CN104894106A - 高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，依次由盖玻片层、反应层、修饰层与封接层由下而上热键合组成，其中反应层设有n个反应模块，反应模块利用多层软光刻技术制作出流通通道、反应微腔室和进样口。本发明芯片保证样品引入小室前的流通距离相等，进样量均等，避免反应体积不均造成的误差。降低实验成本。提高了进样速度。可以实现实时定量检测。本发明芯片设计合理，结构及操作简单，制作成本低，可在实时荧光定量核酸扩增、数字核酸扩增、核酸扩增的单细胞分选、SNP的检测、单碱基突变的检测、拷贝数失衡的检测、单细胞基因表达谱的研究、癌症标志物的早期检测、干细胞分化鉴定以及细胞分选鉴定等中应用。
Description
技术领域
本发明属生物领域检测装置，涉及一种等距等分进样的用于核酸扩增的高集成度微流控芯片，尤其涉及高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，及其该芯片的应用。
背景技术
癌症、心脑血管疾病、传染病等重大疾病每年夺去我国数以百万计人的性命，疾病诊断之间的个体差异对优质高效的个性化医疗需求越来越大，新的预防、诊断方法研究愈加迫切。疾病的发生一般源于分子变异，实现分子水平早期诊断具有巨大的重要性和紧迫性。因此助力于人类健康维护，发展能够实现疾病预防和早期诊断的个性化医疗检测仪器及相关技术具有重大意义。
在癌症早期突变基因在体内丰度非常低，例如非小细胞肺癌中的L（8）（5）（8）R基因、T（7）90M基因，存在稀有变异和拷贝数变异，应用常规PCR技术检出率很低； 病毒感染潜伏期较长，在早期很难发现。因此核酸分子量化检测显的十分重要。目前常规分子诊断手段荧光定量PCR技术，可实时动态定量观察PCR扩增的变化，但需要与标准曲线比较推算出待检物起始拷贝量，不是绝对测量，仍然无法做到单分子检测。
上世纪九十年代末由Vogeinzler和Klstein发明的数字PCR技术为解决核酸单分子计数检测开辟了道路。数字PCR是通过将样品稀释后通入大量的反应单元中，稀释的倍数满足每个反应单元中所含有的待测分子数不会超过（1）个，再对这些大量的反应单元进行PCR信号扩增放大，并对阳性反应单元逐个进行计数的一种技术。它是一种绝对定量方法，已经被广泛应用于SNP、单碱基突变、拷贝数变异、早期癌症标志物的检测、胎儿无创产前诊断以及单细胞基因表达谱的研究等。
微流控芯片进行数字PCR扩增显示出了巨大的优越性，样品进样、扩增及检测都在封闭体系中实现，减少了孔板数字PCR繁复的加样操作和气溶胶污染。美国Fluidigm公司开发出了商品化的数字PCR芯片，用实时PCR仪进行核酸扩增和定量检测，芯片每个反应小室只需要nL~pL样品，芯片集成度大大改善了数字PCR的检测性能。
许多研究组已开发了数字PCR平台，如微流控芯片、微乳滴、离心式芯片、滑动芯片等，但是这些平台操作复杂，有的需要特殊的仪器，价格昂贵，如微阀控制的微流控芯片需要控制系统；液滴的芯片需要液滴生成器；有的只能单次进样，这就意味着数字PCR上游的样本前处理包括DNA的提取和转录只能在芯片外完成，结果受很大影响；大多数微流控芯片除进样口外还需设计出样口，产生了样品浪费和气溶胶污染；这些都给普通实验室的应用普及带来了困难，更难以作为常规的健康普查手段。自主研发价格低廉、性能优良更加适用于现场医疗检验、疾病防控、食品安全等诸多领域的新型微流控芯片及其检测系统就成了迫在眉睫的任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，是一种用于核酸分子扩增的等距等分进样的高集成度的无动力源无阀型微流控芯片，具有样品分配更加均匀、无需阀门、制作工艺简便、易于操作、多种核酸分子扩增应用的特点。
本发明芯片依次由盖玻片层（1）、反应层（2）、修饰层（3）与封接层（4）由下而上热键合组成，其中反应层（2）设有n（1≤n≤100）个反应模块（8），反应模块（8）利用多层软光刻技术制作出流通通道（5）、反应微腔室（6）和进样口（7）；每个反应模块（8）中的流通通道（5）由多级流通通道组成，其上一级流通通道与下一级流通通道垂直等分；并且每个反应微腔室（6）到进样口（7）的距离相等，可以实现反应液在各级流通通道中更加均匀的分配。
利用制作材料PDMS聚合物本身的透气性质，预先将芯片置于真空泵中，进行抽真空除气处理，然后置于常压环境下，由于流通通道（5）和反应微腔室（6）与外界形成气压差，流通通道（5）和反应微腔室（6）处于负压状态，进样口（7）处的样品溶液利用此气压差自动分配进入各个反应微腔室（6），实现样品的无动力源进样，待反应微腔室（6）均匀充满样品溶液后，向进样口（7）内加入与水不相容的油相液体，同样利用气压差使油相液体吸入流通通道（5）从而将反应样品封入反应微腔室（6）内，实现样品的无阀隔离。整个芯片装置只需从进样口（7）进样，没有出样口，从而实现了无废液进样，既减少了样品浪费又可以避免一些特殊样品例如病毒形成气溶胶污染，更加适用于现场的医疗检验、疾病防控、食品安全等诸多领域。
流通通道（5）宽度范围1~200 μm，反应微腔室（6）长宽范围为1-500 μm，反应微腔室（6）体积可以达到nL到 fL级别，每平方厘米芯片具有数十至百万个反应微腔室（6）。流通通道（5）及反应微腔室（6）的尺寸可调节性，使其分布密度具有可扩展性：当流通通道（5）宽度优选30 μm，反应微腔室（6）的长宽优选为100 μm，反应微腔室（6）之间的间距为100 μm时，反应微腔室（6）的分布密度ρ约为2525个/cm2；当流通通道（5）宽度优选50 μm，反应微腔室（6）长宽优选为150 μm，反应微腔室（6）之间的间距为150 μm时，反应微腔室（6）的分布密度ρ约为1122个/cm2(ρ=反应微腔室（6）个数/反应模块（8）的面积)。
等距等分进样其特征在于流通通道（5）多级通道的分支对称结构设计，从进样通道开始作为第1级流通通道，垂直等分第2级流通通道，第2级流通通道长度等于反应模块（8）边长的1/2；第2级流通通道垂直等分第3级流通通道，第3级流通通道长度等于反应模块（8）边长的1/2；第3级流通通道垂直等分第4级流通通道，第4级流通通道长度等于反应模块（8）边长的1/4；第4级流通通道垂直等分第5级流通通道，第5级流通通道长度等于反应模块（8）边长的1/4；第5级流通通道垂直等分第6级流通通道，第6级流通通道长度等于反应模块（8）边长的1/8；第6级流通通道垂直等分第7级流通通道，第7级流通通道长度等于反应模块（8）边长的1/8；第7级流通通道垂直等分第8级流通通道，第8级流通通道长度等于反应模块（8）边长的1/16；假设有m（m≥2）级流通通道，m为奇数时则该级流通通道长度为反应模块（8）边长的1/2(m-1)/2，m为偶数时该级流通通道长度为反应模块（8）边长的1/2m/2。假设反应模块（8）边长为L，第1级流通通道长度为a，与反应微腔室相连的末端流通通道长度为b，则当m为奇数时每个反应微腔室（6）到进样口（7）的距离为a+b+(1/2+1/4+1/8+……+1/2(m-1)/2)L；当m为偶数时每个反应微腔室到进样口的距离为a+b+(1/2+1/4+1/8+……+1/2m/2)L，证明每个反应微腔室（6）到进样口（7）是等距离的，其最终长度与流通通道分级数m的奇偶性有关。
微流控芯片流通通道（5）分级数m与反应微腔室（6）个数M之间存在关系：M= 2m+1（2≤m≤100）。
微流控芯片可以实现多次进样，并且每次进样在每级流通通道中都是均匀等分的，从而进入每个反应微腔室（6）中的样品是等体积的。
盖玻片层（1）选用洁净的盖玻片，预先采用空气等离子体处理，以备与反应层（2）键合实现反应层底部的密封。
反应层（2）及封接层（4）的制作材料选用具有透气性质的聚合物材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）。反应层（2）的制作方法根据不同的透气性聚合物材料的性质采用不同的方法，比如激光刻蚀、化学刻蚀、光刻、热压、浇铸及注塑等方法。当优选材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）时，采用多层软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，在模具上以10:1（前聚体：固化剂）的比例浇注固化形成。
修饰层（3）是采用EGC-1720氟素表面处理剂进行旋涂处理形成约10 nm厚的具有防蒸发作用的纳米薄膜。匀胶机旋涂的转速、时间可根据所需聚合物薄膜的厚度来选择，优选500
rpm，10 s，2000
rpm，10 s，获得的具有防蒸发性质的聚合物薄膜厚度约为10 nm。
封接层（4）是由聚合物材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）直接浇筑在修饰层（3）上的用于抽真空前储气和固型的辅助层。
反应层（2）、修饰层（3）和封接层（4）之间的封接，可以利用聚合物固有的化学性质而以化学方法粘合在一起，热板上85℃，40min热烘即可。
油封可以选用与水不相容的氟化油、石蜡油或硅油等油相液体。样品的引入通过利用聚合物材料的透气性质，预先将芯片装置用胶带密封置于真空泵中，进行抽真空除气处理。根据流通通道（5）和反应微腔室（6）的尺寸参数选择不同的抽真空压强和时间，优选10
kPa，20 min。
芯片进行抽真空除气处理结束后，将其置于常压下时，其内流通通道（5）和反应微腔室（6）中的气体优先进入聚合物块体，导致流通通道（5）和反应微腔室（6）中的气压相应下降，与外界环境形成气压差，此气压差驱动样品溶液均匀充满整个流通通道（5）和反应微腔室（6）。同样与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入流通通道（5），将流通通道（5）中的样品溶液冲入后续的反应微腔室（6），直至样品进入所有的反应微腔室（6），从而将反应样品封入反应微腔室（6）内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化，最后用PDMS预聚物将进样口（7）封闭。
本发明另一个目的是提供一种利用上述芯片进行实时荧光定量核酸扩增的方法，通过以下步骤实现：
（1）样品制备：
将模板DNA/RNA与Taqman探针试剂盒或SYBR Premix EXTaq试剂盒混合；
（2）预先将该等距等分核酸扩增微流控芯片用胶带密封置于真空泵中，进行抽真空除气处理；根据流通通道（5）和反应微腔室（6）的尺寸参数选择不同的抽真空压强和时间，优选10
kPa，20 min；
（3）芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出芯片置于常压下，刺破进样口（7）处的胶带，将样品溶液加入进样口（7）处，样品溶液在流通通道（5）和反应微腔室（6）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个流通通道（5）和反应微腔室（6）；
（4）待样品溶液进样完成后，紧接着在样品的进样口（7）处加入与水不相容的油相液体（硅油）；
（5）待硅油完全充满整个流通通道（5）后，用聚二甲基硅氧烷（PDMS） 将进样口（7）密封；
（6）将该等距等分核酸扩增微流控芯片置于实时荧光定量PCR仪上，采用电荷耦合元件（CCD）图像传感器，在每一轮的PCR反应结束时，采集每个反应微腔室（6）在该轮反应的荧光信号，并最终绘制成反应过程的荧光信号曲线，反应结束后通过对反应过程中指数期荧光信号分析对核酸进行定量。
本发明的再一个目的是提供一种利用上述装置进行数字核酸扩增的方法，通过以下步骤实现：
（1）样品制备：
如果核酸扩增采用荧光定量PCR方法，则将模板DNA/RNA与Taqman探针试剂盒或SYBR Premix
EXTaq试剂盒混合；
如果核酸扩增采用环介导等温扩增（LAMP），则将模板DNA/RNA与LAMP反应试剂及DNA荧光染料SYBR GreenⅠ混合；
（2）预先将该等距等分核酸扩增微流控芯片用胶带密封置于真空泵中，进行抽真空除气处理；根据流通通道（5）和反应微腔室（6）的尺寸参数选择不同的抽真空压强和时间，优选10
kPa，20 min；
（3）芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出芯片置于常压下，刺破进样口（7）处的胶带，将样品溶液加入进样口（7）处，样品溶液在流通通道（5）和反应微腔室（6）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个流通通道（5）和反应微腔室（6）；
（4）待样品溶液进样完成后，紧接着在样品的进样口（7）处加入与水不相容的油相液体（硅油）；
（5）待油相液体完全充满整个流通通道（5）后，用PDMS 将进样口（7）密封；
（6）随后将油封后的芯片置于原位PCR仪或类似于原位PCR仪的热循环装置上，可进行荧光定量PCR扩增；若对核酸进行环介导等温扩增，将集成流路芯片组件置于普通的热板上，65℃加热30-60分钟即可；
（7）反应结束后，采用电荷耦合元件（CCD）图像传感器采集反应微腔室（6）的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的小室代表一个阳性的PCR反应，通过对阳性反应微腔室（6）的计数，即可实现对所检测样品的原始拷贝数进行绝对定量。
本发明的第四个目的是提供一种利用上述芯片进行核酸扩增的单细胞分选的方法，通过以下步骤实现：
（1）样品制备：将待分选鉴定细胞与Taqman探针试剂盒混合；
（2）预先将该等距等分核酸扩增微流控芯片用胶带密封置于真空泵中，进行抽真空除气处理。根据流通通道（5）和反应微腔室（6）的尺寸参数选择不同的抽真空压强和时间，优选10
kPa，20 min；
（3）芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出芯片置于常压下，刺破进样口（7）处的胶带，将样品溶液加入进样口（7）处，样品溶液在流通通道（5）和反应微腔室（6）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个流通通道（5）和反应微腔室（6）；
（4）待样品溶液进样完成后，紧接着在样品的进样口（7）处加入与水不相容的油相液体（硅油）；
（5）待硅油完全充满整个流通通道（5）后，用PDMS 将进样口（7）密封；
（6）将等距进样数字PCR芯片组件置于原位PCR仪或类似于原位PCR仪的热循环装置上进行荧光定量PCR扩增。
（7）反应结束后，采用电荷耦合元件（CCD）图像传感器采集反应微腔室（6）的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的小室代表一个阳性的PCR反应，通过对阳性反应微腔室（6）的计数，就可以实现对具有标志物特异性表达细胞的分选鉴定。
本发明的应用范围包括：SNP的检测，单碱基突变的检测，拷贝数失衡的检测，单细胞基因表达谱的研究，癌症标志物的早期检测，干细胞分化鉴定以及各种肿瘤干细胞等特异性细胞的细胞分选鉴定等研究。
本发明的有益之处是：
1、与多孔板上进行数字PCR相比，本发明具有微型化的特点，试剂和样品的消耗量均的减少大大降低了实验成本。该发明装置利用流通通道（5）和反应微腔室（6）抽真空后与外界大气形成的气压差，使样品自动快速均匀的分散到成千上万个独立的反应微腔室（6），大大提高了进样速度。
2、本发明的芯片结构设计使每个反应小室到进样口的距离相等，保证样品引入小室前的流通距离相等，流通路径完全对称的这种结构均等分布性质使反应小室的进样量更均等，避免了反应体积不均造成的误差。
3、本发明装置与现有的商品化液滴数字PCR芯片相比，小室密度具有可扩展性，整张芯片反应小室个数范围为万级到百万级，反应过程中反应小室的独立分割优势使之可以实现实时定量检测。
4、本发明装置与现有的商品化集成流路数字PCR芯片相比，不需要微阀，没有出样口大大减少了芯片制作和使用的复杂程度及节省试剂减少污染，为制作大规模集成流路芯片提供了结构基础。
5、本发明结构及操作简单，芯片只需要一个配套的真空泵，或者使用真空包装将预先抽真空脱气的聚合物芯片封包，无需其他的控制设备，其应用成本比目前基于PDMS弹性微阀的数字PCR芯片大大减少，为数字PCR技术的推广与应用提供了一个良好的平台。
附图说明
图1是本发明装置结构示意图，其中（1）为盖玻片层，（2）为反应层，（3）为修饰层，（4）为封接层，（5）为流通通道，（6）为反应微腔室，（7）为进样口，（8）为反应模块。
图2是实施例2本发明反应层（2）结构示意图。
图3是实施例3本发明反应层（2）的示意图。
图4是实施例4本发明反应层（2）的示意图。
图5是实施例5本发明反应层（2）的示意图。
图6是实施例6本发明装置进样的示意图。
图7是本发明的装置PCR反应结果实施例示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例
1
参见图1，为本发明芯片由盖玻片层（1）、反应层（2）、修饰层（3）、封接层（4）依次从下而上构成；反应层（2）有4个完全相同的反应模块（8）组成，每个反应模块（8）由流通通道（5）、反应微腔室（6）及进样口（7）构成；盖玻片层（1）采用0.2mm厚的盖玻片层玻璃作为材料，预先采用空气等离子体处理，以备与反应层（2）结合；反应层（2）采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，采用多层软光刻技术制作具有微通道结构的模具，在模具上浇注具有透气性质的5:1（前聚体：固化剂）的PDMS固化脱模形成；修饰层（3）是采用EGC-1720氟素表面处理剂进行旋涂处理形成约10 nm厚的具有防蒸发作用的纳米薄膜。匀胶机旋涂的转速、时间可根据所需聚合物薄膜的厚度来选择，优选500
rpm，10 s，2000
rpm，10 s，获得的具有防蒸发性质的聚合物薄膜厚度约为10 nm；封接层（4）的制作材料同样选用10:1（前聚体：固化剂）的PDMS浇注固化作为固型和储气介质以备抽真空后使用。反应层（2）、修饰层（3）和封接层（4）之间的封接，可以利用聚合物固有的化学性质而以化学方法粘合在一起，热板上85℃，40min热烘即可。芯片制作好后，用直径（1）mm的打孔器在进样口（7）处打孔备用。
实施例
2
参见图2，为本发明装置反应层（2）的示意图，其中（5）为流通通道，（6）为反应小室，（7）为进样口，（8）为反应模块；反应模块（8）为4个；流通通道（5）有7级，宽为50 μm；反应微腔室（6）为正方形，边长设计为150 μm，高度设计为300 μm。
实施例
3
参见图3，为本发明装置反应层（2）的设计示意图：反应模块（8）为4个；流通通道（5）有7级，宽为30 μm；反应微腔室（6）为正方形，边长设计为100 μm，高度设计为200 μm。
实施例
4
参见图4，为本发明装置反应层（2）的设计示意图：反应模块（8）为4个；流通通道（5）有9级，宽为20 μm；反应微腔室（6）为正方形，边长设计为50 μm，高度设计为100 μm。
实施例
5
参见图5，为本发明装置反应层（2）的设计示意图：反应模块（8）为1个；流通通道（5）有11级，宽为5μm，反应微腔室（6）为正方形，边长设计为10 μm，高度设计为10 μm。
实施例
6
参见图6，为本发明装置进样实例图：进样量15 μL，由于每个反应小室到进样口的距离相等，保证样品引入小室前的流通距离相等，流通路径完全对称的这种结构均等分布的性质使反应小室的进样量更均等，避免了反应体积不均造成的误差。
实施例
7
参见图7，一种用于核酸分子扩增的等距等分进样的高集成度微流控芯片装置，其特征在于应用该芯片进行核酸扩增实时荧光定量检测，其方法包括以下步骤：
1）样品制备：将模板DNA/RNA与β-actin
Taqman探针试剂盒混合。
2）预先将该芯片用胶带密封置于真空泵中，进行抽真空除气处理。
3）芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出芯片置于常压下，刺破进样口（7）处的胶带，将样品溶液加入进样口（7）处，样品溶液在流通通道（5）和反应微腔室（6）与外界的气压差驱动下均匀充满整个流通通道（5）和反应微腔室（6）。
4）待进样完成后，紧接着在样品的进样口（7）处加入与水不相容的油相液体。
5）待油相液体完全充满整个流通通道（5）后，用PDMS 将进样口（7）密封。
6）密封后将将芯片装置置于实时荧光定量PCR仪上，采用电荷耦合元件（CCD）图像传感器，在每一轮的PCR反应结束时，采集每个反应微腔室（6）在该轮反应的荧光信号，并最终绘制成反应过程的荧光信号曲线，反应结束后通过对反应过程中指数期荧光信号分析从而对核酸进行定量。
实施例
8
参考图7，一种用于核酸单分子扩增的等距等分进样的高集成度微流控芯片，其特征在于应用该芯片进行数字核酸扩增，其方法包括以下步骤：
1）样品制备：将模板DNA/RNA与β-actin
Taqman探针试剂盒混合。
2）预先将该芯片用胶带密封置于真空泵中，进行抽真空除气处理。
3）芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出芯片置于常压下，刺破进样口（7）处的胶带，将样品溶液加入进样口（7）处，样品溶液在流通通道（5）和反应微腔室（6）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个流通通道（5）和反应微腔室（6）。
4）待进样完成后，紧接着在样品的进样口（7）处加入与水不相容的油相液体。
5）待油相液体完全充满整个流通通道（5）后，用PDMS 将进样口（7）密封。
6）密封后将芯片装置置于原位PCR仪或类似于原位PCR仪的热循环仪上，进行荧光定量PCR扩增。
7）反应结束后，采用电荷耦合元件（CCD）图像传感器采集反应微腔室（6）的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的微腔室代表一个阳性的PCR反应，通过对阳性反应微腔室（6）的计数，就可以实现对所检测样品的原始拷贝数进行绝对定量。
实施例
9
参考图7，一种用于核酸单分子扩增的等距进样的微流控，其特征在于应用该芯片进行单细胞核酸扩增分离鉴定，其方法包括以下步骤：
1）提取人间充质干细胞MSC-HF总RNA逆转录成cDNA作为反应模板，
将模板cDNA稀释到适当的浓度并与适量的商品化的荧光定量PCR反应试剂和β-actin 探针混合：
2）将500 ng/μL的MSC-HF cDNA溶液稀释为5 pg/μL、0.5 pg/μL、0.05 pg/μL、0.005 pg/μL，作为DNA模板各取1 μL进行PCR反应。
3）使用TaqMan® Gene Expression Master Mix试剂盒进行PCR扩增反应，按照20 μL体积配制反应液：TaqMan® Gene
Expression Master Mix 10 μL，β-actin Forward Primer (900 nM) 1 μL，β-actin Revers
Primer (900 nM) 1 μL, β-actin Probe (250 nM) 1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA模板1 μL。
4）将集成流路芯片组件置于实时荧光定量PCR仪上，反应条件：50℃ 2 min, 95℃ 10 min预变性，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，共40个循环。采用电荷耦合元件（CCD）图像传感器，在PCR反应结束时，采集每个反应微腔室（6）的荧光信号，并最终绘制成反应过程的荧光信号曲线。发生扩增反应的小室将呈现绿色荧光，阴性将无颜色变化。因此，如果有核酸分子被分配到某个独立的反应微腔室（6），该小室在反应后将产生绿色的荧光；如果核酸的浓度足够低，使每个反应微腔室（6）最多能分到一个核酸分子，那么，通过对阳性孔的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量，从而通过对反应过程中指数期荧光信号的分析对核酸进行定量。图7中A表示阴性反应小室，B表示阳性反应小室。
Claims (7)
1.高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，其特征在于，依次由盖玻片层（1）、反应层（2）、修饰层（3）与封接层（4）由下而上热键合组成，其中反应层（2）设有n个反应模块（8），反应模块（8）设有流通通道（5）、反应微腔室（6）和进样口（7），每个反应模块（8）中的流通通道（5）由多级流通通道组成，其上一级流通通道与下一级流通通道垂直等分，并且每个反应微腔室（6）到进样口（7）的距离相等，其中1≤n≤100。
2.根据权利要求1所述的高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，其特征在于，盖玻片层（1）选用洁净的盖玻片，预先采用空气等离子体处理；反应层（2）及封接层（4）的制作材料选用具有透气性质的聚合物材料聚二甲基硅氧烷；修饰层（3）是采用EGC-1720氟素表面处理剂进行旋涂处理形成约10 nm厚的具有防蒸发作用的纳米薄膜。
3.根据权利要求1所述的高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，其特征在于，流通通道（5）的分级数m与反应微腔室（6）的个数M之间的关系：M= 2m+1，其中2≤m≤100。
4.根据权利要求1所述的高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片在实时荧光定量核酸扩增的方法中的应用。
5.根据权利要求1所述的高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片在数字核酸扩增的方法中应用。
6.根据权利要求1所述的高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片在核酸扩增的单细胞分选的方法中的应用。
7. 根据权利要求1所述的高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片在SNP的检测、单碱基突变的检测、拷贝数失衡的检测、单细胞基因表达谱的研究、癌症标志物的早期检测、干细胞分化鉴定以及细胞分选鉴定中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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