CN112592815B - 一种进行多重microRNA检测的微流控芯片及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种进行多重microRNA检测的微流控芯片及应用，由载玻片、空白层、小室层、支撑层、封口层和螺丝阀门组成，分为三个检测区域和一个空白对照区域。四个区域通过螺丝阀门进行分隔，同时检测区域提前包埋了不同的探针，使得多重microRNA的检测变得十分便捷，同时设有空白对照区，可有效防止假阳性，使检测结果更加准确。该芯片只需在等温环境下，50度反应一个小时即可，不需要复杂的实验仪器，减少了检测对昂贵仪器的依赖，既适用于恒温条件下的反应也适用于聚合酶链式扩增的方法进行microRNA检测，十分适合医疗条件不发达的地区或者需要即时检测的场合。

Description

一种进行多重microRNA检测的微流控芯片及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种进行多重microRNA检测的微流控芯片及应用。

背景技术

微流控芯片技术(Microfluidics)是指能在微米尺度上操控流体的芯片。微流控芯片一般仅有几平方厘米大小，但是却能将生物、化学、医学分析过程种的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一起，自动完成分析全过程。它具有半/全自动性、试剂消耗少、便携性、检测灵敏度高、容易量产等特点。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。

microRNA是一类小型的非编码RNA(通常长度为19-23个核苷酸)，主要用作基因表达的翻译后抑制剂。它们是具有高度组织特异性的生物标志物，具有潜在的临床应用价值。特别是microRNA对核糖核酸酶(RNases)的消化具有抵抗性，对反复冻融操作和长期贮存具有稳定性，作为疾病诊断和预后的新生物标志物具有独特优势。然而，由于microRNA片段短、丰度低、家族成员间序列同源性高，在生物系统中检测microRNA仍具有挑战性，特别是在医疗条件不发达地区。

microRNA的多重检测可以给出更加系统、全面的信息。进行多重检测不仅可以对疾病有更全面的认识，同时可以提高检测的效率。微流控芯片不仅制作简便，结构也可以灵活多变，适合应用于多重检测。另外，微流控芯片检测灵敏，试剂消耗少，容易量产，成本低，在体外诊断领域具有独特的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种进行多重microRNA检测的微流控芯片。该芯片能够同时完成3种microRNA检测。芯片操作简单，反应时间快，易便携，由于预包埋探针的操作，使得芯片可以直接进样，快速完成多重microRNA的检测。

本发明提供的一种进行多重microRNA检测的微流控芯片，具有五层结构，从下到上依次由：载玻片、空白层、小室层、支撑层、封口层和螺丝阀门组成，按区域划分为第一多重microRNA检测区、第二多重microRNA检测区、第三多重microRNA检测区和空白对照区。每个检测区域有四个检测单元，分别起到重复的作用。

所述每个检测单元是圆柱形的小室，直径是2mm，高350μm。单个检测区域的进样体积是4.396μl，整个芯片的最佳进样体积是24.8μl(包含损耗)。

四个检测单元各有一条三级通道，四条三级通道与二级通道相连。每个检测区以及空白对照区分别连接一条二级通道，二级通道的分别连接第二进样口、一级通道和第一进样口。螺丝阀门放置于一级通道和二级通道交叉点，用于分隔四块区域。

所述载玻片为玻璃材质或其它可以与聚二甲基硅氧烷(PDMS)封接的材质。

所述空白层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，PDMS透明且具有很强的透气性储气性，同时还具有疏水性。

所述小室层先用标准软光刻法制作模具，再浇筑PDMS，待其固化后脱模制作而成。

所述支撑层高度在2mm～5mm之间，用来支撑的螺丝阀门以及提供一定的负压。

所述螺丝阀门为不锈钢螺杆微阀门，直径在2-5mm之间，高度为3-9mm。

封口层由聚丙烯薄膜制成。

所述空白层、小室层、支撑层都由疏水材料PDMS制成。

所述空白层、小室层通过不可逆等离子体键合或者加热键合。

本发明提供的进行多重microRNA检测的微流控芯片的制备方法，通过以下步骤实现：

(1)用浓硫酸彻底预清洁4英寸硅晶片；

(2)用标准软光刻法制作小室层模具，通过在硅片上旋涂光胶、紫外曝光、显影等；

(3)将模具用三甲基氯硅烷处理5分钟；

(4)将5：1的PDMS浇筑到小室层模具上，固化后制成小室层；

(5)不锈钢螺杆微阀门放在小室层3上，摆放在一级通道和二级通道的交汇处；

(6)将10：1的PDMS(A：B)倾倒在小室层3上，固化后形成支撑层4，揭下芯片对其进行裁剪、打孔(形成第一、第二进样口)；

(7)通过等离子体处理将芯片用与涂有固化的PDMS的载玻片封接；

(8)在支撑层4上贴聚丙烯薄膜(封口层5)，密封进出样口。

本发明的另一个目的是提供所述微流控芯片在同时进行检测多种microRNA中的应用，通过以下步骤实现：

(1)将含有反应组分包括探针，缓冲液通过第二进样口进入芯片中，再进行冻干，形成预包埋物；

(2)将预包埋好的多重microRNA微流控检测芯片的进样口封闭后，置于提供真空环境的仪器设备，对芯片进行脱气处理；

(3)将待检测样品加入第一进样口，打开螺丝阀门，样品在负压下进入4个检测区域和空白对照区域，最后进入检测单元；

(4)矿物油随即充满一级通道、二级通道和三级通道，将各个检测单元进行分隔，贴上聚丙烯薄膜；

(5)将芯片放置于50℃热板上进行孵育60min；

(6)用荧光成像系统进行成像，激发光波长为455nm，发射光为495nm，对检测单元的荧光强度进行分析，最后得到待测样品的microRNA浓度。

其中步骤(1)所述的反应组分预埋方法，通过以下步骤实现：

(1)将芯片抽成真空；

(2)用移液枪吸取稀释好的探针和缓冲溶液，通过4个第二进样口在负压作用下进入芯片内；

(3)使用矿物油将第二进样口封堵；

(4)将密封后的芯片放入到冻干机进行冻干。

本发明具有的有益效果为：

(1)本发明提供的能进行多重microRNA检测的微流控芯片，制备相对简单。由于具有单独的预包埋材料进样口，可以根据检测需求，灵活改变检测对象。在应用时，由于此芯片的小室基板为具有透气性储气性的疏水材料，因此进样方式是基于负压的自吸分液，而无需进行亲水疏水等表面修饰对其进行处理或需施加离心力等外界力。

(2)本发明提供的能进行多重microRNA检测的微流控芯片，具有同时检测三种microRNA的优点，每个检测区域都具有4个复孔，同时设计有空白对照区，可以有效防止假阳性，使得检测结果更加准确。

(3)本发明提供的能进行多重microRNA检测的微流控芯片既可以适用于恒温条件下的反应也适用于聚合酶链式扩增的方法进行microRNA检测，可以应用于多种检测场景，非常适用于医疗资源不太发达的地区。

附图说明

图1是本发明的三维结构示意图。

图2是本发明的平面示意图。

图3是基于该微流控芯片和DSN循环扩增技术对多种microRNA进行检测的原理。利用DSN对双链核酸的特异性识别，以及对DNA链的剪切功能。将DNA探针设计成与microRNA互补配对，探针的两端分别修饰上荧光基团和淬灭基团，当DNA探针完整的时候，不会发出荧光，一旦与合适的microRNA互补配对，被DSN识别，探针就会被剪切，荧光基团不再受到淬灭基团的约束，从而发出荧光，如此往复，放大检测信号。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以说明本发明，仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。该微流控芯片对多种microRNA进行检测的原理不仅仅局限于基于DSN、RT-PCR或RCA等。

实施例1基于DSN循环扩增技术在微流控芯片上对多种microRNA进行检测

参见图1，该芯片的检测原理是利用Duplex-Specific Nuclease(DSN)对双链核酸的特异性识别，以及对DNA链的剪切功能。将DNA探针设计成与microRNA互补配对，探针的两端分别修饰上荧光基团和淬灭基团，当DNA探针完整的时候，不会发出荧光，一旦与合适的microRNA互补配对，被DSN识别，探针就会被剪切，荧光基团不再受到淬灭基团的约束，从而发出荧光，如此往复，放大检测信号。

参见图2，所述微流控芯片具有五层结构，从下到上依次为：载玻片1，空白层2，小室层3，支撑层4和封口层5，按区域划分，该芯片分为多重microRNA检测区7-9和空白对照区10。

多重microRNA检测区7-9由3个检测区组成，每个检测区以及空白对照区分别连接1条二级通道15，二级通道15分别连接第二进样口13、一级通道14和第一进样口12。支撑层4起到提供负压的作用。图2中的二级通道15中间部分需要被螺丝阀门6完全覆盖，如果线条比较粗会导致螺丝阀门覆盖不全。穿过4个区域的线条粗一些的优势是，在预包埋的时候，如果通道宽一点进样速度可以快一点。

每个检测区域有四个检测单元11，分别起到重复的作用。四个检测单元11有各有一条三级通道16。四条三级通道16与二级通道15相连。第一进样口12用来进待测样本，第二进样口用来预包埋探针。

每个检测单元11是圆柱形的小室，直径是2mm，高350μm，体积是1.099μl，，单个检测区域的进样体积是4.396μl，整个芯片的最佳进样体积是24.8μl(包含损耗)。

螺丝阀门6放置于一级通道14和二级通道15交叉点，用于分隔四块区域。

支撑层4是可以是任意比例的PDMS材料，在正常情况下可以储存气体，在真空条件下可以形成负压，为后续的进样提供动力。

空白层2、小室层3之间通过不可逆的等离子体键合贴合在一起。

空白层2，小室层3，支撑层4由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。

封口层5由聚丙烯薄膜制成。

实施例2本发明提供的微流控芯片通过以下步骤制备：

(1)清洗硅片：用浓硫酸浸泡硅片，用抹布擦干，再用去离子水清洗，最后200℃烘烤30min。

(2)小室层模具制作：倾倒一个硬币大小的SU-8 2075负性光胶在硅片中央，涂覆程序为：500rpm，10s；1600rpm，30s，旋涂的光胶厚度为150μm。前烘：65℃烘烤5min，95℃烘烤30min，缓慢冷却至室温。曝光：将掩膜对准涂有光胶的硅片，然后利用单面光刻机进行曝光，波长360nm，曝光时间为18s。后烘：65℃烘烤5min，95℃烘烤12min，缓慢冷却至室温。显影：在通风橱里，将硅片放入玻璃平皿中，倒入显影液没过硅片，盖上平皿的盖子放在摇床上，显影15min后取出硅片，用异丙醇清洗硅片，若硅片上出现乳白色絮状物，则将其放入显影液中继续显影，直至用异丙醇清洗不会出现乳白色沉淀，最后用去离子水清洗硅片，并用空气吹干。显影后的硅片放置在热板上进行硬烘，200℃烘烤30min。待硅片降至室温，用三甲基氯硅烷处理模具表面5min，以便后期PDMS更容易脱模。

(3)小室层制作：配制5:1的PDMS预聚物6g，混匀后用匀胶机离心并真空脱气去除气泡。将配好的预聚物倒在制作好的模具上，放入旋转涂覆机中旋涂，程序为：500rpm，10s；1500rpm，30s，厚度大约为300μm，85℃烘烤5min。将螺丝阀门6放在小室层上方相应的位置。

(4)支撑层制作：在小室层上方旋涂一层10:1的PDMS，厚度约为5mm，在85℃烘烤40min。

(5)空白层制作：在干净的载玻片上旋涂100μm厚度的5:1的PDMS，85℃烘烤5min，固化后冷却至室温。

(6)空白层、小室层键合，用等离子体处理空白层和小室层表面，再将两者贴合，并在85℃烘烤过夜。

(7)将固化的PDMS从模具上揭下并打孔。

(8)最后在芯片上贴上聚丙烯薄膜，用以密封进样口。

实施例3所述的样品反应液的组分如下：

microRNA样品；DSN：0.3μl(20μl)；NaCl：5mM；CaCl₂：50mM。

所述芯片的第一进样口用来进样品反应液，第二进样口用来进预包埋物。

所述芯片的进样口用封口油将进样口进行密封，最后再贴上聚丙烯薄膜，以防止蒸发。

所述芯片反应条件为50℃热板上进行孵育60min。

所述芯片反应结果用荧光成像系统系统进行成像，激发光波长为455nm，发射光为495nm。

以上所述的，仅为本实验的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的要求权利保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (6)

1.一种进行多重microRNA检测的微流控芯片，其特征在于，从下到上依次由：载玻片（1）、空白层（2）、小室层（3）、支撑层（4）、封口层（5）和螺丝阀门（6）组成，按区域划分为四个，分别为第一多重microRNA检测区（7）、第二多重microRNA检测区（8）、第三多重microRNA检测区（9）和空白对照区（10），每个检测区域有四个检测单元（11），四个检测单元（11）各有一条三级通道（16），四条三级通道（16）与二级通道（15）相连，每个检测区以及空白对照区分别连接一条二级通道（15），二级通道（15）分别连接第二进样口（13）、一级通道（14）和第一进样口（12），螺丝阀门（6）放置于一级通道（14）和二级通道（15）交叉点，用于分隔四个区域，每个检测单元（11）是圆柱形的小室，直径是2 mm，高350 μm，所述支撑层（4）高度为2 mm～5 mm，用来支撑的螺丝阀门以及提供一定的负压。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，二级通道（15）中间部分被螺丝阀门（6）完全覆盖。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述空白层（2）、小室层（3）、支撑层（4）由疏水材料聚二甲基硅氧烷制成，所述空白层（2）、小室层（3）通过不可逆等离子体键合或者加热键合。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述螺丝阀门（6）为不锈钢螺杆微阀门，直径为2-5mm，高度为3-9 mm。

5.权利要求1所述微流控芯片在同时进行检测多种microRNA中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）将螺丝阀门拧紧，防止四款区域互串，再将含有反应组分包括探针、缓冲液通过第二进样口进入芯片中，再进行冻干，形成预包埋物；

（2）将预包埋好的多重microRNA微流控检测芯片的进样口封闭后，置于提供真空环境的仪器设备，对芯片进行脱气处理；

（3）将待检测样品加入第一进样口，打开螺丝阀门，样品在负压下进入3个检测区域和空白对照区域，最后进入检测单元；

（4）矿物油随即充满一级通道、二级通道和三级通道，将各个检测单元进行分隔，贴上聚丙烯薄膜；

（5）将芯片放置于50℃热板上进行孵育60 min；

（6）用荧光成像系统进行成像，激发光波长为455 nm，发射光为495 nm，对检测单元的荧光强度进行分析，最后得到待测样品的microRNA浓度。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的反应组分预埋方法，通过以下步骤实现：

（1）将芯片抽成真空；

（2）用移液枪吸取稀释好的探针和缓冲溶液，通过4个第二进样口在负压作用下进入芯片内；

（3）使用矿物油将第二进样口封堵；

（4）将密封后的芯片放入到冻干机进行冻干。

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