JP2022511398A - ５’転写物配列の決定 - Google Patents

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本明細書の開示は、試料中の核酸標的を標識するためのシステム、方法、組成物、およびキットを含む。一部の実施形態では、核酸標的（例えば、ｍＲＮＡ）は、最初に、３’末端でバーコード化され、次に、５’末端でバーコード化され、その後、テンプレートスイッチング反応ならびに分子間および／または分子内ハイブリダイゼーションならびに伸長が続く。一部の実施形態では、５’ベースおよび３’ベースの遺伝子発現プロファイリングの方法が提供される。一部の実施形態では、免疫レパートリープロファイリング方法も提供される。

Description

関連出願
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）のもとに、２０１８年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／７３９，７９５号の利益を主張し、この関連出願の内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表への言及
本出願は、電子形式の配列表と一緒に出願されている。配列表は、４．０キロバイトのサイズで、２０１９年９月３０日に作成された６８ＥＢ＿２９８７０３＿ＷＯと題するファイルとして提出されている。配列表の電子形式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、分子生物学の分野に関し、より具体的には、分子バーコード化を使用するマルチオミクス分析に関する。
分子バーコード化の方法および技法は、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、細胞の状態を決定するために、遺伝子発現プロファイルを解読することなど、単一細胞トランスクリプトミクス分析に有用である。分子バーコード化はまた、単一細胞プロテオミクス分析にも有用である。５’末端と３’末端のうちの一方または両方において核酸標的を分子バーコード化するための方法および技法に対する必要性が存在する。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的を標識するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップとを含む。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含み得る。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それぞれが、第１の分子標識または第２の分子標識を含む、複数の単一標識核酸分子を生成するステップであって、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、ステップを含み得る。一部の実施形態では、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップは、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピーを生成するステップであって、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、（ｉ）複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー、または、その産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数、および／または（ｉｉ）複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、ステップを含み得る。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それぞれが、第１の分子標識または第２の分子標識を含む、複数の単一標識核酸分子を生成するステップと、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
一部の実施形態では、本方法は、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせる前に、複数のバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む。一部の実施形態では、核酸標的のコピー数を決定するステップは、複数の核酸標的のそれぞれの配列を含む複数の単一標識核酸分子のうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の複数の核酸標的のそれぞれのコピー数を決定するステップを含む。一部の実施形態では、核酸標的のコピー数を決定するステップは、複数の核酸標的のそれぞれの配列を含む複数の単一標識核酸分子のうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の複数の核酸標的のそれぞれのコピー数を決定するステップを含む。一部の実施形態では、複数の核酸標的のそれぞれの配列は、複数の核酸標的のそれぞれの部分配列を含む。一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含む。
一部の実施形態では、第１の分子標識は、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む。一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の一部分に相補的である。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）配列を含む。
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、ステムループを形成する、バーコード化された核酸分子内の標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体である。一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は第１の分子標識と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。一部の実施形態では、本方法は、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
一部の実施形態では、逆転写酵素は、末端転移酵素活性の能力がある。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、例えば、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含む。
一部の実施形態では、試料は、単一細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、単一細胞は、免疫細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。一部の実施形態では、単一細胞は、循環腫瘍細胞を含む。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列を含む。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子は、第１のユニバーサル配列および第１のユニバーサル配列の相補体を含む。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピーを生成するステップは、第１のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用するステップを含む。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の単一標識核酸分子を生成するステップは、第１のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および増幅プライマーを使用するステップを含む。一部の実施形態では、増幅プライマーは、標的特異的プライマーである。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体に特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体の定常領域に特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体の可変領域に特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体の多様性領域に特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体の可変領域と多様性領域の接合部に特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体である。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ＢＣＲは、ＢＣＲ重鎖および／またはＢＣＲ軽鎖を含む。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプターを、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物に結合させるステップを含む。一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプターを、複数の単一標識核酸分子、またはその産物に結合させるステップを含む。一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、単一細胞のＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、ＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報は、ＢＣＲ軽鎖および／またはＢＣＲ重鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む。一部の実施形態では、方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含み、本方法は、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報は、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含み、本方法は、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報は、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含み、本方法は、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む。
一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の逆相補配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の相補配列を含む。一部の実施形態では、分子標識の相補体は、分子標識の逆相補配列を含む。一部の実施形態では、分子標識の相補体は、分子標識の相補配列を含む。一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子は、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む。一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子は、バーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む。一部の実施形態では、核酸標的は、核酸分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫受容体をコードする。一部の実施形態では、核酸標的は、細胞成分結合試薬を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、細胞成分結合試薬に会合している。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個は、異なる分子標識配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に会合している。一部の実施形態では、同じ固体支持体に会合した複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、同一の試料標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、同じ固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含む。一部の実施形態では、異なる固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、細胞標識および該細胞標識の相補体を含む。一部の実施形態では、細胞標識の相補体は、細胞標識の逆相補配列を含む。一部の実施形態では、細胞標識の相補体は、細胞標識の相補配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、合成粒子を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、平面表面を含む。
一部の実施形態では、試料は、単一細胞を含み、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、合成粒子を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含む。一部の実施形態では、単一細胞を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子と単一細胞は、同じウェル中にある。一部の実施形態では、合成粒子と単一細胞は、同じ液滴中にある。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に部分的に固定されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能である。一部の実施形態では、合成粒子は、ビーズを含む。一部の実施形態では、ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み、合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに／または支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合している。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；逆転写酵素；標的結合領域を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、またはその一部分；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。一部の実施形態では、キットは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、キットは、緩衝液を含む。一部の実施形態では、キットは、カートリッジを含む。一部の実施形態では、キットは、逆転写反応のための１つまたは複数の試薬を含む。一部の実施形態では、キットは、増幅反応のための１つまたは複数の試薬を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に部分的に固定されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能である。一部の実施形態では、合成粒子は、ビーズを含む。一部の実施形態では、ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み、合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに／または支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合している。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
非限定的な例示的バーコードを示す図である。 バーコード化および電子計数の非限定的な例示的ワークフローを示す図である。 複数の標的から３’末端でバーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するための非限定的な例示的プロセスを示す略図である。 ５’末端において核酸標的を遺伝子特異的に標識する非限定的な例示的方法の略図を示す。 全トランスクリプトーム分析のために５’末端において核酸標的を標識する非限定的な例示的方法の略図を示す。 ５’バーコード化および／または３’バーコード化を使用して、核酸標的（例えば、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域）の配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 １つのワークフローとして、Ｖ（Ｄ）Ｊプロトコール、抗体－オリゴヌクレオチド（ＡｂＯ）プロトコール、および単一細胞ｍＲＮＡ発現プロファイルプロトコール（例えば、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ標的化プロトコール）を実施する非限定的な例示的略図を示す。 Ｖ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用する、５’Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ（Ｄ）Ｊ領域の捕捉およびシーケンシングの非限定的な例示的実験結果を示す図である。Ｖ（Ｄ）Ｊヘアピンプロトコールは、捕捉された単一の、静止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のｍＲＮＡ分子を用いて、同じビーズ上で実施された３’増幅および５’増幅を含み得る。ＴＣＲアルファ鎖／ベータ鎖の対合効率は、３７．９％であり、これは、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈのｓｃＴＣＲプロファイリングキットなどの他のプラットフォームに匹敵した。 改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用して５’Ｖ（Ｄ）Ｊ検出感度を改善することを示す、非限定的な例示的プロットを示す。エチレングリコールを添加して、逆転写（ＲＴ）における二次構造の低減を補助した。ハイブリダイゼーション時間、緩衝液、およびテンプレートスイッチング（ＴＳ）オリゴｄＴ長を変更して、感度を改善した。４つのライブラリーを生成し、一緒にシーケンシングした：５’ＴＣＲ、５’ＢＣＲ、５’３０－ｐｌｅｘ免疫パネル、および３’免疫応答パネル。よりストリンジェントなＡｍｐｕｒｅクリーンアップ（０．６Ｘ）を実施した。 図９に関して記載した改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用して、５’Ｖ（Ｄ）Ｊ検出感度を改善する非限定的な例示的実験結果を示す図である。図８に関して記載したプロトコールと比較して、ＴＣＲアルファ／ベータ対合効率を３７．９％から５２％に改善した。Ｂ細胞における５’重鎖および軽鎖のｍＲＮＡ分子を検出することに成功した。 ３’増幅（図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ）および５’増幅（図１１Ｂ、１１Ｄ、１１Ｆ）を使用して決定したＩＧＨＭ、ＩＧＨＤ、およびＩＧＨＡの発現プロファイルと比較して、改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用する５’Ｂ細胞重鎖の検出を示す非限定的な例示的プロットである。 ３’増幅（図１２Ａ、１２Ｃ、１２Ｅ）および５’増幅（図１２Ｂ、１２Ｄ、１２Ｆ）を使用して決定したＣＤ３Ｄ、ＣＤ８Ａ、およびＨＬＡ－ＤＲの発現プロファイルと比較した、非限定的な例示的プロットである。
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面への参照がなされる。図面では、類似の記号は、文脈により別途示されない限り、典型的には類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、制限することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を用いることができ、他の変更を行うことができる。概して本明細書に記載され、図面で図示されている本開示の態様は、広範な異なる構成で配置、置換え、組合せ、分離、および設計がなされてもよく、それらのすべてが、本明細書において明示的に企図され、本明細書の開示の一部をなすことが、容易に理解される。
本明細書において参照されるすべての特許、公開特許出願、他の刊行物、およびＧｅｎＢａｎｋからの配列、ならびに他のデータベースは、関連技術に関してその全体が参照により組み込まれる。
少数の核酸、例えば、メッセンジャーリボヌクレオチド酸（ｍＲＮＡ）分子を定量することは、例えば、異なる発生段階にあるかまたは異なる環境条件下にある細胞において発現される遺伝子を決定するために、臨床上重要である。しかしながら、特に分子の数が非常に少ない場合には、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の絶対数を決定することも非常に困難であり得る。試料中の分子の絶対数を決定する１つの方法は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。理想的には、ＰＣＲにより、それぞれのサイクルで同一の分子コピーが得られる。しかしながら、ＰＣＲは、それぞれの分子が確率的な見込みで複製し、この見込みは、ＰＣＲサイクルおよび遺伝子配列によって変動し、増幅バイアスおよび不正確な遺伝子発現測定値をもたらすため、欠点を有し得る。固有の分子標識（分子インデックス（ＭＩ）とも称される）を有する確率的バーコードを使用して、分子数を計数し、増幅バイアスを補正することができる。Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））およびＲｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））などの確率的バーコード化によって、ＰＣＲおよび逆転写（ＲＴ）の間にｍＲＮＡを標識するために分子標識（ＭＬ）を使用することによるライブラリー調製ステップによって誘導されるバイアスを補正することができる。
Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイは、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドに、多数の、例えば、６５６１～６５５３６個の固有の分子標識配列を有する確率的バーコードの枯渇しないプールを利用して、ＲＴステップの間に試料中のすべてのポリ（Ａ）－ｍＲＮＡにハイブリダイズさせることができる。確率的バーコードは、ユニバーサルＰＣＲプライミング部位を含み得る。ＲＴの間に、標的遺伝子分子は、確率的バーコードとランダムに反応する。それぞれの標的分子は、確率的バーコードにハイブリダイズし、その結果、確率的にバーコード化された相補リボヌクレオチド酸（ｃＤＮＡ）分子を生成し得る。標識した後、マイクロウェルプレートのマイクロウェルから得られた確率的にバーコード化されたｃＤＮＡ分子を、ＰＣＲ増幅およびシーケンシングのために単一のチューブにプールしてもよい。生のシーケンシングデータを分析して、リードの数、固有の分子標識配列を有する確率的バーコードの数、およびｍＲＮＡ分子の数を得ることができる。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的を標識するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップとを含む。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それぞれが、第１の分子標識または第２の分子標識を含む、複数の単一標識核酸分子を生成するステップと、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；逆転写酵素；標的結合領域を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、またはその一部分；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。
定義
別途定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照されたい。本開示の目的で、次の用語を、以下に定義する。
本明細書で使用される場合、「アダプター」という用語は、会合した核酸の増幅またはシーケンシングを容易にするための配列を意味し得る。会合した核酸は、標的核酸を含み得る。会合した核酸は、空間標識、標的標識、試料標識、インデックス化標識、またはバーコード配列（例えば、分子標識）のうちの１つまたは複数を含み得る。アダプターは、線形であり得る。アダプターは、事前にアデニル化されたアダプターであってもよい。アダプターは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。１つまたは複数のアダプターが、核酸の５’末端または３’末端に配置され得る。アダプターが５’末端および３’末端に公知の配列を含む場合、公知の配列は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に配置されるアダプターは、表面に固定化された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり得る。アダプターは、一部の実施形態では、ユニバーサル配列を含み得る。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸分子に共通しているヌクレオチド配列の領域であり得る。２つ以上の核酸分子はまた、異なる配列の領域を有し得る。したがって、例えば、５’アダプターは、同一および／またはユニバーサル核酸配列を含み得、３’アダプターは、同一および／またはユニバーサル配列を含み得る。複数の核酸分子の異なるメンバーにユニバーサル配列が存在し得ることにより、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用した複数の異なる配列の複製または増幅が可能となり得る。同様に、少なくとも１つ、２つ（例えば、１対）、またはそれ以上のユニバーサル配列が、核酸分子の集合体の異なるメンバーに存在し得ることにより、ユニバーサル配列に相補的である少なくとも１つ、２つ（例えば、１対）、またはそれ以上の単一のユニバーサルプライマーを使用した複数の異なる配列の複製または増幅が可能となり得る。したがって、ユニバーサルプライマーには、そのようなユニバーサル配列にハイブリダイズすることができる配列が含まれる。標的核酸配列を有する分子を、異なる標的核酸配列の一方または両方の末端にユニバーサルアダプター（例えば、非標的核酸配列）を付加するように改変してもよい。標的核酸に結合した１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマーのハイブリダイゼーションのための部位を提供し得る。標的核酸に結合した１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、互いに同じであっても異なってもよい。
本明細書で使用される場合、「会合した」または「と会合した」という用語は、２つ以上の種が、ある時点で一緒に位置しているとして特定可能であることを意味し得る。会合は、２つ以上の種が、類似の容器内にあるかまたはそこにあったことを意味し得る。会合は、情報的会合であってもよい。例えば、２つ以上の種に関するデジタル情報は、記憶され得、種のうちの１つまたは複数がある時点で一緒に位置していたことを決定するために使用され得る。会合はまた、物理的会合であってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の会合した種は、互いにまたは共通の固体もしくは半固体表面に「係留されている」、「結合している」、または「固定化されている」。会合は、ビーズなどの固体または半固体支持体に標識を結合させるための共有結合的または非共有結合的手段を指し得る。会合は、標的と標識との間の共有結合であってもよい。会合は、２つの分子（例えば、標的分子および標識）間のハイブリダイゼーションを含み得る。
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つのヌクレオチド間の正確な対合の能力を指し得る。例えば、核酸の所与の位置にあるヌクレオチドが、別の核酸のヌクレオチドと水素結合することができる場合、２つの核酸は、その位置において互いに相補的であると考えられる。２つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドのうちのいくつかだけが結合する「部分的」であってもよく、または一本鎖分子間に全相補性が存在する完全なものであってもよい。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列に相補的である場合、第２の配列の「相補体」であると称され得る。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２の配列の逆転物である（すなわち、ヌクレオチドの順序が逆転している）配列に相補的である場合、第２の配列の「逆相補体」であると称され得る。本明細書で使用される場合、「相補」配列は、配列の「相補体」または「逆相補体」を指し得る。ある分子が別の分子にハイブリダイズすることができる場合、それは、ハイブリダイズしている分子に相補的であるか、または部分的に相補的であり得ることが、本開示から理解される。
本明細書で使用される場合、「デジタル計数」という用語は、試料中の標的分子の数を概算するための方法を指し得る。デジタル計数は、試料中の標的と会合している固有の標識の数を決定するステップを含み得る。本質的に確率的であり得るこの方法論は、分子計数の問題を、同一の分子の位置決定および同定のうちの１つを、事前に定義した標識セットの検出に関する一連のはい／いいえ式のデジタル質問に変換する。
本明細書で使用される場合、「標識」または「複数の標識」という用語は、試料内の標的と会合した核酸コードを指し得る。標識は、例えば、核酸標識であり得る。標識は、全体的または部分的に増幅可能な標識であってもよい。標識は、全体的または部分的にシーケンシング可能な標識であってもよい。標識は、異なるものとして特定可能な天然の核酸の一部分であってもよい。標識は、公知の配列であってもよい。標識は、核酸配列の接合部、例えば、天然および非天然の配列の接合部を含み得る。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「インデックス」、「タグ」、または「標識タグ」という用語と互換可能に使用することができる。標識は、情報を運ぶことができる。例えば、様々な実施形態では、標識は、試料の同一性、試料の供給源、細胞の同一性、および／または標的を判定するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「枯渇しないリザーバ」という用語は、多数の異なる標識で構成されるバーコード（例えば、確率的バーコード）のプールを指し得る。枯渇しないリザーバは、枯渇しないリザーバを標的のプールと会合させたときに、それぞれの標的が固有のバーコードと会合する可能性が高くなるように、多数の異なるバーコードを含み得る。それぞれの標識した標的分子の固有性は、ランダム選択の統計学によって決定することができ、標識の多様性と比較して、集団内の同一な標的分子のコピー数に依存する。結果として得られる標識した標的分子のサイズは、バーコード化プロセスの確率的性質によって決定することができ、次いで、検出されたバーコードの数の分析により、もともとの集団または試料中に存在している標的分子数の計算が可能となる。固有のバーコードの数に対する存在する標的分子の数の比が、低い場合、標識した標的分子は、固有性が高い（すなわち、１つを上回る標的分子が１つの所与の標識で標識されることになる確率は非常に低い）。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはその断片を指す。核酸は、ヌクレオチドを含み得る。核酸は、細胞に対して外因性であっても内因性であってもよい。核酸は、無細胞環境で存在してもよい。核酸は、遺伝子またはその断片であり得る。核酸は、ＤＮＡであり得る。核酸は、ＲＮＡであり得る。核酸は、１つまたは複数のアナログ（例えば、改変された骨格、糖、または核酸塩基）を含み得る。アナログの一部の非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド」、および「標的核酸」は、互換可能に使用することができる。
核酸は、新しいかまたは亢進された特性（例えば、改善された安定性）を有する核酸をもたらすように、１つまたは複数の改変（例えば、塩基改変、骨格改変）を含んでもよい。核酸は、核酸親和性タグを含んでもよい。ヌクレオシドは、塩基－糖の組合せであり得る。ヌクレオシドの塩基部分は、複素環式塩基であり得る。そのような複素環式塩基の２つのもっとも一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含んだヌクレオシドであり得る。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結され得る。核酸を形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合的に連結させて、線形ポリマー化合物を形成し得る。次に、この線形ポリマー化合物のそれぞれの末端が、さらに結合されて、環状化合物が形成され得るが、線形化合物が、一般的には好適である。加えて、線形化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物が生じるような様式でフォールディングし得る。核酸内において、リン酸基は、一般に、核酸のヌクレオシド間骨格を形成すると称され得る。連結または骨格は、３’と５’のホスホジエステル連結であり得る。
核酸は、改変された骨格および／または改変されたヌクレオシド間連結を含み得る。改変された骨格には、骨格にリン原子を保持するものおよび骨格にリン原子を有さないものが含まれ得る。リン原子を中に含む好適な改変された核酸骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、およびノルマル３’－５’連結を有するボラノホスフェート、２’－５’連結アナログ、ならびに逆極性を有するものを挙げることができ、ここで、１つまたは複数のヌクレオチド間連結は、３’と３’、５’と５’、または２’と２’の連結である。
核酸は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数のヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成されるポリヌクレオチド骨格を含み得る。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ2成分部分を有するその他のものを挙げることができる。
核酸は、核酸模倣体を含み得る。「模倣体」という用語は、フラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられたポリヌクレオチドを含むことを意図し得、フラノース環のみの置換えはまた、糖代理物であると称され得る。複素環式塩基部分または改変された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持され得る。１つのそのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられ得る。ヌクレオチドは保持されてもよく、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物における骨格は、２つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位を含み得、これにより、ＰＮＡにアミド含有骨格が提供される。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合され得る。
核酸は、モルホリノ骨格構造を含み得る。例えば、核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含み得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結により、ホスホジエステル連結を置き換えることができる。
核酸は、モルホリノ環に結合した複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（例えば、モルホリノ核酸）を含み得る。連結基は、モルホリノ核酸においてモルホリノモノマー単位を連結し得る。非イオン性モルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞内タンパク質との望ましくない相互作用をあまり有さない可能性がある。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、核酸の非イオン性模倣体であり得る。モルホリノクラス内の様々な化合物は、異なる連結基を使用して結合することができる。ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称され得る。核酸分子に通常存在するフラノース環を、シクロヘキセニル環で置き換えることができる。ＣｅＮＡ ＤＭＴで保護されたホスホロアミダイトモノマーを調製し、ホスホロアミダイトケミストリーを使用したオリゴマー化合物の合成に使用することができる。ＣｅＮＡモノマーを核酸鎖に組み込むことにより、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加させることができる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に類似する安定性で、核酸相補体と複合体を形成することができる。さらなる改変には、２’－ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、それによって２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン連結が形成され、それによって二環式糖部分が形成される、ロックド核酸（ＬＮＡ）を挙げることができる。連結は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ2）基であり得、ここで、ｎは、１または２である。ＬＮＡおよびＬＮＡアナログは、相補性核酸との非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３～＋１０℃）、３’－エクソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な可溶性特性を示し得る。
核酸はまた、核酸塩基（単純に「塩基」と称されることが多い）改変または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「改変されていない」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））、ならびにピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））を挙げることができる。改変された核酸塩基としては、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびに他のアルキル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、および他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを挙げることができる。改変された核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）を挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、標的を含む組成物を指し得る。開示される方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適な試料としては、細胞、組織、器官、または生物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「試料採取デバイス」または「デバイス」という用語は、試料の切片を採取し、かつ／または基質上に切片を配置することができる、デバイスを指し得る。試料デバイスは、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）機、細胞分取機、生検ニードル、生検デバイス、組織切片化デバイス、マイクロ流体デバイス、ブレードグリッド、および／またはミクロトームを指し得る。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）が結合され得る別々の固体または半固体表面を指し得る。固体支持体は、核酸を（例えば、共有結合的または非共有結合的に）固定化することができる、プラスチック、セラミック、金属、またはポリマー材料（例えば、ハイドロゲル）で構成される任意の種類の固体、多孔質、または中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成を包含し得る。固体支持体は、球状（例えば、マイクロスフェア）であり得る別個の粒子を含み得るか、または非球状もしくは不規則な形状、例えば、立方体、立方体様、ピラミッド形、円筒形、円錐形、長方形、もしくは円盤形などを有し得る。ビーズは、非球体の形状であり得る。アレイに離間配置された複数の固体支持体は、基質を含まない場合がある。固体支持体は、「ビーズ」という用語と互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「確率的バーコード」という用語は、本開示の標識を含むポリヌクレオチド配列を指し得る。確率的バーコードは、確率的バーコード化に使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る。確率的バーコードは、試料内の標的を定量するために使用することができる。確率的バーコードは、標識を標的に会合させた後に発生し得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅またはシーケンシングエラーを評価するために使用することができる。標的と会合した確率的バーコードは、確率的バーコード－標的または確率的バーコード－タグ－標的と称され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子特異的確率的バーコード」という用語は、標識および遺伝子特異的である標的結合領域を含むポリヌクレオチド配列を指し得る。確率的バーコードは、確率的バーコード化に使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る。確率的バーコードは、試料内の標的を定量するために使用することができる。確率的バーコードは、標識を標的に会合させた後に発生し得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅またはシーケンシングエラーを評価するために使用することができる。標的と会合した確率的バーコードは、確率的バーコード－標的または確率的バーコード－タグ－標的と称され得る。
本明細書で使用される場合、「確率的バーコード化」という用語は、核酸のランダムな標識化（例えば、バーコード化）を指し得る。確率的バーコード化は、ポアソン再帰戦略を利用して、標識を会合させ、標的と会合した標識を定量することができる。本明細書で使用される場合、「確率的バーコード化」という用語は、「確率的標識化」と互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、バーコード（例えば、確率的バーコード）と会合され得る組成物を指し得る。本開示の方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適な例示的な標的としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔＲＮＡなどが挙げられる。標的は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、標的は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、標的は、脂質である。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「逆転写酵素」という用語は、逆転写酵素活性を有する（すなわち、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成を触媒する）酵素の群を指し得る。一般に、そのような酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、ＩＩ群イントロン由来逆転写酵素、およびこれらの変異体、バリアント、または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。非レトロウイルス逆転写酵素としては、非ＬＴＲレトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、およびＩＩ群イントロン逆転写酵素が挙げられる。ＩＩ群イントロン逆転写酵素の例としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＬＩ．ＬｔｒＢイントロン逆転写酵素、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＴｅＩ４ｃイントロン逆転写酵素、またはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＧｓＩ－ＩＩＣイントロン逆転写酵素が挙げられる。逆転写酵素の他のクラスとしては、非レトロウイルス逆転写酵素の多数のクラス（すなわち、とりわけ、レトロン、ＩＩ群イントロン、および多様性発生レトロエレメント）を挙げることができる。
「ユニバーサルアダプタープライマー」、「ユニバーサルプライマーアダプター」または「ユニバーサルアダプター配列」という用語は、バーコード（例えば、確率的バーコード）にハイブリダイズし、遺伝子特異的バーコードを生成するために使用することができるヌクレオチド配列を指すために、互換可能に使用される。ユニバーサルアダプター配列は、例えば、本開示の方法において使用されるすべてのバーコードにわたりユニバーサルである公知の配列であり得る。例えば、複数の標的が、本明細書に開示される方法を使用して標識される場合、標的特異的配列のそれぞれは、同じユニバーサルアダプター配列に連結され得る。一部の実施形態では、２つ以上のユニバーサルアダプター配列は、本明細書に開示される方法において使用することができる。例えば、複数の標的が、本明細書に開示される方法を使用して標識される場合、標的特異的配列のうちの少なくとも２つは、異なるユニバーサルアダプター配列に連結される。ユニバーサルアダプタープライマーおよびその相補体は、２つのオリゴヌクレオチド中に含まれてもよく、そのうちの一方は標的特異的配列を含み、他方はバーコードを含む。例えば、ユニバーサルアダプター配列は、標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列を生成するために、標的特異的配列を含むオリゴヌクレオチドの一部であってもよい。バーコードおよびユニバーサルアダプター配列の相補配列を含む第２のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、標的特異的バーコード（標的特異的な確率的バーコード）を生成し得る。一部の実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーは、本開示の方法において使用されるユニバーサルＰＣＲプライマーと異なる配列を有する。
バーコード
バーコード化、例えば、確率的バーコード化は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２９９７８４号、国際公開第ＷＯ２０１５／０３１６９１号、およびFu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2011 May 31;108(22):9026-31に記載されており、これらの刊行物の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるバーコードは、標的を確率的に標識する（例えば、バーコード化する、タグ付けする）ために使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る、確率的バーコードであり得る。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数の、標識しようとする標的のうちの任意のものの発生の数に対する比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る場合に、確率的バーコードと称され得る。標的は、同一またはほぼ同一な配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であり得る。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数の、標識しようとする標的のうちの任意のものの発生の数に対する比が、少なくとも、または最大で１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１である場合に、確率的バーコードと称され得る。確率的バーコードのバーコード配列は、分子標識と称され得る。
バーコード、例えば、確率的バーコードは、１つまたは複数の標識を含み得る。例示的な標識としては、ユニバーサル標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、試料標識、プレート標識、空間標識、および／または空間前（ｐｒｅ－ｓｐａｔｉａｌ）標識を挙げることができる。図１は、空間標識を有する例示的なバーコード１０４を示す。バーコード１０４は、バーコードを固体支持体１０５に連結させることができる５’アミンを含み得る。バーコードは、ユニバーサル標識、次元標識（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｌａｂｅｌ）、空間標識、細胞標識、および／または分子標識を含み得る。バーコード内の異なる標識（ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、および分子標識を含むがこれらに限定されない）の順序は、変動し得る。例えば、図１に示されるように、ユニバーサル標識がもっとも５’側の標識であってもよく、分子標識がもっとも３’側の標識であってもよい。空間標識、次元標識、および細胞標識は、任意の順序であってよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、次元標識、細胞標識、および分子標識は、任意の順序である。バーコードは、標的結合領域を含み得る。標的結合領域は、試料内の標的（例えば、標的核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）と相互作用し得る。例えば、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部と相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。一部の事例では、バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド、またはそれ以上離間していてもよい。
標識、例えば、細胞標識は、エラー補正能力を提供するように設計され得る、定義された長さ、例えば、それぞれが７ヌクレオチドずつの（一部のハミングエラー補正コードにおいて使用されるビット数と同等の）固有の核酸部分配列セットを含み得る。７ヌクレオチドの配列を含むエラー補正用部分配列セットは、セット内の配列の任意の対での組合せが、定義された「遺伝子距離」（またはミスマッチ塩基数）を呈するように設計することができ、例えば、エラー補正用部分配列セットは、３ヌクレオチドの遺伝子距離を呈するように設計することができる。この場合、標識した標的核酸分子の配列データセットにおけるエラー補正配列の考察（以下により詳細に記載される）により、増幅またはシーケンシングエラーを検出または補正することが可能となり得る。一部の実施形態では、エラー補正コードを作成するために使用される核酸部分配列の長さは、変動し得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、３１、４０、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、他の長さの核酸部分配列が、エラー補正コードを作成するために使用されてもよい。
バーコードは、標的結合領域を含み得る。標的結合領域は、試料内の標的と相互作用し得る。標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、それぞれがポリ（Ａ）尾部を含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せであり得るか、またはこれらを含み得る。一部の実施形態では、複数の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部と相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列（例えば、分子標識））のうちの１つまたは複数は、バーコードの残りの標識のうちの別の１つまたは２つから、スペーサーによって離間していてもよい。スペーサーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、バーコードの標識のいずれも、スペーサーによって離間していない。
ユニバーサル標識
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサル標識を含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、所与の固体支持体に結合したバーコードのセットにおいて、すべのバーコードについて同じであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、複数のビーズに結合したすべてのバーコードについて同じであり得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。シーケンシングプライマーは、ユニバーサル標識を含むバーコードをシーケンシングするために使用することができる。シーケンシングプライマー（例えば、ユニバーサルシーケンシングプライマー）は、高スループットのシーケンシングプラットフォームと会合したシーケンシングプライマーを含み得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、ＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーおよびＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。シーケンシングプライマーまたはＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができるユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位と称され得る。ユニバーサル標識は、バーコードの転写を開始させるために使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、バーコードまたはバーコード内の領域の伸長のために使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。例えば、ユニバーサル標識は、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含み得る。ユニバーサル標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、バーコードを支持体から切断することを可能にするために、切断可能なリンカーまたは改変されたヌクレオチドが、ユニバーサル標識配列の一部となっていてもよい。
次元標識
バーコードは、１つまたは複数の次元標識を含み得る。一部の実施形態では、次元標識は、標識化（例えば、確率的標識化）が発生した次元に関する情報を提供する核酸配列を含み得る。例えば、次元標識は、標的がバーコード化された時間に関する情報を提供することができる。次元標識は、試料におけるバーコード化（例えば、確率的バーコード化）の時間と関連付けられてもよい。次元標識は、標識化の時点で活性化され得る。異なる次元標識は、異なる時点で活性化され得る。次元標識は、標的、標的の群、および／または試料がバーコード化された順序に関する情報を提供する。例えば、細胞集団は、細胞周期のＧ０期に、バーコード化され得る。細胞は、細胞周期のＧ１期に、バーコード（例えば、確率的バーコード）で再びパルスされ得る。細胞は、細胞周期のＳ期に、バーコードで再びパルスされ得るなどとなり得る。それぞれのパルス（例えば、細胞周期のそれぞれの段階）におけるバーコードは、異なる次元標識を含み得る。このようにすると、次元標識により、細胞周期のどの段階でどの標的が標識されたかに関する情報が得られる。次元標識は、多くの異なる生物学的時間を調べることができる。例示的な生物学的時間としては、細胞周期、転写（例えば、転写開始）、および転写物分解を挙げることができるが、これらに限定されない。別の例では、試料（例えば、細胞、細胞集団）は、薬物および／または治療法での処置の前および／または後に、確率的に標識され得る。別個の標的のコピー数の変化により、薬物および／または治療法に対する試料の応答を示すことができる。
次元標識は、活性化可能であり得る。活性化可能な次元標識は、特定の時点で活性化させることができる。活性化可能な標識は、例えば、継続的に活性化させることができる（例えば、停止されない）。活性化可能な次元標識は、例えば、可逆的に活性化可能であってもよい（例えば、活性化可能な次元標識は、作動させることができ、停止させることができる）。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上、可逆的に活性化可能であってもよい。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上、可逆的に活性化可能であってもよい。一部の実施形態では、次元標識は、蛍光、光、化学的事象（例えば、切断、別の分子のライゲーション、改変の付加（例えば、ペグ化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、脱アセチル化、脱メチル化）、光化学的事象（例えば、光ケージング）、および非天然のヌクレオチドの導入により活性化させることができる。
次元標識は、一部の実施形態では、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコード（例えば、確率的バーコード）について同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）については異なり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％が、同じ次元標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ次元標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ次元標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）に、１０6個以上もの多くの固有の次元標識配列が提示されてもよい。次元標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。次元標識は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチド長であり得る。次元標識は、約５～約２００個のヌクレオチドを含み得る。次元標識は、約１０～約１５０個のヌクレオチドを含み得る。次元標識は、約２０～約１２５ヌクレオチドの長さを含み得る。
空間標識
バーコードは、１つまたは複数の空間標識を含み得る。一部の実施形態では、空間標識は、バーコードと会合した標的分子の空間配向に関する情報を提供する、核酸配列を含み得る。空間標識は、試料における座標と関連付けられ得る。座標は、固定座標であってもよい。例えば、座標は、基質に関連して固定され得る。空間標識は、二次元または三次元グリッドを参照するものであってもよい。座標は、ランドマークに対して固定され得る。ランドマークは、空間内で特定可能であり得る。ランドマークは、画像化することができる構造体であり得る。ランドマークは、生物学的構造体、例えば、解剖学的ランドマークであり得る。ランドマークは、細胞ランドマーク、例えば、オルガネラであり得る。ランドマークは、非天然のランドマーク、例えば、特定可能な識別子、例えば、カラーコード、バーコード、磁気特性、蛍光、放射性、もしくは固有のサイズもしくは形状を有する構造体であってもよい。空間標識は、物理的区画（例えば、ウェル、容器、または液滴）と関連付けられていてもよい。一部の実施形態では、複数の空間標識が、空間内の１つまたは複数の位置をコードするために、一緒に使用される。
空間標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）については異なり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、少なくとも、または最大で６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ空間標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ空間標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）に、１０6個以上もの多くの固有の空間標識配列が提示されてもよい。空間標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。空間標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。空間標識は、約５～約２００個のヌクレオチドを含み得る。空間標識は、約１０～約１５０個のヌクレオチドを含み得る。空間標識は、約２０～約１２５ヌクレオチドの長さを含み得る。
細胞標識
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、１つまたは複数の細胞標識を含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞を起源としているかを決定するための情報を提供する、核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて同一であるが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）については異なる。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得るか、またはおよそでこれらの値であり得る。例えば、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ細胞標識を含み得る。別の例として、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ細胞標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）に、１０6個以上もの多くの固有の細胞標識配列が提示されてもよい。細胞標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。細胞標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、細胞標識は、約５～約２００個のヌクレオチドを含み得る。別の例として、細胞標識は、約１０～約１５０個のヌクレオチドを含み得る。さらに別の例として、細胞標識は、約２０～約１２５ヌクレオチドの長さを含み得る。
バーコード配列
バーコードは、１つまたは複数のバーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、バーコード配列は、バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定の種類に関する情報の特定をもたらす、核酸配列を含み得る。バーコード配列は、バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生に関するカウンタを提供する（例えば、およその近似値を提供する）、核酸配列を含む。
一部の実施形態では、バーコード配列の多様なセットが、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合される。一部の実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の固有の分子標識配列が存在し得る。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個のバーコード配列を含み得る。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個のバーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも、または最大で１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個の固有のバーコード配列が存在し得る。固有の分子標識配列は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合していてもよい。一部の実施形態では、固有の分子標識配列は、粒子（例えば、ハイドロゲルビーズ）によって部分的または全体的に包含される。
バーコードの長さは、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。例えば、バーコードは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。別の例として、バーコードは、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチド長であってもよい。
分子標識
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、１つまたは複数の分子標識を含み得る。分子標識は、バーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、分子標識は、バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定の種類に関する情報の特定をもたらす、核酸配列を含み得る。分子標識は、バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生に対するカウンタを提供する、核酸配列を含む。
一部の実施形態では、分子標識の多様なセットが、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合される。一部の実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲の固有の分子標識配列、または約１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲の固有の分子標識配列が存在し得る。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個の分子標識を含み得る。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個の分子標識を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも、または最大で１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、もしくは１０9個の固有の分子標識配列が存在し得る。固有の分子標識配列を有するバーコードは、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合していてもよい。
複数の確率的バーコードを使用するバーコード化（例えば、確率的バーコード化）については、異なる分子標識配列の数と、標的のうちのいずれかの発生の数との比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。標的は、同一またはほぼ同一な配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であり得る。一部の実施形態では、異なる分子標識配列の数と、標的のうちのいずれかの発生の数との比は、少なくとも、または最大で１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、もしくは１００：１である。
分子標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。分子標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。
標的結合領域
バーコードは、１つまたは複数の標的結合領域、例えば、捕捉プローブを含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、目的の標的とハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、標的（例えば、標的核酸、標的分子、例えば、分析しようとする細胞核酸）、例えば、特定の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、特定の標的核酸の特定の位置に結合（例えば、ハイブリダイズ）することができる核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、制限酵素部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイゼーションが可能である核酸配列を含み得る。バーコードは、次いで、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲーションすることができる。
一部の実施形態では、標的結合領域は、非特異的標的核酸配列を含み得る。非特異的標的核酸配列は、標的核酸の特定の配列とは独立して、複数の標的核酸に結合することができる配列を指し得る。例えば、標的結合領域は、ランダム多量体配列、またはｍＲＮＡ分子上のポリ（Ａ）尾部にハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。ランダム多量体配列は、例えば、ランダム二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、または任意の長さのそれ以上の多量体配列であり得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、所与のビーズに結合したすべてのバーコードについて、同じである。一部の実施形態では、所与のビーズに結合した複数のバーコードの標的結合領域は、２つ以上の異なる標的結合配列を含み得る。標的結合領域は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリアデニル化末端を含むｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるオリゴ（ｄＴ）を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的であり得る。例えば、標的結合領域は、標的の特定の領域にハイブリダイズするように構成され得る。標的結合領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、約５～３０ヌクレオチドの長さであり得る。バーコードが遺伝子特異的標的結合領域を含む場合、バーコードは、本明細書において、遺伝子特異的バーコードと称され得る。
配向特性
確率的バーコード（例えば、確率的バーコード）は、バーコードを配向する（例えば、アライメント）するために使用することができる１つまたは複数の配向特性を含み得る。バーコードは、等電点電気泳動のための部分を含み得る。異なるバーコードは、異なる等電点電気泳動点を含み得る。これらのバーコードを試料に導入すると、試料は、バーコードを公知の様式で配向するために、等電点電気泳動を受け得る。このようにして、配向特性を使用して、試料におけるバーコードの公知のマップを展開することができる。例示的な配向特性としては、電気泳動移動度（例えば、バーコードのサイズに基づく）、等電点、スピン、導電性、および／または自己アセンブリを挙げることができる。例えば、自己アセンブリの配向特性を有するバーコードは、活性化されると、特定の配向（例えば、核酸ナノ構造）に自己アセンブルし得る。
親和性特性
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、１つまたは複数の親和性特性を含み得る。例えば、空間標識は、親和性特性を含み得る。親和性特性としては、別の実体（例えば、細胞受容体）へのバーコードの結合を促進することができる化学的および／または生物学的部分を挙げることができる。例えば、親和性特性は、抗体、例えば、試料上の特定の部分（例えば、受容体）に特異的な抗体を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、バーコードを、特定の細胞種または分子へと誘導し得る。特定の細胞種または分子にあるおよび／またはその近傍にある標的を、標識（例えば、確率的に標識）することができる。親和性特性は、一部の実施形態では、抗体がバーコードを特定の位置へと誘導し得るため、空間標識のヌクレオチド配列に加えて、空間情報を提供することができる。抗体は、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、ヒト化またはキメラであってもよい。抗体は、ネイキッド抗体または融合抗体であってもよい。
抗体は、全長（すなわち、天然に存在するかもしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的結合）部分、例えば、抗体断片であり得る。
抗体断片は、例えば、抗体の一部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどであり得る。一部の実施形態では、抗体断片は、全長抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片としては、抗体の可変領域からなる単離された断片、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を挙げることができる。例示的な抗体としては、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体（ＣＤ８、ＣＤ３４、ＣＤ４５）に結合する抗体、および治療用抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。
ユニバーサルアダプタープライマー
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサルアダプタープライマーを含み得る。例えば、遺伝子特異的バーコード、例えば、遺伝子特異的確率的バーコードは、ユニバーサルアダプタープライマーを含み得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、すべてのバーコードにわたってユニバーサルなヌクレオチド配列を指し得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、遺伝子特異的バーコードを構築するために使用することができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、またはこれらのうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さであり得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、５～３０ヌクレオチドの長さであり得る。
リンカー
バーコードが、１つを上回る種類の標識（例えば、１つを上回る細胞標識または１つを上回るバーコード配列、例えば、１つの分子標識）を含む場合、標識には、リンカー標識配列が散在していてもよい。リンカー標識配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。リンカー標識配列は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。一部の事例では、リンカー標識配列は、１２ヌクレオチドの長さである。リンカー標識配列は、バーコードの合成を容易にするために使用することができる。リンカー標識は、エラー補正（例えば、ハミング）コードを含み得る。
固体支持体
本明細書において開示されるバーコード、例えば、確率的バーコードは、一部の実施形態では、固体支持体と会合していてもよい。固体支持体は、例えば、合成粒子であり得る。一部の実施形態では、バーコード配列の一部またはすべて、例えば、固体支持体上の複数のバーコード（例えば、第１の複数のバーコード）の確率的バーコード（例えば、第１のバーコード配列）の分子標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる。同じ固体支持体上のバーコードの細胞標識は、同じであり得る。異なる固体支持体上のバーコードの細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。例えば、第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識は、同じ配列を有してもよく、第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、同じ配列を有してもよい。第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識および第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。細胞標識は、例えば、約５～２０ヌクレオチド長であり得る。バーコード配列は、例えば、約５～２０ヌクレオチド長であり得る。合成粒子は、例えば、ビーズであり得る。
ビーズは、例えば、シリカゲルビーズ、細孔制御ガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、ｓｅｐｈａｄｅｘ／ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはこれらの任意の組合せであり得る。ビーズは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはこれらの任意の組合せなどの材料を含み得る。
一部の実施形態では、ビーズは、ポリマービーズ、例えば、バーコードまたは確率的バーコードで官能化された変形可能なビーズまたはゲルビーズ（例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からのゲルビーズ）であり得る。一部の実装形態では、ゲルビーズは、ポリマー系ゲルを含み得る。ゲルビーズは、例えば、１つまたは複数のポリマー前駆体を液滴に封入することによって、生成することができる。ポリマー前駆体を、促進剤（例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））に曝露すると、ゲルビーズが生成され得る。
一部の実施形態では、粒子は、崩壊可能（例えば、溶解可能、分解可能）であり得る。例えば、ポリマービーズは、例えば、所望される条件下において、溶解、融解、または分解し得る。所望される条件には、環境条件が含まれ得る。所望される条件は、制御された様式で、ポリマービーズの溶解、融解、または分解をもたらし得る。ゲルビーズは、化学的刺激、物理的刺激、生物学的刺激、熱刺激、磁気刺激、電気刺激、光刺激、またはこれらの任意の組合せに起因して、溶解、融解、または分解し得る。
分析物および／または試薬、例えば、オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、ゲルビーズの内部表面（例えば、オリゴヌクレオチドバーコードおよび／またはオリゴヌクレオチドバーコードを生成するために使用される材料の拡散を通じてアクセス可能な内部）、および／またはゲルビーズもしくは本明細書に記載の任意の他のマイクロカプセルの外部表面に連結／固定化されていてもよい。連結／固定化は、任意の形態の化学結合（例えば、共有結合、イオン結合）または物理的現象（例えば、ファンデルワールス力、双極子間相互作用など）を介してもよい。一部の実施形態では、試薬の、ゲルビーズまたは本明細書に記載の任意の他のマイクロカプセルへの連結／固定化は、例えば、不安定性部分を介する（例えば、本明細書に記載の化学的架橋剤を含む、化学的架橋剤を介する）ものなど、可逆的であってもよい。刺激を適用すると、不安定性部分は、切断され、固定化された試薬が遊離され得る。一部の実施形態では、不安定性部分は、ジスルフィド結合である。例えば、オリゴヌクレオチドバーコードがジスルフィド結合を介してゲルビーズに固定化されている事例では、ジスルフィド結合を還元剤に曝露することにより、ジスルフィド結合が切断され、オリゴヌクレオチドバーコードがビーズから遊離され得る。不安定性部分は、ゲルビーズもしくはマイクロカプセルの一部として、試薬もしくは分析物をゲルビーズもしくはマイクロカプセルに連結させる化学的リンカーの一部として、および／または試薬もしくは分析物の一部として含まれてもよい。一部の実施形態では、複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、粒子に固定化されていてもよく、粒子に部分的に固定化されていてもよく、粒子に封入されていてもよく、粒子に部分的に封入されていてもよく、またはこれらの任意の組合せであってもよい。
一部の実施形態では、ゲルビーズは、ポリマー、熱感受性ポリマー、光感受性ポリマー、磁性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、塩感受性ポリマー、化学感受性ポリマー、高分子電解質、多糖、ペプチド、タンパク質、および／またはプラスチックを含むがこれらに限定されない、広範な異なるポリマーを含み得る。ポリマーとしては、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（スチレンスルホネート）（ＰＳＳ）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｍ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（ジアリルジメチル－アンモニウムクロリド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ（ピロール）（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰＯＮ）、ポリ（ビニルピリジン）（ＰＶＰ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ（テトラヒドロフラン）（ＰＴＨＦ）、ポリ（フタルアルデヒド）（ＰＴＨＦ）、ポリ（ヘキシルビオロゲン）（ＰＨＶ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＡＲＧ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの材料を挙げることができるが、これらに限定されない。
多数の化学的刺激を使用して、ビーズの崩壊、溶解、または分解をトリガーすることができる。これらの化学変化の例としては、ビーズ壁へのｐＨに媒介される変化、架橋結合の化学的切断を介したビーズ壁の崩壊、ビーズ壁の脱重合のトリガー、およびビーズ壁のスイッチング反応を挙げることができるが、これらに限定されない。バルク変化を使用して、ビーズの崩壊をトリガーすることもできる。
様々な刺激を通じたマイクロカプセルに対するバルク変化または物理的変化はまた、試薬を放出するためのカプセルの設計において、多くの利点を提供する。バルク変化または物理的変化は、巨視的規模で発生し、ビーズの破裂は、刺激によって誘導される機械－物理力の結果である。これらのプロセスとしては、圧力に誘導される破裂、ビーズ壁の融解、またはビーズ壁の多孔性の変化を挙げることができるが、これらに限定されない。
生物学的刺激もまた、ビーズの崩壊、溶解、または分解をトリガーするために使用することができる。一般に、生物学的トリガーは、化学的トリガーに似ているが、多くの例では、生体分子、または酵素、ペプチド、糖、脂肪酸、核酸などといった生体系において一般に見出される分子を使用する。例えば、ビーズは、特定のプロテアーゼによる切断に対して感受性であるペプチド架橋を有するポリマーを含み得る。より具体的には、１つの例では、ＧＦＬＧＫペプチド架橋を含むマイクロカプセルを含み得る。プロテアーゼカテプシンＢなどの生物学的トリガーを添加すると、シェル壁のペプチド架橋が切断され、ビーズの内容物が放出される。他の事例では、プロテアーゼは、熱活性化され得る。別の例では、ビーズは、セルロースを含むシェル壁を含む。加水分解性酵素であるキトサンの添加が、セルロース結合の切断、シェル壁の脱重合、およびその内部の内容物の放出の生物学的トリガーとしての機能を果たす。
ビーズはまた、熱刺激を適用するとその内容物を放出するように誘導することもできる。温度の変化は、ビーズに様々な変化を引き起こし得る。熱の変化は、ビーズ壁が崩壊するようにビーズの融解を引き起こし得る。他の事例では、熱は、ビーズが崩壊または爆発するように、ビーズの内部成分の内圧を増加させ得る。なおも他の事例では、熱は、ビーズを圧縮され脱水された状態へと変換させ得る。熱はまた、ビーズの壁内の熱感受性ポリマーに対して作用して、ビーズの崩壊を引き起こすことができる。
マイクロカプセルのビーズ壁に磁性ナノ粒子を含めることにより、ビーズの崩壊をトリガーすること、ならびにビーズをアレイにおいて誘導することができる。本開示のデバイスは、いずれかの目的で磁性ビーズを含み得る。１つの例では、Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を高分子電解質含有ビーズに組み込むことにより、振動磁界刺激の存在下において崩壊がトリガーされる。
ビーズはまた、電気刺激の結果として、崩壊、溶解、または分解され得る。前の節に記載されている磁性粒子と同様に、電気感受性ビーズにより、ビーズの崩壊、ならびに電界におけるアライメント、電気伝導、または酸化還元反応などの他の機能の両方をトリガーすることが可能となり得る。１つの例では、電気感受性材料を含有するビーズは、内部試薬の放出を制御することができるように、電界においてアライメントされる。他の例では、電界は、ビーズ壁自体内における酸化還元反応を誘導し得、これにより多孔性が増加し得る。
光刺激もまた、ビーズを崩壊させるために使用することができる。多数の光トリガーが、可能であり、これには、特定の範囲の波長の光子を吸収することができるナノ粒子および発色団などの様々な分子を使用するシステムが含まれ得る。例えば、金属酸化物コーティングを、カプセルトリガーとして使用することができる。ＳｉＯ2をコーティングした高分子電解質カプセルのＵＶ照射は、ビーズ壁の崩壊をもたらし得る。さらに別の例では、光スイッチ可能な材料、例えば、アゾベンゼン基を、ビーズ壁に組み込んでもよい。ＵＶまたは可視光を適用すると、これらのような化学物質は、光子を吸収して可逆的なシスからトランスへの異性化を受ける。この態様では、光スイッチの組込みにより、光トリガーを適用すると崩壊し得るかまたはより多孔性となり得るビーズ壁が得られる。
例えば、図２に示されるバーコード化（例えば、確率的バーコード化）の非限定的な例では、ブロック２０８において、細胞、例えば、単一細胞を、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに導入した後、ブロック２１２において、ビーズを、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに導入することができる。それぞれのマイクロウェルは、１つのビーズを含み得る。ビーズは、複数のバーコードを含み得る。バーコードは、ビーズに結合した５’アミン領域を含み得る。バーコードは、ユニバーサル標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的結合領域、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
本明細書において開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、ビーズ）と会合していてもよい（例えば、それに結合していてもよい）。固体支持体と会合しているバーコードは、それぞれが、固有の配列を有する少なくとも１００または１０００個のバーコード配列を含む群から選択される、バーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合した異なるバーコードは、異なる配列を有するバーコードを含み得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合しているあるパーセンテージのバーコードは、同じ細胞標識を含む。例えば、パーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。別の例として、パーセンテージは、少なくとも、または最大で６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合しているバーコードは、同じ細胞標識を有し得る。異なる固体支持体と会合しているバーコードは、固有の配列を有する少なくとも１００または１０００個の細胞標識を含む群から選択される、異なる細胞標識を有し得る。
本明細書において開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、ビーズ）に会合していてもよい（例えば、それに結合していてもよい）。一部の実施形態では、試料における複数の標識をバーコード化するステップは、複数のバーコードと会合した複数の合成粒子を含む固体支持体を用いて行うことができる。一部の実施形態では、固体支持体は、複数のバーコードと会合した複数の合成粒子を含み得る。異なる固体支持体上の複数のバーコードの空間標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。固体支持体は、例えば、二次元または三次元で複数のバーコードを含み得る。合成粒子は、ビーズであり得る。ビーズは、シリカゲルビーズ、細孔制御ガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはこれらの任意の組合せであり得る。固体支持体としては、ポリマー、マトリックス、ハイドロゲル、ニードルアレイデバイス、抗体、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。一部の実施形態では、固体支持体は、自由に浮動することができる。一部の実施形態では、固体支持体は、半固体または固体アレイに包埋されていてもよい。バーコードは、固体支持体と会合していなくてもよい。バーコードは、個別のヌクレオチドであってもよい。バーコードは、基質と会合していてもよい。
本明細書で使用される場合、「係留された」、「結合した」、および「固定化された」という用語は、互換可能に使用され、バーコードを固体支持体に結合させるための共有結合的または非共有結合的手段を指し得る。様々な異なる固体支持体のうちのいずれかを、事前に合成したバーコードを結合させるため、またはバーコードのインサイツでの固相合成のための固体支持体として使用することができる。
一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズである。ビーズは、核酸を（例えば、共有結合的または非共有結合的に）固定化することができる１つまたは複数の種類の固体、多孔質、または中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成を含み得る。ビーズは、例えば、プラスチック、セラミック、金属、ポリマー材料、またはこれらの任意の組合せから構成され得る。ビーズは、球状（例えば、マイクロスフェア）である別個の粒子であるか、もしくはそれを含み得るか、または非球状もしくは不規則な形状、例えば、立方体、立方体様、ピラミッド形、円筒形、円錐形、長方形、もしくは円盤形などを有し得る。一部の実施形態では、ビーズは、非球体の形状であり得る。
ビーズは、常磁性材料（例えば、マグネシウム、モリブデン、リチウム、およびタンタル）、超常磁性材料（例えば、フェライト（Ｆｅ3Ｏ4、マグネタイト）ナノ粒子）、強磁性材料（例えば、鉄、ニッケル、コバルト、これらの一部の合金、および一部の希土類金属化合物）、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、シリカ、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、アガロース、ハイドロゲル、ポリマー、セルロース、ナイロン、またはこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない、様々な材料を含み得る。
一部の実施形態では、ビーズ（例えば、標識が結合されるビーズ）は、ハイドロゲルビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、ハイドロゲルを含む。
本明細書において開示される一部の実施形態は、１つまたは複数の粒子（例えば、ビーズ）を含む。粒子のそれぞれは、複数のオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード）を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、細胞標識、および標的結合領域（例えば、オリゴ（ｄＴ）配列、遺伝子特異的配列、ランダム多量体、またはこれらの組合せ）を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの細胞標識配列は、同じであってもよい。異なる粒子上のオリゴヌクレオチドの細胞標識配列は、異なる粒子上のオリゴヌクレオチドを特定することができるように、異なってもよい。異なる細胞標識配列の数は、異なる実装形態では異なり得る。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、これらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、またはそれ以上であってもよい。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、少なくとも、または最大で１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個であり得る。一部の実施形態では、複数の粒子のうちの１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、６０個以下、７０個以下、８０個以下、９０個以下、１００個以下、２００個以下、３００個以下、４００個以下、５００個以下、６００個以下、７００個以下、８００個以下、９００個以下、１０００個以下、またはそれ以上を上回らないものが、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数の粒子は、最大で０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、複数の粒子のうちのいずれもが、同じ細胞標識配列を有さない。
それぞれの粒子上の複数のオリゴヌクレオチドは、異なるバーコード配列（例えば、分子標識）を含み得る。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、少なくとも、または最大で１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個であり得る。例えば、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個は、異なるバーコード配列を含む。別の例として、単一の粒子において、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、１５０００個、２００００個、５００００個、これらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはそれよりも多くが、異なるバーコード配列を含む。一部の実施形態は、バーコードを含む複数の粒子を提供する。一部の実施形態では、標識しようとする標的の発生（またはコピーもしくは数）と、異なるバーコード配列との比は、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、試料標識、ユニバーサル標識、または両方をさらに含む。粒子は、例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子であり得る。
ビーズのサイズは、変動し得る。例えば、ビーズの径は、０．１マイクロメートル～５０マイクロメートルの範囲に及び得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０マイクロメートル、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。
ビーズの径は、基質のウェルの径に関連し得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、ウェルの径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、長いかまたは短くてもよい。ビーズの径は、細胞（例えば、基質のウェルによって包囲される単一細胞）の径と関連し得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、ウェルの径よりも、少なくとも、または最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、長いかまたは短くてもよい。ビーズの径は、細胞（例えば、基質のウェルによって包囲される単一細胞）の径と関連し得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、細胞の径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、長いかまたは短くてもよい。一部の実施形態では、ビーズの径は、細胞の径よりも、少なくとも、または最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％、長いかまたは短くてもよい。
ビーズは、基質に結合および／または包埋されていてもよい。ビーズは、ゲル、ハイドロゲル、ポリマー、および／またはマトリックスに結合および／または包埋されていてもよい。基質（例えば、ゲル、マトリックス、スキャフォールド、またはポリマー）内のビーズの空間位置は、位置アドレスとしての機能を果たし得るビーズ上のバーコードに存在する空間標識を使用して特定することができる。
ビーズの例としては、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシル末端化磁性ビーズを挙げることができるが、これらに限定されない。
ビーズは、量子ドットまたは蛍光色素と会合（例えば、それを含浸）させて、それを１つの蛍光光学チャネルまたは複数の光学チャネルにおいて蛍光性にすることができる。ビーズは、酸化鉄または酸化クロムと会合させて、それを常磁性または強磁性にすることができる。ビーズは、特定可能であり得る。例えば、ビーズは、カメラを使用してイメージングすることができる。ビーズは、ビーズと会合した検出可能なコードを有し得る。例えば、ビーズは、バーコードを含み得る。ビーズは、例えば、有機または無機溶液中での膨張に起因して、サイズが変化し得る。ビーズは、疎水性であり得る。ビーズは、親水性であり得る。ビーズは、生体適合性であり得る。
固体支持体（例えば、ビーズ）は、視覚化することができる。固体支持体は、視覚化タグ（例えば、蛍光色素）を含み得る。固体支持体（例えば、ビーズ）は、識別子（例えば、数字）をエッチングすることができる。識別子は、ビーズのイメージングを通じて視覚化することができる。
固体支持体は、不溶性、半可溶性、または不溶性材料を含み得る。固体支持体は、そこに結合したリンカー、スキャフォールド、構築ブロック、または他の反応性部分が含まれる場合、「官能化」されたと称され得るが、固体支持体は、そこに結合したそのような反応性部分が欠如している場合、「非官能化」であり得る。固体支持体は、溶液中、例えばマイクロタイターウェル形式において、フロースルー形式、例えばカラムにおいて、またはディップスティックにおいて、自由に用いることができる。
固体支持体は、膜、紙、プラスチック、コーティング表面、平坦面、ガラス、スライド、チップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。固体支持体は、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何構成の形態をとり得る。固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、キャリパー、平坦支持体、例えば、ガラス繊維フィルタ、ガラス面、金属面、金属面（鋼、金銀、アルミニウム、シリコン、および銅）、ガラス支持体、プラスチック支持体、シリコン支持体、チップ、フィルタ、膜、マイクロウェルプレート、スライド、多重ウェルプレートもしくは膜を含むプラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、二フッ化ポリビニリデンか形成される）、および／またはウエハ、コーム、ピンもしくはニードル（例えば、コンビナトリアル合成もしくは分析に好適なピンのアレイ）、または平坦面の穴もしくはナノリットルウェルのアレイ、例えば、ウエハ（例えば、シリコンウエハ）、底部がフィルタになっているか、もしくはなっていない穴を有するウエハにおけるビーズを含み得る。
固体支持体は、ポリマーマトリックス（例えば、ゲル、ハイドロゲル）を含み得る。ポリマーマトリックスは、細胞内空間（例えば、オルガネラの周囲）に浸透することが可能であり得る。ポリマーマトリックスは、循環系を通して送り出すことが可能であり得る。
基質およびマイクロウェルアレイ
本明細書で使用される場合、基質は、ある種の固体支持体を指し得る。基質は、本開示のバーコードまたは確率的バーコードを含み得る固体支持体を指し得る。基質は、例えば、複数のマイクロウェルを含み得る。例えば、基質は、２つ以上のマイクロウェルを含むウェルアレイであり得る。一部の実施形態では、マイクロウェルは、容積が定義されている小さな反応チャンバを含み得る。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つまたは複数の細胞を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの細胞を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つまたは複数の固体支持体を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの固体支持体を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、単一の細胞および単一の固体支持体（例えば、ビーズ）を取り込む。マイクロウェルは、本開示のバーコード試薬を含み得る。
バーコード化の方法
本開示は、身体試料（例えば、組織、器官、腫瘍、細胞）の別個の位置における別個の標的の数を概算するための方法を提供する。本方法は、試料に近接してバーコード（例えば、確率的バーコード）を配置するステップ、試料を溶解させるステップ、別個の標的をバーコードと会合させるステップ、標的を増幅させるステップ、および／または標的をデジタル計数するステップを含み得る。本方法は、バーコードの空間標識から得られる情報を分析および／または視覚化するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、方法は、試料中の複数の標的を視覚化するステップを含む。複数の標的を試料のマップにマッピングするステップは、試料の二次元マップまたは三次元マップを作成するステップを含み得る。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコード化（例えば、確率的バーコード化）する前または後に作成され得る。試料中の複数の標的を視覚化するステップは、複数の標的を試料のマップにマッピングするステップを含み得る。複数の標的を試料のマップにマッピングするステップは、試料の二次元マップまたは三次元マップを作成するステップを含み得る。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコード化する前または後に作成され得る。一部の実施形態では、二次元マップおよび三次元マップは、試料を溶解させるステップの前または後に作成され得る。二次元マップまたは三次元マップを作成する前または後に試料を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、複数の標的をバーコード化するステップは、複数のバーコードを複数の標的にハイブリダイズさせ、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）を作製するステップを含む。複数の標的をバーコード化するステップは、バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップを含み得る。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を含む固体支持体を用いて実施され得る。
試料とバーコードを接触させるステップ
本開示は、試料（例えば、細胞）を本開示の基質に接触させるための方法を提供する。例えば、細胞、臓器、または組織の薄切片を含む試料を、バーコード（例えば、確率的バーコード）に接触させることができる。例えば、重力流によって、細胞を接触させることができ、その場合、細胞は定着して単層を形成し得る。試料は、組織薄片であってもよい。薄片を基質上に配置することができる。試料は、一次元であってもよい（例えば、平面表面を形成してもよい）。例えば、基質上で細胞を増殖させる／培養することによって、試料（例えば、細胞）を基質全体に広げることができる。
バーコードが標的と近接して存在する場合、標的は、バーコードにハイブリダイズし得る。それぞれ別個の標的が、本開示の別個のバーコードと会合し得るように、バーコードを、非枯渇的比率で接触させることができる。標的とバーコードとの間の効率的な会合を確実にするために、標的をバーコードと架橋させてもよい。
細胞溶解
細胞およびバーコードの分配後に、細胞を溶解させて、標的分子を遊離させることができる。細胞溶解は、種々の手段のいずれかによって、例えば、化学的もしくは生化学的手段によって、浸透圧ショックによって、または熱溶解、機械溶解、もしくは光学溶解によって達成することができる。界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉドデシルスルフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、またはＮＰ－４０）、有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトン）、もしくは消化酵素（例えば、プロテイナーゼＫ、ペプシン、またはトリプシン）、またはこれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液を添加することによって、細胞を溶解させてもよい。標的とバーコードとの会合を増加させるために、例えば、温度を低下させるおよび／またはライセートの粘度を増加させることによって、標的分子の拡散速度を変化させてもよい。
一部の実施形態では、濾紙を使用することによって、試料を溶解させてもよい。濾紙は、濾紙の上を溶解緩衝液で浸漬可能である。試料の溶解および基質への試料の標的のハイブリダイゼーションを促進可能な圧力で試料に適用することができる。
一部の実施形態では、溶解は、機械溶解、熱溶解、光学溶解、および／または化学溶解によって実施することができる。化学溶解には、プロテイナーゼＫ、ペプシン、およびトリプシンなどの消化酵素の使用が含まれてもよい。溶解は、基質への溶解緩衝液の添加によって実施することができる。溶解緩衝液は、トリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより多いトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、最大で約０．０１、０．０５、０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより多いトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、約０．１ＭのトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液のｐＨは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより高い値であってもよい。溶解緩衝液のｐＨは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより高い値であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液のｐＨは、約７．５である。溶解緩衝液は、塩（例えば、ＬｉＣｌ）を含んでもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、少なくとも約０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、最大約０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の塩濃度は、約０．５Ｍである。溶解緩衝液は、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉドデシルスルフェート、ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ｔｗｅｅｎ、ＮＰ－４０）を含んでもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、少なくとも約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、もしくは７％、またはそれより高い割合であってもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、最大約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、もしくは７％、またはそれより高い割合であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、約１％のＬｉドデシルスルフェートである。溶解のための方法において使用される時間は、使用される界面活性剤の量に依存し得る。一部の実施形態では、使用される界面活性剤が多いほど、溶解のために必要とされる時間は少ない。溶解緩衝液は、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を含んでもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｍＭ、またはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、最大約１、５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｍＭ、またはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、約１０ｍＭである。溶解緩衝液は、還元試薬（例えば、ベータ－メルカプトエタノール、ＤＴＴ）を含んでもよい。溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５、もしくは２０ｍＭまたはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、最大約１、５、１０、１５、もしくは２０ｍＭまたはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、約５ｍＭである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、約０．１ＭのトリスＨＣｌ（約ｐＨ７．５）、約０．５ＭのＬｉＣｌ、約１％のリチウムドデシルスルフェート、約１０ｍＭのＥＤＴＡ、および約５ｍＭのＤＴＴを含んでもよい。
溶解は、約４、１０、１５、２０、２５、または３０℃の温度で実施することができる。溶解は、約１、５、１０、１５、２０分、またはそれより長い時間実施することができる。溶解された細胞は、少なくとも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００個、またはそれより多い標的核酸分子を含んでもよい。溶解された細胞は、最大約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００個、またはそれより多い標的核酸分子を含んでもよい。
標的核酸分子へのバーコードの結合
細胞の溶解およびそれからの核酸分子の放出の後に、核酸分子は、共局在化された固体支持体のバーコードとランダムに会合し得る。会合には、標的核酸分子の相補的部分へのバーコードの標的認識領域のハイブリダイゼーションが含まれ得る（例えば、バーコードのオリゴ（ｄＴ）は、標的のポリ（Ａ）テールと相互作用し得る）。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件（例えば、緩衝液のｐＨ、イオン強度、温度など）は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。一部の実施形態では、溶解された細胞から放出された核酸分子は、基質上の複数のプローブと会合し得る（例えば、基板上のプローブとハイブリダイズする）。プローブが、オリゴ（ｄＴ）を含む場合、ｍＲＮＡ分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写され得る。オリゴヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）部分は、ｃＤＮＡ分子の第１鎖合成のためのプライマーとして作用し得る。例えば、図２のブロック２１６に示すバーコード化の非限定的な例において、ｍＲＮＡ分子は、ビーズ上のバーコードにハイブリダイズし得る。例えば、一本鎖ヌクレオチド断片は、バーコードの標的結合領域にハイブリダイズし得る。
結合は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の一部分とのライゲーションをさらに含み得る。例えば、標的結合領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ付着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイゼーションが可能となり得る核酸配列を含み得る。アッセイの手順は、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で標的核酸を処置して、制限部位オーバーハングを生成することをさらに含み得る。次いで、バーコードは、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートされ得る。２つの断片を接続するために、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を使用することができる。
例えば、図２のブロック２２０に示すバーコード化の非限定的な例では、複数の細胞（または複数の試料）に由来する標識標的（例えば、標的－バーコード分子）を、次に、例えば、チューブ中にプールすることができる。例えば、バーコードおよび／または標的－バーコード分子が結合したビーズを回収することによって、標識標的をプールすることができる。
結合した標的－バーコード分子の固体支持体ベースのコレクションの回収は、磁性ビーズおよび外部から印加された磁界の使用によって実現され得る。標的－バーコード分子がプールされたら、すべてのさらなる処理を単一反応槽内で進行させることができる。さらなる処理としては、例えば、逆転写反応、増幅反応、切断反応、解離反応、および／または核酸伸長反応が挙げることができる。さらなる処理反応は、マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞から標識標的核酸分子を最初にプールすることなく、実施することができる。
逆転写
本開示は、逆転写（例えば、図２のブロック２２４）を使用して、標的－バーコードコンジュゲートを作製するための方法を提供する。標的－バーコードコンジュゲートは、バーコードと標的核酸のすべてまたは一部分の相補配列（すなわち、バーコード化されたｃＤＮＡ分子、例えば、確率的にバーコード化されたｃＤＮＡ分子）とを含み得る。会合したＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写酵素と一緒に逆転写プライマーを添加することによって起こり得る。逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２～１８ヌクレオチド長であってもよく、または約１２～１８ヌクレオチド長であってもよく、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）テールに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、種々の相補部位でｍＲＮＡに結合し得る。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的のｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
一部の実施形態では、標識ＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写プライマーの添加によって起こり得る。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーである。一般的に、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２～１８ヌクレオチド長であり、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）テールに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、種々の相補部位でｍＲＮＡに結合し得る。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的のｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
逆転写は、繰り返し起こり、複数の標識ｃＤＮＡ分子を生じ得る。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の逆転写反応を行うステップを含み得る。本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の逆転写反応を行うステップを含み得る。
増幅
標識標的核酸分子の複数のコピーを作製するために、１または複数回の核酸増幅反応（例えば、図２のブロック２２８）を実施することができる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される、多重方式で実施することができる。増幅反応を使用して、核酸分子にシーケンシングアダプターを付加することができる。増幅反応は、存在する場合、試料標識のうちの少なくとも一部分を増幅することを含み得る。増幅反応は、細胞標識および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）の少なくとも一部分を増幅させるステップを含み得る。増幅反応は、試料タグ、細胞標識、空間標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的核酸、またはこれらの組合せのうちの少なくとも一部分を増幅することを含み得る。増幅反応は、複数の核酸の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲もしくは数を増幅することを含み得る。本方法は、試料標識、細胞標識、空間標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含む標的－バーコード分子のｃＤＮＡコピーを１つまたは複数生成するために、１または複数回のｃＤＮＡ合成反応を行うステップをさらに含み得る。
一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、増幅を実施することができる。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のＤＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅するための反応を指し得る。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、以下に限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲを含む、反応の派生形を包含し得る。
標識核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含み得る。非ＰＣＲベースの方法の例としては、以下に限定されないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークル－サークル増幅が挙げられる。他の非ＰＣＲベースの増幅方法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動ＲＮＡ転写増幅またはＲＮＡ指向ＤＮＡ合成および転写の多重サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ならびにＱβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用するオリゴヌクレオチド駆動増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズされかつ得られた二本鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅方法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用する鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに分岐伸長増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。一部の実施形態では、増幅は、環化転写物を生成しない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、標識核酸（例えば、標識ＲＮＡ、標識ＤＮＡ、標識ｃＤＮＡ）上でポリメラーゼ連鎖反応を行い、標識アンプリコン（例えば、確率標識アンプリコン）を生成するステップをさらに含む。標識アンプリコンは、二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズされたＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料標識、空間標識、細胞標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含み得る。標識アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含み得る。本開示の核酸は、合成核酸または改変核酸を含み得る。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含み得る。非天然ヌクレオチドは、光不安定性またはトリガー性のヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を挙げることができる。非天然ヌクレオチドを増幅反応の１または複数回のサイクルに添加することができる。非天然ヌクレオチドの添加を使用して、増幅反応の特定のサイクルまたは時点として産物を同定することができる。
１または複数回の増幅反応を行うことは、１つまたは複数のプライマーの使用を含み得る。１つまたは複数のプライマーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５またはそれより多いヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５またはそれより多いヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、１２未満～１５ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的（例えば、確率標識標的）のうちの少なくとも一部分にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的の３’末端または５’末端にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的の内部領域にアニールし得る。内部領域は、複数の標識標的の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマーの一定パネルを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の遺伝子特異的プライマーを含み得る。
１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールし得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、第１の試料標識、第２の試料標識、空間標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的、またはこれらの任意の組合せにアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。カスタムプライマーは、１つまたは複数の標的を増幅するように設計され得る。標的は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含み得る。標的は、１つまたは複数の試料中の全標識標的のサブセットを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６０個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６００個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、２つ以上の異なる標識核酸にアニールし得る。２つ以上の異なる標識核酸は、１つまたは複数の遺伝子に対応し得る。
任意の増幅スキームを本開示の方法において使用することができる。例えば、一スキームでは、１回目のＰＣＲによって、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１の配列に対するプライマーを使用して、ビーズに結合した分子を増幅することができる。２回目のＰＣＲでは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー２の配列に隣接するネステッド遺伝子特異的プライマー、およびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１の配列に対するプライマーを使用して、第１のＰＣＲ産物を増幅することができる。３回目のＰＣＲでは、Ｐ５およびＰ７ならびに試料インデックスが付加されて、ＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーに入れる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシングは、リード１上の細胞標識およびバーコード配列（例えば、分子標識）、リード２上の遺伝子、ならびにインデックス１リード上の試料インデックスを明らかにし得る。
一部の実施形態では、化学的切断を使用して基質から核酸を除去することができる。例えば、核酸中に存在する化学基または修飾塩基を使用して、固体支持体からのその除去を促進することができる。例えば、酵素を使用して、核酸を基質から除去することができる。例えば、核酸は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって、基質から除去することができる。例えば、ｄＵＴＰまたはｄｄＵＴＰを含有する核酸のウラシル－ｄ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理を使用して、核酸を基質から除去することができる。例えば、ヌクレオチド切除を実施する酵素、例えば、塩基除去修復酵素、例えば、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼを使用して、核酸を基質から除去することができる。一部の実施形態では、光切断可能な基と光とを使用して、核酸を基質から除去することができる。一部の実施形態では、切断可能なリンカーを、核酸を基質から除去するために使用することができる。例えば、切断可能なリンカーは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、Ｉｇ－プロテインＡ、光不安定性リンカー、酸もしくは塩基不安定性リンカー基、またはアプタマーのうちの少なくとも１つを含み得る。
プローブが遺伝子特異的である場合、分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写および／または増幅され得る。一部の実施形態では、核酸が合成された（例えば、逆転写された）後に、増幅され得る。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される多重方式で実施することができる。増幅によって、核酸にシーケンシングアダプターを付加し得る。
一部の実施形態では、増幅は、例えば、ブリッジ増幅を用いて基質上で実施することができる。基質上でオリゴ（ｄＴ）プローブを使用するブリッジ増幅に適合する末端を生成するために、ｃＤＮＡにホモポリマーテールを付加することができる。ブリッジ増幅では、テンプレート核酸の３’末端に相補的なプライマーは、固体粒子に共有結合される各対の第１のプライマーであってもよい。テンプレート核酸を含有する試料が粒子に接触しており、かつ１回の熱サイクルが実施される場合、テンプレート分子は第１のプライマーにアニールされ、かつ第１のプライマーはヌクレオチドの添加によって順方向に伸長して、テンプレート分子とテンプレートに相補的な新たに形成されたＤＮＡ鎖とからなる二本鎖分子を形成し得る。次のサイクルの加熱ステップでは、二本鎖分子は変性されて、粒子からテンプレート分子を放出し、第１のプライマーを通じて粒子に結合した相補的ＤＮＡ鎖を残存させ得る。続くアニーリングおよび伸長ステップのアニーリング段階では、相補鎖は、第１のプライマーから除去された位置の相補鎖のセグメントに相補的な第２のプライマーにハイブリダイズし得る。このハイブリダイゼーションにより、相補鎖は、共有結合により第１のプライマーにかつハイブリダイゼーションにより第２のプライマーに固定化されたブリッジを第１および第２のプライマー間に形成し得る。伸長段階では、第２のプライマーは、同一の反応混合物中にヌクレオチドを添加することにより逆方向に伸長し、それにより、ブリッジを二本鎖ブリッジに変換し得る。次いで、次のサイクルが開始し、二本鎖ブリッジは変性されて、それぞれ第１および第２のプライマーを通じて粒子表面に結合した一方の末端と、それぞれ未結合の他方の末端とを有する２つの一本鎖核酸分子を得ることができる。この第２のサイクルのアニーリングおよび伸長ステップでは、各鎖は同一の粒子上のこれまで未使用であったさらなる相補的プライマーにハイブリダイズして、新たな一本鎖ブリッジを形成し得る。この時点でハイブリダイズされる２つのこれまで未使用であったプライマーは、伸長して２つの新たなブリッジを二本鎖ブリッジに変換する。
増幅反応は、複数の核酸の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％を増幅することを含み得る。
標識核酸の増幅は、ＰＣＲベースの方法または非ＰＣＲベースの方法を含み得る。標識核酸の増幅は、標識核酸の指数関数的増幅を含み得る。標識核酸の増幅は、標識核酸の線形増幅を含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を指し得る。ＰＣＲは、以下に限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、サプレッションＰＣＲ、セミサプレッシブＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲを含む、反応の派生形を包含し得る。
一部の実施形態では、標識核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含む。非ＰＣＲベースの方法の例としては、以下に限定されないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークル－サークル増幅が挙げられる。他の非ＰＣＲベースの増幅方法としては、ＤＮＡもしくはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動ＲＮＡ転写増幅もしくはＲＮＡ指向ＤＮＡ合成および転写の多重サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、にＱβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用するオリゴヌクレオチド駆動増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズされかつ得られた二本鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅方法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用する鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに／または分岐伸長増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、増幅アンプリコン（例えば、標的）上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行うステップをさらに含む。アンプリコンは二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズされたＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料タグまたは分子識別子標識を含み得る。代替的に、アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含み得る。本発明の核酸は、合成核酸または改変核酸を含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、多数のアンプリコンを生成するために標識核酸を繰返し増幅するステップを含む。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の増幅反応を行うステップを含み得る。代替的に、本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の増幅反応を行うステップを含む。
増幅は、複数の核酸を含む１つまたは複数の試料に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含み得る。増幅は、複数の核酸に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含み得る。対照核酸は、対照標識を含み得る。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含み得る。非天然ヌクレオチドは、光不安定性および／またはトリガー性ヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。非天然ヌクレオチドを増幅反応の１または複数回のサイクルに添加することができる。非天然ヌクレオチドの添加を使用して、増幅反応の特定のサイクルまたは時点として産物を同定することができる。
増幅反応を１または複数回行うことは、１つまたは複数のプライマーの使用を含み得る。１つまたは複数のプライマーは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７～９ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１２未満～１５ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸のうちの少なくとも一部分にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸の３’末端および／または５’末端にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸の内部領域にアニールし得る。内部領域は、複数の標識核酸の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマーの一定パネルを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールし得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、第１の試料タグ、第２の試料タグ、分子識別子標識、核酸またはその産物にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。カスタムプライマーは、１つまたは複数の標的核酸を増幅するように設計され得る。標的核酸は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、本開示のアレイに結合したプローブである。
一部の実施形態では、試料中の複数の標的をバーコード化するステップ（例えば、確率的にバーコード化するステップ）は、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）またはそれらの標的のバーコード化された断片のインデックス化されたライブラリーを生成するステップをさらに含む。異なるバーコードのバーコード配列（例えば、異なる確率的バーコードの分子標識）は、互いに異なっていてもよい。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、試料中の複数の標的から複数のインデックス化されたポリヌクレオチドを生成するステップを含む。例えば、第１のインデックス化された標的と第２のインデックス化された標的とを含むバーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーについて、第１のインデックス化されたポリヌクレオチドの標識領域は、第２のインデックス化されたポリヌクレオチドの標識領域と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲で異なっていてもよい。一部の実施形態では、バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、複数の標的、例えば、ｍＲＮＡ分子を、ポリ（Ｔ）領域および標識領域を含む複数のオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、各々がｃＤＮＡ領域および標識領域を含む一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するために、逆転写酵素を使用して第１鎖合成を行うステップとを含み、ここで、複数の標的は、異なる配列のうちの少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含み、複数のオリゴヌクレオチドは、異なる配列のうちの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を増幅して、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子上でネステッドＰＣＲを行って、標識アンプリコンを生成するステップとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本方法は、アダプター－標識アンプリコンを生成するステップを含み得る。
バーコード化するステップ（例えば、確率的にバーコード化するステップ）は、核酸バーコードまたはタグを使用して、個々の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子を標識するステップを含み得る。一部の実施形態では、これは、ＤＮＡバーコードまたはタグがｍＲＮＡから生成される際に、ｃＤＮＡ分子にこれらを付加するステップを含む。ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスの最小化を実施することができる。例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用するシーケンシングのためにアダプターを付加することができる。例えば、図２のブロック２３２の標的の１つまたは複数のコピーの細胞標識、分子標識、およびヌクレオチド断片の配列を決定するために、シーケンシング結果を使用することができる。
図３は、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）、例えば、バーコード化されたｍＲＮＡまたはその断片のインデックス化されたライブラリーを生成する非限定的な例示的プロセスを示す略図である。ステップ１に示されるように、逆転写プロセスによって、固有の分子標識配列、細胞標識配列、およびユニバーサルＰＣＲ部位を含む各ｍＲＮＡ分子がコードされ得る。特に、ＲＮＡ分子３０２のポリ（Ａ）テール領域３０８への、バーコード（例えば、確率的バーコード）３１０のセットのハイブリダイゼーション（例えば、確率的ハイブリダイゼーション）によって、ＲＮＡ分子３０２を逆転写して、ｃＤＮＡ領域３０６を含む標識ｃＤＮＡ分子３０４を生成することができる。バーコード３１０のそれぞれは、標的結合領域、例えば、ポリ（ｄＴ）領域３１２、標識領域３１４（例えば、バーコード配列または分子）、およびユニバーサルＰＣＲ領域３１６を含み得る。
一部の実施形態では、細胞標識配列は、３～２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、分子標識配列は、３～２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、複数の確率的バーコードのそれぞれは、ユニバーサル標識および細胞標識のうちの１つまたは複数をさらに含み、ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであり、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じである。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、３～２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、３～２０ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、バーコード配列または分子標識３１８および細胞標識３２０を含み得る。一部の実施形態では、標識領域３１４は、ユニバーサル標識、次元標識、および細胞標識のうちの１つまたは複数を含み得る。バーコード配列または分子標識３１８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。細胞標識３２０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであってもよく、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであってもよい。次元標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、もしくはこれらの値のいずれかの間の数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含み得る。各標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。バーコードまたは確率的バーコード３１０のセットは、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０であり得る。また、バーコードまたは確率的バーコード３１０のセットは、例えば、それぞれ、特有の標識領域３１４を含有し得る。過剰なバーコードまたは確率的バーコード３１０を除去するために、標識ｃＤＮＡ分子３０４は精製されてもよい。精製には、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製が含まれてもよい。
ステップ２に示すように、ステップ１の逆転写プロセスからの産物は、１チューブ中にプールされ、第１のＰＣＲプライマープールおよび第１のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。プールすることは、特有の標識領域３１４によって可能である。特に、標識ｃＤＮＡ分子３０４を増幅して、ネステッドＰＣＲ標識アンプリコン３２２を生成することができる。増幅は、多重ＰＣＲ増幅を含み得る。増幅は、単一反応量で９６多重プライマーを用いる多重ＰＣＲ増幅を含み得る。一部の実施形態では、多重ＰＣＲ増幅は、単一反応量で、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用することができる。増幅は、特定の遺伝子を標的化するカスタムプライマー３２６Ａ～Ｃを含む第１のＰＣＲプライマープール３２４およびユニバーサルプライマー３２８を含み得る。カスタムプライマー３２６は、標識ｃＤＮＡ分子３０４のｃＤＮＡ部分３０６’内の領域とハイブリダイズし得る。ユニバーサルプライマー３２８は、標識ｃＤＮＡ分子３０４のユニバーサルＰＣＲ領域３１６とハイブリダイズし得る。
図３のステップ３に示すように、ステップ２のＰＣＲ増幅からの産物は、ネステッドＰＣＲプライマープールおよび第２のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いて増幅され得る。ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスを最小限に抑えることができる。特に、ネステッドＰＣＲ標識アンプリコン３２２は、ネステッドＰＣＲによってさらに増幅することができる。ネステッドＰＣＲは、単一反応量でネステッドＰＣＲプライマー３３２ａ～ｃのネステッドＰＣＲプライマープール３３０と、第２のユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’とを含む多重ＰＣＲを含み得る。ネステッドＰＣＲプライマープール３２８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有し得る。ネステッドＰＣＲプライマー３３２は、アダプター３３４を含有し、標識アンプリコン３２２のｃＤＮＡ部分３０６’’内の領域とハイブリダイズし得る。ユニバーサルプライマー３２８’は、アダプター３３６を含有し、標識アンプリコン３２２のユニバーサルＰＣＲ領域３１６とハイブリダイズし得る。よって、ステップ３は、アダプター標識アンプリコン３３８を生成する。一部の実施形態では、ネステッドＰＣＲプライマー３３２と第２のユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’は、アダプター３３４および３３６を含有しなくてもよい。代わりに、アダプター３３４および３３６は、ネステッドＰＣＲの産物とライゲートして、アダプター標識アンプリコン３３８を生成することができる。
ステップ４に示すように、ステップ３からのＰＣＲ産物は、ライブラリー増幅プライマーを使用するシーケンシングのためにＰＣＲ増幅され得る。特に、アダプター３３４および３３６を使用して、アダプター標識アンプリコン３３８に関する１または複数回の追加のアッセイを行うことができる。アダプター３３４および３３６は、プライマー３４０および３４２とハイブリダイズされ得る。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、ＰＣＲ増幅プライマーであってもよい。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、シーケンシングプライマーであってもよい。アダプター標識アンプリコン３３８のさらなる増幅のために、１つまたは複数のアダプター３３４および３３６を使用することができる。アダプター標識アンプリコン３３８のシーケンシングのために、１つまたは複数のアダプター３３４および３３６を使用することができる。プライマー３４２は、プレートインデックス３４４を含有することができ、これによって、バーコードまたは確率的バーコード３１０の同じセットを使用して生成されたアンプリコンを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用する１回のシーケンシング反応でシーケンシングすることができる。
核酸標的の５’末端のバーコード化
本明細書の開示は、分子標識（または分子インデックス）を有するバーコード（例えば、確率的バーコード）の、バーコード化または標識化されている核酸標的（例えば、デオキシリボ核酸分子、およびリボ核酸分子）の５’末端への結合のための、システム、方法、組成物、およびキットを含む。本明細書に開示される５’ベースの転写物計数方法は、例えば、３’ベースの転写物計数方法（例えば、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標） Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）））を補うか、または補足することができる。バーコード化された核酸標的は、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／またはハイスループット方式の全長シーケンシングのために使用され得る。５’末端（標識されている標的核酸標的に対して５’側）での転写物計数によって、核酸分子の５’末端における、またはそれにより近い選択的スプライシングアイソフォームおよびバリアント（以下に限定されないが、スプライスバリアント、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、置換を含む）が明らかとなり得る。一部の実施形態では、本方法は、分子内ハイブリダイゼーションに関与し得る。
図４Ａ～４Ｂは、５’末端において核酸標的を遺伝子特異的に標識する非限定的な例示的方法４００の略図を示す。標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）テール４２２）を含むバーコード４２０（例えば、確率的バーコード）は、標識化またはバーコード化（例えば、固有の標識化）するために、ポリ（ｄＡ）テール４２６を介してポリアデニル化ＲＮＡ転写物４２４、または他の核酸標的に結合し得る。バーコード４２０は、後続反応のために各バーコード４２０の分子標識（ＭＬ）４２８／試料標識（ＳＬ）４３０領域に隣接する、１つまたは複数の追加の配列（例えば、アダプター配列４３２などのコンセンサス配列）と一緒に、それぞれ、転写物４２４を標識し、ＲＮＡ転写物４２４の試料起源を追跡するための分子標識４２８および試料標識４３０を含み得る。試料ごとのバーコードにおける分子標識の配列のレパートリーは、ＲＮＡ転写物の確率的標識化に対して十分に多量であり得る。
ＲＮＡ転写物４２４（またはその一部分）を含むバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４を生成するためのブロック４０２におけるｃＤＮＡ合成後に、遺伝子特異的方法を５’分子バーコード化のために使用することができる。選択的であり得るブロック４０４における遺伝子特異的増幅の後に、ブロック４０６において末端転写酵素およびデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）を添加し、３’ポリ（ｄＡ）テーリングを促進して、ポリ（Ａ）テール４３８を含むアンプリコン４３６を生成し得る。ブロック４０８における短い変性ステップによって、アンプリコン４３６のフォワード鎖４３６ｍおよびリバース鎖４３６ｃ（ポリ（ｄＡ）テールを含むバーコード化されたｃＤＮＡ分子）の離間が可能となる。アンプリコン４３６のリバース鎖４３６ｃは、鎖の３’末端およびポリ（ｄＴ）領域４２２末端におけるそのポリ（ｄＡ）テール４３８を介して分子内でハイブリダイズし、ブロック４１０において、ヘアピンまたはステムループ４４０を形成し得る。次いで、ポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）を使用して、バーコードを複製するためにポリ（ｄＡ）テール４３８から伸長させて、ブロック４１２において、伸長したバーコード化されたリバース鎖４４２を形成することができる。次いで、ブロック４１４（例えば、任意に）における遺伝子特異的増幅を、目的の遺伝子を増幅するために実施して、ブロック４１６において、シーケンシングのために、５’末端（ＲＮＡ転写物４２４に対して）においてバーコードを含むアンプリコン４４４を生成することができる。一部の実施形態では、方法４００は、ブロック４０４におけるバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４の遺伝子特異的増幅とブロック４１４における伸長したバーコード化されたリバース鎖４４２の遺伝子特異的増幅のうちの一方または両方を含む。
図５Ａ～５Ｂは、全トランスクリプトーム分析のために５’末端において核酸標的を標識する非限定的な例示的方法５００の略図を示す。標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）テール４２２）を含むバーコード４２０（例えば、確率的バーコード）は、標識化またはバーコード化（例えば、固有の標識化）するために、ポリ（ｄＡ）テール４２６を介してポリアデニル化されたＲＮＡ転写物４２４、または他の核酸標的に結合し得る。例えば、標的結合領域を含むバーコード４２０は、標識化またはバーコード化のために、核酸標的に結合し得る。バーコード４２０は、分子標識（ＭＬ）４２８および試料標識（ＳＬ）４３０を含み得る。分子標識４２８および試料標識４３０は、転写物４２４、または核酸標的（例えば、抗体と会合したかまたは抗体から解離した、抗体オリゴヌクレオチド）を標識し、転写物４２４の試料起源を追跡するために、それぞれ、後続反応のための各バーコード４２０の分子標識４２８／試料標識４３０領域に隣接する、１つまたは複数の追加の配列（例えば、アダプター配列４３２などのコンセンサス配列）と一緒に、使用することができる。試料ごとのバーコードにおける分子標識４２８の配列のレパートリーは、ＲＮＡ転写物４２４、または核酸標的の確率的標識化に対して十分に多量であり得る。
ブロック４０２におけるバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４を生成するためのｃＤＮＡ合成の後に、末端転移酵素を、バーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４の３’末端（標識されたＲＮＡ転写物の５’末端に等しい）のＡ－テーリングのために使用し、ブロック４０６において、３’ポリ（ｄＡ）テール４３８をそれぞれ含むｃＤＮＡ分子４３６ｃを生成することができる。ｃＤＮＡ分子４３６ｃの３’ポリ（ｄＡ）テール４３８との分子内ハイブリダイゼーションが開始され（例えば、加熱および冷却サイクルによるか、またはバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３６ｃをポリ（ｄＡ）テール４３８で希釈することによって）、その結果、新たな３’ポリ（ｄＡ）テール４３８が、同じ標識されたｃＤＮＡ分子のポリ（ｄＴ）テール４２２とアニーリングし、ブロック４１０において、バーコード化されたｃＤＮＡ分子のヘアピンまたはステムループ構造４４０を生成することができる。ブロック４１２では、新たな３’ポリ（ｄＡ）テール４３８を超える３’伸長を促進するために、ｄＮＴＰと共にポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素）を添加し、バーコード（例えば、ステムループ４４０を有する標識されたｃＤＮＡ分子の５’末端に存在する分子標識４２８）を複製することができる。ブロック４１４では、鏡像化したアダプター４３２、４３２ｒｃまたはアダプター４３２、４３２ｒｃの配列（または部分配列）を含有するプライマーを使用して、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）を実施することができる。ブロック４１８では、シーケンシングのために（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．）シーケンサーを使用して）、タグメンテーションまたはランダムプライミングなどの方法を使用して、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ４４６およびＰ７ ４４８配列）を含むより小さなアンプリコン４４４の断片を生成することができる。一部の実施形態では、他のシーケンシング方法またはシーケンサー（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳ）またはＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）からのシーケンサー）のためのシーケンシングアダプターを直接ライゲーションさせて、シーケンシングのためのアンプリコンを生成することができる。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、試料中の核酸標的４２４のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０に接触させるステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれが、分子標識配列４２８および核酸標的４２４にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）配列４２２）を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列４２８を含む、ステップと、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させて、ブロック４０２において、それぞれが、核酸標的４２４の少なくとも一部分に相補的な配列４５０ｃを含む、複数の核酸分子４３４を生成するステップと、ブロック４０４において、複数のバーコード化された核酸分子４３４を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された核酸分子４３６を生成するステップと、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子４３６に結合させて、ブロック４０６において、それぞれが、標的結合領域４２２および標的結合領域の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて、ブロック４１０において、ステムループ４４０を形成するステップと、ブロック４１２において、それぞれ、ステムループ４４０を含む複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成するステップと、ブロック４１４において、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させて、それぞれが、分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の単一標識核酸分子４４４ｃを生成するステップと、複数の単一標識核酸分子と会合した別個の配列を有する分子標識の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的の数を決定するステップとを含む。
一部の実施形態では、分子標識４２８は、ステムループ４４０を有する複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、分子標識の相補体４２８ｒｃにハイブリダイズされる。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を変性させて、複数の単一標識核酸分子４４４ｃ（アンプリコン４４４ｃの一部であってもよい）を生成するステップを含み得る。試料中の核酸標的４２４のコピーを接触させるステップは、複数の核酸標的４２４のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０に接触させるステップを含み得る。核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップは、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした複数の核酸標的４２４のコピーを伸長させて、それぞれが、複数の核酸標的４２４のうちの１つの少なくとも一部分に相補的な配列４５０ｃを含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップを含み得る。核酸標的４２４の数を決定するステップは、複数の核酸標的４２４のそれぞれの配列４５２ｃを含む、複数の単一標識核酸分子４４４ｃのうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する分子標識の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の複数の核酸標的４２４のそれぞれの数を決定するステップを含み得る。複数の核酸標的のそれぞれの配列４５２ｃは、複数の核酸標的４２４のそれぞれの部分配列（相補体または逆相補体を含む）を含み得る。
本明細書の開示は、試料中の標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０を使用して、試料中の核酸標的４２４のコピーをバーコード化して（４０２）、それぞれが、核酸標的４２４の配列４５０ｃ（例えば、相補配列、逆相補配列、またはこれらの組合せ）、分子標識４２８、および標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）領域４２２）を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３４を生成するステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列４２８を含む、ステップと、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子４３４に結合して（４０６）、それぞれが、標的結合領域４２２および該標的結合領域４２２の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６を生成する、ステップと、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２と会合した別個の配列を有する分子標識の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップとを含む。
本明細書の開示は、オリゴヌクレオチドバーコードを試料中の標的に結合させるための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０を使用して、試料中の核酸標的４２４のコピーをバーコード化して（４０２）、それぞれが、核酸標的４２４の配列４５０ｃ、分子標識４２８、および標的結合領域４２２を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３４を生成するステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列４２８を含む、ステップと、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子４３４に結合させて、それぞれが、標的結合領域４２２および該標的結合領域４２２の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識４２８の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成するステップとを含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２と会合した、別個の配列を有する分子標識４２８、その相補体４２８ｒｃ、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップを含む。例えば、核酸標的４２４の数は、別個の配列を有する分子標識４２８、その相補体４２８ｒｃのうちの一方または両方に基づいて決定され得る。
一部の実施形態では、複数の標的４２４のコピーをバーコード化するステップ（４０２）は、核酸標的４２４のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０に接触させるステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれが、核酸標的４２４にハイブリダイズさせることが可能な標的結合領域４２２を含む、ステップと、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させて（４０２）、複数のバーコード化された核酸分子４３４を生成するステップとを含む。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコード化された核酸分子４３４を増幅させて（４０４）、複数の増幅したバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップであって、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップが、標的結合領域の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが、標的結合領域４２２および該標的結合領域の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｒを生成するステップを含む、ステップを含む。
遺伝子特異的分析。一部の実施形態では、本方法（例えば、方法４００）は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させて（４１４）、それぞれが、分子標識４２８の相補体４２８ｒｃを含む、複数の単一標識核酸分子４４４ｃを生成するステップを含む。単一標識核酸分子４４４ｃは、それらを含有するアンプリコン４４４が変性される場合に生成され得る。試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップは、複数の単一標識核酸分子４４４ｃと会合した、別個の配列を有する分子標識４２８の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップを含み得る。
全トランスクリプトーム分析。一部の実施形態では、本方法（例えば、方法５００）は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させて（４１４）、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー４４４ｃを生成するステップを含む。試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップは、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー４４４ｃと会合した、別個の配列を有する分子標識４２８の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップを含む。複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー４４４ｃは、それらを含有するアンプリコン４４４が変性される場合に形成され得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列４５２ｃを含む。標的結合領域は、遺伝子特異的配列を含み得る。標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップ（４０６）は、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子４３４にライゲーションさせるステップを含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）配列４２２を含み得る。標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して、複数のアデノシン一リン酸を複数のバーコード化された核酸分子４３４に付加するステップを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップは、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを逆転写して、複数のバーコード化された相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子４３４を生成するステップを含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップ（４０２）を含み得る。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含んでもよい。
一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２の配列情報を得るステップを含む。配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ４４６およびＰ７ ４４８アダプター）を複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２に結合させるステップを含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域の相補体４３８は、標的結合領域の逆相補配列を含み得る。標的結合領域の相補体４３８は、標的結合領域の相補配列を含み得る。分子標識の相補体４２８ｒｃは、分子標識の逆相補配列を含み得る。分子標識の相補体は、分子標識の相補配列を含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子４３４は、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み得る。バーコード化された核酸分子４３４は、バーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み得る。核酸標的４２４は、核酸分子を含み得る。核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
抗体オリゴヌクレオチド。一部の実施形態では、核酸標的は、細胞成分結合試薬を含み得る。核酸標的（例えば、試料インデックス化オリゴヌクレオチドなどの抗体オリゴヌクレオチド）に会合した細胞結合試薬については、ＵＳ２０１８／００８８１１２、および２０１８年３月２７日に出願された米国出願第１５／９３７，７１３号に記載されており、これらの出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示の５’バーコード化方法を使用して、ゲノミクス、クロマチンアクセシビリティ、メチロミクス、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスなどの単一細胞のマルチオミクス情報を得ることができる。核酸分子は、細胞成分結合試薬に会合していてもよい。本方法は、核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含み得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの各分子標識４２８は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドバーコード４２０は、同一の試料標識４３０を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの各試料標識４３０は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード４２０は、同一の細胞標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、該複数のバーコード化された核酸分子のそれぞれにおいて、標的結合領域と該標的結合領域の相補体とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループを形成する場合に、固体支持体と会合している。複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、該複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成する場合に、固体支持体から解離し得る。複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、該複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成する場合に、固体支持体と会合していてもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子のうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、固体支持体と会合している。複数のバーコード化された核酸分子のうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、固体支持体から解離し得る。複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、固体支持体と会合していてもよい。固体支持体は、合成粒子４５４を含み得る。固体支持体は、平面表面または実質的平面表面（例えば、顕微鏡スライドまたはカバーガラスなどのスライド）を含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成する場合に、溶液中にある。例えば、溶液中の複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃの濃度が十分に低い場合に、このような分子内ハイブリダイゼーションが起こり得る。複数のバーコード化された核酸分子のうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、溶液中にあり得る。
一部の実施形態では、試料は、単一細胞を含み、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０を含む合成粒子４５４を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含む。本方法は、合成粒子４５４を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含み得る。単一細胞を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子と単一細胞は、同じウェル中にあり得る。合成粒子と単一細胞は、同じ液滴中にあり得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に固定化されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に部分的に固定化されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に封入されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に部分的に封入されていてもよい。合成粒子４５４は、崩壊可能であり得る。合成粒子４５４は、ビーズを含み得る。ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子４５４は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。合成粒子４５４は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれは、リンカー官能基を含み得る。合成粒子４５４は、固体支持体官能基を含み得る。支持体官能基およびリンカー官能基は、互いに会合していてもよい。リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
核酸標的の５’末端におけるバーコード化のためのキット
本明細書の開示は、オリゴヌクレオチドバーコード４２０を試料中の標的４２４に結合させる、試料中の標的４２４の数を決定する、および／または試料中の核酸標的４２４の数を決定するためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０であって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれが、分子標識４２８および標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）配列４２２）を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列４２８を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０；末端デオキシヌクレオチド転移酵素またはリガーゼ；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含み得る。キットは、緩衝液を含み得る。キットは、カートリッジを含み得る。キットは、逆転写反応のための１つまたは複数の試薬を含み得る。キットは、増幅反応のための１つまたは複数の試薬を含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む。オリゴヌクレオチドバーコードは、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に部分的に固定化されている。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に部分的に固定化されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に封入されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に部分的に封入されていてもよい。合成粒子４５４は、崩壊可能であり得る。合成粒子４５４は、ビーズを含み得る。ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。合成粒子４５４は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み得る。合成粒子４５４は、固体支持体官能基を含み得る。支持体官能基およびリンカー官能基は、互いに会合していてもよい。リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
５’転写物配列の決定
ハイスループット単一細胞ＲＮＡシーケンシングによって、複雑かつ不均一な生体試料についての理解は変化した。しかし、ほとんどの方法はｍＲＮＡ転写物情報の３’のみの分析しか可能にせず、スプライスバリアント、選択的転写開始部位およびＴ細胞およびＢ細胞の受容体と抗体とのＶＤＪ接合などの再編成による可変性の高い遺伝子座の分析が制限される場合がある。本明細書に開示されるように、ｍＲＮＡ分子が捕捉され、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙプラットフォームを使用して、ハイスループット方式で、転写物の３’末端と５’末端の両方に関してシーケンシングライブラリーが作成された。
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および抗体のＶＤＪ領域を同定するために、本開示の方法を使用することができる。体細胞組換えとしても公知の、ＶＤＪ組換えは、免疫系の免疫グロブリン（Ｉｇ）（例えば、ＢＣＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）産生の初期段階における遺伝子組換えの機序である。ＶＤＪ組換えによって、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および接合性（Ｊ）遺伝子セグメントが、ほぼランダムに組み合わされ得る。様々な遺伝子を選択する際のそのランダム性のために、細菌、ウイルス、寄生生物、腫瘍細胞などの機能不全細胞および花粉に由来する抗原に適合するタンパク質を多様にコードすることが可能となる。
ＶＤＪ領域は、可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子および接合性（Ｊ）遺伝子を含む３Ｍｂの大きな遺伝子座を含み得る。これらは、ＶＤＪ組換えに関与し得るセグメントである。ＶＤＪ組換えを受けない可能性もある定常遺伝子も存在し得る。この遺伝子座のＶＤＪ組換えにおける最初の事象は、Ｄ遺伝子のうちの１つをＪ遺伝子のうちの１つに対して再編成することであり得る。この後に、Ｖ遺伝子のうちの１つがこのＤＪ再編成に付加されて、後に重鎖タンパク質の可変セグメントをコードする機能的なＶＤＪ再編成遺伝子を形成することができる。これらのステップの両方が、介在ＤＮＡを欠失し得るリコンビナーゼ酵素によって触媒され得る。
この組換えプロセスは、前駆体Ｂ細胞において段階的に起こり、抗体レパートリーに必要とされる多様性をもたらす。各Ｂ細胞は、１つの抗体（例えば、ＢＣＲ）のみを生じ得る。この特異性は、１つの対立遺伝子の機能的再編成によって、第２の対立遺伝子のさらなる組換えを防ぐためのシグナルが伝達されるような、対立遺伝子排除によって達成され得る。
一部の実施形態では、試料は、免疫細胞を含む。免疫細胞としては、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、リンパ球系幹細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球、顆粒球、Ｂ細胞前駆体、Ｔ細胞前駆体、ナチュラルキラー細胞、Ｔｃ細胞、Ｔｈ細胞、形質細胞、メモリー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、単球、樹状細胞および／もしくはマクロファージ、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。
Ｔ細胞は、単一Ｔ細胞に由来するか、または同一のＴＣＲを有するＴ細胞を指し得るＴ細胞クローンであってもよい。Ｔ細胞は、Ｔ細胞クローンおよび異なるＴＣＲであるが、そのすべてが同じ標的（例えば、抗原、腫瘍、ウイルス）を認識することができる、ＴＣＲを有するＴ細胞の混合集団を含み得るＴ細胞株の一部であってもよい。末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源からＴ細胞を得ることができる。Ｆｉｃｏｌｌ分離を使用するなどして、対象から採取された血液単位からＴ細胞を得ることができる。アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって、個体の循環血に由来する細胞を得ることができる。アフェレーシス産物は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含み得る。細胞を洗浄し、培地中に再懸濁させて、目的の細胞を単離することができる。
赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球からＴ細胞を単離することができる。ポジティブまたはネガティブ選択技法によって、Ｔ細胞の特異的亜集団、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４、ＣＤＣ、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞をさらに単離することができる。例えば、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標） Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ、またはＸＣＹＴＥ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）とのインキュベーションによって、Ｔ細胞を単離することができる。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）は、抗原特異的（例えば、腫瘍に対して特異的）であり得る。
一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、リンパ節由来の活性化Ｂ細胞、リンパ芽球様細胞、休止Ｂ細胞、または例えば、リンパ腫由来の新生物Ｂ細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）であってもよい。ＡＰＣは、表面にＢＣＲＣタンパク質のうちの少なくとも１つを発現するＢ細胞または濾胞樹状細胞を指し得る。
本開示の方法を使用して、単一Ｔ細胞の分子表現型を追跡することができる。Ｔ細胞の様々なサブタイプは、様々な分子マーカーの発現によって識別することができる。Ｔ細胞は、ＴＣＲの多様なレパートリーから固有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ほとんどのＴ細胞では、ＴＣＲは、αおよびβ鎖のヘテロ二量体から構成されてもよく、各機能鎖は、Ｔ細胞発生中の体細胞ＤＮＡ組換え事象の産物であってもよく、単一の個体において１００万を超える異なるＴＣＲの発現を可能にする。ＴＣＲを使用して、個々のＴ細胞の同一性を定義することができ、免疫応答中のＴ細胞クローン増殖の系統追跡が可能となる。本開示の免疫学的方法は、以下に限定されないが、単一Ｔ細胞における固有のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の対合を特定すること、単一細胞レベルでＴＣＲおよびマーカーの発現を定量すること、個体におけるＴＣＲの多様性を特定すること、異なるＴ細胞集団において発現されるＴＣＲレパートリーを特徴付けること、ＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖の対立遺伝子の機能性を決定すること、および免疫応答の間のＴ細胞のクローン増殖を特定することを含む、様々な方法で使用され得る。
Ｔ細胞受容体鎖の対合
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔリンパ球表面に存在する認識分子である。Ｔ細胞表面に見られるＴ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖と称される２つの糖タンパク質サブユニットから構成され得る。両鎖は、約４０ｋＤａの分子量を含み、可変ドメインおよび定常ドメインを有し得る。アルファ鎖とベータ鎖をコードする遺伝子は、遺伝子再編成によって遺伝子が形成されるＶ、ＤおよびＪ領域のライブラリーにおいて編成され得る。ＴＣＲは、組織適合遺伝子によってコードされる特異的自己分子との複合体の一部としての抗原提示細胞によって提示される抗原を認識し得る。ほとんどの有力な組織適合遺伝子は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）として公知である。したがって、Ｔ細胞受容体によって認識される複合体は、ＭＨＣ／ペプチドリガンドからなる。
一部の実施形態では、本開示の方法、デバイス、およびシステムは、Ｔ細胞受容体のシーケンシングおよび対合に使用することができる。本開示の方法、デバイス、およびシステムは、Ｔ細胞受容体アルファ鎖およびベータ鎖をシーケンシングする、アルファ鎖およびベータ鎖を対合させる、ならびに／またはＴ細胞受容体アルファ鎖の機能的コピーを決定するために使用することができる。単一細胞を単一の固体支持体（例えば、ビーズ）を含む単一の区画（例えば、ウェル）に含有させることができる。細胞は溶解されてもよい。ビーズは、ＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖内の特定の位置に結合することができる確率的標識を含み得る。固体支持体に会合したＴＣＲのアルファ分子およびベータ分子は、逆転写、増幅、およびシーケンシングを含む本開示の分子生物学的方法に供することができる。同じ細胞標識を含むＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖は、同じ単一細胞に由来すると考えられ、それによって、ＴＣＲのアルファ鎖とベータ鎖を対合させることができる。
抗体レパートリーにおける重鎖と軽鎖の対合
本開示の方法、デバイスおよびシステムは、ＢＣＲの受容体および抗体の重鎖と軽鎖の対合に使用することができる。本開示の方法は、決定される個々の生物または細胞集団における免疫受容体および抗体のレパートリーを可能にする。本開示の方法は、免疫受容体を構成するポリペプチド鎖の対を決定するのを助け得る。Ｂ細胞およびＴ細胞はそれぞれ、免疫受容体を発現し、Ｂ細胞は、免疫グロブリンおよびＢＣＲを発現し、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。両タイプの免疫受容体は、２つのポリペプチド鎖を含み得る。免疫グロブリンは、可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖を含み得る。２つのタイプのＴＣＲが存在し、１つは、アルファ鎖およびベータ鎖からなり、１つは、デルタ鎖およびガンマ鎖からなる。免疫受容体におけるポリペプチドは、定常領域および可変領域を含み得る。可変領域は、Ｂ細胞またはＴ細胞の染色体における遺伝子断片の組換えおよび末端接合再編成から生じ得る。Ｂ細胞では、可変領域のさらなる多様化が体細胞超変異によって生じ得る。
免疫系は、受容体の大きなレパートリーを有し、リンパ球によって発現される任意の所与の受容体対は、別々の、固有の転写物の対によってコードされ得る。単一細胞において発現される免疫受容体鎖の対の配列についての知識を使用して、所与の個体または細胞集団の免疫レパートリーを確認することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法、デバイス、およびシステムは、抗体のシーケンシングおよび対合に使用することができる。本開示の方法、デバイス、およびシステムは、抗体重鎖および軽鎖のシーケンシング（例えば、Ｂ細胞における）、ならびに／または重鎖および軽鎖の対合に使用することができる。単一細胞を単一の固体支持体（例えば、ビーズ）を含む単一の区画（例えば、ウェル）に含有させることができる。細胞は溶解されてもよい。
ビーズは、抗体の重鎖および／または軽鎖（例えば、Ｂ細胞における）内の特異的位置に結合することができる確率的標識を含み得る。固体支持体に会合した重鎖および軽鎖の分子は、逆転写、増幅、およびシーケンシングを含む本開示の分子生物学的方法に供することができる。同じ細胞標識を含む抗体の重鎖および軽鎖は、同じ単一細胞に由来すると考えられ、それによって、抗体の重鎖と軽鎖を対合させることができる。
一部の実施形態では、試料中の核酸標的を標識するための方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップとを含む。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含み得る。
一部の実施形態では、試料中の核酸標的の数を決定するための方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
一部の実施形態では、単一標識核酸分子の生成および分析方法が提供される。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それぞれが、第１の分子標識または第２の分子標識を含む、複数の単一標識核酸分子を生成するステップであって、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、ステップを含み得る。一部の実施形態では、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップは、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピーを生成するステップであって、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、（ｉ）複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー、もしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数、および／または（ｉｉ）複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー、もしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、ステップを含み得る。
試料中の核酸標的の数を決定するための方法、システム、組成物、およびキットも本明細書において提供される。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それぞれが、第１の分子標識または第２の分子標識を含む、複数の単一標識核酸分子を生成するステップと、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
本明細書において提供される方法の一部の実施形態は、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせる前に、複数のバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含み得る。核酸標的のコピー数を決定するステップは、複数の核酸標的のそれぞれの配列を含む複数の単一標識核酸分子のうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の複数の核酸標的のそれぞれのコピー数を決定するステップを含み得る。核酸標的のコピー数を決定するステップは、複数の核酸標的のそれぞれの配列を含む複数の単一標識核酸分子のうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の複数の核酸標的のそれぞれのコピー数を決定するステップを含み得る。複数の核酸標的のそれぞれの配列は、複数の核酸標的のそれぞれの部分配列を含み得る。複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、標的結合領域の相補体の、バーコード化された核酸分子の末端（例えば、３’末端）への付加（例えば、テンプレートスイッチング反応による）を含む。一部の実施形態では、本方法は、ｉ）分子内ハイブリダイゼーションおよび／またはｉｉ）オリゴヌクレオチドバーコード（またはその産物、例えば、別のバーコード化された核酸分子、またはそのアンプリコンなど）の標的結合領域の分子間ハイブリダイゼーションと、それに続く、伸長したバーコード化された核酸分子を生成するための伸長、を含む。伸長したバーコード化された核酸分子は、３’末端と５’末端の両方でバーコード化され得る。一部の実施形態では、バーコード化された分子の分子内ハイブリダイゼーションによって、３’ポリ（ｄＴ）捕捉ビーズ上に捕捉ｍＲＮＡ転写物を含むヘアピンループが形成される。ｍＲＮＡ分子は、オリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域に結合しているポリ（Ａ）テールによってビーズ上に捕捉され得る。ハイブリダイゼーション後に、テンプレートスイッチングを使用して、捕捉された転写物の５’末端にポリ（ｄＡ）テールを結合させることができる。次いで、新たなポリ（ｄＡ）テールがハイブリダイズし、同じビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチド（例えば、確率的バーコードなどのバーコード）を遊離し得る。伸長後に、ｍＲＮＡ分子は、３’末端と５’末端の両方でバーコード化され得る。これにより、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンシングプラットフォームでシーケンシングされ得る３’および５’でバーコード化された転写物の生成が可能となる。バーコード化された５’配列へのアクセスにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の可変領域、ならびに転写物の５’末端において生じるスプライスバリアントおよび配列多様性の検出を可能とすることができる。
図６Ａ～６Ｋは、５’バーコード化および／または３’バーコード化を使用して、核酸標的（例えば、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域）の配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。ＢＤ（登録商標）Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）ビーズは、幅広い物理的および化学的操作によって完全性を維持する、バーコード化された固体ビーズである。ビーズ上でのｍＲＮＡのポリ（Ａ）捕捉後に、逆転写およびテンプレートスイッチングを実施して、ポリ（ｄＡ）テールをバーコード化されたｃＤＮＡの３’末端に付加することができる。付加されたポリ（ｄＡ）テールによって、ビーズに結合したｃＤＮＡが同じビーズ上のバーコード（例えば、確率的バーコード）のオリゴ（ｄＴ）領域に自己ハイブリダイズし、架橋ループ構造を形成することが可能となる。架橋ループのＫｌｅｎｏｗ伸長によって、反対方向に第１のバーコード化されたｃＤＮＡを有する、同じｍＲＮＡ転写物に由来する新たなバーコード化されたｃＤＮＡ分子を生成することができ、３’末端と５’末端の両方を分子バーコードに連結させることが可能となる。
本明細書に開示される方法によって、３’ベースおよび／または５’ベースの配列決定を可能にすることができる。この方法は、配列決定に柔軟性を与えることを可能にすることができる。一部の実施形態では、本方法は、使用されるプライマーは別として、プロトコールまたは産物の立体構造を変化させずに、試料、例えば、マウスおよびヒトの試料について、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）システムにおけるＴ細胞とＢ細胞の両方の免疫レパートリーのプロファイリングを可能にすることができる。一部の実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊの３’および／または５’遺伝子発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞およびＢ細胞のＶ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。一部の実施形態では、それらの転写物の３’と５’の両方の情報が、単回の実験で捕捉され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。
本明細書に記載の方法およびシステムは、オリゴヌクレオチド（本明細書において、ＡｂＯまたはＡｂＯｌｉｇｏとも称される）と会合した（例えば、それに結合した、またはそれとコンジュゲートした）抗体を使用する、方法およびシステムに関して使用することができる。単一細胞におけるタンパク質発現プロファイルを決定するためにＡｂＯを使用し、試料起源を追跡する実施形態については、米国特許出願公開第２０１８／００８８１１２号として公開された米国特許出願第１５／７１５，０２８号、および米国特許出願第１５／９３７，７１３号に記載されており、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞およびＢ細胞のＶ（Ｄ）Ｊプロファイリング、３’標的化、５’標的化、３’全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）、５’ＷＴＡ、ＡｂＯを用いるタンパク質発現プロファイリング、ならびに／または単回実験での試料多重化を可能にする。図７は、Ｖ（Ｄ）Ｊワークフロー、抗体－オリゴヌクレオチド（ＡｂＯ）ワークフロー、および単一細胞ｍＲＮＡ発現プロファイルワークフロー（例えば、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ標的化ワークフロー）を実施する非限定的な例示的略図を示す。
テンプレートスイッチング反応
図６Ａ～６Ｋは、５’バーコード化および／または３’バーコード化を使用して、核酸標的（例えば、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域）の配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。バーコード（例えば、確率的バーコード、オリゴヌクレオチドバーコード６０２）は、標識化またはバーコード化（例えば、固有の標識化）のために、ポリ（ｄＡ）テール６０８によって核酸標的（例えば、ポリアデニル化ＲＮＡ転写物６０６）に、または他の核酸標的に結合し得る標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）６０４）を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、バーコードは、固体支持体（例えば、粒子６１０）に会合している。複数のバーコード６０２は、粒子６１０と会合していてもよい。一部の実施形態では、粒子は、ビーズである。ビーズは、ポリマービーズ、例えば、バーコードまたは確率的バーコードで機能化された変形可能なビーズまたはゲルビーズ（例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からのゲルビーズ）であり得る。一部の実装形態では、ゲルビーズは、ポリマー系ゲルを含み得る。ゲルビーズは、例えば、１つまたは複数のポリマー前駆体を液滴中に封入することによって、生成することができる。ポリマー前駆体を、促進剤（例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））に曝露すると、ゲルビーズが生成され得る。
図６Ａは、逆転写反応６００ａの非限定的な例示的実施形態を示す。逆転写６００ａ中に、オリゴヌクレオチドバーコード６０２の末端に到達すると、酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）などの逆転写酵素）の末端転移酵素の活性によって、新たに合成されたｃＤＮＡ配列鎖６１４ｃ（ＲＮＡ配列６１４ｒのアンチセンス配列）の３’末端に、いくつかの追加のヌクレオチド（例えば、デオキシシチジン、ＣＣＣ ６１２）が付加される。これらのＣＣＣ塩基６１２は、テールを付加した配列に相補的な配列（例えば、ｒＧｒＧｒＧ６１８）を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６（例えば、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド）のアンカー部位として機能し得る。テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６は、標的結合領域６０４の少なくとも一部を含み得る。ｒＧｒＧｒＧ６１８と付加されたデオキシシチジンストレッチ６１２との間の塩基対合の際に、酵素は、オリゴヌクレオチドバーコード６０２からテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６にテンプレート鎖を「切り替え」、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６の５’末端への複製を継続する。よって、得られた第１の鎖で標識されたｃＤＮＡ（例えば、バーコード化された核酸分子６２０）は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６の逆相補配列を含有し、よって、標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＡ）６０８）の相補体（例えば、逆相補体）を含み得る。バーコード化された核酸分子６２０は、ｃＤＮＡ６１４ｃ（ＲＮＡ配列６１４ｒの逆相補配列）を含み得る。反応は、二次構造（例えば、エチレングリコール）を低減するよう構成された１つまたは複数の添加剤の存在下で実施することができる。バーコード化された核酸分子６２０は、いくつかの標識も含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード６０２は、転写物６０６を標識し、ＲＮＡ転写物６０６（または例えば、抗体と会合したかもしくは抗体から解離した、抗体オリゴヌクレオチドなどの核酸標的）の試料起源を追跡するための第１の分子標識（ＭＬ１）６２２および試料標識（例えば、区画標識、細胞標識（ＣＬ）６２４）を、それぞれ、後続反応のための各バーコード６０２の第１の分子標識６２２／細胞標識６２４領域に隣接する、１つまたは複数の追加の配列、例えば、第１のユニバーサル配列６２６（例えば、リード１配列）などと一緒に、含み得る。試料ごとのオリゴヌクレオチドバーコードにおける分子標識の配列のレパートリーは、ＲＮＡ転写物の確率的標識化に対して十分に多量であり得る。一部の実施形態では、試料標識は、区画標識である。一部の実施形態では、試料標識は、細胞標識である。バーコード化された核酸分子６２０は、変性ステップ６００ｂ（例えば、変性するステップ）を受け、それによって、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１を生じ得る。
一部の実施形態では、第１の分子標識は、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む。一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の一部分に相補的である。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）配列を含む。
用語「テンプレートスイッチング」は、初期核酸配列テンプレートから、初期テンプレートから合成された核酸の３’末端に対してわずかな相補性を有するかまたは相補性を有さない新たな核酸配列テンプレートの３’末端に切り替える、逆転写酵素の能力を指し得る。テンプレートスイッチングの例は、初期核酸配列テンプレート／プライマー基質から、核酸プライマー鎖の３’末端に対してわずかな相補性を有するかまたは相補性を有さない新たな核酸配列テンプレートの３’末端に切り替える、逆転写酵素の能力である。テンプレートスイッチングは、例えば、ＤＮＡコピーが、初期核酸配列テンプレートから、初期テンプレートから合成されたＤＮＡの３’末端に対してわずかな相補性を有するかまたは相補性を有さない新たな核酸配列テンプレートの３’末端に切り替える、逆転写酵素を使用して調製されるのを可能にし、それによって、アダプター配列をライゲーションなしで標的オリゴヌクレオチド配列に直接的に連結させる、連続的産物ＤＮＡの合成を可能にする。テンプレートスイッチングは、アダプターのライゲーション、ホモポリマーのテーリング（例えば、ポリアデニル化）、ランダムプライマー、またはポリメラーゼが会合し得るオリゴヌクレオチドを含み得る。上述の実施形態のいずれかでは、テンプレートスイッチングを使用して、標的結合領域またはその相補体を導入してもよい。
一部の実施形態では、逆転写酵素は、末端転移酵素活性の能力がある。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、配列番号１を含む。
標的結合領域の相補体は、該標的結合領域の逆相補配列を含み得るか、または該標的結合領域の相補配列を含み得る。分子標識の相補体は、該分子標識の逆相補配列を含み得るか、または該分子標識の相補配列を含み得る。一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子は、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子および／またはバーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み得る。一部の実施形態では、核酸標的は、核酸分子（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫受容体をコードする。核酸標的は、細胞成分結合試薬を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、細胞成分結合試薬に会合している。本方法は、核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含み得る。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個は、異なる分子標識配列を含む。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に会合している。同じ固体支持体に会合した複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、同一の試料標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、細胞標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。同じ固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含み得る。異なる固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含み得る。複数の伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、細胞標識および該細胞標識の相補体を含み得る。細胞標識の相補体は、細胞標識の逆相補配列、または細胞標識の相補配列を含み得る。本方法は、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップを含み得る。一部の実施形態では、固体支持体は、合成粒子を含み得る。一部の実施形態では、固体支持体は、平面表面を含み得る。
試料は、単一細胞を含んでもよく、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含み得る。本方法は、合成粒子を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含み得る。単一細胞を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、合成粒子と単一細胞は、同じウェル中にある。一部の実施形態では、合成粒子と単一細胞は、同じ液滴中にある。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に部分的に固定化されている。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されていてもよい。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能である。合成粒子は、ビーズを含み得る。ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含んでもよく、合成粒子は、固体支持体官能基を含んでもよく、ならびに／または支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合していてもよい。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
バーコード化された核酸分子の分子内ハイブリダイゼーション
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、ステムループを形成する、バーコード化された核酸分子内の標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体である。
ワークフローは、図６Ｂの非限定的な例示的略図に示されるように、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の分子内ハイブリダイゼーションを含み得る。ワークフローは、ステムループを形成するための、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１内の標的結合領域６０４および標的結合領域６０８の相補体の分子内ハイブリダイゼーション６００ｃ１を含み得る。ワークフローは、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１のステムループの３’末端を伸長させて（６００ｃ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃを生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃは、第１の分子標識６２２ｒｃの相補体（例えば、逆相補体）、細胞標識６２４ｒｃの相補体（例えば、逆相補体）、および／または第１のユニバーサル配列６２６ｒｃの相補体（例えば、逆相補体）を含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃを変性させて（６００ｃ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄを生成することを含み得る。一部の実施形態では、分子間ハイブリダイゼーション６００ｃ１および／または伸長６００ｃ２は、高塩濃度緩衝液および／またはＰＥＧの存在下で実施される。一部の実施形態では、伸長は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄは、標的核酸分子（例えば、転写物）の５’末端と３’末端の両方にバーコード（例えば、細胞標識および分子標識）を含んでもよく、それによって、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／または全長シーケンシングに関して、一方の末端に１つのバーコードのみを有する標的核酸分子の分析と比較して、標的核酸分子のより広範な分析が可能となる。一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄは、例えば、図６Ｃ～６Ｄに示される非限定的な例示的増幅スキームなどの１つまたは複数の増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に関するテンプレートとしての役割を果たし得る。増幅は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）ｃＤＮＡ増幅を含み得る。例えば、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄは、第１のユニバーサル配列（またはその相補体）の配列を含むユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー６４８および／または標的特異的プライマー６５０）を用いる１回目の増幅（「ＰＣＲ１」）６００ｃ４を受け得る。ＰＣＲ１ ６００ｃ４は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー６４８を含む一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの５’領域を増幅させ、それによって、第１の分子標識６２２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６および部分的ｃＤＮＡ ６１４ｃ１（その長さは、ｃＤＮＡ ６１４ｃにおける標的特異的プライマー６４８の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｃ１を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ１ ６００ｃ４は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー６５０を含む一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの３’領域を増幅させ、それによって、第１の分子標識６２２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６および部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ１（その長さは、ｃＤＮＡ ６１４ｃにおける標的特異的プライマー６５０の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｃａｓ１を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ１ ６００ｃ４は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。
ワークフローは、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６およびネステッド標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー６５２および／または標的特異的プライマー６５４）を用いる２回目の増幅（「ＰＣＲ２」）６００ｃ５を含み得る。標的特異的プライマー６５２および／または標的特異的プライマー６５４は、例えば、第２のユニバーサル配列６３８（例えば、リード２の配列、ユニバーサルＰＣＲハンドル）を含み得るか、またはそれであってもよいオーバーハングを含み得る。ＰＣＲ２ ６００ｃ５は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６およびネステッド標的特異的プライマー６５４を含む一本鎖の核酸分子６２０ｃ１を増幅させ、それによって、第１の分子標識６２２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６、第２のユニバーサル配列６３８、および部分的ｃＤＮＡ ６１４ｃ２（その長さは、部分的ｃＤＮＡ ６１４ｃ１におけるネステッド標的特異的プライマー６５４の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｃ２を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ２ ６００ｃ５は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６およびネステッド標的特異的プライマー６５２を含む単一標識核酸分子６２０ｃａｓ１を増幅させ、それによって、第１の分子標識６２２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６、第２のユニバーサル配列６３８、および部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ２（その長さは、部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ１におけるネステッド標的特異的プライマー６５２の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｃａｓ２を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ２ ６００ｃ５は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。一部の実施形態では、標的特異的プライマー６４８、６５０、６５２、および／または６５４は、免疫受容体の定常領域、可変領域、多様性領域、および／または接合領域に結合する。
ワークフローは、３回目の増幅（「ＰＣＲ３」）６００ｃ６を含み得る。ＰＣＲ３ ６００ｃ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８を含む単一標識核酸分子６２０ｃａｓ２および／または単一標識核酸分子６２０ｃ２のライブラリー増幅を含み得る。シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８は、それぞれ、第１のユニバーサル配列６２６および第２のユニバーサル配列６３８（またはそれらの相補体）にアニーリングし得る。ＰＣＲ３ ６００ｃ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８におけるオーバーハングによって、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ６４０およびＰ７ ６４２）および試料インデックス６４４（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。ライブラリーアンプリコン６２０ｃａｓ３および／または６２０ｃ３をシーケンシングし、本開示の下流方法に供することができる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシングによって、細胞標識、固有の分子標識および／またはリード１上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、リード２上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、ならびにインデックス１リードおよび／またはインデックス２リード上の試料インデックスが明らかになり得る。ＰＣＲ３ ６００ｃ６は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の３’および／または５’発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞および／またはＢ細胞の免疫受容体Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。一部の実施形態では、それらの転写物の３’と５’の両方の情報が、単回の実験で捕捉され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの３’領域と５’領域の両方が増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの５’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの３’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、増幅反応の１つまたは複数が多重ＰＣＲを含む。例えば、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの３’領域と５’領域の両方が同時に増幅され得る（例えば、多重ＰＣＲ）。一部の実施形態では、ワークフローは、標的特異的ＰＣＲ１プライマーのパネルおよび／または標的特異的ＰＣＲ２プライマーのパネルを用いる多重ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、標的は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、および／または免疫関連転写物を含む。
バーコード化された核酸分子のバーコード化された核酸分子との分子間ハイブリダイゼーション
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
ワークフローは、図６Ｅ～６Ｆの非限定的な例示的略図に示されるように、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の、別個のバーコード化された核酸分子６２８との分子間ハイブリダイゼーションを含み得る。別個のバーコード化された核酸分子６２８は、ｃＤＮＡ６３０ｃ、第２の分子標識６３２、細胞標識６２４、および第１のユニバーサル配列６２６を含み得る。バーコード化された核酸分子６２８の第２の分子標識６３２の配列は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１（例えば、相補体ではない）の第１の分子標識６２２の配列と異なっていてもよい。バーコード化された核酸分子６２８の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６と同じ（またはその相補体）であってもよい。ワークフローは、一部の実施形態では、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０８の相補体の、バーコード化された核酸分子６２８の標的結合領域６０４との分子間ハイブリダイゼーション６００ｄ１を含み得る。ワークフローは、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の３’末端を伸長させて（６００ｄ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄを生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄは、第２の分子標識の相補体（例えば、逆相補体）６３２ｒｃ、細胞標識の相補体（例えば、逆相補体）６２４ｒｃ、および／または第１のユニバーサル配列の相補体（例えば、逆相補体）６２６ｒｃを含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄを変性させて（６００ｄ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄを生成することを含み得る。一部の実施形態では、分子間ハイブリダイゼーション６００ｄ１および／または伸長６００ｄ２は、高塩濃度緩衝液および／またはＰＥＧの存在下で実施される。一部の実施形態では、伸長は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄは、標的核酸分子（例えば、転写物）の５’末端と３’末端の両方にバーコード（例えば、細胞標識および分子標識）を含み、それによって、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／または全長シーケンシングに関して、一方の末端に１つのバーコードのみを有する標的核酸分子の分析と比較して、標的核酸分子のより広範な分析を可能とすることができる。一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄは、例えば、図６Ｇ～６Ｈに示される非限定的な例示的増幅スキームなどの１つまたは複数の増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に関するテンプレートとしての役割を果たし得る。増幅は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）ｃＤＮＡ増幅を含み得る。例えば、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄは、第１のユニバーサル配列（またはその相補体）の配列を含むユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー６４８および／または標的特異的プライマー６５０）を含むユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６を用いる１回目の増幅（「ＰＣＲ１」）６００ｄ４を受け得る。ＰＣＲ１ ６００ｄ４は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー６４８を含む一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの５’領域を増幅させ、それによって、第１の分子標識６２２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６および部分的ｃＤＮＡ ６１４ｃ１（その長さは、ｃＤＮＡ ６１４ｃにおける標的特異的プライマー６４８の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｄ１を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ１ ６００ｄ４は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー６５０を含む一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの３’領域を増幅させ、それによって、第２の分子標識６３２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６および部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ１（その長さは、ｃＤＮＡ ６１４ｃにおける標的特異的プライマー６５０の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｄａｓ１を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ１ ６００ｄ４は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。
ワークフローは、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６およびネステッド標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー６５２および／または標的特異的プライマー６５４）を用いる２回目の増幅（「ＰＣＲ２」）６００ｄ５を含み得る。標的特異的プライマー６５２および／または標的特異的プライマー６５４は、例えば、第２のユニバーサル配列６３８（例えば、リード２の配列、ユニバーサルＰＣＲハンドル）を含み得るか、またはそれであってもよいオーバーハングを含み得る。ＰＣＲ２ ６００ｄ５は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６およびネステッド標的特異的プライマー６５４を含む単一標識核酸分子６２０ｄ１を増幅させ、それによって、第１の分子標識６２２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６、第２のユニバーサル配列６３８、および部分的ｃＤＮＡ ６１４ｃ２（その長さは、ｃＤＮＡ ６１４ｃ１におけるネステッド標的特異的プライマー６５４の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｄ２を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ２ ６００ｄ５は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６およびネステッド標的特異的プライマー６５２を含む単一標識核酸分子６２０ｄａｓ１を増幅させ、それによって、第２の分子標識６３２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６、第２のユニバーサル配列６３８、および部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ２（その長さは、部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ１におけるネステッド標的特異的プライマー６５２の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｄａｓ２を生成するステップを含み得る。ＰＣＲ２ ６００ｄ５は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。一部の実施形態では、標的特異的プライマー６４８、６５０、６５２、および／または６５４は、免疫受容体の定常領域、可変領域、多様性領域、および／または接合領域に結合する。
ワークフローは、３回目の増幅（「ＰＣＲ３」）６００ｄ６を含み得る。ＰＣＲ３ ６００ｄ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８を含む単一標識核酸分子６２０ｄａｓ２および／または単一標識核酸分子６２０ｄ２のライブラリー増幅を含み得る。シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８は、それぞれ、第１のユニバーサル配列６２６および第２のユニバーサル配列６３８（またはそれらの相補体）にアニーリングし得る。ＰＣＲ３ ６００ｄ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８におけるオーバーハングによって、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ６４０およびＰ７ ６４２）および試料インデックス６４４（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。ライブラリーアンプリコン６２０ｄａｓ３および／または６２０ｄ３をシーケンシングし、本開示の下流方法に供することができる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシングによって、細胞標識、固有の分子標識および／またはリード１上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、リード２上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、ならびにインデックス１リードおよび／またはインデックス２リード上の試料インデックスが明らかになり得る。ＰＣＲ３ ６００ｄ６は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の３’および／または５’発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞および／またはＢ細胞の免疫受容体Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。一部の実施形態では、それらの転写物の３’と５’の両方の情報が、単回の実験で捕捉され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの３’領域と５’領域の両方が増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの５’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの３’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、増幅反応の１つまたは複数が多重ＰＣＲを含む。例えば、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの３’領域と５’領域の両方が同時に増幅され得る（例えば、多重ＰＣＲ）。一部の実施形態では、ワークフローは、標的特異的ＰＣＲ１プライマーのパネルおよび／または標的特異的ＰＣＲ２プライマーのパネルを用いる多重ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、標的は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、および／または免疫関連転写物を含む。
バーコード化された核酸分子のオリゴヌクレオチドバーコードとの分子間ハイブリダイゼーション
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は第１の分子標識と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。一部の実施形態では、本方法は、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
ワークフローは、図６Ｉ～６Ｊの非限定的な例示的略図に示されるように、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の、別個のオリゴヌクレオチドバーコード６３４との分子間ハイブリダイゼーションを含み得る。別個のオリゴヌクレオチドバーコード６３４は、第２の分子標識６３６、細胞標識６２４、および第１のユニバーサル配列６２６を含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード６３４の第２の分子標識６３６の配列は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１（例えば、相補体ではない）の第１の分子標識６２２の配列と異なっていてもよい。オリゴヌクレオチドバーコード６３４の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６と同じ（またはその相補体）であってもよい。ワークフローは、一部の実施形態では、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０８の相補体の、オリゴヌクレオチドバーコード６３４の標的結合領域６０４との分子間ハイブリダイゼーション６００ｅ１を含み得る。ワークフローは、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の３’末端を伸長させて（６００ｅ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１を生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１は、第２の分子標識の相補体（例えば、逆相補体）６３６ｒｃ、細胞標識の相補体（例えば、逆相補体）６２４ｒｃ、第１のユニバーサル配列の相補体（例えば、逆相補体）６２６ｒｃ、および／またはｃＤＮＡ ６１４ｃを含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１を変性させて（６００ｅ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄを生成することを含み得る。ワークフローは、オリゴヌクレオチドバーコード６３４の３’末端を伸長させて（６００ｅ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２を生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２は、第１の分子標識の相補体（例えば、逆相補体）６２２ｒｃ、細胞標識の相補体（例えば、逆相補体）６２４ｒｃ、第１のユニバーサル配列の相補体（例えば、逆相補体）６２６ｒｃ、および／またはアンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓを含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２を変性させて（６００ｅ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄを生成することを含み得る。一部の実施形態では、分子間ハイブリダイゼーション６００ｅ１および／または伸長６００ｅ２は、高塩濃度緩衝液および／またはＰＥＧの存在下で実施される。一部の実施形態では、伸長は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄは、標的核酸分子（例えば、転写物）の５’末端と３’末端の両方にバーコード（例えば、細胞標識および分子標識）を含み、それによって、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／または全長シーケンシングに関して、一方の末端に１つのバーコードのみを有する標的核酸分子の分析と比較して、標的核酸分子のより広範な分析を可能にすることができる。一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄは、１つまたは複数の増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に関するテンプレートとしての役割を果たし得る。増幅は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）ｃＤＮＡ増幅を含み得る。一部の実施形態では、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄは、２回以上のＰＣＲ増幅（例えば、図６Ｇ～６Ｈに示されるようなＰＣＲ１ ６００ｄ４、ＰＣＲ２ ６００ｄ５、および／またはＰＣＲ３ ６００ｄ６）を受け得る。一部の実施形態では、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄは、例えば、図６Ｋに示される非限定的な例示的増幅スキーム（ＰＣＲ ６００ｅ４）などの単回の増幅に関するテンプレートとしての役割を果たし得る。ＰＣＲ ６００ｅ４は、プライマー６６０、６６２および６６４におけるオーバーハングによって、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ６４０およびＰ７ ６４２）および試料インデックス６４４（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。ＰＣＲ ６００ｅ４は、プライマー６６４（第１のユニバーサル配列またはその相補体にアニーリングする）および標的特異的プライマー６６０を含む一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄを増幅させ、それによって、第１の分子標識６２２、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６および部分的ｃＤＮＡ ６１４ｃ１ｅ（その長さは、ｃＤＮＡ ６１４ｃにおける標的特異的プライマー６６０の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｅ１ｃを生成するステップを含み得る。ＰＣＲ ６００ｅ４は、プライマー６６４（第１のユニバーサル配列またはその相補体にアニーリングする）および標的特異的プライマー６６２を含む一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄを増幅させ、それによって、第２の分子標識６３６、細胞標識６２４、第１のユニバーサル配列６２６および部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ１ｅ（その長さは、アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓにおける標的特異的プライマー６６２の結合部位に応じて変わる）を含む単一標識核酸分子６２０ｅ２ｃを生成するステップを含み得る。ライブラリーアンプリコン６２０ｅ１ｃおよび／または６２０ｅ２ｃをシーケンシングし、本開示の下流方法に供することができる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシングによって、細胞標識、固有の分子標識および／またはリード１上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、リード２上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、ならびにインデックス１リードおよび／またはインデックス２リード上の試料インデックスが明らかになり得る。ＰＣＲ ６００ｅ４は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。一部の実施形態では、標的特異的プライマー６６０および／または６６２は、免疫受容体の定常領域、可変領域、多様性領域、および／または接合領域に結合する。
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の３’および／または５’発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞および／またはＢ細胞の免疫受容体Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。一部の実施形態では、転写物の３’と５’の両方の情報が、単回の実験で捕捉され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの３’領域と５’領域の両方が増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの５’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの３’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、増幅反応の１つまたは複数が多重ＰＣＲを含む。例えば、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの３’領域と５’領域の両方が同時に増幅され得る（例えば、多重ＰＣＲ）。一部の実施形態では、ワークフローは、標的特異的ＰＣＲ１プライマーのパネルおよび／または標的特異的ＰＣＲ２プライマーのパネルを用いる多重ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、標的は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、および／または免疫関連転写物を含む。
免疫レパートリープロファイリング
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の３’および／または５’発現プロファイリングの方法が提供される。一部の実施形態では、試料は、単一細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはこれらの任意の組合せを含む。単一細胞は、免疫細胞を含み得る。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。一部の実施形態では、単一細胞は、循環腫瘍細胞を含み得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列を含み得る。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子は、第１のユニバーサル配列および該第１のユニバーサル配列の相補体を含む。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピーを生成するステップは、第１のユニバーサル配列、またはその相補体をハイブリダイズさせることが可能なプライマーを使用するステップを含む。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の単一標識核酸分子を生成するステップは、第１のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および増幅プライマーを使用するステップを含む。一部の実施形態では、増幅プライマーは、標的特異的プライマーである。一部のこのような実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体に特異的にハイブリダイズする。例えば、標的特異的プライマーは、免疫受容体の定常領域、免疫受容体の可変領域、免疫受容体の多様性領域、免疫受容体の可変領域と多様性領域の接合部、またはこれらの任意の組合せに特異的にハイブリダイズし得る。免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体であり得る。ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ＢＣＲは、ＢＣＲ重鎖および／またはＢＣＲ軽鎖を含み得る。
本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物の配列情報を得るステップを含み得る。配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプターを、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物に結合させるステップを含み得る。配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプターを、複数の単一標識核酸分子、またはその産物に結合させるステップを含み得る。
配列情報を得るステップは、単一細胞のＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報を得るステップを含み得る。ＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報は、ＢＣＲ軽鎖および／またはＢＣＲ重鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含み得る。本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含み得る。試料は、複数の単一細胞を含んでもよく、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞の少なくとも５０％のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、ＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージが、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報を得るステップを含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報は、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含み得る。一部の実施形態では、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含んでもよく、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージが、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報を得るステップを含み得る。ＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報は、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含み得る。本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含み得る。試料は、複数の単一細胞を含んでもよく、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲデルタ鎖とＴＣＲガンマ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲデルタ鎖とＴＣＲガンマ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージが、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
核酸標的の５’末端および３’末端におけるバーコード化のためのキット
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；逆転写酵素；標的結合領域を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、またはその一部分；および５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、例えば、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。一部の実施形態では、キットは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、キットは、緩衝液を含む。一部の実施形態では、キットは、カートリッジを含む。一部の実施形態では、キットは、逆転写反応のための１つまたは複数の試薬を含む。一部の実施形態では、キットは、増幅反応のための１つまたは複数の試薬を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に部分的に固定化されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能である。一部の実施形態では、合成粒子は、ビーズ、例えば、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み、合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに／または支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合している。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
上記の実施形態のいくつかの態様を以下の実施例でさらに詳しく開示するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限することを何ら意図しない。
以下に記載される非限定的な例示的Ｖ（Ｄ）Ｊプロトコールを用いて、標的化パネルのｍＲＮＡ標的の３’末端と５’末端の両方に関するシーケンシングライブラリーの作成について実証した。
ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（登録商標）細胞の捕捉および逆転写
１． 試料細胞の単一細胞懸濁液を調製する。
２． 回収およびビーズの洗浄および氷上へのビーズの配置による単一細胞の捕捉のための標準的ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（登録商標）プロトコールに従う。
３． 以下の表１に従って、テンプレートスイッチ反応ミックスを作製する。
Figure 2022511398000002

４． 磁石上にビーズを配置し、上清を除去し、２００ｕＬの反応ミックス中にビーズを再懸濁させる。
５． Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上に、２５℃で３０分間、続いて、１２００ｒｐｍにて４２℃で１．５時間、チューブを配置する。反応終了後に氷上に配置する。
６． 磁石上にビーズを配置し、上清を除去する。
７． １ｍＬのＴＥ緩衝液中にビーズを再懸濁させる。
８． ９５℃で２分間ビーズを加熱し、ｍＲＮＡを変性させる。
９． 磁石上にビーズを静置し、上清を除去する。
１０． １ｍＬのＴＥ緩衝液中にビーズを再懸濁させる。
１１． ９５℃で２分間ビーズを加熱し、ｍＲＮＡを変性させる。
１２． 磁石上にビーズを静置し、上清を除去する。
１３． ２ｍＬの予め温めた（３７℃）ＨＴ１緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中にビーズを再懸濁させる。
自己ハイブリダイゼーション
１． １２００ｒｐｍにて３７Ｃで５分間、続いて、２５℃で２５分間、チューブを振盪する。その後、氷上に配置する。
２． １ｍＬのＨＴ１緩衝液でビーズを１回洗浄する。
Ｋｌｅｎｏｗ伸長
１．以下の表２に示されるＫｌｅｎｏｗ伸長反応ミックスを調製する。
Figure 2022511398000003
 ２． 磁石上にビーズを静置し、上清を除去する。
３． ２００ｕＬのＫｌｅｎｏｗ伸長反応ミックス中にビーズを再懸濁させる。
４． １２００ｒｐｍにて、３７℃のサーモミキサー中に３０分間配置する。
５． １ｍＬのＴＥで１回洗浄する。
ＥｘｏＩ処理
１． 以下の表３に従って、ＥｘｏＩ反応ミックスを調製する。
Figure 2022511398000004
 ２． 磁石上にビーズを配置し、上清を除去する。
３． ２００ｕＬのＥｘｏＩ反応ミックス中にビーズを再懸濁させる。
４． １２００ｒｐｍにて、３７Ｃのサーモミキサー中に３０分間チューブを配置する。
５． チューブを振盪なしの、８０Ｃのサーモミキサー中に２０分間移す。
６． 氷上に約１分間チューブを配置する。
７． 磁石上にビーズを配置する。
８． 上清を除去し、２００ｕＬのビーズ再懸濁緩衝液中にビーズを再懸濁させる。
ＰＣＲ１増幅
１．以下の表４に従って、ＰＣＲ１マスターミックスを調製する：
Figure 2022511398000005
 ２． （任意の）サブサンプルビーズ。
３． 磁石上にビーズを含むチューブを配置し、上清を除去する。
４． ２００ｕＬのＰＣＲ１反応ミックス中にビーズを再懸濁させる。穏やかにピペッティングし、全体的に混合する。
５． （４）を０．２ｍｌのＰＣＲチューブに均等に分割する（すなわち、チューブ当たり約５０ｕｌ±５ｕｌ）。
６． ポストＰＣＲルームにおいて、以下のＰＣＲプロトコールを実行する：９５℃で３分間、（９５℃で３０秒間、６０℃で３分間、７２℃で１分間）を１５サイクル、７２℃で５分間。４℃で保持。
７． ＰＣＲ後に、ＰＣＲ１産物とビーズをＬｏＢｉｎｄの１．５ｍｌ微量遠心機チューブ中で合わせる。
８． チューブを１．５ｍｌの磁石上に配置し、ＰＣＲ１産物を新しいチューブ中にピペットで移す。
ＰＣＲ１のクリーンアップ
１． ２００ｕｌのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ＰＣＲ産物の体積の１×）をＰＣＲ１産物に添加する。よく混合する。
２． 室温で５分間インキュベートする。
３． 新たな８０％エタノールを調製する（例えば、８００ｕｌのエタノールと２００ｕｌのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない水とで）。
４． Ａｍｐｕｒｅビーズを含むチューブを１．５ｍｌのチューブの磁石上におよそ１～２分間配置する。すべてのビーズがチューブ側に集まった後に、上清を除去する。
５． すべてのビーズがチューブ側に集まった後に、上清を除去する。
６． チューブが磁石上にある間に、５００ｕｌの８０％エタノールを添加して、ビーズペレットを洗浄する。
７． 可能な限りエタノールを除去する。
８． ８０％エタノール洗浄を１回繰り返し、全部で２回洗浄する。
９． 明らかな液滴が存在しなくなるまで（約３～５分）、Ａｍｐｕｒｅビーズを、蓋を開けた磁石上で空気乾燥させる。
１０． チューブが磁石上にある間に、５００ｕｌの８０％エタノールを添加して、ビーズペレットを洗浄する。
１１． 可能な限りエタノールを除去する。
１２． ８０％エタノール洗浄を１回繰り返し、全部で２回洗浄する。
１３． 明らかな液滴が存在しなくなるまで（約３～５分）、Ａｍｐｕｒｅビーズを、蓋を開けた磁石上で空気乾燥させる。
１４． ３０ｕｌの溶出緩衝液中でＡｍｐｕｒｅビーズを再懸濁させる。
１５． １．５ｍｌチューブの磁石上に配置する。
１６． 上清を新しい１．５ｍｌのチューブに移す。これは、精製されたＰＣＲ１産物である。次のステップを同じ日に行う場合は、４Ｃまたは氷上で保存するか、または使用まで－２０℃で保存する。
ＰＣＲ２増幅
１． プレＰＣＲエリアにおいて、以下の反応ミックスを調製する：
Figure 2022511398000006
Figure 2022511398000007
Figure 2022511398000008
Figure 2022511398000009
 ２． 反応ミックスをポストＰＣＲエリアに移す。
３． ５ｕｌのクリーンアップＰＣＲ１産物を４５ｕｌの反応ミックスに添加する。
４． ポストＰＣＲエリアにおけるサーマルサイクラー中で以下のＰＣＲプロトコールを実行する：９５℃で３分間、（９５℃で３０秒間、６０℃で３分間、７２℃で１分間）を１５サイクル、７２℃で５分間。
ＰＣＲ２のクリーンアップ
１． ＴＣＲおよびＢＣＲ産物に対して、３０ｕｌのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ＰＣＲ産物の体積の０．６×）をＰＣＲ１産物に添加する。ＩＲ３’および５’に対して、５０ｕｌのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（体積の１×）を添加する。よく混合する。
２． 室温で５分間インキュベートする。
３． 新たな８０％エタノールを調製する（例えば、８００ｕｌのエタノールと２００ｕｌのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない水とで）。
４． Ａｍｐｕｒｅビーズを含むチューブを１．５ｍｌのチューブの磁石上におよそ１～２分間配置する。すべてのビーズがチューブ側に集まった後に、上清を除去する。
５． チューブが磁石上にある間に、２００ｕｌの８０％エタノールを添加して、ビーズペレットを洗浄する。
６． 可能な限りエタノールを除去する。
７． ８０％エタノール洗浄を１回繰り返し、全部で２回洗浄する。
８． 明らかな液滴が存在しなくなるまで、Ａｍｐｕｒｅビーズを、蓋を開けた磁石上で空気乾燥させる。
９． ３０ｕｌの溶出緩衝液中でビーズを再懸濁させる。
１０． １．５ｍｌチューブの磁石上に配置する。
１１． 上清を新しい１．５ｍｌチューブに移す。これは、精製されたＰＣＲ２産物である。次のステップを同じ日に行う場合は、４℃または氷上で保存するか、または使用まで－２０Ｃで保存する。
１２． Ｑｕｂｉｔ ＤＮＡ ＨＳアッセイを使用して、溶出されたＤＮＡの量を測定し、産物の希釈が次のＰＣＲに必要であるかどうかを評価する。ＰＣＲ２産物は、過剰増幅を回避するため、最終ＰＣＲに進む前に、溶出緩衝液を使用して１０ｎｇ／ｕｌ以下に希釈されなければならない。
インデックス化ＰＣＲ
１． プレＰＣＲエリアでは、表９において示される以下の反応ミックスを調製する。
Figure 2022511398000010
 ２． 反応ミックスをポストＰＣＲエリアに移す。
３． ３ｕｌのクリーンアップＰＣＲ２産物を４７ｕｌの反応ミックスに添加する。
４． ポストＰＣＲエリアにおける以下のＰＣＲプロトコールを実行する：９５℃で５分間、（９８℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）を８サイクル、７２Ｃで１分間。
最終ＰＣＲクリーンアップ
１． ３０ｕｌのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ＰＣＲ産物の体積の０．６×）をＰＣＲ産物に添加する。よく混合する。
２． 室温で５分間インキュベートする。
３． 新たな８０％エタノールを調製する（例えば、８００ｕｌのエタノールと２００ｕｌのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない水とで）。
４． Ａｍｐｕｒｅビーズを含むチューブを１．５ｍｌチューブの磁石上におよそ１～２分間配置する。すべてのビーズがチューブ側に集まった後に、上清を除去する。
５． チューブが磁石上にある間に、２００ｕｌの８０％エタノールを添加して、ビーズペレットを洗浄する。
６． 可能な限りエタノールを除去する。
７． ８０％エタノール洗浄を１回繰り返し、全部で２回洗浄する。
８． 明らかな液滴が存在しなくなるまで、Ａｍｐｕｒｅビーズを、蓋を開けた磁石上で空気乾燥させる。
９． ３０ｕｌの溶出緩衝液中でビーズを再懸濁させる。
１０． １．５ｍｌのチューブの磁石上に配置する。
１１． 上清を新しい１．５ｍｌのチューブに移す。これは、精製されたＰＣＲ２産物である。次のステップを同じ日に行う場合は、４℃または氷上で保存するか、または使用まで－２０℃で保存する。
１２． Ｑｕｂｉｔ ＤＮＡ ＨＳアッセイを使用して、溶出されたＤＮＡの量を測定し、産物の希釈が次のＰＣＲに必要であるかどうかを評価する。ＰＣＲ２産物は、過剰増幅を回避するため、最終ＰＣＲに進む前に、溶出緩衝液を使用して１０ｎｇ／ｕｌ以下に希釈されなければならない。
（実施例１）
Ｖ（Ｄ）Ｊプロトコール
この実施例は、標的化パネルのｍＲＮＡ標的の３’末端と５’末端の両方に関するシーケンシングライブラリーを生成することについて実証する。
この実施例では、Ｔ細胞受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域および免疫グロブリン遺伝子も含んだ、標的化パネルのｍＲＮＡ標的の３’末端と５’末端の両方に対してシーケンシングライブラリーを生成した。５’および３’ユニバーサル分子インデックス（ＵＭＩ）の計数の同時分析に加えて、健康なドナーの末梢血単核細胞のリンパ球におけるＣＤＲ３再編成パターンを同定した。
図８Ａ～８Ｃは、Ｖ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用する、５’Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ（Ｄ）Ｊ領域の捕捉およびシーケンシングの非限定的な例示的実験結果を示す。Ｖ（Ｄ）Ｊヘアピンプロトコールは、捕捉された単一の、静止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のｍＲＮＡ分子に関して、同じビーズ上で実施された３’増幅および５’増幅を含み得る。図８Ａは、細胞型の注釈を示す。図８Ｂおよび８Ｃは、このＶ（Ｄ）Ｊプロトコールで実施した５’増幅を使用する、それぞれ、ＴＣＲアルファとＴＣＲベータの発現プロファイルを示す。ＴＣＲアルファ鎖／ベータ鎖の対合効率は、３７．９％であり、これは、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈのｓｃＴＣＲプロファイリングキットなどの他のプラットフォームに匹敵した。表１０は、このＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用して達成されたＴＣＲアルファ／ベータ対合について示す。
Figure 2022511398000011
図９Ａ～９Ｂは、改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用して５’Ｖ（Ｄ）Ｊ検出感度を改善することを示す、非限定的な例示的プロットを示す。エチレングリコールを添加して、逆転写（ＲＴ）における二次構造の低減を補助した。ハイブリダイゼーション時間、緩衝液、およびテンプレートスイッチング（ＴＳ）オリゴｄＴ長を変更して、感度を改善した。４つのライブラリーを生成し、一緒にシーケンシングした：５’ＴＣＲ、５’ＢＣＲ、５’３０－ｐｌｅｘ免疫パネル、および３’免疫応答パネル。よりストリンジェントなＡｍｐｕｒｅクリーンアップ（０．６Ｘ）を実施した。図９Ｂは、改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用して達成されたバイオアナライザープロットを示し、一方、図９Ａは、図８に関して記載したＶ（Ｄ）Ｊプロトコールに関して達成されたバイオアナライザープロットを示す。
図１０Ａ～１０Ｅは、図９に関して記載した改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用して５’Ｖ（Ｄ）Ｊ検出感度を改善する非限定的な例示的実験結果を示す。図１０Ａは、細胞型の注釈を示す。図１０Ｂ～１０Ｅは、改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用して、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＩＧＫＣ、およびＩＧＬＣについて得られた発現プロファイルを示す。図８に関して記載したプロトコールと比較して、ＴＣＲアルファ／ベータ対合効率を３７．９％から５２％に改善した。Ｂ細胞における５’重鎖および軽鎖ｍＲＮＡ分子を検出することに成功した。表１１および１２は、改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを使用する、それぞれ、ＴＣＲアルファ／ベータ対合およびＢＣＲ重鎖／軽鎖対合を示す。
Figure 2022511398000012
Figure 2022511398000013
図１１Ａ～Ｆは、３’増幅（図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ）および５’増幅（図１１Ｂ、１１Ｄ、１１Ｆ）を使用して決定したＩＧＨＭ、ＩＧＨＤ、およびＩＧＨＡの発現プロファイルと比較して感度が改善された、改善されたＶ（Ｄ）Ｊプロトコールを用いる５’Ｂ細胞重鎖の検出を示す非限定的な例示的プロットである。
図１２Ａ～１２Ｆは、３’増幅（図１２Ａ、１２Ｃ、１２Ｅ）および５’増幅（図１２Ｂ、１２Ｄ、１２Ｆ）を使用して決定したＣＤ３Ｄ、ＣＤ８Ａ、およびＨＬＡ－ＤＲの発現プロファイルと比較する、非限定的な例示的プロットである。
まとめると、データは、ｍＲＮＡ転写物情報の３’と５’の両方をプロファイリングする能力が、３’単一細胞ＲＮＡシーケンシングプラットフォームの柔軟性および可能性を拡大し得ることを示す。
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様および実施形態が当業者にとって明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様および実施形態は、例示を目的とし、限定を意図するものではなく、以下の請求項によって示されている真の範囲および精神を有する。
当業者は、本明細書に開示されるこのおよび他のプロセスおよび方法について、そのプロセスおよび方法において実施される機能が、異なる順序で実現され得ることを認識するであろう。さらに、概説されるステップおよび操作は例として与えられるに過ぎず、ステップおよび操作のいくつかは、より少ないステップおよび操作へと任意に組み合わされてもよく、または本開示の実施形態の根本的要素を減じることなく追加のステップおよび操作に拡大されてもよい。
本明細書の実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関連して、文脈上および／または適用上適切であれば、当業者は、複数形から単数形へおよび／または単数形から複数形への変換が可能である。明確にするために種々の単数形／複数形の入替えを本明細書に明示的に記述し得る。
一般的には、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、全般的に、「オープン」用語であることが意図されることが当業者によって理解されるであろう（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「以下に限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも～を有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「以下に限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであるなど）。さらに、導入された請求項の記載の特定数が意図される場合、このような意図は請求項で明示的に記載され、このような記載の非存在下では、このような意図は存在しないことが、当業者によって理解されるであろう。例えば、理解の一助として、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために、導入語句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」の使用を含み得る。しかし、このような語句の使用は、たとえ同一の請求項が、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」または「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という導入語句および「ａ」または「ａｎ」のような不定冠詞を含む場合でも、「ａ」または「ａｎ」という不定冠詞による請求項の記載の導入がこのような導入された請求項の記載を含むいかなる特定の請求項もそのような記載を１つのみ含む実施形態に限定することを意味するものと解釈させるべきではなく（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」または「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると解釈されるべきである）、請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同様である。さらに、たとえ特定数の導入された請求項の記載が明示的に記載されたとしても、このような記載は少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを当業者は認識するであろう（例えば、「２つの記載」という他の修飾語を含まない無修飾の記載は、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つなど」に類似した慣例が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣例を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つなど」に類似した慣例が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣例を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。さらに、２つ以上の代替用語を表す実質上任意の選言的な語および／または語句は、明細書、請求項、または図面にかかわらず、用語の１つ、用語のいずれか、または用語の両方を含む可能性が企図されると理解されるべきであることが当業者によって理解されるであろう。例えば、語句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解される。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群により記述される場合、それにより、本開示は、マーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーの下位群によっても記述されることが、当業者に認識されるであろう。
当業者に理解されるように、あらゆる目的で、例えば、明細書の提供に関して、本明細書に開示された範囲はすべて、あらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組合せも包含する。いずれの列挙された範囲も、十分に記述されたものとしてかつその範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などされ得るものとして容易に認識可能である。非限定的な例として、本明細書で考察した各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１などに容易に分解可能である。同様に、当業者に理解されるように、「最大」、「少なくとも」などの表現はすべて、記載された数を含み、以上で考察したように後続的に下位範囲に分解可能な範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、それぞれ個々のメンバーを含む。よって、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞を有する群を指し、他も同様である。
前記内容から、本開示の様々な実施形態が例証のために本明細書に記載されており、本開示の範囲および精神を逸脱することなく様々な修正がなされ得ることが認識されよう。したがって、本明細書に開示される様々な実施形態は、限定を意図するものではなく、以下の請求項によって示されている真の範囲および精神を有する。

Claims (91)

  1. 試料中の核酸標的を標識するための方法であって、
    核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、
    逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、
    各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、
    （ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、
    （ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または
    （ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子
    の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、
    複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと
    を含む、方法。
  2. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 試料中の核酸標的の数を決定するための方法であって、
    核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、
    逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、
    各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、
    （ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、
    （ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または
    （ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子
    の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、
    複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、
    複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップと
    を含む、方法。
  4. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それぞれが、第１の分子標識または第２の分子標識を含む、複数の単一標識核酸分子を生成するステップを含み、
    試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、請求項２～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピーを生成するステップを含み、
    試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、（ｉ）複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー、もしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数、および／または（ｉｉ）複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー、もしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、請求項２～３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 試料中の核酸標的の数を決定する方法であって、
    核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、分子標識および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと、
    逆転写酵素および標的結合領域を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、またはその一部分の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと、
    各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、
    （ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、
    （ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または
    （ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子
    の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと、
    複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、
    複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それぞれが、第１の分子標識または第２の分子標識を含む、複数の単一標識核酸分子を生成するステップと、
    複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップと
    を含む、方法。
  8. 複数の単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせる前に、複数のバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 核酸標的のコピー数を決定するステップが、複数の核酸標的のそれぞれの配列を含む複数の単一標識核酸分子のうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の複数の核酸標的のそれぞれのコピー数を決定するステップを含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  12. 核酸標的のコピー数を決定するステップが、複数の核酸標的のそれぞれの配列を含む複数の単一標識核酸分子のうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の複数の核酸標的のそれぞれのコピー数を決定するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 複数の核酸標的のそれぞれの配列が、複数の核酸標的のそれぞれの部分配列を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列が、核酸標的の部分配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 第１の分子標識が、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 伸長したバーコード化された核酸分子がそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 標的結合領域の相補体が、標的結合領域の一部分に相補的である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 標的結合領域が、遺伝子特異的配列、および／またはポリ（ｄＴ）配列を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、ステムループを形成する、バーコード化された核酸分子内の標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体である、請求項１９に記載の方法。
  21. バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体と、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 第２の分子標識が、第１の分子標識と異なり、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体ではない、請求項２１に記載の方法。
  23. バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む、請求項２１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 第２の分子標識の配列が、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体ではない、請求項２３に記載の方法。
  25. バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体と、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 第２の分子標識の配列が、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体ではない、請求項２５に記載の方法。
  27. 逆転写酵素が、末端転移酵素活性の能力がある、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、任意に、３つの３’リボヌクレオチドを含み、さらに、３’リボヌクレオチドがグアニンを含んでもよい、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 逆転写酵素が、ウイルス逆転写酵素を含み、ウイルス逆転写酵素が、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素であってもよい、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 試料が、単一細胞、任意に、免疫細胞、さらに任意にＢ細胞またはＴ細胞を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 試料が、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 単一細胞が、循環腫瘍細胞を含む、請求項３０～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列を含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子が、第１のユニバーサル配列および第１のユニバーサル配列の相補体を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピーを生成するステップが、第１のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用するステップを含む、請求項６～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の単一標識核酸分子を生成するステップが、第１のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および増幅プライマーを使用するステップを含む、請求項６～３４のいずれか１項に記載の方法。
  37. 増幅プライマーが、標的特異的プライマーであり、標的特異的プライマーが、免疫受容体、免疫受容体の定常領域、免疫受容体の可変領域、免疫受容体の多様性領域、および／または免疫受容体の可変領域と多様性領域の接合部に特異的にハイブリダイズしてもよい、請求項３６に記載の方法。
  38. 免疫受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体であり、
    ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよく、
    ＢＣＲ受容体が、ＢＣＲ重鎖および／またはＢＣＲ軽鎖を含んでもよい、請求項３７～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップを含み、ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含んでもよい、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物の配列情報を得るステップを含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 配列情報を得るステップが、シーケンシングアダプターを、複数の伸長したバーコード化された核酸分子、またはその産物に結合させるステップを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 配列情報を得るステップが、シーケンシングアダプターを、複数の単一標識核酸分子、またはその産物に結合させるステップを含む、請求項４０に記載の方法。
  43. 配列情報を得るステップが、単一細胞のＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報を得るステップを含む、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. ＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報が、ＢＣＲ軽鎖および／またはＢＣＲ重鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む、請求項４３～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 試料が、複数の単一細胞を含み、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 配列情報を得るステップが、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報を得るステップを含む、請求項４０～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報が、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む、請求項４７～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 試料が、複数の単一細胞を含み、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 配列情報を得るステップが、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報を得るステップを含む、請求項４０～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. ＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報が、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む、請求項５１～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 試料が、複数の単一細胞を含み、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 標的結合領域の相補体が、標的結合領域の逆相補配列および／または標的結合領域の相補配列を含む、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 分子標識の相補体が、分子標識の逆相補配列および／または分子標識の相補配列を含む、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 複数のバーコード化された核酸分子が、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子および／またはバーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 核酸標的が、核酸分子、任意に、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含み、さらに、ｍＲＮＡが免疫受容体をコードしてもよい、請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 核酸標的が、細胞成分結合試薬を含む、請求項５８～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 核酸分子が、細胞成分結合試薬と会合している、請求項５８に記載の方法。
  61. 核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列を含む、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードが、固体支持体と会合しており、同じ固体支持体と会合している複数のオリゴヌクレオチドバーコードがそれぞれ、同一の試料標識を含んでもよく、さらに、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでもよい、請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードがそれぞれ、細胞標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでもよい、請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 同じ固体支持体に会合しているオリゴヌクレオチドバーコードが、同じ細胞標識を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 異なる固体支持体に会合しているオリゴヌクレオチドバーコードが、異なる細胞標識を含む、請求項６５に記載の方法。
  68. 複数の伸長したバーコード化された核酸分子がそれぞれ、細胞標識および細胞標識の相補体を含み、細胞標識の相補体が、細胞標識の逆相補配列および／または細胞標識の相補配列を含んでもよい、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップを含む、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 固体支持体が、合成粒子または平面表面を含む、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 試料が、単一細胞を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含む、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 合成粒子を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含み、単一細胞を溶解させるステップが、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい、請求項７１に記載の方法。
  73. 合成粒子と単一細胞が、同じウェル中にある、請求項７１～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 合成粒子と単一細胞が、同じ液滴中にある、請求項７１～７２のいずれか１項に記載の方法。
  75. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、または複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている、請求項７１～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 合成粒子が、崩壊可能である、請求項７１～７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 合成粒子が、ビーズを含み、ビーズが、
    セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、もしくはこれらの任意の組合せ；
    ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料；または
    崩壊可能ハイドロゲル粒子
    を含んでもよい、請求項７１～７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、リンカー官能基を含み、
    合成粒子が、固体支持体官能基を含み、
    支持体官能基およびリンカー官能基が、互いに会合しており、
    リンカー官能基および支持体官能基が、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい、請求項７１～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード、
    逆転写酵素、
    標的結合領域を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、またはその一部分、および
    ５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼ
    を含む、キット。
  80. ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む、請求項７９に記載のキット。
  81. 逆転写酵素が、ウイルス逆転写酵素、任意に、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含む、請求項７９～８０のいずれか１項に記載のキット。
  82. テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、任意に、３つの３’リボヌクレオチドを含み、さらに、３’リボヌクレオチドがグアニンを含んでもよい、請求項７９～８１のいずれか１項に記載のキット。
  83. エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む、請求項７９～８２のいずれか１項に記載のキット。
  84. 緩衝液、カートリッジ、逆転写反応のための１つもしくは複数の試薬、増幅反応のための１つもしくは複数の試薬、またはこれらの組合せを含む、請求項７９～８３のいずれか１項に記載のキット。
  85. 標的結合領域が、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項７９～８４のいずれか１項に記載のキット。
  86. オリゴヌクレオチドバーコードが、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含む、請求項７９～８５のいずれか１項に記載のキット。
  87. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識、細胞標識、および／または分子標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、請求項８６に記載のキット。
  88. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、および／または複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている、請求項７９～８７のいずれか１項に記載のキット。
  89. 合成粒子が、崩壊可能である、請求項７９～８８のいずれか１項に記載のキット。
  90. 合成粒子が、ビーズを含み、ビーズが、
    セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、もしくはこれらの任意の組合せ；
    ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料；または
    崩壊可能ハイドロゲル粒子
    を含んでもよい、請求項７９～８９のいずれか１項に記載のキット。
  91. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、リンカー官能基を含み、
    合成粒子が、固体支持体官能基を含み、
    支持体官能基およびリンカー官能基が、互いに会合しており、リンカー官能基および支持体官能基が、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい、請求項７９～９０のいずれか１項に記載のキット。
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6375230B2 (ja) 2012-02-27 2018-08-15 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 分子計数のための組成物およびキット
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
US11535882B2 (en) 2015-03-30 2022-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
CN107580632B (zh) 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
EP3861134A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 Becton, Dickinson and Company Determining 5' transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
CN114008214A (zh) 2019-01-28 2022-02-01 贝克顿·迪金森公司 含寡核苷酸的细胞成分结合试剂及其使用方法
WO2021016239A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
CN114729350A (zh) * 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US10941453B1 (en) * 2020-05-20 2021-03-09 Paragon Genomics, Inc. High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens
US20210371909A1 (en) * 2020-06-02 2021-12-02 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US20220010362A1 (en) 2020-07-13 2022-01-13 Becton, Dickinson And Company cDNA SPIKE-IN CONTROL FOR SINGLE CELL ANALYSIS
TWI811831B (zh) * 2020-11-03 2023-08-11 香港商行動基因（智財）有限公司 用於檢測基因變異的靶向定序方法及套組
EP4247969A1 (en) 2020-11-17 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics
EP4247968A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Use of dextramer in single cell analysis
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
WO2023034739A1 (en) * 2021-08-30 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Template switch oligonucleotide (tso) for mrna 5' analysis
CN117916389A (zh) 2021-09-01 2024-04-19 贝克顿迪金森公司 使用原位逆转录的空间多组学
WO2023044307A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Becton, Dickinson And Company Full length single cell rna sequencing
CN113736777A (zh) * 2021-09-14 2021-12-03 清华大学 一种用于高通量测序核酸编码探针的设计及合成方法
WO2023114203A1 (en) * 2021-12-13 2023-06-22 Cornell University Genotyping of targeted loci with single-cell chromatin accessibility
WO2023150763A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Becton, Dickinson And Company Preparing nucleic acid for further analysis of their sequence
WO2023150764A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Becton, Dickinson And Company Sorting of mrna and abseq containing barcoded beads by flow
WO2023154694A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Becton, Dickinson And Company Reference beads for linking imaging and sequencing readouts with single-cell resolution
US11680293B1 (en) 2022-04-21 2023-06-20 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules
WO2023225360A2 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 The University Of South Alabama Capless and tailless therapeutic exogenous mrna and method to produce the same
GB202211182D0 (en) * 2022-08-01 2022-09-14 Univ Oxford Innovation Ltd Bead-hashing

Family Cites Families (540)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510244A (en) 1980-04-17 1985-04-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Cell labeling with antigen-coupled microspheres
US4725536A (en) 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
WO1990001065A1 (en) 1988-07-26 1990-02-08 Genelabs Incorporated Rna and dna amplification techniques
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5871928A (en) 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5925525A (en) 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5200314A (en) 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
JP3164814B2 (ja) 1990-08-27 2001-05-14 科学技術振興事業団 均一化ｃＤＮＡライブラリーの作製法
DE69132843T2 (de) 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
US5981179A (en) 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5981176A (en) 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
DE69431719T2 (de) 1993-06-25 2003-09-18 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Hybridisierung und sequenzierung von nukleinsäuren
US6087186A (en) 1993-07-16 2000-07-11 Irori Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries
US5500356A (en) 1993-08-10 1996-03-19 Life Technologies, Inc. Method of nucleic acid sequence selection
US6309823B1 (en) 1993-10-26 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5714330A (en) 1994-04-04 1998-02-03 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US6495518B1 (en) 1994-06-13 2002-12-17 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
GB2293238A (en) 1994-09-13 1996-03-20 Inceltec Ltd Primers for replication and/or amplification reactions
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5695934A (en) 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US6600996B2 (en) 1994-10-21 2003-07-29 Affymetrix, Inc. Computer-aided techniques for analyzing biological sequences
EP0709466B1 (en) 1994-10-28 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the simultaneous detection and quantification of multiple specific nucleic acid sequences
ATE254965T1 (de) 1995-04-25 2003-12-15 Discovery Partners Internation Fernprogrammierbare matrizen mit speichern und verwendungen davon
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5968740A (en) 1995-07-24 1999-10-19 Affymetrix, Inc. Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid
US5763175A (en) 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6613544B1 (en) 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5830712A (en) 1996-02-06 1998-11-03 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Selective template deletion method
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
EP1736554B1 (en) 1996-05-29 2013-10-09 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
JPH1021373A (ja) 1996-07-05 1998-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd 画像解析装置
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
US6984491B2 (en) 1996-07-29 2006-01-10 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US7169556B2 (en) 1996-07-29 2007-01-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6100029A (en) 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US5935793A (en) 1996-09-27 1999-08-10 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
US6117631A (en) 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
CA2291180A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6399334B1 (en) 1997-09-24 2002-06-04 Invitrogen Corporation Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof
AU1603199A (en) 1997-12-03 1999-06-16 Curagen Corporation Methods and devices for measuring differential gene expression
US6265163B1 (en) 1998-01-09 2001-07-24 Lynx Therapeutics, Inc. Solid phase selection of differentially expressed genes
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
WO2000014282A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Lynx Therapeutics, Inc. Method of screening for genetic polymorphism
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
US6197554B1 (en) 1998-11-20 2001-03-06 Shi-Lung Lin Method for generating full-length cDNA library from single cells
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US20020019005A1 (en) 1999-02-18 2002-02-14 Arcaris, Inc. Process for identification of genes encoding proteins having cell proliferation-promoting activity
US6629040B1 (en) 1999-03-19 2003-09-30 University Of Washington Isotope distribution encoded tags for protein identification
EP1165839A2 (en) 1999-03-26 2002-01-02 Whitehead Institute For Biomedical Research Universal arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
DE60045059D1 (de) 1999-04-20 2010-11-18 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Verfahren und Sonden zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäure-Molekülen und Verfahren zur Analyse der gewonnenen Daten
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6326148B1 (en) 1999-07-12 2001-12-04 The Regents Of The University Of California Detection of copy number changes in colon cancer
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
JP2001078768A (ja) 1999-09-16 2001-03-27 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 遺伝子発現の測定法
SE9903988D0 (sv) 1999-11-03 1999-11-03 Amersham Pharm Biotech Ab Method of analysis
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
EP1255860A2 (en) 1999-12-29 2002-11-13 Mergen Ltd. Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
WO2001053539A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Phylos, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US20050214825A1 (en) 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
JP2003521252A (ja) 2000-02-07 2003-07-15 イルミナ インコーポレイテッド ユニバーサルプライミングを用いる核酸検出方法
US20020072058A1 (en) 2000-03-24 2002-06-13 Voelker Leroy L. Method for amplifying quinolone-resistance-determining-regions and identifying polymorphic variants thereof
ATE334228T1 (de) 2000-03-29 2006-08-15 Lgc Ltd Hybridisierungsprobe und methode zum schnellen nachweis und zur schnellen unterscheidung von sequenzen
EP2206791B1 (en) 2000-04-10 2016-07-13 Taxon Biosciences, Inc. Methods for the survey and genetic analysis of populations
US20030207300A1 (en) 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7630063B2 (en) 2000-08-02 2009-12-08 Honeywell International Inc. Miniaturized cytometer for detecting multiple species in a sample
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
EP1975251A3 (en) 2000-07-07 2009-03-25 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
AU2001281248A1 (en) 2000-08-11 2002-03-13 Nanosphere Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6934408B2 (en) 2000-08-25 2005-08-23 Amnis Corporation Method and apparatus for reading reporter labeled beads
DE60124363T2 (de) 2000-08-25 2007-09-06 Riken, Wako Methode zur Herstellung von genormten und/oder subtrahierten cDNA
ATE380883T1 (de) 2000-10-24 2007-12-15 Univ Leland Stanford Junior Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna
EP1356109A2 (en) 2000-12-08 2003-10-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020142345A1 (en) 2000-12-22 2002-10-03 Nelsen Anita J. Methods for encoding and decoding complex mixtures in arrayed assays
US20030049616A1 (en) 2001-01-08 2003-03-13 Sydney Brenner Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags
WO2002070684A2 (en) 2001-01-11 2002-09-12 Lion Bioscience Ag Gene library for screening methods
BRPI0206746B8 (pt) 2001-01-25 2021-07-27 Luminex Molecular Diagnostics Inc composição compreendendo conjuntos de moléculas para uso como rótulos ou complementos de rótulo, kit para classificação e identificação de polinucleotídeos, método de análise de uma amostra biológica e método para determinação da presença de um alvo
BR0205268A (pt) 2001-03-09 2004-11-30 Nugen Technologies Inc Processos e composições para a mplificação de sequências de rna
JP2005233974A (ja) 2001-03-21 2005-09-02 Olympus Corp 生化学的検査方法
US7027932B2 (en) 2001-03-21 2006-04-11 Olympus Optical Co., Ltd. Biochemical examination method
WO2002079490A2 (en) 2001-03-28 2002-10-10 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified particles
CA2443894A1 (en) 2001-04-11 2002-10-24 Charlie Xiang Modified random primers for probe labeling
US20030170675A1 (en) 2001-04-11 2003-09-11 The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. Methods of manipulating nucleic acids
AUPR480901A0 (en) 2001-05-04 2001-05-31 Genomics Research Partners Pty Ltd Diagnostic method for assessing a condition of a performance animal
CA2344599C (en) 2001-05-07 2011-07-12 Bioneer Corporation Selective polymerase chain reaction of dna of which base sequence is completely unknown
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
CA2450139A1 (en) 2001-06-11 2002-12-19 Illumina, Inc Multiplexed detection methods
JP4244534B2 (ja) 2001-06-12 2009-03-25 横河電機株式会社 バイオチップ
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
US6830931B2 (en) 2001-07-12 2004-12-14 Automated Cell, Inc. Method and apparatus for monitoring of proteins and cells
WO2003035829A2 (en) 2001-10-09 2003-05-01 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
AU2002360272A1 (en) 2001-10-10 2003-04-22 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US20030077611A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Sention Methods and systems for dynamic gene expression profiling
US20050118589A1 (en) 2001-11-21 2005-06-02 Vann Charles S. Digital array
US20030175749A1 (en) 2001-12-08 2003-09-18 Jong-Yoon Chun Annealing control primer and its uses
JP2005538929A (ja) 2002-01-16 2005-12-22 ダイナル バイオテック エイエスエイ 単一サンプルからの核酸及びタンパク質の単離方法
AU2003206095A1 (en) 2002-01-29 2003-09-02 Global Genomics Ab Methods and means for amplifying nucleic acid
KR20040105717A (ko) 2002-02-14 2004-12-16 이뮤니베스트 코포레이션 저비용 세포 분석기에서의 세포 계산 방법 및 알고리즘
US20030186251A1 (en) 2002-04-01 2003-10-02 Brookhaven Science Associates, Llc Genome sequence tags
US20050175993A1 (en) 2002-04-12 2005-08-11 Chia-Lin Wei Method for making full-length coding sequence cDNA libraries
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US20070178478A1 (en) 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
GB0212391D0 (en) 2002-05-29 2002-07-10 Axis Shield Asa Assay
WO2004003219A2 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Igen International, Inc. Improved assay systems and components
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
US7192700B2 (en) 2002-12-20 2007-03-20 Orchid Cellmark Inc. Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions
EP2315027A1 (en) 2002-08-16 2011-04-27 Decision Biomarkers Incorporated Substrates for isolating, reacting and microscopically analyzing materials
DE60329853D1 (de) 2002-09-03 2009-12-10 Quanta Biosciences Inc Verbesserte zusammensetzungen und verfahren für die cdna-synthese
US7361821B2 (en) 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
WO2004031408A1 (en) 2002-09-30 2004-04-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
JP5695287B2 (ja) 2002-10-02 2015-04-01 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 微小流体の核酸解析
US7822555B2 (en) 2002-11-11 2010-10-26 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
JP2006519977A (ja) 2002-11-11 2006-08-31 アフィメトリックス インコーポレイテッド Ｄｎａコピー数変化を同定するための方法
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
CA2510166A1 (en) 2002-12-20 2004-09-30 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of dna
EP1586068B1 (en) 2003-01-23 2008-07-30 U.S. Genomics, Inc. Methods for analyzing polymer populations
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
DK2374900T3 (en) 2003-03-07 2016-10-17 Rubicon Genomics Inc Polynucleotides for amplification and analysis of the total genomic and total transcription libraries generated by a DNA polymerization
US8206913B1 (en) 2003-03-07 2012-06-26 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process
US7269518B2 (en) 2003-04-30 2007-09-11 Agilent Technologies, Inc. Chemical array reading
US20040259118A1 (en) 2003-06-23 2004-12-23 Macevicz Stephen C. Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
WO2005010209A2 (de) 2003-07-24 2005-02-03 Qiagen Gmbh Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren
EP1670941A1 (en) 2003-08-13 2006-06-21 Affymetrix, Inc. Methods and kits for preparing nucleic acid samples
GB0319332D0 (en) 2003-08-16 2003-09-17 Astrazeneca Ab Amplification
US20050048498A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for assembling probes
US7341837B2 (en) 2003-09-02 2008-03-11 Lawton Robert L Soluble analyte detection and amplification
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
US7824856B2 (en) 2003-09-10 2010-11-02 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
JP2007512811A (ja) 2003-11-10 2007-05-24 インベスチゲン， インコーポレイテッド 検出のための核酸を調製する方法
EP1709203A2 (en) 2004-01-23 2006-10-11 Lingvitae AS Improving polynucleotide ligation reactions
DE602005018166D1 (de) 2004-02-12 2010-01-21 Population Genetics Technologi Genetische analyse mittels sequenzspezifischem sortieren
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US7432055B2 (en) 2004-03-05 2008-10-07 Uchicago Argonne Llc Dual phase multiplex polymerase chain reaction
EP1745155B1 (en) 2004-05-07 2014-10-15 Cepheid Multiplexed detection of biological agents
WO2005111242A2 (en) 2004-05-10 2005-11-24 Parallele Bioscience, Inc. Digital profiling of polynucleotide populations
AU2005252242A1 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Irm Llc Dispensing systems, software, and related methods
US20060035258A1 (en) 2004-08-06 2006-02-16 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US20060041385A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Bauer Kenneth D Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization
US7713697B2 (en) 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
WO2006026828A1 (en) 2004-09-10 2006-03-16 Human Genetic Signatures Pty Ltd Amplification blocker comprising intercalating nucleic acids (tna) containing intercalating pseudonucleotides (ipn)
US20060073506A1 (en) 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
US7435084B2 (en) 2004-12-14 2008-10-14 Align Technology, Inc. System and methods for casting physical tooth model
EP1842226B2 (en) 2004-11-03 2014-07-02 Iris International, Inc. Homogeneous analyte detection
AU2005322131B2 (en) 2004-12-23 2011-11-10 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Ligation-based RNA amplification
US8883487B2 (en) 2004-12-23 2014-11-11 Abbott Point Of Care Inc. Molecular diagnostics system and methods
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
JP5526326B2 (ja) 2005-02-10 2014-06-18 独立行政法人理化学研究所 核酸配列増幅方法
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
EP1856293A2 (en) 2005-03-16 2007-11-21 Compass Genetics, Llc Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
EP1861512A4 (en) 2005-03-18 2009-12-09 Fluidigm Corp THERMAL REACTION DEVICE AND USE METHOD THEREFOR
WO2006110314A2 (en) 2005-03-25 2006-10-19 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
US7695886B2 (en) 2005-05-19 2010-04-13 Fuji Xerox Co., Ltd. Process for producing resin particle liquid dispersion for electrostatic image developing toner, electrostatic image developing toner and production process thereof
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
US20070065844A1 (en) 2005-06-08 2007-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Solution-based methods for RNA expression profiling
US7796815B2 (en) 2005-06-10 2010-09-14 The Cleveland Clinic Foundation Image analysis of biological objects
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US8486621B2 (en) 2005-08-11 2013-07-16 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-based matrixes
CA2620081A1 (en) 2005-09-16 2007-03-29 454 Life Sciences Corporation Cdna library preparation
US8831887B2 (en) 2005-10-12 2014-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Absolute PCR quantification
WO2007053692A1 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Symyx Technologies, Inc. Liquid dispensing for high-throughput experimentation
US7375211B2 (en) 2005-11-18 2008-05-20 Kou Zhong C Method for detection and quantification of T-cell receptor Vβ repertoire
US20080070303A1 (en) 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US7636465B2 (en) 2005-12-09 2009-12-22 Cytyc Corporation Cross-frame object reconstruction for image-based cytology applications
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
WO2007087310A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US8460879B2 (en) 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
US20080038727A1 (en) 2006-03-10 2008-02-14 Applera Corporation MicroRNA and Messenger RNA Detection on Arrays
WO2007114772A1 (en) 2006-04-04 2007-10-11 Sidec Technologies Ab Extended electron tomography
US20080194414A1 (en) 2006-04-24 2008-08-14 Albert Thomas J Enrichment and sequence analysis of genomic regions
WO2007136874A2 (en) 2006-05-18 2007-11-29 President And Fellows Of Harvard College Genomic library construction
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
CA2655272C (en) 2006-06-14 2017-04-18 Living Microsystems, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
US20100159590A1 (en) 2006-10-05 2010-06-24 Nanopoint, Inc. Systems and methods for active microfluidic cell handling
WO2008057163A2 (en) 2006-10-09 2008-05-15 Carnegie Mellon University Preparation of functional gel particles with a dual crosslink network
WO2008047428A1 (fr) 2006-10-18 2008-04-24 Osaki Electric Co., Ltd. COMPTEUR ÉLECTRONIQUE DE kWh
US20100184152A1 (en) 2006-10-23 2010-07-22 Vladislav Sandler Target-oriented whole genome amplification of nucleic acids
CA2958994C (en) 2006-11-15 2019-05-07 Biospherex Llc Kit for multiplex sequencing and ecogenomics analysis
US8050476B2 (en) 2006-11-22 2011-11-01 General Electric Company Heart rate demodulation of periodic movement in ultrasound data for object identification
EP4134667A1 (en) 2006-12-14 2023-02-15 Life Technologies Corporation Apparatus for measuring analytes using fet arrays
EP2096429A4 (en) 2007-01-16 2009-12-16 Olympus Corp FLUORESCENT SIGNAL ANALYSIS APPARATUS AND FLUORESCENT SIGNAL ANALYSIS METHOD
WO2008109207A2 (en) 2007-01-30 2008-09-12 The Regents Of The University Of California Methods and devices for biomolecular arrays
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
WO2008096318A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Identification system
US8003312B2 (en) 2007-02-16 2011-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multiplex cellular assays using detectable cell barcodes
HUE028487T2 (en) 2007-02-27 2016-12-28 Sentoclone Int Ab Detection of tumor cell multiplex using panel of agents associated with extracellular markers
WO2008109176A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2009-02-06 성균관대학교산학협력단 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도
JP2008256428A (ja) 2007-04-03 2008-10-23 Intec Systems Institute Inc マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法
US20080268508A1 (en) 2007-04-30 2008-10-30 Sowlay Mohankumar R Methods and kits for negative selection of desired nucleic acid sequences
US20080274458A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US20090061513A1 (en) 2007-05-15 2009-03-05 Picovitro Ab Cell sorting and cell cultivation methods
WO2008150432A1 (en) 2007-06-01 2008-12-11 454 Life Sciences Corporation System and meth0d for identification of individual samples from a multiplex mixture
US7635566B2 (en) 2007-06-29 2009-12-22 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
ES2391906T3 (es) 2007-09-12 2012-11-30 Institut Pasteur Polinucleótido apto para un ensayo indicador basado en una sola célula para controlar los patrones de expresión génica con una resolución espacio-temporal elevada
US8114681B2 (en) 2007-10-05 2012-02-14 Affymetrix, Inc. Highly multiplexed particle-based assays
US10300482B2 (en) 2010-12-09 2019-05-28 Akonni Biosystems, Inc. Sample analysis system
WO2009105670A2 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Gentel Biosciences, Inc. Substrates for multiplexed assays and uses thereof
US8687189B2 (en) 2008-03-03 2014-04-01 Ajjer, Llc Analysis of arrays by laser induced breakdown spectroscopy
US8206925B2 (en) 2008-04-14 2012-06-26 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Splice variants of human IL-23 receptor (IL-23R) mRNA and use of a delta 9 isoform in predicting inflammatory bowel diseases
US20090298709A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
WO2009148560A2 (en) 2008-05-30 2009-12-10 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US20100069250A1 (en) 2008-08-16 2010-03-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital PCR Calibration for High Throughput Sequencing
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US8835110B2 (en) 2008-11-04 2014-09-16 The Johns Hopkins University DNA integrity assay (DIA) for cancer diagnostics, using confocal fluorescence spectroscopy
EP2703816B1 (en) 2008-11-21 2016-10-05 Saint Louis University Biosensor for detecting multiple epitopes on a target
US20100159533A1 (en) 2008-11-24 2010-06-24 Helicos Biosciences Corporation Simplified sample preparation for rna analysis
US8492096B2 (en) 2008-12-24 2013-07-23 Boris Pasche TGFBR1 expression modifies risk for colorectal cancer
JP2012515533A (ja) 2009-01-20 2012-07-12 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 診断、予後診断、および創薬ターゲットの同定のための単細胞遺伝子発現の方法
US20100323348A1 (en) 2009-01-31 2010-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process
EP2404918B1 (en) 2009-03-05 2016-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Pyridine derivative as ppary inhibitor
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
ES2555389T3 (es) 2009-03-30 2015-12-30 Illumina, Inc. Análisis de expresión génica en células individuales
CN103952482A (zh) 2009-04-02 2014-07-30 弗卢伊蒂格姆公司 用于对目标核酸进行条形码化的多引物扩增方法
WO2010127186A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
WO2010131645A1 (ja) 2009-05-14 2010-11-18 和光純薬工業株式会社 Rnaに対応する二本鎖dnaの合成方法及び増幅方法
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
GB0909923D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Oxford Gene Tech Ip Ltd Picowell capture devices for analysing single cells or other particles
US20120058902A1 (en) 2009-06-25 2012-03-08 Livingston Robert J Method of measuring adaptive immunity
US8330957B2 (en) 2009-06-29 2012-12-11 Hager Enviromental and Atmospheric Technologies, LLC Device and method for quantification of gases in plumes by remote sensing
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
EP2467479B1 (en) 2009-08-20 2016-01-06 Population Genetics Technologies Ltd Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
WO2011028818A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Trustees Of Boston University High throughput multichannel reader and uses thereof
WO2011027268A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Koninklijke Philips Electronics N.V. Devices and methods for microarray selection
CN102575220B (zh) 2009-09-03 2015-09-16 贝克顿·迪金森公司 用于直接化学裂解的方法和组合物
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
WO2011041308A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Quest Diagnostics Investments Incorporated Bcr-abl truncation mutations
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
WO2011091046A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
EP2366031B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Sequencing methods in prenatal diagnoses
EP2529026B1 (en) 2010-01-25 2013-11-13 Rd Biosciences Inc. Self-folding amplification of target nucleic acid
WO2011100604A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
WO2011106738A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Use of tcr clonotypes as biomarkers for disease
WO2011123246A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
DK2556171T3 (en) 2010-04-05 2015-12-14 Prognosys Biosciences Inc Spatially CODED BIOLOGICAL ASSAYS
WO2011143659A2 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Fluidigm Corporation Nucleic acid isolation methods
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
ES2960184T3 (es) 2010-06-09 2024-03-01 Keygene Nv Códigos de barras de secuencias combinatorias para el cribado de alto rendimiento
US20120004132A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Affymetrix, Inc. Detection of Nucleic Acids and Proteins
KR101374465B1 (ko) 2010-07-07 2014-03-18 가부시키가이샤 어드밴티스트 시험 장치 및 시험 방법
EP2407242A1 (en) 2010-07-13 2012-01-18 Dublin City University Direct clone analysis and selection technology
US20120040843A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Dublin City University Centrifugal capture system
DK2623613T3 (en) 2010-09-21 2016-10-03 Population Genetics Tech Ltd Increasing the reliability of the allele-indications by molecular counting
EP2436766A1 (en) 2010-09-29 2012-04-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for improved protein interaction screening
WO2012042374A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Anssi Jussi Nikolai Taipale Method of determining number or concentration of molecules
DK2625320T3 (da) 2010-10-08 2019-07-01 Harvard College High-throughput enkeltcellestregkodning
US20120088691A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Gao Chen Highly multiplexed real-time pcr using encoded microbeads
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
AU2011336707A1 (en) 2010-11-29 2013-07-04 Dako Denmark A/S Methods and systems for analyzing images of specimens processed by a programmable quantitative assay
US9394511B2 (en) 2010-12-05 2016-07-19 Wenbin Jiang Rapid single cell based parallel biological cell sorter
DK2652155T3 (en) 2010-12-16 2017-02-13 Gigagen Inc Methods for Massive Parallel Analysis of Nucleic Acids in Single Cells
JP6328934B2 (ja) 2010-12-22 2018-05-23 ナテラ， インコーポレイテッド 非侵襲性出生前親子鑑定法
US10241075B2 (en) 2010-12-30 2019-03-26 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
EP3567121B1 (en) 2011-01-17 2023-08-30 Life Technologies Corporation Workflow for detection of ligands using nucleic acids
WO2012103154A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Nugen Technologies, Inc. Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations
WO2012103031A2 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
WO2012106385A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 Apprise Bio, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
US9365897B2 (en) 2011-02-08 2016-06-14 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
JP6068365B2 (ja) * 2011-02-23 2017-01-25 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム Ｄｎａ合成のためのテンプレートスイッチの使用
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
KR20120110431A (ko) 2011-03-29 2012-10-10 에스케이하이닉스 주식회사 반도체 메모리 장치
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP3246416A1 (en) 2011-04-15 2017-11-22 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US8946389B2 (en) 2011-04-25 2015-02-03 University Of Washington Compositions and methods for multiplex biomarker profiling
EP3789498A1 (en) 2011-04-25 2021-03-10 Bio-rad Laboratories, Inc. Methods for nucleic acid analysis
EP3418380B1 (en) 2011-04-28 2022-05-25 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Identification of polynucleotides associated with a sample
GB201108259D0 (en) 2011-05-17 2011-06-29 Cambridge Entpr Ltd Gel beads in microfluidic droplets
SG10201605049QA (en) 2011-05-20 2016-07-28 Fluidigm Corp Nucleic acid encoding reactions
HRP20211595T1 (hr) 2011-05-24 2022-01-21 BioNTech SE Individualizirana cjepiva protiv raka
WO2012162621A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Brandeis University Methods for suppression pcr
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
EP2724160A2 (en) 2011-06-27 2014-04-30 Life Technologies Corporation Acoustic cytometry methods and protocols
US9340826B2 (en) 2011-08-01 2016-05-17 Celemics, Inc. Method of preparing nucleic acid molecules
US10364464B2 (en) 2011-08-08 2019-07-30 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
JP5816486B2 (ja) 2011-08-18 2015-11-18 オリンパス株式会社 蛍光観察装置および蛍光観察システム並びに蛍光観察装置の蛍光画像処理方法
WO2013038010A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Lexogen Gmbh Nucleic acid transcription method
US9297047B2 (en) 2011-10-24 2016-03-29 Jennifer Furchak Molecular beacon based assay for the detection of biomarkers for breast cancer metastasis
EP2776833B1 (en) 2011-11-11 2018-09-05 Eli N. Glezer Co-binder assisted assay methods
KR101337094B1 (ko) 2011-11-30 2013-12-05 삼성에스디에스 주식회사 염기 서열 정렬 장치 및 그 방법
EP3211100A1 (en) 2011-12-22 2017-08-30 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
WO2013120089A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Raindance Technologies, Inc. Molecular diagnostic screening assay
WO2013123125A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
WO2013126741A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
JP6375230B2 (ja) 2012-02-27 2018-08-15 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 分子計数のための組成物およびキット
ES2776673T3 (es) 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
WO2013137737A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Flexgen B.V. Methods of creating and screening of dna encoded combinatorial libraries of chemical antibodies
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
SG11201407107VA (en) 2012-05-08 2014-11-27 Adaptive Biotechnologies Corp Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions
EP2850211B1 (en) 2012-05-14 2021-09-08 iRepertoire, Inc. Method for increasing accuracy in quantitative detection of polynucleotides
EP2852682B1 (en) 2012-05-21 2017-10-04 Fluidigm Corporation Single-particle analysis of particle populations
EP2856177B1 (en) 2012-05-25 2020-11-18 The University of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
CA2876209A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
ES2774165T3 (es) 2012-06-15 2020-07-17 Univ Texas Secuenciación de alto rendimiento de múltiples transcritos de una única célula
CN104619894B (zh) 2012-06-18 2017-06-06 纽亘技术公司 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
EP3243937A1 (en) 2012-07-17 2017-11-15 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
EP3354750A1 (en) 2012-07-18 2018-08-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Kit of normalizing biological samples
AU2013293240A1 (en) 2012-07-24 2015-03-05 Adaptive Biotechnologies Corp. Single cell analysis using sequence tags
ES2917400T3 (es) 2012-07-26 2022-07-08 Illumina Inc Composiciones y métodos para la amplificación de ácidos nucleicos
EP3578669A1 (en) 2012-08-08 2019-12-11 F. Hoffmann-La Roche AG Increasing dynamic range for identifying multiple epitopes in cells
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150005199A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378349A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378322A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005200A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
WO2014028537A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 10X Technologies, Inc. Microcapsule compositions and methods
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2888349B1 (en) 2012-08-24 2022-02-09 Yale University System, device and method for high-throughput multi-plexed detection
CA2886974C (en) 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
GB201218909D0 (en) 2012-10-22 2012-12-05 Univ Singapore Assay for the parallel detection of biological material based on PCR
EP2914745B1 (en) 2012-11-05 2017-09-06 Rubicon Genomics, Inc. Barcoding nucleic acids
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014108850A2 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. High throughput transcriptome analysis
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
WO2014116729A2 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Haplotying of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing
CN104955576A (zh) 2013-01-24 2015-09-30 沙特基础全球技术有限公司 由聚酯-聚碳酸酯制成的微孔板
US10017761B2 (en) 2013-01-28 2018-07-10 Yale University Methods for preparing cDNA from low quantities of cells
US10190963B2 (en) 2013-02-01 2019-01-29 Becton, Dickinson And Company Methods and systems for assessing sample behavior in a flow cytometer
EP3862435A1 (en) 2013-02-08 2021-08-11 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US9850515B2 (en) 2013-02-08 2017-12-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity-based partition assay for detection of target molecules
WO2014126937A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Suspension arrays and multiplexed assays based thereon
US9621600B2 (en) 2013-02-26 2017-04-11 PortAura Group Method and system for providing recommendations using location information
US20140274811A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Lyle J. Arnold Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome
CN105189748B (zh) 2013-03-15 2021-06-08 血统生物科学公司 测序免疫组库的方法
GB2584364A (en) 2013-03-15 2020-12-02 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
WO2014145458A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Nucleic acid-tagged compositions and methods for multiplexed protein-protein interaction profiling
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
US20140303005A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Raindance Technologies, Inc. Rare cell analysis after negative selection
CA2909861C (en) 2013-04-25 2022-12-06 Firefly Bioworks, Inc. Multiplexed analysis of target nucleic acids
US10822605B2 (en) 2013-05-03 2020-11-03 Gensinta, Inc. Method and apparatus for producing sequence verified DNA
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
AU2014278537B2 (en) 2013-06-12 2018-04-19 The General Hospital Corporation Methods, kits, and systems for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
WO2014201273A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The Broad Institute, Inc. High-throughput rna-seq
US20150011398A1 (en) 2013-06-17 2015-01-08 Kim Lewis Methods for quantitative determination of protein-nucleic acid interactions in complex mixtures
CN111662960B (zh) 2013-06-25 2024-04-12 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
EP3013957B2 (en) 2013-06-27 2022-05-11 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
US20160153973A1 (en) 2013-07-09 2016-06-02 Lucas David Smith Device and method of rapid linker mediated label-based immunoassays
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US20150132743A1 (en) 2013-09-04 2015-05-14 Fluidigm Corporation Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
ES2875998T3 (es) 2013-09-30 2021-11-11 Vesicode Ab Procedimientos de perfilado de complejos moleculares mediante el uso de códigos de barras dependientes de la proximidad
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
HUE045954T2 (hu) 2013-10-17 2020-01-28 Illumina Inc Eljárások és készítmények nukleinsavkönyvtárak elõállítására
WO2015061719A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Massachusetts Institute Of Technology Method and apparatus for tracking cell identity
WO2015061844A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 The University Of Sydney Assay to stratify cancer patients
WO2015070037A2 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Prognosys Biosciences, Inc. Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection
WO2015103339A1 (en) 2013-12-30 2015-07-09 Atreca, Inc. Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes
AU2015209079B2 (en) 2014-01-27 2021-07-15 Archerdx, Llc Methods of preparing nucleic acids for sequencing
US20150218620A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods to capture and/or remove highly abundant rnas from a heterogenous rna sample
EP3126512B1 (en) 2014-02-26 2019-04-17 Ventana Medical Systems, Inc. Photo-selective method for biological sample analysis field
AU2015227054A1 (en) 2014-03-05 2016-09-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
CN106459967A (zh) 2014-04-29 2017-02-22 Illumina公司 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析
KR102343605B1 (ko) 2014-05-19 2021-12-27 윌리엄 마쉬 라이스 유니버시티 비대립 유전자-특이적 프라이머 및 대립 유전자-특이적 블로커 올리고뉴클레오티드를 중첩하는 조성물을 사용한 대립 유전자-특이적 증폭
CN106795553B (zh) 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
KR20170026383A (ko) 2014-06-26 2017-03-08 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 서열의 분석
EP3626834B1 (en) 2014-07-15 2022-09-21 Qiagen Sciences, LLC Semi-random barcodes for nucleic acid analysis
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
SG11201702060VA (en) 2014-09-15 2017-04-27 Abvitro Inc High-throughput nucleotide library sequencing
US9529672B2 (en) 2014-09-25 2016-12-27 Everspin Technologies Inc. ECC word configuration for system-level ECC compatibility
US11873480B2 (en) 2014-10-17 2024-01-16 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
EP3234602B1 (en) 2014-12-19 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for identifying multiple epitopes in selected sub-populations of cells
EP3248018B1 (en) 2015-01-22 2020-01-08 Becton, Dickinson and Company Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
EP3247804B1 (en) 2015-01-23 2020-08-05 Qiagen Sciences, LLC High multiplex pcr with molecular barcoding
EP3253479B1 (en) 2015-02-04 2022-09-21 The Regents of The University of California Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
MX2017010142A (es) 2015-02-09 2017-12-11 10X Genomics Inc Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes.
EP3259371B1 (en) 2015-02-19 2020-09-02 Becton, Dickinson and Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
CN107208157B (zh) 2015-02-27 2022-04-05 贝克顿迪金森公司 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物
CN107614700A (zh) 2015-03-11 2018-01-19 布罗德研究所有限公司 基因型和表型偶联
US20160266094A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 University Of Iowa Research Foundation Cellular barcode
WO2016149418A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing
WO2016160965A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Rubicon Genomics, Inc. Methods and compositions for repair of dna ends by multiple enzymatic activities
US11535882B2 (en) 2015-03-30 2022-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
WO2016168825A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for performing spatial profiling of biological molecules
CN107580632B (zh) * 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
US9618871B2 (en) 2015-04-28 2017-04-11 Kyocera Document Solutions Inc. Image forming apparatus
CN107922967B (zh) 2015-05-22 2022-04-19 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 用于下一代基因组步移的方法以及相关的组合物和试剂盒
WO2016190795A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Kaarel Krjutskov Blocking oligonucleotides
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
US11248262B2 (en) 2015-08-24 2022-02-15 Qiagen Gmbh Method for generating a RNA-sequencing library
JP6743150B2 (ja) 2015-08-28 2020-08-19 イルミナ インコーポレイテッド 単一細胞の核酸配列分析
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
CN108291257B (zh) 2015-09-24 2023-12-29 阿布维特罗有限责任公司 亲和-寡核苷酸缀合物及其用途
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
KR20180097536A (ko) * 2015-11-04 2018-08-31 아트레카, 인크. 단일 세포와 연관된 핵산의 분석을 위한 핵산 바코드의 조합 세트
US20170136458A1 (en) 2015-11-18 2017-05-18 Wafergen, Inc. Systems and methods for pooling samples from multi-well devices
WO2017096239A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Cloning and expression system for t-cell receptors
EP3263715B1 (en) 2016-06-28 2020-01-08 Hifibio Method for transcriptome analysis of single cells
US11965891B2 (en) 2015-12-30 2024-04-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital protein quantification
US20170205404A1 (en) 2016-01-19 2017-07-20 General Electric Company Multifunctional beads and methods of use for capturing rare cells
WO2017139690A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 10X Genomics, Inc. Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes
US20190218276A1 (en) 2016-03-21 2019-07-18 The Broad Institute, Inc. Methods for determining spatial and temporal gene expression dynamics in single cells
EP3436581B1 (en) 2016-04-01 2020-10-14 Baylor College of Medicine Methods of whole transcriptome amplification
JP7129343B2 (ja) 2016-05-02 2022-09-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 正確な分子バーコーディング
WO2017196768A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 President And Fellows Of Harvard College Self-targeting guide rnas in crispr system
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
CN109074430B (zh) 2016-05-26 2022-03-29 贝克顿迪金森公司 分子标记计数调整方法
TWI600309B (zh) 2016-05-28 2017-09-21 Hon Hai Prec Ind Co Ltd 角度調整機構
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
WO2018017949A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Verily Life Sciences Llc Quantitative massively parallel proteomics
WO2018020489A1 (en) 2016-07-24 2018-02-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods and kits for analyzing dna binding moieties attached to dna
US20180037942A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Cellular Research, Inc. Enzyme-independent molecular indexing
RU2019106038A (ru) 2016-08-10 2020-09-17 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Способы de novo сборки баркодированных фрагментов геномной днк
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
WO2018061699A1 (ja) 2016-09-29 2018-04-05 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
WO2018061695A1 (ja) 2016-09-29 2018-04-05 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
CA3038535A1 (en) 2016-10-01 2018-04-05 Berkeley Lights, Inc. Dna barcode compositions and methods of in situ identification in a microfluidic device
DK3529357T3 (da) 2016-10-19 2022-04-25 10X Genomics Inc Fremgangsmåder til stregkodning af nukleinsyremolekyler fra individuelle celler
CN108473975A (zh) 2016-11-17 2018-08-31 领星生物科技（上海）有限公司 检测肿瘤发展的系统和方法
WO2018111872A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Grail, Inc. Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
BR112019012958A2 (pt) 2016-12-22 2019-11-26 Guardant Health Inc métodos e sistemas para análise de moléculas de ácido nucleico
WO2019113533A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
WO2018132635A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for analyzing t cell receptors and b cell receptors
US20180208975A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Assay for simultaneous genomic and proteomic analysis
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
FI3583214T3 (fi) 2017-02-02 2023-12-19 New York Genome Center Inc Menetelmiä ja koostumuksia biologisen näytteen sisältämien kohteiden tunnistamiseksi tai kvantifioimiseksi
US20200115753A1 (en) 2017-03-17 2020-04-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
US20230183791A1 (en) 2017-03-24 2023-06-15 National University Of Singapore Methods For Multiplex Detection Of Molecules
CN110446789A (zh) 2017-03-24 2019-11-12 赛卢拉研究公司 用于多重态确定的合成多重态
US11530436B2 (en) 2017-05-23 2022-12-20 President And Fellows Of Harvard College Multiplex end-tagging amplification of nucleic acids
EP3631001A4 (en) 2017-05-23 2021-01-20 Centrillion Technology Holdings Corporation PROCESSES FOR ESTABLISHING A SPATIAL PROFILE OF BIOLOGICAL MOLECULES
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN111148849A (zh) 2017-05-26 2020-05-12 阿布维托有限责任公司 高通量多核苷酸文库测序和转录组分析
EP3631004A4 (en) 2017-05-29 2021-03-03 President and Fellows of Harvard College MONOCELLULAR TRANSCRIPTOME AMPLIFICATION PROCESS
EP4345172A2 (en) 2017-06-05 2024-04-03 Becton, Dickinson and Company Sample indexing for single cells
US20200217850A1 (en) 2017-09-15 2020-07-09 Apton Biosystems, Inc. Heterogeneous single cell profiling using molecular barcoding
WO2019060804A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Cellular Research, Inc. IMMUNE BAR CODE RECEIVER ERROR CORRECTION
EP4339298A3 (en) 2017-09-25 2024-04-17 Fred Hutchinson Cancer Center High efficiency targeted in situ genome-wide profiling
WO2019076768A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus As METHOD AND KIT FOR PREPARING DNA BANK
US11702649B2 (en) 2017-10-23 2023-07-18 The Broad Institute, Inc. Single cell cellular component enrichment from barcoded sequencing libraries
US20200354767A1 (en) 2017-11-16 2020-11-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods to measure functional heterogeneity among single cells
WO2019113499A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. High-throughput methods for identifying gene interactions and networks
CN111699042A (zh) 2017-12-07 2020-09-22 麻省理工学院 单细胞分析
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
WO2019118355A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
WO2019126789A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing nucleic acid molecules from one or more cells
EP3735470B1 (en) 2018-01-05 2023-11-22 BillionToOne, Inc. Quality control templates for ensuring validity of sequencing-based assays
CN112004920A (zh) 2018-02-05 2020-11-27 斯坦福大学托管董事会 用于单细胞和集合细胞的多重测量的系统和方法
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
EP3765596A4 (en) 2018-03-12 2022-04-06 Silicon Valley Scientific, Inc. METHOD AND APPARATUS FOR PROCESSING TISSUE AND OTHER SAMPLES ENCODING CELLULAR SPATIAL POSITION INFORMATION
WO2019204560A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 The Regents Of The University Of California Method to connect chromatin accessibility and transcriptome
WO2019210049A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 X Gen Us Co. Methods and compositions for preparing polynucleotides
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN110499251A (zh) 2018-05-17 2019-11-26 中国科学院大连化学物理研究所 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
EP3821011B1 (en) 2018-07-11 2023-04-26 Cygnus Biosciences (Beijing) Co., Ltd. Transposome enabled dna/rna-sequencing (ted rna-seq)
CN112840024A (zh) 2018-08-03 2021-05-25 贝克顿迪金森公司 单细胞中的核条形码化和捕获
CA3108770A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Vanderbilt University Systems and methods for simultaneous detection of antigens and antigen specific antibodies
EP4242324A3 (en) 2018-08-17 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Aptamer barcoding
CN112912513A (zh) 2018-08-28 2021-06-04 贝克顿迪金森公司 使用糖类结合试剂和膜透过性试剂进行样品多重化
EP3861134A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 Becton, Dickinson and Company Determining 5' transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
WO2020131699A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Natera, Inc. Methods for analysis of circulating cells
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
CN114008214A (zh) 2019-01-28 2022-02-01 贝克顿·迪金森公司 含寡核苷酸的细胞成分结合试剂及其使用方法
EP3924506A1 (en) 2019-02-14 2021-12-22 Becton Dickinson and Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
WO2020219721A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods characterizing metastasis
SG10201904897UA (en) 2019-05-30 2020-12-30 Nat Univ Singapore Method, structures and system for nucleic acid sequence topology assembly for multiplexed profiling of proteins.
EP3997217A4 (en) 2019-07-12 2023-06-28 New York Genome Center, Inc. Methods and compositions for scalable pooled rna screens with single cell chromatin accessibility profiling
US20210039582A1 (en) 2019-08-07 2021-02-11 ZF Passive Safety Systems US Inc. Airbag package with improved packaging
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
EP4339299A2 (en) 2020-01-10 2024-03-20 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
WO2021146219A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Cell capture using du-containing oligonucleotides
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
EP4090762A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for single cell secretomics
EP4097228A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 Becton, Dickinson and Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
US20210238661A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Mesophilic dna polymerase extension blockers
WO2021163374A2 (en) 2020-02-12 2021-08-19 Becton, Dickinson And Company Intracellular abseq
EP4106769A4 (en) 2020-02-17 2024-03-27 Universal Sequencing Tech Corporation METHOD FOR BARCODING NUCLEIC ACIDS FOR DETECTION AND SEQUENCING
AU2021224760A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
CN115151810A (zh) 2020-02-25 2022-10-04 贝克顿迪金森公司 实现使用单细胞样品作为单色补偿对照的双特异性探针
US20230193246A1 (en) 2020-03-05 2023-06-22 BioLegend, Inc. Methods and compositions for detecting targets
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US20210371909A1 (en) 2020-06-02 2021-12-02 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US20220010362A1 (en) 2020-07-13 2022-01-13 Becton, Dickinson And Company cDNA SPIKE-IN CONTROL FOR SINGLE CELL ANALYSIS
US20220033810A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
JP2023539822A (ja) 2020-08-20 2023-09-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 血液培養物から細菌を単離するための血液細胞溶解薬
EP4247969A1 (en) 2020-11-17 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics
EP4247968A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Use of dextramer in single cell analysis
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
CN116569042A (zh) 2020-12-09 2023-08-08 贝克顿迪金森公司 多重化的单细胞免疫测定
EP4279609A1 (en) 2020-12-31 2023-11-22 Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (China National Center for Bioinformation) Method and kit for labeling nucleic acid molecules
JP2024502618A (ja) 2021-01-08 2024-01-22 セラノーム， インコーポレイテッド 生体試料を分析するためのデバイスおよび方法
CN117396613A (zh) 2021-06-01 2024-01-12 10X基因组学有限公司 用于分析物检测和探针解析的方法和组合物

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