CN107904161B

CN107904161B - 一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法和检测方法

Info

Publication number: CN107904161B
Application number: CN201711350711.1A
Authority: CN
Inventors: 李敏; 汪骅; 刘倩; 徐燕萍; 秦娟秀
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN107904161A

Abstract

本发明涉及一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片，其包括设有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层基片，所述上层基片设置依次连通的样本处理及DNA提取区、流体控制区以及可视化检测区；其中，所述可视化检测区包括检测池，所述检测池设有包被特异性引物或DNA的色谱纸；所述流体控制区设置进行流体控制的螺丝阀；本发明还涉及上述微流控芯片的制备方法和检测方法。本发明提供了一种集样本处理、病原体核酸提取、扩增及可视化检测于一体的微流控芯片，其可简单、快速、可视化床旁检测病原体核酸，利用该微流控芯片的检测方法具有快速、简单、无需特殊仪器的特点，可应用于呼吸道、生殖道样本中各类病原体核酸的即时检验。

Description

一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及集成微流控芯片制造技术和基因诊断领域，尤其涉及一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法，以及一种采用微流控芯片进行病原体核酸的检测方法。

背景技术

人类健康和医学的发展史是一部与各种感染性疾病斗争的历史。每一次新发感染性疾病的出现，都导致了严重的社会恐慌和经济损失。呼吸道感染作为儿科的常见病、多发病，是引起世界范围内5岁以下儿童死亡的首位原因，其临床表现易被认识，但引起呼吸道感染的病因却很难明确。

呼吸道病原体的实验室检测，可以明确感染病因，有利于对疾病做出及时诊断、治疗，制定防控策略，阻止传播和流行。下呼吸道感染是最常见呼吸道感染性疾病，其中以社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)为多见，是威胁人群健康的常见感染性疾病之一。我国每年有数百万人罹患CAP，近年来，由于社会人口的老龄化、免疫损害宿主增加、病原体变迁和抗生素耐药率上升等原因，CAP的诊治面临许多新问题。CAP是在院外由细菌，病毒、衣原体和支原体等多种微生物所引起。肺炎链球菌和肺炎支原体在CAP的感染率分别为27％，15％。因此，检测上述高感染率的呼吸道病原体，有助于对CAP做出及时诊断、治疗，制定防控策略，阻止传播和流行。自1850年首次使用海藻(琼脂)生产培养基方法到分子生物学方法被引入病原体检测，微生物学检测法的变化日新月异。目前实验室检测方法主要包括病原体分离培养、血清学检测和分子生物学检测。肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia，Sp)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，Mp)分离培养虽然高度特异，但其敏感性较低，周期较长。病原体血清学抗体检测不能解决免疫学检测的“窗口期”问题，无法判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。病原体血清抗原检测虽具有很高的检测价值，但检出限为10^5-7个病原体，灵敏度低，限制了其在临床实验室的广泛开展。基于病原体DNA或RNA的核酸检测方法具有高敏感性、高特异性等优点，聚合酶链反应(PCR)技术已在实验室诊断中起到了关键的作用，已成为目前所有病原体首推的重要的确诊手段之一，但是，由于用于临床实验室的PCR技术都需依赖特定场所、设备、仪器及经培训上岗的工作人员，操作复杂，费时，技术要求高不适合病原体检测的常规开展。因此，临床微生物实验室急待研发、转化和推广快速、灵敏和准确的鉴定上述病原体核酸的技术方法。目前，FilmArray呼吸道病原体检测仪作为一种容易操作的多重PCR平台，可用于多重病原体检测，但仍需精良仪器对操作过程进行控制，且检测费用昂贵，限制了其在临床上的广泛使用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的体外等温扩增特异性核酸片段技术。此技术主要利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。因为其克服了传统PCR反应需通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，并避免了反复降温的耗时过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，可以在15-60分钟扩增出10⁹-10¹⁰倍靶序列拷贝，具有更高的灵敏度、特异性和扩增效率。LAMP在病原微生物的快速检测、遗传病诊断、单核苷酸多态性分型等领域显示出巨大的应用潜力。目前LAMP已应用于肿瘤突变基因、结核分枝杆菌、及病毒的快速检测。

LAMP产物检测方法包括琼脂糖电泳检测，焦磷酸镁浊度检测，荧光定量检测和荧光目测。LAMP产物琼脂糖电泳检测的结果为连续梯状电泳条带，但由于需要开盖检测，容易造成污染。荧光定量检测存在较为繁琐且需特殊仪器设备、成本高的特点。焦磷酸镁浊度检测是相对简便检测方法，但仍需实时浊度检测仪，从而限制了其广泛应用。荧光目测法是目前最简便、快速的方法，选择钙黄绿素作为荧光指示剂，反应前加入LAMP反应体系，一步反应后可直接裸眼准确判断反应结果，适用于即时检验(Point of care testing,POCT)。POCT主要是指在实验室以外的现场(包括患者床旁、急诊科室、医师诊所、家庭内)实施的快速检测。就LAMP技术本身而言，并不能实现分子诊断的POCT。LAMP结合微流控芯片则可摆脱对精良仪器设备及精确温度的的依赖，可望实现对病原体核酸的POCT。微流控芯片是一种在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的技术平台，在微型化、集成化和便携化方面的优势为生物分子即时检验提供了广阔的应用平台。随着交叉学科的发展，近几年发展的微流控芯片采用纸张代替硅、玻璃、高聚物等材料，通过各种加工技术，在纸上加工出具有一定结构的亲/疏微细通道网络及相关分析器件，从而构建成“纸上微型实验室。(lab-on-paper)。纸芯片廉价、生物相容性强，是捕获及稳定保存DNA的良好介质，也便于存贮干化的试剂(提供较大的反应面积)，成为目前微流控芯片研究领域的热点。

目前针对呼吸道病原体核酸检测，都需从临床样本中提取DNA或RNA，且需要相应的检测系统，如PCR分析仪、离心机或凝胶电泳仪等，受固定的检测场所限制，达不到POCT的要求。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种集样本处理、病原体核酸提取、扩增及可视化检测于一体的微流控芯片，其可简单、快速、可视化床旁检测病原体核酸，利用该微流控芯片的检测方法具有快速、简单、无需特殊仪器的特点，可应用于呼吸道、生殖道样本中各类病原体核酸的即时检验。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片，其包括设有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层基片，所述上层基片设置依次通过流体通道连通的样本处理及DNA提取区、流体控制区以及可视化检测区；其中，所述可视化检测区包括检测池，所述检测池设有包被特异性引物或DNA的色谱纸。

为了进一步优化上述微流控芯片，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述流体控制区设置进行流体控制的螺丝阀。目前微流控芯片阀门包括气阀、液压阀和电磁阀等，上述微阀制作复杂且需要精良仪器精确控制。本发明采用手动螺丝阀，在芯片成型过程中制备而成，操作简单且有效控制流体，适合在现场、野外及家庭进行操作。

进一步地，所述螺丝阀的直径为3～8mm，高为3～8mm，螺距为0.5～1.0mm；更优选为直径5mm，高5mm，螺距0.7mm。

进一步地，所述样本处理及DNA提取区为圆形通道区，其通过流体通道分别与样品入口、样品废液出口和流体控制区连通，所述样品入口和样品废液出口均设置于所述流体控制区的相对侧，并且所述样品入口和样品废液出口及其与样本处理及DNA提取区连接的流体通道均相对于所述流体控制区进行对称布置，以利于流体均匀流至可视化检测区。

进一步地，所述可视化检测区的入口处设置反应试剂入口。

进一步地，所述可视化检测区设置至少2个检测池，各检测池相对于所述流体控制区进行对称布置，每一检测池分别对应设置一与其连通的检测废液出口。

进一步地，所述流体控制区的流体通道为直线型通道。

进一步地，所述可视化检测区的流体通道包括第一通道、第二通道、第三通道和第四通道；其中，所述第一通道为直线型通道，所述第一通道的一端连接所述流体控制区和所述反应试剂入口，所述第一通道的另一端连接第二通道的中部；所述第二通道的两端各自连接用于将流体分配至相对应的检测池的第三通道，在所述检测池入口处的部分第三通道为波浪形通道；所述第四通道用于连接检测池和检测废液出口。上述流体通道的形状、尺寸及制作方法有利于流体均匀分配及螺丝微阀有效控制流体。

进一步地，所述第二通道为凹处朝向所述流体控制区的半圆弧形通道，确保提取的DNA和等温扩增反应试剂均匀分配至两边对称的检测池中；更进一步地，所述半圆弧形通道半径等于反应试剂入口的半径与第一通道的长度之和。

进一步地，所述检测池的数量为8个，其分为2组，每组4个检测池，每组各自检测不同的病原体核酸，2组分别对称位于所述流体控制区的两侧；其中每侧的第三通道均设置一个主分支点和两个次分支点，主分支点和次分支点均将流股进行对分，每一次分支点分别与2个检测池连通；其中，与每一主分支点连通的次分支点均相对于所述主分支点对称布置，与每个次分支点连通的检测池均相对于所述次分支点对称布置，以使得反应液流动至每一检测池的流动阻力相接近，保证各检测池均能被反应液充满，从而保证反应的完成度及检测的准确度。

进一步地，所述样品入口、样品废液出口、反应试剂入口、检测废液出口处均设置封堵件；优选地，所述封堵件为硅胶塞或硅胶贴。

进一步地，所述上层基片的材质为PDMS(聚二甲基硅氧烷)，所述下层基片的材质为玻璃硅片，所述螺丝阀的材质是PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)。

进一步地，所述微流控芯片选自圆盘形、四边形中的一种。

本发明的第二个目的是提供一种上述微流控芯片的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1)采用光刻胶制作微流控芯片阳模；

步骤2)将铸模溶液浇在步骤1)制得的微流控芯片阳模上，待铸模溶液固化后脱模获得具有微流控通道结构的上层基片；

步骤3)等离子机清洗由步骤2)获得的的上层基片以及下层基片，将包被特异型引物或DNA的色谱纸分别置于各检测池，然后将上层基片与下层基片进行封合，制备成可检测病原体核酸的微流控芯片。

为了进一步优化上述微流控芯片的制备方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述步骤1)中制作微流控芯片阳模的步骤包括：采用光刻胶工艺制作芯片微通道阳模，激光切割制作直径PMMA聚甲基丙烯酸甲酯微柱(直径10mm，高2mm)和PMMA微柱(直径3mm，高2mm)，采用无影胶将PMMA微柱分别粘贴在AZ-50阳模上，制成微流控芯片阳模。

进一步地，所述步骤2)中，将螺丝阀预先包埋于未固化的铸模溶液中，所述螺丝阀的底部与微流控通道的垂直距离为0.3～0.8mm；在铸模溶液固化后，将螺丝阀旋转取出，形成具有螺纹的通道，以实现流体控制；更进一步地，所述螺丝阀的底部与微流控通道的垂直距离为0.5mm。

进一步地，所述螺丝阀的直径为3～8mm，高为3～8mm，螺距为0.5～1.0mm；更进一步地，所述螺丝阀的直径为5mm，高5mm，螺距0.7mm。

进一步地，所述光刻胶为AZ-50光刻胶，所述铸模溶液为PDMS溶液，所述下层基片为玻璃片，具体为玻璃硅片，所述螺丝阀的材质为PMMA，具体为无色透明PMMA。

进一步地，所述色谱纸包被的引物包括肺炎支原体等温扩增引物和肺炎链球菌等温扩增引物，所述肺炎支原体等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎链球菌等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示；所述色谱纸包被的DNA包括肺炎支原体DNA和肺炎链球菌DNA。

上述引物序列具体如下表所示：

本发明的第三个目的是提供采用上述微流控芯片进行病原体核酸的检测方法，其包括以下步骤：

步骤A)样本的处理：采集咽拭子样本，经无菌生理盐水中经生理盐稀释、离心后获得沉淀物，将所述沉淀物与裂解液和磁珠混匀，获得混合液；

步骤B)病原体核酸的提取：将步骤A)获得的混合液从样品入口处加入到微流控芯片的样品处理及DNA提取区，封堵样品入口及样品废液出口，关闭螺丝阀；微流控芯片置热板上于一定温度下加热一段时间；开启样品入口及样品废液出口，通过磁珠法在微流控芯片上提取DNA；

步骤C)病原体核酸的检测：将去离子水加入到样品处理区后封堵样品入口及样品废液出口，微流控芯片置热板上于一定温度下加热一段时间，旋开螺丝阀；DNA样本在热气压作用下平均分配至各个检测池，所述检测池中设有包被特异性引物或DNA的色谱纸；关闭螺丝阀，从反应试剂入口加入LAMP反应液，然后再加入矿物油，封堵反应试剂入口及检测废液出口；将微流控芯片置于热板于一定反应温度下加热一段反应时间，记录检测结果。

为了进一步优化上述检测方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述色谱纸包被的引物包括肺炎支原体等温扩增引物和肺炎链球菌等温扩增引物，所述肺炎支原体等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎链球菌等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示；所述LAMP反应液包括肺炎支原体等温扩增引物或肺炎链球菌等温扩增引物、反应缓冲液(RM)、钙黄绿素、Bst DNA以及去离子水；

更进一步地，所述用于检测肺炎支原体核酸的LAMP反应液包括5μmol/lF3-MP 1μL，5μmol/l B3-Mp 1μL，40μmol/l FIP-MP 1μL，40μmol/l BIP-Mp 1μL，80μmol/l LF-Mp1μL，12.5μL 2×反应缓冲液(RM)，钙黄绿素1μL，Bst DNA 1μL，去离子水3.5μL，其与样品DNA2μL一起构成反应体系。

更进一步地，所述用于检测肺炎链球菌核酸的LAMP反应液包括5μmol/lF3-SP 1μL，5μmol/l B3-Sp 1μL，40μmol/l FIP-SP 1μL，40μmol/l BIP-Sp 1μL，80μmol/l LF-Sp 1μL，12.5μL 2×反应缓冲液(RM)，钙黄绿素1μL，Bst DNA 1μL，去离子水3.5μL，其与样品DNA2μL一起构成反应体系。

进一步地，所述步骤A)中，所述沉淀物、裂解液、磁珠的体积分别为：40μL、80μL、1μL。

进一步地，所述步骤B)中，所述微流控芯片置热板上55～65℃加热3～8min，更优选为60℃加热5min。

进一步地，所述步骤B)中，通过磁珠法在微流控芯片上提取DNA的步骤包括：

a)将磁柱置于样品处理及DNA提取区的上方，吸附磁珠，移液器除去废液；

b)移开磁柱，移液器吸取无水乙醇反复洗涤磁珠，再将磁柱置于样品处理及DNA提取区的上方，移液器除去废液；

c)移开磁柱，移液器吸取75％乙醇反复洗涤磁珠，再将将磁柱置于样品处理及DNA提取区的上方，移液器除去废液。

进一步地，所述步骤C)中，所述LAMP反应液的用量为58μL，矿物油的用量为5μL。

进一步地，所述步骤C)中，所述反应温度为60～68℃，所述反应时间为0.5～1.5h，更优选为反应温度为64℃，反应时间为1h。

进一步地，所述步骤C)中，记录检测结果的具体步骤如下：采用紫外荧光笔照射，智能设备(手机、相机、平板电脑等)拍照记录结果。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明设计和制作了集成样本处理、病原体核酸提取、等温扩增及可视化检测的聚二甲基硅氧烷(PDMS)复合微流控芯片，实现了咽拭子样本中的肺炎链球菌及肺炎支原体的快速、同步即时检验。在制作过程中将包被了包被特异性引物或DNA(如肺炎支原体和肺炎链球菌特异型引物或DNA)的色谱纸分别封装于芯片的检测池中，制备成功能化微流控芯片。将经生理盐水稀释的咽拭子样本离心，取沉淀直接加入到芯片样本处理及核酸提取区中，通过磁珠法在芯片上提取DNA。采用塑料螺丝阀控制流体，热气压驱动DNA平均分配至基因扩增池。反应液中加入荧光染料钙黄绿素作为指示剂，一步反应，不需任何仪器在1小时内实现对结果的可视化检测。

附图说明

图1是本发明一实施例中的微流控芯片的结构示意图；

图2是本发明一实施例中螺丝阀的制作示意图；

图3是本发明一实施例中用于检测肺炎支原体和肺炎链球菌的微流控芯片的结构示意图；其中1'和1"为包被肺炎支原体等温扩增引物的检测池(双池检测提高检测结果准确性)；P1为包被肺炎支原体等温扩增引物及肺炎支原体DNA的检测池(阳性对照)；N1为没有包被引物的检测池(阴性对照)；2'和2"为包被肺炎链球菌等温扩增引物的检测池(双池检测提高检测结果准确性)；P2为包被肺炎链球菌等温扩增引物及肺炎链球菌DNA的检测池(阳性对照)；N1为没有包被引物的检测池(阴性对照)；

图4是采用图3所示的微流控芯片的检测结果示意图；其中A表示肺炎支原体的检测结果；B表示肺炎链球菌的检测结果；C表示肺炎支原体LAMP产物的测序图(CARDS Toxin基因部分保守序列)；D表示肺炎链球菌LAMP产物的测序图(lytA基因部分保守序列)。

图中的附图标记为：

1、上层基片；2、下层基片；3、样本处理及DNA提取区；31、样品废液出口；32、样品入口；4、流体控制区；41、螺丝阀；5、可视化检测区；51、检测池；52、色谱纸；53、反应试剂入口；54、检测废液出口；55、第一通道；56、第二通道；57、第三通道；571、部分第三通道；58、第四通道；591、主分支点；592、次分支点；6、微流控通道；d、制作过程中螺丝阀与微流控通道之间的垂直距离。

具体实施方式

本发明涉及一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片，其包括设有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层基片，所述上层基片设置依次连通的样本处理及DNA提取区、流体控制区以及可视化检测区；其中，所述可视化检测区包括检测池，所述检测池设有包被特异性引物或DNA的色谱纸；所述流体控制区设置进行流体控制的螺丝阀；本发明还涉及上述微流控芯片的制备方法和检测方法。

下面结合实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例一

本实施例为一较佳形式的微流控芯片。

如图1和图3所示，本实施例所述的微流控芯片包括相互封合的PDMS材质的上层基片1和玻璃硅片材质的下层基片2，上层基片1和下层基片2的形状均为四方形。上层基片1上设置微流控通道6，具体的为设置依次通过流体通道连通的样本处理及DNA提取区3、流体控制区4以及可视化检测区5。

上述样本处理及DNA提取区3为圆形通道区，其通过流体通道分别与样品入口32、样品废液出口31和流体控制区4连通，所述样品入口32和样品废液出口31均设置于所述流体控制区4的相对侧，并且所述样品入口32和样品废液出口31及其与样本处理及DNA提取区3连接的流体通道均相对于所述流体控制区4进行对称布置。

上述流体控制区4的流体通道为直线型通道，在该流体控制区4设置进行流体控制的螺丝阀41，其直径为3～8mm，高为3～8mm，螺距为0.5～1.0mm。

上述可视化检测区5设置2个检测池51，各检测池51相对于所述流体控制区4进行对称布置，每一检测池51分别对应设置一与其连通的检测废液出口54，其中1个检测池51内设有包被相关病原体的特异性引物的色谱纸52，另1个检测池51内设有包被相关病原体的特异性引物和DNA的色谱纸52(作为阳性对照)。

上述可视化检测区5的入口处设置反应试剂入口53，可视化检测区5的流体通道包括第一通道55、第二通道56、第三通道57和第四通道58；其中，第一通道55为直线型通道，其一端连接流体控制区4和反应试剂入口53(类似于三通)，另一端连接第二通道56的中部；该第二通道56为凹处朝向所述流体控制区4的半圆弧形通道，其半径等于反应试剂入口53的半径与第一通道55的长度之和，第二通道56的两端各自连接用于将流体分配至相对应的检测池51的第三通道57，在所述检测池51入口处的部分第三通道571为波浪形通道；第四通道58用于连接检测池51和检测废液出口54。

在该实施例中，所述样品入口32、样品废液出口31、反应试剂入口53、检测废液出口54处均设置封堵件，例如硅胶塞或硅胶贴。

实施例二

本实施例为实施例一所述的微流控芯片的制备方法，其包括如下步骤：

步骤1)采用光刻胶制作微流控芯片阳模：芯片制作采用软光刻技术及微加工技术，采用AZ-50光刻胶工艺制作芯片微通道阳模，激光切割制作直径PMMA聚甲基丙烯酸甲酯微柱(直径10mm，高2mm)和PMMA微柱(直径3mm，高2mm)，采用无影胶将PMMA微柱分别粘贴在AZ-50阳模上，制成微流控芯片阳模；

步骤2)将PDMS铸模溶液浇在步骤1)制得的微流控芯片阳模上，将无色透明PMMA螺丝阀(直径5mm，高5mm，螺距0.7mm)预先包埋于未固化的铸模溶液中，所述螺丝阀的底部与微流控通道的垂直距离d约为0.5mm；在PDMS铸模溶液加热固化后，采用螺丝刀将螺丝阀旋转取出，形成具有螺纹的通道，以实现流体控制；待铸模溶液完全固化后脱模获得具有微流控通道结构的上层基片；

步骤3)等离子机清洗由步骤2)获得的的PDMA上层基片以及下层基片(玻璃硅片)，将包被特异型引物或DNA的色谱纸分别置于各检测池，然后将上层基片与下层基片进行封合，制备成可检测病原体核酸的微流控芯片。

在该制作方法中，其中1个检测池中的色谱纸包被肺炎支原体等温扩增引物，另1个检测池中的色谱纸包被肺炎支原体等温扩增引物和肺炎支原体DNA；或者进一步地，其中1个检测池中的色谱纸包被肺炎链球菌等温扩增引物，另1个检测池中的色谱纸包被肺炎链球菌等温扩增引物和肺炎链球菌DNA；可理解的是上述病原体可替换为其他任一合适的可采用LAMP恒温扩增检测的病原体。

实施例三

本实施例为另一较佳的微流控芯片，其用于同时检测肺炎支原体和肺炎链球菌。

该实施例中的微流控芯片与实施例一中的微流控芯片其余结构均相同，仅在以下方面存在不同：如图2所示，在该实施例中，微流控芯片设置8个检测池54，其分为2组，每组4个检测池54，每组各自检测不同的病原体核酸，具体为位于左侧的1组检测池中分别封装了包被肺炎支原体等温扩增引物色谱纸的检测池(1'和1")、包被肺炎支原体特异引物和肺炎支原体DNA色谱纸的检测池(阳性对照P1)、没有包被引物和病原体DNA色谱纸的检测池(阴性对照N1)；位于右侧的1组检测池中分别封装了包被肺炎双球菌等温扩增引物色谱纸的检测池(2'和2")、包被肺炎双球菌特异引物和肺炎双球菌DNA色谱纸的检测池(阳性对照P2)、没有包被引物和病原体DNA色谱纸的检测池(阴性对照N2)。上述2组检测池51分别对称位于所述流体控制区4的两侧；其中每侧的第三通道57均设置一个主分支点591和两个次分支点592，主分支点591和次分支点592均将流股进行流量对分，每一次分支点592分别与2个检测池51连通；其中，与每一主分支点591连通的次分支点592均相对于所述主分支点591对称布置，与每个次分支点592连通的检测池51均相对于所述次分支点592对称布置。

实施例四

本实施例为采用实施例三所述的微流控芯片进行病原体核酸的检测方法，其建立肺炎链球菌与肺炎支原体等温扩增方法，主要包括以下步骤：

1)建立肺炎链球菌与肺炎支原体等温扩增方法

(1)使用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V5，根据肺炎支原体CARDS Toxin基因设计等温扩增引物。

F3-Mp:CCACCTAGTGATTTGGAAGA(SEQ ID NO：1)；

B3-Mp:GGACAAAGAAGATTTTCGAAGTT(SEQ ID NO：2)；

FIP-Mp:GCTGAACATCAACAAAGAAGGTGCATTGTTGATGAATGTACTACCCA(SEQ ID NO：3)；

BIP-Mp:ATACCCCACAATTAAGTGGTTGATTCATAGAATATCTGTCCATCTGG(SEQ ID NO：4)；

LF-Mp:CTGCACGCATAGTAACAAACTG(SEQ ID NO：5)。

(2)使用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V5，根据肺炎链球菌lytA基因设计等温扩增引物。

F3-Sp:GCGTGCAACCATATAGGCAA(SEQ ID NO：6)；

B3-Sp:AGCATTCCAACCGCC(SEQ ID NO：7)；

FIP-Sp:CCGCCAGTGATAATCCGCTTCACACTCAACTGGGAATCCGC(SEQ ID NO：8)；

BIP-Sp:TCTCGCACATTGTTGGGAACGGCCAGGCACCATTATCAACAGG(SEQ ID NO：9)；

LB-Sp:TGCATCATGCAGGTAGGA(SEQ ID NO：10)。

2)配置LAMP反应体系优化(25μL体系)

5μmol/l F3-MP 1μL；5μmol/l B3-Mp 1μL；40μmol/l FIP-MP 1μL；40μmol/lBIP-Mp 1μL；80μmol/l LF-Mp1μL；12.5μL 2×反应缓冲液(RM)；钙黄绿素1μL；Bst DNA 1μL；去离子水3.5μL；DNA 2μL(来自样本)。

5μmol/l F3-SP 1μL；5μmol/l B3-Sp 1μL；40μmol/l FIP-SP 1μL；40μmol/l BIP-Sp 1μL；80μmol/l LF-Sp 1μL；12.5μL 2×反应缓冲液(RM)；钙黄绿素1μL；Bst DNA 1μL；去离子水3.5μL；DNA 2μL(来自样本)。

3)微流控芯片检测病原体核酸步骤

(1)样本处理

每例患者均采集咽拭子样本，立即洗涤于1mL无菌生理盐水中(如不需即时检测时可置-20℃保存)，3000rpm离心5分钟，弃上清，取40μL沉淀与80μL裂解液和1μL磁珠混匀。(细菌裂解液及磁珠由上海浩源生物科技有限公司提供)

(2)病原体核酸提取

①采用移液器将混合液从样品出口处加入到芯片样品处理及DNA提取区(A)，封堵A区的样品入口及废液出口，关闭螺丝阀。

②芯片置热板上60℃加热5min。

③开启样品入口及废液出口，将磁柱置于芯片样品处理区上方，吸附磁珠，移液器除去废液。

④移开磁柱，移液器吸取无水乙醇反复洗涤磁珠。磁柱置于芯片样品处理区上方，移液器除去废液。

⑤移开磁柱，移液器吸取75％乙醇反复洗涤磁珠，再将将磁柱置于芯片样品处理区上方，移液器除去废液。

(3)病原体核酸检测

①将32μL去离子水加入到样品处理区后封堵样品入口及废液出口，芯片置热板上60℃加热5min，旋开螺丝阀，DNA 样本在热气压作用下平均分配至8个检测池。关闭螺丝阀，从试剂入口加入58μL LAMP反应液，然后再加入5μL矿物油。封堵试剂入口及其余8个微池废液出口。

②芯片置热板64℃加热1h，365紫外荧光笔照射，智能手机拍照记录结果。

上述检测结果如图4所示，其中A部分为肺炎支原体检测结果图，B部分为肺炎链球菌检测结果图，而C部分和D部分为采用仪器进行的LAMP产物测序图，其中C部分为肺炎支原体LAMP产物测序图(CARDS Toxin基因部分保守序列)；D部分为肺炎链球菌LAMP产物测序图(lytA基因部分保守序列)。

由上述实施例可知，本发明提供了一种集样本处理、病原体核酸提取、扩增及可视化检测于一体的微流控芯片，其可简单、快速、可视化床旁检测病原体核酸，利用该微流控芯片的检测方法具有快速、简单、无需特殊仪器的特点，可应用于呼吸道、生殖道样本中各类病原体核酸的即时检验。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> 一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法和检测方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccacctagtg atttggaaga 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggacaaagaa gattttcgaa gtt 23

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgaacatc aacaaagaag gtgcattgtt gatgaatgta ctaccca 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataccccaca attaagtggt tgattcatag aatatctgtc catctgg 47

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcacgcat agtaacaaac tg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgtgcaacc atataggcaa 20

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcattccaa ccgcc 15

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgccagtga taatccgctt cacactcaac tgggaatccg c 41

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctcgcacat tgttgggaac ggccaggcac cattatcaac agg 43

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgcatcatgc aggtagga 18

Claims

1.一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片，其特征在于，包括设有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层基片，所述上层基片设置依次连通的样本处理及DNA提取区、流体控制区以及可视化检测区；其中，所述可视化检测区包括检测池，所述检测池设有包被特异性引物或DNA的色谱纸；所述流体控制区设置进行流体控制的螺丝阀；

所述样本处理及DNA提取区为圆形通道区，其通过流体通道分别与样品入口、样品废液出口和流体控制区连通，所述样品入口和样品废液出口均设置于所述流体控制区的相对侧；

所述可视化检测区的流体通道包括第一通道、第二通道、第三通道和第四通道；其中，所述第一通道为直线型通道，所述第一通道的一端为连接流体控制区和反应试剂入口，所述第一通道的另一端连接第二通道的中部；所述第二通道为凹处朝向所述流体控制区的半圆弧形通道，其半径等于反应试剂入口的半径与第一通道的长度之和，所述第二通道的两端各自连接用于将流体分配至相对应的检测池的第三通道，在所述检测池入口处的部分第三通道为波浪形通道；所述第四通道用于连接检测池和微池废液出口。

2.一种如权利要求1所述的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)采用光刻胶制作微流控芯片阳模；

3.根据权利要求2所述的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，将螺丝阀预先包埋于未固化的铸模溶液中，所述螺丝阀的底部与微流控通道的垂直距离为0.3～0.8mm；在铸模溶液固化后，将螺丝阀旋转取出，形成具有螺纹的通道，以实现流体控制。

4.根据权利要求3所述的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述螺丝阀的直径为3～8mm，高为3～8mm，螺距为0.5～1.0mm。

5.根据权利要求3所述的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述光刻胶为AZ-50光刻胶，所述铸模溶液为PDMS溶液，所述下层基片为玻璃片，所述螺丝阀的材质为PMMA。

6.根据权利要求2所述的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述色谱纸包被的引物包括肺炎支原体等温扩增引物和肺炎链球菌等温扩增引物，所述肺炎支原体等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎链球菌等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示。

7.一种非诊断和治疗目的的采用权利要求1所述的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片用于病原体核酸的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤B)病原体核酸的提取：将步骤A)获得的混合液从样品入口处加入到微流控芯片的样品处理及DNA提取区，封堵样品入口及样品废液出口，关闭螺丝阀；微流控芯片置热板上于60℃下加热5min；开启样品入口及样品废液出口，通过磁珠法在微流控芯片上提取DNA；

步骤C)病原体核酸的检测：将去离子水加入到样本处理及DNA提取区后封堵样品入口及样品废液出口，微流控芯片置热板上于60℃下加热5min，旋开螺丝阀；DNA样本在热气压作用下平均分配至各个检测池，所述检测池中设有包被特异性引物或DNA的色谱纸；关闭螺丝阀，从反应试剂入口加入LAMP反应液，然后再加入矿物油，封堵反应试剂入口及微池废液出口；将微流控芯片置于热板于64℃下加热1h，记录检测结果。

8.根据权利要求7所述的非诊断和治疗目的的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片用于病原体核酸的检测方法，其特征在于，所述色谱纸包被的引物包括肺炎支原体等温扩增引物和肺炎链球菌等温扩增引物，所述肺炎支原体等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎链球菌等温扩增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示；所述LAMP反应液包括肺炎支原体等温扩增引物或肺炎链球菌等温扩增引物、反应缓冲液(RM)、钙黄绿素、Bst DNA以及去离子水。

9.根据权利要求7所述的非诊断和治疗目的的可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片用于病原体核酸的检测方法，其特征在于，所述步骤B)中，通过磁珠法在微流控芯片上提取DNA的步骤包括：