CN111699042A - 单细胞分析 - Google Patents

单细胞分析 Download PDF

Info

Publication number
CN111699042A
CN111699042A CN201880088780.6A CN201880088780A CN111699042A CN 111699042 A CN111699042 A CN 111699042A CN 201880088780 A CN201880088780 A CN 201880088780A CN 111699042 A CN111699042 A CN 111699042A
Authority
CN
China
Prior art keywords
array
bead
barcode
nucleic acid
photoresist
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880088780.6A
Other languages
English (en)
Inventor
J·克里斯托弗·洛夫
托德·米歇尔·吉兰
亚历山大·K·沙列克
马克·黑文斯·沃兹沃思
特拉维斯·K·休斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute of Technology filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Publication of CN111699042A publication Critical patent/CN111699042A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03F—PHOTOMECHANICAL PRODUCTION OF TEXTURED OR PATTERNED SURFACES, e.g. FOR PRINTING, FOR PROCESSING OF SEMICONDUCTOR DEVICES; MATERIALS THEREFOR; ORIGINALS THEREFOR; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED THEREFOR
    • G03F7/00—Photomechanical, e.g. photolithographic, production of textured or patterned surfaces, e.g. printing surfaces; Materials therefor, e.g. comprising photoresists; Apparatus specially adapted therefor
    • G03F7/20—Exposure; Apparatus therefor
    • G03F7/2002—Exposure; Apparatus therefor with visible light or UV light, through an original having an opaque pattern on a transparent support, e.g. film printing, projection printing; by reflection of visible or UV light from an original such as a printed image
    • G03F7/2014—Contact or film exposure of light sensitive plates such as lithographic plates or circuit boards, e.g. in a vacuum frame
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0851—Bottom walls

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本公开内容描述了对用于单细胞分析(例如但不限于Seq‑well)的硬件和酶促反应二者的改进，其使得能够实现每个细胞转录物产率的显著提高、改善的可携带性和易用性、提高的测定可扩展性、以及转录物信息与在皮米孔阵列中进行的其他测量的联系。

Description

单细胞分析
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年12月7日提交的标题为“SINGLE CELLANALYSES”的美国临时申请No.62/595,895的优先权，出于所有目的，其通过引用整体并入本文。
背景技术
基于孔的生物分析平台(也称为Seq-well)有助于使用包含预装载有条码化转录物捕获珠的10,000至1,000,000或更多个微米尺寸和皮升(picoliter)体积的孔的装置从数千个单细胞产生条码化单细胞测序文库。细胞被简单地施加至阵列的顶表面，并在数分钟内通过重力落入孔中。这种简化的装载方案使得Seq-well能够捕获将近100％的施加至装置表面的细胞。通过Seq-well稳健捕获单细胞转录物组的关键是在细胞装载之后将半透膜附着于阵列表面(如公布的PCT申请No.PCT/US17/13791中公开的)，使得能够在保持捕获生物大分子(例如，DNA、RNA和蛋白质)的同时在孔中容易地进行缓冲液交换以用于细胞裂解和RNA杂交。由于其低输入要求和对珠和细胞的高效捕获，Seq-well平台已广泛应用于众多研究和临床环境。尽管已针对在限制细胞和mRNA捕获珠之后生成单独条码化的单细胞测序文库对平台进行了优化(Macosko，等2015)，但其能够进行多个级别的数据采集。该平台与用同一阵列进行的其他测定和测量兼容。可使用限制体积技术(confined volumetechnology)评估细胞表面蛋白质(Ogunniyi，A.O.，B.A.Thomas，T.J.Politano，N.Varadarajan，E.Landais，P.Poignard，B.D.Walker，D.S.Kwon，and J.C.Love，″Profiling Human Antibody Responses by Integrated Single-Cell Analysis″Vaccine，32(24)，2866-2873)、分泌的蛋白质(参见例如，US 7,776,553；US 8,835，187；US8,772,049；US 8,865,479；JP 571822；EP 2 297 333；美国公布No.2012/0015824)、细胞的细胞溶解行为(参见例如，美国公布No.2012/0149592)、动态运动性(参见例如，Yao，X.等Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulatingtumor cells with malignant traits.Integr Biol(Camb)，doi：10.1039/c3ib40264a(2014))和基因表达(参见例如，美国公布No.2011/0111981)的水平。然而，这些另外的测量尚未与每个细胞的完整转录物组联系起来，这是因为条码化珠装载过程的随机性质阻止了将测序空间中的珠条码链接回其来源孔。
发明概述
因此，本公开内容提供了用于单细胞分析的改善的产品和方法。这些改善的产品和方法可用于基于孔的测定和/或基于珠的测定，例如但不限于Seq-well测定。其改善了这样的测定的稳健性(robustness)，例如，通过提高捕获的单细胞转录物的比例从而得到这样的单细胞的更完整的“转录物组”，和/或降低孔阵列中从一个孔与另一个孔的材料交叉污染的可能性。其还用于通过提供空间定位每个转录物组的来源孔的手段来扩展基于孔的测定的使用。后一种改善使得能够将转录物组数据与转录物捕获之前在细胞上进行的其他测量或操作联系起来。例如，提供了向孔阵列中的每个孔(或孔的子集)施加不同条件或不同试剂的方法，并且可确定这样的操作的效果。然后，还可将这种细胞响应与这些孔中单细胞的转录物组分析相关联。作为另一个实例，终端用户可基于一种或更多种标志物(例如细胞表面标志物)的表达来询问细胞，并且再次将这样的标志物表达与细胞的转录谱相关联。在又一个实例中，其允许对单细胞进行功能分析，例如细胞增殖或迁移活性，并随后将这样的功能属性与特定的基因表达模式相关联。对阵列中的孔和因此阵列中的细胞进行空间条码化的能力允许对这样的细胞进行组合的转录物组学、蛋白质组学和功能分析。其还用于通过提供由干膜光致抗蚀剂(photoresist)制成的阵列来扩展基于孔的阵列的使用，得到了以高度可扩展的方式制造并且可超泊松(super-Poisson)装载的阵列。
因此，在一个方面，本公开内容提供了用于从输入核酸产生在5’和3’端包含通用引物位点的核酸的文库的方法，其包括：(a)使输入核酸与捕获寡核苷酸库接触，每个捕获寡核苷酸包含5’通用引物位点和与输入核酸中的核苷酸序列互补的3’靶结合位点(也称为捕获位点)，并且任选地包含条码，所述条码任选地存在于所述5’通用引物位点与所述3’靶结合位点之间，(b)添加DNA聚合酶并且从而使与输入核酸杂交的捕获寡核苷酸延伸，并且使第一链核酸从其互补核酸上变性，以形成第一链核酸，每个第一链核酸包含5’通用引物位点和与输入核酸互补的序列，(c)使所述第一链核酸与第二链引发寡核苷酸库接触，每个第二链引发寡核苷酸包含5’通用引物位点和与所述第一链核酸中的核苷酸序列互补的3’靶结合位点，以及(d)添加DNA聚合酶并且从而使所述第二链引发寡核苷酸延伸以形成第二链核酸，所述第二链核酸包含位于所述输入核酸中所存在核苷酸序列的侧翼的5’和3’通用引物位点。
在一些实施方案中，捕获寡核苷酸包含含有poly(dT)序列的靶结合序列。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸包含含有poly(dT)序列的靶结合序列和/或含有靶向输入核酸中特定序列的序列的靶结合序列。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸包含含有靶向输入核酸中特定序列的序列的靶结合序列。
在一些实施方案中，捕获寡核苷酸附着于表面，任选地，珠的表面。
在一些实施方案中，输入核酸作为输入核酸的复杂混合物提供。在一些实施方案中，输入核酸包含RNA。在一些实施方案中，输入核酸包含单链DNA(ssDNA)与RNA的混合物。在一些实施方案中，输入核酸(a)来自于病毒或细菌，或者(b)来自于真核细胞，例如酵母或昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入核酸来自于包含哺乳动物或酵母或昆虫RNA和细菌或病毒DNA的受感染细胞。在一些实施方案中，输入核酸来自于单细胞。在一些实施方案中，输入核酸来自于2至1000个细胞。
在一些实施方案中，第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含随机核苷酸序列。在一些实施方案中，第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含半随机核苷酸序列。在一些实施方案中，第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含随机序列和与第一链核酸中的特定序列互补的序列。在一些实施方案中，第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含与第一链核酸中的序列互补的序列。
在一些实施方案中，第二链引发寡核苷酸库还包含诱饵寡核苷酸，所述诱饵寡核苷酸包含与第一链核酸中的序列互补的靶结合序列但缺少通用引物位点来介导特定核酸的耗尽。
在一些实施方案中，第二链引发寡核苷酸附着于表面，任选地，珠的表面。
在一些实施方案中，在步骤(a)、(b)、(c)和/或(d)中添加拥挤试剂(crowdingreagent)。在一些实施方案中，在步骤(b)中添加拥挤试剂。在一些实施方案中，在步骤(d)中添加拥挤试剂。
在一些实施方案中，捕获寡核苷酸还包含用于独特分子鉴定的随机核苷酸序列。
本公开内容的另一方面提供了用于从单细胞产生多个相同地5’和3’标记的cDNA分子的方法，其包括(a)从单细胞RNA文库合成第一链cDNA文库，其中来自所述文库的第一链cDNA分子各自包含相同的5’通用引物位点，以及任选地，相同的条码；(b)使具有5’通用引物位点的第一链cDNA分子与在靶结合序列上游具有5’通用引物位点的寡核苷酸接触；以及(c)使所述寡核苷酸延伸以产生多个第二链cDNA分子，所述第二链cDNA分子被5’通用引物位点和3’通用引物位点相同地标记。
在一些实施方案中，通过将单RNA分子与包含5’通用引物位点和随机、半随机和/或靶向捕获序列的捕获寡核苷酸杂交来合成第一链cDNA文库。在一些实施方案中，通过将单RNA分子与包含5’通用引物位点和poly(dT)捕获序列的捕获寡核苷酸杂交来合成第一链cDNA文库。
在一些实施方案中，捕获寡核苷酸附着于珠。在一些实施方案中，多个相同的捕获寡核苷酸附着于所述珠。
在一些实施方案中，捕获寡核苷酸包含5’通用引物序列、条码和3’捕获序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括从单细胞获得RNA文库或提供来自单细胞的RNA文库。
在一些实施方案中，步骤(b)还包括使第一链cDNA分子与缺少5’通用引物位点的诱饵寡核苷酸接触。
本公开内容的另一方面提供了用于产生多个核酸分子的方法，其包括(a)从多个亲本核酸合成第一链核酸，每个第一链核酸与所述多个中的亲本核酸互补，其中第一链核酸各自包含相同的5’通用引物位点；(b)使具有5’通用引物位点的第一链核酸与在靶结合序列上游包含5’通用引物位点的第二链引发寡核苷酸接触；以及(c)使所述第二链引发寡核苷酸延伸以产生多个第二链核酸，所述第二链核酸被5’通用引物位点和3’通用引物位点相同地标记。
在一些实施方案中，通过使亲本核酸与具有随机、半随机或靶向序列的捕获寡核苷酸杂交来合成每个第一链核酸。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸附着于珠。
在一些实施方案中，多个相同的捕获寡核苷酸附着于所述珠。
在一些实施方案中，捕获寡核苷酸包含5’通用引物序列、条码序列和3’捕获序列。
在一些实施方案中，所述方法包括从单细胞或病毒获得多个亲本核酸。在一些实施方案中，单细胞是病原体。
在一些实施方案中，靶结合序列包含随机序列、半随机序列和/或非随机/靶向序列。
在一些实施方案中，第一链cDNA分子或第一链核酸各自包含相同的条码。在一些实施方案中，第一链cDNA分子或第一链核酸附着于珠。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(a)、(b)和/或(c)中添加拥挤试剂。
在一些实施方案中，所述方法还包括产生第一链cDNA分子，包括：提供包含5’通用引物位点、捕获序列和任选的其间的条码序列的捕获寡核苷酸；使所述捕获寡核苷酸与来自单细胞的多个RNA分子接触；使得所述多个RNA分子与其相应的捕获序列退火；以及添加DNA聚合酶，从而使所述捕获寡核苷酸延伸以产生第一链cDNA分子，其中所述第一链cDNA分子与所述多个RNA分子互补。
在一些实施方案中，所述方法还包括产生第一链核酸，包括：提供包含5’通用引物位点、捕获序列和任选的其间的条码序列的捕获寡核苷酸；使所述捕获寡核苷酸与来自单细胞或病毒的多个亲本核酸接触；使得所述多个亲本核酸与所述捕获序列退火；以及添加DNA聚合酶，从而使所述捕获寡核苷酸延伸以产生第一链核酸，其中所述第一链核酸各自与亲本核酸互补。
本公开内容的另一方面提供了提高模板转换反应的产率的方法，其包括向模板转换反应添加拥挤试剂。
本公开内容的另一方面提供了增强膜对皮米孔(picowell)阵列的密封的方法，其包括使所述皮米孔阵列和膜与拥挤试剂接触。在一些实施方案中，皮米孔阵列用于Seq-well测定。
本公开内容的另一方面提供了皮米孔阵列，其包含多个皮米孔，每个皮米孔包含含有一个或更多个核酸条码的官能化表面。
在一些实施方案中，每个核酸条码相对于阵列中的所有其他核酸条码或相对于阵列中其他核酸条码的子集是独特的。
在一些实施方案中，在多个皮米孔之间共有一个或更多个核酸条码。
在一些实施方案中，在阵列中每个核酸条码的位置是已知的。
在一些实施方案中，向具有独特核酸条码的每个皮米孔施加独特刺激物(stimulus)。
在一些实施方案中，官能化表面是皮米孔的底部内表面。
在一些实施方案中，皮米孔阵列的底部内表面包含DNA微阵列。
在一些实施方案中，多个皮米孔各自包含光谱编码的珠。在一些实施方案中，多个皮米孔各自包含多个光谱编码的珠。在一些实施方案中，光谱编码的珠附着于皮米孔的官能化表面。
本公开内容的另一方面提供了皮米孔阵列，其包含多个皮米孔，每个皮米孔包含官能化表面，所述官能化表面包含一个或更多个具有独特空间条码的核酸分子，每个独特空间条码对于一个或一组皮米孔是独特的，任选地其中每个空间条码在所述皮米孔阵列中的位置是已知的。
在一些实施方案中，官能化表面存在于皮米孔的内部底表面。在一些实施方案中，皮米孔阵列的内部底表面包含DNA微阵列。
在一些实施方案中，官能化表面包含光谱编码的珠。
本公开内容的另一方面提供了用于在皮米孔阵列中对转录物进行空间定位的方法，其包括：(a)提供皮米孔阵列，其中：(i)一个或更多个皮米孔包含一个或更多个官能化表面，每个官能化表面包含具有独特空间条码的核酸分子；(ii)一个或更多个皮米孔包含独特的空间条码组合；(iii)位于每个皮米孔中的空间条码的身份是已知的；并且(iv)一个或更多个皮米孔装载有条码化转录物捕获珠(b)使所述皮米孔阵列与细胞群接触，每个细胞包含一个或更多个转录物；(c)裂解所述细胞并在驻留在同一孔中的珠上从细胞捕获RNA；(d)从被捕获的转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；(e)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：空间条码杂交分子；(f)对所述cDNA和珠条码：空间条码杂交分子进行测序；(g)确定与每个珠条码相关的所有空间条码；(h)通过将与珠条码相关的空间条码的组合与具有相同的空间条码组合的已知皮米孔相匹配来确定每个珠条码的来源孔；以及(i)通过将所述cDNA中的珠条码与鉴定为该珠条码来源的皮米孔相匹配来在皮米孔阵列上对转录物进行定位。
在一些实施方案中，官能化表面包含皮米孔的底部内表面。在一些实施方案中，皮米孔阵列的底部内表面包含DNA微阵列。
在一些实施方案中，官能化表面包含光谱编码的珠。
在一些实施方案中，将细胞群作为与载玻片结合的薄组织切片递送至所述阵列。
本公开内容的另一方面提供了用于使用皮米孔阵列来确定对一组刺激物的转录响应的方法，其包括：(a)提供皮米孔阵列，其中大多数皮米孔各自包含一个或更多个官能化表面，所述官能化表面包含(1)具有独特空间条码的核酸分子和(2)独特刺激物；(b)使所述皮米孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；(c)从所述官能化表面释放所述刺激物；(d)培养所述细胞以允许对所释放的刺激物进行转录响应；(e)向大多数孔中装载条码化转录物捕获珠；(f)裂解所述细胞并且在与所述细胞驻留在同一孔中的珠上从所述细胞捕获RNA；(g)从被捕获的RNA产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；(h)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：空间条码杂交分子；(i)对所述cDNA和珠条码：空间条码杂交分子进行测序；(j)确定与每个珠条码相关的空间条码的组合；以及(k)通过将空间条码的组合转变成存在于孔中的刺激物的组合来确定作为与给定珠条码相关的cDNA来源的细胞的刺激物暴露。
在一些实施方案中，官能化表面包含皮米孔的底部。
在一些实施方案中，皮米孔阵列的底部包含DNA微阵列。
在一些实施方案中，官能化表面包含光谱编码的珠。
本公开内容的另一方面提供了用于在皮米孔阵列上对转录物进行空间定位的方法，其包括：(a)提供皮米孔阵列，其中：(i)每个皮米孔包含官能化表面，所述官能化表面包含一个或更多个具有独特空间条码的核酸分子；(ii)每个独特空间条码对于一个或一组皮米孔是独特的，并且(iii)在所述皮米孔阵列上每个独特空间条码的位置是已知的；(iv)每个皮米孔装载有条码化转录物捕获珠；(b)使所述皮米孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；(c)从所述转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；(d)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸同时产生珠条码：空间条码杂交分子；以及(e)通过将所述cDNA中的珠条码与珠条码：空间条码杂交分子相匹配来在所述皮米孔阵列上对所述转录物进行定位。
在一些实施方案中，官能化表面包含皮米孔的底部。
在一些实施方案中，皮米孔阵列的底部包含微阵列。
在一些实施方案中，官能化表面包含光谱编码的珠。
在一些实施方案中，每个皮米孔还包含刺激物。
本公开内容的另一方面提供了用于对组织切片中的转录物进行空间定位的方法，其包括：(a)提供皮米孔阵列，其中：(i)每个皮米孔包含官能化表面，所述官能化表面包含一个或更多个具有独特空间条码的核酸分子；(ii)每个独特空间条码对于一个或一组皮米孔是独特的，并且(iii)在所述皮米孔阵列上每个独特空间条码的位置是已知的；(iv)每个皮米孔装载有条码化转录物捕获珠；(b)使所述皮米孔阵列接触与载玻片结合的薄组织切片；(c)从所述转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；(d)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：空间条码杂交分子；以及(e)通过将所述cDNA中的珠条码与珠条码：空间条码杂交分子相匹配来在所述皮米孔阵列上对所述转录物进行定位。
在一些实施方案中，官能化表面包含皮米孔的底部。
在一些实施方案中，皮米孔阵列的底部包含微阵列。
在一些实施方案中，官能化表面包含光谱珠。
在一些实施方案中，每个皮米孔还包含刺激物。
本公开内容的另一方面提供了用于将膜施加至皮米孔阵列的膜施加器，其包含：半多孔膜；以及刚性支持物；其中所述膜通过可逆化学物质附着于所述刚性支持物。
在一些实施方案中，可逆化学物质是亲水性薄膜。
在一些实施方案中，亲水性薄膜是盐桥或亲水性聚合物。
在一些实施方案中，刚性支持物是玻璃或丙烯酸类塑料(acrylic plastic)。
在一些实施方案中，皮米孔阵列是Seq-well阵列。
本公开内容的另一方面提供了用于将半多孔膜密封至包含多个皮米孔的阵列的方法，其包括：(a)使皮米孔阵列与刚性支持物上的半多孔膜接触；以及(b)将加热的表面施加至所述刚性支持物，其中所述半多孔膜夹在所述刚性支持物与所述阵列之间；从而将所述膜密封至所述皮米孔阵列。
在一些实施方案中，将加热的表面施加至膜持续少于10分钟。
在某些实施方案中，加热的表面为35℃至50℃。
本公开内容的另一方面提供了装置，其配置成使一个或更多个皮米孔阵列与刚性支持物上的半多孔膜接触，以及将加热的表面施加至所述刚性支持物，从而将所述半多孔膜密封至所述皮米孔。
在一些实施方案中，所述装置包含刚性支持物和能够被加热至期望温度的表面。
本公开内容的另一方面提供了用于向细胞递送刺激物的方法，其包括：(a)提供皮米孔阵列，其中每个皮米孔包含附着于刺激物的一个或更多个珠和包含与所述刺激物独特相关的独特刺激物条码的核酸；(b)使所述皮米孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；(c)用所述刺激物培养细胞；(d)向每个孔装载条码化转录物捕获珠；(e)从所述珠释放包含独特刺激物条码的核酸；(f)从所述转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；(g)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：刺激物条码杂交分子；以及(h)通过将所述cDNA中的珠条码与珠条码：刺激物条码杂交分子相匹配来鉴定每个cDNA的来源细胞的刺激物。
在一些实施方案中，所述方法还包括从珠释放刺激物。
在一些实施方案中，所述方法还包括对珠条码：刺激物条码杂交分子进行测序。
本公开内容的另一方面提供了用于将膜固定至皮米孔阵列的夹具，其包含：三螺杆设计；其中所述夹具是方形，其包围阵列保持器(holder)和顶件(top piece)，并且仅在下侧接触所述阵列保持器，从而在所述阵列上产生向上的力。
在一些实施方案中，夹具是塑料的。
本公开内容的另一方面提供了用于使用作条码化珠的多孔树脂磁化的方法，其包括：(a)使所述树脂收缩，从而扩大所述树脂的孔；(b)使所述树脂与磁性纳米粒接触；以及(c)使所述树脂膨胀。
在一些实施方案中，通过降低温度使树脂收缩，并且通过提高温度使树脂膨胀。在一些实施方案中，通过改变溶剂的组成来使树脂收缩和膨胀。
本公开内容的另一方面提供了皮米孔阵列，其包含多个皮米孔，其中每个皮米孔(1)被表面官能化以使得能够实现膜附着和单细胞转录物捕获；并且(2)包含沉淀和/或固定至所述皮米孔的一个或更多个内壁的单细胞的内容物。
本公开内容的另一方面提供了储存细胞以用于单细胞分析的方法，其包括(a)提供皮米孔阵列，其中大多数皮米孔装载有条码化转录物捕获珠，(b)使所述阵列的表面与单细胞悬液接触，(c)通过重力使得细胞装载到皮米孔中，(d)将所述阵列浸没在固定剂中，以及(e)将所述阵列储存一天或更多天。
在一些实施方案中，皮米孔阵列被官能化以使得能够实现膜的附着以用于转录物捕获。
在一些实施方案中，在固定之后将所述阵列干燥。
本公开内容的另一方面提供了孔阵列，其包含：第一多孔膜，其具有0.1至100mL/分钟/cm2的通量率(flux rate)和/或50nm至3微米的孔径(pore size)；以及第一无底微米孔(microwell)阵列，其包含具有第一多个通孔的光致抗蚀剂干膜；其中所述第一多孔膜在所述第一无底微米孔阵列的底表面处接触所述第一无底微米孔阵列；并且其中所述阵列的每个孔包含第一多个通孔之一和包含所述第一多孔膜的底表面。
本公开内容的另一方面提供了光致抗蚀剂干膜，其包含第一孔阵列，所述第一孔阵列具有15至100微米的最大横向尺寸并且具有通量率为0.1至100mL/分钟/cm2和/或孔径为50nm至3微米的多孔底部。
本公开内容的另一方面提供了微流控装置，其包含最大横向尺寸为1至500微米的第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列与(a)最大横向尺寸为1至500微米的第二无底微米孔阵列和(b)第一多孔膜结合。
本公开内容的另一方面提供了制造包含多个通孔的独立式(free standing)光致抗蚀剂膜的方法，其包括：将第一光致抗蚀剂干膜与光掩模对准；通过所述光掩模将所述第一光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于紫外(UV)光以在所述第一光致抗蚀剂干膜中形成多个第一通孔，从而产生包含多个通孔的第一独立式光致抗蚀剂膜。
本公开内容的另一方面提供了一种方法，其包括：使包含多个细胞和/或多个珠的第一流体流过本文中所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置中的任一个，从而形成装载细胞和/或装载珠的微米孔阵列。
本公开内容的另一方面提供了一种方法，其包括：提供微流控装置，所述微流控装置包含第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列的平均孔直径为15至100微米并且与平均孔直径为80至1000纳米的第一多孔膜结合；使包含多个珠的第一流体流过所述微流控装置；使与所述第一多孔膜结合的所述第一无底微米孔阵列与第二多孔膜结合，所述第二多孔膜的平均孔直径为80至1000纳米并且与平均孔直径为1至10微米的第二无底微米孔阵列结合；以及使包含多个细胞的第二流体流过所述微流控装置；其中所述第一无底微米孔阵列的80％的孔被单珠占据。
本公开内容的另一方面提供了一种方法，其包括：提供微流控装置，所述微流控装置包含第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列的平均孔直径为1至10微米并且与(a)平均孔直径为15至100微米的第二无底微米孔阵列和(b)平均孔直径为80至1000纳米的多孔膜结合；使包含多个细胞的第一流体流过所述微流控装置；以及使所述微流控装置暴露于包含珠的第二流体。
本公开内容的另一方面提供了用于处理生物样品的试剂盒，其包含基板、一个或更多个膜和杂交板。所述基板可包含具有在其中形成的多个容器(receptacle)的表面，并且每个容器的尺寸和形状设置为接收微米孔阵列。所述一个或更多个膜可配置成附着于基板的表面以形成组合体，使得所述一个或更多个膜覆盖所述多个容器。所述杂交板可配置成附着于所述组合体，其中所述一个或更多个膜定位在杂交板与基板之间。可在杂交板的内表面与所述一个或更多个膜之间形成分开的体积，其中每个体积与分开的所述多个容器之一流体连接。
本公开内容的另一方面提供了微孔装置，其包含：(a)光致抗蚀剂膜，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及(b)与所述光致抗蚀剂膜的底表面接触的多孔底膜，其中所述底膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的。
本公开内容的另一方面提供了无基底两层层压制品(laminate)，其包含：(a)光致抗蚀剂膜，其中所述光致抗蚀剂膜包含(i)顶表面、底表面以及(ii)加强部分和未加强部分，其中在与溶解剂接触之后：所述未加强部分溶解以形成从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，并且每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，并且所述顶表面、所述底表面或这两个表面的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％或75％被所述通孔覆盖，并且所述加强部分显著地对所述溶解剂具有抗性；以及(b)光掩模，其中所述光掩模上的最大特征距离不超过2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6或0.5mm，并且其中所述光掩模接触并覆盖所述光致抗蚀剂膜的整个顶表面的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或整个顶表面。
本公开内容的另一方面提供了制造包含多个通孔的独立式光致抗蚀剂膜的方法，其包括：(a)将光致抗蚀剂膜与光掩模进行层压，其中所述光掩模具有多个特征并且最大特征距离不超过2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6或0.5mm，并且其中所述光掩模覆盖整个光致抗蚀剂膜的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或整个光致抗蚀剂膜，(b)通过所述光掩模将所述光致抗蚀剂膜暴露于光源持续足以产生光致抗蚀剂的加强部分的时间，(c)使所述光致抗蚀剂膜显影，以及(d)将所述光致抗蚀剂膜与所述光掩模分离，从而制造包含所述多个通孔的独立式光致抗蚀剂膜。
本公开内容的另一方面提供了细胞装载方法，其包括：(a)使包含多个细胞的流体样品流过微阵列装置，所述装置包含：(i)无底微米孔阵列，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及(ii)与所述微米孔阵列的底表面接触的多孔底膜，其中所述底膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的，(b)从所述多个通孔中的至少一个通孔的顶部开口至底部开口施加压力梯度，从而将单细胞装载到所述至少一个通孔中，(c)通过施加压力梯度将所述细胞保留在所述至少一个通孔的底部，(d)在保留所述细胞的同时将所述微米孔阵列倒置，以及(e)使倒置的微米孔阵列反转，从而将细胞装载到所述微阵列中的所述通孔中。
本公开内容的另一方面提供了培养或储存分离的细胞的方法，其包括：(a)使包含多个细胞的流体样品流过微阵列装置，所述装置包含：(i)无底微米孔阵列，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及(ii)与所述微米孔阵列的底表面接触的多孔底膜，其中所述底膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的，(b)通过重力或通过施加压力梯度将所述多个细胞中的至少一个细胞装载到所述通孔中，(c)在所述微米孔阵列的顶表面上方施加多孔顶膜，从而将所述细胞保留在所述通孔中，以及(d)将所述微米孔阵列浸没在介质中，使得所述多个通孔的至少一部分通过所述顶部开口、所述底部开口或这两种开口与所述介质流体连接。
本公开内容的另一方面提供了对组织切片进行分析的方法，其包括：(a)使所述组织切片与微阵列装置接触，所述装置包含：(i)无底微米孔阵列，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，其中所述多个通孔的至少一部分包含条码化转录物捕获珠和功能表面，以及(ii)与所述微米孔阵列的底表面接触的多孔底膜，以及(b)从转录物产生cDNA序列，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中，从而对所述组织切片进行分析。
本公开内容的另一方面提供了单细胞分析试剂盒，其包含：(a)一个或更多个微阵列，每个微阵列包含光致抗蚀剂膜，所述微阵列包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及(b)至少一个多孔干膜，其中所述膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的。
本文将更详细地描述本公开内容的这些和其他方面以及实施方案。
附图简述
图1：拥挤试剂提高全转录物组扩增产物产率。在杂交缓冲液和清洗缓冲液二者中包含不同浓度的多种聚(乙二醇)尺寸。使用AATI片段分析仪对来自相等数目的条码化珠的全转录物组扩增(WTA)产物产率进行定量。WTA包括通过首先从RNA合成cDNA并随后扩增cDNA的全转录物组的扩增。AATI片段分析仪提供了关于核酸浓度和尺寸分布的详细信息。
图2A至2C：通过第二链cDNA标记改善的转录物捕获。图2A用于施加5’引物标签的标准模板转换方法。图2B新的第二链cDNA标记方法。图2C使用第二链cDNA标记(紫色；水平线)或模板转换(金色；垂直线)从不同细胞类型获得的独特转录物和基因数目的小提琴图(violin plot)。
图3A至3B：光谱条码化颗粒。用5种不同的荧光标记链霉亲和素分子的组合性组合对乙醛基官能化的琼脂糖珠进行官能化，制得31个独特的光谱条码。使用标准落射荧光显微镜(epifluorescent microscope)在5个光谱通道中对珠进行成像。图3A光谱数据的二维t-SNE降低的散点图。图3B使用5色光谱条码正确调用的珠的百分比。
图4：包含空间条码的寡核苷酸的一个实施方案的示意图。dA17可用较短或较长长度的poly(dA)序列代替。如果设计成捕获mRNA转录物，则捕获寡核苷酸(例如存在于捕获珠上的那些)可包含poly(dT)序列而不是poly(dA)序列。或者，其可包含与待捕获的核酸(也称为靶核酸)中的序列互补的另一捕获序列。
图5A至5D：皮米孔阵列的DNA微阵列介导的空间条码化。图5A描绘了双链微阵列特征的产生的示意图。图5B自上而下条码化的阵列的示意图。图5C自下而上条码化的阵列的示意图。图5D用标记的DNA微阵列密封的皮米孔阵列的图像。
图6A至6C：将化合物向皮米孔阵列中的单独孔的递送。图6A使用喷墨打印递送至皮米孔阵列的材料的图像。图6B使用颗粒递送的化合物递送的示意图。图6C使用脱硫生物素-链霉亲和素和二巯基连接的生物素：链霉亲和素连接对两种化合物(FITC标记的寡核苷酸和AF555标记的抗体)的受控非同步递送。
图7：膜施加器。膜施加器的层的示意图。从上到下：PC膜、PVA或盐、丙烯酸或玻璃。
图8A至8D：塑料夹具的示意图。图8A组合的三个件。图8B没有内部空腔的顶件。图8C带有三个螺孔的方形夹具。图8D阵列保持器的底部。
图9A至9E：在装载到阵列中之后，从活细胞或经80％甲醇固定的细胞获得的单细胞RNAseq文库的度量。图9A来自于活细胞或经甲醇固定细胞的单细胞的基因表达特征的热图。图9B来自于活细胞或经固定细胞的文库的基因/细胞。图9C来自于活细胞或经固定细胞的文库的每个细胞的转录物。图9D来自于活细胞或经固定细胞的文库的每个细胞的％线粒体基因。图9E来自于活细胞或经固定细胞的文库的每个细胞的测序读取。
图10A至10E是本文中所述的分层装置的示意图。图10A是根据某些非限制性实施方案的孔的阵列100的截面示意图。图10B是根据某些非限制性实施方案的孔的阵列1000的截面示意图。图10C是根据某些非限制性实施方案的孔的阵列800的截面示意图。图10D是根据某些非限制性实施方案的分层装置200的截面示意图。图10E是根据某些非限制性实施方案的分层装置300(例如，微流控装置)的截面示意图。
图11A和11B是具有通孔的光致抗蚀剂干膜的图像。图11A是具有50微米直径的通孔的光致抗蚀剂干膜。图11B是具有5微米直径的通孔的光致抗蚀剂干膜。
图12A至12D是本文中所述的分层装置的截面示意图。图12A是根据某些非限制性实施方案的分层装置400(例如，微流控装置)的截面示意图。图12B是根据某些非限制性实施方案的分层装置500(例如，微流控装置)的截面示意图。图12C是根据某些非限制性实施方案的分层装置600(例如，微流控装置)的截面示意图。图12D是根据某些非限制性实施方案的分层装置700(例如，微流控装置)的截面示意图。
图13A和图13B是装载细胞的阵列的图像。图13A是由干膜光致抗蚀剂制成的装载细胞的阵列。图13B是由干膜光致抗蚀剂制成并用mitotracker红染色的装载细胞的阵列。
图14是用于处理多个微米孔阵列的试剂盒的一个实施方案的示意性透视图。
图15是用于支持微米孔阵列的基板的一个实施方案的示意性透视图。
图16是用于支持微米孔阵列的基板的另一个实施方案的示意性透视图。
图17是膜板的一个实施方案的示意性透视图。
图18是杂交板的一个实施方案的示意性透视图。
图19是杂交板的另一个实施方案的示意性透视图。
图20A和20B是本文中所述的杂交室的示意性透视图。图20A是在与微米孔阵列结合之前杂交室的一个实施方案的示意性透视图。图20B是在样品收集期间与微米孔阵列结合的图20A的杂交室的实施方案的示意性透视图。
图21是杂交室的另一个实施方案的示意性透视图。
图22是用于处理样品的工作流程的示意图。
发明详述
本公开内容描述了对与基于孔的或包含其他的体积系统(包括基于皮米孔的系统和基于微滴的系统)有关的硬件和应用的改善。
皮米孔和皮米孔阵列有助于对大量单细胞或其他核酸来源(例如单病毒、单核等)进行大规模平行分析。但是，这些孔的特别小的体积及其相应阵列的高密度妨碍了使用标准流体操作技术来向这样的孔递送和/或从这样的孔取回试剂、核酸来源(例如细胞)和/或细胞内容物(例如mRNA转录物)。将理解的是，在一些实施方案中，本文中所述的阵列(例如包含干膜光致抗蚀剂的阵列)不被称为皮米孔阵列(其是指每个孔中包含的体积)，而是通过孔的直径和深度来表征。
本公开内容部分地提供了与阵列(例如，皮米孔和高密度皮米孔阵列)有关的改善。这些改善包括但不限于从单细胞的核酸捕获的改善、可携带性(portability)和易用性(ease of use)的改善、任何给定测定的可扩展性的提高、转录物或转录物组信息与孔中进行的其他测量或干预的联系，以及由干膜光致抗蚀剂制备的阵列的改善，这提供了制造中可扩展性的提高和超泊松装载，如下面进一步详细描述的。将理解的是，这些改善中的多种也可应用于基于非孔的系统，例如基于微滴的系统。
如本文中所用的，皮米孔是指具有在皮升范围内的体积的孔，所述皮升范围内的体积包括小于1皮升至约10,000皮升的体积，包括约0.01皮升至约1000皮升或约0.1皮升至小于1000皮升或约0.01皮升至约500皮升的体积。该范围可以是约1皮升至约1000皮升、或约3皮升至约1000皮升、或约3皮升至约500皮升、或约3皮升至约125皮升、或约0.05皮升至约1000皮升、或约0.1皮升至约500皮升、或约0.1皮升至约125皮升。这些孔通常具有在微米范围内的尺寸(例如，x和y或直径，以及高度尺寸。例如，孔可具有约45微米(x)乘以约45微米(y)乘以约60微米(h)的尺寸并且具有矩形体积，或者其可具有约50微米(x)乘以约50微米(y)乘以约50(h)微米的尺寸并且具有立方体积。孔的截面面积(通过自上而下的视角)可以是方形或圆形或卵形，但不限于这些中的任何一个。因此，就本公开内容中使用术语“微孔”或“孔”的程度而言，应理解的是，这样的术语是指具有皮升或亚皮升(例如，从1毫皮升至10,000皮升体积)的孔。
皮米孔阵列可包含约103至约107个孔，约3x103至约107个孔，约5x103至约107个孔，约104至约107个孔，约104或约5x104或约8x104至约105或约5x105或约1x106或约5x106或约1x107个孔，并且因此被称为“高密度”阵列。
在一些实施方案中，将孔和孔阵列官能化以进行Seq-well。Seq-well阵列描述于公布的PCT申请No.PCT/US17/13791中，其内容整体并入本文。在Seq-well中，使用＞80,000个皮升孔的阵列来分离单细胞以及条码化转录物捕获珠。使用半多孔膜来密封孔，以努力使大分子(例如mRNA)的逃逸和因此交叉污染最小化，同时允许小分子和裂解缓冲液通过。这使得能够在密封孔中进行细胞裂解，并从而产生RNA-seq文库。这是通过首先在驻留在孔中的条码化珠上捕获由裂解的细胞释放的mRNA分子完成的。捕获之后，在从每个单细胞产生cDNA文库的过程中，将珠的(并且因此孔的)独特条码并入到使用逆转录从被捕获的mRNA转录物(并因此与之互补)合成的第一链cDNA中。因此，珠条码对来自同一单细胞的所有被捕获的转录物进行了相同地标记(或标注(label))。然后可将条码化cDNA文库合并，每个cDNA都标记有其单细胞来源，并且可进行全转录物组扩增(WTA)，并随后进行测序。在一些实施方案中，通过聚集具有相同珠条码的所有转录物，经由电脑(in silico)回收单细胞转录物。
文库可包含来自多个细胞的转录物，包括例如约100、1,000、10,000、20,000.30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000或更多个细胞。因此，在一些情况下，孔阵列足够大以容纳这些相同数目的细胞，以便对这些细胞进行平行分析。
鉴于本公开内容，本领域技术人员将理解的是，可采用多种方法来提高阵列中被单细胞占据的孔的比例并同时降低阵列中被两个或更多个细胞占据的孔的比例。实现这一点的一种方法是稀释细胞悬液(并同时减少施加至阵列的绝对细胞数目)以使得绝大多数孔中没有细胞或有单细胞。在一些情况下，约5％至15％的孔被单细胞占据，并且1％至2％或更少的孔被两个或更多个细胞占据。其余的孔未被任何细胞占据。将理解的是，相同的方法可应用于可使用本公开内容的方法和产品进行分析的其他核酸来源，包括但不限于病毒、核、外排体、血小板等。
下面将更详细地讨论由本公开内容提供的多种改善。
用于提高核酸(例如，转录物)回收的方法
本公开内容的一些方面涉及通过提高从单细胞捕获的独特转录物的数目来改善单细胞RNA-seq文库的质量。更高的细胞转录物产率提供了提高的统计能力以用于鉴定样品中的独特细胞群。本文中提供了改善单孔或微滴中来自例如单细胞或小的细胞群的转录物捕获产率的方法。这些方法涉及改善的第二链cDNA标记方法以提高转录物捕获效率，以及拥挤试剂的使用。这些尤其与基于孔的测定(例如Seq-well测定)以及基于微滴的系统的性能的改善相关。本公开内容考虑到可顺序地或同时使用一种或两种方法。
第二链核酸(例如，cDNA)标记/标记以提高核酸(例如，转录物)捕获效率
本文中提供了用通用引物序列高效地标记(例如，用核酸标记或与其缀合)核酸(例如但不限于第二链cDNA分子)的改善方法。这些方法可用于对来自于单一来源(例如单细胞、单细胞核、单病毒等)的核酸进行相同地5’和3’标记。对核酸进行相同地5’和3’标记意味着在来自单一来源的多个核酸的5’端并入相同的核苷酸序列，并且在来自单一来源的多个核酸的3’端并入相同的核苷酸序列。然而，在5’和3’端的核苷酸序列不必相同，并且在大多数情况下不相同。相同地5’和3’标记的核酸共有相同的5’核苷酸序列和相同的3’核苷酸序列，但是5’和3’核苷酸序列可能不相同(并且通常不相同)。对核酸进行相同地5’和3’标记的益处是可以以相对相似的效率对这样的核酸进行扩增和/或测序。
核酸之间共有的5’和3’核苷酸序列将最少包含5’和3’通用引物序列(或通用引物位点，因为这些术语在本文中可互换使用)。多个核酸中共同的或共有的5’和3’UPS有助于这样的核酸的相对非优先扩增和/或测序，包括将这样的核酸合并在一起时。这样的核酸可来自单一来源，例如单细胞，或者其可来自多个不同来源，例如多个细胞。
核酸之间共有的5’和/或3’核苷酸序列可包含条码。条码是指用于标记和标识来自特定来源的核酸并将这些核酸与来自一个或更多个其他来源的其他核酸区分开的独特序列。在本文中，由于其核酸性质，条码可称为核酸条码。在本文中提供的一些实例中，条码被用于标记、标识来自于单细胞的核酸，以及将其与来自于一个或更多个其他细胞的那些区分开。这样的条码可称为细胞特异性条码。条码也可用于标记和标识并且从而区分来自已进行了类似操作的细胞群的核酸。在一些情况下，可使用两个或更多个条码，其中一个条码标识细胞来源，而另一个条码标识操作。条码可被并入到核酸的5’端和/或3’端中。例如，可在第一链cDNA合成反应期间通过在从其合成cDNA的引物序列中包含条码来并入条码。然后可将条码并入第二链cDNA和进一步的后代中。条码可以是已知序列。条码可以是随机的。
核酸之间共有的5’和/或3’核苷酸序列可包含捕获位点或结构域(或靶结合位点，因为这些术语可互换使用)。捕获结构域包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列(并且因此可称为靶结合序列)或其互补序列。该结构域用于杂交(并因此捕获)靶核酸，其后可产生第一链和第二链核酸。捕获结构域可具有随机、半随机或特异性(或靶向)序列。特异性(或靶向)序列的一个实例是与mRNA转录物的poly(dA)序列杂交的poly(dT)序列。特异性(或靶向)序列的另一些实例是与转录物、特定转录物或某些核酸类别中的已知保守核苷酸序列互补的序列。将理解的是，取决于捕获结构域是存在于第一链还是第二链核酸中，捕获序列将与靶核酸中的相应序列互补或相同。
图2B示出了在mRNA捕获以及第一链和第二链cDNA合成的情况下用于对靶核酸进行5’和3’标记的一个实施方案。最初，通过与结合至珠的捕获寡核苷酸杂交来捕获mRNA。捕获寡核苷酸最少包含UPS和捕获结构域，并且可任选地包含条码序列。例如，捕获寡核苷酸序列可来自珠5’-UPS-条码-捕获结构域-3’。由于靶核酸是mRNA转录物，因此捕获结构域可具有poly(dT)序列以便与mRNA的poly(dA)尾杂交。靶mRNA转录物通过捕获结构域与捕获寡核苷酸结合，并随后通过逆转录过程从捕获寡核苷酸合成第一链cDNA。这样，第一链cDNA包含5’UPS、条码、捕获结构域和mRNA靶标的互补序列。
然后，通过使第一链cDNA与各自具有5’UPS和捕获结构域的一个或更多个其他寡核苷酸杂交来进行第二链cDNA的合成。这些寡核苷酸可称为“第二链引发寡核苷酸”。在图2B中，它们被称为UPS标记的随机聚体(randomer)。捕获结构域可包含随机、半随机或特异性(靶向)序列。该寡核苷酸的一个实例在图2B中显示为具有序列NNNGGNNNB。GG基序防止自杂交以及与poly(dT)/通用引物结合。图中所示的寡核苷酸被称为随机聚体，意指其捕获序列是随机的，并且其被设计为与mRNA转录物随机结合。添加DNA聚合酶之后，寡核苷酸将延伸直至其到达下一个相邻的寡核苷酸或第一链cDNA的末端。最感兴趣的是位于最接近第一链cDNA末端的那些第二链核酸，并且其将并入5’和3’UPS二者，以及任选地5和/或3’条码(其可以是随机序列条码)，和/或任选地5’和/或3’捕获序列。
还应理解，一旦靶核酸(例如，mRNA转录物)被捕获在珠上，则该过程中的其余步骤可在孔(或微滴)中或在孔外部进行。特别地，第二链合成步骤通常在合并来自多个孔或多个微滴的内容物之后的溶液中进行。可以在有限的体积(例如孔或微滴)之外进行此步骤，因为细胞特异性转录物已经通过共价连接的第一链核酸(例如第一链cDNA)与珠共价连接。第二链合成可使用来自多个孔或微滴(包括例如来自皮米孔阵列的所有孔)的珠在单反应体积中进行。
如果使用该方法从多个细胞捕获mRNA转录物，则产生的第二链cDNA的子集将具有相同的5’UPS和相同的3’UPS。因此，这些“相同地”标记的单链核酸可使用相同的引物进行扩增和/或使用相同的引物进行测序。
因此，在一些情况下，该方法用通用引物序列来标记(或标注)第二链cDNA以使得实现全转录物组扩增(WTA)。由于可用RNA的量有限，在测序之前必须对从单细胞或少量细胞产生的cDNA文库进行PCR扩增。PCR扩增需要待扩增序列侧翼的已知引物结合位点。在WTA的情况下，通常将通用引物位点添加至cDNA的两侧。如上所讨论的，通过使靶RNA与在捕获序列(例如poly(dT)序列)的5’包含通用引物序列的寡核苷酸杂交，并随后进行逆转录而容易地将通用引物位点添加至第一链cDNA的5’端，从而产生在其5’端具有通用引物序列的第一链cDNA。
然而，迄今为止，向cDNA的另一端添加通用引物序列具有挑战。本文中，我们提供了高效添加该第二通用引物位点的方法。
现有技术利用模板转换逆转录反应、第一cDNA链的poly(dA)加尾、或与双链cDNA的连接以添加第二通用位点，其中模板转换(图2A)是最常见的操作。模板转换利用一些逆转录酶的dC加尾活性在逆转录反应过程中在第一链cDNA的末端上产生通用的poly(dC)位点，其与在poly(dG)段的5’包含通用引物位点的模板转换寡核苷酸结合。然后，逆转录酶从cDNA上poly(dC)尾开始延伸，将通用引物位点添加至第一链cDNA的3’端。尽管简单，但模板转换是低效的并且需要整个RNA的逆转录，有利于较短的RNA分子。
代替在第一链cDNA的3’端添加第二通用引物位点，我们设计了在第二链合成过程中添加第二引物位点的方法。这至少可如上所述并且如图2B中所示实现。从在其5’端包含通用引物位点的第一链cDNA开始，通过杂交和延伸在靶结合(或捕获)序列的5’包含通用引物序列的寡核苷酸来合成第二链。靶结合序列可以是随机引物序列或者其可以是靶向引物序列。使用DNA聚合酶延伸引物，优选缺少5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性二者的DNA聚合酶，例如Klenow exo-、Bsu大片段或Bst大片段。图2C示出了使用标准模板转换方法和本公开内容的第二链合成方法对于多种细胞类型的每个细胞的转录物产率的比较。如所示，与模板转换反应相比，第二链合成方法将每个细胞的转录物产率提高了5至10倍(图2C)。例如，如图2C中所示，相对于模板转换反应，UMI的数目(例如，单独转录物的数目)和所鉴定的基因的数目二者均显著增多。
在SeqWell的情况下，当由结合珠的寡核苷酸引发第一链合成时，在第二链核酸(例如，DNA或cDNA)上具有两个引物位点的另外的益处是，第二链不与条码化珠表面共价连接，使得在随后的操作(例如但不限于扩增(例如，PCR))之前能够更轻松地将标记的第二链核酸(例如，DNA或cDNA)与珠分离。非共价连接的第二链与珠的分离可通过任何方式包括但不限于简单的碱基介导的DNA变性来实现。这使得能够将单PCR反应用于WTA扩增并保留条码化珠以用于样品储存(banking)。
在现有技术的方法中，由于珠表面上的低效引发以及如果以太高浓度存在珠对PCR反应的“毒性”，必须将WTA反应跨越约40个反应/阵列进行分割以确保第二链核酸(例如，cDNA)的高效扩增。另外，在PCR循环之后，珠通常被丢弃。WTA扩增是文库制备价格的一半，因此第二链标记也应显著降低文库制备的成本。
如上所述，本公开内容的第二链DNA合成方法也可用于生成定向文库。具有对期望的第一链cDNA分子组具有特异性的靶结合序列(捕获序列)的第二链引发寡核苷酸库可用于生成包含目的转录物的测序文库。或者，当与包含通用引物序列和靶结合序列(捕获序列)二者的探针结合使用时，包含对cDNA分子组具有特异性的靶结合序列(捕获序列)但是缺少通用引物序列的寡核苷酸可用于从文库中耗尽靶向cDNA分子。最后，包含相同靶结合序列(捕获序列)并且缺少或包含通用引物序列的两种寡核苷酸的混合物可用于根据两种寡核苷酸的比例对高表达的cDNA分子的浓度进行定量归一化，例如，如果包含通用引物位点的寡核苷酸与缺少该位点的寡核苷酸的比例为1∶3，则将给定cDNA的4个拷贝中仅1个用通用引物序列标记并扩增。
如本文中所用的，“通用引物位点”是出于引物结合的目的引入到核酸分子中的外源引物结合位点。通用引物位点的实例包括p5和nextera。应理解，术语“通用引物位点”和“通用引物序列”可互换使用。
在一些实施方案中，5’通用引物位点的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，例如长度为10至30个或15至25个核苷酸。在一些实施方案中，3’通用引物位点的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，例如长度为10至30个或15至25个核苷酸。5’和3’端的通用引物位点可相同或者其可不同。
在一些实施方案中，靶结合位点(或靶结合序列或捕获位点、序列或结构域，因为这些术语可互换使用)是随机聚体，例如不与特定核酸(例如cDNA分子)中的序列互补(参见，例如图2B中的UPS标记的随机聚体)。在一些实施方案中，靶结合位点的序列是半随机的。在一些实施方案中，靶结合位点的序列与特定核酸(例如，cDNA分子)中的序列互补，使得能够进行期望的核酸(例如，cDNA分子)的靶向标记。在一些实施方案中，靶结合序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸，例如长度为5至15或7至12个核苷酸。在一些实施方案中，使用具有不同靶结合位点的多个寡核苷酸来制备期望的cDNA分子的靶向文库。
在一些实施方案中，使具有5’通用引物位点的第一链核酸(例如，cDNA)与包含位于靶结合序列上游的通用引物位点的寡核苷酸接触包括使具有5’通用引物位点的第一链核酸(例如，cDNA)与包含所述位于靶结合序列上游的通用引物位点的寡核苷酸在靶结合位点处退火(或杂交)(参见，例如，图2B)。在一些实施方案中，在45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃使靶结合位点与具有5’通用引物位点的第一链核酸(例如，cDNA)退火。
在一些实施方案中，具有5’通用引物位点的第一链核酸(例如，cDNA)在通用引物位点5’附着于珠。可使用常规的共价连接方法将捕获寡核苷酸并因此最终将第一链核酸附着于珠。可使用具有足够强度的任何共价或非共价连接方式，包括例如亲和结合对，例如但不限于生物素-链霉亲和素。在一些实施方案中，珠是转录物捕获珠。
如本文中所用的，“捕获珠”包括具有附着于其表面的捕获寡核苷酸的珠，该捕获寡核苷酸进而包含用于与靶核酸(例如靶转录物)退火的捕获结构域、位点或序列。如果靶核酸是转录物，则珠可被称为“转录物捕获珠”。在一些实施方案中，转录物捕获珠具有用于与mRNA转录物的poly(dA)尾退火的poly(dT)捕获序列。如上所讨论的，在一些实施方案中，捕获寡核苷酸还包含条码。条码可用于标记来自单细胞的所有被捕获的核酸，包括单细胞的所有被捕获的转录物。当将转录物捕获珠与单细胞放置在同一孔中并裂解细胞时，这就可完成。条码可用于标记来自单细胞(或单孔)的核酸，或者其可用于标记来自多个细胞(或多个孔)的核酸。在该后一个实施方案中，条码可用于表示对细胞(或孔)进行的特定操作。
捕获珠的尺寸通常取决于所使用的孔或微滴的尺寸。在一些实施方案中，选择珠的尺寸使得在单一时间仅一个珠可占据孔或微滴。或者，可选择孔或微滴的尺寸使得在单一时间仅一个珠可占据孔或微滴。在一些实施方案中，捕获珠的直径为1μm、5μm、10μm、15μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、150μm或200μm。在一些实施方案中，转录物捕获珠的直径为10μm至50μm。在一些实施方案中，珠的直径为约35微米。
如本文中所用的，“条码”是指用作标识符的核苷酸序列。在一些情况下，其可用于标识条件(例如，孔以及因此细胞所经受的条件)、阵列上的物理位置、或单核酸来源，例如单细胞。在一些实施方案中，条码将核酸或核酸组(例如，转录物或转录物组)标识为来自同一细胞。在一些实施方案中，条码将核酸或核酸组(例如，转录物或转录物组)标识为与特定空间位置或与特定处理或操作(任选地在该位置)相关。例如，在一些实施方案中，条码将核酸或核酸组(例如，转录物或转录物组)标识为与暴露于特定刺激物相关。在一些实施方案中，条码的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，例如10至30个核苷酸。
在一些实施方案中，捕获序列包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。
在一些实施方案中，捕获寡核苷酸包含约10、20、30、40或50个核苷酸。
在一些实施方案中，在45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃使RNA或单链DNA与其捕获序列退火。用于使捕获寡核苷酸与靶核酸和/或使第二链引发寡核苷酸与第一链核酸退火(杂交)的条件可取决于特定的核苷酸序列，但是仍然可由普通技术人员确定。本公开内容的方法提供了靶核酸以及第一链核酸与其相应的互补寡核苷酸相对相等的杂交，无论这样的寡核苷酸是附着于珠的捕获寡核苷酸还是第二链引发寡核苷酸。
应理解，前述方法可用于捕获来自单细胞的RNA转录物，并且因此适用于例如但不限于Seq-well、Drop-Seq、InDrop和10X Genomics的技术。但是，这些方法具有更广泛的适用性并且可用于捕获来自核酸来源的其他核酸，条件是这样的核酸可与捕获寡核苷酸杂交，并且其可用于产生从其形成第二链核酸的第一链核酸。
核酸来源是包含目的核酸的来源。这些包括细胞、病毒、核、外排体、体液及其沉淀物等。几乎任何的核酸来源都可用于本文中提供的方法中。
在本发明的上下文中，“寡核苷酸”是指与可交换有机碱基连接的多个连接的核苷酸(即，包含糖(例如，核糖或脱氧核糖)的分子)，所述有机碱基是嘧啶(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或嘌呤(例如，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。寡核苷酸包括DNA(例如D型DNA和L型DNA)和RNA，及其各种修饰。修饰包括碱基修饰、糖修饰和骨架修饰。下面提供了这些的非限制性实例。
可用于本发明的DNA变体的非限制性实例是L-DNA(DNA的骨架对映体，在文献中已知)、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、bisPNA夹、伪互补PNA、锁核酸(locked nucleicacid，LNA)，或上述的共核酸，例如DNA-LNA共核酸。应理解，本发明的产品和方法中使用的寡核苷酸在性质上可以是均质的或异质的。例如，其在性质上可以是完全DNA，或者其可由DNA和非DNA(例如，LNA)单体或序列构成。因此，可使用核酸元件的任何组合。寡核苷酸修饰可使寡核苷酸在某些条件下更稳定和/或更不易降解。例如，在某些情况下，寡核苷酸是核酸酶抗性的。
寡核苷酸可具有均质骨架(例如，完全磷酸二酯或完全硫代磷酸酯)或异质(或嵌合)骨架。在某些条件下，硫代磷酸酯骨架修饰使寡核苷酸不那么易受核酸酶的影响，并且因此更稳定(与天然磷酸二酯骨架核酸相比)。可以为寡核苷酸提供更高稳定性的其他连接包括但不限于二硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接、甲基硫代磷酸酯连接、硼烷膦酸酯连接、肽连接、烷基连接、脱磷酸型连接等。因此，在一些情况下，寡核苷酸具有非天然存在的骨架。
寡核苷酸可在体外合成。用于合成核酸(包括自动核酸合成)的方法在本领域中也是已知的。具有经修饰骨架(例如包含硫代磷酸酯连接的骨架)并且包括包含嵌合修饰的骨架的那些的寡核苷酸可使用采用氨基磷酸酯或H膦酸酯化学的自动化技术来合成。(F.E.Eckstein，″Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach″IRL Press，Oxford，UK，1991，以及M.D.Matteucci and M.H..Caruthers，Tetrahedron Lett.21，719(1980))。可例如如美国专利No.4,469,863中所述来制备芳基和烷基磷酸酯连接；并且可使用市售试剂通过自动固相合成来制备烷基磷酸三酯连接(其中带电荷的氧部分被烷基化)，例如如美国专利No.5,023,243和欧洲专利No.092,574中所述。已经描述了用于进行其他DNA骨架修饰和替换的方法。Uhlmann E等(1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165；Crooke ST等(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36：107-129；以及Hunziker J等(1995)Mod Synth Methods 7：331-417。
作为补充或替代，寡核苷酸可包含其糖中的修饰。例如，β-核糖单元或β-D-2′-脱氧核糖单元可被经修饰糖单元代替，其中所述经修饰糖单元例如选自β D-核糖、α-D-2′-脱氧核糖、L-2′-脱氧核糖、2′-F-2′-脱氧核糖、阿拉伯糖、2′-F-阿拉伯糖、2′-O-(C1-C6)烷基-核糖，优选地，2′-O-(C1-C6)烷基-核糖是2′-O-甲基核糖、2′-O-(C2 C6)烯基-核糖、2′-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2′-NH2-2′-脱氧核糖、β D木-呋喃糖、α阿拉伯呋喃糖、2，4双脱氧-β-D-赤-己-吡喃糖、和碳环(例如，在Froehler J(1992)Am Chem Soc114：8320中描述的)和/或开链糖类似物(例如，在Vandendriessche等(1993)Tetrahedron49：7223中描述的)和/或双环糖类似物(例如，在Tarkov M等(1993)Helv Chim Acta 76：481中描述的)。
寡核苷酸可包含其碱基中的修饰。经修饰碱基包括经修饰胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶、以及未经取代或经取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(例如，N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环体系的胞嘧啶类似物(例如，N，N′-丙烯胞嘧啶或吩
Figure BDA0002621120660000261
嗪)，以及尿嘧啶及其衍生物(例如，5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)，经修饰鸟嘌呤，例如7脱氮鸟嘌呤、7脱氮7取代的鸟嘌呤(例如7脱氮7(C2 C6)炔基鸟嘌呤)、7脱氮8取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)，5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮，2，6二氨基嘌呤，2氨基嘌呤，嘌呤，吲哚，腺嘌呤，经取代腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)，8取代的鸟嘌呤(例如8羟基鸟嘌呤和8溴鸟嘌呤)和6硫代鸟嘌呤。核酸可包含通用碱基(例如3-硝基吡咯、P-碱基、4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚、和K-碱基)和/或芳族环体系(例如氟苯、二氟苯、苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸酰胺)。可并入到本发明的寡核苷酸中的特定碱基对是Yang等NAR，2006，34(21)：6095-6101报道的dZ和dP非标准核碱基对。嘧啶类似物dZ是6-氨基-5-硝基-3-(1′-β-D-2′-脱氧呋核亚硝脲)-2(1H)-吡啶酮，并且其沃森-克里克(Watson-Crick)互补物嘌呤类似物dP是2-氨基-8-(1′-β-D-1′-脱氧呋核亚硝脲)-咪唑并[1，2-a]-1，3，5-三嗪-4(8H)-酮。
如本文中所述，“探针”和“引物”包含寡核苷酸。其可整体或部分是核酸。其可包含天然存在的核苷酸和/或非天然存在的核苷酸。其可以是或可包含DNA、RNA、DNA类似物、RNA类似物、PNA、LNA及其组合，前提是其能够以序列特异性方式与寡核苷酸杂交和/或在一些情况下与标记物缀合。
在一些实施方案中，探针或引物包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶。在一些实施方案中，探针或引物包含尿嘧啶代替胸腺嘧啶。
探针或引物可与靶标形成至少沃森-克里克键。在另一些情况下，探针或引物(例如探针)可与靶标形成胡斯坦键(Hoogsteen bond)，从而形成三链体。通过胡斯坦结合而结合的探针或引物进入核酸的大沟并与位于那里的碱基杂交。在一些实施方案中，探针或引物可与靶标形成沃森-克里克键和胡斯坦键二者。例如，BisPNA探针能够与核酸进行沃森-克里克结合和胡斯坦结合二者。
探针或引物可以是任何长度，包括但不限于8至100个核苷酸、8至75个核苷酸、8至50个核苷酸、8至30个核苷酸、18至30个核苷酸，以及它们之间的每个整数，就如同本文中明确记载的那样。
探针或引物优选是单链的，但其不限于此。例如，当探针或引物是bisPNA时，其可采用与靶标产生三螺旋构象的二级结构，其中bisPNA的一个区与标识符序列的骨架形成胡斯坦键，而bisPNA的另一个区与靶标的碱基形成沃森-克里克键。
可根据杂交条件来操纵探针或引物通过杂交与靶标的结合。例如，可调节盐浓度和温度。本领域普通技术人员将能够确定用于期望特异性的最佳条件。在一些实施方案中，杂交条件是严格的，使得仅完全互补的探针或引物与靶标结合。在另一些实施方案中，使用不那么严格的条件。
当在核酸杂交的情况下使用时，序列依赖性结合意指识别核酸中核苷酸的特定线性排列并与其结合。在探针和引物的情况下，线性排列包括连续的核苷酸，其每一个与探针和引物中的相应互补核苷酸结合。
本文中所述的探针和引物通常在严格条件下与其靶核酸杂交。如本文中所用的，术语“严格条件”是指本领域熟悉的参数。核酸杂交参数可见于汇编此类方法的参考文献，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook，等，编辑，第四版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2012，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，等，编辑，John Wiley&Sons，Inc.，NewYork。更具体地，本文中所用的严格条件是指例如在杂交缓冲液(3.5x SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中于65℃杂交。SSC为0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠，pH 7；SDS是十二烷基硫酸钠；并且EDTA是乙二胺四乙酸。杂交之后，清洗其上转移有DNA的膜，例如在室温下在2x SSC中并随后在高至68℃的温度下在0.1至0.5x SSC/0.1x SDS中。
可使用导致类似严格程度的其他条件、试剂等。技术人员将熟悉这样的条件，并因此这里不再给出它们。然而，应理解，技术人员将能够以允许探针和/或引物与本发明的核酸特异性和选择性杂交的方式操纵条件(例如，通过使用较低严格性条件)。
提高核酸(例如，转录物)捕获效率的拥挤试剂
用于提高核酸捕获效率(即，增多每个单核酸来源(例如每个细胞)的核酸捕获数目)的另一种方法涉及使用拥挤试剂。
拥挤试剂是具有本文中所述功能中的一种或更多种的任何化合物(例如，生物或合成聚合物)。如下所述，其可以以多种方式用于提高核酸捕获效率。拥挤试剂可以是不干扰膜与阵列之间的电荷相互作用的两性离子或中性电荷的试剂。拥挤试剂的非限制性实例是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG具有等于或大于1000Da的分子量。拥挤试剂的其他实例包括但不限于右旋糖酐、ficoll、牛血清白蛋白(BSA)和蔗糖。
因此，本文中提供了通过在本文中所述的方法中的多个步骤中包含拥挤试剂来提高每个细胞的核酸(例如，转录物)捕获率的方法。拥挤试剂可例如在以下使用：在核酸(例如，mRNA)与捕获珠结合的过程中，在从阵列去除之前或之后清洗结合核酸的珠的过程中，在开放孔中或本体中使结合的核酸(例如，RNA)逆转录以产生第一链核酸(例如，cDNA)的过程中，以及在珠上第二链核酸(例如，cDNA)的合成过程中。
拥挤试剂改善转录物产率的机制根据使用试剂的时间而不同。
在一些步骤中，拥挤试剂与溶液中的大部分溶剂分子缔合或影响溶液中的大部分溶剂分子，从而有效地提高溶液中溶质的浓度。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但是拥挤试剂可使溶质周围的溶剂无序，从而提高熵并且这导致了分子拥挤，如该术语在本领域中被理解的那样。
在膜密封的孔中进行RNA杂交期间，由于尺寸排阻，拥挤试剂无法穿透半多孔膜，因此由于孔(例如，皮米孔)中密封的溶液的较低渗透压而在膜上建立向内力。这种向内力导致膜对孔的更好密封，从而降低了孔内容物的损失并减少了交叉污染。在珠清洗和逆转录过程中，拥挤试剂降低了结合珠的RNA的解离速率常数，从而增多了逆转录成cDNA的分子数目。最后，在第二链cDNA合成反应中包含拥挤试剂提高了第二链引发寡核苷酸(例如，图2B的随机聚体)的杂交速率，导致第二链cDNA的量大幅增多。
图1中示出了相对于在不存在拥挤试剂的情况下捕获的转录物数目，使用多种PEG类型的转录物捕获产率。添加拥挤试剂(例如PEG)可导致全转录物组扩增产物增多约50％，并且每个细胞的转录物捕获率更高。
无论拥挤试剂的性质如何，相对于在不存在这样的拥挤试剂的情况下的捕获，所述方法可用于将核酸(例如，转录物)产率提高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少有50％。在一些实施方案中，相对于在不存在这样的拥挤试剂的情况下的捕获，拥挤试剂的使用可将捕获产率提高至少25％或至少50％。
拥挤试剂可以以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的浓度用于反应混合物中。在一些实施方案中，拥挤试剂以1％至15％或5％至10％的浓度用于反应混合物中。
在一些实施方案中，可将拥挤试剂与其他组分分开或与其他组分一起添加至反应，所述其他组分例如但不限于反应缓冲液、清洗缓冲液或溶液。例如，可将拥挤试剂与杂交缓冲液(例如在细胞裂解之后施加至Seq-well阵列表面的缓冲液)一起添加(或添加到杂交缓冲液中)，和/或与在从Seq-well阵列去除珠期间使用的清洗缓冲液一起添加(或添加到所述清洗缓冲液中)。
用于对孔阵列进行空间条码化的方法
将细胞功能与单细胞RNA-seq联系起来的能力使得实现许多应用，包括对干扰(包括药物、其他细胞或代谢物)的单细胞响应。Seq-well阵列的大规模平行性质提供了足够的重复以能够使用临床样品对多种化合物进行多剂量筛选或对化合物进行组合筛选，或者鉴定罕见的功能表型，其在精准医疗的领域中可以是极其强大的。但是，由于条码化珠随机装载到孔阵列中，以前的单细胞功能活性无法与通过Seq-well获得的单细胞转录物信息联系起来，这使得无法将在测序数据中检测到的给定条码序列追溯回阵列上的特定孔或刺激物条件。本公开内容的方法通过将已知的独特DNA空间条码或独特的条码组合递送至每个孔而克服了该限制。空间条码被用于定位每个转录物的孔来源，使得能够将转录物数据与在阵列上进行的其他测定或处理的结果联系起来。空间条码化孔阵列还可用于从附着于载玻片的薄组织切片获取转录物，从而保留原始组织结构内每个转录物的2D位置。空间条码递送方法被进一步用于共递送具有匹配的独特刺激物的独特空间条码，以使得能够实现阵列上的多种药物组合筛选。
有多种对阵列进行空间条码化的方法。例如，可以使用喷墨打印机或阵列化装置将已知条码序列直接递送至Seq-well阵列上的已知位置。作为另一个实例，可使用具有已知序列和位置的核酸的核酸微阵列(例如DNA微阵列)将已知序列递送到单独的皮米孔中。在另一些实施方案中，空间条码化可涉及使用光谱相关的珠，例如荧光条码化珠。
在一个方面，本文中提供了孔阵列。在一些实施方案中，每个孔包含官能化表面，其包含一个或更多个具有独特空间条码的核酸分子。在一些实施方案中，每个独特空间条码对于一个或一组孔是独特的。在一些实施方案中，每个孔包含独特的空间条码组合。在一些实施方案中，每个独特空间条码与独特的刺激物共递送。在一些实施方案中，每个空间条码在孔阵列上的位置是已知的。
在另一方面，本文中提供了用于在所述孔阵列上对转录物进行空间定位的方法，其包括使孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；从标准条码化捕获珠上的转录物产生cDNA，使得将独特珠条码的序列并入到cDNA中；同时从孔表面释放独特空间条码使得空间条码能够与条码化捕获珠结合；通过在逆转录反应期间通过杂交的空间条码序列使珠捕获探针延伸来产生空间条码与珠条码的融合；以及通过使cDNA分子中存在的珠条码与测序数据中的珠条码-空间条码融合序列相匹配，在孔阵列上对转录物进行定位。
应理解，术语cDNA或第一链cDNA意指包含与mRNA互补的核苷酸序列以及不与mRNA互补的核苷酸序列的核酸分子。这些后一种序列的实例包括5’UPS、条码核苷酸序列等。因此，尽管为了简洁起见一些核酸在本文中被称为cDNA或第一链cDNA，但是应当注意的是，这样的核酸包含cDNA序列以及cDNA序列的5’和/或3’侧翼序列。
在另一方面，本文中提供了用于确定包含结合有独特空间条码和匹配的刺激物的官能化表面的孔阵列上的细胞中对一组刺激物或刺激物组合的转录响应的方法，其包括使孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；从官能化表面释放刺激物；在孔中培养细胞足够长的时间以使得能够对每个孔中存在的刺激物进行转录响应；从标准条码化捕获珠上的转录物产生cDNA，使得将独特珠条码的序列并入到cDNA中；同时从孔表面释放独特空间条码，使得空间条码能够与条码化捕获珠结合；通过在逆转录反应期间通过杂交的空间条码序列使珠捕获探针延伸来产生空间条码与珠条码的融合；以及通过使cDNA分子中存在的珠条码与限定了孔中存在的刺激物或刺激物的组合的测序数据中的珠条码-空间条码融合序列相匹配将转录响应与特定刺激物联系起来。
在一些实施方案中，官能化表面是孔的壁。在一些实施方案中，官能化表面是孔的底壁。在一些实施方案中，孔阵列的每个孔包含1、2、3、4或5个官能化表面。在一些实施方案中，官能化表面是插入孔中的物体。在一些实施方案中，官能化表面是珠。在一些实施方案中，官能化表面是光谱珠。
在一些实施方案中，孔阵列构建在独特空间条码的微阵列上。在一些实施方案中，孔阵列构建在印有独特空间条码的表面上。在一些实施方案中，独特空间条码被转移到孔阵列的孔中。
在一些实施方案中，每个独特空间条码对于一个或一组孔是独特的。在一些实施方案中，每个独特空间条码对于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个孔是独特的。
在一些实施方案中，官能化表面用链霉亲和素官能化并且空间独特条码是生物素标记的。在一些实施方案中，官能化表面用丙烯酸基团官能化。在一些实施方案中，官能化表面用乙醛基、巯基、胺类、羧基、琥珀酰亚胺酯、环氧化物和/或硫氰酸酯官能化。几乎任何共价或非共价结合化学物质都可用于使条码附着于表面例如孔表面或珠，只要连接是可逆的或可裂解的即可。
在一些实施方案中，所述方法还包括从官能化表面释放具有独特空间条码的核酸分子。在一些实施方案中，通过还原剂(例如细胞裂解缓冲液)从官能化表面释放具有独特空间条码的核酸分子。例如，在一些实施方案中，通过二硫键接头用生物素标记具有独特空间条码的核酸分子，并且官能化表面是链霉亲和素官能化的，产生可由还原剂(例如在细胞裂解缓冲液中)裂解的二硫桥，以从官能化表面释放具有独特空间条码的核酸分子。在一些实施方案中，通过光敏连接的裂解从官能化表面释放具有独特空间条码的核酸分子。在一些实施方案中，通过可酶促裂解连接的裂解从官能化表面释放具有独特空间条码的核酸分子。在一些实施方案中，空间条码与与表面共价连接的互补寡核苷酸杂交，并通过温度、离液剂或碱诱导DNA变性而被释放。
如本文中所用的，“光谱编码的珠”是具有光学特征(signature)的珠。在一些实施方案中，光谱珠用一种或更多种染料标记。在一些实施方案中，光谱珠用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、28、19或20个荧光团标记。在一些实施方案中，光谱珠用一种或更多种染料和一种或更多种荧光团标记。在一些实施方案中，光谱珠用质量标签标记。
在一些实施方案中，光谱编码的珠的直径为约3至约10微米。
在一些实施方案中，光谱编码的珠可以是聚苯乙烯或琼脂糖珠。
在一些实施方案中，光谱编码的珠用链霉亲和素表面官能化，并且因此可与具有独特空间条码的生物素化的核酸分子结合。链霉亲和素可与珠表面复合和/或寡核苷酸可通过二巯基接头与生物素复合。
在一些实施方案中，每个孔有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个光谱编码的珠。
在一些实施方案中，通过落射荧光显微术使孔阵列中光谱编码珠的位置得以显现。
在一些实施方案中，独特空间条码的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2324、25、26、27、28、29或30个核苷酸，例如10至30个核苷酸。
在一些实施方案中，包含独特空间条码的核酸还包含通用引物位点。在一些实施方案中，通用引物位点的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，例如长度为10至30个或15至25个核苷酸。在一些实施方案中，包含独特空间条码的核酸还包含与附着于转录物捕获珠的核酸上的捕获序列互补的序列。在一些实施方案中，所述与附着于转录物捕获珠的核酸上的捕获序列互补的序列的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，所述与附着于转录物捕获珠的核酸上的捕获序列互补的序列是poly(dA)段。
在一些实施方案中，所述方法包括使孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触。在一些实施方案中，在25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃使细胞与孔阵列接触。
在一些实施方案中，细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是灵长类细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，细胞是非哺乳动物细胞并且可以是原核细胞或其他真核细胞。细胞(或核酸来源)可以是天然存在的，或者其可以是非天然存在的。非天然存在的核酸的实例是合成产生的细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括用半透膜密封孔阵列的孔。
在一些实施方案中，所述方法包括裂解细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括从一个或更多个转录物产生cDNA，使得将珠条码的序列并入到cDNA中。用于使用逆转录酶从mRNA转录物产生cDNA的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，转录物结合条码化珠上的捕获序列；同时，空间条码从孔表面释放并且也结合捕获珠上的捕获序列；去除珠并且通过在逆转录反应中延伸捕获寡核苷酸来复制结合的空间条码和转录物二者，形成具有与转录物序列或空间条码序列融合的珠条码的第一链cDNA。在一些实施方案中，使用在这里所述的方法合成cDNA的第二链。
因此，在一些实施方案中，每个孔产生两个不同但相关的第二链核酸，一个具有靶核酸序列并且另一个具有空间条码序列，但是两个都具有可用于最终缔合两个第二链核酸的珠条码序列。
在一些实施方案中，通过使cDNA中的珠条码与珠条码-空间条码融合相匹配来在孔阵列上对转录物进行定位。在一些实施方案中，与官能化表面相关的独特空间条码的位置是已知的。在一些实施方案中，官能化表面是光谱珠并且通过使孔阵列上的光谱珠显现而知道独特空间条码的位置。
在一些实施方案中，光谱珠还包含刺激物。在一些实施方案中，刺激物是药物。在一些实施方案中，刺激物通过脱硫生物素-链霉亲和素键附接于光谱珠。在一些实施方案中，药物包含在附接于光谱珠的光敏胶束中。在一些实施方案中，刺激物通过光敏共价键附接于光谱珠。
本文中所述方法的一种示例性实施包括使用光谱编码的珠在孔阵列上对转录物进行空间定位(图3A和B)。可通过不同量的有限数目的染料的组合性组合(如由例如Luminex或BD等公司商业提供的)或者多至16种不同的荧光团的组合性组合或二者对珠进行光谱标记，从而产生大量潜在的空间条码。每个独特的光谱编码的条码化珠通过可裂解键与独特空间条码结合。一种优选的方法是使用链霉亲和素官能化的珠和具有通过二硫桥连接的生物素分子的寡核苷酸，因为二硫键可被标准细胞裂解缓冲液中的还原剂裂解。可使用其他化学物质，包括光敏或可酶促裂解的连接。条码化寡核苷酸由三部分组成：通用引物位点、条码序列和介导与转录物捕获珠上的poly(dT)序列结合的poly(dA)段(图4)。将条码化珠以每孔产生多个珠的密度装载到阵列中。条码化珠装载可在进行其他细胞测定之前或之后进行，这取决于对珠装载期间转录物组是否变化或珠的存在是否干扰其他测定的关注。在完成所有细胞功能测定并装载条码化珠之后，对阵列进行成像以确定每个孔中存在哪种空间条码化珠组合。最后，将标准DNA条码化转录物捕获珠装载到阵列中，并按所述进行Seq-well。在一些实施方案中，尽管转录物捕获珠的化学变化可允许这些珠始终存在，但是如果其是自发荧光的并且如果存在会阻止空间条码化珠的图像采集，则最后装载条码化转录物捕获珠。当孔仍被多孔膜密封时，必须使用光、酶或优选地存在于细胞裂解缓冲液中的还原剂将独特空间珠条码从空间条码化珠中释放出来。释放之后，一部分空间条码结合转录物捕获珠。结合的寡聚物在标准逆转录反应期间延伸，产生包含在转录物捕获珠上的独特空间珠条码与转录物捕获条码之间的融合。可使用独特的空间珠条码寡核苷酸和转录物捕获珠上的引物位点扩增这些融合事件，并使用标准化学方法对其进行测序(实施例2和3)。与任何转录物捕获条码相关的独特空间条码寡核苷酸的组合可与每个孔中存在的光谱珠的组合进行匹配，以将测序数据链接回特定孔。通过光谱珠进行空间条码化的局限性在于，其需要大量(100个)不同的光谱珠，这对使用落射荧光显微术进行制备和精确区分可能具有挑战性，并且每个孔需要相对大数目的珠(例如4至5个)才能得到独特的珠/孔组合，这进一步使精确的图像处理复杂化，并且需要在测序空间中捕获来自存在于孔中的所有珠的空间光谱珠条码。这些限制使其对于较低密度(1000个孔)的孔阵列最为有用，但是其为可容易地应用于任何Seq-well阵列的廉价选择。
本文中所述方法的第二示例性实施包括使用DNA微阵列将已知寡核苷酸递送至每个孔来在孔阵列上对转录物进行空间定位(图5A至D)。在一些实施方案中，该方法需要制备上述独特空间条码寡核苷酸的反向互补序列的DNA微阵列(图4)，其中每个DNA微阵列特征具有独特空间条码序列。在一些实施方案中，优选地通过商业原位DNA合成来实现，特别是对于包含多至一百万个独特条码序列的密集微阵列。设计DNA微阵列特征的尺寸和间距使得在以任何配准(registration)对孔阵列进行密封时，每个孔都将可进入微阵列特征的至少一部分区域，并且没有微阵列特征可跨越两个孔。与通用引物位点互补的荧光标记寡核苷酸与微阵列杂交，并随后使用标准DNA聚合酶进行酶促延伸，产生包含独特空间条码的双链微阵列特征。在一些实施方案中，如果空间条码序列通过可裂解键(例如可被光、还原剂或酶裂解的键)附接至阵列表面，则直接在阵列上对其进行合成。然后，可使用具有空间条码的微阵列通过自上而下(图5A，实施例2)或优选自下而上(图5C，实施例3)的方法将条码递送至孔阵列。
在自上而下的递送方案(实施例2)中，用于在微阵列上引发第二链的寡核苷酸还具有生物素接头，其包含可被光、还原剂或酶裂解的键。在进行细胞测定之前，可用链霉亲和素分子，优选通过碳二亚胺化学或本领域已知的其他共价化学将标准Seq-well微阵列的内孔表面官能化。然后可使用双链微阵列密封孔阵列(图5A)。荧光显微术可用于确定DNA微阵列特征与孔格的对准(图5B)。然后可加热密封的阵列以使双链微阵列特征变性。通过生物素-链霉亲和素键将一部分释放的寡聚物捕获在孔表面上。该孔阵列现在被认为是空间条码化的并且可用于细胞功能测定。测定完成之后，装载条码化转录物捕获珠并可正常进行Seq-well。在裂解过程中，还原剂裂解寡核苷酸-生物素键，释放空间条码以在转录物捕获珠上捕获。如上所述，独特空间条码再次在逆转录期间与转录物捕获条码融合，被扩增和测序。一般来说，微阵列递送空间条码是优选的，因为每孔仅需要单一条码就可成功地将其捕获在转录物捕获珠上和测序空间中，使其在技术上不那么具有挑战性。而且，限定空间条码与孔阵列的配准是更加直接得多的图像处理步骤。自上而下的递送方式的益处包括能够使用标准的Seq-well皮米孔阵列。
在自下而上的递送方案(图SC，实施例3)中，在DNA微阵列的顶部合成孔阵列，使每个孔的底部是DNA微阵列表面。这是通过用可用于将DNA微阵列表面与用于合成孔阵列的材料连接的官能团对DNA微阵列进行官能化来实现的，一种优选的实施是丙烯酸基团并与丙烯酸树脂的3D立体光刻交联组合，以在DNA微阵列的顶部共价连接并构建阵列。DNA微阵列官能化优选地通过在最终的核苷酸环脱保护之前用含亚磷酰胺的丙烯酸(例如丙烯酸酯)对原位合成的DNA微阵列进行处理来完成。完成标准寡核苷酸的脱保护和第二链合成，然后在DNA孔阵列上进行孔阵列合成。或者，也可通过丙烯酸硅烷的气相沉积将丙烯酸官能团添加至DNA微阵列，或者可最初在用丙烯酸基团预官能化的载玻片上合成DNA微阵列。完成时，再次使用荧光显微术来确定DNA微阵列与孔格之间的配准。然后使用所述化学方法对合成的孔阵列进行官能化，以使其与标准Seq-well方案相容。然后如自上而下的方法中所述将阵列用于细胞测定和转录物捕获。通过使细胞裂解缓冲液变性可释放独特空间条码。自下而上的方法比自上而下的方法更优选，因为其更具可扩展性，因为条码已整合到孔阵列合成中。孔之间独特空间条码泄漏的机会也较低，因为条码只有在孔被半多孔膜完全密封后才会被释放。在重新生成双链条码之后，这些条码化阵列也可重复使用。
本文中所述方法的第三示例性实施包括通过使用共装载有空间条码和匹配的独特刺激物的官能化表面来将对一组单独刺激物或刺激物组合的转录响应联系起来(图6)。可通过用交联化学物质(例如链霉亲和素)对孔阵列的内壁进行官能化并随后使用改进的喷墨打印机将不同分子与匹配的空间条码一起打印到阵列的不同段上来产生共官能化表面(图6A)，二者均被官能化以与与孔表面结合的官能团连接。或者，将珠与匹配的独特刺激物和空间条码共装载并随机装载到阵列上(图6B)。在任一方法中，药物都通过在对细胞无害的条件下能够诱导药物释放的机制与官能化表面稳定缔合。一种方法是通过脱硫生物素-链霉亲和素键将药物与表面连接，其通过存在于标准细胞培养基中的生物素释放(图6C)。药物释放之后，培养细胞以允许对每种药物的转录响应。在适当的孵育之后，如上所述与共递送的空间条码一样将转录物捕获在条码化珠上。通过识别与对该特定刺激物具有特异性的空间条码融合的珠条码来确定对给定刺激物的单细胞转录反应。
用于进行基于孔的测定和分析的改善的硬件例如但不限于Seq-well
膜施加器
在另一方面，本文中提供了用于将半多孔膜施加至孔阵列的膜施加器。Seq-well需要将半多孔膜附着于阵列表面以实现最佳的转录物捕获。在最初的方案中，通过机械挑战性方法将等离子体活化的聚碳酸酯膜附着于皮米孔阵列，该方法是用一个载玻片将膜抵靠阵列保持在适当的位置，并随后将第二个载玻片抵靠在膜的背面移动以从膜与阵列之间去除任何液体。此步骤对技术的可扩展性、可携带性和易用性提出了数个挑战。等离子体活化对于膜附着是必不可少的，但是需要特殊的设备(即，等离子体烘箱)，为了使该技术得到广泛采用，需要对膜进行集中活化。然而，经等离子体处理的膜在干燥和水合状态二者下都非常脆弱，这使得运输和在没有大量训练的情况下可重现地进行膜附着极具挑战性。最后，每个膜单独处理，限制了测定的可扩展性。
本文提出了出人意料地克服了这些挑战的膜施加器。施加器的广义形式由通过可逆化学物质(例如，亲水性薄膜)附着于玻璃或优选丙烯酸类塑料的刚性背衬(backing)的膜组成(图7)。在最简单的形式中，薄膜是盐桥，但理想地由亲水性聚合物组成，使得能够实现更厚的膜。施加器解决了运输问题，因为活化膜在干燥状态下长时间稳定地黏附在刚性背衬上，使得能够在标准显微镜载片容器中运输膜。通过使用透明的丙烯酸支持物和较厚的聚合物薄膜可实现单独膜的可扩展生产。使用这些材料，可构造大的本体施加器。丙烯酸背衬使实现将本体施加器激光切割成100个单独的施加器。需要较厚的薄膜来防止在激光切割过程中膜与丙烯酸背衬融合，从而能够在应用过程中使膜脱离。最后，施加器极大地简化了膜与阵列的附着，因为整个施加器可作为单干燥件放置在阵列的顶部。夹紧和孵育之后，将施加器：阵列三明治浸没在溶液中。亲水性薄膜吸收水，使膜从施加器释放并使膜附着在阵列上。因此，施加器不需要终端用户处理脆弱的膜和进行标准的易于出错的膜附着操作。
在一个实施方案中，本文中提供了膜施加器，其包含：膜；以及刚性支持物；其中所述膜通过可逆化学物质附着于刚性支持物。
在一些实施方案中，刚性支持物包含玻璃。在一些实施方案中，刚性支持物包含丙烯酸类塑料。在一些实施方案中，刚性支持物包含聚碳酸酯或聚苯乙烯。
在一些实施方案中，刚性支持物厚度为约1至约2mm。在一些实施方案中，膜是半多孔膜。在一些实施方式中，膜是等离子体活化的。在一些实施方案中，膜是聚碳酸酯。
在一些实施方案中，膜通过可逆化学物质附着于刚性支持物。在一些实施方案中，可逆化学物质是亲水性薄膜。在一些实施方案中，亲水性薄膜是盐桥。在一些实施方案中，亲水性薄膜是亲水性聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)、琼脂糖或藻酸盐。在一些实施方案中，可逆化学物质是由生物素-链霉亲和素相互作用产生的二硫桥，其可被还原剂裂解。在一些实施方案中，可逆化学物质是光敏连接。在一些实施方案中，可逆化学是可酶促裂解的连接。
在一些实施方案中，膜施加器的宽度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30mm。在一些实施方案中，膜施加器的长度为70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80mm。在另一些实施方案中，膜施加器可大得多，包括例如1至5英尺乘1至5英尺(例如，2英尺×2英尺或2英尺乘3英尺)。这些较大的施加器的使用使得能够同时密封多个阵列。
阵列夹具
为了在膜与孔阵列之间产生完全密封，必须在升高的温度下将膜用刚性背衬抵靠阵列压上长时间，通常在37℃下30分钟。传统方案使用商业的450美元钢杂化夹具。夹具的高成本限制了可同时处理的样品数目，并为新实验室采用该技术带来了摩擦点。
为了有助于该技术在新实验室中的迅速采用，本文中提供了重新设计的手动夹具，其在由更柔韧和更便宜的塑料材料制成的情况下发挥作用(图8A至D)。使以塑料发挥作用的夹具工程化有三个关键。1.需要沿着阵列的长轴施加压力。如果在中间使用单螺杆，则顶件会弯曲，从而在阵列的端部提供差的密封。发现三螺杆设计对于沿长轴提供向下的力是最佳的。2.在阵列下方直接施加向上的力。这通过创建方形夹具来完成，该方形夹具完全包围阵列保持器和顶件，并且仅在下侧接触阵列保持器，从而在阵列下产生向上的力。3.允许流体离开阵列表面的路径。本文给出的设计可以以＜15美元进行注塑模制，使夹具成为一次性物品，其可与膜和阵列一起送到新实验室。廉价的成本还使得可使用大量的夹具，从而提高了重度(heavy)用户实验室或中心的吞吐量(throughput)。
用加热压力机(heated press)进行可扩展的阵列夹紧
在另一方面，本文中提供了用于使用加热压力机将孔密封至阵列的方法。手动夹紧每个阵列仍然代表了重度用户实验室测定的吞吐量的瓶颈。压力机由在其上放置阵列的弹性的底表面组成。可使用标准操作将膜预先放置在阵列上，或更优选地，将膜施加器放置在阵列的顶部。如上所述，将压力机的顶表面加热到限定的温度，通常为37℃。然后将压力机在限定的压力下关闭限定量的时间，以调节膜的附着。对于重度用户实验室，加热压力机方法具有数个优势。当前压力机尺寸使得能够使膜同时附着于50个阵列。与烘箱相比，压力机的改善的传热使得能够在5分钟而不是30分钟内使膜附着。最后，单膜可用于密封所有五十个阵列，其通过需要制作较少的单独膜而有助于技术的扩展，并且还通过使实现在转录物捕获后同时从所有阵列移除膜而不是一次一个来帮助用户。
在一些实施方案中，用于将膜密封至孔阵列的方法包括使孔阵列与膜接触；以及将加热的表面施加至与孔阵列接触的膜。
在一些实施方案中，膜包含刚性支持物，例如本文中所述的刚性支持物，其中膜面向孔并且刚性支持物面向加热的表面。在一些实施方案中，膜包含本文中所述的膜施加器。
在一些实施方案中，加热的表面被加热到30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、4U℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃ 47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃。在一些实施方案中，加热的表面被加热到35℃至50℃。
在一些实施方案中，将加热的表面施加至膜持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟。在一些实施方案中，将加热的表面施加至膜持续少于10分钟。在一些实施方案中，将加热的表面施加至膜持续5分钟。
在一些实施方案中，加热压力机包括热压力机。在一些实施方案中，加热压力机包括T恤压力机。在一些实施方案中，加热压力机包括熨斗(iron)。
使多孔塑料颗粒或珠磁化的方法
磁性颗粒已成为利用颗粒的大多数生物测定的首选树脂，因为其显著简化了颗粒与溶液的分离并且能够实现自动化。磁性捕获珠(例如磁性条码化转录物捕获珠)将大幅简化在Seq-well期间转录物捕获之后进行的许多酶促反应，但迄今为止尚未使用磁珠。Seq-well中利用的转录物捕获珠具有多种规格，这些规格对于测定必不可少，包括大尺寸(例如，约35微米)、高度均一的尺寸分布、大孔性(＞100nm孔)和密集的表面官能度。满足这些规格的商业树脂非常少，并且没有一个是磁性的。为了避免从头开始产生磁性树脂，已经设计了用于使市售多孔树脂磁化的容易方法。该方法利用溶剂或温度引起用于制造树脂的聚合物的收缩，优选为-20℃下的4M NaCl、10％PEG8000的水溶液。树脂的皱缩(shrinkage)引起树脂内的孔变得更大。在皱缩状态下，将尺寸略大于正常状态下的孔的磁性颗粒(优选50至100nm)与树脂混合。在颗粒渗透皱缩状态下的树脂的孔之后，使树脂恢复到标准溶剂条件和标准温度。随着孔恢复正常，磁性颗粒被永久捕捉在孔结构中，从而产生磁性树脂。
用于稳定储存单细胞RNA的方法
当前，由于标准的批量冷冻过程后细胞恢复差，单细胞RNAseq分析稀疏细胞样品需要在采集当天将样品处理为条码化cDNA。这是该技术的重大局限性，因为其要求在样品采集点或其附近有合适的仪器可用并且需要将每个样品处理到cDNA阶段，这可能是昂贵和费时的，对于大型临床试验尤其令人望而却步。为了克服这一限制，我们已开发了利用皮米孔阵列(例如Seq-Well阵列)作为数千个细胞的单细胞RNA储存载体发挥作用的方法。将细胞在约数分钟内装载到预装载有条码化捕获珠的官能化微阵列中。然后将该阵列浸没在醇固定剂(例如，甲醇)中以使每个细胞的内容物沉淀，并且从而在细胞裂解、内容物沉淀期间以及最终在储存期间将这样的内容物保持在孔中。我们已经证明，一旦装载到阵列中，用醇(例如，甲醇)固定细胞对从细胞的转录物回收具有最小的影响(图9A至E)。然后可将该阵列置于在低于0℃的温度下(包括例如在约-80℃下或在约-20℃下)长期储存。为了从储存的阵列中回收单细胞转录物组，将半多孔膜附着于醇固定剂中的阵列。然后实施Seq-Well方案或涉及皮米孔或皮米孔阵列的任何其他方案。稳健的变性裂解缓冲液使沉淀的物质重新溶解使得能够以单细胞分辨率捕获RNA。
分层装置
本文公开了具有通孔和/或具有多个孔的孔阵列(例如，微米孔阵列)的分层装置(例如，微流控装置、孔阵列，例如包含光致抗蚀剂干膜)，所述孔配置成使得每个孔可容纳一个细胞和/或珠，以及相关方法。在一些实施方案中，这样的装置包含基础层，其任选地为多孔膜。在一些实施方案中，具有通孔和/或孔阵列的光致抗蚀剂干膜还包含具有通孔和/或孔阵列的第二光致抗蚀剂干膜(例如，其第二层或顶层)。孔阵列/无底微米孔阵列有利地由光致抗蚀剂干膜制成，而不使用固体支持物，从而提供了优于本领域中的阵列和制造方法的数个优点。
其他类型的孔阵列(例如，包含不允许液体通过的固体孔底部)可仅允许将细胞和/或珠泊松装载到阵列中，导致比使用本公开内容的分层装置(例如，包含含有多孔膜的孔底部的分层装置，所述多孔膜允许包含细胞和/或珠的液体流过分层装置的多孔膜)可实现的吞吐量显著更低。
用于制造分层装置(例如，孔阵列，例如，微米孔阵列)的其他方法可在可扩展性和/或可重现性方面受到限制。在本文中所述装置制造方法的替代方法中，将光致抗蚀剂旋转涂覆(spin-coat)到固体支持物表面上。在这些方法之后可以是在光致抗蚀剂中曝光并显影通孔阵列，并随后通过机械方法从支持物上释放光致抗蚀剂膜(例如，通过使用刀片(razor blade)从支持物上刮下光致抗蚀剂膜)。这样的机械方法可能不容易应用于大面积光致抗蚀剂膜(例如，大于长度0.1m×宽度0.1m)，并且可能不容易重现。从固体表面分离光致抗蚀剂的另一种替代方法可包括将光致抗蚀剂旋转涂覆到被称为剥离(lift-off)层的可溶解固体支持物上。但是，这种方法可给制造过程添加相当大的复杂性。制造装置的其他替代方法包括使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造微米孔阵列，但是这些方法可能难以应用于大面积的PDMS(例如，大于长度0.1m×宽度0.1m)，并且可能不容易重现。
有利地，本文中公开的制造分层装置的方法可用光致抗蚀剂干膜进行，并且除光掩模之外不需要光致抗蚀剂干膜的任何固体支持物，所述光掩模在暴露于显影溶液(developing solution)期间可自然地从光致抗蚀剂干膜上脱离。本文中公开的制造分层装置的方法可更容易地应用于大面积光致抗蚀剂膜(例如，大于长度0.1m×宽度0.1m)，并且与替代方法相比可更容易地重现。例如，本文中公开的方法可用于在短时间段内以可重现方式制造成千上万，而无需大量的人力，包括例如由数个技术人员每天制造至少10,000个阵列。
制备包含光致抗蚀剂干膜并且除光掩模之外不需要光致抗蚀剂干膜的固体支持物的独立式结构(例如，无底孔阵列)的方法除了稳健、容易和可重复生产孔阵列之外还具有重要的用途。
在本文中所述装置的替代装置中，无底孔阵列可由壳聚糖层支持，该壳聚糖层形成孔的底表面。通常，这些具有壳聚糖层的替代阵列的孔径和/或通量如此低以防止或阻碍液体足够快地经由那里流动，目的是以高通量(high throughput)装载细胞和/或珠，和/或目的是将细胞和/或珠超泊松装载到孔阵列中。与这些壳聚糖分层阵列相比，本文中公开的孔阵列可具有显著更高的通量和/或显著更高的孔径，并因此有助于以高通量装载细胞和/或珠和/或超泊松装载孔阵列。
装置
在一些实施方案中，提供了分层装置(例如，微流控装置、孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)。在一些实施方案中，分层装置包含多个层。分层装置中的层可包含例如一个或更多个多孔膜、一个或多个无底孔阵列、和/或一个或更多个超滤膜。
如本文中所用的，“无底微米孔阵列”包含具有多个通孔的平面基底。在一些实施方案中，无底微米孔阵列包含约103个或更多的通孔，例如，103至约107个通孔、3x103至约107个通孔、约5x103至约107个通孔、约104至约107个通孔、约104或约5x104或约8x104个通孔至约105或约5x105或约1x106或约5x106或约1x107个通孔。在一些实施方案中，当无底微米孔阵列未在底部与多孔膜结合时，其是微米孔阵列的状态。
孔
在一些实施方案中，分层装置包含含有多个通孔或孔的独立式光致抗蚀剂膜(例如，无底孔阵列，例如，无底微米孔阵列)。
在一些实施方案中，分层装置包含孔阵列。在一些实施方案中，孔阵列的每个孔包含多个通孔(例如，在光致抗蚀剂干膜中)之一和底表面(例如，包含基础层，例如，包含多孔膜)。在一些实施方案中，本文中所述孔阵列中的孔配置成捕获单细胞和/或珠。在一些实施方案中，本文中所述孔阵列中的孔布置成六边形图案。在一些实施方案中，本文中所述孔阵列中的孔布置成方形或矩形网格图案。
在一些实施方案中，术语“微孔”或“孔”或“通孔”可互换使用，并且是指最大横向尺寸或直径(例如，均一直径)小于或等于1000微米(例如，1微米至1000微米或等于1微米和1000微米)的孔。
孔可以是任何形状并且具有至少侧面和任选地底表面。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的通孔的形状为圆柱形、矩形棱柱(例如，具有方形截面)、锥体、或锥形。
如本文中所用的，术语层(例如，光掩模、无底孔阵列)中的特征(例如，孔)的“最大横向尺寸”是指在与该特征所在其上和/或其中的层(例如，无底孔阵列)的平面平行的平面(例如，任何平面、特定平面)中同一特征(例如，孔)的两个边缘(例如，两个相对边缘、两个对角边缘)之间的最大距离。例如，对于具有圆形截面的孔，与孔阵列的平面平行的平面中的最大横向尺寸是该平面中圆形截面的直径。作为另一个实例，对于具有矩形截面(例如，方形截面)的孔，与孔阵列的平面平行的平面中的最大横向尺寸是该平面中矩形截面的对角线长度。如本文中所用的，术语制品(例如，细胞、珠)的“最大横向尺寸”是指同一制品(例如，细胞、珠)的任意两个边缘之间的最大距离。
在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的通孔的形状为圆柱形、矩形棱柱(例如，具有方形截面)、锥体或锥形。
本文中所述孔阵列中的孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔可具有合适的最大和/或最小横向尺寸。在一些实施方案中，本文中所述孔阵列中的孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的最大和/或最小横向尺寸为至少5微米、至少7微米、至少10微米、至少20微米、至少45微米、至少50微米或至少100微米。在一些实施方案中，本文中所述孔阵列中的孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的最大和/或最小横向尺寸为至多500微米、至多400微米、至多300微米或至多200微米。也可以是上述范围的组合(例如，5微米至500微米、7微米至400微米、5微米至50微米)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，本文中所述孔阵列中的孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的最大和/或最小横向尺寸为5微米至500微米(例如，45微米、7微米、10微米)。
如本文中所用的，当定量特性(例如，最大横向尺寸)被描述为“在……范围内”时，当伴随着较小值和较大值时，这是指该定量特性具有介于较小值和较大值之间或等于较大值中的较小值的值。
在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔具有均一深度。
在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的深度使得至多数个珠和/或细胞(例如，单珠和/或单细胞)将适合孔和/或通孔的内部。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的深度等于无底孔阵列和/或光致抗蚀剂干膜的厚度。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的深度为至少5微米、至少10微米、至少20微米或至少30微米。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的深度为至多500微米、至多200微米或至多100微米。也可以是上述范围的组合(例如，5微米至500微米、10微米至200微米、30微米至100微米)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔的深度为5微米至500微米(例如，30微米至100微米)。
在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的通孔具有均一的最大横向尺寸。
在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸使得至多数个珠和/或细胞(例如，单珠和/或单细胞)将适合于孔和/或通孔的内部。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸(例如，均一直径)为至少1微米、至少10微米或至少15微米。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸(例如，均一直径)为至多500微米、至多300微米、至多200微米、至多100微米或至多10微米。也可以是上述范围的组合(例如，1微米至500微米、10微米至300微米、15微米至100微米)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸(例如，均一直径)为1微米至500微米(例如，15微米至100微米、1微米至10微米)。
在一些实施方案中，相对于细胞和/或孔的最大横向尺寸，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸使得至多数个珠和/或细胞(例如，单珠和/或单细胞)将适合于孔和/或通孔的内部。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸为细胞和/或珠的最大横向尺寸的至少1倍、至少2倍或至少3倍。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸为细胞和/或珠的最大横向尺寸的至多6倍、至少5倍或至多4倍。也可以是上述范围的组合(例如，1至6倍、2至5倍、3至4倍)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸为细胞和/或珠的最大横向尺寸的1至6倍。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸为细胞的最大横向尺寸的1至6倍。在一些实施方案中，无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的至少一些(例如，全部)孔和/或光致抗蚀剂干膜中的至少一些(例如，全部)通孔的最大横向尺寸为珠的最大横向尺寸的1至6倍。
在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔为圆柱形。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔为圆柱形并且具有均一直径。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔为圆柱形并且直径为至少1微米、至少10微米或至少15微米。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔为圆柱形并且直径为至多500微米、至多300微米、至多200微米、至多100微米或至多10微米。也可以是上述范围的组合(例如，1微米至500微米、10微米至300微米、15微米至100微米)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔为圆柱形并且直径为1微米至500微米(例如，15微米至100微米或1微米至10微米)。
在一些实施方案中，孔阵列(例如，无底微米孔阵列)中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的形状为矩形棱柱(例如，具有方形截面的方形棱柱)。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的形状为矩形棱柱(例如，具有方形截面的方形棱柱)，并且具有均一的最大横向尺寸。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的形状为矩形棱柱(例如，具有方形截面的方形棱柱)，并且最大横向尺寸(例如，矩形或方形截面的对角线；例如，均一的最大横向尺寸)为1微米至500微米(例如，15微米至100微米或1微米至10微米)。
在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔为椎体(形状为椎体；例如，矩形椎体、方形椎体、三角形椎体，等)。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)阵列中的至少一些(例如，全部)通孔为椎体并且具有均一的最大横向尺寸。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)阵列中的至少一些(例如，全部)通孔为椎体并且在层或阵列(例如，无底微米孔阵列)的顶表面处的最大横向尺寸(例如，最大截面的对角线；例如，均一的最大横向尺寸)为35微米至100微米(例如，45微米至80微米、40微米至50微米)，并且在层或阵列(例如，无底微米孔阵列)的底表面处的最大横向尺寸为0.5微米至10微米(例如，0.5微米至3微米、1微米至5微米)。也可以是其他范围。
在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔为椎形。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)阵列中的通孔为椎形并且具有均一直径。在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)阵列中的至少一些(例如，全部)通孔为椎形并且在层或阵列(例如，无底微米孔阵列)的顶表面处的直径(例如，均一直径)为35微米至100微米(例如，45微米至80微米、40微米至50微米)，并且在层或阵列(例如，无底微米孔阵列)的底表面处的直径为0.5微米至10微米(例如，0.5微米至3微米、1微米至5微米)。也可以是其他范围。
如本文中所用的，在提及数量(例如，距离、厚度、尺寸(例如，最大横向尺寸))时，特征化术语“均一”是指该数量的变化不超过所述值或该数量平均值的10％更多或更少(例如，不超过所述值或该数量平均值的5％更多或更少，不超过1％更多或更少，不超过0.1％更多或更少)。
在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的间距(pitch)足够低以便降低对大量细胞和/或珠进行分析(其中每个孔或通孔有一个单细胞和/或珠)所需的装置面积或使其最小化，同时在每个孔或通孔之间提供足够的间隔。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜的层中通孔的间距足够低以使得可在显影溶液中去除与光致抗蚀剂干膜结合的光掩模，同时在每个孔或通孔之间提供足够的间隔。
如本文中所用的，术语层中的特征(例如，孔阵列中的孔，光掩模上的特征)之间的“间距”是指在与该特征所在其上和/或其中的层(例如，无底孔阵列)的平面平行的平面(例如，任何平面、特定平面)中的层中的特征之间的中心到中心的距离。
在一些实施方案中，孔阵列中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的最大间距为2mm。在一些实施方案中，孔阵列(例如，无底微米孔阵列)中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的间距为至少1微米、至少10微米、至少20微米或至少50微米。在一些实施方案中，孔阵列(例如，无底微米孔阵列)中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的间距为至多2mm、至多1mm、至多500微米或至多200微米。也可以是上述范围的组合(例如，1微米至2mm、10微米至1mm、20微米至500微米)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，孔阵列(例如，无底微米孔阵列)中的至少一些(例如，全部)孔和/或层(例如，光致抗蚀剂干膜)中的至少一些(例如，全部)通孔的间距为20微米至200微米(例如，10微米至200微米)。
在一些实施方案中，在面向光掩模的表面上，光致抗蚀剂干膜的层中的通孔占据光致抗蚀剂干膜的面积百分比足够大以使得可在显影溶液中去除与光致抗蚀剂干膜结合的光掩模。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜顶表面(例如，接触光掩模的表面)的孔的总横向面积为光致抗蚀剂干膜总横向面积的至少10％。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜顶表面处孔的总横向面积为光致抗蚀剂干膜总横向面积的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜顶表面处孔的总横向面积为光致抗蚀剂干膜总横向面积的至多99.9％、至多99％、至多90％、至多80％、至多70％或至多60。也可以是上述范围的组合(例如，10％至99.9％、20％至90％、30％至80％)。也可以是其他范围。
如本文中所用的，术语层中的特征的(例如，孔的)集合的“总横向面积”是指与该特征所在其上和/或其中的层(例如，无底孔阵列)的平面平行的平面(例如，任何平面、特定平面)中的所有特征(例如，孔)的累积截面面积。
在一些实施方案中，孔代表光致抗蚀剂干膜顶表面(例如，接触光掩模的表面)的表面积的至少约10％。在一些实施方案中，孔代表光致抗蚀剂干膜顶表面的表面积的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在一些实施方案中，孔代表光致抗蚀剂干膜顶表面的表面积的至多99.9％、至多99％、至多90％、至多80％、至多70％或至多60％。也可以是上述范围的组合(例如，10％至99.9％、20％至90％、30％至80％)。也可以是其他范围。
第一无底微米孔阵列
在一些实施方案中，分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)包含例如包含多个通孔或孔的光致抗蚀剂干膜(例如，无底孔阵列、无底微米孔阵列)。
如本文中所用的，术语“光致抗蚀剂”是本领域普通技术人员已知的并且是指对在材料表面上和/或通过材料形成图案的方法中使用的某些电磁辐射(例如，紫外(UV)光)敏感的材料。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜是负性光致抗蚀剂。术语“负性光致抗蚀剂”是本领域普通技术人员已知的并且是指这样的光致抗蚀剂，其中暴露于某些电磁辐射(例如，UV光)的部分变得交联，而未暴露的部分在显影溶液中保持可溶性并且可在显影期间去除。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜包含含有环氧基团的负性光致抗蚀剂材料。环氧基团是指具有三元环的环醚，其任选地包含与三元环中的两个碳键合的多种取代基中的任一个。在一些实施方案中，负性光致抗蚀剂在暴露于某些电磁辐射(例如，UV光)期间形成酸，该酸诱导负性光致抗蚀剂材料的聚合。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜包含SU-8光致抗蚀剂，其是包含8个环氧基团的普通光致抗蚀剂，其中SU-8中环氧基团的化学结构为：
Figure BDA0002621120660000481
在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜包括市售的光致抗蚀剂干膜(例如，负性光致抗蚀剂干膜)。尽管提及环氧化物光致抗蚀剂化学物质作为实例，但应理解，也可以是其他光致抗蚀剂化学物质。
在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜(例如，包含多个通孔；例如，无底微米孔阵列)位于多孔膜上方(例如，位于与其相邻，接触、直接接触、黏附于其，与其结合)。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜与多孔膜直接接触。在某些实施方案中，光致抗蚀剂干膜(例如，包含多个通孔；例如，无底微米孔阵列)与多孔膜结合。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜与多孔膜结合(例如，通过热层压)。
如本文中所用的，涉及两个制品(例如，两个层，例如，无底阵列和基础层)的术语“接触”意指将两个制品的可接触的任何部分物理地接触在一起。例如，在两个制品(例如，层)的分层配置中，第一制品的顶表面可接触第二制品的底表面。
如本文中所用的，术语“结合的”是指一层与另一层的连接状态(例如，通过黏合剂，通过层压，例如，通过热层压)。
在一些实施方案中，第一无底微米孔阵列包含第一多孔膜。在一些实施方案中，第一多孔膜的孔径(例如，平均孔径)足够大以适应液体流以高通量通过多孔膜，但是足够小以防止细胞和/或珠穿过多孔膜。在一些实施方案中，多孔膜的孔径(例如，平均孔径)为至少1nm、至少10nm、至少50nm、至少80nm、至少100nm、至少200nm、至少300nm或至少500nm。在一些实施方案中，多孔膜的孔径(例如，平均孔径)为至多3微米、至多2微米或至少1微米。也可以是上述范围的组合(例如，5nm至3微米、1nm至1微米、80nm至200nm)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，多孔膜的孔径(例如，平均孔径)为50nm至3微米。在一些实施方案中，多孔膜的平均孔径(例如，直径)为1nm至1000nm(例如，80nm至200nm)。
在一些实施方案中，多孔膜的孔径(例如，平均孔径)是细胞和/或珠的最大横向尺寸的足够低的倍数，以使得细胞和/或珠不能穿过多孔膜。在一些实施方案中，多孔膜的平均孔径为细胞和/或珠的最大横向尺寸的至少0.001倍、至少0.01倍或至少0.1倍。在一些实施方案中，多孔膜的平均孔径为细胞和/或珠的最大横向尺寸的至多0.25倍、至多0.2倍或至多0.15倍。也可以是上述范围的组合(例如，0.001倍至0.25倍、0.01倍至0.2倍、0.1倍至0.15倍)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，多孔膜的平均孔径为细胞和/或珠的最大横向尺寸的0.001至0.25倍(例如，0.001至0.1倍)。在一些实施方案中，多孔膜的平均孔径为细胞的最大横向尺寸的0.001至0.1倍。在一些实施方案中，多孔膜的平均孔径为珠的最大横向尺寸的0.001至0.1倍。
在一些实施方案中，多孔膜的通量率足够高以适应液体流以高通量通过多孔膜。在一些实施方案中，多孔膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2、至少0.5mL/分钟/cm2或至少1mL/分钟/cm2。在一些实施方案中，多孔膜的通量率为至多100mL/分钟/cm2、至多10mL/分钟/cm2或至多5mL/分钟/cm2。也可以是上述范围的组合(例如，0.1mL/分钟/cm2至100mL/分钟/cm2、0.5mL/分钟/cm2至10mL/分钟/cm2、1mL/分钟/cm2至5mL/分钟/cm2)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，多孔膜的通量率为0.1mL/分钟/cm2至100mL/分钟/cm2。
在一些实施方案中，多孔膜具有足够的厚度以提供机械完整性，使得细胞或珠均不穿过但并不是高至使得通过膜的液体流降低到低于期望值。在一些实施方案中，多孔膜的厚度为至少5微米、至少10微米或至少20微米。在一些实施方案中，多孔膜的厚度为至多500微米、至多200微米或至多100微米。也可以是上述范围的组合(例如，5微米至500微米、10微米至200微米、20微米至100微米)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，多孔膜的厚度为5微米至500微米。在一些实施方案中，多孔膜的厚度为10微米。
在一些实施方案中，多孔膜位于光致抗蚀剂干膜下方(例如，位于与其相邻，接触、直接接触、黏附于其，与其结合)，所述光致抗蚀剂干膜例如在第二层的底表面处包含多个通孔，例如，无底微米孔阵列。
如本文中所用的，术语“相邻”是指位于彼此附近并且可以或可以不彼此接触(例如，在中间可具有居间层(intervening layer))的两个制品(例如，两个层，例如，无底阵列和基础层)。
在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜具有多个通孔。在一些实施方案中，包含多个通孔的光致抗蚀剂干膜形成无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)。
在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜具有均一厚度。
在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜具有的厚度使得至多数个珠和/或细胞(例如，单珠和/或单细胞)将适合于光致抗蚀剂干膜中的孔和/或通孔的内部。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜的厚度为至少5微米、至少10微米或至少20微米。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜的厚度为至多500微米、至多200微米或至多100微米。也可以是上述范围的组合(例如，5微米至500微米、10微米至200微米、20微米至100微米)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜的厚度为5微米至500微米。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜的厚度为5微米至100微米。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜的厚度为50微米。
顶膜
在一些实施方案中，分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)还包含第二多孔膜。在一些实施方案中，第二多孔膜用于密封分层装置的孔。如本文中所用的，术语“超滤膜”是指具有足够小以排除高分子量分子(例如，DNA)穿过的孔径(例如，平均孔径)的半透膜。在一些实施方案中，超滤膜的截留分子量(molecular weightcut-off)小于或等于106Da(例如，103至106Da或等于103和106Da、103至3*105Da或等于103和3*105Da)。术语“截留分子量”是本领域技术人员已知的并且是指其中至少90％的分子被阻止穿过膜的分子的最低分子量。在一些实施方案中，超滤膜包含聚合物(例如，聚砜、聚丙烯、乙酸纤维素、聚乳酸)和/或陶瓷。
在一些实施方案中，第二多孔膜(例如，超滤膜)具有足够小以排除细胞和至少一些细胞内容物(例如，高分子量分子，例如，DNA)穿过的平均孔径(例如，直径)。在一些实施方案中，第二多孔膜的平均孔径在本文中所述的范围(例如，1nm至200nm)内。
在一些实施方案中，第二多孔膜相对于分层装置的其他组件(例如，层)位于分层装置中。例如，在一些实施方案中，第二多孔膜位于层(例如，光致抗蚀剂干膜)上方，例如，接触在该层(例如，光致抗蚀剂干膜)顶表面的层(例如，光致抗蚀剂干膜)。在一些实施方案中，第二多孔膜位于第二层上方或下方。例如，在一些实施方案中，第二多孔膜接触第二层(例如，光致抗蚀剂干膜，无底微米孔阵列)的顶表面或底表面。在一些实施方案中，第二多孔膜位于第二无底微米孔阵列上方。在一些实施方案中，第二多孔膜与第二无底微米孔阵列直接接触。
第二无底微米孔阵列
在一些实施方案中，分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)包含例如包含多个通孔的第二光致抗蚀剂干膜(例如，无底孔阵列、无底微米孔阵列)。
在一些实施方案中，第二光致抗蚀剂干膜(例如，第二无底微米孔阵列)位于第一光致抗蚀剂干膜(例如，第一无底微米孔阵列)上方(例如，与其相邻、接触、结合)。在一些实施方案中，第二光致抗蚀剂干膜(例如，第二无底微米孔阵列)与第一光致抗蚀剂干膜(例如，第一无底微米孔阵列)直接接触。在一些实施方案中，第二光致抗蚀剂干膜(例如，第二无底微米孔阵列)与第三多孔膜结合。在一些实施方案中，第二无底微米孔阵列包含第二光致抗蚀剂干膜。在一些实施方案中，第二光致抗蚀剂干膜在第一光致抗蚀剂干膜上方(例如，在中间具有多孔膜，或者在中间具有更多层，或者与其直接相邻和/或接触)并且具有第二多个通孔。
在一些实施方案中，分层装置包含在分层配置中含有通孔的至少两个光致抗蚀剂干膜(例如，无底孔阵列，例如，无底微米孔阵列)，所述至少两个光致抗蚀剂干膜位于彼此上方(例如，彼此接触或结合；例如，在中间具有多孔膜)。在一些实施方案中，第一无底孔阵列的至少70％、至少80％或至少90％的通孔(例如，孔)中的每一个与第一无底孔阵列的相应单通孔(例如，孔)流体连通。在一些实施方案中，第一无底孔阵列的至多100％、至多95％或至多85％的通孔(例如，孔)中的每一个与第一无底孔阵列的相应单通孔(例如，孔)流体连通。也可以是上述范围的组合(例如，70％至100％、80％至95％、80％至85％)。也可以是其他范围。在一些实施方案中，第一无底孔阵列的至少90％的通孔(例如，孔)中的每一个与第一无底孔阵列的相应单通孔(例如，孔)流体连通。
在一些实施方案中，第一无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸小于第二无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸。在一些实施方案中，第一无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸为1至10微米，并且第二无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸为15至100微米。在一些实施方案中，第一无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸大于第二无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸。在一些实施方案中，第一无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸为15至100微米，并且第二无底孔阵列中通孔的最大横向尺寸为1至10微米。
在一些实施方案中，分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)包含第三多孔膜。在一些实施方案中，第三多孔膜位于第二光致抗蚀剂干膜(例如，包含通孔；例如，无底微米孔阵列)下方，和/或位于第一光致抗蚀剂干膜(例如，包含通孔；例如，无底微米孔阵列)上方。在一些实施方案中，第三多孔膜与第一和/或第二光致抗蚀剂干膜(例如，包含通孔；例如，无底微米孔阵列)直接接触。在一些实施方案中，第三多孔膜位于第一光致抗蚀剂干膜(例如，包含通孔；例如，无底微米孔阵列)与第二光致抗蚀剂干膜(例如，包含通孔；例如，无底微米孔阵列)之间。在一些实施方案中，第三多孔膜具有本文中所述的第一多孔膜的任何性质。
在一些实施方案中，如本文中所述，分层装置的孔还包含珠和/或细胞。
进一步详细描述了分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)的数个非限制性实施方案。然而，应理解，本公开内容不仅限于本文中所述的那些具体实施方案。相反，多种公开的组件、制品、特征和方法可以以任何合适的组合来布置，因为本公开内容不限于此。
在一些实施方案中，分层装置包含附着于包含多个通孔的光致抗蚀剂干膜的基础层(例如，多孔膜)，所述通孔的形状为圆柱形或矩形棱柱形(例如，方形棱柱形)，分别具有圆形或矩形截面。该配置在图10A和10D中示出。
图10A是根据某些非限制性实施方案的孔阵列100的截面示意图。所示孔阵列100包含第一层102(例如，多孔膜)。在一些实施方案中，第一层102是多孔膜并且通量率为0.1mL/分钟/cm2至100mL/分钟/cm2和/或孔径为50nm至3微米。所示孔阵列100还包含第一无底孔阵列104(例如，无底微米孔阵列)，所述第一无底孔阵列104包含具有第一多个通孔103的第一光致抗蚀剂干膜105。第一层102在第一无底孔阵列104的底表面106处接触(例如，位于与其相邻、直接接触、黏附于、结合至)第一无底孔阵列104。阵列100的每个孔包含第一多个通孔103之一和包含第一层102的底表面101。虽然示出了三个孔，并且将孔示出为具有与光致抗蚀剂干膜的平面垂直的壁，但是应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)和/或可包含任何合适形状(例如，圆柱形、矩形棱柱形、方形棱柱形、椎形或椎体形状)和/或尺寸(例如，最大横向尺寸)的孔；参见例如，图10C。也可以是其他范围。阵列100可用于细胞和/或珠的超泊松装载，例如，通过使包含细胞和/或珠的液体在流动方向131上流过阵列100。
图10D是根据某些非限制性实施方案的分层装置200的截面示意图。所示的分层装置200包含含有孔阵列204的光致抗蚀剂干膜205。在一些实施方案中，孔阵列204中的孔的最大横向尺寸209为15微米至100微米。阵列204中的孔具有底部201(例如，多孔底部)。底部201(例如，多孔底部)包含层202(例如，多孔膜)。在一些实施方案中，底部201(例如，多孔底部)和/或层202(例如，多孔膜)是多孔的并且通量率为0.1mL/分钟/cm2至100mL/分钟/cm2和/或孔径为50nm至3微米。应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)和/或可包含任何合适形状(例如，圆柱形、矩形棱柱形、方形棱柱形、椎形或椎体形状)和/或尺寸(例如，最大横向尺寸)的孔。也可以是其他范围。阵列200可用于细胞和/或珠的超泊松装载，例如，通过使包含细胞和/或珠的液体在流动方向231上流过阵列200。
在一些实施方案中，分层装置包含含有多个通孔的光致抗蚀剂干膜，所述通孔的形状为圆柱形或矩形棱柱形(例如，方形棱柱形)，分别具有圆形或矩形截面，该光致抗蚀剂干膜在底表面上附着于基础层(例如，多孔膜)并且在顶表面处附着于第二层(例如，超滤膜)。该配置在图10B中示出。
图10B是根据某些非限制性实施方案的孔阵列1000的截面示意图。所示的阵列1000包含阵列100的特征，并且还包含在第一光致抗蚀剂干膜105的顶表面107处接触第一光致抗蚀剂干膜105的第二层108(例如，多孔膜)。第二层108(例如，多孔膜)可具有与第一层102相同的平均孔径或不同的平均孔径。第二多孔膜108可位于阵列1000上，例如，通过在流动方向131上施加真空。
在一些实施方案中，分层装置包含附着于光致抗蚀剂干膜的基础层(例如，多孔膜)，所述光致抗蚀剂干膜包含形状为椎形或椎体的多个通孔。这在图10C中示出。
图10C是根据某些非限制性实施方案的孔阵列800的截面示意图。所示孔阵列800包含第一层802(例如，多孔膜)。在一些实施方案中，第一层802(例如，多孔膜)的通量率为0.1mL/分钟/cm2至100mL/分钟/cm2和/或孔径为50nm至3微米。所示孔阵列800还包含第一无底孔阵列804，所述第一无底孔阵列804包含具有第一多个通孔803的第一光致抗蚀剂干膜805。第一层802(例如，多孔膜)在第一无底孔阵列804的底表面806处接触(例如，位于与其相邻、直接接触、黏附于)第一无底孔阵列804。阵列800的每个孔包含第一多个通孔803之一和包含第一层802(例如，多孔膜)的底表面801。虽然示出了两个孔，但是应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)。所示出的孔具有锥状截面(由于例如，椎形形状或椎体形状)使得每个孔在光致抗蚀剂干膜805的顶表面807处具有最大截面尺寸809，并且在光致抗蚀剂干膜805的底表面806处具有最小截面尺寸813。在一些实施方案中，孔在光致抗蚀剂干膜805的顶表面807处的最大截面尺寸809为35微米至100微米。在一些实施方案中，孔在光致抗蚀剂干膜805的底表面806处的最小截面尺寸813为0.5微米至3微米。在一些实施方案中，光致抗蚀剂干膜805的厚度815为30微米至100微米或等于30微米和100微米。也可以是其他范围。阵列800可用于细胞和/或珠的超泊松装载，例如，通过使包含细胞和/或珠的液体在流动方向831上流过阵列800。在一些实施方案中，阵列800首先用于细胞(如本文中所述)的超泊松装载并随后其次用于珠(如本文中所述)的超泊松装载，例如，通过使包含细胞的液体在流动方向831上流过阵列800并随后将阵列800暴露于包含珠的液体(例如，允许珠沉降到阵列中，使包含珠的液体在流动方向831上流过阵列800)。
在一些实施方案中，分层装置包含含有多个通孔的第一光致抗蚀剂干膜，所述通孔的形状为圆柱形或矩形棱柱形(例如，方形棱柱形)，分别具有圆形或矩形截面，该第一光致抗蚀剂干膜在底表面上附着于基础层(例如，多孔膜)，并且在顶表面处附着于第二光致抗蚀剂干膜，其中第二光致抗蚀剂干膜包含多个通孔，所述通孔的形状为圆柱形或矩形棱柱形(例如，方形棱柱形)，分别具有圆形或矩形截面，其中第一光致抗蚀剂干膜中的不多于一个通孔与第二光致抗蚀剂干膜中的不多于一个通孔重叠，并且其中第一光致抗蚀剂干膜中70％至100％或等于70％和100％(例如，70％至85％或等于70％和85％)的通孔与第二光致抗蚀剂干膜中相应的通孔重叠。这在图10E中示出。
图10E是根据某些非限制性实施方案的分层装置300(例如，微流控装置)的截面示意图。所示出的分层装置300包含含有第一多个通孔303的第一无底孔阵列304。在一些实施方案中，第一多个通孔303的最大横向尺寸(例如，309)为1微米至500微米。第一无底孔阵列304接触(例如，结合至)包含第二多个通孔313的第二无底孔阵列314。在一些实施方案中，第二多个通孔313的最大横向尺寸(例如，311)为1微米至500微米。第一无底孔阵列304也接触(例如，结合至)第一层302(例如，多孔膜)。应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)和/或可包含任何合适形状(例如，圆柱形、矩形棱柱形、方形棱柱形、椎形或椎体形状)和/或尺寸(例如，最大横向尺寸)的孔。也可以是其他范围。阵列300可用于细胞和/或珠的超泊松装载，例如，通过使包含细胞和/或珠的液体在流动方向331上流过阵列300。在一些实施方案中，使用类似于图10C中阵列800中的方法将阵列300首先用于细胞(如本文中所述)的超泊松装载并随后其次用于珠(如本文中所述)的超泊松装载，例如，通过使包含细胞的液体在流动方向331上流过阵列300并随后将阵列300暴露于包含珠的液体(例如，允许珠沉降到阵列中，使包含珠的液体在流动方向331上流过阵列300)。在一些实施方案中，分层装置还包含无底孔阵列304与无底孔阵列314之间的多孔膜，和/或位于无底孔阵列314的顶部上的多孔膜。
在一些实施方案中，分层装置包含含有多个通孔的第一光致抗蚀剂干膜，所述通孔的形状为圆柱形或矩形棱柱形(例如，方形棱柱形)，分别具有圆形或矩形截面，该第一光致抗蚀剂干膜在底表面上附着于基础层(例如，多孔膜)并且在顶表面处附着于多孔膜，该多孔膜的顶表面附着于第二光致抗蚀剂干膜，其中第二光致抗蚀剂干膜包含多个通孔，所述通孔的形状为圆柱形或矩形棱柱形(例如，方形棱柱形)，分别具有圆形或矩形截面，其中第一光致抗蚀剂干膜中不多于一个通孔与第二光致抗蚀剂干膜中不多于一个通孔重叠，其中第一光致抗蚀剂干膜中70％至100％或等于70％和100％(例如，70％至85％或等于70％和85％)的通孔与第二光致抗蚀剂干膜中相应的通孔重叠，并且其中第一光致抗蚀剂干膜中至少70％(例如，至少80％、80％至85％)的通孔各自被单珠占据。
应理解，如本文中所用的，特征化术语“第一”和“第二”特征和/或层(例如，无底微米孔阵列，多个通孔)是指分层装置内的不同特征和/或层，并且不意在对该特征和/或层的位置进行限制。此外，在一些实施方案中，除图中所示的特征和/或层之外，可存在另外的特征和/或层(例如，“第三”、“第四”、“第五”、“第六”或“第七”特征)。还应理解，并不是图中所示的所有特征和/或层都需要在一些实施方案中存在。
如本文中所用的，描述词“在……上方”和“在……下方”是指分层配置，并且不是特定取向，但是根据保持阵列的角度可在……上方或在……下方。“在……上方”或“在……下方”意味分层但不必直接接触；可存在一个或更多个居间层。
制造方法
提供了制造独立式光致抗蚀剂膜(例如，如本文中所述的分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜))的方法。
如本文中所用的，“独立式光致抗蚀剂膜”包含如本文中所述的包含通孔的任何光致抗蚀剂干膜，其中通孔是通过将光致抗蚀剂干膜暴露于UV光而没有将光致抗蚀剂附着于除光掩模之外的固体支持物上而产生的。
在一些实施方案中，方法包括将光致抗蚀剂干膜与光掩模对准。
如本文中所用的，术语两个层(例如，光致抗蚀剂和光掩模)的“对准”意指将两个层布置在分层配置中，并且使得两个层中的每个层的平面彼此平行。在一些实施方案中，两个对准的层在两个层之间具有空间和/或一个或更多个居间层。在一些实施方案中，两个对准的层彼此接触。
在一些实施方案中，在装置制造期间，光致抗蚀剂干膜未受基底支持。
在一些实施方案中，所述方法包括将光致抗蚀剂干膜的表面直接层压至光掩模，任选地在没有基础支持物的情况下。在一些实施方案中，所述方法包括从光致抗蚀剂干膜的表面移除释放衬垫(release-liner)(例如，聚烯烃释放衬垫)。在一些实施方案中，所述方法包括在紧临层压之前移除释放衬垫。在一些实施方案中，将光致抗蚀剂干膜的表面直接层压至光掩模包括使光致抗蚀剂干膜的表面与光掩模的表面接触；以及将光致抗蚀剂干膜和光掩模暴露于60摄氏度至80摄氏度(例如，60摄氏度至70摄氏度或等于60摄氏度和70摄氏度，65摄氏度)的温度下持续足以使光致抗蚀剂干膜的表面与光掩模的表面结合的持续时间。也可以是其他温度范围。
在一些实施方案中，将光致抗蚀剂干膜的表面直接层压至光掩模包括以0.1m/分钟至0.5m/分钟(例如，0.2m/分钟至0.4m/分钟；0.3048m/分钟＝1ft/分钟)的速率将光致抗蚀剂干膜直接热层压至光掩模。也可以是其他暴露速率(exposure rate)范围。
在一些实施方案中，所述方法包括通过光掩模将光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于紫外(UV)光持续1分钟至10分钟(例如，2分钟至8分钟、2分钟至3分钟、2.5分钟)的时间段。也可以是其他持续时间。
在一些实施方案中，通过光掩模将光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于UV光包括从垂直于光致抗蚀剂干膜表面的方向以0度至45度的角度引导UV光，使得在光致抗蚀剂干膜中形成的无底孔阵列的孔(例如，微孔)的形状为椎形。在一些这样的实施方案中，通过光掩模将光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于UV光包括在暴露期间在垂直于光掩模和光致抗蚀剂干膜的平面的轴上旋转光掩模和光致抗蚀剂干膜。
在一些实施方案中，通过光掩模将光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于UV光包括在紧靠光掩模之前的光路(例如，UV光路)中放置漫射器(diffuser)，其中光路源于来自光致抗蚀剂干膜的光掩模的相对侧，从而从垂直于光致抗蚀剂干膜表面的方向以0度至45度的角度引导UV光，使得在光致抗蚀剂干膜中形成的无底孔阵列的孔(例如，微孔)的形状为椎形。
在一些实施方案中，通过反应离子蚀刻(reactive ion etching)或UV背面暴露光刻技术(UV backside exposure photolithography technique)在光致抗蚀剂干膜中形成形状为椎形的无底孔阵列的孔(例如，微孔)。
在一些实施方案中，在将附着于光掩模的光致抗蚀剂干膜暴露于电磁辐射(例如，光)之后(例如，在使暴露于电磁辐射的光致抗蚀剂的区域交联之后)，所述方法还包括：将光致抗蚀剂干膜和/或光掩模(例如，其中光掩模附着于光致抗蚀剂干膜)暴露于80摄氏度至100摄氏度(例如，85摄氏度至95摄氏度，95摄氏度)的温度下持续足以使通过光掩模暴露于UV光的光致抗蚀剂干膜的至少一部分交联的持续时间。也可以是其他温度范围。
在一些实施方案中，所述方法包括将光致抗蚀剂干膜和/或光掩模(例如，其中光掩模附着于光致抗蚀剂干膜)暴露于80摄氏度至100摄氏度(例如，85摄氏度至95摄氏度，95摄氏度)的温度下持续1分钟至30分钟(例如，5分钟至25分钟，10分钟至20分钟，15分钟)的时间段。也可以是其他温度和持续时间范围。
在一些实施方案中，方法包括将光致抗蚀剂干膜和/或光掩模(例如，其中光掩模附着于光致抗蚀剂干膜)暴露于10摄氏度至30摄氏度(例如，15摄氏度至25摄氏度，20摄氏度)的温度下持续足以使光致抗蚀剂干膜(例如，包含至少一个交联部分)和光掩模冷却至该温度的持续时间。也可以是其他温度范围。
在一些实施方案中，方法包括将光致抗蚀剂干膜(例如，包含至少一个交联部分)和/或光掩模(例如，其中光掩模附着于光致抗蚀剂干膜)暴露于10摄氏度至30摄氏度(例如，15摄氏度至25摄氏度，20摄氏度)的温度下持续30分钟至90分钟(例如，40分钟至70分钟，50分钟至70分钟，60分钟)的时间段。也可以是其他温度和持续时间范围。
在一些实施方案中，方法还包括将光致抗蚀剂干膜和/或光掩模暴露于显影溶液。
在一些实施方案中，方法包括将光致抗蚀剂干膜和/或光掩模暴露于显影溶液持续足以从光致抗蚀剂干膜去除光致抗蚀剂干膜的任何未交联部分的持续时间。
在一些实施方案中，方法包括将光致抗蚀剂干膜和/或光掩模暴露于显影溶液持续1分钟至30分钟(例如，10分钟至30分钟，20分钟)的时间段。也可以是其他持续时间范围。
在一些实施方案中，显影溶液包含显影溶剂。显影溶液包括但不限于环己醇、环己酮、丙二醇和甲醚乙酸酯。
在一些实施方案中，方法包括在显影溶液中从光掩模脱层(de-laminate)第一和/或第二光致抗蚀剂干膜。
在一些实施方案中，方法包括清洗经显影的光致抗蚀剂干膜。在一些实施方案中，方法包括将经显影的光致抗蚀剂干膜在异丙醇中清洗。在一些实施方案中，方法包括将经显影的光致抗蚀剂干膜在异丙醇中清洗足以从第一和/或第二光致抗蚀剂干膜去除残余显影溶液的持续时间。在一些实施方案中，方法包括将经显影的光致抗蚀剂干膜在异丙醇中清洗1分钟至10分钟(例如，2分钟至8分钟、3分钟至7分钟、5分钟)的时间段。也可以是其他持续时间范围。
在一些实施方案中，方法包括将经显影的光致抗蚀剂干膜空气干燥。
光掩模
在一些实施方案中，光掩模包含聚合物。在一些实施方案中，光掩模包含聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)。
在一些实施方案中，光掩模设计成使得在暴露于显影溶液期间，光致抗蚀剂干膜从光掩模脱离。在一些这样的实施方案中，光掩模具有使得在显影期间光致抗蚀剂干膜从光掩模脱离的特征密度(例如，由特征的最大间距表示)。相比之下，例如，如果光掩模不具有特征(例如，其整个表面区域对于其所暴露的电磁辐射的波长或波长范围是透明的)，则光致抗蚀剂在显影溶液中可能仍与光掩模结合并且难以去除。在一些实施方案中，通过降低光掩模中特征的最大间距，光掩模与光致抗蚀剂干膜的交联部分之间的相互作用的表面积减少。如本文中所用的，术语“间距”是指(例如，对于实体阵列)实体(例如，特征、孔)之间中心到中心的距离。不受理论的束缚，认为光掩模中较低的特征间距导致显影溶液能够在整个表面区域以较短的可接近区域之间的距离接近光致抗蚀剂/光掩模界面，以使得光致抗蚀剂与光掩模之间的结合更容易被显影溶液破坏。在一些实施方案中，光掩模的特征在任意两个相邻特征之间的最大间距为2mm。在一些实施方案中，光掩模的图案化面积(patterned area)大于光致抗蚀剂膜的面积。不受理论的束缚，认为在一些实施方案中，最大间距为2mm、特征覆盖了至少10％的光掩模面积与光掩模图案化面积大于光掩模面积的组合有助于在显影溶液中光掩模从光致抗蚀剂完全脱离。相比之下，标准方法包括将光掩模图案化面积放置在光致抗蚀剂的中心，非图案化面积围绕在图案的边缘。如果将该标准方法与本文中所述的方法组合，则光致抗蚀剂的边缘在显影溶液中可能不从光掩模脱离，并且可能难以在不损坏膜的情况下从光掩模脱离。
在一些实施方案中，光掩模包含在任何两个相邻特征之间的最大间距为2mm的特征(例如，其将是形成包含光致抗蚀剂干膜的无底孔阵列中的孔壁的通孔，并且其在本文中也称为光掩模的“孔”)。在一些实施方案中，光掩模包含沿光掩模的表面在任何方向上每2mm或更小的特征。在一些实施方案中，光掩模具有间距为至少1微米、至少10微米、至少20微米或至少50微米的特征。在一些实施方案中，光掩模具有间距为至多2mm、至多1mm、至多500微米或至多200微米的特征。也可以是上述范围的组合(例如，1微米至2mm、10微米至1mm、20微米至500微米)。也可以是其他范围。
在一些实施方案中，光掩模上的特征(例如，“孔”)占据光掩模面积的至少10％和光掩模面积的至多99.9％(例如，50％)。在一些实施方案中，光掩模上的“孔”占据光掩模面积的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在一些实施方案中，光掩模上的“孔”占据光掩模面积的至多99.9％、至多99％、至多90％、至多80％、至多70％或至多60％。也可以是上述范围的组合(例如，10％至99.9％、20％至90％、30％至80％)。也可以是其他范围。
如本文中所用的，术语光掩模的“特征”是指光掩模的掩蔽部分(例如，对电磁辐射波长范围内的光或者光掩模和/或光致抗蚀剂干膜所暴露的光不透明的部分)，例如，对应于使用光掩模通过光刻法形成的干膜光致抗蚀剂中的孔的横向位置。
分层装置
在一些实施方案中，所述方法还包括使无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)与基础层接触以形成孔阵列。
在一些实施方案中，基础层包含塑料片、丙烯酸类塑料片、DNA微阵列、硅酮弹性体片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或多孔膜(例如，第一多孔膜，例如，本文中所述的第一多孔膜)，或其组合。
在一些实施方案中，方法包括使基础层与无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的底表面结合(例如，通过黏合剂、通过热层压)。在一些实施方案中，方法包括将基础层热层压至无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)的底表面(例如，在其中基础层包含多孔膜的一些实施方案中)。
在一些实施方案中，方法包括将无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)和基础层封闭在壳体(housing)中。在一些实施方案中，壳体包含聚苯乙烯。也可以是用于壳体的其他材料。
在一些实施方案中，所述方法还包括将珠装载到孔阵列或无底微米孔阵列中。
在一些实施方案中，方法包括使无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)或孔阵列在其顶表面与本文中所述的第二多孔膜接触。
在一些实施方案中，所述方法还包括使第二多孔膜在其暴露表面与第二无底微米孔阵列接触(例如，定位、结合、热层压)。
在一些实施方案中，方法包括使第一无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)在其顶表面与第二无底微米孔阵列接触。在一些实施方案中，第二无底微米孔阵列通过本文中所述的方法产生。
在一些实施方案中，方法包括将第一无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)与第二无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)随机对准。在一些实施方案中，方法包括将第一无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)与第二无底孔阵列(例如，无底微米孔阵列)热层压。
在一些实施方案中，方法包括通过本文中所述的方法使用光掩模在光致抗蚀剂干膜(本文中所述)中形成多个通孔(本文中所述)以形成第一无底孔阵列(本文中所述)，以及使第一无底孔阵列与基础层(例如，多孔膜)接触(例如，附着、结合)以形成孔阵列。在一些实施方案中，所述方法还包括用珠装载孔阵列。在一些实施方案中，所述方法还包括使第一无底孔阵列的顶表面与多孔膜接触。在一些实施方案中，所述方法还包括使多孔膜的顶表面与第二无底孔阵列接触。
在一些实施方案中，方法包括通过本文中所述的方法使用光掩模在光致抗蚀剂干膜(本文中所述)中形成多个通孔(本文中所述)以形成第一无底孔阵列(本文中所述)，以及使第一无底孔阵列与基础层(例如，多孔膜)接触(例如，附着、结合)以形成孔阵列。在一些实施方案中，所述方法还包括使第一无底孔阵列的顶表面与第二无底孔阵列接触使得来自第一无底孔阵列的不多于一个孔与来自第二无底孔阵列的不多于一个孔重叠，并且来自第一无底孔阵列的至少70％的孔与来自第二无底孔阵列的相应孔重叠。
分层装置的用途
有利地，本文中所述的分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)可用于多种类型的单细胞分析，包括但不限于本文中所述的那些。例如，包含多个细胞和/或多个珠的第一流体可流过本文中所述的任何分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)以形成细胞装载和/或珠装载的微米孔阵列。
在一些实施方案中，第一流体流过该装置并且第一流体包含珠。在一些实施方案中，第一流体流过该装置并且第一流体包含细胞。在一些实施方案中，第一流体流过该装置并且第一流体包含珠和细胞。在一些实施方案中，第二流体流过该装置并且第二流体包含珠。在一些实施方案中，第二流体流过该装置并且第二流体包含细胞。
超泊松装载
用于单细胞分析的传统阵列的缺点是细胞和/或珠以泊松分布装载到阵列中。如本文中所用的，“泊松分布”是离散概率分布，其表示在固定的时间段或空间内发生多个事件的概率(如果这些事件以已知的平均速率发生并且彼此独立)。泊松分布公式如下：f(k；λ)＝(e-λλk/k！)其中k是事件的发生次数，并且λ是给定间隔期间预期发生次数的正实数。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载细胞时，(例如，第一和/或第二无底微米孔阵列或者第一和/或第二孔阵列的)至少1％的孔将具有多于一个细胞。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载细胞时，1％至40％，例如，1％至10％或1％至2％，例如，1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的孔将具有多于一个细胞。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载珠时，至少1％的孔将具有多于一个珠。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载珠时，1％至40％，例如，1％至10％或1％至2％，例如，1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的孔将具有多于一个珠。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载细胞时，至少10％的孔将没有细胞。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载细胞时，10％至40％，例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的孔将没有细胞。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载珠时，至少10％的孔将没有珠。在一些实施方案中，当横向装置以泊松分布装载珠时，10％至40％，例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的孔将没有珠。
因此，当横向装置以泊松分布装载细胞(或装载珠)时，将明显的是，不是所有孔都将包含单细胞(或单珠)并因此不是所有孔都可使用或提供有用的“单细胞”(或“单珠”)信息。因此，同样明显的是，当装载以泊松分布发生时，阵列中的大多数孔是不可用的。这导致细胞和/或珠的大量浪费，所述细胞和/或珠中的一者或二者可能是稀缺和/或昂贵的。本文中提供的阵列及其使用方法(包括超泊松分布)为基于泊松的分析的这一缺点提供了稳健的解决方案。
因此，相比之下，在本文中提供的分层装置中，在一些实施方案中，一个或更多个层以超泊松分布装载细胞和/或珠。如本文中所用的，“超泊松分布”意指在固定的时间段或空间内以平均速率发生多个事件的概率(如果这些事件以已知的平均速率发生并且彼此独立)大于其将以泊松分布发生的概率。例如，如果阵列用珠装载，并且平均载量为每孔1个珠，则与装载有相同数目珠的超泊松装载阵列相比，泊松装载阵列将具有更少的具有1个珠的孔以及更多的具有0或2或更多个珠的孔。在一些实施方案中，当横向装置以超泊松分布装载细胞时，与用相同数目的细胞以泊松分布装载细胞的横向装置相比，5％更多(或更多)的孔具有1个细胞。在一些实施方案中，当横向装置以超泊松分布装载细胞时，与用相同数目的细胞以泊松分布装载细胞的横向装置相比，(例如，第一和/或第二无底微米孔阵列或者第一和/或第二孔阵列的)1％至20％更多，例如，1％、5％、10％、15％或20％更多的孔具有1个细胞。换句话说，与泊松装载相比，超泊松装载导致更多数目的可用孔(例如，具有单细胞和/或单珠的那些)。类似地，在一些实施方案中，当横向装置以超泊松分布装载珠时，与用相同数目的珠以泊松分布装载珠的横向装置相比，5％更多(或更多)的孔具有1个珠。在一些实施方案中，当横向装置以超泊松分布装载珠时，与用相同数目的珠以泊松分布装载细胞的横向装置相比，1％至20％更多，例如，1％、5％、10％、15％或20％更多的孔具有1个珠。在一些实施方案中，将珠超泊松装载到横向装置中是通过将横向装置形成为包含最大横向尺寸为珠直径的1至1.5倍的孔以使得孔中适合仅一个珠来实现的。
装载的珠和/或细胞的超泊松分布是由流体流过分层装置引起的。实际上，在其中装置具有多孔底部的一些实施方案中，流体能够流过装置(例如，从孔的顶部到底部)。液体流过该装置导致细胞和/或珠流入到孔中并流向该装置的底部。在一些实施方案中，一旦细胞和/或珠流到孔的底部，其将阻塞孔，导致流速降低。这将降低孔将变成装载有多于一个细胞/珠的可能性。例如，这在图12D中进行了示例，其中阵列714的第一层的孔的尺寸设置成使得细胞722将进入阵列并阻塞多孔膜702，从而降低了通过孔的流量，使得其他细胞相对于不具有降低流量的孔具有降低的进入孔的可能性。
在一些实施方案中，(例如，第一和/或第二无底微米孔阵列或者第一和/或第二孔阵列的)25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、或者90％或更多的孔装载有单细胞。在一些实施方案中，约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的孔装载有单细胞。
在一些实施方案中，(例如，第一和/或第二无底微米孔阵列或者第一和/或第二孔阵列的)25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、或者90％或更多的孔装载有单珠。在一些实施方案中，约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的孔装载有单珠。
在一些实施方案中，(例如，第一和/或第二无底微米孔阵列或者第一和/或第二孔阵列的)25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、或者90％或更多的孔装载有单珠和单细胞。在一些实施方案中，约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的孔装载有单珠和单细胞。
可以以多种方式使包含细胞和/或珠的流体流过孔。例如且不限于，可通过在阵列的流动方向上施加真空或者在通过阵列的流动方向上对液体施加压力(例如通过对阵列进行离心)来使细胞流过阵列。
在一些实施方案中，使细胞和/或珠流过阵列持续30分钟或更少、25分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、或者10分钟或更少。在一些实施方案中，使细胞和/或珠流过阵列持续1至10分钟，例如，约1至5分钟或1至5分钟。
在一些实施方案中，使细胞和/或珠在20℃至40℃，例如25℃至35℃，例如，约30℃下流过阵列。
在一些实施方案中，流速为0.01至100mL/分钟，例如，0.05至50mL/分钟，例如，0.1至10mL/分钟。在一些实施方案中，流速为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mL/分钟。
珠和/或细胞装载的装置的配置
在一些实施方案中，珠/和或细胞分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)是本文中所述的任何装置。示例性的珠和/或细胞装载装置在图12A至12C中示出。
图12A表示具有与多孔膜接触的第一无底微米孔阵列的分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)，其中该阵列的每个孔均包含珠。图12A是根据某些非限制性实施方案的分层装置400(例如，微流控装置)的截面示意图。所示分层装置400包含接触(例如，结合至，例如，通过热层压)基底402的无底孔阵列404。作为非限制性实例，基底402可包含玻璃、塑料、弹性体(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS))和/或多孔膜。作为非限制性实例，基底402可包含具有良好光学透明度的玻璃或塑料，例如，可用于蛋白质测定和/或组织转录组学。在一些实施方案中，分层装置400的成本为每个制成的阵列小于1美元(U.S.dollar，USD)。在一些实施方案中，通过本文中所述的方法(例如，光刻工艺)，以0.3048m长×0.9144m宽的尺度制造无底孔阵列404，并切割以形成较小的微米孔阵列。微米孔阵列404中的孔(可以是本文中所述的孔)各自包含珠420(可以是本文中所述的珠)。在一些实施方案中，微米孔阵列404中至少70％的孔包含珠。该装置可包含或可不包含珠。应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)和/或可包含任何合适形状(例如，圆柱形、矩形棱柱形、方形棱柱形、椎形或椎体形状)和/或尺寸(例如，最大横向尺寸)的孔。也可以是其他范围。
图12B示出了类似的单层装置，不同之处在于每个孔包含珠和细胞。图12B是根据某些非限制性实施方案的分层装置500(例如，微流控装置)的截面示意图。所示分层装置500包含接触(例如，结合至，例如通过热层压)多孔膜502(例如，可以是本文中所述的多孔膜)的无底孔阵列504。微米孔阵列504中的孔(可以是本文中所述的孔)各自包含珠520(可以是本文中所述的珠)。在一些实施方案中，多孔膜502具有尺寸范围为200nm至3微米或等于200nm和3微米(例如，200nm至400nm)的孔。在一些实施方案中，微米孔阵列504中至少70％的孔包含珠。微米孔阵列504中的一些孔(可以是本文中所述的孔)包含细胞522(可以是本文中所述的细胞)。在一些实施方案中，微米孔阵列504中至少70％的孔包含细胞。该装置可包含或可不包含珠和/或细胞。在一些实施方案中，通过使包含细胞和/或珠的液体在流动方向531上流过微米孔阵列504(例如，通过抽真空通过微米孔阵列)来装载细胞和/或珠。在一些实施方案中，超滤膜508与微米孔阵列504的顶表面507接触(例如，附着、结合)，例如，通过在流动方向531上抽真空。该分层装置500可与全自动液体处理器联合以装载细胞和/或珠。应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)和/或可包含任何合适形状(例如，圆柱形、矩形棱柱形、方形棱柱形、椎形或椎体形状)和/或尺寸(例如，最大横向尺寸)的孔。也可以是其他范围。
在图12C中的配置中，该装置具有双层无底微米孔阵列(例如，第一无底微米孔阵列和第二无底微米孔阵列)，并且还包含与第一无底微米孔阵列的底部结合的多孔膜，其中在底层上孔配置成适合珠(例如，直径为15至100微米)并且在顶层上孔配置成适合细胞(例如，直径为1至10微米)。图12C是根据某些非限制性实施方案的分层装置600(例如，微流控装置)的截面示意图。所示分层装置600包含接触(例如，结合至，例如，通过热层压)第一多孔膜602(可以是本文中所述的多孔膜)和第二多孔膜612(可以是本文中所述的多孔膜)的无底孔阵列604。微米孔阵列604中的孔(可以是本文中所述的孔)各自包含珠620(可以是本文中所述的珠)。在一些实施方案中，第一多孔膜602和/或第二多孔膜612具有尺寸范围为200nm至3微米或等于200nm和3微米(例如，200nm至400nm)的孔。在一些实施方案中，微米孔阵列604中至少70％的孔包含珠。第二多孔膜612接触微米孔阵列614。微米孔阵列614中的孔(可以是本文中所述的孔)各自包含细胞622(可以是本文中所述的细胞)。该装置可包含或可不包含细胞。在一些实施方案中，微米孔阵列614中至少70％的孔包含细胞。所示微米孔阵列614中的每个孔与微米孔阵列604中对应的孔重叠。在一些实施方案中，微米孔阵列614中70％至85％或等于70％和85％的孔与微米孔阵列604中对应的孔重叠(例如，由于两个微米孔阵列的随机对准)。在一些实施方案中，微米孔阵列604和614中孔的最大横向尺寸和间距使得微米孔阵列604中的至多一个孔可与微米孔阵列614中对应的孔重叠。在一些实施方案中，微米孔阵列604的孔的最大横向尺寸为20微米至500微米(例如，50微米)，并且微米孔阵列614的孔的最大横向尺寸为1微米至10微米(例如，5微米)。在一些实施方案中，通过使包含细胞和/或珠的液体在流动方向631上流过分层装置600(例如，通过抽真空通过微米孔阵列)来装载细胞和/或珠。在一些实施方案中，通过以下装载珠：将装置600暴露于包含珠的液体(例如，通过使珠沉降到装置中)，例如，通过使包含珠的液体在流动方向631上流过(例如，通过抽真空通过微米孔阵列604，通过对阵列进行离心)分层装置600的一部分，所述分层装置600的一部分包含多孔膜602和微米孔阵列604但不包含其他所示组件。然后，在一些实施方案中，将第二多孔膜612和微米孔阵列614如分层装置600中所示定位(例如，结合在一起)。在一些实施方案中，通过使包含细胞的液体在流动方向631上流动(例如，通过抽真空通过分层装置600)来装载细胞。不受理论的束缚，认为一旦细胞装载到孔中，其将阻塞孔的基底，消除通过孔的通量并由此阻止第二个细胞装载。在一些实施方案中，例如，通过在流动方向631上抽真空使超滤膜608与分层装置600的顶表面607接触(例如，附着、结合)。该分层装置600可与全自动液体处理器联合以装载细胞和/或珠。应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)和/或可包含任何合适形状(例如，圆柱形、矩形棱柱形、方形棱柱形、椎形或椎体形状)和/或尺寸(例如，最大横向尺寸)的孔。也可以是其他范围。在一些实施方案中，细胞被裂解，并且在裂解之后，每个细胞的内容物从微米孔阵列614中的孔扩散到微米孔阵列604中对应的相邻孔中，其可能包含珠(例如，微米孔阵列604中70％或更多的孔包含珠)。
为了制造这样的阵列，在一些实施方案中，使用本文中所述的方法，通过使包含多个珠的第一流体流过该装置，使与底表面上的第一多孔膜结合的第一无底微米孔阵列装载珠。然后使用本文中所述的方法将第二无底微米孔阵列密封至装载珠的第一无底微米孔阵列，并随后通过使用本文中所述的方法使包含多个细胞的第二流体流过该装置来使第二无底微米孔阵列装载细胞。
在图12D的配置中，该装置具有双层无底微米孔阵列(例如，第一无底微米孔阵列和第二无底微米孔阵列)，并且还包含与第一无底微米孔阵列的底部结合的多孔膜，其中在底层上孔配置成适合细胞(例如，直径为1至10微米)并且在顶层上孔配置成适合细胞(例如，直径为15至100微米)。图12D是根据某些非限制性实施方案的分层装置700(例如，微流控装置)的截面示意图。所示分层装置700包含接触(例如，结合至，例如，通过热层压)第一多孔膜702(可以是本文中所述的多孔膜)的第一无底孔阵列714，和第二无底孔阵列704。在一些实施方案中，第一多孔膜702具有尺寸范围为200nm至3微米或等于200nm和3微米(例如，200nm至400nm)的孔。在一些实施方案中，第二无底孔阵列704接触(例如，结合至，例如，通过热层压)超滤膜708。微米孔阵列714中的孔(可以是本文中所述的孔)各自包含细胞722(可以是本文中所述的细胞)。微米孔阵列704中的孔(可以是本文中所述的孔)各自包含珠720(可以是本文中所述的珠)。分层装置700可包含或可不包含珠和/或细胞。在一些实施方案中，微米孔阵列714中至少70％的孔包含细胞。在一些实施方案中，微米孔阵列704中至少70％的孔包含珠。所示微米孔阵列714中的每个孔与微米孔阵列704中对应的孔重叠。在一些实施方案中，微米孔阵列714中70％至85％或等于70％和85％的孔与微米孔阵列704中对应的孔重叠(例如，由于两个微米孔阵列的随机对准)。在一些实施方案中，微米孔阵列704和714中孔的最大横向尺寸和间距使得微米孔阵列704中至多一个孔可与微米孔阵列714中对应的孔重叠。在一些实施方案中，通过使包含细胞和/或珠的液体在流动方向731上流过分层装置700(例如，通过抽真空通过微米孔阵列)来装载细胞和/或珠。在一些实施方案中，通过使包含细胞的液体在流动方向731上流动(例如，通过抽真空通过分层装置700)来装载细胞。不受理论的束缚，认为在一些实施方案中，一旦细胞装载到孔中，其阻塞孔的基底，消除通过孔的通量并由此阻止第二个细胞装载。在一些实施方案中，然后珠通过以下装载：将装置700暴露于包含珠的液体(例如，通过使珠沉降到装置中)，例如，通过使包含珠的液体在流动方向731上流过分层装置700(例如，通过抽真空通过分层装置700)。在一些实施方案中，例如，通过在流动方向731上抽真空使超滤膜708与分层装置700的顶表面接触(例如，附着、结合)。该分层装置700可与全自动液体处理器联合以装载细胞和/或珠。应理解，阵列可在一维或二维上包含任何合适数目的孔(例如，1、10、100、1000或更多个孔)和/或可包含任何合适形状(例如，圆柱形、矩形棱柱形、方形棱柱形、椎形或椎体形状)和/或尺寸(例如，最大横向尺寸)的孔。也可以是其他范围。在一些实施方案中，细胞被裂解，并且在裂解之后，每个细胞的内容物从微米孔阵列714中的孔扩散到微米孔阵列704中对应的相邻孔中，其可能包含珠(例如，微米孔阵列704中70％或更多的孔包含珠)。
单细胞的表征
本文中所述的装载细胞和/或装载珠的分层装置(例如，微流控装置，孔阵列，例如，包含光致抗蚀剂干膜)可用于多种类型的单细胞生物化学分析。例如，横向装置可用于高通量生物化学分析，例如，在孔中进行的细胞裂解，以及随后进行一个或更多个RT-PCR、RNA-seq、PCR、qPCR、DNA-seq、质谱、ATAC-seq、亚硫酸氢盐测序、免疫PCR、原位测序、滚环扩增、原位杂交、邻近延伸测定、免疫荧光、ELISA、反向ELISA、多重置换反应、DNA酶超敏反应、chip-seq、或使用本领域中已知的方法与常规阵列一起用于单细胞分析的任何其他基因组测定(例如，如在PCT US17/13719或WO 2018/132635中描述的，其每一个的全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是灵长类细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，细胞是非哺乳动物细胞并且可以是原核细胞或其他真核细胞。细胞(或核酸来源)可以是天然存在的，或者其可以是非天然存在的。非天然存在的核酸的一个实例是合成产生的细胞。
在一些实施方案中，在分层装置装载细胞和/或珠之后，将其在顶表面上用多孔膜(例如，本文中所述的超滤膜)密封。膜使用本文中所述的方法(例如，用加热压力机或PCR机器)或者通过以下来密封：使膜与分层装置的顶部接触，将固体表面(例如，载玻片)放置在膜的顶部，并将分层装置夹在载片上。在一些实施方案中，将分层装置夹在载片上30分钟或更多，例如，30分钟至2小时，例如，约1小时。
在一些实施方案中，通过向分层装置的顶部施加裂解缓冲液来裂解横向装置内的细胞。示例性的裂解缓冲液是本领域已知的并且包括盐酸胍。细胞在横向装置内裂解，并且膜将细胞的内容物保留在横向装置内，同时裂解缓冲液可被洗掉。
在一些实施方案中，所述方法还包括对裂解细胞的蛋白质和/或核酸进行分析。
在一些实施方案中，然后分离每个细胞的单细胞转录组。这通过首先捕获由驻留在孔中的条码珠上的裂解细胞释放的mRNA分子来完成。捕获之后，在创建来自每个单细胞的cDNA文库的过程中，将珠的(以及因此孔的)独特条码并入到使用捕获的mRNA转录物(并因此与之互补)的逆转录合成的第一链cDNA中。因此，珠条码对来自同一单细胞的所有捕获的转录物进行相同地标记(或标注)。然后可将条码化cDNA文库进行组合，其中每个cDNA标记有其单细胞来源，并且可进行全转录物组扩增(WTA)，并随后测序。
一些示例性实施方案
本文中提供了可使用可扩展的制造方法制造的独立式光致抗蚀剂膜和制造该膜的方法。传统上，光致抗蚀剂膜制造在基底上，该基底为光致抗蚀剂提供支持使得光致抗蚀剂的液体涂层可涂覆在该基底上。为了使用传统方法制造独立式光致抗蚀剂膜，光致抗蚀剂膜与基底分离或从基底“剥离”，这需要繁琐的过程并且不可扩展。本文中提供的方法克服了这些限制。
本文中提供了制造独立式光致抗蚀剂膜的方法。所述方法可包括数个步骤，例如用光掩模层压光致抗蚀剂膜，通过光掩模暴露光致抗蚀剂膜以加强光致抗蚀剂的一部分，去除光致抗蚀剂的未加强部分(显影步骤)，以及从光掩模分离光致抗蚀剂膜。光致抗蚀剂膜可以是负性或正性光致抗蚀剂膜，并且根据光致抗蚀剂的类型，可使用合适的光源例如电子束、紫外光(UV)或其他短波长光源用于加强。本文中所述的光掩模可包含多个特征，包括但不限于重复特征、非重复特征、实心特征、阴影特征、阵列(例如，圆形、方形、矩形、卵形、三角形和五边形的阵列)、字母和图。如本文中所用的，术语“特征距离”是指(i)特征边缘之间的距离和(ii)特征边缘与光掩模边缘之间的距离二者。
因此，本文中所述的一些光掩模的最大特征距离不多于5、4、3、2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1mm，并且本文中所述的一些光掩模的最大特征距离不小于3、2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.1或0.01mm。在一些情况下，光掩模的最大特征距离为约2、1.5或1mm。在暴露过程期间，光掩模可覆盖光致抗蚀剂膜表面或光致抗蚀剂膜暴露表面的最小百分比。例如，光掩模可覆盖表面的至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。又例如，光掩模可覆盖光致抗蚀剂膜的整个表面或整个暴露表面。此外，一些光掩模可具有如下特征覆盖范围：最大百分比的光致抗蚀剂膜表面暴露于光源，即，对于负性光致抗蚀剂，最大百分比的光致抗蚀剂表面被加强。例如，光致抗蚀剂的加强部分可以为按表面积计光致抗蚀剂的至多25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％或75％。
光致抗蚀剂膜和光掩模的层压制品可暴露于来自预选来源的一种或更多种类型的辐射或光持续足以加强膜的时间，从而形成具有加强部分和一些未加强部分的光致抗蚀剂膜。对于负性光致抗蚀剂膜，加强可涉及聚合或交联以分别产生聚合或交联的部分。加强部分显著地对溶解剂具有抗性，并因此在显影过程期间将不被去除。在显影步骤期间，光致抗蚀剂被显影并去除未加强部分，例如，通过在溶解剂中将其溶解。该制造方法可包括分离步骤，其中从光掩模分离光致抗蚀剂膜。分离可与显影步骤同时发生或在显影步骤之后发生，并且其可自然发生或通过操作发生。在一些实施方案中，当光致抗蚀剂被显影时，分离自然发生。应当注意，本领域技术人员将理解的是，对于正性光致抗蚀剂膜，暴露部分可变成可溶的并且在显影步骤期间去除。所述方法还可包括从光致抗蚀剂移除释放衬垫。释放衬垫可在层压之后例如，在暴露步骤或显影步骤之前或之后去除。
在一个方面，本文中提供了包含光致抗蚀剂膜和光掩模的无基底双层层压制品，由该层压制品可产生独立式光致抗蚀剂膜。在暴露之后，光致抗蚀剂膜可包含加强部分和未加强部分，并且加强部分显著地对在显影过程中使用的溶解剂具有抗性。在与溶解剂接触之后，未加强部分溶解以形成图案，例如，多个通孔。通孔可占据按表面积计光致抗蚀剂的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、75％、80％、85％或90％。
光致抗蚀剂膜可包含顶表面和底表面，并且其可包含加强(例如，交联)部分和未加强(例如，未交联)部分。对于一些光致抗蚀剂膜，未加强(例如，未交联)部分可在溶解剂(或显影剂)中去除以形成从顶表面至底表面的多个通孔，并且每个孔在顶表面上具有顶部开口并且在底表面上具有底部开口。通常来说，在显影阶段期间，可通过显影剂去除光致抗蚀剂的未加强部分，从而在光致抗蚀剂上形成图案，例如，多个六边形填充的通孔。
一些光致抗蚀剂膜的厚度可以为至少或至多0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500微米。多个通孔可具有顶部开口的平均直径和底部开口的平均直径；两个平均直径可相同或不同。一些光致抗蚀剂膜的顶部开口、底部开口或两个开口的平均直径为至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200或500微米。一些光致抗蚀剂膜的顶部开口、底部开口或两个开口的平均直径为至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200或500微米。顶部开口的几何形状和底部开口的几何形状可选自方形、圆形、矩形、三角形、五边形、六边形、七边形、八边形或其他几何形状。另外，光致抗蚀剂膜的多个通孔的形状可以为圆柱体、立方体、长方体、椎体、三角形棱锥、方形棱锥或三角形棱柱。此外，光致抗蚀剂的通孔的壁可包含功能性壁表面，例如，PCT/US17/13791中描述的那些，其通过引用在此以其整体并入。对于一些应用，通孔的尺寸和形状配置成每个通孔容纳一个细胞或一个珠。
通过本文中所述的方法制备的光致抗蚀剂膜可用于多种应用。例如，皮米孔、微孔或无底微米孔阵列可包含独立式光致抗蚀剂膜或是独立式光致抗蚀剂膜。在一个方面，微孔装置可包含光致抗蚀剂膜和多孔底膜。多孔底膜可与光致抗蚀剂膜的底表面接触。微孔装置还可包含平行的两个光致抗蚀剂膜(第一光致抗蚀剂膜和第二光致抗蚀剂膜)，任选地彼此结合，其中第二光致抗蚀剂膜的底表面面向第一光致抗蚀剂膜的顶表面。两个光致抗蚀剂膜的通孔的尺寸可相同或不同；例如，第一膜的通孔可大于或小于第二膜的通孔，并且它们可具有相同或不同的形状和几何结构。一些装置可在第一与第二光致抗蚀剂膜之间包含多孔膜；并且一些装置可在第二光致抗蚀剂膜的顶表面上包含实心或多孔的膜。
所述多孔膜可具有期望的膜通量。例如，多孔膜的通量率可以为至少0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的，所述水可预先过滤或未过滤。又例如，多孔膜的通量率可以为至多0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或200mL/分钟/cm2，如通过以10psi的初始水通量率测量的。多孔膜可以是干膜的膜或基于水凝胶的膜。
多孔膜可配置成保留目的对象，例如细胞、珠、基因组、核酸、病毒、细胞核、蛋白质、肽或其他生物大分子。细胞可以是细菌、植物或动物(例如，哺乳动物)细胞。细胞可以是血细胞，例如白细胞(例如，单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞)、红细胞(红血球)或血小板。可适用于血细胞分析的一些方法在PCT/US2018/013443中进行了描述，其通过引用在此以其整体并入。细胞也可以是健康细胞或不健康细胞(例如，受感染细胞或肿瘤细胞)。因此，根据应用，多孔膜的平均孔径可以为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500或1000nm。多孔膜的平均孔径还可以为至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000或5000nm。
微孔装置还可容纳与光致抗蚀剂膜的顶表面接触的组织部分。微孔装置还可在通孔中包含珠(预先装载的(例如，每个通孔一个或更多个珠)或者在细胞之后装载的)和/或细胞。
在一个方面，本文中提供了包含光致抗蚀剂膜的无底微米孔阵列。微米孔阵列可包含顶表面、底表面和从顶表面至底表面的多个通孔，其中每个孔在顶表面上具有顶部开口并且在底表面上具有底部开口。本文中还提供了使用无底微米孔阵列的方法，无论该阵列是否包含光致抗蚀剂膜。
在一个方面，本文中提供了细胞装载的方法。该方法可包括使包含多个细胞的流体样品流过微阵列装置，该装置包含无底微米孔阵列和与微米孔阵列的底表面接触的多孔底膜。细胞装载的方法可包括通过重力装载细胞或者从多个通孔中的至少一个通孔的顶部开口到底部开口施加压力梯度，从而将单细胞装载到所述至少一个通孔中。压力梯度可通过任何方式(包括施加真空或迫使流体流动)产生。该方法可包括通过施加压力梯度将细胞保留在所述至少一个通孔的底部。当细胞保留在通孔的底部时，通孔内的压力梯度可降低，例如，降低至不足以引起第二个细胞装载的水平以使得每个孔装载仅单细胞。所述方法还可包括在保留细胞的同时将微米孔阵列倒置，使得可例如，通过流体流去除未装载的细胞，并且可保留装载细胞。所述方法还可包括当倒置微米孔阵列时清洗细胞或微米孔阵列。另外，所述方法还可包括使倒置的微米孔阵列反转，并且在反转之后，可任选地去除压力梯度。使用细胞装载方法，多个通孔的至少一部分可以是每个通孔装载单细胞。
在一个方面，本文中提供了培养或储存分离的细胞的方法。所述方法可包括使包含多个细胞的流体样品流过微阵列装置。所述方法还可包括通过重力或通过施加压力梯度将多个细胞中的至少一个细胞装载到通孔中。所述方法还可包括使介质流过微米孔阵列和/或将微米孔阵列浸没在介质中，使得多个通孔的至少一部分通过顶部开口、底部开口或这两种开口与介质流体连接。介质可以是缓冲液、细胞培养基或固定剂。对于一些应用，可在微米孔阵列的顶表面上方施加多孔顶膜。对于某些应用例如测序，所述方法可包括使包含多个珠的流体样品流过微米孔阵列。该方法还可包括在温度下储存微阵列多于一天、一周、一个月、6个月或一年，并且所述温度可以是环境温度或者低于或高于40℃、30℃、20℃、10℃、0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃的任何温度。
在一个方面，本文中提供了对组织切片进行分析的方法，例如，对组织切片中的转录物进行空间定位。该方法可包括使组织切片与微阵列装置接触，所述微阵列装置包含无底微米孔阵列(例如，光致抗蚀剂膜)和与微米孔阵列的底表面接触的多孔底膜。多个通孔的一部分可包含一个或更多个条码化转录物捕获珠，和/或包含在微阵列上具有已知位置的独特空间条码的一个或更多个功能表面。该方法可包括在组织附着于微米孔阵列之前或之后使通孔水合。对于一些装置，可通过在附着组织切片之前使通孔水合来实现更好的水合作用。所述方法还可包括从转录物产生cDNA序列，和/或通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：空间条码杂交分子。该方法还可包括将cDNA中的珠条码与珠条码：空间条码杂合分子相匹配，从而在微阵列上对转录物进行定位。
应当注意的是，技术人员将理解使用和组装该装置的多种方法；可在该装置完全组装之前或之后将样品(例如细胞或组织)附着于或装载到装置中。以组织切片分析为例，作为上述方法的替代方法之一，可将组织附着于无底微米孔阵列的顶表面，然后在有或没有珠的情况下进行水合作用，并随后可向微米孔阵列的底表面施加多孔膜。如果没有预先装载珠，则其可在附着底部多孔膜之前装载。类似的原理适用于其他样品，例如细胞和珠。当装置包含两个或更多个光致抗蚀剂膜或者两个或更多个多孔膜时，装置和样品的组装顺序也可根据样品的类型和用途而变化；所有均由本公开内容所涵盖。
在一个方面，单细胞分析试剂盒可包含一个或更多个微阵列，每个微阵列包含光致抗蚀剂膜和至少一个多孔膜。试剂盒可包含另外的组件，包括但不限于第二多孔膜、膜施加器、微阵列保持器、膜框架、杂交室板、缓冲液、细胞培养基、固定剂、珠、手动夹具、拥挤试剂、DNA聚合酶、热循环仪适配件、或其任意组合。在一些试剂盒中，将珠预先装载在一个或更多个微阵列中，例如，每个通孔一个珠。
试剂盒
在一些情况下，可期望降低与准备用于分析的样品相关的手动处理和操作的量。这可有助于降低与处理样品相关的时间量以及降低用于处理样品的成本二者。例如，可将包含用于处理样品的组件的试剂盒提供给从业者用于装载多个用于批量处理的微米孔阵列。尽管任何数目的不同方法和试剂盒可用于这样的应用，但以下进一步详述了试剂盒及其用途的可能的一些实施方案。
图14表示用于处理生物样品的试剂盒的一个实施方案。试剂盒可包含一个或更多个基板700、膜板702(其可包含一个或更多个膜)、杂交板704、盖706、收集板708、杂交缓冲液710、裂解缓冲液712，其组合和/或任何其他合适的组件或溶液。在一些实施方案中，试剂盒可还包含使用该试剂盒来处理生物样品的书面说明。
图15和16举例说明了基板700的两个可能的实施方案。基板可包含在基板表面(例如，顶表面)中形成的多个容器。每个容器的尺寸和形状可设置为在其中接收微米孔阵列。例如，如图15中所示，容器可以是在基板的顶表面中形成的凹部(depression)714使得每个容器包含在其上可设置单独的微米孔阵列的底表面。在一些情况下，凹部可足够深以使得微米孔阵列在容器内被完全接收。这样的一个实施方案可用于具有闭合底部的微米孔阵列，其中单独的孔不会一直延伸通过阵列。在另一个实施方案中，基板可包含为多个通孔716和周围唇状物718形式的容器。单独的通孔和唇状物的尺寸和形状可设置为在其中既接收又支持微米孔阵列。在这样的一个实施方案中，设置在基板中的微米孔阵列的底表面可通过通孔的底部开口暴露于环境。这样的一个实施方案可用于其中微米孔阵列包含完全延伸通过如先前所讨论的阵列的微孔的应用中。然而，还考虑了其中这些分离的基板与具有和/或不具有完全延伸通过阵列的微孔的不同类型微米孔阵列一起使用的一些实施方案，因为本公开内容不限于此。
图17示出了包含一个或更多个膜722的膜板的一个可能的实施方案，所述膜722配置成附着于基板的表面以使得其覆盖基板中形成的多个容器。在一些情况下，这可简单地对应于可附着于基板的单膜片。然而，在一些情况下，可期望为所述一个或更多个膜提供支持和/或帮助使多个容器彼此分离。例如，膜板可包含具有多个肋状物(rib)720a或其他结构的框架720，其上设置并附着所述一个或更多个膜。此外，如图所示，布置肋状物或其他结构使得当设置在包含容器的基板的表面上时，其围绕基板单独的容器的外围。当与基板适当结合时，膜板可阻止单独的容器之间通过膜板自身流动，同时仍允许流体通过一个或更多个膜的分离部分流体连通到容器中的阵列中并且流体连通出容器中的阵列。
图18和19举例说明了杂交板704的两个可能的实施方案。在两个实施方案中，杂交板包含具有在其中形成的开口724的板704a。开口可分布在整个板上以使得当杂交板与上述基板组装时，单独的开口与分离容器流体连通。在一些实施方案中，杂交板可包含唇状物704b，所述唇状物704b围绕板的外围，并在从板的外围垂直向外的方向上延伸。唇状物的尺寸和形状可设置为当杂交板组装到那时，围绕基板的对应外周，如以下进一步描述的。在图18的实施方案中，杂交板可包含设置在板的内表面上的为黏合剂垫圈(gasket)形式的黏合剂726，所述黏合剂垫圈旨在抵靠其中形成容器的基板的表面设置。黏合剂垫圈可构造成使得其与膜板框架的一部分和/或另一种适当的结构接合，以帮助在杂交板的内表面与所述一个或更多个膜之间形成单独分离的体积，使得每个体积与基板的单独容器和其中包含的阵列流体连通。这些单独体积中的每一个还与杂交板中形成的至少一个开口流体连接，以允许向单独的容器引入流体用于微米孔阵列的处理。图19示出了杂交板的另一个实施方案，其中使用机械干涉配合(例如，可与在基板中形成的凹槽(recess)接合的突出部(tab)728)将杂交板附着于基板。在这样的一个实施方案中，单独的体积可由存在于杂交板和/或膜板上的适当对应的唇状物、垫圈和/或任何其他适当的结构形成以形成与单独容器和阵列相关的上述分离的体积，因为本公开内容不限于此。
尽管以上已讨论了杂交板的一些具体实施方案和用于将杂交板附着于基板的方法，但是应理解，本公开内容不限于这些特定的构造和方法。例如，可使用任何适当的方法将杂交板附着于基板，所述方法包括但不限于螺纹紧固件、夹具、黏合剂、机械干涉配合和/或任何其他适当的技术，因为本公开内容不限于这种方式。
图20A和20B示出了用于样品收集的装置和方法的一个实施方案。在所示的实施方案中，将杂交室800结合到其中形成多个微孔的微米孔阵列800的顶表面上。可使用任何适当的方法和/或材料将杂交室结合至阵列。然而，在一些实施方案中，用疏水性黏合剂可有益于将杂交室结合到阵列上。由于所示的杂交室没有完全围绕阵列，因此阵列可包含闭合的底表面，使得微米孔阵列仅部分地延伸通过阵列。杂交室可包含内表面，所述内表面在杂交室的内表面802a与阵列之间形成内部体积。可通过移液管806或其他合适的流体分配装置通过从杂交室的外表面向内表面延伸的开口804引入液体。因此，可使用所示的组合体将样品注入并进行初始处理。
图21示出了杂交室808的另一个实施方案。在该具体实施方案中，杂交室包含第一主体部分810和第二主体部分812。第一和第二主体部分通过铰合部814连接，所述铰合部814可以是任何适当的结构，其包含活动铰合部和附着于主体部分和/或包覆成型(overmold)到主体部分中的单独形成的铰合部二者。适当的连接件822(例如所示的突出部和槽(slot)配置)可用于选择性地将第一和第二主体部分相对于彼此保持在闭合配置中。第一和第二主体部分可包含内表面，其适当地构造成在第一和第二主体部分处于彼此相对设置的闭合配置中时，在第一和第二主体部分之间形成室816。室的尺寸和形状可设置为接受包含多个微孔的阵列。在一些情况下，微孔可完全延伸通过阵列。室可还包含围绕室外周的垫圈820以在闭合时密封室。另外，类似于以上实施方案，可在第一和/或第二主体部分中形成开口818，以便引入液体并从室去除液体用于初始样品处理。
不管所使用的具体杂交室如何，一旦将阵列适当地放置在杂交室中和/或与杂交室结合，就可通过引入期望的缓冲液或其他溶液持续期望的持续时间来使阵列水合。然后可在引入适当缓冲细胞之前抽吸杂交室，所述细胞通过室开口引入到杂交室中。细胞可在杂交室中保留适当的持续时间以确保阵列的大多数或基本上所有微孔已在其中接收了细胞。然后可再次抽吸杂交室，并且可向杂交室引入缓冲固定剂。根据具体应用，然后可将杂交室旋转干燥和/或可将张贴物(sticker)、塞子或其他密封件放置在杂交室开口中和/或上方，用于保持在阵列内的生物样品(即细胞)的后续使用和处理。
在收集许多样品之后，可期望一次处理多个阵列。使用先前描述的试剂盒在图22中示出了这样的过程。最初，可将多个微米孔阵列800装载到在基板700中形成的对应的多个容器中，所述基板700构造和布置成支持该阵列。可将单独的膜板702与基板和阵列的第一组合体700a组装使得膜板的一个或更多个膜设置在基板的表面上，所述基板包含将阵列接收在内的容器。在组装状态下，膜板的一个或更多个膜可覆盖多个容器和位于其中的阵列。如前所述，膜板可包含用于将容器彼此分离的适当结构以避免容器之间通过膜板的流体连通。在组装之后，可将膜板密封到基板上以形成第二组合体700b。在一些实施方案中，可使用热压力机将膜板密封到基板上。然而，也考虑了其中使用其他密封方法的一些实施方案。例如，如前所述，在其中基板包含由基板中形成的通孔形成的容器的情况可有助于使用真空密封将膜板附着于并密封至基板。然而，可使用任何适当的附着和/或密封方法，因为本公开内容不限于此。
还如图22中所举例说明的，所得包含密封至基板的膜板的第二组合体700b可随后与杂交板704组装。特别地，可对杂交板的内表面进行定位使得其设置在其中膜板设置在杂交板内表面与基板之间的第二组合体上。如前所述，可构造杂交板以在膜板的所述一个或更多个膜与杂交板内表面的对应区域之间形成单独分离的体积。每个单独分离的体积可与基板的单独的各个容器以及设置在其中的阵列处于流体连通。可使用任何合适的方法将杂交板附着于第二组合体以形成第三组合体700c。
一旦形成第三组合体700c，就可对第三组合体中包含的阵列的微孔中包含的生物样品进行任何适当的处理。特别地，多种反应物、缓冲液、溶剂和/或任何其他期望的材料可通过在杂交板中形成的开口输入到单独的体积和相关容器中。这可手动地和/或使用自动化系统完成，因为本公开内容不限于此。例如，细胞裂解、RNA杂交、RT、exo和S3反应均可通过将期望的材料注入到包含阵列的分离的单独容器中而容易地进行。然后可从系统中抽吸材料，同时膜防止保留在阵列中的生物材料在处理期间离开系统。然后可类似地进行下一个处理步骤直至处理完成。
一旦完成了阵列微孔中生物材料的所有处理，杂交板和膜板就可从组合体中移除。阵列800，以及在一些实施方案中所对应的基板700，可放置在相关收集板708上。如前所述，收集板可包含构造和布置成支持单独的阵列和基板的多个凹槽，使得每个阵列以及基板的相关容器与收集板的单凹槽流体连通。因此，可将阵列、基板和收集板的组合体离心，以将阵列的多个微孔中包含的生物材料旋出到收集板的凹槽中。在一些实施方案中，微孔中包含的生物材料可以是与微珠结合的细胞片段，例如DNA和/或RNA片段，尽管也可考虑了其中收集了不同生物材料的一些实施方案。根据所期望的用途，收集板可用适当的盖密封以用于后续使用和/或处理，所述盖的尺寸和形状设置为密封收集板的多个凹槽。或者，所收集的生物材料可简单地从凹槽收集并以任何期望的方式使用。
实施例
实施例1-Seq-well第二链合成方案
0.1M NaOH
TE-10mM Tris，1mM EDTA pH 8.0
TE-0.5％SDS
TE-0.01％吐温(Tween)
RT反应-无TSO
40uL 5×Maxima缓冲液
80uL 30％PEG8000
20uL dNTP
5uL RNA酶抑制剂
10uL Maxima RT(Thermo)
45uL水
第二链合成反应
40uL 5×Maxima缓冲液
80uL 30％PEG8000
20uL dNTP
2uL dN-SMRT寡聚物(1mM)
5uL Klenow Exo-(NEB)
53uL水
dN-S MRT寡聚物
-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGANNNGGNNNB(SEQ ID NO：1)
在标准Seq-well方案的Exo处理之后，在第二次TE-吐温清洗之后开始
1)在抽吸第二次TE-吐温清洗之后，将珠重悬于500uL 0.1M NaOH中
2)在室温下使管旋转5分钟。
3)旋转并吸出上清液
4)在TE-吐温中清洗1×
5)在TE中清洗1×
6)将珠重悬于200uL第二链合成反应物中。
7)在37℃下旋转1小时
8)在TE-吐温中清洗珠2×
9)在TE中清洗1×
10)将珠重悬于200uL水中
11)对珠进行计数
12)继续进行标准WTA方案。
实施例2-用条码微阵列密封皮米孔阵列的空间条码化方案
试剂
空间条码微阵列延伸
原位合成微阵列-80k特征
每个特征是
5’-dT17-空间BC10-CAACTCTGCGTTGATACCACTG-3’(SEQ ID NO：2)
杂交缓冲液-6×SSC、10％甲酰胺、0.01％吐温20、.01mg/mL BSA Klenow exo-Rxn-1×缓冲液2、30uM dNTP、0.2U/uL Klenow Exo-
任选地：6uM德克萨斯红-5-dCTP以显现延伸产物
20×SSC缓冲液
引物
SpatBC寡聚物/56-FAM//iAmMC6T/AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTTG(经HPLC纯化)(SEQ ID NO：3)
0.1M碳酸氢钠缓冲液pH 8.5
NHS-S-S-生物素
Seq-well阵列缀合
标准壳聚糖/天冬氨酸Seq-well纳米孔阵列
EDC((1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)-(Thermo 22980)
NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)-(Thermo)
BupH MES盐水缓冲液pH 4.7(Thermo 28390B)
PBS
链霉亲和素(Biolegend)
60×25加边载玻片(lifter slip)(Electron Microscopy Sciences)
对空间条码进行扩增/测序
Ampure珠(Beckman)
Klenow Exo-(NEB)
Kapa HiFi 2×Master mix(Kapa)
引物
P5-TSO_杂交体-
Figure BDA0002621120660000811
SB_Nextera_引物1-
Figure BDA0002621120660000812
Nextera N7xx-(N701)-
Figure BDA0002621120660000814
Read1CustomSeqB-
Figure BDA0002621120660000813
装置
60℃烘箱
杂交夹具(Agilent)
方案
将寡聚物与可裂解生物素缀合
1.将寡聚物重悬于0.1M碳酸氢钠缓冲液pH8.5中至浓度为200uM
2.每90uL寡聚物溶液，在1.5mL管中测量250ug NHS-S-S-生物素。
3.将NHS-生物素重悬于10uL DMSO中
4.将寡聚物溶液快速添加至生物素交联剂中。
5.在黑暗中孵育＞6小时-ON。前2小时每30分钟轻轻涡旋一次。
6.当寡聚物缀合时，通过在每次清洗之间以1000×g离心1分钟，通过用300uL PBS清洗2x来准备去盐柱(desalting column)。
7.孵育之后，通过去盐柱(100uL/柱)通过进行反应去除未反应的生物素
空间条码微阵列延伸
通常在slide washer上进行
1. 2×SSC清洗2分钟
2.注入200uL杂交缓冲液
3.杂交10分钟
4. 2×SSC清洗
5.注入200uL杂交缓冲液+100nM SPATBC寡聚物
6. 70℃孵育3分钟
7. 25℃孵育1小时
8. 2×SSC清洗
9. 0.2×SSC清洗
10.注入200uL 1×缓冲液2
11.注入200uL Klenow反应物
12. 25℃孵育30分钟
13. 2×SSC清洗
14. 0.2×SSC清洗
15.储存在PBS中多至5天(可能长得多-不干燥)
Seq-well阵列与抗FITC抗体的缀合
16.在尖端盒中在50mL水中清洗阵列
17.在4孔盘中在5mL 1×MES缓冲液中清洗阵列
18.在4孔盘中将阵列浸没在5mL MES缓冲液中的10mg/mL EDC、1mg/mL NHS中
19.在RT下孵育30分钟
20.在尖端盒中在50mL水中清洗阵列2×
21.在尖端盒中在1×PBS中快速清洗1×
22.在阵列顶部上PBS中添加200uL 50ug/mL链霉亲和素
13)任选地：5ug/mL PE-链霉亲和素以显现经缀合的蛋白质层
23.将加边载玻片放置在阵列上
24.在4℃下孵育＞15小时
25.在PBS中清洗2×
转移空间条码
26.在0.1×PBS中清洗Seq-well阵列和延伸的空间条码微阵列
27.将Seq-well阵列放置在杂交夹具中
28.将微阵列放在顶部，阵列朝下，确保没有气泡压在下面。
29.通过拧紧夹具密封阵列
30.在37℃下孵育30分钟以提高密封
31.移除夹具
32.对透射光和FITC荧光通道中的阵列夹层(sandwich)进行成像以记录空间阵列与Seq-well阵列之间的关系
33.在成像时，准备沸水浴
34.在成像之后，将夹层放回夹具中
35.将夹具转移至沸水浴持续3分钟
36.将夹具转移至RT持续1小时
37.打开夹具
38.在显微镜下检查阵列-FITC信号应充满整个孔体积
39.如果是这样的话，将阵列放入50mL PBS中并打开夹层
40.在尖端盒中在PBS中快速清洗2×
41.阵列是空间条码化的
装载细胞
进行功能测定/图像细胞计数
进行标准Seq-well捕获反应直至RT步骤
对空间条码进行扩增和测序
14)
42.根据Seq-well方案进行RT和ExoI步骤。
43.使用相同的PCR混合物进行WTA反应，但仅扩增8个循环(仅在捕获大量条码的情况下才需要)。
cDNA文库的纯化
44.使珠达到室温(30分钟)并偶尔涡旋5至10秒。
45.将一个样品的PCR反应物合并到1.5mL管中(例如，如果对一个样品(又称一个阵列)运行7个PCR反应，则将这些合并在一起用于后续处理)
46.向合并的PCR产物添加0.6×体积的Ampure XP珠
47.孵育5分钟
48.将管放在磁体架上。使珠聚集在磁体上(约1至2分钟)
49.移出上清液并将其放置于干净的管中
50.向带有珠的管添加400uL的80％乙醇
51.向移出的上清液添加1.4×体积的Ampure珠
任选地：为了节省珠，可仅纯化部分上清液
52.孵育5分钟
53.放置在磁体上。使珠聚集在磁体上(约1至2分钟)
54.移出上清液
55.向上清液管添加400uL的80％乙醇
56.使磁体上所有管的位置旋转4×以使珠移动通过管体积
57.移出清洗物
58.重复步骤7至10
59.移出第二清洗物之后，封闭管顶部并放置在离心机中。
60.以最大速度旋转10秒
61.将管放回磁体架中
62.用20uL移液管移出剩余液体
63.孵育5分钟打开以干燥沉淀物(不要超过这个太多，否则珠将不能良好地重悬)
64.从磁体架上移出管
65.向每个管添加15uL H2O
66.将珠完全重悬于水中
67.放回磁体架上
68.将上清液转移至新的PCR管，弃去带有珠的管。
69.添加25uL Kapa HiFi和4uM Seq-well WTA引物。
70.再用8个循环完成WTA产物的扩增。
对空间条码进行扩增
71.稀释上清液部分1∶10、1∶100和1∶1000、1∶10,000
72.对以下PCR混合物进行4次反应：
25uL 2×Kapa HiFi混合物
1uL 40uM P5-TSO_杂交体
1uL 40uM SB_Nextera_引物1
1uL经稀释的上清液部分
22uL水
73.用以下程序对每个稀释物进行扩增
PCR程序
15)95℃ 3分钟
16)以下的15个循环：
17)98℃ 20秒
18)67℃ 20秒
19)72℃ 30分钟
20)然后：
21)4℃永远
74.对以下第二PCR混合物进行4次反应：
22)25uL 2×Kapa HiFi混合物
23)1uL 40uM P5-TSO_杂交体
24)1uL 40uM SB_Nextera N7xx
25)1uL PCR反应物1
26)22uL水
75.用以下程序对每个稀释物进行扩增
PCR程序
27)95℃ 3分钟
28)以下的12个循环：
29)98℃ 20秒
30)67℃ 20秒
31)72℃ 30分钟
32)然后：
33)4℃永远
76.如上所述用2×Ampure珠对反应物进行纯化
77.通过生物分析仪进行分析
78.选择未过度扩增的文库(2至20nM)
a.文库应该是干净的约230至240bp峰
79.MiSeq上的序列如下
读取1-20bp-引物-Read1 CustomSeqB
指数1-8bp-Nextera标准
读取2-40bp-引物-Nextera标准
实施例3-使用在条码寡聚物微阵列上合成的皮米孔阵列的空间条码化方案
试剂
空间条码微阵列功能化
原位合成微阵列-80k特征，未去保护
每个特征是
5’-dT17-空间BC1o-CAACTCTGCGTTGATACCACTG-3’(SEQ ID NO：2)
丙烯酸酯亚磷酰胺(无水乙腈中0.1M)
二氯甲烷(DCM)中的3％三氯乙酸(TCA)
0.3M BTT
THF/吡啶/水中的0.1M碘
最终去保护溶液-乙醇胺∶乙醇1∶1溶液
空间条码微阵列延伸
杂交缓冲液-6×SSC、10％甲酰胺、0.01％吐温20、.01mg/mL BSA Klenow exo-Rxn-1×缓冲液2、30uM dNTP、0.2U/uL Klenow Exo-
任选地：6uM德克萨斯红-5-dCTP以显现延伸产物
20×SSC缓冲液
引物
SpatBC寡聚物
/56-FAM/AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTTG(SEQ ID NO：3)(经HPLC纯化)
皮米孔阵列表面功能化
0.1M乙酸pH 6.0中的0.2％壳聚糖
PBS中的1％BSA
对空间条码进行扩增/测序
Ampure珠(Beckman)
Klenow Exo-(NEB)
Kapa HiFi 2×Master mix(Kapa)
引物
P5-TSO_杂交体-
Figure BDA0002621120660000881
SB_Nextera_引物1-
Figure BDA0002621120660000882
Nextera N7xx-(N701)-
Figure BDA0002621120660000884
Read1 Custo mSeqB-
Figure BDA0002621120660000883
装置
60℃烘箱
杂交夹具(Agilent)
方案
空间条码微阵列丙烯酰基功能化
1.通过用500uL TCA溶液处理阵列2分钟，从在寡聚物上仍包含保护基团的空间条码微阵列中移出DMT
2.用无水DCM清洗
3.在无水小瓶中混合250uL BTT活化试剂和250uL丙烯酸酯溶液
4.添加至顶部微阵列表面
5.孵育10分钟
6.用5mL乙腈清洗2×
7.将阵列浸没到4mL碘溶液中持续2分钟
8.用乙腈清洗2×
9.用乙醇清洗2×
10.在65℃下将阵列浸没到5mL最终去保护溶液持续25分钟。
11.在乙醇中清洗3×
12.在丙酮中清洗1×
13.旋转干燥
空间条码微阵列延伸
通常在slide washer上进行
14. 2×SSC清洗2分钟
15.注入200uL杂交缓冲液
16.杂交10分钟
17. 2×SSC清洗
18.注入200uL杂交缓冲液+100nM SPATBC寡聚物
19. 70℃孵育3分钟
20. 25℃孵育1小时
21. 2×SSC清洗
22. 0.2×SSC清洗
23.注入200uL 1×缓冲液2
24.注入200uL Klenow反应物
25. 25℃孵育30分钟
26. 2×SSC清洗
27. 0.2×SSC清洗
28.储存在PBS中多至5天(可能长得多-不干燥)
使用含丙烯酰基的树脂在微阵列表面上使用3D立体光刻合成皮米孔阵列对皮米孔阵列表面进行功能化
29.将阵列浸没到壳聚糖溶液中2小时
30.用水清洗4×
31.浸没到BSA溶液中
32.放置在真空室中以使皮米孔水合
33.在真空室中摇动孵育过夜
34.放置在PBS中直至使用之前
35.在细胞装载之前转移至RPMI+10％FBS(或等同介质)
装载细胞
进行功能测定/图像细胞计数
进行标准Seq-well捕获反应直至RT步骤
裂解缓冲液将导致双链条码变性。释放的寡聚物将结合条码化的捕获珠。
对空间条码进行扩增和测序
34)
36.根据Seq-well方案进行RT和ExoI步骤。
37.使用相同的PCR混合物进行WTA反应，但仅扩增8个循环(仅在捕获大量条码的情况下才需要)。
cDNA文库的纯化
38.使珠达到室温(30分钟)并偶尔涡旋5至10秒。
39.将一个样品的PCR反应物合并到1.5mL管中(例如，如果对一个样品(又称一个阵列)运行7个PCR反应，则将这些合并在一起用于后续处理)
40.向合并的PCR产物添加0.6×体积的Ampure XP珠
41.孵育5分钟
42.将管放在磁体架上。使珠聚集在磁体上(约1至2分钟)
43.移出上清液并将其放置于干净的管中
44.向带珠的管添加400uL的80％乙醇
45.向移出的上清液添加1.4×体积的Ampure珠
任选地：为了节省珠，可仅纯化部分上清液
46.孵育5分钟
47.放置在磁体上。使珠聚集在磁体上(约1至2分钟)
48.移出上清液
49.向上清液管添加400uL的80％乙醇
50.使磁体上所有管的位置旋转4×，以使珠移动通过管体积
51.移出清洗物
52.重复步骤7至10
53.移出第二次清洗物之后，封闭管顶部并放置在离心机中。
54.以最大速度旋转10秒
55.将管放回磁体架中
56.用20uL移液管移出剩余液体
57.孵育5分钟打开以干燥沉淀物(不要超过这个太多，否则珠将不能良好地重悬)
58.从磁体架上移出管
59.向每个管添加15uL H2O
60.将珠完全重悬于水中
61.放回磁体架上
62.将上清液转移至新的PCR管，弃去带有珠的管。
63.添加25uL Kapa HiFi和4uM Seq-well WTA引物。
64.再用8个循环完成WTA产物的扩增。
对空间条码进行扩增
65.稀释上清液部分1∶10、1∶100和1∶1000、1∶10,000
66.对以下PCR混合物进行4次反应：
25uL 2×Kapa HiFi混合物
1uL 40uM P5-TSO_杂交体
1uL 40uM SB_Nextera_引物1
1uL经稀释的上清液部分
22uL水
67.用以下程序对每个稀释物进行扩增
PCR程序
35)95℃ 3分钟
36)以下的15个循环：
37)98℃ 20秒
38)67℃ 20秒
39)72℃30分钟
40)然后：
41)4℃永远
68.对以下第二PCR混合物进行4次反应：
42)25uL 2×Kapa HiFi混合物
43)1uL 40uM P5-TSO_杂交体
44)1uL 40uM SB_Nextera N7xx
45)1uL PCR反应物1
46)22uL水
69.用以下程序对每个稀释物进行扩增
PCR程序
47)95℃ 3分钟
48)以下的12个循环：
49)98℃ 20秒
50)67℃ 20秒
51)72℃ 30分钟
52)然后：
53)4℃永远
70.如上所述用2×Ampure珠对反应物进行纯化
71.通过生物分析仪进行分析
72.选择未过度扩增的文库(2至20nM)
a.文库应该是干净的约230至240bp峰
73.MiSeq上的序列如下
读取1-20bp-引物-Read1CustomSeqB
指数1-8bp-Nextera标准
读取2-40bp-引物-Nextera标准
实施例4-用于使用干膜光致抗蚀剂层压制品制造具有微米尺寸特征的模板化多孔膜的可扩展方法
目前微流控装置的可扩展制造的实现具有挑战性。大多数研究级装置是通过在模具中用聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物将复制模制的微流控组件蚀刻到硅晶片或光致抗蚀剂中来制造的。PDMS具有使得其适用于微流控装置的数种特性，包括弹性、光学透明度和易用性。然而，由于材料长的固化时间、短的适用期(pot life)和黏度，PDMS装置的规模化制造非常困难。通常来说，为了微流控装置的大规模制造，增选(co-opt)其他系统，包括热塑性塑料的微注射模制或直接在玻璃中蚀刻流体组分。然而，这些技术并不广泛可用并且对可产生的几何形状有限制。此外，其在保持薄装置的同时不能产生弹性装置或具有通孔的装置。本文中提供的新方法已被开发用于微流体特征的可扩展生产，所述新方法可被用来以低成本大规模地制造标准弹性装置，并且可用于制造包含用于单细胞分析的过滤板的新装置(例如，阵列)形式。
本文中所述的方法利用光致抗蚀剂干膜以使用光刻工艺使用膜辊对板(membraneroll-to-plate)制造过程直接在光致抗蚀剂中制造最终的微流体特征。在处于研究或规模化的传统微流控装置制造中，将液体光致抗蚀剂旋转涂覆到基底上，通常是硅晶片。然后使用光刻掩模和UV-暴露来制造光致抗蚀剂中的特征。光掩模限定孔的几何形状和间距。然后将经显影的光致抗蚀剂中的特征复制(使用PDMS或镍用于微注射模制)或用作掩模以将特征蚀刻到基础基底(玻璃微流体)中。在本文中所述的方法中，代替旋转涂覆的液体光致抗蚀剂，使用预先制造的光致抗蚀剂干膜，并且这样的干膜可批量(以100m或更大的卷)购买。将干膜直接层压至没有基础基底的光掩模，暴露于UV光并显影，在膜中产生微流体特征。由于干膜的低成本和规模，光致抗蚀剂中的特征可用作最终的流体特征。该方法不需要昂贵且技术上具有挑战性的微特征的复制。该过程可在加热的膜辊对板过程中用添加的UV光源完成，使得能够使用标准工业膜方法每天制造用于数千个装置的材料。
另一个主要优点是，由于整个膜的性质是光致抗蚀剂，因此微流体特征变成膜中的通孔，使所得产品成为由光设计的高度工程化的多孔无底微米孔阵列。即使在小规模情况下，使用任何微流控制造方法，通孔的产生都众所周知地具有挑战性。本文中所述的方法无需大量努力即可制造通孔。另一个优点是，可将多个光致抗蚀剂膜分开暴露并层压至彼此顶部以产生复杂的3D几何形状。最终，将膜预先制成约多种厚度，包括例如5至500微米，使得极其容易控制特征的厚度，这是传统旋转涂覆所具有的问题。
工程化无底微米孔阵列已用于产生多种形式的单细胞分析装置。在一个实例中，无底微米孔阵列可与标准丙烯酸类塑料片结合并激光切割以制造硬塑料装置，其成本和规模与微注射模制相似，但前期工具和成本却少得多。此外，该方法可延伸到在微流体特征的底部并入生物功能。例如，已制造了这样的装置，其中具有通孔的干膜光致抗蚀剂与DNA微阵列结合以将已知DNA序列放置在每个纳米孔中以用于本文中所公开的空间条码化技术。在另一个实例中，无底微米孔阵列可与弹性体硅酮片结合以制造弹性装置，其中微流体特征的壁是光致抗蚀剂，但是顶部和底部是弹性的，从而重新获得PDMS的优点但维持可扩展性和低成本。
在又一个实例中，通过将工程化无底微米孔阵列与具有小得多的较小孔(例如，80至200nm)的商业膜结合，产生允许通量通过微流体特征的滤器来产生装置。作为一个实例，制造了24孔滤板，其具有排列在与200nm孔膜结合的光致抗蚀剂中的45微米孔。这允许细胞通过真空装载到孔中，以及在通过抽吸装载细胞之后将半孔膜附着于顶表面。这极大地提高了包括用于基因组研究的纳米孔阵列的可用性。
在图10A和10B中示出了示例性配置。图11A和11B分别示出了具有50微米和5微米孔径(直径)的示例性阵列。图13A和13B示出了示例性装载阵列。通过将两个工程化光致抗蚀剂与商业膜结合来制造双层阵列。示例性双层配置在图10C和10D中示出，并且装载配置在图12A和12B中示出。工程化阵列的孔尺寸为7微米和45微米，并且孔的间距设计成使得仅一个7微米孔可与任何给定的45微米孔重叠。当通过抽吸将细胞装载到工程化阵列中时，仅单细胞可适合于小孔，随后该单细胞阻止抽吸力进入较大的45微米孔结构，从而能够将单细胞定向细胞装载到与10微米孔重叠的每个45微米孔中。
定向细胞装载是单细胞基因组学的重大进步，其通常通过孔或微滴的泊松装载实现单细胞分辨率，遗憾的是，这也意味着每十个孔或微滴中仅约1个装载了单细胞，浪费了90％的试剂和装置的表面积。定向细胞装载具有以相同的成本将装置中可分析的细胞数目提高一个数量级的能力。
另一些实施方案
本公开内容的另外的非限制性实施方案如下：
1.孔阵列，其包含：
第一多孔膜，其具有0.1至100mL/分钟/cm2的通量率和/或50nm至3微米的孔径；以及
第一无底微米孔阵列，其包含具有第一多个通孔的光致抗蚀剂干膜；
其中所述第一多孔膜在所述第一无底微米孔阵列的底表面处接触所述第一无底微米孔阵列；
并且其中所述阵列的每个孔包含所述第一多个通孔之一和包含所述第一多孔膜的底表面。
2.实施方案1所述的孔阵列，其中所述阵列还包含在所述第一光致抗蚀剂干膜的顶表面处接触所述第一光致抗蚀剂干膜的第二多孔膜。
3.实施方案2所述的孔阵列，其中所述第二多孔膜是超滤膜。
4.实施方案3所述的孔阵列，其中所述超滤膜的平均孔直径为1nm至200nm。
5.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一光致抗蚀剂干膜与所述第一多孔膜结合。
6.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的间距为20微米至200微米。
7.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的均一深度为5微米至500微米。
8.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔为圆柱形并且均一直径为1微米至500微米(例如，15至100微米或1至10微米)。
9.实施方案1至7中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔为长方体并且最大横向长度为1微米至500微米(例如，15至100微米或1至10微米)。
10.实施方案1至7中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔为椎形并且在顶表面处的均一直径为35微米至100微米，并且在底表面处的均一直径为0.5微米至3微米。
11.实施方案10所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的均一深度为30微米至100微米。
12.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为细胞和/或珠的最大横向尺寸的1至6倍。
13.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为细胞的最大横向尺寸的1至6倍。
14.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为珠的最大横向尺寸的1至6倍。
15.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述第一光致抗蚀剂干膜与所述第一多孔膜直接接触。
15.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中在所述第一光致抗蚀剂干膜的顶表面处孔的总横向面积为所述第一光致抗蚀剂干膜的总横向面积的至少10％。
16.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述阵列还包含第二无底微米孔阵列。
17.实施方案16所述的孔阵列，其中所述第二无底微米孔阵列包含在具有第二多个通孔的第一光致抗蚀剂干膜上方的第二光致抗蚀剂干膜。
18.实施方案16或17所述的孔阵列，其中所述阵列还包含在所述第二无底微米孔阵列上方的第二多孔膜。
19.实施方案18所述的孔阵列，其中所述第二多孔膜与所述第二无底微米孔阵列直接接触。
20.实施方案16至19中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的均一直径为1微米至10微米。
21.实施方案16至20中任一项所述的孔阵列，其中所述第二无底微米孔阵列的孔的均一直径为15微米至100微米。
22.实施方案16至21中任一项所述的孔阵列，其中所述第二无底微米孔阵列与所述第一无底微米孔阵列直接接触。
23.实施方案16至19中任一项所述的孔阵列，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的均一直径为15微米至100微米。
24.实施方案16至19或23中任一项所述的孔阵列，其中所述第二无底微米孔阵列的孔的均一直径为1微米至10微米。
25.实施方案16至24中任一项所述的孔阵列，其中所述阵列还包含在所述第一无底微米孔阵列与所述第二无底微米孔阵列之间的第三多孔膜。
26.实施方案25所述的孔阵列，其中所述第三多孔膜与所述第一无底微米孔阵列和/或所述第二无底微米孔阵列直接接触。
27.实施方案16至26中任一项所述的孔阵列，其中在所述第二光致抗蚀剂干膜的顶表面处孔的总横向面积为所述第二光致抗蚀剂干膜的总横向面积的至少10％。
29.实施方案16至27中任一项所述的孔阵列，其中所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的孔的最大间距为2mm。
30.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述阵列还包含一个或更多个细胞。
31.前述实施方案中任一项所述的孔阵列，其中所述阵列还包含一个或更多个珠。
32.光致抗蚀剂干膜，其包含第一孔阵列，所述第一孔阵列具有15至100微米的最大横向尺寸并且具有通量率为0.1至100mL/分钟/cm2和/或孔径为50nm至3微米的多孔底部。
33.实施方案32所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述多孔底部包含第一多孔膜。
34.实施方案32或33所述的光致抗蚀剂干膜，所述光致抗蚀剂干膜还包含接触所述第一光致抗蚀剂干膜顶表面的第二多孔膜。
35.实施方案32至34中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述光致抗蚀剂干膜与所述第一多孔膜结合。
36.实施方案32至35中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述光致抗蚀剂干膜的间距为20微米至200微米。
37.实施方案32至36中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述光致抗蚀剂干膜的孔的最大间距为2mm。
38.实施方案32至37中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述孔的均一深度为5微米至500微米。
39.实施方案32至38中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述孔为圆柱形，均一直径为1微米至500微米(例如，15至100微米或1至10微米)。
40.实施方案32至38中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述孔为长方体并且最大横向长度为1微米至500微米(例如，15至100微米或1至10微米)。
41.实施方案32至38中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中所述孔为椎形并且在顶表面处均一直径为35微米至100微米，并且在底表面处均一直径为0.5微米至3微米。
42.实施方案41所述的光致抗蚀剂干膜，其中孔的均一深度为30微米至100微米。
43.实施方案32至42中任一项所述的光致抗蚀剂干膜，其中在所述光致抗蚀剂干膜顶表面处孔的总横向面积为所述光致抗蚀剂干膜的总横向面积的至少10％。
44.微流控装置，其包含最大横向尺寸为1至500微米的第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列与(a)最大横向尺寸为1至500微米的第二无底微米孔阵列和(b)第一多孔膜结合。
45.实施方案44所述的微流控装置，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为1至10微米，并且所述第二无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为15至100微米。
46.实施方案45所述的微流控装置，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的间距为20微米至200微米。
47.实施方案45或46所述的微流控装置，其中所述第二无底微米孔阵列的孔的间距为10微米至200微米。
48.实施方案44所述的微流控装置，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为15至100微米，并且所述第二无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为1至10微米。
49.实施方案48所述的微流控装置，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的间距为10微米至200微米。
50.实施方案48或49所述的微流控装置，其中所述第二无底微米孔阵列的孔的间距为20微米至200微米。
51.实施方案44至50中任一项所述的微流控装置，其中所述第一和第二无底微米孔阵列的孔的最大间距为2mm。
52.实施方案44至51中任一项所述的微流控装置，其中在所述第一无底微米孔阵列顶表面处孔的总横向面积为所述第一无底微米孔阵列的总横向面积的至少10％。
53.实施方案44至52中任一项所述的微流控装置，其中在所述第二无底微米孔阵列顶表面处孔的总横向面积为所述第二无底微米孔阵列的总横向面积的至少10％。
54.实施方案44至53中任一项所述的微流控装置，其中所述孔为圆柱形。
55.实施方案44至53中任一项所述的微流控装置，其中所述孔为长方体。
56.实施方案44至53中任一项所述的微流控装置，其中所述阵列的孔为椎形。
57.实施方案44至56中任一项所述的微流控装置，其中所述第一无底微米孔阵列的至少90％的孔中的每一个与所述第二无底微米孔阵列的单孔流体连通。
58.实施方案44至57中任一项所述的微流控装置，其中所述第一和或第二无底微米孔阵列包含光致抗蚀剂干膜。
59.实施方案44至58中任一项所述的微流控装置，其中所述微流控装置还包含接触所述第二无底微米孔阵列的顶表面的第二多孔膜。
60.实施方案44至59中任一项所述的微流控装置，其中所述第一无底微米孔阵列与所述第一多孔膜结合。
61.实施方案44至60中任一项所述的微流控装置，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的均一深度为5微米至500微米。
62.实施方案44至61中任一项所述的微流控装置，其中所述微流控装置还包含位于所述第一和第二无底微米孔阵列之间的第三多孔膜。
63.实施方案62所述的微流控装置，其中所述第二无底微米孔阵列与第三多孔膜结合。
64.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中孔配置成捕获单细胞和/或珠。
65.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述孔以六边形图案布置。
66.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述第一多孔膜的平均孔径为1nm至1000nm(例如，80nm至200nm)。
67.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述第一多孔膜的平均孔径为细胞和/或珠的最大横向尺寸的0.001至0.25倍。
68.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述第一多孔膜的平均孔径为细胞的最大横向尺寸的0.001至0.1倍。
69.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述第一多孔膜的平均孔径为珠的最大横向尺寸的0.001至0.1倍。
70.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述第二多孔膜是超滤膜。
71.实施方案70所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述超滤膜的平均孔直径为1nm至200nm。
72.前述实施方案中任一项所述的孔阵列、光致抗蚀剂干膜或微流控装置，其中所述第三多孔膜的平均孔径为1nm至1000nm(例如，80nm至200nm)。
73.制造包含多个通孔的独立式光致抗蚀剂膜的方法，其包括：
将第一光致抗蚀剂干膜与光掩模对准；
通过所述光掩模将所述第一光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于紫外(UV)光以在所述第一光致抗蚀剂干膜中形成多个第一通孔，从而产生包含多个通孔的第一独立式光致抗蚀剂膜。
73a.实施方案73所述的方法，其中所述包含多个通孔的第一独立式光致抗蚀剂膜包含第一无底微米孔阵列。
73a.实施方案73或73a所述的方法，其中所述方法还包括使所述无底微孔与基础层接触以形成孔阵列，其中所述第一光致抗蚀剂干膜未受基底支持。
74.实施方案73至73b中任一项所述的方法，其中所述基础层包含第一多孔膜。
75.实施方案74所述的方法，其中所述方法还包括将珠装载到所述孔阵列中。
76.实施方案73至75中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述第一无底微米孔阵列或所述孔阵列在其顶表面处与第二多孔膜接触。
77.实施方案76所述的方法，其中所述方法还包括使所述第二多孔膜在其暴露表面处与第二无底微米孔阵列接触(例如，结合、热层压)。
78.实施方案73至75中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述第一无底微米孔阵列在其顶表面处与第二无底微米孔阵列接触。
79.实施方案78所述的方法，其中所述方法还包括将所述第一无底微米孔阵列与所述第二无底微米孔阵列热层压至无底微米孔阵列。
80.实施方案73至79中任一项所述的方法，其中所述第二无底微米孔阵列通过以下产生：
将第二光致抗蚀剂干膜与第二光掩模对准；
通过所述第二光掩模将所述第二光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于UV光以在所述第二光致抗蚀剂干膜中形成多个第二通孔，从而产生第二无底微米孔阵列。
81.实施方案80所述的方法，其还包括将所述第一无底微米孔阵列与所述第二无底微米孔阵列随机对准。
82.实施方案80或81所述的方法，其中通过所述光掩模将所述第一光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于UV光包括从垂直于所述第一光致抗蚀剂干膜表面的方向以0度至45度的角度引导所述UV光，使得所述第一无底微米孔阵列的第一微孔的形状为椎形。
83.实施方案73a至82中任一项所述的方法，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的间距为20微米至200微米。
84.实施方案73a至83中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二无底微米孔阵列的厚度为5微米至500微米。
85.实施方案73a至84中任一项所述的方法，其中所述孔的最大和/或最小横向尺寸为5微米至500微米(例如，45微米、7微米、10微米)。
86.实施方案73a至85中任一项所述的方法，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为1至10微米，并且所述第二无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为15至100微米。
87.实施方案86所述的方法，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的间距为20微米至200微米。
88.实施方案86或87所述的方法，其中所述第二无底微米孔阵列的孔的间距为10微米至200微米。
89.实施方案73a至88中任一项所述的方法，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为15至100微米，并且所述第二无底微米孔阵列的孔的最大横向尺寸为1至10微米。
90.实施方案89所述的方法，其中所述第一无底微米孔阵列的孔的间距为10微米至200微米。
91.实施方案89或90所述的方法，其中所述第二无底微米孔阵列的孔的间距为20微米至200微米。
92.实施方案73至91中任一项所述的方法，其中所述光掩模包含聚合物。
93.实施方案92所述的方法，其中所述光掩模包含聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。
94.实施方案73至93中任一项所述的方法，其中所述光掩模包含任何两个相邻孔之间最大间距为2mm的孔。
95.实施方案73至94中任一项所述的方法，其中所述光掩模包含沿所述光掩模的表面的任何方向上每2mm或更小的特征。
96.实施方案95所述的方法，其中所述光掩模上的特征占所述光掩模面积的至少10％和所述光掩模面积的至多99.9％(例如，50％)。
97.实施方案73b至96中任一项所述的方法，其中所述基础层包含塑料片。
98.实施方案97所述的方法，其中所述塑料片包含丙烯酸类塑料片。
97.实施方案73b至96中任一项所述的方法，其中所述基础层包含DNA微阵列。
100.实施方案73b至96中任一项所述的方法，其中所述基础层包含硅酮弹性体片。
101.实施方案100所述的方法，其中所述硅酮弹性体片包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
102.实施方案7b3至96中任一项所述的方法，其中所述基础层包含多孔膜。
103.实施方案102所述的方法，其中所述多孔膜的通量率为0.1至100mL/分钟/cm2和/或孔径为50nm至3微米。
104.实施方案73至103中任一项所述的方法，其还包括将所述第一光致抗蚀剂干膜的表面直接层压至所述光掩模，任选地在没有基础支撑物的情况下。
105.实施方案104所述的方法，其还包括从所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的表面移除释放衬垫(例如，聚烯烃释放衬垫)。
106.实施方案105所述的方法，其还包括在紧临层压之前移除所述释放衬垫。
107.实施方案104至106中任一项所述的方法，其中将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的表面直接层压至所述第一和/或第二光掩模包括使所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的表面与所述第一和/或第二光掩模的表面接触；以及
将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模暴露于60摄氏度至80摄氏度(例如，65摄氏度)的温度下持续足以使所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的表面与所述第一和/或第二光掩模的表面结合的持续时间。
108.实施方案104至107中任一项所述的方法，其中将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的表面直接层压至所述第一和/或第二光掩模包括以0.1m/分钟至0.5m/分钟(例如，0.3048m/分钟＝1ft/分钟)的速率将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜直接热层压至所述第一和/或第二光掩模。
109.实施方案73至108中任一项所述的方法，其中通过所述第一和/或第二光掩模将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于紫外(UV)光持续1分钟至10分钟(例如，2.5分钟)的时间段。
110.实施方案73至109中任一项所述的方法，其还包括将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模暴露于80摄氏度至100摄氏度(例如，95摄氏度)的温度下持续足以使通过所述第一和/或第二光掩模暴露于UV光的所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的至少一部分交联的持续时间。
111.实施方案73至110中任一项所述的方法，其还包括将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模暴露于80摄氏度至100摄氏度(例如，95摄氏度)的温度下持续1分钟至30分钟(例如，15分钟)的时间段。
112.实施方案73至111中任一项所述的方法，其还包括以下方法，所述方法还包括将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模暴露于15摄氏度至25摄氏度(例如，20摄氏度)的温度下持续足以使所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模冷却至所述温度的持续时间。
113.实施方案112所述的方法，其中将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模暴露于15摄氏度至25摄氏度(例如，20摄氏度)的温度下持续30分钟至90分钟(例如，60分钟)的时间段。
114.实施方案73至113中任一项所述的方法，其还包括将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模暴露于显影溶液持续足以从所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜去除所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜的任何未交联部分的持续时间。
115.实施方案114所述的方法，其中将所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜和所述第一和/或第二光掩模暴露于显影溶液持续10分钟至30分钟(例如，20分钟)的时间段。
116.实施方案114或115所述的方法，其中所述显影溶液包含显影溶剂(例如，环己醇、环己酮)。
117.实施方案73至116中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述显影溶液中从所述光掩模脱层所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜。
118.实施方案73至118中任一项所述的方法，其还包括清洗经显影的第一和/或第二光致抗蚀剂干膜。
119.实施方案119所述的方法，其中将所述经显影的第一和/或第二光致抗蚀剂干膜在异丙醇中清洗足以从所述第一和/或第二光致抗蚀剂干膜去除残余显影溶液的持续时间。
120.实施方案118或119所述的方法，-所述方法包括将所述经显影的第一和/或第二光致抗蚀剂干膜在异丙醇中清洗1分钟至10分钟(例如，5分钟)的时间段。
121.实施方案73至120中任一项所述的方法，其还包括将所述经显影的第一和/或第二光致抗蚀剂干膜空气干燥。
122.实施方案73至121中任一项所述的方法，其还包括使所述基础层与所述包含多个通孔(例如，第一无底微米孔阵列)的第一独立式光致抗蚀剂膜的底表面结合(例如，通过黏合剂、通过热层压)。
123.实施方案122所述的方法，其中将所述基础层层压至所述第一无底微米孔阵列的底表面。(例如，在其中所述基础层包含多孔膜的一些实施方案中)。
124.实施方案73b至123中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述第一无底微米孔阵列和所述基础层封闭在壳体中。
125.实施方案124所述的方法，其中所述壳体包含聚苯乙烯。
126.包括以下的方法：
使包含多个细胞和/或多个珠的第一流体流过：
(i)实施方案1至31或64至72中任一项所述的孔阵列；
(ii)实施方案32至43或64至72中任一项所述的光致抗蚀剂干膜；或者
(iii)实施方案44至72中任一项所述的微流控装置，
从而形成装载细胞和/或装载珠的微米孔阵列。
126a.实施方案126所述的方法，其中所述装载细胞的阵列是超泊松装载。
127.实施方案126或126a所述的方法，其中所述装载珠的阵列是超泊松装载。
128.实施方案126至127中任一项所述的方法，其中使所述第一液体流动包括使液体以0.1至10mL/分钟的流速流过所述阵列。
129.实施方案126至128中任一项所述的方法，其中所述第一液体在室温下流过所述阵列。
130.实施方案126至129中任一项所述的方法，其中所述第一液体流过所述阵列持续1至5分钟。
131.实施方案126至130中任一项所述的方法，其中使所述第一液体流动包括在通过所述阵列的流动方向上施加真空。
132.实施方案126至131中任一项所述的方法，其中使所述第一液体流动包括在通过所述阵列的流动方向上向所述液体施加压力。
133.实施方案126至132中任一项所述的方法，其中使所述第一液体流动包括对所述阵列进行离心。
134.实施方案126至133中任一项所述的方法，其中85％的孔被单细胞占据。
135.实施方案126至134中任一项所述的方法，其中所述第一流体中细胞的浓度是未知的。
136.实施方案126至135中任一项所述的方法，其中所述第一流体中细胞的浓度超过泊松分布所需的浓度。
137.实施方案126至136中任一项所述的方法，其中所述第一流体中细胞的浓度导致大于75％的孔被细胞占据。
138.实施方案126至137中任一项所述的方法，其中95％的孔装载有单珠。
139.实施方案126至138中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用超滤膜密封所述阵列。
140.实施方案126至139中任一项所述的方法，其还包括使所述阵列与一种或更多种裂解缓冲液接触以裂解所述细胞，以及对从裂解细胞释放的蛋白质和/或核酸进行分析。
141.实施方案140所述的方法，其中所述珠是条码化转录物捕获珠，并且来自每个孔中的所述裂解细胞的RNA被捕获在同一孔中存在的珠上。
142.实施方案141所述的方法，其还包括从被捕获的RNA产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中。
143.实施方案125至138中任一项所述的方法，其中所述第一流体包含一个或更多个珠并且流过(i)实施方案1至31或64至72中任一项所述的孔阵列或(ii)实施方案32至43或64至72中任一项所述的光致抗蚀剂干膜；并且所述方法还包括使所述阵列与具有多个通孔(例如，第二无底微米孔阵列)的第二光致抗蚀剂干膜接触。
144.实施方案143所述的方法，其中所述第一无底微米孔阵列或所述光致抗蚀剂干膜的至少90％的孔与所述第二光致抗蚀剂干膜的单通孔流体连通。
145.实施方案143或144所述的方法，其中所述方法还包括使包含一个或更多个细胞的第二流体流过所述孔阵列或光致抗蚀剂干膜。
146.实施方案145所述的方法，其中使所述第二液体流动包括在通过所述阵列的流动方向上施加真空。
147.实施方案145所述的方法，其中使所述第二液体流动包括在通过所述阵列的流动方向上向所述液体施加压力。
148.实施方案145所述的方法，其中使所述第二液体流动包括对所述阵列进行离心。
149.实施方案144至148中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用超滤膜密封所述阵列。
150.实施方案144至149中任一项所述的方法，其还包括使所述阵列与一种或更多种裂解缓冲液接触以裂解所述细胞，以及对从裂解细胞释放的蛋白质和/或核酸进行分析。
151.实施方案144至150中任一项所述的方法，其中所述珠是条码化转录物捕获珠，并且来自每个孔中的所述裂解细胞的RNA被捕获在同一孔中存在的珠上。
152.实施方案151所述的方法，其还包括从被捕获的转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中。
153.包括以下的方法：
提供微流控装置，所述微流控装置包含第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列的平均孔直径为15至100微米并且与平均孔直径为80至1000纳米的第一多孔膜结合；
使包含多个珠的第一流体流过所述微流控装置；
使与所述第一多孔膜结合的所述第一无底微米孔阵列与第二多孔膜结合，所述第二多孔膜的平均孔直径为80至1000纳米并且与平均孔直径为1至10微米的第二无底微米孔阵列结合；以及
使包含多个细胞的第二流体流过所述微流控装置；
其中所述第一无底微米孔阵列的80％的孔被单珠占据。
154.包括以下的方法：
提供微流控装置，所述微流控装置包含第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列的平均孔直径为1至10微米并且与(a)平均孔直径为15至100微米的第二无底微米孔阵列和(b)平均孔直径为80至1000纳米的多孔膜结合；
使包含多个细胞的第一流体流过所述微流控装置；以及
将所述微流控装置暴露于包含珠的第二流体；
其中所述第一无底微米孔阵列的80％的孔被单细胞占据。
155.实施方案153或154所述的方法，其中所述第一无底微米孔阵列的至少90％的孔与所述第二无底微米孔阵列的单孔接触。
156.实施方案153至155中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二无底微米孔阵列包含光致抗蚀剂干膜。
157.实施方案153至156中任一项所述的方法，其中所述第二无底微米孔阵列的85％的孔被单细胞和/或珠占据。
158.实施方案153至157中任一项所述的方法，其中所述第一流体中所述多个细胞的浓度是未知的。
159.实施方案153至158中任一项所述的方法，其中所述第一流体中所述多个细胞的浓度超过泊松分布所需的浓度。
等同方案
虽然本文中已对数个本发明实施方案进行了描述和举例说明，但是本领域普通技术人员将容易预想到用于执行本文中所述功能和/或获得本文中所述结果和/或一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且认为这些变化或修改中的每一个均在本文中所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文中所描述的所有参数、尺寸、材料和构造均意在为示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的一种或更多种具体应用。本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验确定本文中所描述的具体本发明实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅作为实例示出，并且除非特别描述并要求，本发明的实施方案可以在所附权利要求范围及其等同的范围内实施。本公开内容的本发明实施方案涉及本文中所描述的每一个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并非互相不一致，则任何两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的组合也包含在本公开内容的本发明范围内。
如所定义和本文中使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义的术语的一般含义。
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其被引用的各自主题通过引用并入，在一些情况下，其可涵盖文件的整个内容。
除非明确指出相反，否则如本文在说明书和权利要求中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此连接要素(即，在一些情况下相关联存在，而在另一些情况下不相关联地存在的要素)中的“任一个或二者”。用“和/或”列举的多个要素应以相同方式理解，即如此连接要素中的“一个或更多个”。除非明确有相反的指示，否则除通过由“和/或”子句所具体确定的要素之外，其他要素也可以任选地存在，无论是否与具体确定的那些元素相关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言例如“包含/包括”结合使用时，对“A和/或B”的提及可在一个实施方案中仅指A(任选地包含除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包含除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指代A和B二者(任选地包含其他要素)；等。
如本文在说明书和权利要求书中所用的，“或/或者”应理解为与如上所定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或/或者”或“和/或”应被解释为包括性的，即在多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，并且任选地包括另外的未列出项目。仅明确指出相反的术语(例如“仅之一”或“恰好之一”，或者在权利要求书中使用时，“由……组成”)才将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“恰好之一”)时，本文中使用的术语“或/或者”应被解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，但非二者”)。当在权利要求书使用中时，“基本由……组成”应具有其在专利法领域中所使用的通常含义。
如本文在说明书和权利要求书中所用的，短语“至少一个”涉及一个或更多个要素的列表时，应理解为意指在要素列表中，选自任一个或更多个要素的至少一个要素，但并不一定包括要素列表中具体列出的各个和每个要素中的至少一个，并且也不排除该要素列表中要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表中具体确定的要素之外，其他要素可任选的存在，无论是否与具体确定的那些要素相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指至少一个A，任选地包括多于一个A，但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个B，任选地包括多于一个B，但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个A，任选地包括多于一个A，和至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其它要素)；等。
还应理解，除非明确指出相反，否则在本文中要求保护的包括多于一个步骤或操作的任何方法中，该方法的步骤或操作的顺序不必需限于其中记载该方法的步骤或操作的顺序。
在权利要求书中以及上述说明书中，所有过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持/容纳”、“由……构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局的专利审查程序手册(United States Patent OfficeManual of Patent Examining Procedures)2111.03节中所述，仅过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭式或半封闭式的过渡性短语。
序列表
<110> 麻省理工学院
<120> 单细胞分析
<130> M0656.70427WO00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/595,895
<151> 2017-12-07
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(28)
<223> n 是 a、c、g、t 或 u
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(33)
<223> n 是a、c、g、t 或 u
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> b 是 c、g 或 t
<400> 1
aagcagtggt atcaacgcag agtgannngg nnnb 34
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(27)
<223> n 是a、c、g、t 或 u
<400> 2
tttttttttt tttttttnnn nnnnnnncaa ctctgcgttg ataccactg 49
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 3
aagcagtggt atcaacgcag agttg 25
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctgtccgcg gaagcagtgg tatcaacgca 60
gagtac 66
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 5
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaagcag tggtatcaac gcagagttg 59
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcgg 47
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 7
gcctgtccgc ggaagcagtg gtatcaacgc agagtac 37

Claims (134)

1.用于从输入核酸产生在5’和3’端包含通用引物位点的核酸的文库的方法，其包括：
(a)使输入核酸与捕获寡核苷酸库接触，每个捕获寡核苷酸包含5’通用引物位点和与输入核酸中的核苷酸序列互补的3’靶结合位点，并且任选地包含条码，所述条码任选地存在于所述5’通用引物位点与所述3’靶结合位点之间，
(b)添加DNA聚合酶并且从而使与输入核酸杂交的捕获寡核苷酸延伸以形成第一链核酸，每个第一链核酸包含所述5’通用引物位点和与输入核酸互补的序列，
(c)使所述第一链核酸与第二链引发寡核苷酸库接触，每个第二链引发寡核苷酸包含5’通用引物位点和与所述第一链核酸中的核苷酸序列互补的3’靶结合位点，以及
(d)添加DNA聚合酶并且从而使所述第二链引发寡核苷酸延伸以形成第二链核酸，所述第二链核酸包含位于所述输入核酸中所存在核苷酸序列的侧翼的5’和3’通用引物位点。
2.权利要求1所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸包含含有poly(dT)序列的靶结合序列。
3.权利要求1所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸库的靶结合序列包含poly(dT)序列或靶向所述输入核酸中的特定序列的序列。
4.权利要求1所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸库中的靶结合序列包含靶向所述输入核酸中的特定序列的序列。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸附着于表面，任选地，珠的表面。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述输入核酸作为输入核酸的复杂混合物提供。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述输入核酸包含RNA。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述输入核酸包含单链DNA(ssDNA)与RNA的混合物。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述输入核酸是(a)来自于病毒或细菌，(b)来自于酵母或昆虫或哺乳动物细胞，(c)分离的细胞核，或(d)外排体。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述输入核酸来自于包含酵母或昆虫或哺乳动物RNA和细菌或病毒DNA的受感染细胞。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述输入核酸来自于单细胞。
12.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述输入核酸来自于2至1000个细胞。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含随机核苷酸序列。
14.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含半随机核苷酸序列。
15.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含随机序列和与所述第一链核酸中的特定序列互补的序列。
16.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二链引发寡核苷酸库中的靶结合序列包含与所述第一链核酸中的序列互补的序列。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第二链引发寡核苷酸库还包含诱饵寡核苷酸，所述诱饵寡核苷酸包含与所述第一链核酸中的序列互补的靶结合序列但缺少通用引物位点。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述第二链引发寡核苷酸附着于表面，任选地，珠的表面。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在步骤(a)、(b)、(c)和/或(d)中添加拥挤试剂。
20.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中添加拥挤试剂。
21.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中添加拥挤试剂。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸还包含用于独特分子鉴定的随机核苷酸序列。
23.用于从单细胞产生多个相同地5’和3’标记的cDNA分子的方法，其包括
(a)从单细胞RNA文库合成第一链cDNA文库，其中来自所述文库的第一链cDNA分子各自包含相同的5’通用引物位点，以及任选地，相同的条码；
(b)使具有5’通用引物位点的第一链cDNA分子与在靶结合序列上游具有5’通用引物位点的寡核苷酸接触；以及
(c)使所述寡核苷酸延伸以产生多个第二链cDNA分子，所述第二链cDNA分子被5’通用引物位点和3’通用引物位点相同地标记。
24.权利要求23所述的方法，其中通过将单RNA分子与包含所述5’通用引物位点和随机、半随机和/或靶向捕获序列的捕获寡核苷酸杂交来合成所述第一链cDNA文库。
25.权利要求23所述的方法，其中通过将单RNA分子与包含所述5’通用引物位点和poly(dT)捕获序列的捕获寡核苷酸杂交来合成所述第一链cDNA文库。
26.权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸附着于珠。
27.权利要求23至26中任一项所述的方法，其中多个相同的捕获寡核苷酸附着于所述珠。
28.权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸包含5’通用引物序列、条码和3’捕获序列。
29.权利要求23至28中任一项所述的方法，其还包括从单细胞获得所述RNA文库或提供来自单细胞的所述RNA文库。
30.权利要求23至29中任一项所述的方法，其中步骤(b)还包括使第一链cDNA分子与缺少5’通用引物位点的诱饵寡核苷酸接触。
31.用于产生多个核酸分子的方法，其包括
(a)从多个亲本核酸合成第一链核酸，每个第一链核酸与所述多个中的亲本核酸互补，其中第一链核酸各自包含相同的5’通用引物位点；
(b)使具有5’通用引物位点的第一链核酸与在靶结合序列上游包含5’通用引物位点的第二链引发寡核苷酸接触；以及
(c)使所述第二链引发寡核苷酸延伸以产生多个第二链核酸，所述第二链核酸被5’通用引物位点和3’通用引物位点相同地标记。
32.权利要求31所述的方法，其中通过使亲本核酸与具有随机、半随机或靶向序列的捕获寡核苷酸杂交来合成每个所述第一链核酸。
33.权利要求32所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸附着于珠。
34.权利要求33所述的方法，其中多个相同的捕获寡核苷酸附着于所述珠。
35.权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸包含5’通用引物序列、条码序列和3’捕获序列。
36.权利要求31至35中任一项所述的方法，其还包括从单细胞或病毒获得所述多个亲本核酸。
37.权利要求36所述的方法，其中所述单细胞是病原体。
38.权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述靶结合序列包含随机序列、半随机序列和/或非随机/靶向序列。
39.权利要求23至38中任一项所述的方法，其中第一链cDNA分子或所述第一链核酸各自包含相同的条码。
40.权利要求23至38中任一项所述的方法，其中所述第一链cDNA分子或所述第一链核酸附着于珠。
41.权利要求23至38中任一项所述的方法，其还包括在步骤(a)、(b)和/或(c)中添加拥挤试剂。
42.权利要求23至30中任一项所述的方法，其还包括产生第一链cDNA分子，包括：
提供包含所述5’通用引物位点、捕获序列和任选的其间的条码序列的捕获寡核苷酸；
使所述捕获寡核苷酸与来自单细胞的多个RNA分子接触；
使得所述多个RNA分子与其相应的捕获序列退火；以及
添加DNA聚合酶，从而使所述捕获寡核苷酸延伸以产生所述第一链cDNA分子，其中所述第一链cDNA分子与所述多个RNA分子互补。
43.权利要求31至38中任一项所述的方法，其还包括产生第一链核酸，包括：
提供包含所述5’通用引物位点、捕获序列和任选的其间的条码序列的捕获寡核苷酸；
使所述捕获寡核苷酸与来自单细胞或病毒的多个亲本核酸接触；
使得所述多个亲本核酸与所述捕获序列退火；以及
添加DNA聚合酶，从而使所述捕获寡核苷酸延伸以产生所述第一链核酸，其中所述第一链核酸各自与亲本核酸互补。
44.提高模板转换反应的产率的方法，其包括向模板转换反应添加拥挤试剂。
45.增强膜对皮米孔阵列的密封的方法，其包括使所述皮米孔阵列和膜与拥挤试剂接触。
46.权利要求45所述的方法，其中皮米孔阵列用于Seq-well测定。
47.皮米孔阵列，其包含
多个皮米孔，每个皮米孔包含含有一个或更多个核酸条码的官能化表面。
48.权利要求47所述的皮米孔阵列，其中每个核酸条码相对于所述阵列中的所有其他核酸条码或相对于所述阵列中的其他核酸条码的子集是独特的。
49.权利要求47所述的皮米孔阵列，其中所述多个中的皮米孔各自包含独特的核酸条码组合。
50.权利要求47所述的皮米孔阵列，其中在多个皮米孔之间共有一个或更多个核酸条码。
51.权利要求47至50中任一项所述的皮米孔阵列，其中在所述阵列中每个核酸条码的位置是已知的。
52.权利要求47至51中任一项所述的皮米孔阵列，其中向具有独特核酸条码的每个皮米孔施加独特刺激物。
53.权利要求47至52中任一项所述的皮米孔阵列，其中所述官能化表面是所述皮米孔的底部内表面。
54.权利要求47至53中任一项所述的皮米孔阵列，其中所述皮米孔阵列的底部内表面包含DNA微阵列。
55.权利要求47至54中任一项所述的皮米孔阵列，其中多个皮米孔各自包含光谱编码的珠。
56.权利要求47至55中任一项所述的皮米孔阵列，其中多个皮米孔各自包含多个光谱编码的珠。
57.权利要求55或56所述的皮米孔阵列，其中所述光谱编码的珠附着于所述皮米孔的官能化表面。
58.皮米孔阵列，其包含
多个皮米孔，每个皮米孔包含官能化表面，所述官能化表面包含一个或更多个具有独特空间条码的核酸分子，每个独特空间条码对于一个或一组皮米孔是独特的，任选地其中每个空间条码在所述皮米孔阵列中的位置是已知的。
59.权利要求58所述的皮米孔阵列，其中所述官能化表面存在于所述皮米孔的内部底表面。
60.权利要求59所述的皮米孔阵列，其中所述皮米孔阵列的底部包含DNA微阵列。
61.权利要求59所述的皮米孔阵列，其中所述官能化表面包含光谱编码的珠。
62.用于在皮米孔阵列中对转录物进行空间定位的方法，其包括：
(a)提供皮米孔阵列，其中：
(i)一个或更多个皮米孔包含一个或更多个官能化表面，每个官能化表面包含具有独特空间条码的核酸分子；
(ii)一个或更多个皮米孔包含独特的空间条码组合；
(iii)位于每个皮米孔中的空间条码的身份是已知的；并且
(iv)一个或更多个皮米孔装载有条码化转录物捕获珠；
(b)使所述皮米孔阵列与细胞群接触，每个细胞包含一个或更多个转录物；
(c)裂解所述细胞并在驻留在同一孔中的珠上从细胞捕获RNA；
(d)从被捕获的转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；
(e)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：空间条码杂交分子；
(f)对所述cDNA和珠条码：空间条码杂交分子进行测序；
(g)确定与每个珠条码相关的所有空间条码；
(h)通过将与珠条码相关的空间条码组合与具有相同的空间条码组合的已知皮米孔相匹配来确定每个珠条码的来源孔；以及
(i)通过将所述cDNA中的所述珠条码与鉴定为该珠条码来源的皮米孔相匹配来在所述皮米孔阵列上对所述转录物进行定位。
63.权利要求62所述的方法，其中所述官能化表面包含所述皮米孔的底部内表面。
64.权利要求62或63所述的方法，其中所述皮米孔阵列的底部包含DNA微阵列。
65.权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述官能化表面包含光谱编码的珠。
66.权利要求62至65中任一项所述的方法，其中将所述细胞群作为与载玻片结合的薄组织切片递送至所述阵列。
67.用于使用皮米孔阵列来确定对一组刺激物的转录响应的方法，其包括：
(a)提供皮米孔阵列，其中大多数皮米孔各自包含一个或更多个官能化表面，所述官能化表面包含(1)具有独特空间条码的核酸分子和(2)独特刺激物；
(b)使所述皮米孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；
(c)从所述官能化表面释放所述刺激物；
(d)培养所述细胞以允许对所释放的刺激物的转录响应；
(e)向大多数孔中装载条码化转录物捕获珠；
(f)裂解所述细胞并且在与所述细胞驻留在同一孔中的珠上从所述细胞捕获RNA；
(g)从被捕获的RNA产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述eDNA中；
(h)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：空间条码杂交分子；
(i)对所述cDNA和珠条码：空间条码杂交分子进行测序；
(j)确定与每个珠条码相关的空间条码的组合；以及
(k)通过将空间条码的组合转变成存在于孔中的刺激物的组合来确定作为与给定珠条码相关的cDNA来源的细胞的刺激物暴露。
68.权利要求67所述的方法，其中所述官能化表面包含所述皮米孔的底部。
69.权利要求67所述的方法，其中所述皮米孔阵列的底部包含DNA微阵列。
70.权利要求67所述的方法，其中所述官能化表面包含光谱编码的珠。
71.用于在皮米孔阵列上对转录物进行空间定位的方法，其包括：
提供皮米孔阵列，其中：
(i)每个皮米孔包含官能化表面，所述官能化表面包含一个或更多个具有独特空间条码的核酸分子；
(ii)每个独特空间条码对于一个或一组皮米孔是独特的，并且
(iii)在所述皮米孔阵列上每个独特空间条码的位置是已知的；
(iv)每个皮米孔装载有条码化转录物捕获珠；
使所述皮米孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；
从所述转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；
通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸同时产生珠条码：空间条码杂交分子；以及
通过将所述eDNA中的所述珠条码与珠条码：空间条码杂交分子相匹配来在所述皮米孔阵列上对所述转录物进行定位。
72.权利要求71所述的皮米孔阵列，其中官能化表面包含所述皮米孔的底部。
73.权利要求72所述的皮米孔阵列，其中所述皮米孔阵列的底部包含微阵列。
74.权利要求71所述的皮米孔阵列，其中所述官能化表面包含光谱编码的珠。
75.权利要求71至74中任一项所述的方法，其中每个微皮米孔还包含刺激物。
76.用于对组织切片中的转录物进行空间定位的方法，其包括：
提供皮米孔阵列，其中：
(i)每个皮米孔包含官能化表面，所述官能化表面包含一个或更多个具有独特空间条码的核酸分子；
(ii)每个独特空间条码对于一个或一组皮米孔是独特的，并且
(iii)在所述皮米孔阵列上每个独特空间条码的位置是已知的；
(iv)每个皮米孔装载有条码化转录物捕获珠；
使所述皮米孔阵列接触与载玻片结合的薄组织切片；
从所述转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；
通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：空间条码杂交分子；以及
通过将所述cDNA中的所述珠条码与珠条码：空间条码杂交分子相匹配来在所述皮米孔阵列上对所述转录物进行定位。
77.权利要求76所述的皮米孔阵列，其中官能化表面包含所述皮米孔的底部。
78.权利要求77所述的皮米孔阵列，其中所述皮米孔阵列的底部包含微阵列。
79.权利要求76所述的皮米孔阵列，其中所述官能化表面包含光谱珠。
80.权利要求76至79中任一项所述的方法，其中每个皮米孔还包含刺激物。
81.用于将膜施加至皮米孔阵列的膜施加器，其包含：
半多孔膜；以及
刚性支持物；
其中所述膜通过可逆化学物质附着于所述刚性支持物。
82.权利要求81所述的膜施加器，其中所述可逆化学物质是亲水性薄膜。
83.权利要求82所述的膜施加器，其中所述亲水性薄膜是盐桥或亲水性聚合物。
84.权利要求81至83中任一项所述的膜施加器，其中所述刚性支持物是玻璃或丙烯酸类塑料。
85.权利要求81至84中任一项所述的膜施加器，其中所述皮米孔阵列是Seq-well阵列。
86.用于将半多孔膜密封至包含多个皮米孔的阵列的方法，其包括：
使皮米孔阵列与刚性支持物上的半多孔膜接触；以及
将加热的表面施加至所述刚性支持物，其中所述半多孔膜夹在所述刚性支持物与所述阵列之间；
从而将所述膜密封至所述皮米孔阵列。
87.权利要求86所述的方法，其中将所述加热的表面施加至所述膜持续少于10分钟。
88.权利要求86或87所述的方法，其中所述加热的表面为35℃至50℃。
89.装置，其配置成使一个或更多个皮米孔阵列与刚性支持物上的半多孔膜接触，将加热的表面施加至所述刚性支持物，从而将所述半多孔膜密封至所述皮米孔。
90.权利要求89所述的装置，其中所述装置包含刚性支持物和能够被加热至期望温度的表面。
91.用于向细胞递送刺激物的方法，其包括：
(a)提供皮米孔阵列，其中每个皮米孔包含附着于刺激物的一个或更多个珠和包含与所述刺激物独特相关的独特刺激物条码的核酸；
(b)使所述皮米孔阵列与包含一个或更多个转录物的细胞群接触；
(c)用所述刺激物培养细胞；
(d)向每个孔装载条码化转录物捕获珠；
(e)从所述珠释放包含所述独特刺激物条码的核酸；
(f)从所述转录物产生cDNA，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中；
(g)通过与转录物捕获珠结合的空间条码的引物延伸来产生珠条码：刺激物条码杂交分子；以及
(h)通过将所述cDNA中的珠条码与珠条码：刺激物条码杂交分子相匹配来鉴定每个cDNA的来源细胞的刺激物。
92.权利要求91所述的方法，其还包括从所述珠释放所述刺激物。
93.权利要求91或92所述的方法，其还包括对所述珠条码：刺激物条码杂交分子进行测序。
94.用于将膜固定至皮米孔阵列的夹具，其包含：
三螺杆设计；
其中所述夹具是方形，其包围阵列保持器和顶件，并且仅在下侧接触所述阵列保持器，从而在所述阵列上产生向上的力。
95.权利要求94所述的方法，其中所述夹具是塑料的。
96.用于使用作条码化珠的多孔树脂磁化的方法，其包括：
使所述树脂收缩，从而扩大所述树脂的孔；
使所述树脂与磁性纳米粒接触；以及
使所述树脂膨胀。
97.权利要求96所述的方法，其中通过降低温度使所述树脂收缩，并且通过提高温度使所述树脂膨胀。
98.权利要求96所述的方法，其中通过改变溶剂的组成来使所述树脂收缩和膨胀。
99.皮米孔阵列，其包含
多个皮米孔，其中每个皮米孔
(1)被表面官能化以使得能够实现膜附着和单细胞转录物捕获；并且
(2)包含沉淀和/或固定至所述皮米孔的一个或更多个内壁的单细胞的内容物。
100.权利要求99所述的皮米孔阵列，其中在多个皮米孔中装载条码化转录物捕获珠。
101.储存细胞以用于单细胞分析的方法，其包括
(a)提供皮米孔阵列，其中大多数皮米孔装载有条码化转录物捕获珠，
(b)使所述阵列的表面与单细胞悬液接触，
(c)通过重力使得细胞装载到皮米孔中，
(d)将所述阵列浸没在固定剂中，以及
(e)将所述阵列储存一天或更多天。
102.权利要求101所述的方法，其中所述皮米孔阵列被官能化以使得能够实现膜的附着以用于转录物捕获。
103.权利要求102所述的方法，其中在固定之后将所述阵列干燥。
104.孔阵列，其包含：
第一多孔膜，其具有0.1至100mL/分钟/cm2的通量率和/或50nm至3微米的孔径；以及
第一无底微米孔阵列，其包含具有第一多个通孔的光致抗蚀剂干膜；
其中所述第一多孔膜在所述第一无底微米孔阵列的底表面处接触所述第一无底微米孔阵列；
并且其中所述阵列的每个孔包含所述第一多个通孔之一和包含所述第一多孔膜的底表面。
105.光致抗蚀剂干膜，其包含孔阵列，所述孔阵列具有15至100微米的最大横向尺寸并且具有通量率为0.1至100mL/分钟/cm2和/或孔径为50nm至3微米的多孔底部。
106.微流控装置，其包含最大横向尺寸为1至500微米的第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列与(a)最大横向尺寸为1至500微米的第二无底微米孔阵列和(b)第一多孔膜结合。
107.制造包含多个通孔的独立式光致抗蚀剂膜的方法，其包括：
将第一光致抗蚀剂干膜与光掩模对准；
通过所述光掩模将所述第一光致抗蚀剂干膜的至少一部分暴露于紫外(UV)光以在所述第一光致抗蚀剂干膜中形成多个第一通孔，从而产生包含多个通孔的第一独立式光致抗蚀剂膜。
108.包括以下的方法：
使包含多个细胞和/或多个珠的第一流体流过：
(i)权利要求104所述的孔阵列；
(ii)权利要求105所述的光致抗蚀剂干膜；或
(iii)权利要求106所述的微流控装置；
从而形成装载细胞和/或装载珠的微米孔阵列。
109.包括以下的方法：
提供微流控装置，所述微流控装置包含第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列的平均孔直径为15至100微米并且与平均孔直径为80至1000纳米的第一多孔膜结合；
使包含多个珠的第一流体流过所述微流控装置；
使与所述第一多孔膜结合的所述第一无底微米孔阵列与第二多孔膜结合，所述第二多孔膜的平均孔直径为80至1000纳米并且与平均孔直径为1至10微米的第二无底微米孔阵列结合；以及
使包含多个细胞的第二流体流过所述微流控装置；
其中所述第一无底微米孔阵列的80％的孔被单珠占据。
110.包括以下的方法：
提供微流控装置，所述微流控装置包含第一无底微米孔阵列，所述第一无底微米孔阵列的平均孔直径为1至10微米并且与(a)平均孔直径为15至100微米的第二无底微米孔阵列和(b)平均孔直径为80至1000纳米的多孔膜结合；
使包含多个细胞的第一流体流过所述微流控装置；以及
使所述微流控装置暴露于包含珠的第二流体。
111.用于处理生物样品的试剂盒，所述试剂盒包含：
基板，其包含具有在其中形成的多个容器的表面，其中每个容器的尺寸和形状设置为接收微米孔阵列；
一个或更多个膜，其配置成附着于所述基板的所述表面以形成组合体，使得所述一个或更多个膜覆盖所述多个容器；以及
杂交板，其配置成附着于所述组合体，其中所述一个或更多个膜定位在所述杂交板与所述基板之间，并且在所述杂交板的内表面与所述一个或更多个膜之间形成分开的体积，其中每个体积与分开的所述多个容器之一流体连接。
112.权利要求111所述的试剂盒，其还包含收集板，所述收集板包含多个凹口，其中所述收集板配置成接收所述基板和相关的微米孔阵列，并且其中当所述收集板接收了所述基板和相关的微米孔阵列时，每个凹口与单微米孔阵列流体连接。
113.权利要求111或112所述的试剂盒，其还包含盖，所述盖的尺寸和形状设置为密封所述收集板的所述多个凹口。
114.权利要求111至113中任一项所述的试剂盒，其还包含杂交缓冲液。
115.权利要求111至114中任一项所述的试剂盒，其还包含裂解缓冲液。
116.权利要求111至115中任一项所述的试剂盒，其中所述多个容器中的每一个包含底表面。
117.权利要求111至116中任一项所述的试剂盒，其中所述多个容器包含形成在所述基板中的通孔。
118.权利要求111至117中任一项所述的试剂盒，其中所述杂交板包含多个开口，其中所述多个开口中的每一个布置成与所述分开的体积之一流体连通。
119.权利要求111至118中任一项所述的试剂盒，其还包含用于使用所述试剂盒来处理生物样品的书面说明。
120.微孔装置，其包含：
(a)光致抗蚀剂膜，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及
(b)与所述光致抗蚀剂膜的所述底表面接触的多孔底膜，其中所述底膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的。
121.权利要求120所述的装置，其中所述多孔底膜是通量率为至少0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、或90mL/分钟/cm2的干膜。
122.无基底两层层压制品，其包含：
(a)光致抗蚀剂膜，
其中所述光致抗蚀剂膜包含(i)顶表面、底表面以及(ii)加强部分和未加强部分，
其中在与溶解剂接触之后：
所述未加强部分溶解以形成从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，并且每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，并且所述顶表面、所述底表面或这两个表面的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％或75％被所述通孔覆盖，并且
所述加强部分显著地对所述溶解剂具有抗性；以及
(b)光掩模，
其中所述光掩模上的最大特征距离不超过2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6或0.5mm，并且
其中所述光掩模接触并覆盖所述光致抗蚀剂膜的整个顶表面的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或整个顶表面。
123.制造包含多个通孔的独立式光致抗蚀剂膜的方法，其包括：
(a)将光致抗蚀剂膜与光掩模进行层压，其中所述光掩模具有多个特征并且最大特征距离不超过2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6或0.5mm，并且
其中所述光掩模覆盖整个光致抗蚀剂膜的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或整个光致抗蚀剂膜，
(b)通过所述光掩模将所述光致抗蚀剂膜暴露于光源持续足以产生所述光致抗蚀剂的加强部分的时间，
(c)使所述光致抗蚀剂膜显影，以及
(d)将所述光致抗蚀剂膜与所述光掩模分离，从而制造包含所述多个通孔的独立式光致抗蚀剂膜。
124.权利要求123所述的方法，其中所述光致抗蚀剂的加强部分为所述光致抗蚀剂的按表面积计至多25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％或75％。
125.权利要求123或124所述的方法，其中将所述光致抗蚀剂膜同时显影和分离。
126.权利要求123至125中任一项所述的方法，其还包括在使所述所述光致抗蚀剂暴露之前或之后，从所述光致抗蚀剂膜上移除释放衬垫。
127.细胞装载方法，其包括：
(a)使包含多个细胞的流体样品流过微阵列装置，所述装置包含：(i)无底微米孔阵列，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及(ii)与所述微米孔阵列的所述底表面接触的多孔底膜，其中所述底膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的，
(b)从所述多个通孔中的至少一个通孔的所述顶部开口至所述底部开口施加压力梯度，从而将单细胞装载到所述至少一个通孔中，
(c)通过施加压力梯度将所述细胞保留在所述至少一个通孔的底部，
(d)在保留所述细胞的同时将所述微米孔阵列倒置，以及
(e)使倒置的微米孔阵列反转，从而将细胞装载到所述微阵列中的所述通孔中。
128.权利要求127所述的方法，其中保留的细胞将所述至少一个通孔内的压力梯度降低至不足以引起第二个细胞的装载的水平。
129.权利要求127或128所述的方法，其还包括当所述微米孔阵列倒置时清洗所述细胞或所述微米孔阵列。
130.培养或储存分离的细胞的方法，其包括：
(a)使包含多个细胞的流体样品流过微阵列装置，所述装置包含：(i)无底微米孔阵列，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及(ii)与所述微米孔阵列的底表面接触的多孔底膜，其中所述底膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的，
(b)通过重力或通过施加压力梯度将所述多个细胞中的至少一个细胞装载到所述通孔中，
(c)在所述微米孔阵列的所述顶表面上方施加多孔顶膜，从而将所述细胞保留在所述通孔中，以及
(d)将所述微米孔阵列浸没在介质中，使得所述多个通孔的至少一部分通过所述顶部开口、所述底部开口或这两种开口与所述介质流体连接。
131.权利要求127至130中任一项所述的方法，其中将多个珠预装载在所述微米孔阵列中。
132.权利要求127至130中任一项所述的方法，其还包括使包含多个珠的流体样品流动。
133.对组织切片进行分析的方法，其包括：
(a)使所述组织切片与微阵列装置接触，所述装置包含：
(i)无底微米孔阵列，其包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，
其中所述多个通孔的至少一部分包含条码化转录物捕获珠和功能表面，以及(ii)与所述微米孔阵列的所述底表面接触的多孔底膜，以及
(b)从所述转录物产生cDNA序列，使得将所述珠条码的序列并入到所述cDNA中，从而对所述组织切片进行分析。
134.单细胞分析试剂盒，其包含：
(a)一个或更多个微阵列，每个微阵列包含光致抗蚀剂膜，所述微阵列包含顶表面、底表面和从所述顶表面至所述底表面的多个通孔，其中每个孔在所述顶表面上具有顶部开口并且在所述底表面上具有底部开口，以及
(b)至少一个多孔干膜，其中所述膜的通量率为至少0.1mL/分钟/cm2，如通过以10磅/平方英寸(psi)的初始水通量率测量的。
CN201880088780.6A 2017-12-07 2018-12-07 单细胞分析 Pending CN111699042A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762595895P 2017-12-07 2017-12-07
US62/595,895 2017-12-07
PCT/US2018/064494 WO2019113457A1 (en) 2017-12-07 2018-12-07 Single cell analyses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111699042A true CN111699042A (zh) 2020-09-22

Family

ID=65003473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880088780.6A Pending CN111699042A (zh) 2017-12-07 2018-12-07 单细胞分析

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11767557B2 (zh)
EP (1) EP3720605A1 (zh)
JP (1) JP2021505157A (zh)
CN (1) CN111699042A (zh)
AU (1) AU2018378827B2 (zh)
CA (1) CA3084439A1 (zh)
WO (1) WO2019113457A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022087881A1 (zh) * 2020-10-28 2022-05-05 深圳华大生命科学研究院 微珠及其制备方法

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
GB2513024B (en) 2012-02-27 2016-08-31 Cellular Res Inc A clonal amplification method
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
ES2836802T3 (es) 2015-02-27 2021-06-28 Becton Dickinson Co Códigos de barras moleculares espacialmente direccionables
CN107406888A (zh) 2015-03-30 2017-11-28 赛卢拉研究公司 用于组合条形编码的方法和组合物
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
ES2745694T3 (es) 2015-09-11 2020-03-03 Cellular Res Inc Métodos y composiciones para normalización de biblioteca de ácido nucleico
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
WO2017216270A1 (de) 2016-06-15 2017-12-21 Grabmayr Heinrich Einzelmolekülnachweis bzw. -quantifizierung durch dna-nanotechnologie
JP7091348B2 (ja) 2016-09-26 2022-06-27 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー バーコード付きオリゴヌクレオチド配列を有する試薬を用いたタンパク質発現の測定
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
JP7536450B2 (ja) 2017-06-05 2024-08-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 単一細胞用のサンプルインデックス付加
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
CN112805389B (zh) 2018-10-01 2024-08-06 贝克顿迪金森公司 确定5’转录物序列
JP2022506546A (ja) 2018-11-08 2022-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析
EP3894585A2 (en) 2018-12-10 2021-10-20 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11661631B2 (en) 2019-01-23 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides associated with antibodies
WO2020167920A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cellular Research, Inc. Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
JP2022535300A (ja) 2019-06-07 2022-08-05 ハニカム・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド 生物学的試料の収集、保存、及び分析のための試料容器カセット
EP4004231A1 (en) 2019-07-22 2022-06-01 Becton, Dickinson and Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
WO2021045875A1 (en) * 2019-09-04 2021-03-11 Cellecta, Inc. Compartment-free single cell genetic analysis
CN110577982A (zh) * 2019-09-29 2019-12-17 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片
CN110951580B (zh) * 2019-09-29 2022-05-20 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置
WO2021065766A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 東京応化工業株式会社 分泌物産生細胞のスクリーニング方法、及び分泌物産生細胞のスクリーニングキット
EP4407041A3 (en) 2019-11-08 2024-09-25 Becton Dickinson and Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
WO2021155057A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
AU2021222056A1 (en) * 2020-02-20 2022-09-01 The Regents Of The University Of California Methods of spatially resolved single cell RNA sequencing
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
EP4139485B1 (en) 2020-04-22 2023-09-06 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
WO2021236929A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
AU2021294334A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
CN117581094A (zh) * 2021-08-18 2024-02-20 株式会社日立高新技术 生物试料分析装置
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005042759A2 (en) * 2003-09-10 2005-05-12 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
CN105219766A (zh) * 2015-11-10 2016-01-06 东华大学 一种三轮扩增的多重pcr方法
CN107208157A (zh) * 2015-02-27 2017-09-26 赛卢拉研究公司 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60569B2 (ja) 1980-06-04 1985-01-09 株式会社日立製作所 減衰軸受
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
ATE75483T1 (de) 1981-10-23 1992-05-15 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US5939291A (en) * 1996-06-14 1999-08-17 Sarnoff Corporation Microfluidic method for nucleic acid amplification
JP2002065263A (ja) * 2000-08-23 2002-03-05 Toyobo Co Ltd ｃＤＮＡの増幅方法及び標識ｃＤＮＡの調製方法
ATE484598T1 (de) 2003-03-07 2010-10-15 Rubicon Genomics Inc Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden
US9200245B2 (en) * 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US7776553B2 (en) 2005-09-16 2010-08-17 Presidents And Fellows Of Harvard College Screening assays and methods
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US20090099040A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-16 Sigma Aldrich Company Degenerate oligonucleotides and their uses
DK2297333T3 (en) 2008-05-30 2015-04-07 Massachusetts Inst Technology Method for spatial separation and for screening cells
US9244080B2 (en) 2008-12-04 2016-01-26 Massachussetts Institute Of Technology Method for diagnosing allergic reactions
US9404924B2 (en) 2008-12-04 2016-08-02 Massachusetts Institute Of Technology Method of performing one-step, single cell RT-PCR
CN104745669A (zh) 2009-01-21 2015-07-01 麻省理工学院 用于对单个细胞所具有的细胞毒性进行评价的组合物以及方法
ES2903425T3 (es) 2009-03-30 2022-04-01 Illumina Inc Análisis de expresión génica en células individuales
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
ES2562159T3 (es) 2009-08-20 2016-03-02 Population Genetics Technologies Ltd. Composiciones y métodos para el reordenamiento de ácido nucleico molecular
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP3088532B1 (en) * 2009-12-22 2019-10-30 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
ES2966040T3 (es) 2010-10-08 2024-04-18 Harvard College Alto rendimiento de células individuales con código de barra
DK2861760T3 (da) 2012-06-15 2020-03-09 Univ Texas Sekventering med høj kapacitet af flere udskrifter af en enkelt celle
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10017761B2 (en) * 2013-01-28 2018-07-10 Yale University Methods for preparing cDNA from low quantities of cells
US10612088B2 (en) 2013-03-14 2020-04-07 The Broad Institute, Inc. Massively multiplexed RNA sequencing
EP2971116A4 (en) * 2013-03-15 2016-12-14 Broad Inst Inc EXPRESSION OF DENDRITIC CELL RESPONSE GENE, COMPOSITIONS OF MATERIALS AND METHODS OF USE THEREOF
CN104349319B (zh) 2013-08-01 2018-10-30 华为终端（东莞）有限公司 一种用于配置多设备的方法、设备和系统
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
EP2921556A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-23 Lexogen GmbH Copy number preserving RNA analysis method
WO2016038670A1 (ja) 2014-09-09 2016-03-17 株式会社日立製作所 細胞解析装置およびそれを用いた細胞解析方法
CN107873054B (zh) 2014-09-09 2022-07-12 博德研究所 用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备
JP6672310B2 (ja) 2014-09-15 2020-03-25 アブビトロ， エルエルシー ハイスループットヌクレオチドライブラリーシークエンシング
EP3274466A4 (en) 2015-03-24 2018-11-21 Sigma Aldrich Co. LLC Directional amplification of rna
US10280449B2 (en) * 2015-06-29 2019-05-07 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same
EP3568508A4 (en) 2017-01-12 2020-12-16 Massachusetts Institute Of Technology METHODS FOR T-LYMPHOCYTE RECEPTOR AND B-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANALYSIS

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005042759A2 (en) * 2003-09-10 2005-05-12 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
CN107208157A (zh) * 2015-02-27 2017-09-26 赛卢拉研究公司 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物
CN105219766A (zh) * 2015-11-10 2016-01-06 东华大学 一种三轮扩增的多重pcr方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022087881A1 (zh) * 2020-10-28 2022-05-05 深圳华大生命科学研究院 微珠及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3720605A1 (en) 2020-10-14
AU2018378827B2 (en) 2023-04-13
JP2021505157A (ja) 2021-02-18
US11767557B2 (en) 2023-09-26
US20190218607A1 (en) 2019-07-18
AU2018378827A1 (en) 2020-06-11
WO2019113457A1 (en) 2019-06-13
CA3084439A1 (en) 2019-06-13
US20240200134A1 (en) 2024-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111699042A (zh) 单细胞分析
US20220333185A1 (en) Methods and compositions for whole transcriptome amplification
KR102671480B1 (ko) 올리고뉴클레오타이드 인코딩된 화학적 라이브러리
US11052368B2 (en) Systems and methods for barcoding nucleic acids
US20210222241A1 (en) Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
CN111051526A (zh) 用于实施生物分子空间分布分析的方法
AU2015250034B2 (en) Systems and methods for barcoding nucleic acids
CN107208158B (zh) 空间上可寻址的分子条形编码
CN116157534A (zh) 用于单细胞分析的cDNA加标对照
US20020187485A1 (en) Open substrate platforms suitable for analysis of biomolecules
EP3568234B1 (en) Hydrophilic coating of fluidic channels
WO2016162997A1 (ja) 遺伝子解析システム
WO2022147139A1 (en) Methods and compositions for light-controlled surface patterning using a polymer
WO2023011628A1 (zh) 一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法
EP4097232A1 (en) Oligonucleotide encoded chemical libraries, related systems, devices, and methods for detecting, analyzing, quantifying, and testing biologics/genetics
US20230304072A1 (en) Methods and compositions related to microsphere surface gelation
WO2020186174A1 (en) Methods and systems for processing or analyzing oligonucleotide encoded molecules
US20230065224A1 (en) Oligonucleotide encoded chemical libraries, related systems, devices, and methods for detecting, analyzing, quantifying, and testing biologics/genetics
Zhao et al. Matrix-seq: an adjustable-resolution spatial transcriptomics via microfluidic matrix-based barcoding
WO2024086776A1 (en) Hybrid microbead arrays
CN118451201A (zh) 空间组学平台和系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination