CN107012220A - 一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法。所述的配对微流控芯片为高通量捕获单微球/单细胞的微流控芯片，所述的方法包括：a、高通量配对捕获单微球/单细胞；b、对配对单元平行操控，如对大量单细胞的隔离、培养、裂解等，单细胞各种内含物的捕获等；c、通过编码微球将单细胞内含物信息转化为DNA序列信息，利用高通量测序技术和生物信息学方法分析大量单细胞内含物，如转录组、基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。本方法可以全面完整的分析单细胞内含物信息，具有通量高，准确性高，成本低，可分析靶标广等优点。
Description
技术领域
本发明涉及分子细胞生物学，具体涉及一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的技术。
背景技术
分析细胞内含物是分子生物学研究的基础，也是现代医疗诊断的分析靶标。传统分析细胞内含物的方法对大量细胞平均信号的分析处理使得信号的平均化模糊了人们对单细胞之间异质性的认识。目前前沿生物学研究和医学研究表明，同一个体的不同组织之间，同一组织的不同部位之间，以及同一部位的不同细胞之间都存在异质性(heterogeneity)，即使是同一种细胞的不同个体之间也可能存在很大的异质性，这差异最大的这些细胞往往能够揭示重要生物学现象或者提示癌症等重大疾病。因此单细胞的全面分析是现代生物学和医学研究十分需要的技术。
对单细胞分析来说，其面临的挑战主要有三点，首先是快速高效地分离单细胞，防止单细胞的丢失；其次是由于单细胞中所含有的分析靶标量太少，如何无偏放大靶标的信号，减少或者消除放大偏差性，真实反应细胞内含物的表达水平；再次是提高单细胞分析的通量，减少重复操作，提高效率；最后是如何实现单细胞内含物的全面分析，分析各种内含物的表达量以及相互之间的关联。
目前尚无能够将高通量捕获单细胞、无偏扩增微量单细胞内含物、全面分析单细胞内含物集成在一起的公开技术。但已有公开报道利用微流控技术高通量分析单细胞转录组。比如Cell文章(Macosko et al.，2015,Cell：161，1202-1214；Klein et al.,2015,Cell161,1187-1201)报道的结合液滴微流控和编码微球的方法，基于泊松分布原理利用液滴微流控的方法配对捕获单细胞与单微球，单细胞裂解释放的mRNA被与之配对的编码微球捕获，再经过逆转录和扩增，将单细胞mRNA信息编码与放大，通过高通量测序与生物信息学方法分析大量大细胞mRNA的表达情况。该方法中细胞与微球的捕获是基于泊松分布原理，大部分的液滴没有细胞，只有～1％的液滴含有单个细胞，再结合微球的泊松分布，有效分析目标进一步减少，只能实现对大量实际样品中少部分细胞的分析，这样可能会忽略掉样品中一些重要的细胞个体。另外该策略只适合分析对象数目较多的样品，对于一些稀有细胞(比如循环肿瘤细胞)，由于其样品中细胞数量太少(10-100/mL血液)，无法用该方法来实现单细胞分析。这些技术都仅限于分析单细胞的mRNA，其他单细胞内含物无法进行分析，如基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。目前公开的技术中，都没有涉及到高通量分析。
发明内容
针对现有技术的缺陷，为了解决以上问题，本发明的目的在于：利用申请人发展的配对微流控芯片，基于流体力学原理和尺寸效应高通量捕获单细胞，结合编码技术和高通量测序技术，提供一种高通量分析单细胞内含物的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明公开了一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，所述方法包括步骤：
首先提供一微流控芯片，该微流控芯片包括捕获层、控制层、载片三部分；捕获层包括两个并行的流道(10，11)和连接通道(13)，控制层包括隔离通道(12)；其中每个捕获通道由多个捕获单元(8，9)首尾串接而成，每个单元包括流道(10，11)、储液腔室(14，15)、捕获通道(16，17)三部分，流道(10，11)包括U形管，前一单元U形管的左臂端连接后一单元U形管的右臂端，储液腔室(14)位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管的液体进口端，第二通道为捕获通道，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往U型管的液体出口端；第三通道为连接通道(13)，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往并行的另一捕获单元的储液腔室；
连接通道(13)连接两个捕获单元的储液腔室(14，15)；隔离通道(12)层位于连接通道(13)下方或上方，垂直于连接通道(13)并由隔膜(18)隔离开；两个流道分别含有一个样品入口(1，2)、一个油相入口(4，5)以及一个出口(6，7)，隔离通道含有一个入口(3)。
a、在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入细胞悬浮液，当单细胞进入捕获单元(8)时，因为流体从流道(10)经过的路径大于从储液腔室(14)，细胞会先进入储液腔室(14)，由于捕获通道(16)小于细胞，细胞被卡在捕获通道(16)前，同时堵住捕获通道(16)，流经储液腔室(14)的流体流速趋近于零，此时后续的细胞无法再次进入该储液腔室(14)，只能通过流道(10)进入下一个捕获单元，这样就实现了单细胞的捕获。在后续的微球/细胞捕获单元中重复该过程，即可实现高通量单细胞的捕获。
b、保持连接通道(13)关闭状态，在微球通道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，与步骤a类似可以在并行的另一个微球通道中实现高通量单微球的捕获。具体过程如下：从通道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，当单个微球进入捕获单元(9)时，因为流体从流道(11)经过的路径大于从储液腔室(15)，微球会先进入储液腔室(15)，由于捕获通道(17)小于微球，微球被卡在捕获通道(17)前，同时堵住捕获通道(17)，流经储液腔室(15)的流体流速趋近于零，此时后续的微球无法再次进入该储液腔室(15)，只能通过流道(11)进入下一个捕获单元。在后续的微球捕获单元中重复该过程，即可实现该流道内高通量单微球的捕获。同时实现了两个单微球/细胞的高通量配对捕获。
c、保持连接通道(13)关闭状态，分别细胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入清洗溶液，洗去通道中残余的细胞和微球。
d、保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入清洗溶液或者反应溶液A，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液或者反应溶液B，将微球通道和捕获腔室的清洗溶液替换为相应的反应溶液。
e、保持连接通道(13)关闭状态，将细胞入口(1)打开，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相，当油相进入捕获单元(8)时，由于捕获通道(16)远小于流道(10)，其毛细阻力较大，因此油相进入流道(10)而不进入捕获通道(16)并将溶液从捕获腔室(14)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中。当油相流通完整个芯片时，所有的单细胞均被隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，且相邻的液滴被油相隔开，不会相会干扰。
f、保持连接通道(13)关闭状态，在e步骤进行的同时，将微球入口(2)打开，关闭出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相，当油相进入捕获单元(9)时，由于捕获通道(17)远小于流道(11)，其毛细阻力较大，因此油相进入流道(11)而不进入捕获通道(17)并将溶液从捕获腔室(15)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，这样就实现了在并行的捕获通道中的单微球隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，且相邻的液滴被油相隔开，不会相会干扰。
g、关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开，此时并行通道中包裹微球/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，微球储液腔室(15)里面的细胞裂解液或者反应溶液B扩散到细胞储液腔室(14)将细胞裂解，释放单细胞中的内含物，且内含物也可以通过扩散作用进入微球捕获腔室，与反应溶液A和微球一起充分接触后被捕获或者反应，单细胞中的内含物反应后可以被微球全部捕获，完成所有单微球对与其配对的单细胞的内含物的单独捕获。
h、打开细胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再从两个通道入口(1，2)分别通入洗涤溶液，将未被捕获的其他物质洗去；将捕获层与控制层剥离开，回收捕获通道中的微球，然后再次用洗涤溶液清洗微球，进一步除去溶液中未结合的其他物质。
i、配制连接酶反应溶液，将微球分散在酶反应溶液中，将微球上的编码信息与所捕获的内含物通过酶反应连接在一起形成编码内含物信息，用洗涤溶液对清洗完成酶反应的微球进行洗涤。
j、外切酶切割：配制核酸外切酶I反应溶液，将经过酶反应的微球分散在核酸外切酶I反应溶液中反应，切割去掉多余的单链编码引物，保留编码内含物信息，然后用洗涤溶液洗涤微球，将微球分散在缓冲溶液中。
k、建库测序：配制PCR反应溶液，将微球分散在PCR反应溶液中对编码内含物信息进行PCR扩增，微球上的编码内含物信息被扩增到溶液中，对扩增产物进行纯化并定量；用纯化后的扩增产物进行DNA文库构建并测序。
l、生物信息学分析：分析得到的高通量测序结果，根据编码分析物信息对单细胞中的内含物进行定量分析，绘制针对内含物的单细胞分子生物学图谱。
本发明的一个优选的实施方式中，可分析的对象为单细胞的内含物，包括转录组、基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂的至少一种。
本发明的一个优选的实施方式中，分析的对象可以是这些内含物的一类或者几类。
本发明的一个优选的实施方式中，能够分析的数量根据实际情况而定，可以是1个，10个，100个，1000个，10000个，100000个。
本发明的一个优选的实施方式中，所用微球为编码微球，微球上的编码信息由通用引物、细胞编码、分子编码、捕获探针四部分组成。其中所有微球上的通用引物含有相同的核酸序列，用来扩增编码内含物；单个微球上的细胞编码含相同的核酸序列、不同微球上的细胞编码序列不同，用来对编码不同的单细胞内含物；微球上的分子编码为随机序列、各不相同，用来对内含物进行定量分析；捕获探针含相同的核酸序列，用来捕获内含物。
本发明的一个优选的实施方式中，步骤d通入的反应溶液A可以为PBS、带DNA标签的抗体混合溶液、基因组扩增溶液、DNA转座酶反应溶液、DNA片段化溶液或RNA片段化溶液等。
本发明的一个优选的实施方式中，步骤g中编码微球对内含物的捕获方式为捕获探针与目标内含物互补杂交，或者与目标内含物上结合的DNA/RNA标签杂交。
本发明的一个优选的实施方式中，步骤d通入的反应溶液B可以为PBS、细胞裂解液等。
本发明的一个优选的实施方式中，步骤i中的酶反应溶液为逆转录酶反应溶液、连接酶反应溶液、聚合酶反应溶液、基因组酶扩增反应溶液等。
本发明的一个优选的实施方式中，步骤l中，利用细胞编码信息区别内含物所属的细胞个体，根据内含物的种类和分子编码的数量对目标内含物定量分析，从而绘制单细胞内含物生物学表达图谱。
本发明的一个优选的实施方式中，所使用的微流控芯片可以为芯片中的任意结构。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1.本发明采用微流控技术，具有高通量、易集成、易自动化优点，单微球/细胞占有率高，在有限微球/细胞数目的条件下可以使得绝大多数捕获单元捕获有单微球/细胞，能够根据芯片捕获单元的数目控制单微球/细胞捕获数目，目标分析数目范围广，从几个到几十万个不等。
2.本发明微球、细胞的捕获是基于微球/细胞尺寸和流体动力学原理，在完成单个微球/细胞的捕获后，后续的微球/细胞不会再次被同一个捕获单元捕获，只能进入后续的捕获单元，因此该芯片单微球/细胞捕获效率高、配对效率高，尤其适合单细胞分析。另外单微球/细胞配对效率高，能够实现对所有捕获的靶标进行分析，有效性较高。在微球/细胞数量较少的时候，也可以实现高效率的捕获，微球/细胞损失很少，特别适用于稀有样品的分析，比如循环肿瘤细胞(CTC)、干细胞等稀有细胞的分析。
3.本发明引入编码技术，可实现对成千上万个单细胞进行标记以及校正扩增的偏差，提高对单细胞内含物分析的通量以及准确性。同时编码技术的引入，可以实现一次测序获得成千上万个单细胞的信息，降低了测序成本。通过对细胞内含物的核酸编码，将细胞内含物的信息转化为DNA序列信息，不仅可以分析转录组、基因组等基因信息，也可以应用于蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等一类或者几类，大大拓展了分析靶标的范围。
附图说明
图1芯片整体结构俯视图，其中1、2是微球/细胞入口，3是隔离泵入口，4、5是微球/细胞通道油相入口，6、7是微球/细胞出口。
图2芯片放大结构示意图，其中8、9是微球/细胞捕获单元，10、11是微球/细胞流路通道，12是隔离泵通道，13是连接通道。
图3微球/细胞配对捕获单元俯视图，其中10、11是微球/细胞流路通道，12是隔离泵通道，13是连接通道，14、15是微球/细胞捕获单元储液腔室，16、17是微球/细胞捕获通道。
图4微球/细胞配对捕获单元截面图，其中13是连接通道，14、15是微球/细胞储液腔室，12是隔离泵通道，18是间隔薄膜。
图5高通量单细胞mRNA分析编码微球结构示意图，编码微球由由通用引物、细胞编码、分子编码、polyT四部分组成。其中所有微球上的通用引物含有相同的核酸序列，用来扩增编码内含物；单个微球上的细胞编码含相同的核酸序列、不同微球上的细胞编码序列不同，用来对编码不同的单细胞mRNA；微球上的分子编码为随机序列、各不相同，用来校正扩增偏差，对mRNA进行准确定量分析；polyT是用来捕获带有polyA尾巴的mRNA。
图6高通量单细胞转录组分析流程图
图7高通量单细胞基因组分析编码微球结构示意图，编码微球由由通用引物、细胞编码、分子编码、捕获探针四部分组成。其中所有微球上的通用引物含有相同的核酸序列，用来扩增编码内含物；单个微球上的细胞编码含相同的核酸序列、不同微球上的细胞编码序列不同，用来对编码不同的单细胞基因组；微球上的分子编码为随机序列、各不相同，用来校正扩增偏差；捕获探针含有相同的核酸序列，用来捕获片段化的基因组。
图8高通量单细胞基因组分析流程图。
具体实施方式
实施例1
如图1至图3所示，本发明用于高通量配对捕获单微球和单细胞，该芯片由标准软光刻技术加工，包括捕获层、控制层、载片三部分。捕获层由细胞流道(10)、微球流道(11)、连接通道(13)三部分组成，控制层由隔离通道(12)组成。其中细胞流道含有多个串联的细胞捕获单元(8)，每个单元由流道(10)、储液腔室(14)、捕获通道(16)三部分组成；参见图3，流道(10)包括U形管，前一单元的U形管的左臂端连接后一单元的U形管的右臂端，U形管之间的连接部分为直管，储液腔室(14)位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管右臂，第二通道(捕获通道16)直径小于捕获的单微球/单细胞，通往U型管的左臂；第三通道为连接通道13，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往微球捕获单元储液腔室(15)。
微球流道含有多个串联的微球捕获单元(9)，微球捕获单元(9)和细胞捕获单元对称设置，每个单元由流道(11)、储液腔室(15)、捕获通道(17)三部分；参见图3，流道(11)包括U形管，前一单元的U形管的左臂端连接后一单元U形管的右臂端，U形管之间的连接部分为直管，储液腔室(15)位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管右臂，第二通道(捕获通道17)直径小于捕获的单微球/单细胞，通往U型管的左臂；第三通道为连接通道13，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往细胞捕获单元的储液腔室(14)。
控制层内设有隔离通道(12)；隔离通道(12)位于连接通道13下方，垂直于连接通道(13)，并由隔膜18隔开；隔离通道(12)连接一隔离泵，通过改变隔离通道(12)的压力阻断或连通连接通道(参见图4)；细胞流道含有一个细胞入口(1)和油相入口(4)以及一个出口(7)，微球流道含有一个微球入口(2)和油相入口(5)以及一个出口(6)，隔离通道12只含有一个入口(3)。
作为本发明的优选实施方式，所述的细胞流道宽度为60μm，储液腔室直径为100μm，细胞捕获通道宽度为6μm，通道深度为46μm，细胞捕获单元为720个。
作为本发明的优选实施方式，所选用的细胞为A549细胞，细胞直径为10-20μm。
作为本发明的优选实施方式，所述的微球流道宽度为60μm，储液腔室直径为100μm，微球捕获通道宽度为15μm，通道深度为46μm，微球捕获单元为720个。
作为本发明的优选实施方式，所选用的聚苯乙烯微球，直径为40μm。
作为本发明的优选实施方式，所选用的聚苯乙烯微球上含有mRNA捕获序列T30，T30可以与带有polyA尾巴的mRNA杂交。
作为本发明的优选实施方式，控制层中所述的隔离通道宽度为30μm，高度为30μm。
作为本发明的优选实施方式，所述的所有入口均为圆柱形孔，直径为1.00mm。
作为本发明的优选实施方式，所述的捕获层和控制层的材料均为聚二甲基硅氧烷PDMS。
作为本发明的优选实施方式，所述的载片的材料为玻璃。
作为本发明的优选实施方式，隔离通道充满水溶液，通过控制注射泵的驱动的压力，控制隔离泵压力。
作为本发明的优选实施方式，所选用的细胞流速为0.04mL/h。
作为本发明的优选实施方式，所选用的微球流速为0.2mL/h。
作为本发明的优选实施方式，所选用的油相流速为0.1mL/h。
实施例2
高通量单细胞转录组分析
a、单细胞捕获：在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入细胞A549悬浮液，当单细胞进入捕获单元(8)时，因为流体从流道(10)经过的路径大于从储液腔室(14)，细胞会先进入储液腔室(14)，由于捕获通道(16)小于细胞，细胞被卡在捕获通道(16)前，同时堵住捕获通道(16)，流经储液腔室(14)的流体流速趋近于零，此时后续的细胞无法再次进入该储液腔室(14)，只能通过流道(10)进入下一个捕获单元，完成了单个A549细胞的捕获。在后续的细胞捕获单元中重复该过程，完成高通量单细胞的捕获。
b、单编码微球捕获：保持连接通道(13)关闭状态，在微球通道入口(2)用注射泵通入mRNA编码微球悬浮液(结构如图5所示)，与步骤a类似可以在并行的微球通道中实现高通量单mRNA编码微球的捕获。具体过程如下：从通道入口(2)用注射泵通入mRNA编码微球悬浮液，当单个微球进入捕获单元(9)时，因为流体从流道(11)经过的路径大于从储液腔室(15)，微球会先进入储液腔室(15)，由于捕获通道(17)小于微球，微球被卡在捕获通道(17)前，同时堵住捕获通道(17)，流经储液腔室(15)的流体流速趋近于零，此时后续的微球无法再次进入该储液腔室(15)，只能通过流道(11)进入下一个捕获单元，完成单个mRNA编码微球的捕获。在后续的微球捕获单元中重复该过程，完成高通量单mRNA编码微球的捕获。同时实现了单mRNA编码微球/细胞的高通量配对捕获。
c、清洗：保持连接通道(13)关闭状态，分别细胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入PBS溶液，洗去通道中残余的细胞和微球。
d、保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入PBS溶液，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液(0.2％Triton X-100)，将微球通道溶液替换为细胞裂解液。
e、单细胞隔离：保持连接通道(13)关闭状态，将细胞入口(1)打开，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相FC40，当FC40进入捕获单元(8)时，由于捕获通道(16)远小于流道(10)，其毛细阻力较大，因此FC40进入流道(10)而不进入捕获通道(16)并将溶液从捕获腔室(14)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中。当油相流通完整个芯片时，所有的单个A549细胞均被隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元。
f、单微球隔离：保持连接通道(13)关闭状态，在e步骤进行的同时，将微球入口(2)打开，关闭出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相FC40，当FC40进入捕获单元(9)时，由于捕获通道(17)远小于流道(11)，其毛细阻力较大，因此FC40进入流道(11)而不进入捕获通道(17)并将溶液从捕获腔室(15)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，这样就实现了在并行的捕获通道中的单微球隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，每个液滴中含有单微球以及细胞裂解液。
g、单细胞平行裂解：关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开，此时并行通道中包裹编码微球/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，微球储液腔室(15)里面的细胞裂解液扩散到细胞储液腔室(14)进行细胞裂解，释放单细胞中的mRNA，且mRNA也可以通过扩散作用进入与之配对的微球捕获腔室，被mRNA编码微球上的捕获序列捕获，配对微球/细胞之间进行独立的mRNA捕获，无交叉污染。
h、编码微球回收：打开细胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再从两个通道入口(1，2)分别通入洗涤溶液PBS，将细胞裂解液洗去；将捕获层与控制层剥离开，取50μlPBS滴加在芯片表面来回吸打回收捕获通道中的微球，重复3次。合并回收溶液然后再次用PBS清洗微球，进一步除去溶液中残留的其他物质。
i、逆转录：配制逆转录反应溶液，逆转录溶液的配方如下表。将微球分散在逆转录反应溶液中，在旋转混匀器上室温反应30分钟，再置于42℃烘箱中旋转孵育90分钟，然后用PBS清洗微球，将微球保存在10mM Tris缓冲溶液中(pH8.0)。此时微球上的mRNA被逆转录为cDNA，每条cDNA上附有对应微球的编码信息。
逆转录反应溶液配方
编码微球序列
j、外切酶切割：配制核酸外切酶I反应溶液，配方如下表所示。将微球分散在核酸外切酶I反应溶液中反应，切割去掉多余的单链编码引物，保留编码cDNA，然后用PBS洗涤微球，将微球分散在10mM Tris缓冲溶液中(pH8.0)保存。
核酸外切酶I配方
k、PCR扩增：配制PCR反应溶液，PCR反应溶液配方以及条件如下表所示。将微球分散在PCR反应溶液中对编码cDNA进行PCR扩增，微球上的编码cDNA信息被扩增到溶液中。
PCR反应溶液配方
PCR反应条件
l、DNA文库构建及上机测序：采用常规DNA文库构建技术进行DNA文库构建，质检合格后，采用IlluminaHiSeq X Ten测序系统进行测序。
m、生物信息分析：对编码cDNA进行高通量测序，共20Gb数据进行分析。其中首先通过细胞编码将不同细胞的转录组信息区别开，在根据每个细胞中分子编码以及基因信息分析单细胞mRNA的表达量，绘制单细胞mRNA表达图谱，并进行单细胞mRNA的可变剪切分析、新转录本/lncRNA预测、变异分析等，研究人非小细胞肺癌细胞A549演变过程中基因表达水平的变化、关键基因的变异以及变异率，加深对细胞生物学状态、转录过程的本质以及基因表达调控的认识，解释更多的诸如遗传性疾病的成因、癌症恶化的机制等，为个性化医疗、精准医疗等提供坚实的理论基础，完善的肿瘤诊疗体系，进而从个体水平实现有效的靶向治疗。
实施例3：单细胞基因组分析
高通量单细胞基因组分析
a、单细胞捕获：在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入细胞A549悬浮液，当单细胞进入捕获单元(8)时，因为流体从流道(10)经过的路径大于从储液腔室(14)，细胞会先进入储液腔室(14)，由于捕获通道(16)小于细胞，细胞被卡在捕获通道(16)前，同时堵住捕获通道(16)，流经储液腔室(14)的流体流速趋近于零，此时后续的细胞无法再次进入该储液腔室(14)，只能通过流道(10)进入下一个捕获单元，完成了单个A549细胞的捕获。在后续的细胞捕获单元中重复该过程，完成高通量单细胞的捕获。
b、单编码微球捕获：保持连接通道(13)关闭状态，在微球通道入口(2)用注射泵通入基因组编码微球悬浮液(结构如图7所示)，与步骤a类似可以在并行的微球通道中实现高通量单基因组编码微球的捕获。具体过程如下：从通道入口(2)用注射泵通入基因组编码微球悬浮液，当单个微球进入捕获单元(9)时，因为流体从流道(11)经过的路径大于从储液腔室(15)，微球会先进入储液腔室(15)，由于捕获通道(17)小于微球，微球被卡在捕获通道(17)前，同时堵住捕获通道(17)，流经储液腔室(15)的流体流速趋近于零，此时后续的微球无法再次进入该储液腔室(15)，只能通过流道(11)进入下一个捕获单元，完成单个基因组编码微球的捕获。在后续的微球捕获单元中重复该过程，完成高通量单基因组编码微球的捕获。同时实现了单基因组编码微球/细胞的高通量配对捕获。
c、清洗：保持连接通道(13)关闭状态，分别细胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入PBS溶液，洗去通道中残余的细胞和微球。
d、保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入DNA片段化溶液，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液(0.2％Triton X-100)，将细胞通道溶液置换为DNA片段化溶液，采用Nextera试剂盒(Nextera DNA Library Preparation Kit,Illumina)，微球通道溶液置换为细胞裂解液。
DNA片段化溶液配方
e、单细胞隔离：保持连接通道(13)关闭状态，将细胞入口(1)打开，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相FC40，当FC40进入捕获单元(8)时，由于捕获通道(16)远小于流道(10)，其毛细阻力较大，因此FC40进入流道(10)而不进入捕获通道(16)并将溶液从捕获腔室(14)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中。当油相流通完整个芯片时，所有的单个A549细胞均被隔离在单个油包水液滴中，每个液滴中含有单个的A549细胞以及DNA片段化溶液，形成独立的反应单元。
f、单微球隔离：保持连接通道(13)关闭状态，在e步骤进行的同时，将微球入口(2)打开，关闭出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相FC40，当FC40进入捕获单元(9)时，由于捕获通道(17)远小于流道(11)，其毛细阻力较大，因此FC40进入流道(11)而不进入捕获通道(17)并将溶液从捕获腔室(15)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，这样就实现了在并行的捕获通道中的单微球隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，每个液滴中含有单微球以及细胞裂解液。
g、单细胞平行裂解：关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开，此时并行通道中包裹编码微球/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，微球储液腔室(15)里面的细胞裂解液扩散到细胞储液腔室(14)进行细胞裂解，释放单细胞中的基因组，且释放出的基因组与细胞捕获腔体中的DNA片段化溶液反应，基因组被转座酶Tn5打断成350bp左右的片段，每个片段附带一段固定的单链DNA序列，编码微球上的捕获序列与固定单链DNA序列互补杂交，这样单细胞中被片段化的基因组被与之配对的编码微球捕获，且配对微球/细胞之间进行独立的基因组捕获，无交叉污染。
h、编码微球回收：打开细胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再从两个通道入口(1，2)分别通入洗涤溶液PBS，将细胞裂解液洗去；将捕获层与控制层剥离开，取50μl PBS滴加在芯片表面来回吸打回收捕获通道中的微球，重复3次。合并回收溶液然后再次用PBS清洗微球，进一步除去溶液中残留的其他物质。
i、基因组片段编码延伸：配制延伸反应溶液，延伸溶液的配方如下表。将微球分散在反应溶液中，在旋转混匀器上室温反应10分钟，再置于65℃烘箱中旋转孵育90分钟，然后用PBS清洗微球，将微球保存在10mM Tris缓冲溶液中(pH8.0)。此时微球上的编码引物以捕获的基因组片段为模板进行延伸，将每个单细胞基因组片段上结合上编码信息。单个细胞的基因组片段附有对应微球的编码信息。
延伸反应溶液配方
基因组编码微球序列
k、PCR扩增：配制PCR反应溶液1，PCR反应溶液配方1以及条件1如下表所示。将微球分散在PCR反应溶液1中对编码基因组片段进行PCR扩增，微球上的编码基因组片段信息被扩增到溶液中。配制PCR反应溶液2，PCR反应溶液配方2以及条件2如下表所示，将PCR反应溶液1作为PCR反应2的模板进行进一步扩增。
PCR反应溶液配方1
PCR反应条件1
PCR反应溶液配方2
PCR反应条件2
l、DNA文库构建及上机测序：采用常规DNA文库构建技术进行DNA文库构建，质检合格后，采用IlluminaHiSeq X Ten测序系统进行测序。
m、生物信息分析：对编码基因组进行高通量测序，共110Gb数据进行分析。通过细胞编码将不同细胞的基因组信息分类，针对每个单细胞的测序信息比对NCBI人参考序列，分析每个单细胞的平均测序深度，分析每个单细胞基因组的遗传变异信息，如DNA拷贝数变异(CNV)、单核苷酸多态性位点(SNP)、少数碱基的插入和确实(InDel)、结构变异(SV)等。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换、具体方式的选择等，均属于本发明的保护范围和公开范围之内。
<110>厦门大学
<120>一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法
<160>7
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>1
AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTGAA 25
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>2
AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGT 23
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>3
AGATGTGTAT AAGAGACAG 19
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>4
CTGTCTCTTA TACACATCTC TGATGGCGCG AGGGAGGC 38
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>
GTGAGTGATG GTTGAGGTAG TGTGGAG 27
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>6
AATGATACGG CGACCACCGA GGCCTCCCTC GCGCCATCAG 40
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>7
AATGATACGG CGACCACCGA G 21
Claims (8)
1.一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，所述方法包括如下步骤：
首先提供一微流控芯片，该微流控芯片包括捕获层、控制层、载片三部分；捕获层包括两个并行的流道(10，11)和连接通道(13)，控制层包括隔离通道(12)；其中每个捕获通道由多个捕获单元(8，9)首尾串接而成，每个单元包括流道(10，11)、储液腔室(14，15)、捕获通道(16，17)三部分，流道(10，11)包括U形管，前一单元U形管的左臂端连接后一单元U形管的右臂端，储液腔室(14)位于U形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往U形管的液体进口端，第二通道为捕获通道，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往U型管的液体出口端；第三通道为连接通道(13)，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往并行的另一捕获单元的储液腔室；
连接通道(13)连接两个捕获单元的储液腔室(14，15)；隔离通道(12)层位于连接通道(13)下方或上方，垂直于连接通道(13)并由隔膜(18)隔离开；两个流道分别含有一个样品入口(1，2)、一个油相入口(4，5)以及一个出口(6，7)，隔离通道含有一个入口(3)；
a、在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入细胞悬浮液，各捕获单元(8)捕获单细胞；
b、保持连接通道(13)关闭状态，在微球通道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，在并行的另一个微球通道中实现高通量单微球的捕获；
c、保持连接通道(13)关闭状态，分别细胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入清洗溶液，洗去通道中残余的细胞和微球；
d、保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入清洗溶液或者反应溶液A，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液或者反应溶液B，将微球通道和捕获腔室的清洗溶液替换为相应的反应溶液；
e、保持连接通道(13)关闭状态，将细胞入口(1)打开，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相，储液腔室内形成一个油包水的液滴，液滴中含有单细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中；
f、保持连接通道(13)关闭状态，将微球入口(2)打开，关闭出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相，储液腔室形成一个油包水的液滴，液滴中含有单微球，形成独立的反应单元；
g、关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开，此时并行通道中包裹微球/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，微球储液腔室(15)里面的细胞裂解液或者反应溶液B扩散到细胞储液腔室(14)将细胞裂解，释放单细胞中的内含物，且内含物通过扩散作用进入微球捕获腔室，与反应溶液A和微球一起充分接触后被捕获或者反应，单细胞中的内含物反应后被微球全部捕获，完成所有单微球对与其配对的单细胞的内含物的单独捕获；
h、打开细胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再从两个通道入口(1，2)分别通入洗涤溶液，将未被捕获的其他物质洗去；将捕获层与控制层剥离开，回收捕获通道中的微球，然后再次用洗涤溶液清洗微球，进一步除去溶液中未结合的其他物质；
i、配制连接酶反应溶液，将微球分散在酶反应溶液中，将微球上的编码信息与所捕获的内含物通过酶反应连接在一起形成编码内含物信息，用洗涤溶液对清洗完成酶反应的微球进行洗涤；
j、外切酶切割：配制核酸外切酶I反应溶液，将经过酶反应的微球分散在核酸外切酶I反应溶液中反应，切割去掉多余的单链编码引物，保留编码内含物信息，然后用洗涤溶液洗涤微球，将微球分散在缓冲溶液中；
k、建库测序：配制PCR反应溶液，将微球分散在PCR反应溶液中对编码内含物信息进行PCR扩增，微球上的编码内含物信息被扩增到溶液中，对扩增产物进行纯化并定量；用纯化后的扩增产物进行DNA文库构建并测序；
l、生物信息学分析：分析得到的高通量测序结果，根据编码分析物信息对单细胞中的内含物进行定量分析，绘制针对内含物的单细胞分子生物学图谱。
2.根据权利要求1所述的一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，其特征在于：待分析的单细胞内含物为转录组、基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体或磷脂中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，其特征在于：所述的微球为DNA编码微球，微球上的编码信息由通用引物、细胞编码、分子编码、捕获探针四部分组成；其中所有微球上的通用引物含有相同的核酸序列，用来扩增编码内含物；单个微球上的细胞编码含相同的核酸序列、不同微球上的细胞编码序列不同，用来对编码不同的单细胞内含物；微球上的分子编码为随机序列、各不相同，用来对内含物进行定量分析；捕获探针含相同的核酸序列，用来捕获内含物。
4.根据权利要求1所述的一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，其特征在于：步骤d通入的反应溶液A为PBS、带DNA标签的抗体混合溶液、基因组扩增溶液、DNA转座酶反应溶液、DNA片段化溶液或RNA片段化溶液中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，其特征在于：步骤d通入的反应溶液B为PBS或细胞裂解液。
6.根据权利要求1所述的一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，其特征在于：步骤g中编码微球对内含物的捕获方式为捕获探针与目标内含物互补杂交，或者与目标内含物上结合的DNA标签杂交。
7.根据权利要求1所述的一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，其特征在于：步骤i中的连接酶反应溶液为逆转录酶反应溶液、DNA/RNA连接酶反应溶液、聚合酶反应溶液、基因组酶扩增反应溶液中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，其特征在于：步骤l中，利用细胞编码信息区别内含物所属的细胞个体，根据内含物的种类和分子编码的数量对目标内含物定量分析，从而绘制单细胞内含物生物学表达图谱。
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