CN111575346A - 一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法 - Google Patents

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CN111575346A CN202010423323.7A CN202010423323A CN111575346A CN 111575346 A CN111575346 A CN 111575346A CN 202010423323 A CN202010423323 A CN 202010423323A CN 111575346 A CN111575346 A CN 111575346A
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Abstract

本申请涉及一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，包括步骤：(a)对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选，获得目标微量细胞；(b)将目标微量细胞采用温和裂解体系进行裂解，获得DNA，所述温和裂解体系包含温和裂解配方、较低的裂解温度和较长的裂解时间；(c)对步骤(b)获取的DNA采用优化的ChromInst扩增体系进行扩增获得扩增产物，所述优化的ChromInst体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶；能够降低细胞分选后的细胞损伤、核酸片段化、DNA‑蛋白质交联以及碱基变异，从而提高扩增效率、扩增均匀性以及降低扩增错误率。

Description

一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法
技术领域
本发明涉及一种单细胞全基因组扩增方法，具体地，本发明涉及一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，减少因细胞分选对单细胞全基因组扩增所造成的干扰。
背景技术
研究发现人体内有一些含量极低但具有重要研究价值的细胞，如：孕妇外周血中含有极少量的胎儿有核红细胞，对该细胞的基因分析可用于胎儿无创产前检测；血液中的循环肿瘤细胞，该细胞可用于肿瘤早期检测及辅助治疗；等等。由于这些细胞含量极低，因此对这些微量细胞的扩增是重要环节，目前采用的技术为单细胞全基因组扩增技术，该技术的理想是将单细胞/微量细胞中的DNA完整、准确的扩增很多倍、用于后续的基因分析。单细胞全基因组扩增技术目前主要有三种方法：1.MDA(Multiple displacementamplification,多重置换扩增)，它是2001年由Laskin团队发明，具有很强的链置换性、可在等温条件下扩增；2.MALBAC(multiple annealing and looping-based amplificationcycles，多次退火环状循环扩增技术)，它是2012年由谢晓亮团队发明，拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性，MALBAC的起始模板量可低至皮克级，并且具有很好的扩增均一性及较小的扩增偏差；3.ChromInst扩增技术，它是2016年由亿康基因在MALBAC的基础上进行优化得到的一个试剂盒产品，ChromInst为该试剂盒的商标，业界简称ChromInst扩增技术，ChromInst扩增的起始模板量也可低至皮克级，并且操作步骤简化，能够实现一步成库，并且具有良好的扩增效果、基因组覆盖率及较小的扩增偏差。
但是，由于对所述单细胞/微量细胞的分离、捕获过程应用的细胞分选技术，会对后续单细胞全基因组扩增造成干扰，导致扩增效率低、偏好性显著、扩增错误率高的问题，影响基因分析结果的准确性。具体的，细胞分选是将一种细胞从多种细胞中分离出来的技术，常见的是利用荧光标记的特性来分离细胞，例如荧光激活细胞分选技术(FACS，fluorescence-activated cell sorting)，细胞分选时使用的荧光标记物质、或固定剂如：碘化丙啶、多聚甲醛，会造成细胞损伤、核酸片段化、DNA-蛋白质交联，从而导致扩增效率低(扩增产物少，总量不足1μg)、具有显著的偏好性；另外，固定剂的使用，还会造成脱氨基作用导致的C碱基变成U碱基，从而导致扩增错误率高，这也是单细胞/微量细胞捕获和扩增后，对下游应用的主要限制因素。
因此，本领域迫切需要一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，能够降低细胞分选对后续单细胞全基因组扩增的影响，从而使扩增效率更高、扩增均匀性更好、扩增错误率低。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，能够降低细胞分选后的细胞损伤、核酸片段化、DNA-蛋白质交联以及碱基变异，从而提高扩增效率、扩增均匀性以及降低扩增错误率。
本申请人经过长期广泛深入的研究，通过大量筛选和测试，首次发现，对于孕妇外周血中的胎儿有核红细胞、血液中的循环肿瘤细胞、卵细胞、生殖细胞、肿瘤组织细胞等人体内微量细胞，进行细胞分选后，通过优化的裂解体系和扩增体系，具体的，通过利用温和的裂解体系及优化的扩增体系，进行裂解及单细胞全基因组扩增，可获得更高的扩增效率、更好的扩增均匀性、且扩增错误率低。在一些实施方案中，可实现在单细胞水平有效扩增2-4ug的全基因组产物、覆盖度＞90％、重复单一位点扩增成功率＞95％。
具体地，对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选后，采用温和裂解体系对目标微量细胞进行裂解，温和裂解体系采用温和裂解配方，可以减少细胞损伤，同时降低裂解温度并且延长裂解时间，可以减少DNA-蛋白质交联；然后将获取的DNA采用优化的扩增体系进行扩增，优化的扩增体系是在ChromInst技术的基础上进行优化，在本申请中称为优化的Chromlnst体系，所述优化的Chromlnst体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度，使之更适合核酸短片段的扩增并且有针对性的提高短片段的扩增效率，可以降低核酸片段化及核酸片段化的影响，从而提高扩增效率及扩增均匀性；更重要的，优化的Chromlnst体系应用了无dU容忍性的DNA聚合酶，该DNA聚合酶对于dU碱基不耐受，不能识别DNA模板上的U碱基，因此受细胞分选固定剂作用C-U的错误突变在扩增阶段就会被排除，从而极大的降低了扩增错误率；扩增后的产物可用于高通量测序平台测序、芯片平台测序及数据分析。在此基础上，本发明人完成了本发明。
因此，本申请的一方面，提供一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，所述方法包括步骤：
(a)对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选，获得目标微量细胞，其中所述样本为来源于人类或哺乳动物，所述目标微量细胞为人体内含量极低但具有重要研究价值的细胞，例如孕妇外周血中的胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞、卵细胞、生殖细胞、肿瘤组织细胞；其中所述细胞分选为常规的荧光标记细胞分选技术，例如荧光激活细胞分选技术(FACS，fluorescence-activated cell sorting)、荧光流式细胞分选技术。
(b)将目标微量细胞采用温和裂解体系进行裂解，获得DNA，其中所述温和裂解体系包含温和裂解配方，减少细胞损伤；同时降低裂解温度并且延长裂解时间，减少DNA-蛋白质交联。
在一些实施方案中，所述温和的裂解配方进一步包括：0.4％-0.6％的NP-40、0.2％-0.3％的脱氧胆酸盐、和低浓度的蛋白酶K，进一步的，所述蛋白酶K的浓度由常规的100μg/mL降低至15-25μg/mL。
在一些实施方案中，所述温和裂解体系的裂解温度较低，进一步的，所述裂解温度由常规的55℃降低至3-6℃；所述温和裂解体系的裂解时间较长，进一步的，所述裂解时间由常规的1小时延长至2.5-3.5小时。
(c)对步骤(b)获取的DNA采用优化的扩增体系进行扩增，获得扩增产物，其中所述优化的扩增体系为优化的Chromlnst体系，所述优化的ChromInst体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶。
在一些实施方案中，所述优化的扩增缓冲液和引物浓度，更适合核酸短片段的扩增并且能够有针对性的提高短片段的扩增效率，降低了核酸片段化及核酸片段化的影响；所述无dU容忍性的DNA聚合酶，该DNA聚合酶对于dU碱基不耐受，不能识别DNA模板上的U碱基，因此受细胞分选的固定剂作用C-U的错误突变在扩增阶段就会被排除，极大的降低了扩增错误率。
在一些实施方案中，所述优化的扩增缓冲液进一步包括：45-55mM的Tris-HCl(pH7.4)、23-27mM的KCl、18-22mM的MgCl2、3-7mM的(NH4)2SO4、0.8-1.2mM的dNTPs、22-27μM的Pre-primer，所述优化的引物浓度为：9-18ng/ul的泓迅181114引物。
在一些实施方案中，所述无dU容忍性的DNA聚合酶为：0.05-0.1U/uL的Deep VentEXO- R DNA polymerase，可以有效的避免由于脱氨基作用导致的G/C到T/A的假阳性突变。
在一些实施方案中，扩增产物可用于高通量测序平台测序、芯片平台测序及数据分析。
本申请的另一方面，提供一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增的试剂盒，所述试剂盒包括：温和裂解配方、优化的ChromInst体系。
在一些实施方案中，所述温和裂解配方进一步包括：0.4％-0.6％的NP-40、0.2％-0.3％的脱氧胆酸盐、和低浓度的蛋白酶K，进一步的，蛋白酶K的浓度由常规的100μg/mL降低至15-25μg/mL；目标微量细胞进行裂解时，与温和裂解配方相配合的，需要使用较低的裂解温度和较长的裂解时间，所述裂解温度由常规的55℃降低至3-6℃，所述裂解时间由常规的1小时延长至2.5-3.5小时。
在一些实施方案中，所述优化的ChromInst体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶，所述优化的扩增缓冲液和引物浓度，更适合核酸短片段的扩增并且能够有针对性的提高短片段的扩增效率，降低了核酸片段化及核酸片段化的影响；所述无dU容忍性的DNA聚合酶，该DNA聚合酶对于dU碱基不耐受，不能识别DNA模板上的U碱基，因此受细胞分选的固定剂作用C-U的错误突变在扩增阶段就会被排除，极大的降低了扩增错误率。
在一些实施方案中，所述优化的扩增缓冲液进一步包括：45-55mM的Tris-HCl(pH7.4)、23-27mM的KCl、18-22mM的MgCl2、3-7mM的(NH4)2SO4、0.8-1.2mM的dNTPs、22-27μM的Pre-primer，所述优化的引物浓度为：9-18ng/ul的泓迅181114引物。
在一些实施方案中，所述无dU容忍性的DNA聚合酶为：0.05-0.1U/uL的Deep VentEXO- R DNA polymerase。
在一些实施方式中，所述试剂盒用于单细胞全基因组扩增、和/或构建单细胞全基因组DNA文库。
在一些实施方案中，所述扩增产物可用于高通量测序平台测序、芯片平台测序及数据分析。
附图说明
结合以下附图一起阅读时，将会更加充分地描述本申请内容的上述和其他特征，本申请内容将会得到更加明确和详细的说明。可以理解，这些附图仅描述了本申请内容的若干实施方式，因此不应认为是对本申请内容范围的限定。
图1显示了本发明的一个技术方案的流程图。
图2显示了ChromInst单细胞全基因组扩增的原理图。
图3显示了MDA扩增与本发明方法扩增的碱基错误频率。
图4显示了ChromInst试剂盒与本发明方法扩增的CNV分析结果。
发明详述
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。
本发明提供一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，以及提供一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增的试剂盒。
在本发明之前，对目标微量细胞的细胞分选，会造成细胞损伤、核酸片段化、DNA-蛋白质交联以及碱基变异，从而影响扩增效率、扩增均匀性以及导致扩增错误率较高。本申请人发明人通过温和的裂解体系和优化的扩增体系，降低细胞分选的干扰，获得更高的扩增效率、更好的扩增均匀性、且扩增错误率低。温和裂解体系采用温和裂解配方，同时降低裂解温度并且延长裂解时间，减少细胞损伤和DNA-蛋白质交联；优化的扩增体系为优化的ChromInst扩增体系具有优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶，降低核酸片段化和扩增错误率。在一些实施方案中，可实现在单细胞水平有效扩增2-4ug的全基因组产物、覆盖度＞90％、重复单一位点扩增成功率＞95％。
本申请的一方面，提供一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，所述方法包括步骤：
(a)对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选，获得目标微量细胞；(b)将目标微量细胞采用温和裂解体系进行裂解，获得DNA，所述温和裂解体系包含温和裂解配方、较低的裂解温度和较长的裂解时间；(c)对步骤(b)获取的DNA采用优化的ChromInst扩增体系进行扩增，获得扩增产物，所述优化的ChromInst体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶。本申请提供的扩增方法的一种实施方式的图示请见图1。
(a)：对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选，获得目标微量细胞；
所述含有目标微量细胞的样本为来源于生物样本，进一步的，来源于人类、哺乳动物，例如生物组织或含有细胞或游离DNA的体液；可以通过已知的方法获取，例如通过口腔粘膜样本、鼻腔样本、头发、漱口水、脐带血、血液、羊水、体外培养7天内胚胎的无胚胎细胞的培养液或腔液、内皮细胞等获取。
所述目标微量细胞为人体内含量极低但具有重要研究价值的细胞，例如孕妇外周血中的胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞、卵细胞、生殖细胞、肿瘤组织细胞等。
所述细胞分选也是本领域公知的，为常规的荧光标记细胞分选技术，例如荧光激活细胞分选技术(FACS，fluorescence-activated cell sorting)、荧光流式细胞分选技术。
(b)：将目标微量细胞采用温和裂解体系进行裂解，获得DNA；
所述温和裂解体系包含温和裂解配方，减少细胞损伤；同时具有较低的裂解温度并且较长的裂解时间，减少DNA-蛋白质交联。
在一些实施方案中，所述温和的裂解配方包括表面活性剂和裂解酶。表面活性剂可以分为离子型、两性和非离子型表面活性剂，一般情况下，两性和非离子型表面活性剂的裂解效能弱于离子型表面活性剂。示例性的表面活性剂包括：NP-40、吐温、SDS、GHAPS、TritonX-100、TritonX-114、EDTA、脱氧胆酸钠、胆酸钠、异硫氰酸胍中的一种或多种。示例性的裂解酶可以是蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述温和的裂解配方进一步包括：0.4％-0.6％的NP-40、0.2％-0.3％的脱氧胆酸盐、和低浓度的蛋白酶K，进一步的，所述蛋白酶K的浓度由常规的100μg/mL降低至15-25μg/mL。
在一些实施方案中，所述温和裂解体系的裂解温度较低，进一步的，所述裂解温度由常规的55℃降低至3-6℃；所述温和裂解体系的裂解时间较长，进一步的，所述裂解时间由常规的1小时延长至2.5-3.5小时。
(c)：对步骤(b)获取的DNA采用优化的ChromInst扩增体系进行扩增，获得扩增产 物。
本发明除了采用温和裂解体系，进一步在ChromInst扩增技术的基础上进行优化，进一步降低细胞分选对扩增所带来的干扰。所述优化的ChromInst扩增体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶。
ChromInst扩增的扩增步骤为本领域公知的，将裂解后获取的基因组DNA加入到反应混合物中进行预扩增，然后将预扩增产物进行指数扩增，获得扩增产物。ChromInst单细胞全基因组扩增的原理见图2。
本发明进一步在ChromInst扩增技术的基础上进行优化，ChromInst扩增的主体扩增步骤不变，但是进一步优化了预扩增和指数扩增中的扩增缓冲液和引物浓度、以及使用无dU容忍性的DNA聚合酶，所述优化的扩增缓冲液和引物浓度，更适合核酸短片段的扩增并且能够有针对性的提高短片段的扩增效率，降低了核酸片段化及核酸片段化的影响；所述无dU容忍性的DNA聚合酶，该DNA聚合酶对于dU碱基不耐受，不能识别DNA模板上的U碱基，因此受细胞分选的固定剂作用C-U的错误突变在扩增阶段就会被排除，极大的降低了扩增错误率。
在一些实施方案中，所述优化的扩增缓冲液进一步包括：45-55mM的Tris-HCl(pH7.4)、23-27mM的KCl、18-22mM的MgCl2、3-7mM的(NH4)2SO4、0.8-1.2mM的dNTPs、22-27μM的Pre-primer，所述优化的引物配比为：9-18ng/ul的泓迅181114引物。
在一些实施方案中，所述无dU容忍性的DNA聚合酶为：0.05-0.1U/uL的Deep VentEXO- R DNA polymerase，可以有效的避免由于脱氨基作用导致的G/C到T/A的假阳性突变。
在一些实施方案中，所述扩增产物可用于高通量测序平台测序、芯片平台测序及数据分析。
所述测序方法为本领域公知的，例如杂交测序法(SBH)、连接酶测序法(SBL)、定量增量荧光核酸增加测序法(QIFNAS)、逐步连接和切割法、分子信标法、焦磷酸测序法、多重测序法、聚合群体(POLONY)测序法、摆动测序法、TaqMan报告分子探针消化法、和等位基因特异的寡核苷酸连接分析法等。例如，高通量测序的方法，高通量测序的方法通过在一次测序反应中平行地对几万个、几十万个、几百万个、几千万个、甚至上亿个这样的短片段测序，可以大大提高测序的通量、缩短测序所需的时间。将测得的短片段的序列通过软件进行数据处理，可以拼接成完整的序列。本领域已知多种高通量测序平台，例如Roche 454、Illumina Solexa、AB-SOLiD、Helicos、Polonator平台技术等。
所述数据分析也是本领域公知的，例如单核苷酸多态性(SNP)分析、短串联重复序列(STR)分析、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、可变数目串联重复序列(VNTRs)分析、复杂重复序列(CTR)分析或微卫星分析等。
在一些实施方式中，本申请的方法得到的扩增产物还可以用于医学分析和/或诊断分析。例如，可以对个体的生物样品用本申请的方法进行扩增，分析扩增产物中在感兴趣的基因或DNA序列中是否存在突变、缺失、插入或染色体之间的融合等异常情况，从而评估该个体患上某种疾病的风险、疾病的进展阶段、疾病的基因分型、疾病的严重程度、或者该个体对某种疗法反应的可能性。可以使用本领域已知的适当的方法对感兴趣的基因或DNA序列进行分析，例如但不限于，通过核酸探针杂交、引物特异性扩增、对感兴趣的序列测序、单链构象多态性(SSCP)等。
本申请的另一方面，提供一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增的试剂盒，所述试剂盒包括：温和的裂解配方、优化的ChromInst扩增体系。
在一些实施方案中，所述温和的裂解配方进一步包括：0.4％-0.6％的NP-40、0.2％-0.3％的脱氧胆酸盐、和低浓度的蛋白酶K，进一步的，蛋白酶K的浓度由常规的100μg/mL降低至15-25μg/mL；目标微量细胞进行裂解时，与温和裂解配方相配合的，需要使用较低的裂解温度和较长的裂解时间，所述裂解温度由常规的55℃降低至3-6℃，所述裂解时间由常规的1小时延长至2.5-3.5小时。
在一些实施方案中，所述优化的ChromInst扩增体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶，所述优化的扩增缓冲液和引物浓度，更适合核酸短片段的扩增并且能够有针对性的提高短片段的扩增效率，降低了核酸片段化及核酸片段化的影响；所述无dU容忍性的DNA聚合酶，该DNA聚合酶对于dU碱基不耐受，不能识别DNA模板上的U碱基，因此受细胞分选的固定剂作用C-U的错误突变在扩增阶段就会被排除，极大的降低了扩增错误率。
在一些实施方案中，所述优化的扩增缓冲液进一步包括：45-55mM的Tris-HCl(pH7.4)、23-27mM的KCl、18-22mM的MgCl2、3-7mM的(NH4)2SO4、0.8-1.2mM的dNTPs、22-27μM的Pre-primer，所述优化的引物配比为：9-18ng/ul的泓迅181114引物。
在一些实施方案中，所述无dU容忍性的DNA聚合酶为：0.05-0.1U/uL的Deep VentEXO- R DNA polymerase。
在一些实施方式中，所述试剂盒用于单细胞全基因组扩增、和/或构建单细胞全基因组DNA文库。
在一些实施方案中，扩增产物可用于高通量测序平台测序、芯片平台测序及数据分析。
“和/或”在本申请中，用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。
“包含”或“包括”在本申请中，意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
“覆盖率”是指，基因组或染色体区段上获知序列信息的序列部分占整个组或区段的比例。在一些实施方案中，覆盖度是指，例如通过测序测到序列信息的碱基数占所检测区域的总碱基数的比例。例如，在测序检测全基因组序列时，由于存在大片段拼接的缺口(gap)、测序读长有限、重复序列等问题，测序后得到的基因组序列通常无法完全覆盖基因组的所有区域，此时，覆盖度就是最终得到的测序碱基数占整个基因组碱基数的比例。在另一些实施方案中，覆盖度是指，就所检测的区域而言，(例如通过SNP芯片或测序分析)测到序列信息的基因位点(例如SNP位点或基因变异位点)的数目，占该区域中所检测的总基因位点数的比例。所检测区域可以是全基因组、特定染色体、或特定染色体区段、或转录物组、或特定转录区域。
“Read”也称为“读长”，测序数据中每一条序列就是一个read。
“芯片”，是指利用所述芯片杂交后获得的信号(通常为荧光信号)能够判断某个位点的基因型。在实际的研究中，SNP芯片会因芯片厂家、型号等的不同而包含不同的SNP位点。例如Affymetrix公司和Illumina公司生产的人类芯片包含不同的SNP集。
实施例
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成为限制本发明的保护范围。
实施例1：高通量测序平台进行单细胞全基因组测序
步骤(a)：对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选，获得目标微量细胞。
取人体肿瘤组织样本，经过荧光激活细胞分选技术(FACS)分选捕获目标微量细胞，获得目标微量细胞为CD133+肿瘤干细胞。
步骤(b)：对步骤(a)获得的目标微量细胞采用温和裂解体系进行裂解，获得DNA。
获得的CD133+肿瘤干细胞，对照组采用常规的裂解液进行裂解，实验组采用本发明记载的裂解方法进行裂解。对照组采用Qiagen REPLI-g Single Cell kit试剂盒进行裂解，获得DNA，操作步骤参见产品说明书。实验组将获取的目标微量细胞加入到温和裂解配方中，该温和裂解配方包括：0.5％NP-40、0.25％脱氧胆酸盐、和20μg/mL的蛋白酶K，同时，裂解温度为4℃，裂解时间为3小时，获得DNA。
步骤(c)：对步骤(b)获取的DNA采用优化的ChromInst扩增体系进行扩增，获得扩增产物。
获得的DNA，对照组采用商品化的MDA试剂盒：Qiagen REPLI-g Single Cell kit试剂盒，进行单细胞全基因组扩增，实验组采用本发明记载的扩增方法进行单细胞全基因组扩增。
对照组采用Qiagen REPLI-g Single Cell kit试剂盒进行单细胞全基因组扩增，获得扩增产物，操作步骤参见产品说明书。实验组将获取的DNA加入到反应混合液中进行预扩增，反应混合液包括：50mM的Tris-HCl(pH7.4)、25mM的KCl、20mM的MgCl2、5mM的(NH4)2SO4、1.0mM的dNTPs、25μM的Pre-primer、12ng/ul的泓迅181114引物、0.08U/uL的Deep VentEXO- R DNA polymerase，预扩增程序为：
Figure BDA0002497767330000141
预扩增程序后，将预扩增产物进行指数扩增得到扩增产物，指数扩增程序为：
Figure BDA0002497767330000142
Figure BDA0002497767330000151
步骤(d)：高通量测序及数据分析。
对照组及实验组获得的扩增产物，采用商品化NGS建库试剂盒：NEBNext Ultra IIDNA试剂盒构建高通量测序文库，并在Illumina Novaseq测序平台上进行全基因组测序；测序数据获取后，采用FastQC软件过滤低质量的reads，用bwa软件将高质量的reads与参考基因组做比对，最后用GATK软件进行SNP识别(SNP calling)，其中，FastQC软件、bwa软件以及GATK软件均为商品化的软件，具体为开源软件。
将对照组采用MDA扩增和实验组采用本发明方法扩增，然后均测序得到的SNP进行比较，比较两种扩增方法导致的碱基错误频率，结果见附图图3，从图3中可以看出，采用本发明的单细胞全基因组扩增方法比MDA扩增比较，本发明扩增方法的碱基错误频率明显低于MDA扩增。
实施例2：芯片平台进行单细胞全基因组测序
步骤(a)：对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选，获得目标微量细胞。
取孕妇外周血，经过荧光激活细胞分选技术(FACS)分选捕获目标微量细胞，获得目标微量细胞为胎儿有核红细胞。
步骤(b)：对步骤(a)获得的目标微量细胞采用温和裂解体系进行裂解，获得DNA。
获得的胎儿有核红细胞，对照组采用常规的裂解液进行裂解，实验组采用本发明记载的裂解方法进行裂解。对照组采用Qiagen REPLI-g Single Cell kit试剂盒进行裂解，获得DNA，操作步骤参见产品说明书。实验组将获取的目标微量细胞加入到温和裂解配方中，该温和裂解配方包括：0.5％NP-40、0.25％脱氧胆酸盐、和20μg/mL的蛋白酶K，同时，裂解温度为4℃，裂解时间为3小时。
步骤(c)：对步骤(b)获取的DNA采用优化的ChromInst扩增体系进行扩增，获得扩增产物。
获得的DNA，对照组采用商品化的ChromInst试剂盒进行单细胞全基因组扩增，实验组采用本发明记载的扩增方法进行单细胞全基因组扩增。
对照组ChromInstTM基因测序通用文库试剂盒(亿康基因)进行单细胞全基因组扩增，获得扩增产物，操作步骤参见产品说明书。实验组将获取的DNA加入到反应混合液中进行预扩增，反应混合液包括：50mM的Tris-HCl(pH7.4)、25mM的KCl、20mM的MgCl2、5mM的(NH4)2SO4、1.0mM的dNTPs、25μM的Pre-primer、16ng/ul的泓迅181114引物、0.08U/uL的DeepVent EXO- R DNA polymerase，预扩增程序为：
Figure BDA0002497767330000161
预扩增程序后，将预扩增产物进行指数扩增得到扩增产物，指数扩增程序为：
Figure BDA0002497767330000171
步骤(d)：高通量测序及数据分析。
对照组及实验组获得的扩增产物，使用Illumina公司的Infinium AsianScreening Array芯片对扩增产物进行检测；芯片原始数据获取后，使用Illumina公司的GenomeStudio软件中的基因分型功能模块进行数据分析。
比较ChromInst试剂盒与本发明方法扩增产物的CNV分析结果，结果见附图图4，图4左图为ChromInst试剂盒扩增产物的CNV分析结果，右图为本发明方法扩增产物的CNV分析结果，对比可见，本发明方法的扩增的均一性更好。
尽管本发明已公开了多个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本发明，本发明的实际保护范围以权利要求为准。

Claims (10)

1.一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)对含有目标微量细胞的样本进行细胞分选，获得目标微量细胞；
(b)将目标微量细胞采用温和裂解体系进行裂解，获得DNA，所述温和裂解体系包含温和裂解配方、3-6℃的裂解温度、2.5-3.5小时的裂解时间；
(c)将步骤(b)获得的DNA采用优化的ChromInst扩增体系进行扩增，获得扩增产物，所述优化的ChromInst扩增体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述温和裂解配方包括：0.4％-0.6％的NP-40、0.2％-0.3％的脱氧胆酸盐、15-25μg/mL的蛋白酶K。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述优化的扩增缓冲液包括：45-55mM的Tris-HCl(pH7.4)、23-27mM的KCl、18-22mM的MgCl2、3-7mM的(NH4)2SO4、0.8-1.2mM的dNTPs、22-27μM的Pre-primer，所述优化的引物浓度为：9-18ng/ul的泓迅181114引物，所述无dU容忍性的DNA聚合酶为：0.05-0.1U/uL的Deep Vent EXO- R DNA polymerase。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述目标微量细胞包括：孕妇外周血中的胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞、卵细胞、生殖细胞、肿瘤组织细胞，所述含有目标微量细胞的样本来源于人类或哺乳动物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述细胞分选包括：荧光激活细胞分选技术、荧光流式细胞分选技术。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，其中所述扩增产物可用于高通量测序平台测序、芯片平台测序及数据分析。
7.一种针对细胞分选后的单细胞全基因组扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：温和裂解配方、优化的ChromInst扩增体系，所述优化的ChromInst扩增体系包含优化的扩增缓冲液和引物浓度、以及无dU容忍性的DNA聚合酶，对细胞分选后的目标微量细胞进行裂解及单细胞全基因组扩增获得扩增产物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，其中所述温和裂解配方包括：0.4％-0.6％的NP-40、0.2％-0.3％的脱氧胆酸盐、15-25μg/mL的蛋白酶K，同时与温和裂解配方相配合的，裂解温度为3-6℃、裂解时间为2.5-3.5小时。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，其中所述优化的扩增缓冲液包括：45-55mM的Tris-HCl(pH7.4)、23-27mM的KCl、18-22mM的MgCl2、3-7mM的(NH4)2SO4、0.8-1.2mM的dNTPs、22-27μM的Pre-primer，所述优化的引物浓度为：9-18ng/ul的泓迅181114引物，所述无dU容忍性的DNA聚合酶为：0.05-0.1U/uL的Deep Vent EXO- R DNA polymerase。
10.根据权利要求7-9任一所述的试剂盒，其特征在于，其中所述试剂盒用于单细胞全基因组扩增、和/或构建单细胞全基因组DNA文库，扩增产物可用于高通量测序平台测序、芯片平台测序及数据分析。
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