CN110577982A - 高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，所述芯片在其基板上设置有多个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，每个所述微孔具有唯一的空间坐标编码，且所述微孔内修饰有若干条已知的核酸序列，所述核酸序列依次包括：Spacer序列；通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；细胞标签，用于标示RNA源自的细胞；分子标签，用于标示结合的RNA；以及Ploy T。本发明提供了一种能用于高通量单细胞转录组与基因突变整合分析的芯片，通过采用微孔空间坐标、细胞核酸标签和分子核酸标签的三重编码技术，可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来。

Description

高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片。
背景技术
肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病之一，肿瘤细胞从基因型到表型上存在极大的差异(肿瘤的高度异质性)，而这种高度异质性与肿瘤的恶性程度、耐药性、复发转移等都密切相关，是造成肿瘤早期诊断困难、临床诊治复杂、耐药复发和预后差的根源之一。全面解析肿瘤异质性是实现肿瘤精准治疗的关键。
高通量测序技术的发展为解析异质性肿瘤群体带来希望。目前各种组学水平的常规高通量测序成为肿瘤异质性群体研究的常用手段，用来发现新的遗传变异或异常通路，探索新的发病或耐药机制等。然而目前基于bulk(混合群体)的常规高通量测序技术无法克服肿瘤细胞高度异质性的难题，仅能通过大样本人群研究发现关键主克隆变异及通路改变，难以实现对单个患者异质性克隆群体的全面解析，成为实现肿瘤精准治疗的瓶颈。近年来新兴的单细胞测序技术为解析肿瘤异质性、鉴别不同功能亚群提供了可能。单细胞测序能够获得每个细胞的基因组变异图谱及转录组表达图谱，通过单个细胞的图谱精确划分克隆归属，实现对异质性克隆群体的全面解析。Timothy A.Graubert团队将一例已通过全基因组测序与靶向深度测序进行全面刻画的继发白血病样本进行了单细胞基因组分型测序，仅通过12个细胞DNA测序数据即发现了之前被认为是一个亚克隆的群体其实是由两个互斥的亚克隆构成，充分说明单细胞测序的优势和其在多克隆研究中的必要性。然而早期的单细胞测序技术往往通量低，成本高，一定程度上限制了精确分析并追踪异质性群体变化的分析。2016年10x Genomics公司推出的10x Chromium Single Cell Gene ExpressionSolution平台实现了高通量的单细胞转录组测序，具有周期短、成本低、细胞捕获率高等优势，在发育生物学及肿瘤异质性群体研究中应用广泛，在转录组水平实现对异质性肿瘤群体的全面刻画。
然而对于基因组变异驱动的恶性肿瘤群体，仅从转录组水平无法实现对肿瘤群体的鉴定以及功能异质性的解析。研究者开始着眼于基于单细胞水平的多组学研究平台，10x和BD公司分别实现单细胞转录组与单细胞染色质开放性(ATAC-seq)或单细胞蛋白质组的结合。然而，对于肿瘤异质性研究中最需要的单细胞转录组与基因组信息的整合平台，目前尚无成熟技术。对此，来自不同实验室的研究者进行了大量尝试，目前大部分技术仍然依赖同时将单个细胞中的转录组与基因组进行分离而分别测序，操作繁琐且通量较小。对转录组和基因组同时测序的技术又面临扩增效率低下或等位基因扩增偏好等难题，近期新提出的Target-seq技术针对肿瘤群体设计同时检测转录组及特异基因突变的技术，也说明了肿瘤研究中对该技术的需求，但该技术仍处于实验室水平，仍然无法实现一次上千细胞数的分析。另外，Peter Van Galen等人在Cell发表文献，通过单细胞转录本与三代测序技术相结合，首次实现对白血病患者肿瘤群体(以基因组变异为金标准)中转录组异质性的解析，发现肿瘤群体存在于表达谱不同的多种谱系中，明确了基因组异质性与转录组异质性相互独立又相互影响的关系，也表明在单细胞转录组水平进一步明确细胞的基因组变异的重要性。然而，该研究中使用的三代测序检测突变的技术具有很大局限性，突变检出率受到具体突变位点的限制，单个突变检出率最高仅23％，平均可以检测到突变的细胞不超过5％，作者最终采用随机森林的机器学习算法预测肿瘤群体，无法实现对肿瘤细胞群体的直接鉴定，也没有将基因组与转录组异质性很好的对应。且该技术操作繁琐，样本需求量高，花费大，不适于全面推广。
因此，在肿瘤研究中实现单细胞水平基因组与转录组异质性的整合分析具有重要性与迫切性，而提供一种可用于进行单细胞转录组与基因突变整合分析的芯片显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，所述芯片在其基板上设置有多个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，每个所述微孔具有唯一的空间坐标编码，且所述微孔内修饰有若干条已知的核酸序列，所述核酸序列依次包括：
Spacer序列；
通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；
细胞标签，用于标示RNA源自的细胞；
分子标签，用于标示结合的RNA；
以及Ploy T。
优选的是，每个所述微孔内修饰的核酸序列不小于106条。
优选的是，所述分子标签为一段已知的随机核酸序列。
优选的是，每个微孔的细胞标签与空间坐标编码一一对应，单个所述微孔内的所有细胞标签具有相同的序列，不同所述微孔内的细胞标签的序列均不相同，从而通过所述细胞标签标识RNA源自的细胞；
单个所述微孔内的所有分子标签具有不同的序列，从而通过所述分子标签标识单个细胞中的RNA。
优选的是，所述微孔为正六边形，且呈蜂窝状排列，其数量为102-106个。
优选的是，所述微孔的外接圆的直径为30-60μm，深度为20-300μm，孔间的间距为10-30μm。
一种如上所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片的制作工艺，包括以下步骤：
1)制备微孔阵列芯片；
2)在所述微孔内修饰核酸序列。
优选的是，所述步骤1)具体为：在硅上通过光刻和深硅刻蚀直接形成微孔，微孔可以是盲孔或通孔。
优选的是，所述步骤1)具体为：首先通过硅的光刻制备阳膜，然后通过PDMS浇筑脱模形成软光刻图形，与平面玻片结合后，采用毛细微模塑的方法，将聚氨酯或环氧树脂固化与玻片形成微孔阵列。
优选的是，所述步骤2)具体包括：利用喷墨打印的方式，结合寡核苷酸原位化学合成方法，在微孔内合成spacer、通用引物、细胞标签序列和延伸接头；然后通过核酸扩增方法，以分子标签和PolyA为模板，将原位合成的序列延伸形成分子标签序列段，从而得到最终的核酸序列。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种能用于高通量单细胞转录组与基因突变整合分析的芯片，通过采用微孔空间坐标、细胞核酸标签和分子核酸标签的三重编码技术，可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来，能为实现高通量单细胞转录组与基因突变整合分析提供芯片基础。
附图说明
图1为本发明的一种实施例中的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片的制作流程示意图；
图2为本发明的一种实施例中的核酸序列修饰的流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，芯片在其基板上设置有多个微孔，微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，每个微孔具有唯一的空间坐标编码，且微孔内修饰有若干条已知的核酸序列，核酸序列依次包括：
Spacer序列；
通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；
细胞标签，用于标示RNA源自的细胞；
分子标签，用于标示结合的RNA；
以及Ploy T。
其中，每个微孔内修饰的核酸序列不小于106条。分子标签为一段已知的随机核酸序列。
每个微孔的细胞标签与空间坐标编码一一对应，当该微孔阵列装载细胞后，针对每一个特定微孔，一个细胞就携带了该微孔空间坐标编码，这个微孔空间坐标同时对应一个已知的细胞标签(核酸序列)和一组已知的分子标签(随机序列)。装载的单细胞可以进行免疫荧光标记，通过高通量多色荧光成像获取蛋白表达信息。
其中，单个微孔内的所有细胞标签具有相同的序列，不同微孔内的细胞标签的序列均不相同，从而通过细胞标签标识RNA源自的细胞；所以，在最后测序数据中可以通过细胞标签知道序列来源与哪个细胞，区分哪些序列是来自同一个细胞，哪些是来自不同的细胞。
单个微孔内的所有分子标签具有不同的序列，从而通过分子标签标识单个细胞中的RNA。分子标签标识只负责针对同一个细胞内的RNA进行标记，而不管不同细胞之间的RNA。对于单个细胞来说，通过分子标签可区别每一条RNA。所以，对于最后得到的检测数据，通过细胞标签区分不同的细胞，并且一个细胞标签对应一个唯一的微孔空间坐标编码，从而知道RNA源自的细胞以及微孔坐标位置，然后再通过分子标签区分每一条RNA。从而能将每一条RNA源自的细胞、位置坐标信息对应起来，在单细胞转录组与基因突变整合分析中，通过本发明的芯片所采用的微孔空间坐标、细胞核酸标签和分子核酸标签的三重编码技术，可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来。
当细胞在孔内原位裂解后，释放RNA被孔内的核酸序列捕获，通过碱基互补配对的方式，为检测目标标志物接上了细胞标签和分子标签。并且，通过扩增在孔壁和孔内同时形成了cDNA。针对游离的cDNA通过进行高通量测序，可以获取单细胞的转录组信息，这一组学信息会与单细胞的微孔空间坐标编码进行对应。针对固定在孔壁上的cDNA，进行原位的荧光PCR，可以获取单细胞额基因突变信息。这样通过本发明的编码技术，即可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来。
例如，在一种实施例中，利用本发明的芯片进行高通量单细胞转录组与基因突变整合分析的方法为：
1)进行单细胞表面蛋白分型分析：预先通过荧光标记目的基因，通过芯片捕获单细胞，细胞孵育，然后进行荧光图像采集，通过微孔位置定位，利用荧光图像分析识别计算含有目的基因的特异细胞的位置，得到各个微孔位置的细胞蛋白表达信息；
2)加入裂解液和扩增试剂，对微孔中的单细胞进行原位裂解扩增，逆转录合成携带细胞标签、分子标签的cDNA，游离cDNA收集后用于单细胞转录组分析，固定在微孔内的cDNA序列用于基因突变分析；
加入PCR扩增试剂，针对固定在微孔内的cDNA进行PCR扩增，并加入预先设计的修饰有不同荧光基团的两种引物探针，其中一种用于与野生型目的基因结合，另一种用于与突变型目的基因结合，对微孔中的单细胞进行原位裂解扩增；扩增后野生型目的基因和突变型目的基因均分别带有不同的荧光分子；然后进行双色荧光图像采集，对得到的双色荧光图像上的微孔位置进行定位，计算每个微孔位置2种荧光的强度值，通过聚类算法统计每个微孔位置2种荧光的强度的比值，从而得到各微孔位置的目的基因的野生型与突变型的比例，获得单细胞的基因突变表达信息；
针对游离cDNA，通过基因测序分析cDNA，获取单细胞转录谱及亚型信息，由于cDNA上接上了细胞标签和分子标签，从而能获知每一条cDNA来源的细胞和微孔位置，从而将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来，形成高通量单细胞转录组与基因突变整合分析的完整数据库，建立多组学整合分析模型。
在优选的实施例中，微孔为正六边形，且呈蜂窝状排列，其数量为102-106个。微孔的外接圆的直径为30-60μm，深度为20-300μm，孔间的间距为10-30μm。
在优选的实施例中，高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片的制作工艺，包括以下步骤：
1)制备微孔阵列芯片；
2)在微孔内修饰核酸序列，获得高通量单细胞分析芯片。
其中，步骤1)具体为：通过MEMS技术，在硅上通过光刻和深硅刻蚀直接形成微孔，微孔可以是盲孔或通孔。或是利用软光刻技术，参照图1，首先通过硅的光刻制备阳膜，然后通过PDMS浇筑脱模形成软光刻图形，与平面玻片结合后，采用毛细微模塑的方法，将聚氨酯或环氧树脂固化与玻片形成微孔阵列。图1中编码芯片即指先在平面玻片上原位合成的已修饰好核酸序列的芯片。
编码核酸的修饰方法与芯片制备方法对应：可以选择在微孔阵列中原位合成或在平面玻片上原位合成。在优选的实施例中，步骤2)具体包括：利用喷墨打印的方式，结合寡核苷酸原位化学合成方法，在微孔内合成spacer、通用引物、细胞标签序列和延伸接头；然后通过核酸扩增方法，以分子标签和PolyA为模板，将原位合成的序列延伸形成分子标签序列段，从而得到最终的核酸序列。其流程参照图2，其中UMI表示分子标签。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，其特征在于，所述芯片在其基板上设置有多个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，每个所述微孔具有唯一的空间坐标编码，且所述微孔内修饰有若干条已知的核酸序列，所述核酸序列依次包括：
Spacer序列；
通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；
细胞标签，用于标示RNA源自的细胞；
分子标签，用于标示结合的RNA；
以及Ploy T。
2.根据权利要求1所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，其特征在于，每个所述微孔内修饰的核酸序列不小于106条。
3.根据权利要求2所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，其特征在于，所述分子标签为一段已知的随机核酸序列。
4.根据权利要求3所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，其特征在于，每个微孔的细胞标签与空间坐标编码一一对应，单个所述微孔内的所有细胞标签具有相同的序列，不同所述微孔内的细胞标签的序列均不相同，从而通过所述细胞标签标识RNA源自的细胞；
单个所述微孔内的所有分子标签具有不同的序列，从而通过所述分子标签标识单个细胞中的RNA。
5.根据权利要求1所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，其特征在于，所述微孔为正六边形，且呈蜂窝状排列，其数量为102-106个。
6.根据权利要求5所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片，其特征在于，所述微孔的外接圆的直径为30-60μm，深度为20-300μm，孔间的间距为10-30μm。
7.一种如权利要求1-6中任意一项所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片的制作工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备微孔阵列芯片；
2)在所述微孔内修饰核酸序列。
8.根据权利要求7所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片的制作工艺，其特征在于，所述步骤1)具体为：在硅上通过光刻和深硅刻蚀直接形成微孔，微孔可以是盲孔或通孔。
9.根据权利要求7所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片的制作工艺，其特征在于，所述步骤1)具体为：首先通过硅的光刻制备阳膜，然后通过PDMS浇筑脱模形成软光刻图形，与平面玻片结合后，采用毛细微模塑的方法，将聚氨酯或环氧树脂固化与玻片形成微孔阵列。
10.根据权利要求7所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析编码芯片的制作工艺，其特征在于，所述步骤2)具体包括：利用喷墨打印的方式，结合寡核苷酸原位化学合成方法，在微孔内合成spacer、通用引物、细胞标签序列和延伸接头；然后通过核酸扩增方法，以分子标签和PolyA为模板，将原位合成的序列延伸形成分子标签序列段，从而得到最终的核酸序列。
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