CN103602583A - 一种集成式多功能微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于细胞捕获、裂解、DNA浓缩和纯化、PCR扩增的微流控芯片，属于生物及医学检测领域。本发明公开了这种微流控芯片，包括四层芯片结构，用于样品入口的盖片、嵌合有用于细胞捕获滤膜、细胞裂解和DNA纯化和浓缩的芯片层以及用于PCR扩增的芯片层和用于附着加热装置的基片层。本发明的微流控芯片体积小、结构简单、易于操作、成本低、性能稳定、分析检测灵敏度高、疾病诊断周期短，适用于有关疾病的诊断。

Description

一种集成式多功能微流控芯片

技术领域

本发明涉及一种集成式多功能微流控芯片，主要用于微生物样品中细胞的捕获、细胞裂解、DNA纯化及浓缩和PCR扩增，达到检测样品中微生物的目的，属于生命科学和医学检测领域。

背景技术

微全分析系统的概念于20世纪90年代初首次提出，在此后十余年中该领域已发展为当前世界上最前沿的科技领域之一。微全分析系统将目前现代宏观实验室中的生物化学分析技术的许多过程与步骤，在生物化学分析技术的功能缩微化的基础上，实现生物化学分析技术全分析过程结构集成化，即将传统成熟的生物化学分析技术实验室各种器具和仪器的结构进行缩微，同时将现代宏观实验室中的的生物化学分析技术实验室各种器具和仪器具有的功能进行集成，在100平方毫米左右（甚至更小的面积）的芯片上，实现微型化的全过程与步骤的生物化学分析系统，达到生物化学分析目的。微全分析系统具有检测速度快、试样用量少、通量高等显著的特点，因此深受世界各国的极为关注，并开展了大量的相关研究。

微流控芯片分析技术很快成为实现微全分析系统理念的实用技术，已应用到生物工程、临床医学检验、卫生免疫、国防化学、农业、林业、畜牧业、海洋渔业、法医、运动医学、食品监督检验、制药、化工、环境监测、生化反恐等领域。在产业化方面，全球基于微流控技术的产品的年利润以每年20%的增长率迅速突破150亿欧元。

微流控芯片分析技术是将整个实验室的功能，从加样、反应、分离、检测等过程集成在只有几平方厘米的微型芯片上，目前已经在化学合成，细胞培养，药物高通量筛选，疾病诊断，食品安全，血液分析和环境检测等方面取得重要进展。微流控芯片技术的发展，使得芯片上细胞捕获、细胞裂解和PCR技术得以实现。随着微加工技术的发展，微流体所经过的沟道尺寸从微米级已经进入到纳米级，使得微流控技术的研究对象从细胞级进入到了分子级。微流控技术已经成为当今的研究前沿和热点。

自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养物，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同材料，可以采用不同的方法，最终目的是要分离出目标微生物。

对分离后获得的细胞进行裂解的常用方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA断裂。这两种方法（包括SDS和溶解酶处理等）是提取纯化DNA的常用方法。对细菌细胞和病毒颗粒的DNA/RNA的分析是很多技术领域（如诊断学、环境检测、法庭辩论和分子生物学）研究中的关键步骤，为了分析含有核酸的样品，通常需要进行两个步骤。首先，对样品进行破碎、分离和浓缩以产生纯化的核酸提取物。其次，扩增纯化的核酸提取物以增加存在的核酸量，以利于核酸的检测。

常规地，核酸的提取、纯化和扩增是在实验室由经过训练的技术人员手动进行的。这不仅需要有技术熟练的使用者，还由于使用者错误而导致显著的错误率。另外，这种常规提取使得提取、纯化和扩增无法在现场即时进行，因此，生物测定的结果被推迟。因此，需要提供生物测定，其降低和简化使用者输入，并使得测定可在实际取样的时间和地点进行，例如在医生的手术室、诊所、兽医的手术室、甚至在患者的家中或者野外。

微流控芯片分析技术是进行完备的生物反应的有吸引力的选择，它只需要使用者进行尽可能少的试剂操作，并且允许使用小样品的体积，这对于需要昂贵的试剂生物反应而言是一个显著的优点。

曾有一个提供微制造“芯片实验室”装置来提取和纯化含有核酸样品的方法在WO 2005/073691中描述。在该文献中，过滤含有细胞和/或颗粒的样品。将滤液（即细胞和/或颗粒）通过裂解流体进行裂解。然后，使已经裂解的样品通过核酸提取单元。核酸提取并保存在提取单元中，而裂解液流出该单元。合适的核酸提取方法的实例涉及在离液剂存在下使DNA结合到二氧化硅颗粒上。将提出的核酸用一次或多次洗涤溶剂洗涤，然后用洗脱液提取核酸。这个步骤也用于浓缩核酸。

当核酸被提取、浓缩和纯化后，然后通常需要对其进行扩增。通常使用聚合酶链式反应（PCR）技术，聚合酶链式反应技术，也称无细胞克隆技术，作为分子生物学和基因工程的一项重要技术，是一种在引物引导下选择性扩增DNA和RNA片段的方法。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在小容器内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增复制至几十万乃至几百万倍，共分析研究和检测鉴定。

PCR扩增需要反应液在高温变性，低温退火，中温延伸这三个温区之间不断变化，因此快速准确的循环温度控制是关键。传统的PCR技术存在热惯性大从而升降温慢、反应温度分布不均匀、反应体积大需要试剂量大、产物必须转移分离等缺点。研究表明，PCR反应实际上在变性和退火阶段所需要时间很短，PCR产物中如果能客服热惯性可以大大减少降温时间以加速整个反应过程。

连续流PCR通过使反应液流过不同的恒温温区进行PCR反应，可以克服传统的PCR的弱点，大大减少反应时间和对试剂的消耗。本发明在微流控连续流PCR的基础上，进一步扩展与创新，针对现有细胞捕获、细胞裂解及DNA纯化、浓缩等弱点，将细胞捕获、细胞裂解、DNA纯化及浓缩和PCR扩增集一个微流控装置控制。整体结构简单，具有模块化特点，便于集成使用和单独使用。

 

发明内容

本发明克服现有技术的不足，提供一种实现细胞捕获、细胞裂解、DNA纯化和浓缩、PCR扩增的微流控芯片，可以在微流控芯片上进行小样本快速、准确地检测，减少细胞裂解液、PCR试剂用量和缩短实现一次PCR扩增所需温度循环的时间，并对PCR扩增产物进行实时检测。

本发明通过以下技术方案实现：所述的微流控芯片包括用于样品进样的盖片，细胞捕获和裂解的芯片层，可有微孔道的PCR扩增芯片层，用于附着温度控制单元加热薄膜的玻璃基片。

所述的盖片层包括两个样品注入的进样口、样品注入通道。

所述的两个进样口分别用来注入样品和PCR反应液和细胞裂解液，样品注入通道分别用来注入样品和PCR反应液和细胞裂解液。

作为本发明的进一步改进，在样品的进样口处通过光刻技术形成有过滤装置，可以使直径大于100μm的颗粒被阻挡在外部，而不进入样品的孔道内，起到粗筛的作用。

所述的细胞捕获包括上部芯片和下部芯片，上部芯片和下部芯片之间形成有一条孔道，所述孔道具有入口和出口，上部芯片和下部芯片均是透明的材料。   

所述的孔道入口处放置有0.22μm的滤膜，孔道入口连接到盖片的进样孔道的出口。

作为本发明的进一步改进，PCR扩增层采用PDMS芯片，其上面的微孔道是根据特有生物菌种扩增时的PCR反应体系进行计算的，可通过不同的PCR扩增体积来设计微孔道的尺寸，实现不同的PCR扩增。

作为本发明的进一步改进，采用三个独立的温度控制单元分别实现PCR扩增所需要的三个恒温区，三个独立的恒温区分别为低温退火恒温区、适温延伸恒温区和高温变性恒温区，所述的低温退火恒温区、适温延伸恒温区和高温变性恒温区是依次并排设置的，所述的低温退火恒温区、适温延伸恒温区和高温变性恒温区分别具有三个基本PCR反映步骤所需的温度，在上述三个独立的恒温区的上方放置有PCR微流控芯片，在PCR微流控芯片内分布有扩增反应管，扩增反应管有PCR反应液进口、PCR反应产物出口和DNA扩增反应管，PCR反应液进口位于高温变性区内，扩增反应管依次穿过我高温变性区、适温延伸区和低温退火区，PCR微流控芯片中的PCR反应能在低温退火区、适温延伸区和高温变性区中实现；PCR微流控芯片中各PCR反应的高温变性区、适温延伸区和低温退火区相应与控制解链、延伸和退火的三个温区位置相对应。

所述的温度控制单元由铜薄膜加热片、Pt100、多路电源和PID温控仪组成，铜薄膜加热片用来对PCR微孔道进行加热，Pt100作为温度传感器用于检测PCR反应腔的温度并将温度转换成电信号，通过预先存储在PID温控器的数据处理及控制单元中的电信号和温度之间的相互关系，来确定PCR反应腔的温度并对铜薄膜加热片进行反馈控制，可以实现高精度的温度控制，多路电源是将交流电转化为直流电并对铜薄膜加热片加热。

所述的数据处理及控制单元实现对温度控制单元和信号探测单元数据的采集、处理、存储和显示；数据处理及控制单元首先向温度控制单元发出命令，使铜薄膜加热片对反应腔中的PCR反应试剂进行加热，温度传感器实时测量PCR反应腔中的PCR反应试剂的温度；当达到设定值时，数据处理及控制单元发出命令停止加热，从而实现高精度温度控制。

    本发明在微流控芯片上实现了细胞捕获、细胞裂解、DNA纯化和浓缩、PCR扩增一体化集成。三个独立的微型恒温器，可精确控制高温变性、低温退火及适温延伸三个基本反应步骤的温度，实现微流控芯片中的PCR反应。微流控装置集细胞捕获、细胞裂解及DNA纯化、浓缩功能，大大提高了实验的检测时间、成本、染料污染，简化并避免了细胞捕获、裂解DNA纯化、浓缩等实验室操作繁琐和污染，拓宽了PCR集成微流控芯片的研究范围。本发明将细胞捕获、细胞裂解、DNA纯化和浓缩、PCR扩增集成为一体，快捷、简便、集成化程度高。

附图说明

图1为本发明的集成细胞捕获、裂解、DNA纯化和浓缩、PCR扩增一体化的功能原理图。

图2为本发明的集成化细胞捕获、裂解、DNA纯化和浓缩、PCR扩增一体化装置示意图。

 

具体实施方案

下面结合具体的实例和附图对本发明进行详细说明，以下实施例详细显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其同物界定。

如图1和2 所示，本发明所提供的集成式多功能微流控芯片，包括细胞捕获、裂解、DNA纯化和浓缩、PCR扩增三个功能单元。细胞捕获通过滤膜装置在两层芯片之间的滤膜实现，DNA的纯化和浓缩液是通过裂解后的滤膜实现。在两层芯片之间放置有0.22μm的滤膜，使样品中的细胞在流经样品孔道处时被阻拦在滤膜上，通过加入特异性细胞裂解液，将滤膜上的细胞进行裂解，然后流入到DNA纯化和浓缩管道内，在DNA纯化和浓缩管道内将细胞裂解的碎片杂志除去，使DNA进行纯化和浓缩然后流入到PCR扩增的管道，作为PCR扩增的模板。在微流控芯片的玻璃基片上附着有三个独立的恒温器，三个独立的恒温器分别为低温退火恒温器、适温延伸恒温器和高温变性恒温器，依序并排设置，分别形成有可精确控制温度的低温退火恒温区、适温延伸恒温区和高温变性恒温区的三个温度区，在低温退火恒温区、适温延伸恒温区和高温变性恒温区分别具有三个基本PCR反应步骤所需的温度。在上述三个独立的恒温器的上方放置有PCR微流控芯片，在PCR微流控芯片内分布有扩增反应管，扩增反应管有PCR反应液进液口，PCR反应产物出口和DNA扩增反应管，PCR反应进液口位于高温变性区内，扩增反应管依次穿过高温变性区、适温延伸区和低温退火区，最后完成PCR扩增反应。

Claims (9)

1.一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于主要包括细胞捕获、细胞裂解、DNA纯化和浓缩、PCR扩增和温度控制四个功能部分。

2.根据权利要求1所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于微流控芯片有用于样品进入的进样口的盖片、用于细胞捕获的嵌有直径0.22μm滤膜的第二层芯片、用于PCR扩增并刻蚀有微通道的第三层芯片、以及用于与温度控制单元连接的玻璃基片以及实现PCR三个温区的温度控制单元。

3.根据权利要求1所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于可通过加入特殊细胞裂解液使细胞裂解以及DNA纯化。

4.根据权利要求1所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于微流控芯片上PCR扩增层采用PDMS芯片，其上面的微孔道是根据特有生物菌种扩增时的PCR反应体系进行计算的，可通过不同的PCR扩增体积来设计微孔道的尺寸，实现不同PCR扩增的需要。

5.根据权利要求1所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于温度控制单元集成了薄膜加热器和电阻式温度控制，再通过连接到外部的控制电路来实现对反应区三个独立的温度控制，以满足PCR的扩增。

6.根据权利要求1所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于温度控制单元的薄膜加热器/温度传感器尺寸小，热熔和能耗均低，响应速度快，可集成化程度高。

7.根据权利要求1所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于数据处理及控制单元实现对温度控制单元和信号探测单元数据的采集、处理、存储和显示。

8.根据权利要求2所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于有样品进样口的盖片可以实现对样品进行粗滤，使粒径大于100μm以上的颗粒或杂质被阻挡，不会进入样品孔道中。

9.根据权利要求2所述的一种集成式多功能微流控芯片，其特征在于微流控芯片上所述的滤膜可以粒径是0.22μm，可选择性的将目标微生物过滤到滤膜上。

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