CN113070109B - 一种微流控芯片及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单细胞抗体检测与扩增技术领域。具体涉及一种微流控芯片及其应用。本发明的芯片由依次叠放在一起并相互密封的微阀控制层，微阀薄膜层，细胞处理层和基底层组成；具有液体注入口、细胞悬液入口、细胞悬液出口、扩增产物收集出口、微阀进气口、微阀进气口、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；扩增产物释放微阀控制结构通过气体流道上的微阀控制扩增产物的释放，液体流动微阀控制结构通过气体流道上的微阀控制控制细胞处理层中液体的流动，细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道和一个基因扩增腔室；细胞的捕获、鉴别和扩增在其中完成。本发明所有功能集成在同一芯片上，操作快速、简便。

Description

一种微流控芯片及其应用
技术领域
本发明涉及单细胞抗体检测与扩增技术领域。具体地说，涉及一种微流控芯片及其应用。
背景技术
单克隆抗体成为肿瘤治疗、抵抗病毒和疾病诊断的有效方法之一，尤其在免疫治疗领域发挥了重要的作用。抗体分子由2条相同的重链和2条相同的轻链组成，相同链间、不同链间通过二硫键相连接形成Y字型结构。重链和轻链的N端110个左右氨基酸高度可变，称为可变区，具有特异性结合抗原的功能，因此获取抗体可变区的基因序列是抗体研制的关键步骤。
抗体研制的平台有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单个B细胞技术。杂交瘤技术是经典的方法，由抗原免疫的正常小鼠/人源化小鼠细胞的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，采用ELISA、免疫荧光、流式细胞术等检测抗体的特异性、亲和力等性质。杂交瘤技术筛选方法低通量、耗时、耗力，需要较长的筛选周期才能得到目标抗体。噬菌体展示技术将所有阳性抗体的细胞重链和轻链cDNA克隆至噬菌体载体中，表达于细胞的表面进行多轮淘洗，获取强亲和力的抗体，对表达强亲和力的细胞培养、基因扩增得到抗体的轻重链序列。但上述方法是基于细胞群体分析，收集不同细胞分泌的抗体，或混合筛选抗体，无法排除非特异性抗体的干扰，不能精确反映每个细胞分泌的抗体的特异性。
近年来，基于单细胞分析的方法成为抗体发现的重要发展领域，如流式细胞术、微流控芯片等方法；其中，流式细胞术是基于荧光染色的方法，将荧光标记的抗原与B细胞混合孵育，分泌特异性抗体的细胞被染上荧光，从而被分选至96/384孔板内，进行单细胞的RT-PCR。该方法具有高通量的优势，但仅能检测细胞膜上的抗体，而分泌型的抗体几乎无法检测其抗体特异性，只能筛选表达特定标志物的细胞。微流控芯片技术是通过微纳加工的方法，制作与细胞大小尺寸相对应的几何结构腔室、物理屏障来捕获单个细胞，每个腔室的体积仅纳升/皮升水平。微流控芯片技术有微液滴和微阵列方法，微液滴方法可将单个细胞与荧光探针包裹于油包水的液滴内，把细胞分泌的抗体收集于纳升/皮升的液滴内，由此检测到单细胞分泌出的抗体。同时，也可以将单个细胞与细胞裂解液、RT-PCR反应液包裹在一起形成液滴，实现抗体基因的扩增。上述两种功能：抗体检测、基因扩增需要2次液滴生成的过程，操作要求高、而且液滴是封闭的腔室、无法进行游离荧光探针的清洗去除，从而增加背景信号的干扰、降低信噪比，造成假阴性。相对于液滴，微阵列芯片是开放的环境，微结构完成细胞的捕获与固定、可以实现溶液的交换、液体的连续流动进样，对游离荧光探针的去除，有效避免假阴性的出现。但现有微流控芯片功能单一，仅能完成抗体检测、基因扩增中的一个步骤。少量细胞在不同芯片间的转移，容易造成细胞的丢失、扩增的污染，导致实验的失败。
所以，有必要针对单细胞的抗体检测和基因扩增应用设计全新的微流控芯片。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种可在同一芯片中实现对单细胞的捕获、抗体鉴定和基因扩增的微流控芯片，以达到筛选高分泌抗体的细胞并扩增抗体基因的目的。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种微流控芯片，其由依次叠放在一起并相互密封的四层结构组成，所述四层结构由上至下分别为微阀控制层1，微阀薄膜层2，细胞处理层3和基底层4；
所述微阀控制层1上设有第一液体注入口101、多个第一细胞悬液入口102-109、多个第一细胞悬液出口110-113、多个第一扩增产物收集出口114-117、多个第一微阀进气口118-129、多个第二微阀进气口130-137、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；
所述扩增产物释放微阀控制结构由多条独立控制的气体流道组成，与微阀薄膜层共同控制扩增产物的释放；每个第一微阀进气口对应连通一条气体流道，用于控制气体流道内的压力，每条气体流道上包括多个扩增产物释放微阀；
所述液体流动微阀控制结构包括第一气体流道、第二气体流道和第三气体流道；所述第一气体流道上包括多个基因扩增腔室控制微阀D；所述第二气体流道上包括一个主流道起始控制微阀A、多个支流道控制微阀B和多个细胞处理单元间控制微阀C；所述第三气体流道上包括多个反应液流道控制微阀E；多个所述第二微阀进气口130-137用于控制液体流动微阀控制结构中的各气体流道内的压力；所述第一气体流道和第三气体流道内的压力由同一个所述第二微阀进气口控制，所述第二气体流道内的压力由另一个所述第二微阀进气口控制；
所述微阀薄膜层2上设有第二液体注入口、多个第二细胞悬液入口、多个第二细胞悬液出口和多个第二扩增产物收集出口；
所述细胞处理层3上设有第三液体注入口301，多个第三细胞悬液入口302-309、多个第三细胞悬液出口310-313、多个第三扩增产物收集出口314-317和细胞处理结构；
所述细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道和一个基因扩增腔室；
所述液体流道包括主流道、支流道和反应液流道；多个所述细胞处理单元通过主流道和反应液流道进行串联；
第一个细胞处理单元的主流道上包括一个主流道起始微阀控制区A’、一个流道狭窄区域和一个细胞处理单元间微阀控制区C’；
所述主流道和所述支流道的直径大于待捕获的单个细胞，所述流道狭窄区域的直径小于所述单个细胞，在适当的流速下，单个细胞可被拦截在流道狭窄区域。具体各流道直径可根据单个细胞尺寸进行调整。
第一个细胞处理单元的支流道包括连通流道、腔室进入流道和反应液连通流道；所述第一个细胞处理单元位于串联的多个所述细胞处理单元的起始位置；
所述连通流道将所述流道狭窄区域的两侧进行连通，并包括一个支流道微阀控制区B’；
所述腔室进入流道将所述连通流道与所述基因扩增腔室连通，并包括一个基因扩增腔室微阀控制区D’；所述支流道微阀控制区B’位于连通所述基因扩增腔室微阀控制区D’和所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向一侧的连通流道上；
所述反应液连通流道将所述主流道与所述反应液流道连通，并包括一个反应液流道微阀控制区E’；所述反应液连通流道与所述主流道连接的位置位于所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向的一侧；
其余细胞处理单元的结构与第一个细胞处理单元相同，区别仅在于其余细胞处理单元的主流道上不包括所述主流道起始微阀控制区A’；
所述主流道起始控制微阀A对应控制所述主流道起始微阀控制区A’，从而控制主流道整体的连通或封闭；每个所述支流道控制微阀B对应控制一个所述支流道微阀控制区B’，从而控制连通流道的连通或封闭；每个所述细胞处理单元间控制微阀C对应控制一个所述细胞处理单元间微阀控制区C’，从而控制细胞处理单元间在主流道上的连通或封闭；每个所述基因扩增腔室控制微阀D对应控制一个所述基因扩增腔室微阀控制区D’，从而控制腔室进入流道的连通或封闭；每个所述反应液流道控制微阀E对应控制一个所述反应液流道微阀控制区E’，从而控制反应液连通流道的连通或封闭；所述扩增产物释放微阀用于控制每一个基因扩增腔室的产物释放；
所述第一液体注入口101、第二液体注入口和第三液体注入口301相互对应连通，用于使液体流入整个微流控芯片区域；
多个所述第一细胞悬液入口102-109、多个所述第二细胞悬液入口和多个第三细胞悬液入口302-309相互对应连通，用于使液体进入各液体流道中；
多个所述第一细胞悬液出口110-113、多个所述第二细胞悬液出口、多个所述第三细胞悬液出口310-313相互对应连通，用于使各液体流道的液体流出微流控芯片；
多个所述第一扩增产物收集出口114-117、多个所述第二扩增产物收集出口和多个所述第三扩增产物收集出口314-317相互对应连通，用于使各基因扩增腔室的扩增产物流出微流控芯片。
本发明微流控芯片中，串联的多个细胞处理单元包括两个一级连续单元，每个所述一级连续单元为从一细胞处理单元串联端点开始，连续的一半细胞处理单元；每个所述一级连续单元包括两个二级连续单元，每个所述二级连续单元为从各自所处的所述一级连续单元的串联端点开始，连续的一半细胞处理单元；依此类推，将所有串联的多个细胞处理单元以二分法进行分级，直至最后一级连续单元中的细胞处理单元的数目为4；
串联的每个细胞处理单元中的基因扩增腔室的产物释放，通过与多个第一微阀进气口对应连通的多条气体流道内的压力变化而被控制；所述压力变化控制扩增产物释放微阀的启闭；具体控制方式为：
多个第一微阀进气口中的第一个所对应的气体流道控制所述一级连续单元中的一个，多个第一微阀进气口中的第二个所对应的气体流道控制所述一级连续单元中的另一个；多个第一微阀进气口中的第三个所对应的气体流道控制所述二级连续单元中间隔分布的两个，多个第一微阀进气口中的第四个所对应的气体流道控制所述二级连续单元中间隔分布的另外两个；依此类推，直至最后一级连续单元；多个第一微阀进气口中的倒数第四个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+1个，多个第一微阀进气口中的倒数第三个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+2个，多个第一微阀进气口中的倒数第二个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+3个，多个第一微阀进气口中的最后一个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+4个，其中，n为0和1至m之间的整数，m为(x-4)/4，x为串联的多个细胞处理单元的总数。
本发明微流控芯片中，包括多行串联的细胞处理单元，所述扩增产物释放微阀控制结构呈弓形迂回排布于微阀控制层，所述液体流动微阀控制结构分为多组，各组设置在弓形同向开口的结构内，每组液体流动微阀控制结构中的各气体流道为对折结构，使得各组液体流动微阀控制结构可控制多行串联的细胞处理单元中的两行。
本发明对各功能模块的排布和控制方式进行了大量研究，最终发现以本发明的方式，既可独立操控每个细胞处理单元，又可以最少的微阀数量完成基因扩增产物的释放，实现了结构的精简。
本发明中，由于对细胞进行鉴定时，需要光线透过微阀控制层和微阀薄膜层，因此，微阀控制层和微阀薄膜层需要采用透明材质；同时，微阀控制层和微阀薄膜层需要制作流体进入和流出的接口，所以需要能够开孔；另外，由于本发明是通过气体挤压薄膜产生弯曲形变，达到微阀开关的目的，所以微阀薄膜层的材质是弹性较好的软材料；此外，由于需要在芯片上对细胞进行培养，所有相关的材质均需要良好的生物兼容性；最后，微阀控制层需要和微阀薄膜层封接在一起，并且实现密封，所以材质的选择上要考虑与微阀薄膜层的兼容性。优选的材料是那些可以通过蒸镀、切割及热塑成型制成特定规格及形状的材料。特别优选的是较薄并透明的聚合物。
优选，微阀控制层、微阀薄膜层均采用PDMS材料。通过软光刻技术获得需要的微阀控制层的气体通道结构，以及涂胶的方式获得薄膜，二者采用键合的方式密封连接。在组装后，再在薄膜上开孔。在其它的实施方法中，微阀控制层也可以采用玻璃材料，利用湿法刻蚀或者激光刻蚀等技术获得气体通道，再通过键合的方式将二者封接在一起。
所述微阀薄膜层的厚度为10-30微米，优选，微阀薄膜层的厚度为25微米。
基底层是刚性材料，且高温不易发生形变，具良好的导热性。可以为透明材料也可以为不透明材料。优选所述基底层的材质为玻璃。
细胞处理层可由易于加工、尺寸可精确控制的材质(如硅片等)制作，可以为透明材料，也可以为不透明材料。优选，微阀控制层，细胞处理层和基底层为透明结构。
优选，所述细胞处理层的材质为具有蛋白吸附功能的材料，更优选为PDMS。
在本发明中，液体流道是用来捕获细胞并对其进行鉴定的关键功能区。为了适应细胞的尺寸，必须选择能够兼容微加工技术的材料。优选，选择PDMS作为液体流道的材料，是因为PDMS可以很好的兼容基于光刻和微加工的工艺，而且加工精度易于控制，从而可以很容易的获得和细胞尺寸相符的捕获阵列。本领域技术人员也可以根据需求选择硅片等可加工的材料。液体流道和基因扩增腔室这2个功能区及其包含的微结构加工方法相同，仅需要在一块硅片上完成一次蚀刻，获得不同尺寸的流道阵列结构。
优选，连通流道的形状为拱形，也可为其他形状。
基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形等任意形状腔室。
本发明还提供上述微流控芯片在同时进行单细胞捕获、鉴定、基因扩增中的应用。
在使用本发明芯片时还需要荧光探针、RT-PCR反应混合液、荧光显微镜、ImageJ图像分析软件、热循环仪和泵共同构成完整的系统，完成对细胞的捕获、鉴定和基因扩增。
RT-PCR反应混合液，包含逆转录酶，RNAase抑制剂，DNA聚合酶，重链和轻链引物，Mg2+,dNTP及缓冲液和其他稳定保护剂等物质。本领域技术人员可根据本领域常识选用。
荧光显微镜用于检测捕获于流道狭窄区域中的细胞周围是否有荧光，并对该流道狭窄区域进行扫描成像，获取荧光图片。
ImageJ图像分析软件用于分析荧光显微镜获取的图像并获得相应的荧光细胞的微孔数量。该软件通过对图像中荧光的强度进行计算，筛选出符合要求的微孔，记录微孔的位置；也可采用其他显微镜配套的图像记录、分析软件。
热循环仪用于RT-PCR反应的温度控制；也可采用其他能够控制温度的设备。
泵用于驱动液体样品、液体培养基、气体和相关试剂；也可采用光、电磁、负压等方式驱动液体、气体流动。
搭建芯片使用系统：在微流控芯片的基础上，使用聚四氟乙烯管连接泵和微阀控制层、细胞处理层的流体出入口，用聚四氟乙烯管连接泵和微阀控制层的气体通道入口，并将芯片放置在可自动进行荧光成像的正置荧光显微镜下，并在ImageJ图像处理软件用于荧光图像的自动分析处理，并注入RT-PCR反应液，结束后收集目标腔室内的扩增产物，即可完成整套系统的搭建。
本发明可检测样品为含有分泌抗体的细胞样本或分泌其他蛋白的细胞。
抗体检测是基因扩增的前提，有效鉴定分泌特异性抗体的细胞，这部分细胞数量达数百上千个，全部进行基因扩增、表达抗体，产生非常大的工作量。本发明在微流控芯片中对单细胞分泌的抗体分析鉴定，能够快速鉴定高分泌量、高亲和力的抗体分泌细胞。
具体地，本发明实现了对单细胞的捕获、鉴定、基因扩增：在本发明所涉及的单细胞筛选与基因扩增领域中，与细胞群筛选与基因扩增相比，具有以下显著优势：首先，与传统技术相比，本发明通过设计微流道结构，尺寸的大小作用捕获单个细胞，可结合细胞的浓度，流速获得较高的捕获效率，有利于对单个细胞分析；同时，样品在微升/纳升体积内，分泌的抗体分子可迅速达到检测浓度，缩短检测时间。其次，优选的PDMS是生物相容性的材料，对细胞无毒性，有利于细胞的培养；另外，操作过程均采用流体压力，对细胞无外界机械力的损伤，可保证细胞的活性。
本发明还实现了对细胞筛选和基因扩增的集成化：本发明采用功能区组合的方式，集抗体鉴定区(液体流道)和基因扩增区(基因扩增腔室)于一体，将整个操作过程集成在同一块芯片上完成，解决了功能模块之间的衔接、单细胞操控、独立扩增与释放等相互配合的难题，减少芯片外的操作，缩短细胞的筛选时间及基因扩增试剂使用量，从而快速得到抗体的序列并且降低成本。
本发明设计的微流控芯片及应用方法适用范围广：本发明中所涉及的微流道单细胞捕获、扩增腔室，其尺寸可以根据不同的细胞进行调整；也可以根据不同的细胞量增加模块的数量，对本领域技术人员来说，很容易实现并且几乎不额外增加成本。
综上所述，本发明通过引入微加工技术和微流控技术，开发了一种多层、多功能区的微流控芯片，实现了单细胞的捕获、鉴定和基因扩增，为单细胞抗体筛选领域提供了一种不同已有公开技术的方法，能够更快，更准确，更方便的获取高分泌细胞的基因序列。
本发明的芯片可在单细胞水平上，从大量的细胞中筛选特异性、高亲和力的细胞，并进行细胞裂解、基因扩增；采用微流控技术及微纳加工方法，将细胞捕获、抗体检测、细胞裂解扩增等功能集成在同一芯片上，可实现快速筛选特异性抗体并进行基因扩增的目的。
附图说明
图1为本发明微流控芯片的各层展开示意图。
图2为微阀控制层示意图，其中，左图为微阀控制层的俯视示意图，右图为微阀控制层中微阀结构部分的局部放大示意图(左图中的虚线区域)。
图3为细胞处理层示意图，其中，左图为细胞处理层的俯视示意图，右图为细胞处理层中细胞处理结构部分的局部放大示意图(左图中的虚线区域)。
图4为细胞注入时，阀门的启闭情况和液体流动示意图，箭头代表液体流动方向。
图5为细胞裂解时，阀门的启闭情况和液体流动示意图，箭头代表液体流动方向。
图6为单个微阀打开、关闭状态示意图。
图7为单个杂交瘤细胞捕获在流道狭窄区域图(左图)及捕获在流道狭窄区域中的分泌特异性抗体的杂交瘤细胞(右上图)及其荧光检测结果(右下图)。
图8为液体流道区域放大示意图。
图9为释放扩增产物时，阀门的启闭情况示意图。
图4、图5中所显示的区域对应于图2、图3中右图的局部放大区域(虚线区域)。图9中所显示的区域对应于图2的右图区域。
附图中：
微阀控制层1、微阀薄膜层2、细胞处理层3、基底层4、第一液体注入口101、第一细胞悬液入口102-109、第一细胞悬液出口110-113、第一扩增产物收集出口114-117、第一微阀进气口118-129、第二微阀进气口130-137、第三液体注入口301，第三细胞悬液入口302-309、第三细胞悬液出口310-313、第三扩增产物收集出口314-317、主流道起始控制微阀A、支流道控制微阀B和细胞处理单元间控制微阀C、基因扩增腔室控制微阀D、反应液流道控制微阀E、主流道起始微阀控制区A’、支流道微阀控制区B’、细胞处理单元间微阀控制区C’、基因扩增腔室微阀控制区D’、反应液流道微阀控制区E’、杂交瘤细胞5、分泌特异性抗体的杂交瘤细胞6、杂交瘤细胞6周围的荧光、气体流道118’-131’、流道狭窄区域的长度W2、流道狭窄区域的高度H2、主流道的高度W1。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，指示方位或位置关系的用语为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种微流控芯片，其由依次叠放在一起并相互密封的四层结构组成，所述四层结构由上至下分别为微阀控制层1，微阀薄膜层2，细胞处理层3和基底层4(材质为玻璃)；微阀控制层1，细胞处理层3和基底层4为透明结构。微阀控制层1，微阀薄膜层2，细胞处理层3均采用PDMS材料，采用氧等离子体辅助键合，在其他的实施方法中，可以根据微阀控制层、微阀薄膜层、细胞处理层的材料来选择合适的封接方法。
微流控芯片的各层展开示意图参见图1。微阀控制层的俯视示意图见图2中的左图，微阀控制层中微阀结构部分的局部放大示意图见图2中的右图。细胞处理层的俯视示意图见图3中的左图，细胞处理层中细胞处理结构部分的局部放大示意图见图3中的右图。
所述微阀控制层1上设有第一液体注入口101、8个第一细胞悬液入口102-109(编号顺序如箭头所示，从上而下依次为：102、103、104、105、106、107、108、109)、4个第一细胞悬液出口110-113(编号顺序如箭头所示，从上而下依次为：110、111、112、113)、4个第一扩增产物收集出口114-117(编号顺序如箭头所示，从上而下依次为：114、115、116、117)、12个第一微阀进气口118-129(编号顺序如箭头所示，从左而右依次为：118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129)、8个第二微阀进气口130-137(编号顺序如箭头所示，从左而右依次为：130、131、132、133、134、135、136、137)、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；
所述扩增产物释放微阀控制结构由12条独立控制的气体流道组成，每个第一微阀进气口118-129分别对应连通一条气体流道118’-129’的一端，另一端封闭，每条气体流道118’-129’上包括多个扩增产物释放微阀；通过控制不同进气口的压力，来控制各扩增产物释放微阀的开和关。
所述液体流动微阀控制结构包括第一气体流道、第二气体流道和第三气体流道；所述第一气体流道上包括多个基因扩增腔室控制微阀D；所述第二气体流道上包括一个主流道起始控制微阀A、多个支流道控制微阀B和多个细胞处理单元间控制微阀C；所述第三气体流道上包括多个反应液流道控制微阀E；每个基因扩增腔室控制微阀D、支流道控制微阀B、反应液流道控制微阀E对应控制一个位于细胞处理层3上的细胞处理单元，细胞处理单元间控制微阀C控制各细胞处理单元间的连通。
本实施例中扩增产物释放微阀控制结构呈弓形迂回排布，液体流动微阀控制结构分为4组，各组设置在弓形同向开口的结构内。每组液体流动微阀控制结构中的各气体流道为U形对折结构，从而使得各组液体流动微阀控制结构可控制位于细胞处理层3上的呈上下排列的细胞处理单元中的两行。
8个所述第二微阀进气口130-137用于控制液体流动微阀控制结构中的各气体流道内的压力；
每两个第二微阀进气口用于控制一组液体流动微阀控制结构，其中一个第二微阀进气口用于控制第一气体流道和第三气体流道内的压力，另一个第二微阀进气口用于控制第二气体流道内的压力。
本实施例中，第一个第二微阀进气口130用于控制第一组液体流动微阀控制结构中的第一气体流道和第三气体流道(气体流道130’)内的压力，第二个第二微阀进气口131用于控制第一组液体流动微阀控制结构中的第二气体流道(气体流道131’)内的压力。其他第二微阀进气口与气体流道的关系以此类推。
所述微阀薄膜层2上设有第二液体注入口、多个第二细胞悬液入口、多个第二细胞悬液出口和多个第二扩增产物收集出口；所述微阀薄膜层2是一层延展性好，易发生形变的薄膜结构，可与微阀控制层1上的各气体流道紧密闭合。
所述细胞处理层3(采用PDMS材料制备)上设有第三液体注入口301，多个第三细胞悬液入口302-309、多个第三细胞悬液出口310-313、多个第三扩增产物收集出口314-317和细胞处理结构；
所述细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道(单细胞捕获与抗体检测在其中进行)和一个基因扩增腔室(抗体基因扩增在其中进行)。
本实施例中基因扩增腔室的形状为长方形，长为2000微米，宽为600微米。细胞处理结构分8行排列，每行具有多个串联的细胞处理单元。第一、第二行由第一组液体流动微阀控制结构中位于U形结构两臂上的各微阀控制其中的液体流道，其他行依此类推。
每个细胞处理单元的所述液体流道包括主流道、支流道和反应液流道；多个所述细胞处理单元通过主流道和反应液流道进行串联；
每行第一个细胞处理单元的主流道上包括一个主流道起始微阀控制区A’、一个流道狭窄区域和一个细胞处理单元间微阀控制区C’；
主流道的直径大于单个细胞，流道狭窄区域的直径小于单个细胞，以使单个细胞可被拦截在流道狭窄区域。
支流道的直径大于单个细胞，可使单个细胞通过。
第一个细胞处理单元的支流道包括连通流道、腔室进入流道和反应液连通流道；所述第一个细胞处理单元位于串联的多个所述细胞处理单元的起始位置；
所述连通流道将所述流道狭窄区域的两侧进行连通，并包括一个支流道微阀控制区B’；本实施例中支流道的连通流道的形状为拱形(也可为其他形状)。
所述腔室进入流道将所述连通流道与所述基因扩增腔室连通，并包括一个基因扩增腔室微阀控制区D’；所述支流道微阀控制区B’位于连通所述基因扩增腔室微阀控制区D’和所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向一侧的连通流道上；
所述反应液连通流道将所述主流道与所述反应液流道连通，并包括一个反应液流道微阀控制区E’；所述反应液连通流道与所述主流道连接的位置位于所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向的一侧；
其余细胞处理单元的结构与第一个细胞处理单元相同，区别仅在于其余细胞处理单元的主流道上不包括所述主流道起始微阀控制区A’；
所述主流道起始控制微阀A对应控制所述主流道起始微阀控制区A’，从而控制主流道整体的连通或封闭；每个所述支流道控制微阀B对应控制一个所述支流道微阀控制区B’，从而控制连通流道的连通或封闭；每个所述细胞处理单元间控制微阀C对应控制一个所述细胞处理单元间微阀控制区C’，从而控制细胞处理单元间在主流道上的连通或封闭；每个所述基因扩增腔室控制微阀D对应控制一个所述基因扩增腔室微阀控制区D’，从而控制腔室进入流道的连通或封闭；每个所述反应液流道控制微阀E对应控制一个所述反应液流道微阀控制区E’，从而控制反应液连通流道的连通或封闭；所述扩增产物释放微阀用于控制每一个基因扩增腔室的产物释放；
每行串联的多个细胞处理单元包括两个一级连续单元，每个所述一级连续单元为从一细胞处理单元串联端点开始，连续的一半细胞处理单元；每个所述一级连续单元包括两个二级连续单元，每个所述二级连续单元为从各自所处的所述一级连续单元的串联端点开始，连续的一半细胞处理单元；依此类推，将所有串联的多个细胞处理单元以二分法进行分级，直至最后一级连续单元中的细胞处理单元的数目为4；
串联的每个细胞处理单元中的基因扩增腔室的产物释放，通过与多个第一微阀进气口对应连通的多条气体流道内的压力变化而被控制；所述压力变化控制扩增产物释放微阀的启闭；具体控制方式为：
多个第一微阀进气口中的第一个所对应的气体流道同时控制所有行中所述一级连续单元中的一个，多个第一微阀进气口中的第二个所对应的气体流道同时控制所有行中所述一级连续单元中的另一个；多个第一微阀进气口中的第三个所对应的气体流道同时控制所有行中所述二级连续单元中间隔分布的两个，多个第一微阀进气口中的第四个所对应的气体流道同时控制所有行中所述二级连续单元中间隔分布的另外两个；依此类推，直至最后一级连续单元；多个第一微阀进气口中的倒数第四个所对应的气体流道同时控制所有行中串联的多个细胞处理单元中的第4n+1个，多个第一微阀进气口中的倒数第三个所对应的气体流道同时控制所有行中串联的多个细胞处理单元中的第4n+2个，多个第一微阀进气口中的倒数第二个所对应的气体流道同时控制所有行中串联的多个细胞处理单元中的第4n+3个，多个第一微阀进气口中的最后一个所对应的气体流道同时控制所有行中串联的多个细胞处理单元中的第4n+4个，其中，n为0和1至m之间的整数，m为(x-4)/4，x为串联的多个细胞处理单元的总数。
本实施例中，每一行共有64个细胞处理单元，每个细胞处理单元的扩增产物的释放与否由12条气体流道中的5条控制。具体采用逐级分解操控的方法，分解至最小单元数为4；详细方法如下：设定每一行中的64个细胞处理单元从左至右依次为第一细胞处理单元至第六十四细胞处理单元。第一微阀进气口118所对应的气体流道118’同时控制每一行中的第三十三细胞处理单元至第六十四细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的第一细胞处理单元至第三十二细胞处理单元呈开启状态(不在基因扩增腔室出口位置设置相应的扩增产物释放微阀进行控制)；第一微阀进气口119所对应的气体流道119’同时控制每一行中的第一细胞处理单元至第三十二细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的第三十三细胞处理单元至第六十四细胞处理单元呈开启状态；第一微阀进气口120所对应的气体流道120’同时控制每一行中的第十七细胞处理单元至第三十二细胞处理单元，第四十九细胞处理单元至第六十四细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的第一细胞处理单元至第十六细胞处理单元，第三十三细胞处理单元至第四十八细胞处理单元呈开启状态；第一微阀进气口121所对应的气体流道121’同时控制每一行中的第一细胞处理单元至第十六细胞处理单元，第三十三细胞处理单元至第四十八细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的其他细胞处理单元呈开启状态；第一微阀进气口122所对应的气体流道122’同时控制每一行中的第九细胞处理单元至第十六细胞处理单元，第二十五细胞处理单元至第三十二细胞处理单元，第四十一细胞处理单元至第四十八细胞处理单元，第五十七细胞处理单元至第六十四细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的其他细胞处理单元呈开启状态；第一微阀进气口123所对应的气体流道123’同时控制每一行中的第一细胞处理单元至第八细胞处理单元，第十七细胞处理单元至第二十四细胞处理单元，第三十三细胞处理单元至第四十细胞处理单元，第四十九细胞处理单元至第五十六细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的其他细胞处理单元呈开启状态；第一微阀进气口124所对应的气体流道124’同时控制每一行中的第五细胞处理单元至第八细胞处理单元，第十三细胞处理单元至第十六细胞处理单元，第二十一细胞处理单元至第二十四细胞处理单元，第二十九细胞处理单元至第三十二细胞处理单元，第三十七细胞处理单元至第四十细胞处理单元，第四十五细胞处理单元至第四十八细胞处理单元，第五十三细胞处理单元至第五十六细胞处理单元，第六十一细胞处理单元至第六十四细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的其他细胞处理单元呈开启状态；第一微阀进气口125所对应的气体流道125’同时控制每一行中的第一细胞处理单元至第四细胞处理单元，第九细胞处理单元至第十二细胞处理单元，第十七细胞处理单元至第二十细胞处理单元，第二十五细胞处理单元至第二十八细胞处理单元，第三十三细胞处理单元至第三十六细胞处理单元，第四十一细胞处理单元至第四十四细胞处理单元，第四十九细胞处理单元至第五十二细胞处理单元，第五十七细胞处理单元至第六十细胞处理单元的扩增产物释放微阀的启闭状态，并使每一行中的其他细胞处理单元呈开启状态；第一微阀进气口126所对应的气体流道126’使每一行中的第4n+1个(n取0、1到15之间的整数)细胞处理单元呈开启状态，同时控制每一行中的其他细胞处理单元的启闭状态。第一微阀进气口127所对应的气体流道127’使每一行中的第4n+2个(n取0、1到15之间的整数)细胞处理单元呈开启状态，同时控制每一行中的其他细胞处理单元的启闭状态。第一微阀进气口128所对应的气体流道128’使每一行中的第4n+3个(n取0、1到15之间的整数)细胞处理单元呈开启状态，同时控制每一行中的其他细胞处理单元的启闭状态。第一微阀进气口129所对应的气体流道129’使每一行中的第4n+4个(n取0、1到15之间的整数)细胞处理单元呈开启状态，同时控制每一行中的其他细胞处理单元的启闭状态。
所述第一液体注入口101、第二液体注入口和第三液体注入口301相互对应连通形成液体注入口，用于使液体(预处理液、RT-PCR反应液)流入整个微流控芯片区域；
8个所述第一细胞悬液入口102-109、8个所述第二细胞悬液入口和8个第三细胞悬液入口302-309相互对应连通形成8个细胞悬液入口，用于使液体(样品、检测试剂)进入各液体流道中；每个细胞悬液入口对应控制一行细胞处理单元的液体流入。
4个所述第一细胞悬液出口110-113、4个所述第二细胞悬液出口、4个所述第三细胞悬液出口310-313相互对应连通形成4个细胞悬液出口，用于使各液体流道的液体流出微流控芯片；
4个所述第一扩增产物收集出口114-117、4个所述第二扩增产物收集出口和4个所述第三扩增产物收集出口314-317相互对应连通4个形成扩增产物收集出口，用于使各基因扩增腔室的扩增产物流出微流控芯片。
本实施例中，第一、第二行细胞处理单元共用同一个细胞悬液出口和一个扩增产物收集出口，其他行以此类推。
本实施例中，微阀控制层1的厚度为2000微米，各气体通道的深度为200微米，微阀薄膜层2的厚度为25微米，可有效控制微阀的开关。当需要微阀控制开关的流道长度、宽度以及深度发生变化时，可由本领域技术人员根据需要自行选择合适的气体通道和微阀薄膜尺寸。
液体流道区域放大示意图参见图8。本实施例中，流道狭窄区域的长度W2为10微米，高度H2(直径)为5微米，整个阵列共有512个流道狭窄区域；对于进入样品的主流道，为适应流速、细胞尽可能保持单层分布，主流道的高度W1为20微米。上述是应用于分析杂交瘤细胞的优先条件。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员根据芯片的尺寸规格和细胞实验的要求，自行选择合适的微孔尺寸及数量。
本发明的微流控芯片可由如下两套不同的制作工艺制备。具体制造步骤如下：
制作方法A：
微阀控制层1：采用Pyrex7740玻璃片(康宁公司)，在硅片正面光刻出微孔(各出入口)和气体通道的平面位置，采用氢氟酸腐蚀玻璃，形成200微米深的气体通道和孔，利用激光将微孔的位置打穿。按照长8厘米，宽6厘米的外形尺寸切成长方形小片。
微阀薄膜层2：采用N型4英寸硅片，利用旋涂法在其表面涂上一层25微米厚的PDMS液体，待其凝固后脱模取出，按照长8厘米，宽6厘米的外形尺寸切成长方形薄膜。
细胞处理层3：采用N型4英寸硅片，对其采用湿法氧化，在硅片表面获得一层1微米厚的氧化层，在硅片正面光刻出细胞处理层3的各流道和各各出入口的平面位置，采用氢氧化钾湿法腐蚀的方法制作。将4英寸硅片按照长10厘米，宽8厘米的外形尺寸切成长方形小片。
基底层4：采用250微米厚玻璃，清洗干净，按8厘米，宽6厘米的外形尺寸切成长方形状。
封接：首先将微阀控制层1、微阀薄膜层2进行氧等离子体处理，然后键合在一起形成复合体，再依次与细胞处理层3、基底层4进行氧气等离子体处理并键合，最终获得完整的微流控芯片。
制作方法B(本实施例的微流控芯片采用该方法)：
微阀控制层1：采用N型4英寸硅片，在光刻出气体通道的平面形状后，使用ICP干法刻蚀出200微米高的凸体。将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出，按照长8厘米，宽6厘米的外形尺寸切成长方形小片，使用打孔器在所需位置打孔(各出入口)，这样就得到了微阀控制层。
微阀薄膜层2：采用N型4英寸硅片，利用旋涂法在其表面涂上一层25微米厚的PDMS液体，待其凝固后脱模取出。
细胞处理层3：采用N型4英寸硅片，在500微米的单抛硅片的表面旋涂一层20微米厚SU-8光刻胶，紫外光刻出结构图形。将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出，按照长8厘米，宽6厘米的外形尺寸切成长方形小片。
基底层4：采用250微米厚玻璃，清洗干净，8厘米，宽6厘米的外形尺寸切成长方形状。
封接：首先将微阀控制层1、微阀薄膜层2进行氧等离子体处理，然后键合在一起形成复合体，再依次与细胞处理层3、基底层4进行氧气等离子体处理并键合，最终获得完整的芯片。
实施例2
本实施例提供采用上述微流控芯片进行杂交瘤细胞的筛选与抗体基因扩增的应用方法，具体以针对CD45蛋白的杂交瘤细胞为例阐述具体应用方法如下：
操作时所有的试剂均为无核酸酶水配制，耗材无核酸酶。
所有的实验步骤均在无菌环境的细胞间内进行，耗材和仪器均提前消毒处理，试剂均是无菌。
1、对微流控芯片预处理，将75％乙醇从液体注入口注入微流控芯片，持续注入5分钟，对流道表面进行灭菌、浸润增加亲水性。注入无菌的磷酸缓冲溶液(PBS)，对流道内的乙醇进行清洗。关闭各腔室进入流道上的基因扩增腔室控制微阀D，将液体流道区域与基因扩增腔室隔离开；然后，通过细胞悬液入口往主流道中泵入CD45检测蛋白(白细胞共同抗原)，放置于4度，孵育过夜，使CD45检测蛋白充分吸附。次日，注入5％的无菌BSA，孵育1小时，封闭未结合抗原的位点。
2、单细胞鉴定：收集异质性的杂交瘤细胞(平均直径为12微米)，重悬于细胞培养液中，调整细胞浓度至8×105个细胞/毫升，通过微泵从细胞悬液入口以3微升/分钟流速注入到主流道中，同时关闭基因扩增腔室控制微阀D和反应液流道控制微阀E(向第一气体流道和第三气体流道施加负压)，保持主流道起始控制微阀A、支流道控制微阀B和细胞处理单元间控制微阀C开启(向第二气体流道施加正压)。当细胞悬液流经沿直线的主流道，由于尺寸大小作用，细胞的尺寸大约12微米，流道狭窄区域的直径为5微米，有效截留单个细胞，导致主流道不通，其余细胞将从支流道的连通流道，穿过开启的支流道控制微阀B绕行到流道狭窄区域的另一侧，接着通过开启的细胞处理单元间控制微阀C，进入下一个细胞处理单元的液体流道内，依次使每个细胞处理单元中的流道狭窄区域捕获单个细胞。细胞注入时，阀门的启闭情况和液体流动示意图见图4，图中黑色的阀门代表关闭状态。
单细胞捕获结束后，放置于二氧化碳培养箱孵育2小时。注入无菌的PBS，清洗未结合的抗体后，注入荧光二抗，反应1小时，注入无菌的PBS，清洗未结合的二抗。使用荧光显微镜从正面对流道狭窄区域进行自动扫描，记录荧光的位置。单个杂交瘤细胞5捕获在流道狭窄区域图见图7的左图，捕获在流道狭窄区域中的分泌特异性抗体的杂交瘤细胞6见图7的右上图，杂交瘤细胞6周围的荧光见图7的右下图。获取荧光图像后，持续泵入生理盐水，清洗细胞和芯片流道。
3、细胞裂解、基因扩增：关闭细胞处理单元间控制微阀C，避免细胞间的相互干扰，关闭主流道起始控制微阀A和支流道控制微阀B(向第二气体流道施加负压)；打开基因扩增腔室控制微阀D和反应液流道控制微阀E(向第一气体流道和第三气体流道施加正压)，从液体注入口向反应液流道中通入含有细胞裂解液的单细胞扩增混合液(RT-PCR反应液)，使混合液流经反应液连通流道、流道狭窄区域，携带捕获在流道狭窄区域的细胞一同经连通流道(未设置支流道控制微阀B的一侧)、腔室进入流道进入基因扩增腔室，持续注入混合液至充满每个基因扩增腔室，然后关闭基因扩增腔室控制微阀D和扩增产物释放微阀，保证液体不向外泄露。之后，将微流控芯片放置于平板PCR仪上，进行扩增反应。细胞裂解时，阀门的启闭情况和液体流动示意图见图5，图中黑色的阀门代表关闭状态。
反应结束后，选取目标反应腔室，打开对应的基因扩增腔室控制微阀D、反应液流道控制微阀E和扩增产物释放微阀，通入去离子水，最终从扩增产物收集出口获得扩增产物，进行二次扩增，并进行测序验证。
当释放第一行，第3列基因扩增腔室(图9中黑色方框中的基因控制腔室)内的产物时，阀门的启闭情况示意图见图9，图中箭头代表去离子水流入方向，黑色的阀门代表关闭状态，气体流道118’-129’分别为由第一微阀进气口118-129控制压力的气体流道。气体流道130’(第一组液体流动微阀控制结构中的第一气体流道和第三气体流道)、气体流道131’(第一组液体流动微阀控制结构中的第二气体流道)分别为由第二微阀进气口130、131控制压力的气体流道。
具体涉及该部分的微阀状态和释放过程如下：向第二微阀进气口130施加负压，使在第一组液体流动微阀控制结构中的第一气体流道和第三气体流道上的各控制微阀开启。对第二微阀进气口131施加正压，使第一组液体流动微阀控制结构中的第二气体流道上的各控制微阀关闭，分隔每个细胞处理单元，之后，向反应液流道内输入用于将扩增产物冲出的液体；与此同时，向第一微阀进气口118施加正压，使第三十三细胞处理单元至第六十四细胞处理单元的扩增产物释放微阀关闭，向第一微阀进气口119施加负压，使第一细胞处理单元至第三十二细胞处理单元的扩增产物释放微阀开启；向第一微阀进气口120施加正压，使第十七细胞处理单元至第三十二细胞处理单元的扩增产物释放微阀关闭，第一细胞处理单元至第十六细胞处理单元呈开启状态；向第一微阀进气口121施加负压，使第一细胞处理单元至第十六细胞处理单元的扩增产物释放微阀开启；向第一微阀进气口122施加正压，使第九细胞处理单元至第十六细胞处理单元的扩增产物释放微阀关闭，第一细胞处理单元至第八细胞处理单元呈开启状态；向第一微阀进气口123施加负压，使第五细胞处理单元至第八细胞处理单元的扩增产物释放微阀开启，第一细胞处理单元至第四细胞处理单元呈开启状态；向第一微阀进气口124施加正压，使第五细胞处理单元至第八细胞处理单元的扩增产物释放微阀关闭，第一细胞处理单元至第四细胞处理单元呈开启状态；向第一微阀进气口125施加负压，使第一细胞处理单元至第四细胞处理单元的扩增产物释放微阀开启，第五细胞处理单元至第八细胞处理单元呈开启状态；向第一微阀进气口126、127、129施加负压，使相应细胞处理单元的扩增产物释放微阀开启；向第一微阀进气口128施加正压，使第一、第二、第四细胞处理单元的扩增产物释放微阀关闭，第三细胞处理单元呈开启状态，释放第三细胞处理单元的基因扩增腔室内的产物。
本发明中，单个微阀打开、关闭状态示意图见图6。在微阀打开状态时，微阀薄膜层2上相应于微阀位置的薄膜向上凸起，贴合于微阀控制层1上的相应微阀区域，此时液体可以通过细胞处理层3上的相应区域。在微阀关闭状态时，微阀薄膜层2上相应于微阀位置的薄膜向下凹陷，贴合于细胞处理层3上的相应微阀控制区，此时液体不能通过细胞处理层3上的相应区域。
本实施例中，采用标记了绿色荧光的山羊抗小鼠Ig二抗作为荧光探针，识别细胞分泌的抗体。在其他实施方法中，也可以针对不同的检测方法，选择不同的抗体、多肽或者生物素-亲和素反应系统及其衍生物作为探针。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (39)

1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由依次叠放在一起并相互密封的四层结构组成，所述四层结构由上至下分别为微阀控制层，微阀薄膜层，细胞处理层和基底层；
所述微阀控制层上设有第一液体注入口、多个第一细胞悬液入口、多个第一细胞悬液出口、多个第一扩增产物收集出口、多个第一微阀进气口、多个第二微阀进气口、扩增产物释放微阀控制结构和液体流动微阀控制结构；
所述扩增产物释放微阀控制结构由多条独立控制的气体流道组成，与微阀薄膜层共同控制扩增产物的释放；每个第一微阀进气口对应连通一条气体流道，用于控制气体流道内的压力，每条气体流道上包括多个扩增产物释放微阀；
所述液体流动微阀控制结构包括第一气体流道、第二气体流道和第三气体流道；所述第一气体流道上包括多个基因扩增腔室控制微阀D；所述第二气体流道上包括一个主流道起始控制微阀A、多个支流道控制微阀B和多个细胞处理单元间控制微阀C；所述第三气体流道上包括多个反应液流道控制微阀E；多个所述第二微阀进气口用于控制所述液体流动微阀控制结构中的各气体流道内的压力；所述第一气体流道和第三气体流道内的压力由同一个所述第二微阀进气口控制，所述第二气体流道内的压力由另一个所述第二微阀进气口控制；
所述微阀薄膜层上设有第二液体注入口、多个第二细胞悬液入口、多个第二细胞悬液出口和多个第二扩增产物收集出口；
所述细胞处理层上设有第三液体注入口，多个第三细胞悬液入口、多个第三细胞悬液出口、多个第三扩增产物收集出口和细胞处理结构；所述细胞处理结构包括多个细胞处理单元，每个细胞处理单元包括液体流道和一个基因扩增腔室；所述液体流道包括主流道、支流道和反应液流道；多个所述细胞处理单元通过主流道和反应液流道进行串联；
第一个细胞处理单元的主流道上包括一个主流道起始微阀控制区A’、一个流道狭窄区域和一个细胞处理单元间微阀控制区C’；
所述主流道和所述支流道的直径大于待捕获的单个细胞，所述流道狭窄区域的直径小于所述单个细胞；
第一个细胞处理单元的支流道包括连通流道、腔室进入流道和反应液连通流道；所述第一个细胞处理单元位于串联的多个所述细胞处理单元的起始位置；
所述连通流道将所述流道狭窄区域的两侧进行连通，并包括一个支流道微阀控制区B’；
所述腔室进入流道将所述连通流道与所述基因扩增腔室连通，并包括一个基因扩增腔室微阀控制区D’；所述支流道微阀控制区B’位于连通所述基因扩增腔室微阀控制区D’和所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向一侧的连通流道上；
所述反应液连通流道将所述主流道与所述反应液流道连通，并包括一个反应液流道微阀控制区E’；所述反应液连通流道与所述主流道连接的位置位于所述流道狭窄区域远离主流道内液体流入方向的一侧；
其余细胞处理单元的结构与第一个细胞处理单元相同，区别仅在于其余细胞处理单元的主流道上不包括所述主流道起始微阀控制区A’；
所述主流道起始控制微阀A对应控制所述主流道起始微阀控制区A’，从而控制主流道整体的连通或封闭；每个所述支流道控制微阀B对应控制一个所述支流道微阀控制区B’，从而控制连通流道的连通或封闭；每个所述细胞处理单元间控制微阀C对应控制一个所述细胞处理单元间微阀控制区C’，从而控制细胞处理单元间在主流道上的连通或封闭；每个所述基因扩增腔室控制微阀D对应控制一个所述基因扩增腔室微阀控制区D’，从而控制腔室进入流道的连通或封闭；每个所述反应液流道控制微阀E对应控制一个所述反应液流道微阀控制区E’，从而控制反应液连通流道的连通或封闭；所述扩增产物释放微阀用于控制每一个基因扩增腔室的产物释放；
所述第一液体注入口、所述第二液体注入口和所述第三液体注入口相互对应连通，用于使液体流入整个微流控芯片区域；
多个所述第一细胞悬液入口、多个所述第二细胞悬液入口和多个所述第三细胞悬液入口相互对应连通，用于使液体进入各液体流道中；
多个所述第一细胞悬液出口、多个所述第二细胞悬液出口和多个所述第三细胞悬液出口相互对应连通，用于使各液体流道的液体流出微流控芯片；
多个所述第一扩增产物收集出口、多个所述第二扩增产物收集出口和多个所述第三扩增产物收集出口相互对应连通，用于使各基因扩增腔室的扩增产物流出微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，串联的多个细胞处理单元包括两个一级连续单元，每个所述一级连续单元为从一细胞处理单元串联端点开始，连续的一半细胞处理单元；每个所述一级连续单元包括两个二级连续单元，每个所述二级连续单元为从各自所处的所述一级连续单元的串联端点开始，连续的一半细胞处理单元；依此类推，将所有串联的多个细胞处理单元以二分法进行分级，直至最后一级连续单元中的细胞处理单元的数目为4；
串联的每个细胞处理单元中的基因扩增腔室的产物释放，通过与多个第一微阀进气口对应连通的多条气体流道内的压力变化而被控制；所述压力变化控制扩增产物释放微阀的启闭；具体控制方式为：
多个第一微阀进气口中的第一个所对应的气体流道控制所述一级连续单元中的一个，多个第一微阀进气口中的第二个所对应的气体流道控制所述一级连续单元中的另一个；多个第一微阀进气口中的第三个所对应的气体流道控制所述二级连续单元中间隔分布的两个，多个第一微阀进气口中的第四个所对应的气体流道控制所述二级连续单元中间隔分布的另外两个；依此类推，直至最后一级连续单元；多个第一微阀进气口中的倒数第四个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+1个，多个第一微阀进气口中的倒数第三个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+2个，多个第一微阀进气口中的倒数第二个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+3个，多个第一微阀进气口中的最后一个所对应的气体流道控制串联的多个细胞处理单元中的第4n+4个，其中，n为0和1至m之间的整数，m为(x-4)/4，x为串联的多个细胞处理单元的总数。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，包括多行串联的细胞处理单元，所述扩增产物释放微阀控制结构呈弓形迂回排布于微阀控制层，所述液体流动微阀控制结构分为多组，各组设置在弓形同向开口的结构内，每组液体流动微阀控制结构中的各气体流道为对折结构，使得各组液体流动微阀控制结构可控制多行串联的细胞处理单元中的两行。
4.根据权利要求1-2任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀控制层和所述微阀薄膜层为透明材质的结构。
5.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀控制层和所述微阀薄膜层为透明材质的结构。
6.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞处理层和所述基底层为透明材质的结构。
7.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞处理层和所述基底层为透明材质的结构。
8.根据权利要求6或7所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀控制层的材质为玻璃或PDMS；所述微阀薄膜层的材质为PDMS；所述基底层的材质为玻璃；所述细胞处理层的材质具有蛋白吸附功能。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞处理层的材质为硅或PDMS。
10.根据权利要求1-2任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为10-30微米。
11.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为10-30微米。
12.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为10-30微米。
13.根据权利要求5-7、9任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为10-30微米。
14.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为10-30微米。
15.根据权利要求10所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为25微米。
16.根据权利要求11、12或14所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为25微米。
17.根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为25微米。
18.根据权利要求1-2任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
19.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
20.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
21.根据权利要求5-7任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
22.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
23.根据权利要求10所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
24.根据权利要求9、11、12、14、15或17所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
25.根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
26.根据权利要求16所述的微流控芯片，其特征在于，所述连通流道的形状为拱形。
27.根据权利要求1-2任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
28.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
29.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
30.根据权利要求5-7任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
31.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
32.根据权利要求10所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
33.根据权利要求9、11、12、14、15、17、19、20、22、23、25或26所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
34.根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
35.根据权利要求16所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
36.根据权利要求18所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
37.根据权利要求21所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
38.根据权利要求24所述的微流控芯片，其特征在于，所述基因扩增腔室的形状为矩形、圆形或多边形。
39.权利要求1-38任一项所述的微流控芯片在同时进行单细胞捕获、鉴定、基因扩增中的应用。
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