序列的所述寡核苷酸各自包含独特分子标识符(UMI)。
391.根据388-390中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
392.根据388-391中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或引入。
393.根据388-391中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或引入。
394.根据388-391中任一项所述的方法，其中所述引入是根据137-139或154-166中任一项。
395.根据388-391中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
396.根据388-391中任一项所述的方法，其中使用167-172中任一项所述的微流控装置混合所述离散实体的组分。
397.根据388-391中任一项所述的方法，其中使用含配体，例如生物素或硫醇部分的寡核苷酸引物进行所述扩增。
398.根据388-397中任一项所述的方法，其中所述亲和试剂为抗体。
399.一种用于条形码化并扩增寡核苷酸偶联的亲和试剂和来自单个细胞的RNA的方法，所述方法包括：
使多个细胞与多种亲和试剂接触，其中每种所述亲和试剂对分子靶标均有特异性并且包括含第一核酸条形码序列的寡核苷酸，所述第一核酸条形码序列标识所述亲和试剂的特异性；
将所述多个细胞包封在多个第一离散实体中，使得每个第一离散实体包含不超过一个细胞；
裂解所述第一离散实体中的所述多个细胞；
在多个第二离散实体中提供多个第二核酸条形码序列；
将每个所述第一离散实体与一个所述第二离散实体组合以在第一微流控装置中形成第三离散实体，其中所述第三离散实体包含足以使RNA逆转录为cDNA产物的试剂；并且
利用第二微流控装置向所述第三离散实体中引入足以条形码化并扩增cDNA产物并且使所述第二核酸条形码序列并入到包含第一核酸条形码序列或其扩增产物的所述寡核苷酸中的试剂。
400.根据399所述的方法，其包括将独特分子标识符(UMI)并入到所述裂解细胞的RNA分子中。
401.根据399或400所述的方法，其中所述第一和第二微流控装置不同。
402.根据399或400所述的方法，其中所述第一和第二微流控装置不同。
403.根据399或400所述的方法，其中包含第一核酸条形码序列的所述寡核苷酸各自包含独特分子标识符(UMI)。
404.根据399-390中任一项所述的方法，其中所述离散实体为微滴。
405.根据399-404中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据1-95中任一项制备或引入。
406.根据399-404中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码序列或所述UMI根据96-120或130-136中任一项制备或引入。
407.根据399-404中任一项所述的方法，其中所述引入是根据137-139或154-166中任一项。
408.根据399-404中任一项所述的方法，其中所述方法至少部分使用144-153中任一项所述的微流控装置进行。
409.根据399-404中任一项所述的方法，其中使用167-172中任一项所述的微流控装置混合所述离散实体的组分。
410.根据399-404中任一项所述的方法，其中使用含配体，例如生物素或硫醇部分的寡核苷酸引物进行所述扩增。
411.根据399-410中任一项所述的方法，其中所述亲和试剂为抗体。
412.一种制备用于测序的条形码化DNA的方法，所述方法包括：
使DNA片段化为多个片段，所述多个片段包含5’末端、3’末端和内部片段；
将所述多个片段连同固相支持体一起包封在一个或多个离散实体中；
使所述5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上；
使所述内部片段与可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端分离；并且
释放可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端。
413.根据412所述的方法，其中所述片段化包括物理剪切。
414.根据412所述的方法，其中所述片段化包括用一种或多种酶进行酶促片段化。
415.根据412-414中任一项所述的方法，其中所述固相支持体为珠粒。
416.根据415所述的方法，其中所述珠粒为磁珠。
417.根据412-416中任一项所述的方法，其包括使可逆地固定在所述固相支持体上的所述5’末端和/或3’末端经受酶促修饰。
418.根据417所述的方法，其中所述酶促修饰选自限制性酶切、连接和聚腺苷酸化。
419.根据412-418中任一项所述的方法，其中所述片段化发生在使所述DNA的5’末端和/或3’末端可逆地固定在所述固相支持体上之后。
420.根据412-419中任一项所述的方法，其中所述一个或多个离散实体为微滴。
421.一种用于使用条形码为测序读段分组的方法，所述方法包括：
对包含核酸条形码序列的多个核酸分子测序以提供测序读段，其中所述多个核酸分子包括源于相同和不同离散实体的核酸分子；
使用汉明或莱文斯坦距离标准按核酸条形码序列为所述测序读段分组；
使用并入到所述测序读段中的一个或多个附加条形码或独特分子标识符(UMI)的序列在统计上确定源于相同离散实体的条形码组；
组合源于相同离散实体的条形码组的读段；并且
去除每个测序读段的条形码部分并使用剩余部分做进一步分析。
422.一种由条形码化核酸文库制备序列文库的方法，所述方法包括：
生成条形码化核酸的第一文库；
由所述第一文库制备测序文库；
储存所述第一文库；并且
由所述第一文库制备第二测序文库。
423.根据422所述的方法，其中所述第一文库包含可溶性核酸。
424.根据422所述的方法，其中所述第一文库包含连接至固相支持体的核酸。
425.根据424所述的方法，其中所述固相支持体包括一个或多个珠粒。
426.根据422-425中任一项所述的方法，其包括通过荧光激活细胞分选术(FACS)、PCR激活细胞分选术(PACS)或磁激活细胞分选术(MACS)中的一种或多种来分选所述珠粒。
427.根据422-426中任一项所述的方法，其中通过用标记引物扩增所述文库的核酸并用对所述标记引物的标记具有特异性结合亲和力的亲和试剂分离所述扩增产物来纯化所述第一文库用于储存和/或附加处理。
428.根据427所述的方法，其中所述标记为生物素并且所述亲和试剂为链霉亲和素。
429.根据428所述的方法，其中所述链霉亲和素涂在一个或多个珠粒上。
430.一种由条形码化核酸文库制备序列文库的方法，所述方法包括：
生成条形码化核酸文库，其中所述文库包含源于多个细胞的核酸分子的序列；
由所述文库获得序列信息；
使用所述序列信息设计能够选择性扩增包含源于特定细胞的序列的条形码化核酸的引物；并且
选择性扩增和分析包含源于特定细胞的序列的所述条形码化核酸。
431.根据430所述的方法，其中能够选择性扩增包含源于特定细胞的序列的条形码化核酸的所述引物包含由先前分析条形码化核酸或与之互补的序列的文库获得的核酸条形码序列。
432.一种分析条形码化序列文库的方法，所述方法包括：
生成条形码化核酸文库；
以第一覆盖深度下对所述文库测序以获得关于所述文库中的多个条形码组的信息；
分析关于所述文库中的所述多个条形码组的信息以鉴定用于以更深的第二覆盖深度测序的条形码组子集；并且
富集所述条形码组子集的所述核酸以生成用于以更深的第二覆盖深度测序的靶向文库。
433.根据432所述的方法，其中所述条形码组子集的核酸与一个或多个珠粒结合，并且其中所述富集包括使与所述条形码组子集中的一个的已知条形码互补的标记探针杂交并且使用所述标记探针分选所述珠粒。
434.根据433所述的方法，其中所述分选是通过荧光激活细胞分选术(FACS)。
435.根据432所述的方法，其中所述富集包括利用与所述条形码组子集中的特定条形码序列杂交的引物在微流控液滴中进行PCR激活分选术，从而分选所述条形码组子集的所述核酸。
436.根据435所述的方法，其中所述条形码组子集的核酸与一个或多个珠粒结合。
437.根据432所述的方法，其中所述富集包括利用与所述条形码组子集中的特定条形码序列杂交的引物，并且使用所述引物扩增所述条形码组子集的核酸。
438.一种用于分析组织的方法，所述方法包括：
使组织解聚成多个细胞或细胞聚集体；
使用根据1-437所述的一种或多种方法和或装置分析所述多个细胞或细胞聚集体的基因组、转录组和/或蛋白质组以获得关于所述组织的异质性或同质性的信息。
439.根据438所述的方法，其中所述组织包括实体组织。
440.根据439所述的方法，其中所述实体组织选自肺、心脏、肾脏和肿瘤组织。
441.根据439所述的方法，其中所述组织包括悬浮细胞或细胞聚集体。
442.根据441所述的方法，其中所述悬浮细胞或细胞聚集体包含血细胞、细胞培养细胞和/或干细胞。
443.一种用于核酸的组合条形码化的方法，所述方法包括：
将核酸靶分子包封在离散实体中；
向所述离散实体中引入足以使所述核酸靶分子片段化并且使核酸条形码序列并入到所述片段中的试剂，其中所述试剂包含多个独特核酸条形码序列；
孵育所述离散实体以片段化所述核酸靶分子并且将所述多个独特核酸条形码序列中的第一个并入到第一片段中而将所述独特核酸条形码序列中的第二个并入到第二片段中。
实施例
实施例1(预言性)：通过数字滚环扩增(RCA)在液滴中生成ssDNA条形码。
首先通过CircLigase环化除保守序列外还包含一部分连续或非连续简并碱基的ssDNA寡核苷酸集合并用外切核酸酶消化以去除未环化的寡核苷酸。然后通过有限稀释使环化寡核苷酸(CO)随DNA聚合酶如Phi29X(或类似的)和滚环扩增(RCA)所必需的试剂一起包封在液滴中。除RCA试剂外，还包括限制酶和与CO具有已知同源性的3’封端寡核苷酸，使得寡核苷酸与RCA产物杂交重新构成被限制酶所识别的dsDNA结构。在液滴中孵育期间，扩增和消化同时和/或相继发生，使得产物是与CO具有序列同源性的主要为线性的ssDNA集合。图10中示意性地描绘了这个过程。
材料/方法：商业上合成了长达150bp的ssDNA寡核苷酸并且除以下的一种或多种以外，还至少含有用作RCA引物结合位点的序列：
(a)一部分连续或非连续简并碱基(条形码)；
(b)用作引物结合位点的序列，其重新构成被限制性内切核酸酶所识别的dsDNA结构；
(c)一个或多个通过甲基化修饰的碱基；
(d)一个或多个为锁核酸的碱基；
(e)对于分子生物学测定很重要的其它序列，包括：
a.多聚腺苷酸序列，使得多聚胸苷酸条形码可用作逆转录引物，
b.适于PCR或连接链式反应(LCR)的引物结合的一部分已知序列，
c.用作载入Tn5转座酶内的识别序列的已知同源性部分，
使ssDNA寡核苷酸在标准反应缓冲液中与来自于Epicentre的CircLigase II孵育以使寡核苷酸环化。通过外切核酸酶处理消化未环化的寡核苷酸并且通过标准方法纯化环化寡核苷酸。使环化ssDNA包封在具有滚环扩增和限制性酶切所必需的试剂的液滴中。试剂包括：
(a)合适的缓冲液如Phi29反应缓冲液(NEB)或CutSmart缓冲液(NEB)；
(b)牛血清白蛋白(BSA)；
(c)DNA聚合酶如Phi29或适于等温RCA的类似聚合酶；
(d)dNTP；
(e)限制性内切核酸酶；
(f)与环化ssDNA具有同源性，用作DNA合成引物的寡核苷酸；
(g)与环化ssDNA具有同源性，重新构成被限制性内切核酸酶识别的dsDNA序列的寡核苷酸。这种寡核苷酸可按以下方式进行修饰：
a.并入3’修饰以阻断DNA合成，如双脱氧碱基、3’间隔区或锁核酸，
b.并入3’/5’荧光团和/或3’/5’淬灭剂以监测裂解；和
(h)与环化ssDNA具有同源性，重新构成用于载入Tn5转座酶内的功能dsDNA元件的寡核苷酸。
反应在30℃下孵育至少60分钟，接着在37℃或更高温度下孵育至少15分钟。任选地，在两次孵育间期可升温至65℃持续10分钟以灭活Phi29聚合酶。
可选地，该过程可以分两步进行，其中先进行RCA，其次再进行限制性切割：
(a)使得小滴仅含环化ssDNA和RCA所必需的试剂。在30℃下孵育小滴至少60分钟，接着在65℃下加热10分钟。
(b)将限制性内切核酸酶和重新构成切割位点的寡核苷酸和/或重新构成Tn5负载位点的寡核苷酸皮量注入到每个液滴内并在37℃下孵育至少15分钟。
实施例2(预言性)：通过数字PCR在液滴中生成dsDNA条形码及其在连接-PCR中的用途。
将除保守序列外还包含一部分连续或非连续简并碱基的ssDNA寡核苷酸(条形码)集合在有限稀释下包封在液滴中并通过PCR扩增以产生dsDNA条形码。然后使小滴与另一含DNA或RNA核酸的小滴合并并且使用与dsDNA条形码具有同源性的引物，通过连接-pcr或连接-rtpcr将dsDNA条形码剪接到所关注的DNA/RNA上。图11中示意性地描绘了这个过程。
材料/方法：商业上合成了长达100bp的ssDNA寡核苷酸并且除以下的一种或多种以外，还至少含有用作PCR的引物结合位点的一个或多个序列：
(a)一部分连续或非连续简并碱基(条形码)；
(b)用作引物结合位点的序列，其重新构成被限制性内切核酸酶所识别的dsDNA结构；
(c)一个或多个通过甲基化修饰的碱基；
(d)一个或多个为锁核酸的碱基；
(e)一个或多个为核糖核苷酸的碱基；
(f)对于分子生物学测定很重要的其它序列，包括：
a.多聚腺苷酸序列，使得多聚胸苷酸条形码可用作逆转录引物，
b.适于PCR或连接链式反应(LCR)的引物结合的一部分已知序列。
ssDNA寡核苷酸包封在具有PCR所必需的试剂的液滴中，包括用作引物的一个或多个寡核苷酸。引物含有以下的一种或多种：
(a)一个或多个通过甲基化修饰的碱基；
(b)一个或多个为锁核酸的碱基；
(c)一个或多个为核糖核苷酸的碱基；
(d)5’生物素化。
这种PCR反应的产物是含有称为条形码的dsDNA片段的液滴。
首先通过微流控操纵使含有PCR扩增条形码液滴与一群单独的含有可源自单个哺乳动物细胞DNA或RNA的小滴配对。用“配对”意指使含有条形码的小滴和含有DNA和/或RNA的小滴群体流过微流控装置，微流控装置将小滴分成含有指定比率的条形码和DNA/RNA小滴的组。
然后通过电场使这些组的配对小滴与单独的小滴合并，单独的小滴除了以下之外，还含有逆转录和PCR所必需的标准试剂的：用作PCR引物并且与dsDNA条形码含有序列同源性的至少一个寡核苷酸。同源性应足以使通过引物靶标扩增的序列与条形码能够进行连接-PCR。
来自上一步的液滴在标准条件下进行热循环，使得每个小滴内的DNA/RNA产物通过连接-PCR扩增并与每个小滴内存在的dsDNA条形码连接。
实施例3(预言性)：用于全转录组扩增和mRNA分子条形码化的OneStep SMARTer+PCR(SMARTONE)。
下面参考图12描述了全转录组扩增和mRNA分子条形码化的方法。SMARTer技术利用一些逆转录酶的末端转移酶活性，其中向cDNA的3’末端，称为dC尾(1)，添加几个胞嘧啶核苷酸。当逆转录反应中包括了在3’末端含有核糖鸟苷或LNA-鸟苷的特殊模板转换寡核苷酸(TSO)时，寡核苷酸将与dC尾杂交并用作逆转录的附加模板，使cDNA延长并且向3’末端添加互补TSO序列。另外，将六个碱基对的简并序列并入到TSO寡核苷酸的设计中，使得由于模板转换机制每个cDNA含有独特条形码(2)，这些条形码称为独特分子标识符(UMI)。UMI用于在下游分析中准确量化mRNA拷贝数并且对于转录谱分析非常重要。重要的是，因为TSO寡核苷酸中的保守性序列被添加到所有cDNA上，所以其可以用作通过PCR进行全转录组扩增的常用引发位点(4)。
本文描述的方法是一步、单管反应中SMART和PCR的联合过程，称为SMARTONE。联合、一步方案也可以在微流控小滴内部进行以使得单细胞转录组的一步法扩增成为可能。
材料/方法：将来自一个或多个细胞的细胞裂解物或纯化的总RNA与dNTP和引物混合，除以下的一种或多种外，引物还含有至少多聚胸苷酸序列：
(a)一部分连续或非连续简并碱基；
(b)一个或多个通过甲基化修饰的碱基；
(c)一个或多个为锁核酸的碱基；
(d)一个或多个为核糖核苷酸的碱基；
(e)5’生物素化；
(f)对于分子生物学测定很重要的其它序列，包括：
a.适于PCR或连接链式反应(LCR)的引物结合的一部分已知序列。
加热溶液至至少72℃持续至少3分钟。
将SMARTONE试剂引入溶液中，包括：
(a)由浓度介于10mM和100mM之间的常用PCR缓冲液如Tris-HCL、Tris-醋酸盐等组成的pH 7.0-8.0的缓冲溶液；
(b)100U至300U SuperScriptII逆转录酶(Invitrogen)；
(c)高保真DNA聚合酶；
(d)浓度介于50和100mM之间的KCl；
(e)浓度介于6和12mM之间的MgCl2；
(f)介于0.2和0.4uM之间的dNTP；
(g)介于2.5和7.5mM之间的DTT；
(h)10U RNaseOUT(Invitrogen)；
(i)1M的甜菜碱；
(j)1uM模板转换寡核苷酸(TSO)，除以下的一种或多种特征外，其还包括以三个或更多个鸟苷碱基结束的已知序列：
a.一部分包括独特分子标识符的连续或非连续简并碱基，
b.一个或多个通过甲基化修饰的碱基，
c.一个或多个为锁核酸的碱基，尤其是3’最末端的鸟苷碱基，
d.一个或多个为核糖核苷酸的碱基，尤其是3’最末端的第二和第三个鸟苷碱基，
e.5’生物素化，
f.对于分子生物学测定很重要的其它序列，包括：
i.适于PCR或连接链式反应(LCR)的引物结合的一部分已知序列
(k)1uM与模板转换寡核苷酸具有同源性的一种或多种寡核苷酸引物和/或多聚胸苷酸逆转录引物。
另外，可向反应中添加性能增强剂，包括：
(a)浓度为0.1％至5％w/v的PEG MW 6000；
(b)浓度为0.1％至5％v/v的吐温20(Tween 20)；和
(c)浓度高达250ug/mL的BSA。
用以下条件使反应进行热循环：
表1
Figure BDA0003744850070001721
实施例4(预言性)：液滴内生成标签化液滴文库。
在该方法中，使用实施例1、5或6的方法在小滴内生成条形码。然而，在这种实施方式中，产物不是ssDNA而是适于载入Tn5转座酶的转座子。除任选序列外，每个转座子还至少含有简并条形码和转座所必需的19个碱基对的保守区域。含有经扩增和消化的转座子的液滴然后与含有Tn5转座酶的液滴在适于将转座子载入转座酶内的缓冲液中合并。然后将该液滴群用于下游应用以使其它液滴中所含的DNA片段化和条形码化。
材料/方法：商业上合成了长达150bp的ssDNA寡核苷酸并且除以下的一种或多种以外，还含有至少用作RCA的引物结合位点的序列和用作载入Tn5转座酶内的识别序列的已知序列：
(a)一部分连续或非连续简并碱基(条形码)；
(b)用作引物结合位点的序列，其重新构成被限制性内切核酸酶所识别的dsDNA结构；
(c)一个或多个通过甲基化修饰的碱基；
(d)一个或多个为锁核酸的碱基；和
(e)对于分子生物学测定很重要的其它序列，包括适于PCR或连接链式反应(LCR)的引物结合的一部分已知序列。
使ssDNA寡核苷酸在标准反应缓冲液中与来自于Epicentre的CircLigase II孵育以使寡核苷酸环化。通过外切核酸酶处理消化未环化的寡核苷酸并且通过标准方法纯化环化寡核苷酸。
使环化ssDNA与滚环扩增和限制性酶切所必需的试剂包封在液滴中。试剂包括：
(a)合适的缓冲液如Phi29反应缓冲液(NEB)或CutSmart缓冲液(NEB)；
(b)BSA；
(c)DNA聚合酶如Phi29或适于等温RCA的类似聚合酶；
(d)dNTP；
(e)限制性内切核酸酶；
(f)与环化ssDNA具有同源性，用作DNA合成的引物结合位点的寡核苷酸；
(g)与环化ssDNA具有同源性，重新构成被限制性内切核酸酶识别的dsDNA序列的寡核苷酸。这种寡核苷酸可按以下方式进行修饰：
a.并入3’修饰以阻断DNA合成，如双脱氧碱基、3’间隔区或锁核酸，
b.并入3’/5’荧光团和/或3’/5’淬灭剂以监测裂解
(h)与环化ssDNA具有同源性，重新构成用于载入Tn5转座酶内的功能dsDNA元件的寡核苷酸。
反应在30℃下孵育至少60分钟，接着在37℃或更高温度下孵育至少15分钟。任选地，在两次孵育间期可升温至65℃持续10分钟以灭活Phi29聚合酶。
可选地，该过程可以分两步进行，其中先进行RCA，第二步再进行限制性切割：
(a)使得小滴仅含环化ssDNA和RCA所必需的试剂。在30℃下孵育小滴至少60分钟，接着在65℃下加热10分钟。
(b)将限制性内切核酸酶和重新构成切割位点的寡核苷酸和/或重新构成Tn5负载位点的寡核苷酸皮量注入到每个液滴内并在37℃下孵育至少15分钟。
皮量注入这些小滴或与含有以下物质的溶液合并：
(a)6uM Tn5转座酶；
(b)高达5％w/v的PEG MW 6000；
(c)高达5％v/v的吐温20；
(d)浓度高达250ug/mL的BSA；和
(e)浓度高达40％v/v的甘油。
实施例5(预言性)：通过转录链式反应(TCR)在液滴内生成ssDNA条形码
下面参考图13描述了通过TCR在液滴内生成ssDNA条形码的方法。通过有限稀释连同TCR试剂一起将除了包括T7 RNA聚合酶启动子区在内的保守序列外还含有一部分连续或非连续简并碱基的ssDNA寡核苷酸集合包封在小滴内(1)。T7 RNA聚合酶首先将ssDNA寡核苷酸的互补序列转录为几千个拷贝(2)。然后逆转录酶和特异性逆转录引物将每个RNA拷贝转化为cDNA，其是原始条形码的ssDNA拷贝。采用上面实施例3中描述的SMART技术使T7启动子序列连接至每个cDNA的末端(3)，从而使其用作T7 RNA聚合酶介导的转录的附加模板。在该过程结束时，用热量或RNA酶降解RNA组分，仅留下原始寡核苷酸的ssDNA拷贝(4)。
材料/方法：商业上合成了长达100bp的ssDNA寡核苷酸并且除以下的一种或多种以外，还至少含有一个或多个用作转录引发位点的序列：
(a)一部分连续或非连续简并碱基(条形码)；
(b)用作引物结合位点的序列，其重新构成被限制性内切核酸酶所识别的dsDNA结构；
(c)一个或多个通过甲基化修饰的碱基；
(d)一个或多个为锁核酸的碱基；
(e)一个或多个为核糖核苷酸的碱基；
(f)对于分子生物学测定很重要的其它序列，包括：
a.多聚腺苷酸序列，使得多聚胸苷酸条形码可用作逆转录引物，
b.适于PCR或连接链式反应(LCR)的引物结合的一部分已知序列。
将ssDNA寡核苷酸与TCR所必需的试剂包封在液滴中，包括：
(a)重新构成dsDNA T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)启动子并且也用作模板转换寡核苷酸(TSO)的寡核苷酸，其可以含有以下的一种或多种：
a.一个或多个通过甲基化修饰的碱基，
b一个或多个为锁核酸的碱基，尤其是3’最末端的鸟苷碱基，
c.一个或多个为核糖核苷酸的碱基，尤其是3’最末端的第二和第三个鸟苷碱基，
d.5’生物素化
(b)T7 RNA聚合酶；
(c)逆转录酶，如SuperScript II；
(d)脱氧核糖核苷酸(dNTP)；
(e)核糖核苷酸(rNTP)；
(f)杂化酶(热稳定性RNA酶H)；
(g)限制性内切核酸酶；
(h)与ssDNA具有同源性，用作通过逆转录酶进行cDNA合成的引物的寡核苷酸；
(i)与ssDNA具有同源性，重新构成被限制性内切核酸酶所识别的dsDNA序列的寡核苷酸。这种寡核苷酸可按以下方式进行修饰：
a.并入3’修饰以阻断DNA合成，如双脱氧碱基、3’间隔区或锁核酸，
b.并入3’/5’荧光团和/或3’/5’淬灭剂以监测裂解；
(j)与ssDNA具有同源性，重新构成用于载入Tn5转座酶内的功能dsDNA元件的寡核苷酸。
反应在42℃下孵育至少60分钟。可选地，可如下使反应热循环：
表2
Figure BDA0003744850070001771
最后，使反应温度升高到65℃以允许RNA降解。这种TCR反应的产物是含有称为条形码的dsDNA片段的液滴。可选地，该过程分两个单独的步骤进行，其中先进行TCR，第二步再进行限制性切割。
实施例6(预言性)：通过滚环转录链式反应(rcTCR)在液滴内生成ssDNA条形码
下面参考图14描述了通过滚环转录链式反应(rcTCR)在液滴内生成ssDNA条形码的方法。
首先通过CircLigase环化除了包括T7 RNA聚合酶启动子区在内的保守序列外还含有一部分连续或非连续简并碱基的ssDNA寡核苷酸集合并用外切核酸酶消化以去除未环化的寡核苷酸(1)。然后通过有限稀释使环化寡核苷酸(CO)与rcTCR试剂一起包封在液滴中。T7 RNA聚合酶首先转录CO的互补序列，产生包括几百至几千个CO反向互补序列的重复序列的长线性多联体(2)。然后逆转录酶和特异性逆转录引物沿着RNA多联体从几个位点逆转录以产生ssDNA长链(3)。使用附加引物在这些线性ssDNA产物内部重新构成T7启动子以引发转录并且产生更多的ssRNA模板(5)。最后，用热量或RNA酶H降解RNA组分并且并行或相继使用限制性酶切以将长ssDNA裂解成单个ssDNA条形码(6)。
材料/方法：商业上合成了长达100bp的ssDNA寡核苷酸并且除以下的一种或多种以外，还含有至少一个或多个用作转录引发位点的序列：
(a)一部分连续或非连续简并碱基(条形码)；
(b)用作引物结合位点的序列，其重新构成被限制性内切核酸酶所识别的dsDNA结构；
(c)一个或多个通过甲基化修饰的碱基；
(d)一个或多个为锁核酸的碱基；
(e)一个或多个为核糖核苷酸的碱基；
(f)对于分子生物学测定很重要的其它序列，包括：
a.多聚腺苷酸序列，使得多聚胸苷酸条形码可用作逆转录引物，
b.适于PCR或连接链式反应(LCR)的引物结合的一部分已知序列。
将ssDNA寡核苷酸在标准反应缓冲液中与来自于Epicentre的CircLigase II孵育以使寡核苷酸环化。通过外切核酸酶处理消化未环化的寡核苷酸并且通过标准方法纯化环化寡核苷酸
使环化ssDNA寡核苷酸与TCR所必需的试剂包封在液滴中，试剂包括：
(a)重新构成dsDNA T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)启动子并且的寡核苷酸，其可以含有以下的一种或多种：
a.一个或多个通过甲基化修饰的碱基，
b一个或多个为锁核酸的碱基，
c.一个或多个为核糖核苷酸的碱基，
d.5’生物素化，
(b)T7 RNA聚合酶；
(c)逆转录酶，如SuperScript II；
(d)脱氧核糖核苷酸(dNTP)；
(e)核糖核苷酸(rNTP)；
(f)杂化酶(热稳定性RNA酶H)；
(g)限制性内切核酸酶；
(h)与环化ssDNA具有同源性，用作通过逆转录酶进行cDNA合成的引物的寡核苷酸；
(i)与环化ssDNA具有同源性，重新构成被限制性内切核酸酶所识别的dsDNA序列的寡核苷酸。这种寡核苷酸可按以下方式进行修饰：
a.并入3’修饰以阻断DNA合成，如双脱氧碱基、3’间隔区或锁核酸，
b.并入3’/5’荧光团和/或3’/5’淬灭剂以监测裂解，
(j)与环化ssDNA具有同源性，重新构成用于载入Tn5转座酶内的功能dsDNA元件的寡核苷酸。
反应在42℃下孵育至少60分钟。可选地，可如下使反应热循环：
表3
Figure BDA0003744850070001801
最后，使反应温度升高到65℃以允许RNA降解。这种TCR反应的产物是含有称为条形码的dsDNA片段的液滴。可选地，该过程分两个单独的步骤进行，其中先进行rcTCR，第二步再进行限制性切割。
实施例7(预言性)：实施方式。
SMARTONE连接PCR：在这种方法中根据实施例1或2生成细胞条形码并通过SMARTONE(实施例3)的PCR步骤剪接到cDNA的5’和3’末端。在这种实施方式中在TSO寡聚核苷酸中并入UMI用于在分子水平条形码化mRNA。
cDNA末端标签和捕获(DEToC)：在这种方法中通过滚环扩增(RCA)生成细胞DNA条形码并用作逆转录引物，从而在单个步骤中使DNA条形码连接至每个cDNA。
DeToC+SMARTONE：在这种方法中通过滚环扩增(RCA)生成细胞DNA条形码并用作逆转录引物，从而在单个步骤中使DNA条形码连接至每个cDNA。另外，使用SMARTONE(实施例3)扩增条形码化转录组，包括或不包括UMI。
SMARTONE+转录组标签和捕获：在这种方法中使用SMARTONE扩增全转录组(UMI任选)。然后使含有全转录组的液滴与含有NextEra试剂的小滴合并并标签化。然后使这些小滴与含有根据实施例1或2生成的细胞条形码的小滴合并使用条形码作为引物，使用连接-PCR扩增标签化转录组。
OneStep全转录组标签和捕获：在该方法中根据实施例4制备标签化液滴文库并且使用SMARTONE(实施例3)进行扩增，使其与含全转录组的小滴合并。
虽然为了清楚理解的目的，通过说明和举例的方式相当详细地描述了前述发明，对于本领域的普通技术人员而言根据本公开的教导将显而易见的是，在不背离所附权利要求的精神或范围的前提下，可对其进行某些变化和修改。
实施例8：用于下一代测序的单个DNA模板的片段化和条形码化
大多数基因组包含数百万至数十亿个核酸碱基对，并且通常，获得最大量的关于基因组的信息需要对每个碱基对测序并了解在基因组规模上碱基如何连接在一起。然而，提供每个碱基最低成本的现有测序技术也获得了长度为几十个至几百个碱基对的“短”读段形式的序列。因此，当使用短读段技术对长分子或全基因组测序时，要将短读段缝合(stitch)成长读段，大量的生物信息学分析是有必要的。
当由短读段集合组装长分子或基因组时，组装的复杂性与文库中读段的数量呈指数改变，因为通常，通过查询每次迭代文库中的每个读段来确定最佳组装是唯一可能的。算法可用于尽可能智能且高效地进行这个过程，但是读段越小，要测试的读段数量越大，并且组装越困难。因此，用于增加读段长度的技术可以显著地简化重组任务并且使得能够回收短读段技术不易取得的信息，如单倍体型。
本文描述了允许对长达100kb的分子深度测序的技术。在这种称为单分子深度测序(SMDS)的技术中，使长达100kb的长的、单独分子包封在液滴中，扩增、片段化并条形码化(图1)。通过使用PCR或MDA扩增液滴内的每个分子，我们产生了单分子的许多拷贝，可对其测序以产生在PCR或测序中误差平均的“深度序列”集群。另外，通过使液滴内的分子片段化和条形码化，我们生成短读段，其可使用可用的、低成本技术测序，同时仍然具有聚集对应于长单分子的读段的能力，而不必依赖于极易失败的组装算法(图21)。
SMDS使用三个主要的分子生物学步骤：(1)单分子数字扩增(图22，步骤1)，(2)标签化以使分子片段化并连接通用扩增接头(图22，步骤2)和(3)以重叠延伸剪接PCR(SOE-PCR)条形码化以使条形码连接至标签化片段(图22，步骤3)。这些步骤中的每一个均使用单独的微流控装置进行，即对于步骤1为液滴发生器，对于步骤2为分裂-合并装置，并且对于步骤3为双液滴合并装置。另外，小心控制原始液滴、其分裂部分和与之合并的液滴的体积以确保核酸、必要试剂和酶的浓度在所需水平以产生提供最高质量数据的有效反应。
SMDS平台提供的数据呈普通序列数据的形式，除了除片段分子、接头等的序列外，还存在要添加到液滴内的分子上的条形码的序列，这容许对应于液滴内单分子的所有读段明显群集。条形码结构很重要，因为条形码用于使读段正确地群集为单分子组。条形码经化学合成(IDT)作为两侧为通用引发位点的随机因子(randomer)集合。条形码核酸分布在碱基对组成上相当一致，这是化学合成技术的典型的，图23，左上。条形码序列包含约15bp，其中存在约109种独特排列。在SMDS中，总计约100,000个分子同时测序，使得对这个空间的约0.001％取样。这个数字将大幅增加，但是可以增加条形码长度来补偿。同样，虽然在对大量分子测序时可以发生，但条形码使用两次的可能性较小。另外，排列空间取样的低密度允许选择相互具有最大汉明距离的序列，图23，右上。这确保即使特定条形码序列中有误差，也不大可能“突变”成另一条形码类别，相反，更有可能产生恰好包括具有突变条形码的一个读段的新组。另外，可能通过将突变条形码与所有其它条形码组做比较并且鉴定与之具有最高序列同源性，其最可能所属的一个条形码来将这些“孤儿(orphan)”条形码“采用”到集群中。
为测试该系统，对包括两种β-葡萄糖苷酶变体的许多拷贝的样品进行SMDS。
材料/方法：原材料-固定长度的已知PCR产物。
步骤I.包封并通过PCR扩增
(1)PCR混合物(总共100μL)
50μL Phusion 2x hotstart MM(NEB：M0536)
2μL引物(10μM)
XμL模板(至最终浓度0.003pM)
4μL PEG 6000(50％W/V)
4μL吐温20(50％V/V)
XμL H2O(最终体积100μL)
(2)将PCR混合物装载至30μmx35μm流动聚焦小滴制造器中。油泵以600μL/小时运行且水泵以500μL/小时运行约10分钟。将乳液收集在PCR管中并热循环：98℃3分钟，(98℃15秒，60℃20秒，72℃4分钟)，循环35次。
步骤I(替代性).通过MDA扩增(以下方案可用作上述步骤1的替代)。
(1)制备MDA混合物(来自Repli-G单细胞试剂盒的试剂-Qiagen产品目录号150343)
3μL D2缓冲液(1：11DTT和DLB)
4μL H2O和模板DNA
加热至65℃持续10分钟，然后添加
3ulμL终止缓冲液
14.5μL聚合酶缓冲液
1μL聚合酶
4.5μL H20
(2)将混合物装载至30μmx35μm流动聚焦小滴制造器中。油泵以600μL/小时运行且水泵以500μL/小时运行约10分钟。将乳液收集在PCR管中并在30℃下孵育6小时，接着在70℃下热灭活10分钟。
步骤II.小滴内模板的片段化(这个步骤使用来自NEBnext Ion Torrent文库制备试剂盒(E6285)的酶)并且在图16中有示意性描绘。
(1)制备片段化混合物(90μL)
10μL片段化酶缓冲液
7.5μL片段化酶混合物
72.5μL H2O
(2)将片段化混合物和热循环小滴装载至小滴合并装置中并以油：100μL/小时，间隔区：300μL/小时，小滴：100μL/小时、片段化酶混合物：100μL/小时运行。运行需要约50分钟。将乳液收集到PCR管中并在25℃下孵育15分钟，然后在70℃下孵育10分钟。
小滴合并装置获得注入小滴的1/10并将其与尺寸为注入小滴的9/10的新小滴合并以产生相同尺寸的新小滴。
可通过增加流速来缩短运行时间。
收集的小滴应与注入小滴尺寸大致相同，并且乳液总体积应为原始的约80-90％。
步骤III.小滴中通用接头的连接(这个步骤中的酶来自与步骤II相同的试剂盒)。这个步骤在图17中有示意性描绘。
(1)制备接头连接混合物(90μL)
10μL连接酶缓冲液
4μL通用接头(80μM原液)
10μL T4连接酶(来自试剂盒的酶，浓度未知)
2.5μL Bst Pol(来自试剂盒的酶，浓度未知)
73.5μL H2O
(2)将来自步骤II的小滴装载至注射器内并用接头连接混合物重复步骤II(2)。使所得乳液在25℃下孵育15分钟并在65℃下孵育5分钟。接头包括两个硫代磷酰化碱基的3’突出。
步骤II-III.(替代性)使用Tn5转座子标签化。这个替代步骤在图18中有描绘。
该步骤使用超活性Tn5转座子使接头片段化并同时将接头添加到DNA上(标签化)。Tn5转座子和接头可从Illumina Nextera试剂盒获得，或如Adey等人，“Rapid，Low-Input，Low-Bias Construction of Shotgun Fragment Libraries by High-Density in VitroTransposition”Genome Biology.2010，11：R119所述制备，其公开内容以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。
(1)制备标签化主要混合物(50μL)
25μL TD缓冲液
2μL PEG 6000(50％W/V)
2μL吐温20(50％V/V)
16μL H20
5μL酶
(2)将片段化混合物和热循环小滴装载至小滴合并装置内并以油：100μL/小时，间隔区：300μL/小时，小滴：100μL/小时、片段化酶混合物：100μL/小时运行。运行需要约50分钟。将乳液收集到PCR管中并在55℃下孵育10分钟，然后在70℃下孵育20分钟。
小滴合并装置获得注入小滴的1/10并将其与尺寸为注入小滴的9/10的新小滴合并以产生相同尺寸的新小滴。
可通过增加流速来缩短运行时间。
收集的小滴应与注入小滴尺寸相同，并且乳液总体积应为原始的约80-90％。
步骤IV.使用条形码大肠杆菌或条形码质粒进行的条形码的SOE-PCR。这个步骤在图19中有示意性描绘。
(1)制备SOE-PCR混合物(90μl)
50μL Platinum Multiplex PCR Mastermix(Invitrogen 4464268)
2μL引物A(10μM)
2μL引物B(10μM)
4μL引物C(0.1μM)(任选)
XμL携带条形码的大肠杆菌(最终浓度达2x106/mL)
4μL PEG 6000(50％W/V)
4μL吐温20(50％V/V)
XμL H2O(总体积达90μL)
条形码文库存在于大肠杆菌内的高拷贝数质粒上。这用于向每个小滴内引入高于一个拷贝的条形码以在更高的模板计数下启动PCR。使用质粒上的条形码相对于仅使用单拷贝条形码是任选的。
(2)将来自步骤III的小滴装载至小滴合并装置内并用SOE-PCR混合物重复步骤III(2)。使反应热循环，95℃5分钟，(95℃15秒，60℃60秒，72℃60秒)，循环22次，72℃5分钟。
(3)通过添加25μL 2，2-全氟-辛醇破坏乳液。
(4)使用DNA净化柱纯化DNA。
此时，DNA是片段、接头连接片段和条形码化片段的混合物。条形码化片段含有必要序列以在Illumina流动比色池上产生集群。可将该DNA混合物直接送至测序仪。
步骤IV(替代性)：使用扩增条形码小滴进行的条形码的SOE-PCR。
(1)制备SOE-PCR主要混合物
125μL Platinum Multiplex PCR Mastermix(Invitrogen 4464268)
5μL引物A+C(10μM)
5μL来自Illumina产品目录号(FC-131-1024)的缓冲液NT
5μL PEG 6000(50％W/V)
5μL吐温20(50％V/V)
5μL Bst 2.0聚合酶(NEB产品目录号M0538)
100μL H20
(2)将SOE PCR主要混合物、条形码小滴和来自步骤III的小滴装载至双小滴合并装置中并以油：700μL/小时，间隔区：150μL/小时，条形码小滴：35μL/小时，片段化DNA小滴：70μL/小时，SOE PCR主要混合物：600μL/小时运行。运行需要约50分钟。将乳液收集到PCR管中并且热循环，65℃5分钟，95℃2分钟，(95℃15秒，60℃60秒，72℃60秒)，循环8次，72℃5分钟。
(3)通过添加25μL 2，2-全氟-辛醇破坏乳液。
(4)使用DNA净化柱纯化DNA。
此时，DNA是片段、接头连接片段和条形码化片段的混合物。条形码化片段含有必要序列以在Illumina流动比色池上产生集群。可将DNA混合物直接送至测序仪。
步骤V.片段-条形码的PCR富集和用于测序的尺寸选择
(1)制备富集PCR混合物(100μL)
50μL Kapa 2x Hotstart Readymix(KapaBiosystems KK2601)
1μL引物P5(10μM)
1μL引物P7(10μM)(存在来自Illumina的P5和P7序列)
XμL来自步骤IV的DNA(总计1ng)
XμL H2O(至100μL)
热循环，98℃3分钟，(98℃10秒，60℃30秒，72℃45秒)，循环14次，72℃5分钟。
(2)使用琼脂糖凝胶(Agarose Gel)、AmpureXP珠粒(或可选地Pippin Prep)选择尺寸为400-1000bp的片段以提供易于进行测序的文库。图20提供了条形码化片段的示意图。
结果：为表征通过SMDS产生的数据，根据对其观测了特定条形码组尺寸的读段的数量绘制直方图。例如，由于孤儿条形码，如果未进行采用，则将存在大量对应一个读段的条形码组。观测到这些一个读段的条形码组的次数对于图23中一个的x轴值而言，是该图的y轴值。从该图可见，实际上存在相对大量的一个读段的条形码组，而且该直方图从尺寸为1至50的条形码组急剧下降。在50-250之间，观测到的属于这些组的读段的数量相对恒定，然后对于较大条形码组而言下降。这表明存在许多尚未取样达到饱和的大条形码组并且如果进行更多测序，则可以获取更多关于这些大组的有用数据。图23插图中根据条形码组ID编号绘制了读段的数量并且显示在条形码组间在从中获得的读段的数量上存在相对较大的变化。这可能部分是由于自然采样噪声，或另外地，是由于过程期间产生的偏差，使得一些条形码组比其它的包含样品中总读段的更大比例，因此，常常总会观测到更多。
为评估所述方法由条形码组准确重构序列的能力，使用从头组装仪(de novoassembler)组装每个条形码组的重叠群。组装后发现一些分子映射到两个模板，意味着在其中对它们进行加工的液滴很可能含有两个模板，如图24上方所示。这可能是由于微流控工作流程或热循环步骤过程中片段的双重包封或转移，在此期间可发生聚结。约三分之一的数据确信地映射到仅其中一个模板，表明液滴仅含单个分子。虽然多个分子有时可终止于单个液滴内，但可以通过在包封步骤期间稀释靶标而任意地降低这种发生的比率，导致对于每个填充液滴而言产生更多空的液滴。这样浪费试剂，但在每个液滴真正需要单个分子序列时，可能是可取的折衷。然而，即使在加工多个分子时，读段任然可按条形码分组，从而对于指定条形码组而言，提供需要重新组装成少量不同重叠群的短读段样品。虽然这可能并不总是可取的，但与目前的测序标准很相似，其中短读段集合来自于单个“集群”，其包括大量的原始片段。然而，在目前可用的测序方法的情形下组装集群比在使用目前描述的液滴条形码化时更具挑战性。因此，即使在这些情况下，在区室化体积内进行反应也应大大地简化重新组装。
在将从头组装仪应用于每个条形码组之后，获得所产生的重叠群集合，图24左下方绘制了其长度的直方图。以已知模板分子的长度为中心的两个尖峰在直方图中清晰可见，与表示比靶标更小或更大的重叠群的肩部一样。这些重叠群对应错误组装，其是由于测序误差或妨碍完美组装的不完全数据。这是进行从头组装时的已知挑战-这些算法常常失败-并且突出了使用条形码化对单分子深度测序的能力。随着对文库更深度的测序，这个直方图将会演化，可能会产生更高的峰值。
因为起始分子的序列是已知的，所以可能通过直接将其与已知参考做比较来评估组装的准确度，图24右下根据碱基位置的变化将其绘制为Phred评分。对于所有重新组装而言获得较高的平均Phred评分，这很可能是由于对于接触分子而言所获得的多次覆盖，从而允许校正扩增和测序误差。
实施例9：基因组片段的SMDS
为证明SMDS进行实际测序任务的实用性，用其对大肠杆菌基因组DNA的不同片段测序，图25。
材料/方法：将DNA片段化为约5-10kb长度，然后用SMDS进行加工。与实施例9中描述的试验系统截然不同，在这项试验中在条形码化步骤之前使用多重置换扩增来扩增靶标。MDA是SMDS的有力工具并且相对于PCR具有优势，因为它可以非特异性地扩增分子并且，还不需要热循环。另外，尽管在分子长度高于10kb时PCR的效率迅速降低，但MDA可以扩增长度＞10kb碱基的分子。在SMDS中，限制“读段长度”的主要因素通常是扩增步骤，以致通过从PCR转换为MDA，可以有效地增加该方法的读段长度。
对大肠杆菌DNA进行SMDS过程并且如同实施例8的双模板实验一样进行类似的生物信息学分析，使条形码组集群，去除取样太稀少的组，并以足够取样对所述组进行从头组装。
结果：图25左侧提供了所得片段长度分布的直方图。该直方图从5-8kb相对较宽且恒定，证明这些长度得到充分体现。然而，在对应多次观测到的重叠群的数据中存在一些尖峰。这些重叠群可能是由于过程期间在文库制备或液滴合并上的偏差，产生偏差文库，其中这些重叠群比其它预期的存在频率更高。然而，直方图显示用所述方法对大量长分子测序。为确定序列是否准确，将其与参考大肠杆菌基因组做比较以进行序列相似性计算。发现约400个分子未映射到所述基因组，可能代表来自其它来源的污染DNA，并且约1000个分子是与大肠杆菌的匹配。这证明用SMDS的MDA是准确地对比用PCR可以产生的更长的分子测序的有效且有力的方式。
实施例10：用单细胞液滴条形码化对配对抗体重链和轻链测序
关联单细胞内的特定序列在抗体或T细胞库的测序中很重要的实施例。抗体和T细胞受体由两种结合在一起的蛋白质组成，两种蛋白质各自单独翻译。在抗体中，重链和轻链组装在一起，使得抗体的结合口袋处于连接两条链的折叠中。表征人类库对于研究自身免疫性疾病和鉴定基于抗体的疗法很重要，但是因为库中存在大量B细胞，各自表达独特的抗体，并且因为获得关于每种抗体的详细信息需要对每个细胞的重链和轻链测序，所以具有挑战性。这用现有方法进行是有挑战性的，因为当细胞裂解时，其转录物可以扩散开并且与其它细胞的转录物混合，同样导致配对信息的损失。这可以通过在孔或微流控腔内分离单细胞来克服，但此类方法仅仅可扩展到几十至几百个细胞。
液滴SOEing技术提供了将单细胞内的不同序列连接在一起的能力和使用液滴条形码化对数百万个单细胞进行此举的能力，图26。在这种方法中，将B细胞与裂解试剂负载至液滴中，并裂解。然后将其与条形码液滴和含有SOE-PCR的必要试剂的液滴合并。正如SMDS中一样，条形码液滴含有独特条形码的许多拷贝。这允许使用PCR反应使条形码连接至细胞的重链和轻链，使得可以单独地对读段测序，但是之后基于条形码用计算机集群。
为证明此的实用性，使用液滴SOEing技术对经历体细胞高频突变的Raji细胞系的抗体库测序。
通过图26所示的工作流程加工细胞，然后利用如SMDS过程中描述的类似生物信息学方法弃去低质量的条形码组。由此看来，可能测量这些基因的重链和轻链的突变频率，图27，并且确定突变围绕着已知高频突变的热点而集群，也如图所示。因为突变在细胞复制时积聚，所以突变分布提供了可用于生成后代树的信息，图27下方。另外，使用重链和轻链，可能跟踪特定突变体L177如何在轻链上分为两个谱系，L301和L303。
实施例11：用液滴条形码化对单细胞转录组测序
适用于对抗体的重链和轻链测序的条形码化策略可以推广为对全转录组测序。为实现这个目标，不使RT-PCR靶向仅两个抗体基因，可以利用一种非特异性、全转录组扩增方法，如模板转换SMART。使用寡核苷酸-dT引物，可能与真核细胞内所有mRNA转录物的多聚腺苷酸化尾部杂交。使用模板转换机制，可以使UMI连接至cDNA模板并且可以扩增cDNA模板，如图28左上所示。此时，在cDNA合成期间添加的已知引物可用于使用SOE-PCR使条形码连接，如图28下方所示。这可以通过使单细胞包封在液滴内，使其裂解并使其那些液滴与含有条形码序列和RT-PCR试剂的液滴合并来实现，如图28右侧所示。
因为哺乳动物细胞的裂解物经蛋白酶消化并稀释至合适的浓度，所以大多数酶促反应在液滴中是有效的。当在液滴内进行SMART条形码化时，观察到有效反应，正如cDNA产物的生物分析仪轨迹所说明的那样，轨迹较宽并且集中在1500个碱基对周围，图29。另外，当根据每一百万个映射片段(FPKM)，外显子每千碱基的片段数绘制基因数量时，遵循该哺乳动物细胞类型的预期、健康分布，表明mRNA被有效地合成为正确长度的cDNA，如图29下方所示。
前述内容仅说明了本发明的原理。将认识到本领域的技术人员将能够设计不同排列，虽然本文未明确描述或示出，但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围之内。此外，本文叙述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理，而不限制此类具体叙述的实例和条件。而且，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有声明均旨在涵盖其结构和功能等效案。另外，其意图是此类等效案包括目前已知的等效案和未来开发的等效案，即不管其结构如何，开发的执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围并非旨在限于本文示出和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims (16)

1.一种向离散实体中引入多个拷贝的核酸条形码序列的方法，所述方法包括：
将多个核酸靶分子包封在离散实体中；
使所述离散实体流入接合点；
使包含珠粒的液流流向接合点，所述珠粒包含多个拷贝的核酸条形码；
使所述离散实体合并到所述液流中；并且
诱导所述液流破裂包含多个核酸靶分子的离散实体和包含多个拷贝的核酸条形码的珠粒。
2.如权利要求1所述的方法，其中将多个核酸靶分子包封在离散实体中包括在中间产物液滴中裂解细胞，从而将细胞的核酸靶分子包封在中间产物液滴中。
3.如权利要求1所述的方法，其中多个拷贝的第一核酸条形码锚定在至少一个包括珠粒的固体衬底上。
4.如权利要求3所述的方法，其中合并包括使用电场来将离散实体合并成连续不分节的试剂流。
5.如权利要求1所述的方法，还包括使连续不分节的试剂流在产生滴落的条件下流动，同时将离散实体合并成试剂流。
6.如权利要求1所述的方法，还包括使连续不分节的试剂流在喷射条件下流动，同时将离散实体合并成连续不分节的试剂流。
7.如权利要求1所述的方法，还包括使第一核酸条形码的拷贝酶促并入到单个微滴中的核酸靶分子中，并且合成用第一核酸条形码标记的核酸靶分子的互补序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中合成互补序列包括扩增。
9.如权利要求7所述的方法，其中合成互补序列包括逆转录。
10.如权利要求7所述的方法，其中合成包括微滴内合成。
11.如权利要求1所述的方法，其中多个拷贝的第一条形码序列各自包括相应的独特分子标识符。
12.如权利要求1所述的方法，还包括在包封之前用独特分子标识符标记多个核酸靶分子。
13.如权利要求12所述的方法，其中第一核酸条形码的序列长度大于独特分子标识符。
14.如权利要求12所述的方法，还包括在包封之前扩增包括独特分子标识符的多个核酸靶分子。
15.如权利要求1所述的方法，还包括：
在接合点，使来自第一通道的离散实体与来自第二通道的连续不分节的试剂流的第一侧接触，并且使来自第三通道的载液与来自第二通道的连续不分节的试剂流接触。
16.如权利要求1所述的方法，还包括：
在使离散实体合并到连续不分节的试剂流中之前，使与接合点下游的连续不分节的试剂流接触的离散实体同向流动。
CN202210828875.5A 2015-02-04 2016-02-03 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序 Pending CN115011670A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562112075P 2015-02-04 2015-02-04
US62/112,075 2015-02-04
PCT/US2016/016444 WO2016126871A2 (en) 2015-02-04 2016-02-03 Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
CN201680020884.4A CN107530654A (zh) 2015-02-04 2016-02-03 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680020884.4A Division CN107530654A (zh) 2015-02-04 2016-02-03 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115011670A true CN115011670A (zh) 2022-09-06

Family

ID=56564869

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210828875.5A Pending CN115011670A (zh) 2015-02-04 2016-02-03 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序
CN201680020884.4A Pending CN107530654A (zh) 2015-02-04 2016-02-03 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680020884.4A Pending CN107530654A (zh) 2015-02-04 2016-02-03 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11111519B2 (zh)
EP (2) EP3253479B1 (zh)
JP (2) JP2018508198A (zh)
CN (2) CN115011670A (zh)
AU (2) AU2016215304B2 (zh)
CA (1) CA2974306A1 (zh)
HK (1) HK1248169A1 (zh)
WO (1) WO2016126871A2 (zh)

Families Citing this family (167)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6375230B2 (ja) 2012-02-27 2018-08-15 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 分子計数のための組成物およびキット
US10564147B2 (en) 2012-05-25 2020-02-18 The Regents Of The University Of California Microfluidic systems for particle trapping and separation using cavity acoustic transducers
CN104736725A (zh) 2012-08-13 2015-06-24 加利福尼亚大学董事会 用于检测生物组分的方法和系统
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014028537A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 10X Technologies, Inc. Microcapsule compositions and methods
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3862435A1 (en) 2013-02-08 2021-08-11 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
EP3597772A1 (en) 2013-04-17 2020-01-22 Agency For Science, Technology And Research Method for generating extended sequence reads
CN111662960B (zh) 2013-06-25 2024-04-12 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
AU2015243445B2 (en) 2014-04-10 2020-05-28 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
CN106795553B (zh) 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
EP3160654A4 (en) 2014-06-27 2017-11-15 The Regents of The University of California Pcr-activated sorting (pas)
GB201414177D0 (en) * 2014-08-11 2014-09-24 Sphere Fluidics Ltd Droplet Sorting
US10434507B2 (en) 2014-10-22 2019-10-08 The Regents Of The University Of California High definition microdroplet printer
CA2964472A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10900065B2 (en) 2014-11-14 2021-01-26 University Of Washington Methods and kits for labeling cellular molecules
EP3244992B1 (en) 2015-01-12 2023-03-08 10X Genomics, Inc. Processes for barcoding nucleic acids
EP3253479B1 (en) 2015-02-04 2022-09-21 The Regents of The University of California Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
BR112017018054A2 (pt) 2015-02-24 2018-07-24 10X Genomics Inc métodos para a cobertura de sequências de ácidos nucleicos direcionadas
EP3262407B1 (en) 2015-02-24 2023-08-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
DK3901281T3 (da) 2015-04-10 2023-01-23 Spatial Transcriptomics Ab Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver
MX2017013471A (es) * 2015-04-27 2018-08-01 Abvitro Llc Metodo de secuenciamiento, determinacion, apareamiento y validacion de agentes terapeuticos y antigenos especificos de enfermedades.
EP3337907A4 (en) * 2015-08-17 2019-01-02 The Regents of The University of California Microdroplet-based multiple displacement amplification (mda) methods and related compositions
US9862941B2 (en) 2015-10-14 2018-01-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Single cell microfluidic device
EP3374083B1 (en) * 2015-11-10 2021-01-06 Illumina, Inc. Inertial droplet generation and particle encapsulation
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
SG10202108763UA (en) 2015-12-04 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
SG11201806757XA (en) 2016-02-11 2018-09-27 10X Genomics Inc Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
WO2018057820A1 (en) 2016-09-21 2018-03-29 Predicine, Inc. Systems and methods for combined detection of genetic alterations
WO2018183796A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Predicine, Inc. Systems and methods for predicting and monitoring cancer therapy
US11702702B2 (en) 2016-04-15 2023-07-18 Predicine, Inc. Systems and methods for detecting genetic alterations
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
CN109563539A (zh) 2016-06-15 2019-04-02 慕尼黑路德维希马克西米利安斯大学 使用dna纳米技术的单分子检测或定量
EP3485215B1 (en) 2016-07-12 2023-06-07 Alexander Poltorak System and method for maintaining efficiency of a heat sink
JP6853523B2 (ja) * 2016-07-27 2021-03-31 国立大学法人京都大学 ヘリカーゼを用いたｐｃｒ
WO2018031691A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 The Regents Of The University Of California Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet
JP2019531091A (ja) 2016-09-15 2019-10-31 オーグメンタ・バイオワークス・インコーポレーテッド 免疫レパートリー配列増幅法および適用
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
WO2018067792A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 President And Fellows Of Harvard College Sequencing of bacteria or other species
WO2018071448A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 The Regents Of The University Of California Systems and methods to encapsulate and preserve organic matter for analysis
CA3032613A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Takara Bio Usa, Inc. Methods of producing amplified double stranded deoxyribonucleic acids and compositions and kits for use therein
EP3545104B1 (en) * 2016-11-23 2021-02-24 Université de Strasbourg Tandem barcoding of target molecules for their absolute quantification at single-entity resolution
AU2017382905A1 (en) * 2016-12-21 2019-07-04 The Regents Of The University Of California Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018140966A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
CN107083423B (zh) * 2017-03-27 2022-01-28 北京极客基因科技有限公司 一种药物靶点预测和药物全方面评价方法
US20210139941A1 (en) * 2017-04-14 2021-05-13 The Broad Institute, Inc. High-throughput screens for exploring biological functions of microscale biological systems
EP3625353B1 (en) 2017-05-18 2022-11-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
SG11201901822QA (en) 2017-05-26 2019-03-28 10X Genomics Inc Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN111148849A (zh) * 2017-05-26 2020-05-12 阿布维托有限责任公司 高通量多核苷酸文库测序和转录组分析
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2018227210A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 The Regents Of The University Of California High-efficiency encapsulation in droplets based on hydrodynamic vortices control
US11517901B2 (en) 2017-06-09 2022-12-06 The Regents Of The University Of California High-efficiency particle encapsulation in droplets with particle spacing and downstream droplet sorting
WO2018236918A1 (en) * 2017-06-20 2018-12-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. MDA USING A BALL OLIGONUCLEOTIDE
TWI637834B (zh) * 2017-07-11 2018-10-11 台灣奈米碳素股份有限公司 微流道裝置的製造方法及其結構
WO2019018446A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Fractal Heatsink Technologies, LLC SYSTEM AND METHOD FOR MULTI-FRACTAL THERMAL DISSIPATOR
EP3665280A4 (en) * 2017-08-10 2021-10-06 Metabiotech Corporation MARKING OF NUCLEIC ACID MOLECULES FROM SINGLE CELLS FOR PHASE-CONTROLLED SEQUENCING
US10549279B2 (en) 2017-08-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Devices having a plurality of droplet formation regions
CN111386351A (zh) 2017-09-22 2020-07-07 华盛顿大学 细胞分子的原位组合标记
WO2019067415A1 (en) * 2017-09-27 2019-04-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. DIGITAL AFFINITY LINK ASSAY
AU2018401700A1 (en) 2017-09-29 2020-04-09 The Regents Of The University Of California Method of generating monodisperse emulsions
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
WO2019075409A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 The Regents Of The University Of California ISOLATION AND IDENTIFICATION WITHOUT MICROFLUIDIC LABEL OF CELLS USING FLUORESCENCE LIFE IMAGING (FLIM)
WO2019079640A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Mission Bio, Inc. METHOD, SYSTEMS, AND DEVICE FOR HIGH-EFFICIENCY UNICELLULAR DNA SEQUENCING OF DROPLET MICROFLUIDS
US10501739B2 (en) 2017-10-18 2019-12-10 Mission Bio, Inc. Method, systems and apparatus for single cell analysis
US11745179B2 (en) 2017-10-20 2023-09-05 The Regents Of The University Of California Microfluidic systems and methods for lipoplex-mediated cell transfection
US11499127B2 (en) 2017-10-20 2022-11-15 The Regents Of The University Of California Multi-layered microfluidic systems for in vitro large-scale perfused capillary networks
WO2019083852A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. MICROFLUIDIC CHANNEL NETWORKS FOR PARTITIONING
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
EP3700672B1 (en) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3717661A1 (en) 2017-11-27 2020-10-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Rna printing and sequencing devices, methods, and systems
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
WO2019113235A1 (en) * 2017-12-06 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing nucleic acid molecules
WO2019118355A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
CN111556900A (zh) * 2017-12-22 2020-08-18 赛默飞世尔科技波罗的海封闭股份公司 包括胺的聚合酶链反应组合物
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
WO2019169028A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Transcriptome sequencing through random ligation
CN111836890A (zh) 2018-03-07 2020-10-27 威斯康星校友研究基金会 单细胞的高通量核酸谱分析
SG11202009889VA (en) 2018-04-06 2020-11-27 10X Genomics Inc Systems and methods for quality control in single cell processing
WO2019224219A1 (en) * 2018-05-22 2019-11-28 Universite De Strasbourg Absolute quantification of target molecules at single-entity resolution using tandem barcoding
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US20210261953A1 (en) * 2018-07-03 2021-08-26 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Method to perform high-throughput single cell genomic and phenotypic analyses
EP3818166A4 (en) * 2018-07-05 2022-03-30 AccuraGen Holdings Limited COMPOSITIONS AND METHODS FOR POLYMERASE CHAIN REACTION
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US20200048626A1 (en) * 2018-08-07 2020-02-13 Augmenta Bioworks, Inc. Methods for Making Gel Beads and Core and Shell Beads with a Cell
EP3837377A4 (en) 2018-08-17 2022-05-18 The Regents of University of California DROPLET FORMATION TRIGGERED BY MONODISPERSE PARTICLES FROM STEADY JETS
US20200056223A1 (en) * 2018-08-20 2020-02-20 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for cellular processing
EP3861134A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 Becton, Dickinson and Company Determining 5' transcript sequences
WO2020077017A2 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Augmenta Bioworks, Inc. Methods for isolating immune binding proteins
US11608524B1 (en) * 2018-10-25 2023-03-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of analyzing cells
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
US11268091B2 (en) 2018-12-13 2022-03-08 Dna Script Sas Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
CN111378557B (zh) 2018-12-26 2023-06-06 财团法人工业技术研究院 用于产生液珠的管状结构及液珠产生方法
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US20200232011A1 (en) * 2019-01-22 2020-07-23 Mission Bio Methods of nucleic acid detection and primer design
SG11202108788TA (en) 2019-02-12 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for processing nucleic acid molecules
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
WO2020183591A1 (en) * 2019-03-11 2020-09-17 Enplas Corporation Fluid handling method, and fluid handling device and fluid handling system used for the method
WO2020185791A1 (en) * 2019-03-11 2020-09-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
JP2022520669A (ja) * 2019-04-02 2022-03-31 ミッション バイオ インコーポレイテッド 核酸検出のための方法、システム、及び装置
EP3947673A4 (en) * 2019-04-02 2023-01-11 Mission Bio, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR PROTEOMIC PROFILING AND CHARACTERIZATION
EP3973074A4 (en) * 2019-05-22 2023-09-06 Mission Bio, Inc. METHOD AND DEVICE FOR SIMULTANEOUS TARGETED SEQUENCING OF DNA, RNA AND PROTEIN
WO2020252387A2 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 Ultima Genomics, Inc. Methods for accurate base calling using molecular barcodes
US20230212556A1 (en) * 2019-06-27 2023-07-06 Cell Microsystems, Inc. Systems and methods for associating single cell imaging with rna transcriptomics
WO2021003255A1 (en) * 2019-07-01 2021-01-07 Mission Bio Method and apparatus to normalize quantitative readouts in single-cell experiments
WO2021007724A1 (zh) * 2019-07-12 2021-01-21 深圳华大生命科学研究院 一种全基因组全流程微流控自动化建库方法和装置
WO2021016239A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
AU2020322027A1 (en) * 2019-07-31 2022-03-03 BioSkryb Genomics, Inc. Single cell analysis
AU2020325026A1 (en) * 2019-08-05 2022-03-17 Mission Bio, Inc. Method and apparatus for single-cell analysis for determining a cell trajectory
CA3150030A1 (en) * 2019-09-04 2021-03-11 Marion Francis SETLIFF METHODS OF IDENTIFYING ANTIGEN BINDING SPECIFICITY OF ANTIBODY
WO2021067286A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-08 Shield Diagnostics Corp. Devices for determining a target nucleic acid profile and methods of use thereof
JP2022550596A (ja) * 2019-10-05 2022-12-02 ミッション バイオ インコーポレイテッド シングルセルで同時に検出されるコピー数変動及び単一ヌクレオチド変動のための方法、システム、及び装置
EP4041310A1 (en) 2019-10-10 2022-08-17 1859, Inc. Methods and systems for microfluidic screening
US20220381781A1 (en) * 2019-10-16 2022-12-01 Georgia Tech Research Corporation Methods for ultrasensitive detection of protein and cellular biomarkers
CN110777048A (zh) * 2019-11-01 2020-02-11 上海市第六人民医院 一种高通量单外泌体分离装置
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
US20210205811A1 (en) * 2019-11-19 2021-07-08 10X Genomics, Inc. Methods and devices for sorting droplets and particles
WO2021128035A1 (zh) * 2019-12-25 2021-07-01 苏州绘真生物科技有限公司 高通量单细胞转录组测序方法及试剂盒
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11104961B2 (en) 2020-01-13 2021-08-31 Fluent Biosciences Inc. Single cell sequencing
EP4090328A4 (en) 2020-01-13 2024-02-14 Fluent Biosciences Inc EMULSION-BASED ACTIVE SCREENING
WO2021146166A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Fluent Biosciences Inc. Methods and systems for single cell gene profiling
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
EP4095256A4 (en) * 2020-01-23 2023-03-15 DGI Tech (Qing Dao) Co., Limited DROPLET MICROFLUIDIC-BASED SINGLE CELL SEQUENCING AND APPLICATIONS
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
WO2021188500A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Fluent Biosciences Inc. Multi-omic analysis in monodisperse droplets
CN111454942A (zh) * 2020-03-16 2020-07-28 张晓鲁 一种同一样品的转录组和基因组同时建立测序文库的构建方法
CN115997030A (zh) 2020-04-30 2023-04-21 德迈逊科技有限公司 用于大分子操作的装置和方法
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
GB202007059D0 (en) * 2020-05-13 2020-06-24 Univ Oxford Innovation Ltd Polynucleotide arrays
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
CN115867676A (zh) * 2020-05-29 2023-03-28 国立研究开发法人理化学研究所 细胞群的处理方法和细胞群中所含的基因的分析方法
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
GB202012730D0 (en) * 2020-08-14 2020-09-30 Cambridge Entpr Ltd Modular microfluidic devices, systems and methodds for total RNA analyses
WO2022099208A1 (en) * 2020-11-09 2022-05-12 The General Hospital Corporation High throughput microfluidics for analysis of immune cell activation
WO2022103712A1 (en) * 2020-11-13 2022-05-19 10X Genomics, Inc. Nano-partitions (encapsulated nucleic acid processing enzymes) for cell-lysis and multiple reactions in partition-based assays
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US20220243264A1 (en) * 2020-11-23 2022-08-04 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for amplifying rna
CN113322254B (zh) * 2021-01-06 2022-05-20 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 多靶点蛋白质-dna相互作用的研究方法和工具
CN114836838A (zh) * 2021-02-01 2022-08-02 南方医科大学 一种中通量单细胞拷贝数文库构建的方法及其应用
AU2022227563A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
WO2023044307A1 (en) * 2021-09-14 2023-03-23 Becton, Dickinson And Company Full length single cell rna sequencing
WO2023154816A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Mission Bio, Inc. Systems and methods of detecting merged droplets in single cell sequencing
DK202200230A1 (en) * 2022-03-21 2023-12-11 Samplix Aps Targeted enrichment of large dna molecules for long-read sequencing using facs or microfluidic partitioning
WO2023212223A1 (en) * 2022-04-28 2023-11-02 BioSkryb Genomics, Inc. Single cell multiomics

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08503854A (ja) 1992-11-30 1996-04-30 ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド 抗体のオリゴヌクレオチド複合体およびキレート化された放射性ヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチド複合体を用いる腫瘍部位の逐次ターゲッティング
US20020068357A1 (en) 1995-09-28 2002-06-06 Mathies Richard A. Miniaturized integrated nucleic acid processing and analysis device and method
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6319507B1 (en) 1997-05-02 2001-11-20 Kobo Products, Inc. Agar gel bead composition and method
DK1019496T3 (da) 1997-07-07 2005-01-10 Medical Res Council In vitro-sorteringsmetode
US6436677B1 (en) 2000-03-02 2002-08-20 Promega Corporation Method of reverse transcription
WO2003054524A1 (en) 2001-12-11 2003-07-03 Sau Lan Tang Staats Microfluidic devices and methods for two-dimensional separations
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
ES2338654T5 (es) 2003-01-29 2017-12-11 454 Life Sciences Corporation Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas
US7041481B2 (en) 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
US10533998B2 (en) * 2008-07-18 2020-01-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
DE10339452A1 (de) 2003-08-22 2005-03-17 Institut für Physikalische Hochtechnologie e.V. Vorrichtung und Verfahren zur Strukturierung von Flüssigkeiten
JP4630870B2 (ja) 2003-08-27 2011-02-09 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ 流体種の電子的制御
CA2540087A1 (en) 2003-09-26 2005-04-07 Circleamp, Inc. Amplification of polynucleotides by rolling circle amplification
EP1691792A4 (en) 2003-11-24 2008-05-28 Yeda Res & Dev COMPOSITIONS AND METHODS FOR IN VITRO / I SORTING OF MOLECULAR AND CELLULAR BANKS
KR100647282B1 (ko) 2003-12-24 2006-11-17 삼성전자주식회사 ＤＮＡ 마이크로어레이 스폿팅(Ｓｐｏｔｉｎｇ) 장치 및이를 이용한 스폿팅 방법
US20060201868A1 (en) 2005-03-11 2006-09-14 Simmons Blake A Methods and devices for high-throughput dielectrophoretic concentration
EP2660482B1 (en) 2005-08-22 2019-08-07 Life Technologies Corporation Vorrichtung, System und Verfahren unter Verwendung von nichtmischbaren Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Volumen
US8383059B2 (en) 2005-09-30 2013-02-26 University Of Utah Research Foundation Microfluidic interface for highly parallel addressing of sensing arrays
US9183349B2 (en) 2005-12-16 2015-11-10 Nextbio Sequence-centric scientific information management
WO2007081386A2 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use
US7998708B2 (en) 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US20080014589A1 (en) 2006-05-11 2008-01-17 Link Darren R Microfluidic devices and methods of use thereof
CA2653321A1 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Althea Technologies, Inc. Biochemical analysis of partitioned cells
CN101600966B (zh) 2006-06-02 2014-07-02 辉瑞产品公司 循环肿瘤细胞分析
WO2008076290A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
US8338166B2 (en) 2007-01-04 2012-12-25 Lawrence Livermore National Security, Llc Sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences in a complex mixture
WO2008109176A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
US8454906B2 (en) 2007-07-24 2013-06-04 The Regents Of The University Of California Microfabricated droplet generator for single molecule/cell genetic analysis in engineered monodispersed emulsions
US8268564B2 (en) 2007-09-26 2012-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and applications for stitched DNA barcodes
GB0720202D0 (en) * 2007-10-16 2007-11-28 Cambridge Entpr Ltd Microfluidic systems
WO2009092106A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 The Regents Of The University Of California Accurate and rapid micromixer for integrated microfluidic devices
EP2271657B1 (en) 2008-03-04 2017-03-01 Crystal Bioscience Inc. Gel microdrop composition and method of using the same
US9409177B2 (en) 2008-03-21 2016-08-09 Lawrence Livermore National Security, Llc Chip-based device for parallel sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences
US8852952B2 (en) 2008-05-03 2014-10-07 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of loading a droplet actuator
US20130084572A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Quantalife, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
WO2013016459A1 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Bio-Rad Laboratories, Inc. Breakage of an emulsion containing nucleic acid
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US20140179544A1 (en) 2012-09-07 2014-06-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions, systems and methods for droplet formation, spacing and detection
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
DK2977455T3 (da) 2009-06-15 2020-07-13 Complete Genomics Inc Fremgangsmåde til langfragmentaflæsnings-sekventering
EP4019977A1 (en) 2009-06-26 2022-06-29 President and Fellows of Harvard College Fluid injection
JP6155418B2 (ja) 2009-09-02 2017-07-05 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 多重エマルジョンの合体による、流体を混合するためのシステム
US8746285B2 (en) 2009-09-04 2014-06-10 Auburn University Programmable fluidic droplet generation
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
US9376713B2 (en) 2009-09-23 2016-06-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Label free detection of nucleic acid amplification
EP2957641B1 (en) 2009-10-15 2017-05-17 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US20120270739A1 (en) 2010-01-19 2012-10-25 Verinata Health, Inc. Method for sample analysis of aneuploidies in maternal samples
AU2013203624B2 (en) 2010-02-09 2015-06-25 General Electric Company Isothermal amplification of nucleic acid using a mixture of randomized primers and specific primers
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
CA2767114A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet transport system for detection
CA2767182C (en) 2010-03-25 2020-03-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
JP5573335B2 (ja) 2010-04-28 2014-08-20 株式会社島津製作所 磁性体粒子操作デバイス及び磁性体粒子操作方法
ES2539047T3 (es) 2010-06-10 2015-06-25 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Aparato y método para dispensar células o partículas confinadas en una gota en vuelo libre
US9650629B2 (en) 2010-07-07 2017-05-16 Roche Molecular Systems, Inc. Clonal pre-amplification in emulsion
CN103153466B (zh) 2010-07-22 2016-04-13 基因细胞生物系统有限公司 复合液体池
US9695390B2 (en) 2010-08-23 2017-07-04 President And Fellows Of Harvard College Acoustic waves in microfluidics
EP3447155A1 (en) 2010-09-30 2019-02-27 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2436444A1 (en) 2010-10-01 2012-04-04 Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Microfluidic device for production and collection of droplets of a fluid
DK2625320T3 (da) 2010-10-08 2019-07-01 Harvard College High-throughput enkeltcellestregkodning
US20120258870A1 (en) 2010-11-22 2012-10-11 The University Of Chicago Methods, Systems, and/or Use of Oligonucleotide Conjugates to Develop Panels for Use in Assays and Detections
DK2652155T3 (en) 2010-12-16 2017-02-13 Gigagen Inc Methods for Massive Parallel Analysis of Nucleic Acids in Single Cells
WO2012102663A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method of coupling binding agents to a substrate surface
US8765455B2 (en) 2011-01-27 2014-07-01 Lawrence Livermore National Security, Llc Chip-based droplet sorting
WO2012106385A2 (en) * 2011-01-31 2012-08-09 Apprise Bio, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
AU2012212148B8 (en) 2011-02-02 2017-07-06 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel contiguity mapping
WO2012109600A2 (en) * 2011-02-11 2012-08-16 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) * 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
EP3246416A1 (en) 2011-04-15 2017-11-22 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
EP3789498A1 (en) 2011-04-25 2021-03-10 Bio-rad Laboratories, Inc. Methods for nucleic acid analysis
SG10201605049QA (en) 2011-05-20 2016-07-28 Fluidigm Corp Nucleic acid encoding reactions
WO2012162296A2 (en) 2011-05-23 2012-11-29 President And Fellows Of Harvard College Control of emulsions, including multiple emulsions
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
KR101974492B1 (ko) 2011-07-26 2019-05-02 베리나타 헬스, 인코포레이티드 샘플 중 상이한 이수성의 존재 또는 부재를 결정하는 방법
US20130032235A1 (en) 2011-08-02 2013-02-07 Teledyne Dalsa Semiconductor, Inc. Integrated microfluidic check valve and device including such a check valve
US9469874B2 (en) * 2011-10-18 2016-10-18 The Regents Of The University Of California Long-range barcode labeling-sequencing
US9483374B2 (en) 2011-12-21 2016-11-01 Intel Corporation PSMI using at-speed scan capture
BR112014019323A8 (pt) 2012-02-08 2017-07-11 Harvard College Formação de gotícula com uso de decomposição de fluido
WO2013126741A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
ES2776673T3 (es) 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
LT3305918T (lt) 2012-03-05 2020-09-25 President And Fellows Of Harvard College Būdai, skirti epigenetinių sekų sudarymui
EP2850211B1 (en) * 2012-05-14 2021-09-08 iRepertoire, Inc. Method for increasing accuracy in quantitative detection of polynucleotides
CN104736725A (zh) 2012-08-13 2015-06-24 加利福尼亚大学董事会 用于检测生物组分的方法和系统
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378349A1 (en) * 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
WO2014028537A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 10X Technologies, Inc. Microcapsule compositions and methods
WO2014047556A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for long insert, paired end libraries of nucleic acids in emulsion droplets
CN104812492A (zh) 2012-11-27 2015-07-29 基因细胞生物系统有限公司 处理液体样品
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014108323A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Eth Zurich Method and apparatus for depositing droplets onto a substrate
US20160011185A1 (en) 2013-03-04 2016-01-14 Gregory M. Lawrence Multi-analyte assay
US9752179B2 (en) 2013-03-14 2017-09-05 Cold Spring Harbor Laboratory Trans-splicing transcriptome profiling
WO2014153071A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Methods for quantitating dna using digital multiple displacement amplification
GB2584364A (en) * 2013-03-15 2020-12-02 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
EP2972405B1 (en) 2013-03-15 2020-12-23 The Regents of The University of California High-speed on demand microfluidic droplet generation and manipulation
US9328382B2 (en) * 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
WO2015069798A1 (en) 2013-11-05 2015-05-14 The Regents Of The University Of California Single-cell forensic short tandem repeat typing within microfluidic droplets
WO2015120398A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Gencell Biosystems Limited Composite liquid cell (clc) mediated nucleic acid library preparation device, and methods for using the same
JP6635939B2 (ja) 2014-04-08 2020-01-29 ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション 多分散液滴を使用するデジタルアッセイを行うための方法及び装置
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
CN106574925B (zh) 2014-05-23 2019-07-26 萤火虫生物股份有限公司 用于生物测定的底物介导的反应器
WO2015189336A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Samplix S.A.R.L. Nucleotide sequence exclusion enrichment by droplet sorting (needls)
CN106795553B (zh) * 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
EP3160654A4 (en) 2014-06-27 2017-11-15 The Regents of The University of California Pcr-activated sorting (pas)
WO2016064755A2 (en) 2014-10-20 2016-04-28 The Regents Of The University Of Califronia Rapid modulation of droplet composition with membrane microvalves
US10434507B2 (en) 2014-10-22 2019-10-08 The Regents Of The University Of California High definition microdroplet printer
US20170022538A1 (en) 2015-02-04 2017-01-26 The Regents Of The University Of California Multiple-emulsion nucleic acid amplification
EP3253479B1 (en) 2015-02-04 2022-09-21 The Regents of The University of California Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
EP3337907A4 (en) 2015-08-17 2019-01-02 The Regents of The University of California Microdroplet-based multiple displacement amplification (mda) methods and related compositions
WO2017184707A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 President And Fellows Of Harvard College Immobilization-based systems and methods for genetic analysis and other applications
WO2018031691A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 The Regents Of The University Of California Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet
AU2017382905A1 (en) 2016-12-21 2019-07-04 The Regents Of The University Of California Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets
CN117604074A (zh) 2017-11-17 2024-02-27 10X基因组学有限公司 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016126871A3 (en) 2016-10-06
AU2016215304A1 (en) 2017-08-10
US11732287B2 (en) 2023-08-22
US11111519B2 (en) 2021-09-07
JP2018508198A (ja) 2018-03-29
EP3253479A4 (en) 2018-10-10
CA2974306A1 (en) 2016-08-11
JP2022088360A (ja) 2022-06-14
CN107530654A (zh) 2018-01-02
US20180216160A1 (en) 2018-08-02
US20170009274A1 (en) 2017-01-12
EP3253479A2 (en) 2017-12-13
EP3253479B1 (en) 2022-09-21
HK1248169A1 (zh) 2018-10-12
EP4112744A1 (en) 2023-01-04
AU2016215304B2 (en) 2022-01-27
AU2022202780A1 (en) 2022-05-19
WO2016126871A2 (en) 2016-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11732287B2 (en) Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
US11312990B2 (en) PCR-activated sorting (PAS)
US20220154248A1 (en) Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet
EP3253910B1 (en) Multiple-emulsion nucleic acid amplification
EP3456846B1 (en) Systems and methods for barcoding nucleic acid
CN106460033B (zh) 使用核酸条形码分析与单细胞缔合的核酸
US6958217B2 (en) Single-stranded polynucleotide tags
JP7050803B2 (ja) 単一細胞の分析
WO2020037113A1 (en) Monodispersed particle-triggered droplet formation from stable jets
WO2021247942A2 (en) Methods and compositions for crispr editing of cells and correlating the edits to a resulting cellular nucleic acid profile

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination