CN106065391A - 用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微阀控制层、阀片层以及流道层；所述微流控芯片的底部外置磁铁。本发明还提供一种与所述芯片配套的用于细胞筛选、鉴定、单细胞扩增和分析的系统。本发明的微流控芯片及其相应的检测系统可以快速、简便和廉价的从大量细胞中分选出目的细胞，并对其中的单个细胞进行全基因组DNA扩增和分析。

Description

用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，具体地说，涉及一种用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片。
背景技术
基因是DNA分子上携带有遗传信息的功能片断,是生物传递遗传信息的物质。人类基因组精细图谱的公布,标志着现代医学的发展已逐步进入基因组医学时代。尤其是在现代医疗方面,基因组医学对疾病诊断、恶性肿瘤、器官移植、精神疾病、心血管疾病、传染病、制药、医学伦理以及基因治疗等方面的重要影响已初见端倪。主要体现在预测患病风险、预防疾病、科学指导生活方式和疾病个性治疗方面。
若能够在细胞水平发现癌细胞并进行基因分析，进行早期治疗和个性化基因精准治疗,癌症将不再是不治之症。但是由于检测方法的灵敏度不够以及分选技术的限制，长期以来基因分析只能进行细胞群体分析,从中获得细胞中的平均化学信息。研究表明，样本中单个细胞之间的基因表达调控也存在差异，尤其是在癌细胞中。而通过细胞群体分析获得的统计平均结果,掩盖了单个细胞之间的差异，并且会受到大量非目的细胞的影响，使生物学及医学等诸多领域的发展受到限制。因此单细胞基因分析对重大疾病如癌症早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究具有重要意义，目前已成为研究的热点之一。
由于细胞极小,直径一般为5-500μm,体积为fL至nL级,组分含量少(fmol至zmol)、种类繁多,使获取操纵、扩增和分析单细胞的难度加大。在单细胞样品的处理过程中也很容易造成样品的遗失和损失，对后续分析造成影响，成功率较低。由于单细胞DNA的数量极其微小，对其分析之前必须进行DNA的扩增。而以PCR(聚合酶链式反应)为基础的全基因组扩增技术，在PCR反应过程中，DNA片段的差异会影响聚合酶的扩增效率甚至导致酶滑链或者从模板上脱离，不能完整地覆盖基因组，并且会向序列中引入很多错误和非特异性扩增产物，存在扩增偏倚，在起始样本非常稀少时，使扩增质量大大降低，并且一次只能通过特定引物对单个基因位点进行检查，无法对同一样品进行多位点扩增和检测，无法进行单细胞全基因的分析。而新型的基于MDA(多重置换扩增)的扩增方法，在现有方法下也存在扩增偏倚量大、扩增质量不好的现象。
现有技术中，尚没有集成单细胞捕获、鉴定、全基因扩增和分析的整套工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片。
本发明的另一目的是提供一种与上述微流控芯片相配套的用于细胞筛选、鉴定、单细胞扩增和分析的系统。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微阀控制层、阀片层以及流道层；所述微流控芯片的底部外置磁铁；
所述顶盖上设有一个样品入口、一个样品出口、三个气泵连接口以及若干个样品采集口；所述样品入口与下层的微阀控制层以及阀片层的进样孔贯通相连，并与流道层上主流道的加样孔连通；所述样品出口与下层的微阀控制层以及阀片层的出样口贯通相连，并与流道层上主流道的流出孔连通；所述各气泵连接口分别与微阀控制层上每条凹槽末端相应的气泵接口连通；所述各样品采集口分别与流道层上各分支流道相应的收集孔连通，贯穿微阀控制层和阀片层；即各样品采集口分别对应于微阀控制层上的各样品连接口；
所述微阀控制层设有三条平行的阵列凹槽结构，每条凹槽包括多个相互连通的微阀控制结构单元，每条凹槽的末端设有一个气泵接口，各气泵接口分别位于顶盖上相应气泵连接口的下方；其中，一条凹槽设置在流道层的捕获区和裂解区之间相应微阀的上方，一条凹槽设置在流道层的裂解区和扩增区之间相应微阀的上方，另一条凹槽设置在流道层的扩增区和收集孔之间相应微阀的上方；
所述阀片层上设有一个进样孔和一个出样口，以及与流道层收集孔对应的若干收集口；
所述流道层上设有一条主流道以及与主流道相连的若干并联式排列的分支流道；主流道的两端分别设有一个加样孔和一个流出孔；每条分支流道包括捕获区、裂解区、扩增区以及收集孔，各部分之间用微阀相连。主流道用于样品的流入和流出(如图1所示，水平的单条流道，两端分别作为入口和出口)；分支流道用于单细胞的捕获、鉴定和基因扩增(如图1所示，带有多个与主流道侧壁相连的、平行的、条形结构)。
所述微阀控制层上凹槽结构的宽度为20～100微米，高度为10～100微米；所述微阀控制结构单元由高度为20～100微米，边长为100～1000微米的正方形组成。
所述阀片层的厚度为10～50微米，由一片完整的薄膜构成。
所述流道层的主流道，其高度为10～200微米，宽度为50～2000微米；分支流道的高度为15～100微米，其中，捕获区是长为30～400微米，宽为30～200微米的长方形结构；裂解区是长为200～2000微米，宽为100～1000微米的长方形结构；扩增区是长为400～4000微米，宽为200～2000微米的长方形结构；收集孔的直径为400～1000微米。
所述流道层的分支流道上设置的微阀，其顶端距阀片层底面2～50微米。微阀深度为5～20微米。
所述顶盖、微阀控制层、阀片层以及流道层由透明、隔水、隔气的弹性材料制成。
本发明的微流控芯片可以分别捕获单个细胞，并实现对细胞的原位荧光鉴定、裂解和扩增。
图1为本发明微流控芯片的结构示意图。
本发明还提供一种用于细胞筛选、鉴定、单细胞扩增和分析的系统，所述系统包括上述微流控芯片，荧光探针，连接磁珠的特异性生物探针、荧光显微镜，图像处理设备，注射泵，气泵和恒温水浴箱等。
本发明进一步提供一种利用上述系统进行单细胞分析的方法，所述方法是向微流控芯片中加入预先结合磁珠生物探针的细胞悬液样品，目的细胞在磁场的作用下，向并联式排布、具有连续反应腔室的微流控芯片的分支流道运动，最终单个目的细胞被捕获在每个分支流道的捕获区内；通过对芯片上微阀的控制，在液体的作用下将捕获的单个细胞从捕获区依次进入裂解区进行细胞裂解，进入扩增区进行单细胞全基因组DNA扩增，所得扩增产物进入收集孔内，用于下游分析。
所述样品是来自于活体组织、血液或体外培养的细胞悬液。
所述磁珠生物探针是标记了磁珠的抗体或多肽，从而对某种特定蛋白进行特异性识别。
如图3所示，首先对细胞样品进行预处理，加入连接磁珠的特异性生物探针，进行共同孵育，使其与目的细胞特异性结合。向微流控芯片的主流道通入细胞样品悬液，细胞流经微流体通道时，受到外界磁场作用，与连接磁珠的特异性生物探针结合的细胞将流入侧面的分支流道，而未结合磁珠的细胞会随着液体从出口流出。当样品注入完毕后，再向微流控芯片中通入一种或多种带有荧光标记的抗体或多肽，抗体(或多肽)会和某些细胞表面特定的抗原(或蛋白)结合，使用荧光显微镜从芯片正面观察分流道的捕获区，确定哪些捕获到的细胞是目的细胞，从而对细胞进行鉴定，并对其所在分流道进行标记。通过控制层打开捕获区与裂解区的连接阀(微阀)，将捕获细胞流入裂解区。通过主流道加入细胞裂解液，对细胞进行裂解。然后再打开裂解区与扩增区的连接阀，将裂解物产物通入到扩增区，再加入多重置换扩增(MDA)试剂，关闭所有连接阀。将芯片放入恒温水浴箱中，进行MDA扩增。最后从收集孔收集单细胞全基因组DNA扩增产物，进行后续基因分析。
本发明通过引入微加工技术和微流控芯片技术，开发出一种多层微结构芯片，实现了对细胞样品进行单细胞筛选、捕获、鉴定、单细胞全基因片上扩增。为单细胞分析领域提供了一种新方法，能够更高效，更准确，更高通量的筛选出单个目的细胞并对其进行基因扩增。
本发明具有以下优点：
(一)实现了对单细胞的分选、原位鉴定和原位扩增。在本发明所涉及的分子生物学领域和医学诊断领域中，对单细胞的精确分析带来了几个显著的优势：首先，单细胞内的DNA含量少，非常容易遗失和损失，本发明提出的原位裂解、扩增技术，可以最大程度的减少在样品液转移过程中的损失。其次，与传统技术相比，大大提高了分析的精确度，从而可以在大量细胞中筛选出极少的细胞。最后，传统的MDA扩增方法，细胞扩增偏倚率高，扩增质量不好，而在微小腔室下进行MDA扩增，可以大大减少偏倚量，提高扩增质量，从而减少对后续基因分析的影响。
(二)实现了对样品高通量、快速处理。本发明利用微加工技术，尺寸远小于采用传统方式的并列式捕获结构和反应腔室，可以同时捕获多个目的细胞，并在并列式的处理流道内同时进行基因扩增，相比传统手工操作方法，大大提高了处理的通量。同时，由于该微流控芯片反应腔室较小，反应充分，可以大大节省所用试剂和反应所需时间。此外，本发明引入了微流控技术，可以根据需要设计多条并联的流体通道，同时进行，大大提高处理速度。
(三)实现了多个实验步骤的高度集成化。本发明利用微流控技术将繁琐的细胞筛选、捕获、鉴定、裂解和扩增步骤集成到一个微流控芯片上，与原有技术相比，大大减少了操作步骤，从而也提高了实验成功率和可靠性。同时，依赖于高度集成化的芯片和简化的操作步骤，缩短了实验时间，提高了样品处理效率。
(四)本发明设计的芯片及相应系统适用范围广，自动化程度高。本发明中所涉及的细胞处理单元，其尺寸可以根据不同的需求进行调整，同时其并联细胞处理单元的数量也可以根据样品特点增减，以适应更广泛的需求。而这些改变对本领域技术人员来说，是容易实现的且几乎不增加成本；本发明涉及的光学鉴定和基于注射泵对反应的控制均可以通过摄像、图像分析、单片机处理以及编程等自动化手段完成，在提高处理速度的同时大大提高了准确率。
附图说明
图1为本发明微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明实施例1中图1微流控芯片的流道层沿AA’的剖面图，展示了芯片中捕获区的细胞腔室、裂解区的细胞腔室、扩增区的细胞腔室以及收集孔和微阀的具体结构。
图3为本发明实施例1中细胞捕获、鉴定、裂解和扩增的流程示意图，展示了微阀的不同开关状态。
图中，1-顶盖；2-气泵连接口；3-微阀控制层；4-微阀控制结构单元；5-样品连接口；6-阀片层；7-进样孔；8-流道层；9-收集孔；10-扩增区的细胞腔室；11-裂解区的细胞腔室；12-捕获区的细胞腔室；13-微阀空隙；14-细胞；15-微阀；16-样品采集口；17-样品入口；18-样品出口；19-收集口；20-收集孔；21-加样孔；22-流出孔。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片
本实施例提供的微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微阀控制层、阀片层以及流道层。在所述微流控芯片的底部外置有磁铁。
1、顶盖和微阀控制层
顶盖和微阀控制层：通过对其连接气泵的数字化控制，完成对芯片微阀开和关状态的切换，以达到对芯片反应进行控制的目的。由于对细胞进行鉴定时，需要光线透过控制层，因此控制层需要采用透明材质；同时，控制层需要制作样品进入和流出的接口以及和控制气泵的接口，所以需要能够开孔，并且要在开口处实现与外界连通管的良好密闭；此外，该控制层上还设有由微加工技术加工而成的微阀控制结构单元，所以需要采用兼容现有的微加工技术的材料；最后，控制层需要和顶盖层封接在一起，并且实现密封，所以材质的选择上要考虑封接问题。优选的材料是那些可以热塑成型制成特定规格及形状，且方便进行二次加工的的材料。
顶盖和微阀控制层的外廓尺寸要与流道层相匹配。控制层微阀控制结构单元的大小和位置要与流道层上的微阀结构相匹配。
在图1和图2所示的优选实施方式中，控制层采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)材料。控制层连接通道的宽度为100微米，高度为100微米；微阀控制区高为100微米的正方形，其边长根据所对应的流道微阀的大小分为200微米和300微米两种。这是针对该优选实施方式中流道层的设计的最优条件。当需要控制不同尺寸微阀时，可由本领域技术人员自行选择合适的控制区域尺寸。
2、阀片层
本发明中，阀片层用于分离细胞流道层与微阀控制层，因此该部分材料要具有隔气隔水性能，同时阀片层需利用其自身的弹性特性，辅助对芯片的微阀进行控制，因此该部分材料要具有良好的弹性性能；此外，阀片层还需要穿孔使流道层与外界连通。最后，阀片层的厚度要尽量薄(如10～50微米)，以达到使细胞顺利通过的目的，所以该部分材料要易于加工并有良好的物理性质。
在图1和图2所示的优选实施方式中，阀片层用PDMS材料，经过旋涂方法制成，厚度为20微米。
3、流道层
细胞流道层是该芯片的主要部分，主要用于实验样品的注入和流向限制，并提供每步反应所需的微腔室环境。为了适应细胞的尺寸和反应腔室的大小，必须选择能够兼容现有微加工技术的材料。
在图2所示的优选实施方式中，水平设置一条两端与外界连接的主流道，其高度为50微米，宽度500微米。在主流道的一侧并联式连通着大量的捕获和扩增单元。每个单元的流道和腔室高度均为50微米。捕获结构为长为200微米，宽为80微米的长方形结构；裂解区为长为800微米，宽为200微米的长方形结构；扩增区长为1600微米，宽为400微米的长方形结构，最后，通过收集孔与外界相连。本实施例的芯片长4厘米，宽2厘米，高0.3厘米，共并排排列80个扩增单元。每个部分用阀结构相连，用于控制流体的流动和提供密闭反应腔室。
在该优选实施方式中，设计了特殊的阀结构，其放大截面图如图2所示，在裂解腔室和扩增腔室的连接阀处，利用二次光刻技术，向下刻蚀4微米的距离，使薄膜分离层在自然情况与细胞流道层的结构有4微米的间距。当通过气泵对薄膜给予正压时，薄膜受力形变，与下面的流道层完全闭合，微阀处于关闭状态；反之，当对通过气泵对薄膜给予负压时，薄膜紧贴上面的微阀控制层的凹槽顶部，微阀属于开启状态；当薄膜处于自然情况时，阀片与流道层间距4微米，阀处于半开状态，此时小与4微米的物质(液体等)可以通过而细胞(大于4微米)不能通过。同时，在细胞扩增时如果引入过量的磁珠，会对扩增结果产生影响。由于所使用磁珠小于4微米，所以可以通过半开状态的阀过滤掉未与细胞结合的磁珠等物质，增加扩增的准确性与可靠性。
对于该芯片流道的具体参数，经过实验优化，达到高效率捕获到单个细胞和最佳的裂解与扩增效果的最优结果。
4、封接方法
在图1所示的优选实施方式中，顶盖采用玻璃制成；微阀控制层、阀片层和流道层的材料采用PDMS材料制成。采用氧等离子辅助键合的方法可以很好的实现PDMS和PDMS、PDMS和玻璃之间的良好密封封接。
在其它的实施方式中，可以根据控制层、阀片层和流道层的材料来选择合适的封接方法。
5、芯片配套系统
本实施例还提供与上述微流控芯片相配套的用于细胞筛选、鉴定、单细胞扩增和分析的系统。除了微流控芯片之外，还需要磁珠抗体，荧光探针(Probe)，连有探针的磁珠，荧光显微镜、图像处理设备和泵，MDA扩增试剂和恒温水浴箱等来构成完整的系统。
连有探针的磁珠用于分选细胞，在样品中加入识别EpCAM(Epithelial celladhesion molecule上皮细胞粘附分子)的抗体免疫磁珠进行孵育，使特定的细胞粘附磁珠。在外置磁铁的作用下，分选出目的细胞。
荧光探针用于鉴定细胞，在图2所示的优选实施方式中，采用标记了红色荧光的CD-45抗体和绿色标记的CK-19抗体作为荧光探针，用来识别白细胞表面的CD-45蛋白，和角质蛋白CK-19对细胞进行进一步鉴定。在其它实施方式中，也可以针对不同的蛋白选择不同的抗体或者多肽作为探针。
荧光显微镜用于检测捕获区的细胞是否有荧光，图像处理设备用于分析荧光显微镜获取的图像并对气泵和注射泵发出指令，对芯片进行自动化控制。气泵用于控制微阀，注射泵用于驱动微流体。
MDA扩增试剂和恒温水浴箱用于在芯片上原位对分离出的单细胞进行全基因组扩增。
6、芯片的具体制作方法
以下制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制造方法，而并不是对本发明所述器件的材料，尺寸和制造方法做出限定。
顶盖：采用4英寸Pyrex7740玻璃片(康宁公司)，按照长4厘米，宽2厘米的外形尺寸切成长方形小片，用激光在每块小片的特定位置打多个孔。
微阀控制层：采用N型4英寸硅片，利用光刻工艺把所需图形转移到4寸硅芯片上，将光刻之后的硅片使用半导体常用的ICP干法刻蚀(感应等离子刻蚀，即使用六氟化硫和四氟化碳的高能等离子来刻蚀硅)进行刻蚀加工。刻蚀出与所需图形相反的凸面芯片作为模具。之后将配置好的PDMS胶状物浇筑到加工完成的芯片模具上，经过加热交联反应，使其成为具有弹性的固体结构。待其凝固后脱模取出，切除PDMS没有槽的部分，按照长4厘米，宽2厘米的外形尺寸切成长方形小片，即得微阀控制层。
流道层：采用N型4英寸硅片，在光刻出流道的平面形状后，使用ICP干法刻蚀出50微米深的流道模具，再利用二次光刻技术，刻蚀出4微米深的微阀模具。将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出，按照长4厘米，宽2厘米的外形尺寸切成长方形小片，制作出流道层。
阀片层：将调制好的PDMS胶状物，通过旋涂法涂抹在匀胶机上的4英寸N型硅片基底上，通过控制转速来得到20微米厚度的PDMS薄膜。然后将其放入烘箱经过加热交联反应，从硅片上脱模后，得到具有弹性的阀片层。
芯片的组装和键合：将芯片的四个部分经过超声清洗等处理后，利用Plasma等离子处理表面，首先将顶盖和控制层键合在一起，再依次将阀片层和流道层键合在一起，经过高温烘烤辅助键合后，形成最终完整芯片。
芯片使用之前，对芯片进行灭菌处理。将整个芯片浸泡于75％的酒精中，同时使用注射器将酒精通过流道注满到芯片内部。静置12小时后，用PBS清洗，除去残留的酒精，进行后续实验。
芯片系统：在微流体芯片的基础上，使用普通塑料管连接泵和顶盖的流体出入口(样品出入口)、气阀控制孔和样品收集孔，并将气泵和注入泵与计算机相连进行控制，并将芯片放置在荧光显微镜下，在需要进行MDA扩增时，将芯片密封，放入恒温水浴锅内即可完成整套系统的构建。
7、具体应用方法
采用以下方法已将本发明所述微流控芯片及相应检测系统成功应用于单细胞操作。提供的具体方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的功能及应用方法，而并不是对本发明所述装置的适用范围做出限定。
取用体重为18-22g的BALB/c小鼠，在其腋下种入MCF-7癌细胞，待肿瘤生长到1立方厘米时，取1毫升小鼠尾血，稀释5倍，除去红细胞和杂质后，加入EPCAM抗体免疫磁珠进行孵育，之后通入微流控芯片中。在样品注入阶段，如图3中(ⅰ)所示，通过对外接气泵的控制，关闭阀(1)，打开阀(2)(3)。肿瘤细胞在磁场作用下进入捕获区，停留在阀(1)前端；细胞捕获完成后，向芯片内通入带有红色荧光的CD-45抗体和带有绿色荧光的CK-19抗体，使用荧光显微镜拍摄图像并进行处理，选出只有绿色荧光，没有红色荧光的单元进行标记。之后，使阀(2)处于半开状态(该状态下，小于4微米的物质与液体通过，而大于4微米的物质，如循环肿瘤细胞，则卡在阀结构前端不能通过)，同时打开阀(1)(3)，如图3中(ⅱ)所示，注入细胞裂解液，在流体的作用下，处于捕获区的细胞将流入裂解区，并卡在阀(2)前端，此时裂解区充满细胞裂解液；打开阀(3)，同时关闭阀(1)(2)，如图3中(ⅲ)所示，将芯片放入65℃水浴锅中10分钟，进行细胞裂解；此后，如图3中(ⅳ)所示，打开阀(1)和阀(2)，关闭阀(3)向芯片中加压注入配制好的MDA扩增试剂，裂解腔室中的细胞裂解产物会在流体的压力下，与MDA扩增试剂一起进入芯片扩增区；待其充满扩增区后，完全关闭阀(2)和阀(3)，如图3中(ⅴ)所示，将芯片放入30℃水浴锅中3小时进行基因MDA扩增；最后，如图3中(ⅵ)所示，打开阀(3)，将扩增之后的DNA产物通过扩增产物出口进行收集，进行DNA测序等下游分析。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于单细胞分选和单细胞全基因组扩增的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微阀控制层、阀片层以及流道层；所述微流控芯片的底部外置磁铁；
所述顶盖上设有一个样品入口、一个样品出口、三个气泵连接口以及若干个样品采集口；所述样品入口与下层的微阀控制层以及阀片层的进样孔贯通相连，并与流道层上主流道的加样孔连通；所述样品出口与下层的微阀控制层以及阀片层的出样口贯通相连，并与流道层上主流道的流出孔连通；所述各气泵连接口分别与微阀控制层上每条凹槽末端相应的气泵接口连通；所述各样品采集口分别与流道层上各分支流道相应的收集孔连通，贯穿微阀控制层和阀片层；
所述微阀控制层设有三条平行的阵列凹槽结构，每条凹槽包括多个相互连通的微阀控制结构单元，每条凹槽的末端设有一个气泵接口，各气泵接口分别位于顶盖上相应气泵连接口的下方；其中，一条凹槽设置在流道层的捕获区和裂解区之间相应微阀的上方，一条凹槽设置在流道层的裂解区和扩增区之间相应微阀的上方，另一条凹槽设置在流道层的扩增区和收集孔之间相应微阀的上方；
所述阀片层上设有一个进样孔和一个出样口，以及与流道层收集孔对应的若干收集口；
所述流道层上设有一条主流道以及与主流道相连的若干并联式排列的分支流道；主流道的两端分别设有一个加样孔和一个流出孔；每条分支流道包括捕获区、裂解区、扩增区以及收集孔，各部分之间用微阀相连。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀控制层上凹槽结构的宽度为20～100微米，高度为10～100微米；所述微阀控制结构单元由高度为20～100微米，边长为100～1000微米的正方形组成。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述阀片层的厚度为10～50微米。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述流道层的主流道，其高度为10～200微米，宽度为50～2000微米；分支流道的高度为15～100微米，其中，捕获区是长为30～400微米，宽为30～200微米的长方形结构；裂解区是长为200～2000微米，宽为100～1000微米的长方形结构；扩增区是长为400～4000微米，宽为200～2000微米的长方形结构；收集孔的直径为400～1000微米。
5.根据权利要求1-4任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述流道层的分支流道上设置的微阀，其顶端距阀片层底面2～50微米，微阀深度为5～20微米。
6.根据权利要求1-5任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述顶盖、微阀控制层、阀片层以及流道层由透明、隔水、隔气的弹性材料制成。
7.用于细胞筛选、鉴定、单细胞扩增和分析的系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1-6任一项所述的微流控芯片，荧光探针，连接磁珠的特异性生物探针、荧光显微镜，图像处理设备，注射泵，气泵和恒温水浴箱。
8.利用权利要求7所述系统进行单细胞分析的方法，其特征在于，所述方法是向微流控芯片中加入预先结合磁珠生物探针的细胞悬液样品，目的细胞在磁场的作用下，向并联式排布、具有连续反应腔室的微流控芯片的分支流道运动，最终单个目的细胞被捕获在每个分支流道的捕获区内；通过对芯片上微阀的控制，在液体的作用下将捕获的单个细胞从捕获区依次进入裂解区进行细胞裂解，进入扩增区进行单细胞全基因组DNA扩增，所得扩增产物进入收集孔内，用于下游分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品是来自于活体组织、血液或体外培养的细胞悬液。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述磁珠生物探针是标记了磁珠的抗体或多肽，从而对某种特定蛋白进行特异性识别。
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