CN115369038A - 一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片及其应用，该用于类器官培养以及检测的微流控芯片包括微阀控制层、微阀薄膜层和处理层，所述微阀薄膜层设置于所述微阀控制层与所述处理层之间，且相邻的两层之间密封配合；所述微阀控制结构包括相互独立的气体通道；所述气体通道与所述微阀薄膜层相配合；所述处理层朝向所述微阀薄膜层的一侧设置有类器官培养结构、单细胞捕获和扩增结构以及微阀控制区，所述类器官培养结构以及所述单细胞捕获和扩增结构分别设置有多个微阀控制区；所述类器官培养结构与所述单细胞捕获和扩增结构连通。本发明的一个技术效果在于，设计合理，能够对类器官进行培养和检测，有利于对单细胞进行准确的分析检测。

Description

一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片及其应用
技术领域
本发明属于微通道流体控制技术领域，具体涉及一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片及其应用。
背景技术
类器官是在体外培养人体器官干细胞，生成与体内器官特征相似的细胞团。类器官作为一种体外3D细胞培养技术能稳定传递肿瘤的基因组和特征，保留了样本个体的异质性。研究证明类器官可囊括肿瘤中97%的基因突变。类器官技术首次提供了体外验证癌症药物实际疗效的可能性，因此成为癌症精准医疗领域最受关注的前沿技术之一。然而，在类器官培养过程中，特别在类器官的转移过程中，类器官细胞团容易受到机械性损伤，而且在培养过程中，类器官团之间容易发生融合，很难实现定位观察，而且样本量的不足也导致我们不能在孔板上对类器官进行高通量药敏试验。
另外，目前对类器官的分析大部分还是简单得观察类器官团的大小、判别细胞团的死活或者对类器官种群的研究。由于细胞是构成生命体的基本单位，而基于细胞种群的研究会在一定程度上掩盖单个细胞或少数细胞的一些重要信息。
因此，目前的类器官培养和分析过程中，由于类器官团之间容易发生融合，很难实现定位观察，同时也不利于对单个细胞进行准确的分析和研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片及其应用的新技术方案。
根据本申请的第一方面，提供一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片，包括微阀控制层、微阀薄膜层和处理层，所述微阀薄膜层设置于所述微阀控制层与所述处理层之间，且相邻的两层之间密封配合；
所述微阀控制层上设置有第一液体入口、第一液体出口、消化液入口、第二液体入口、细胞悬凝液出口、扩增产物出口、微阀进气口以及微阀控制结构；其中，所述第一液体入口、所述第一液体出口、所述消化液入口、所述第二液体入口、所述细胞悬凝液出口、所述扩增产物出口均贯穿至所述处理层；所述微阀控制结构包括相互独立的气体通道，每个所述气体通道连接有一个用于控制气体通道内气体压力的所述微阀进气口；所述气体通道与所述微阀薄膜层相配合以控制各个微阀控制区的打开或者关闭；
所述处理层朝向所述微阀薄膜层的一侧设置有类器官培养结构、单细胞捕获和扩增结构以及微阀控制区，所述类器官培养结构以及所述单细胞捕获和扩增结构分别设置有多个微阀控制区；所述类器官培养结构与所述单细胞捕获和扩增结构连通；所述类器官培养结构分别与所述第一液体入口、第一液体出口、消化液入口连通；所述单细胞捕获和扩增结构分别与所述第二液体入口、细胞悬凝液出口、扩增产物出口连通；
通过控制相应的微阀控制区打开或关闭，肿瘤细胞与凝胶混合形成的凝胶混合液能够由第一液体入口进入类器官培养结构中，以对肿瘤细胞进行培养，并能够由第一液体出口排出；类器官消化酶能够由消化液入口进入类器官培养结构中并将类器官团消化成单细胞，以形成单细胞悬凝液；单细胞悬凝液从类器官培养结构进入单细胞捕获和扩增结构中，以捕获单细胞；由第二液体入口进入的细胞裂解液对单细胞进行裂解并形成细胞裂解液体，再由第二液体入口进入反应液流道的扩增酶溶液对细胞裂解液体进行扩增以形成扩增产物，并能够由扩增产物出口排出扩增产物。
可选地，所述气体通道包括第一气体通道、第二气体通道、第三气体通道、第四气体通道、第五气体通道、第六气体通道和第七气体通道；
所述第一气体通道上设置有A控制微阀；第二气体通道设置有B控制微阀，所述第三气体通道设置有C控制微阀、D控制微阀、E控制微阀；所述第四气体通道设置有F控制微阀和G控制微阀；所述第五气体通道设置有H控制微阀；所述第六气体通道设置有I控制微阀；所述第七气体通道设置有J控制微阀；各个控制微阀与处理层上的各个微阀控制区相对应，且各个控制微阀与所述微阀薄膜层相配合以控制各个所述微阀控制区的打开或者关闭；
所述类器官培养结构包括第一液体流道、类器官培养单元和消化液流道，其中，所述第一液体流道的一端与第一液体入口连通，另一端与第一液体出口连通；所述消化液流道与所述消化液入口连通；
所述类器官培养单元包括类器官培养腔室、消化混合区、类器官裂解腔室，其中，类器官培养腔室分别与第一液体流道以及消化液流道连通；所述第一液体流道上设置有A微阀控制区，用于控制所述第一液体流道的打开或者关闭；消化液流道上设置有B微阀控制区，用于控制所述消化液流道的打开或者关闭；
打开A微阀控制区，肿瘤细胞与凝胶混合形成的凝胶混合液由第一液体入口进入第一液体流道并进入类器官培养腔室，再由第一液体入口向第一液体流道注入培养基，以对肿瘤细胞进行培养；
关闭A微阀控制区，打开B微阀控制区，由消化液入口进入消化液流道的类器官消化酶依次经过类器官培养腔室、消化混合区进入类器官裂解腔室，凝胶混合液与类器官消化酶在所述消化混合区混合并在类器官裂解腔室将类器官团消化成单细胞，以在类器官裂解腔室中形成单细胞悬凝液；
所述单细胞捕获和扩增结构包括主流道、反应液流道以及细胞处理单元，每个细胞处理单元包括细胞裂解腔室、终止裂解腔室以及扩增腔室；
所述主流道的一端与类器官裂解腔室连通，另一端与细胞悬凝液出口连通，所述主流道包括捕获区域和旁路区域，所述捕获区域与所述旁路区域并联，所述捕获区域包括入口端、捕获段和连通段和出口端，所述捕获区域的入口端、捕获段、连通段、出口端依次连通；所述旁路区域、所述细胞裂解腔室、所述终止裂解腔室、所述扩增腔室、所述扩增产物出口依次连通，且所述旁路区域与所述细胞裂解腔室之间设置有F微阀控制区；所述细胞裂解腔室与所述终止裂解腔室之间设置有H微阀控制区；所述终止裂解腔室与所述扩增腔室之间设置I微阀控制区；所述扩增腔室与所述扩增产物出口之间设置G微阀控制区；
所述主流道上设置有C微阀控制区、D微阀控制区和E微阀控制区，所述C微阀控制区位于所述主流道的靠近所述旁路区域以及所述捕获区域的入口端，用于控制所述主流道的打开或者关闭；D微阀控制区设置于所述旁路区域，且所述D微阀控制区位于所述旁路区域的出口端与所述旁路区域和所述细胞裂解腔室的连接点之间，用于控制所述旁路区域的打开或者关闭；所述E微阀控制区位于所述主流道的靠近所述旁路区域以及所述捕获区域的出口端，用于控制所述主流道的打开或者关闭；
反应液流道一端连接第二液体入口，另一端连接捕获区域，所述反应液流道与所述捕获区域的连接点位于所述连通段；所述反应液流道上设置有第六控制阀区，用于控制所述反应液流道的打开或者关闭；打开所述第六控制阀区，关闭所述C微阀控制区、D微阀控制区和E微阀控制区；
关闭所述F微阀控制区和G微阀控制区，单细胞悬凝液由消化液流道进入主流道，在流经捕获区域时，单细胞被捕获并封堵捕获区域，则单细胞悬凝液由旁路区域向细胞悬凝液出口流动；
关闭所述C微阀控制区和D微阀控制区，打开所述F微阀控制区和G微阀控制区，由第二液体入口进入的细胞裂解液经过反应液流道、捕获区域并携带被捕获的单细胞一同穿过所述旁路区域进入所述细胞裂解腔室；
关闭所述F微阀控制区和H微阀控制区，单细胞在所述细胞裂解腔室进行裂解；打开所述F微阀控制区和H微阀控制区，由第二液体入口进入反应液流道的终止裂解液带动细胞裂解腔室内的液体一起流入终止裂解腔室，关闭F微阀控制区和I微阀控制区，终止裂解液与细胞裂解液体充分混合，终止裂解；打开F微阀控制区和I微阀控制区，由第二液体入口进入反应液流道的扩增酶溶液带动终止裂解腔室内的终止裂解液一起流入扩增腔室，关闭F微阀控制区和J微阀控制区，进行扩增，预设时间后终止扩增，以形成扩增产物；打开F微阀控制区和J微阀控制区，由第二液体入口进入反应液流道的纯净水从所述扩增产物出口排出扩增产物。
可选地，多个细胞处理单元并联设置，每个所述细胞处理单元对应一个所述捕获区域和所述旁路区域，相邻的捕获区域之间设置有所述E微阀控制区。
可选地，所述类器官培养单元和所述消化液流道的数量分别为多个，多个所述类器官培养单元通过所述第一液体流道依次串联，相邻的所述类器官培养单元之间设置所述A微阀控制区；每个所述类器官培养单元对应一个所述消化液流道。
可选地，所述微阀控制层、微阀薄膜层和处理层分别采用PDMS材料，且所述微阀控制层与所述微阀薄膜层之间采用氧等离子体辅助键合，所述微阀薄膜层与所述处理层之间采用氧等离子体辅助键合。
可选地，所述微阀薄膜层由PDMS材料旋涂而成，厚度为15微米。
可选地，所述主流道通过多次弯折形成多个相互串联的连接子流道，每个子流道分别连接多个细胞处理单元。
可选地，所述反应液流道包括多个子反应液流道，每个子反应液流道的一端均连接所述第二液体入口，另一端分别连接有一个所述捕获区域。
根据本申请的第二方面，提供一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的应用，应用于如第一方面所述的微流控芯片，包括：
从患者体内取得病灶样本，利用消化液处理获得肿瘤细胞，肿瘤细胞与凝胶混合获得凝胶混合液；
向类器官培养腔室内注入凝胶混合液，放入培养箱中对凝胶进行固定；然后，向类器官培养腔室内通入培养基以进行培养；
向类器官培养腔室通入类器官消化酶，以将类器官团消化成单细胞并形成单细胞悬凝液；然后，向单细胞悬凝液通入终止消化液，以终止消化；
对单细胞悬凝液中的单细胞进行捕获；
通过细胞裂解液对单细胞进行裂解并形成细胞裂解液体；再由扩增酶溶液对细胞裂解液体进行扩增以形成扩增产物。
可选地，所述肿瘤细胞与凝胶的比例为1：2；
所用类器官消化酶为胰蛋白酶，终止消化液为PBS缓冲液。
本发明的一个技术效果在于：
在本申请实施例中，通过将类器官的培养、单细胞捕获、裂解及扩增在一个微流控芯片上实现，不仅能有效地避免类器官的转移过程中对类器官细胞团的机械性损伤，能够较好地保护类器官细胞团，而且能够对单细胞进行准确的分析检测，以获取肿瘤类器官细胞之间的异质性。
另外，该微流控芯片是基于微流控技术和微纳加工技术，其能够实现结构微型化、样本微量化以及流体精准化，能够在微米级别的通道内对液体进行精准控制，不仅可以实现对类器官的高通量培养和精准控制，而且可以准确地实现对类器官细胞的单细胞捕获、裂解以及基因扩增。
附图说明
图1为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的分解结构示意图；
图2为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的微阀控制层的结构示意图；
图3为图2中M处细节放大图；
图4为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的处理层的结构示意图；
图5为图4中N处细节放大图；
图6为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的单细胞捕获处的连接关系示意图；
图7为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的单细胞捕获处的放大结构示意图；
图8为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的类器官培养过程的结构示意图；
图9为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的类器官消化过程的结构示意图；
图10为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的单细胞注入捕获区域的结构示意图；
图11为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的单细胞从捕获区域流入细胞裂解腔室的结构示意图；
图12为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的单细胞的裂解过程示意图；
图13为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的单细胞进入终止裂解腔室的结构示意图；
图14为本发明一实施例的一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的单细胞进入扩增腔室的结构示意图。
图中：1、微阀控制层；101、第一液体入口；102、第一液体出口；103、消化液入口；104、第二液体入口；105、细胞悬凝液出口；106、扩增产物出口；107、第一气体通道；1071、第一微阀进气口；108、第二气体通道；1081、第二微阀进气口；109、第三气体通道；1091、第三微阀进气口；110、第四气体通道；1101、第四微阀进气口；111、第五气体通道；1111、第五微阀进气口；112、第六气体通道；1121、第六微阀进气口；113、第七气体通道；1131、第七微阀进气口；
2、微阀薄膜层；
3、处理层；301、第一液体流道；302、消化液流道；303、类器官培养腔室；304、消化混合区；305、类器官裂解腔室；306、主流道；3061、捕获区域；30611、捕获段；30612、连通段；3062、旁路区域；307、反应液流道；308、细胞裂解腔室；309、终止裂解腔室；310、扩增腔室。
具体实施方式
现在将参照附图来详细描述本申请的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本申请的范围。
下面将详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
参见图1至图14所示，根据本申请的第一方面，提供一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片。
参加图1，该微流控芯片包括微阀控制层1、微阀薄膜层2和处理层3，所述微阀薄膜层2设置于所述微阀控制层1与所述处理层3之间，且相邻的两层之间密封配合。其中，为了便于观察，微阀控制层1、微阀薄膜层2、处理层3均为透明材质。
在一个具体的实施方式中，微阀薄膜层2的厚度为12微米-30微米，优选为20微米，不仅有助于实现微阀控制层1与处理层3之间的密封，也便于减轻微流控芯片的质量。
具体地，参见图2和图3，所述微阀控制层1上设置有第一液体入口101、第一液体出口102、消化液入口103、第二液体入口104、细胞悬凝液出口105、扩增产物出口106、微阀进气口以及微阀控制结构；其中，所述第一液体入口101、所述第一液体出口102、所述消化液入口103、所述第二液体入口104、所述细胞悬凝液出口105、所述扩增产物出口106均贯穿至所述处理层3；所述微阀控制结构包括相互独立的气体通道，每个所述气体通道连接有一个用于控制气体通道内气体压力的所述微阀进气口；所述气体通道与所述微阀薄膜层2相配合以控制各个微阀控制区的打开或者关闭。
需要说明的是，微阀控制层1的各个微阀进气口均通过连接气泵，实现数字化控制，从而能够实现对微流控芯片的微阀控制结构的开关状态切换，以达到对微流控芯片反应的控制。
进一步具体地，参见图4和图5，所述处理层3朝向所述微阀薄膜层2的一侧设置有类器官培养结构、单细胞捕获和扩增结构以及微阀控制区，所述类器官培养结构以及所述单细胞捕获和扩增结构分别设置有多个微阀控制区；所述类器官培养结构与所述单细胞捕获和扩增结构连通；所述类器官培养结构分别与所述第一液体入口101、第一液体出口102、消化液入口103连通；所述单细胞捕获和扩增结构分别与所述第二液体入口104、细胞悬凝液出口105、扩增产物出口106连通。
在本申请中，通过控制相应的微阀控制区打开或关闭，肿瘤细胞与凝胶混合形成的凝胶混合液能够由第一液体入口101进入类器官培养结构中，以对肿瘤细胞进行培养，并能够由第一液体出口102排出；类器官消化酶能够由消化液入口103进入类器官培养结构中并将类器官团消化成单细胞，以形成单细胞悬凝液；单细胞悬凝液从类器官培养结构进入单细胞捕获和扩增结构中，以捕获单细胞；由第二液体入口104进入的细胞裂解液对单细胞进行裂解并形成细胞裂解液体，再由第二液体入口104进入反应液流道307的扩增酶溶液对细胞裂解液体进行扩增以形成扩增产物，并能够由扩增产物出口106排出扩增产物。
需要说明的是，为了便于理解，图2中的A指A控制微阀，B指B控制微阀；图3中的C指C控制微阀，D指D控制微阀，E指E控制微阀，F指F控制微阀，G指G控制微阀，H指H控制微阀，I指I控制微阀，J指J控制微阀。
图4中的A’指A微阀控制区，B’指B微阀控制区；图5中的C’指C微阀控制区，D’指D微阀控制区，E’指E微阀控制区，F’指F微阀控制区，G’指G微阀控制区，H’指H微阀控制区，I’指I微阀控制区，J’指J微阀控制区。
进一步地，在图8至图14中，为了便于理解微阀控制层1与处理层3之间的配合关系，通过控制微阀直接覆盖微阀控制层1的方式对单细胞的各个过程进行示意。图中，控制微阀为黑色代表控制微阀所覆盖的微阀控制区为关闭状态。其余则代表控制微阀所覆盖的微阀控制区为打开状态。
可选地，如图2所示，所述气体通道包括第一气体通道107、第二气体通道108、第三气体通道109、第四气体通道110、第五气体通道111、第六气体通道112和第七气体通道113；微阀进气口包括第一微阀进气口1071、第二微阀进气口1081、第三微阀进气口1091、第四微阀进气口1101、第五微阀进气口1111、第六微阀进气口1121、第七微阀进气口1131。其中，第一微阀进气口1071与第一气体通道107连通；第二微阀进气口1081与第二气体通道108连通；第三微阀进气口1091与第三气体通道109连通；第四微阀进气口1101与第四气体通道110连通；第五微阀进气口1111与第五气体通道111连通；第六微阀进气口1121与第六气体通道112连通；第七微阀进气口1131与第七气体通道113连通。
如图3所示，所述第一气体通道107上设置有A控制微阀；第二气体通道108设置有B控制微阀，所述第三气体通道109设置有C控制微阀、D控制微阀、E控制微阀；所述第四气体通道110设置有F控制微阀和G控制微阀；所述第五气体通道111设置有H控制微阀；所述第六气体通道112设置有I控制微阀；所述第七气体通道113设置有J控制微阀；各个控制微阀与处理层3上的各个微阀控制区相对应，且各个控制微阀与所述微阀薄膜层2相配合以控制各个所述微阀控制区的打开或者关闭；
如图4所示，同时参见图8和图9，所述类器官培养结构包括第一液体流道301、类器官培养单元和消化液流道302，其中，所述第一液体流道301的一端与第一液体入口101连通，另一端与第一液体出口102连通；所述消化液流道302与所述消化液入口103连通；
参见图4、图5、图10至图14，所述类器官培养单元包括类器官培养腔室303、消化混合区304、类器官裂解腔室305，其中，类器官培养腔室303分别与第一液体流道301以及消化液流道302连通；所述第一液体流道301上设置有A微阀控制区，用于控制所述第一液体流道301的打开或者关闭，避免培养基的流入对消化过程产生影响；消化液流道302上设置有B微阀控制区，用于控制所述消化液流道302的打开或者关闭，以在消化过程中选择流通的消化液流道302；
如图1所示，打开A微阀控制区，肿瘤细胞与凝胶混合形成的凝胶混合液由第一液体入口101进入第一液体流道301并进入类器官培养腔室303，再由第一液体入口101向第一液体流道301注入培养基，以对肿瘤细胞进行培养；
如图2所示，关闭A微阀控制区，打开B微阀控制区，由消化液入口103进入消化液流道302的类器官消化酶依次经过类器官培养腔室303、消化混合区304进入类器官裂解腔室305，凝胶混合液与类器官消化酶在所述消化混合区304混合并在类器官裂解腔室305将类器官团消化成单细胞，以在类器官裂解腔室305中形成单细胞悬凝液；
参见图4以及图10至图14，所述单细胞捕获和扩增结构包括主流道306、反应液流道307以及细胞处理单元，每个细胞处理单元包括细胞裂解腔室308、终止裂解腔室309以及扩增腔室310；
所述主流道306的一端与类器官裂解腔室305连通，另一端与细胞悬凝液出口105连通。如图6所示，所述主流道306包括捕获区域3061和旁路区域3062，所述捕获区域3061与所述旁路区域3062并联，所述捕获区域3061包括入口端、捕获段30611和连通段30612和出口端，所述捕获区域3061的入口端、捕获段30611、连通段30612、出口端依次连通，其中，捕获段30611的直径小于单个细胞的直径，从而实现对单细胞的捕获；所述旁路区域3062、所述细胞裂解腔室308、所述终止裂解腔室309、所述扩增腔室310、所述扩增产物出口106依次连通，且所述旁路区域3062与所述细胞裂解腔室308之间设置有F微阀控制区；所述细胞裂解腔室308与所述终止裂解腔室309之间设置有H微阀控制区；所述终止裂解腔室309与所述扩增腔室310之间设置I微阀控制区；所述扩增腔室310与所述扩增产物出口106之间设置G微阀控制区；
所述主流道306上设置有C微阀控制区、D微阀控制区和E微阀控制区，所述C微阀控制区位于所述主流道306的靠近所述旁路区域3062以及所述捕获区域3061的入口端，用于控制所述主流道306的打开或者关闭；D微阀控制区设置于所述旁路区域3062，且所述D微阀控制区位于所述旁路区域3062的出口端与所述旁路区域3062和所述细胞裂解腔室308的连接点之间，用于控制所述旁路区域3062的打开或者关闭；所述E微阀控制区位于所述主流道306的靠近所述旁路区域3062以及所述捕获区域3061的出口端，用于控制所述主流道306的打开或者关闭；
反应液流道307一端连接第二液体入口104，另一端连接捕获区域3061，所述反应液流道307与所述捕获区域3061的连接点位于所述连通段30612；所述反应液流道307上设置有第六控制阀区，用于控制所述反应液流道307的打开或者关闭；打开所述第六控制阀区，关闭所述C微阀控制区、D微阀控制区和E微阀控制区；
参见图6、图7、图10，关闭所述F微阀控制区和G微阀控制区，单细胞悬凝液由消化液流道302进入主流道306，在流经捕获区域3061时，单细胞被捕获并封堵捕获区域3061，则单细胞悬凝液由旁路区域3062向细胞悬凝液出口105流动；
参见图11，关闭所述C微阀控制区和D微阀控制区，打开所述F微阀控制区和G微阀控制区，由第二液体入口104进入的细胞裂解液经过反应液流道307、捕获区域3061并携带被捕获的单细胞一同穿过所述旁路区域3062进入所述细胞裂解腔室308；
参见图12，关闭所述F微阀控制区和H微阀控制区，单细胞在所述细胞裂解腔室308进行裂解；参加图13，打开所述F微阀控制区和H微阀控制区，由第二液体入口104进入反应液流道307的终止裂解液带动细胞裂解腔室308内的液体一起流入终止裂解腔室309，关闭F微阀控制区和I微阀控制区，终止裂解液与细胞裂解液体充分混合，终止裂解；参见图14，打开F微阀控制区和I微阀控制区，由第二液体入口104进入反应液流道307的扩增酶溶液带动终止裂解腔室309内的终止裂解液一起流入扩增腔室310，待扩增腔室310充满，关闭F微阀控制区和J微阀控制区，进行扩增，预设时间后终止扩增，以形成扩增产物，例如，将芯片置于30℃内2h，随后置于65℃内5分钟终止扩增；打开F微阀控制区和J微阀控制区，由第二液体入口104进入反应液流道307的纯净水从所述扩增产物出口106排出扩增产物。
在上述实施方式中，微流控芯片的结构设计合理，能够同时实现类器官的培养、类器官裂解、单细胞捕获、单细胞裂解、单细胞扩增等各个过程，从而能够对单细胞进行准确的分析检测，以获取肿瘤类器官细胞之间的异质性。
在一个具体的实施方式中，具体尺寸可根据所需细胞尺寸而设计，优选地，主流道306和能通过单细胞的流道的直径为30微米-40微米，捕获段30611的直径为4微米-8微米，更优选地，主流道306和能通过单细胞的流道的直径为30微米，捕获段30611的直径为5微米。
示例性的，通过在微阀控制层1的靠近微阀薄膜层2的一侧设置凹槽结构，通过凹槽结构与微阀薄膜层2的配合以形成各个气体通道，从而实现对处理层3上各个微阀控制区进行打开或者关闭。凹槽结构的宽度为20微米～100微米，高度为10微米～100微米；微阀薄膜层2的厚度为10微米～50微米。
同理，处理层3的靠近微阀薄膜层2的一侧也设置凹槽结构，凹槽结构与微阀薄膜层2以形成各个腔室以及流道。所述处理层3第一液体流道301的高度为10微米～200微米，宽度为50微米～2000微米；消化液流道302的高度为15微米～100微米，宽度为50微米～2000微米；反应液流道307的宽度与能够通过单细胞的流道一致。细胞裂解腔室308是高度为15微米～100微米、长为200微米～2000微米，宽为100微米～1000微米的长方体结构；终止裂解腔室309是高度为15微米～100微米、长为200微米～2000微米，宽为100微米～1000微米的长方体结构；扩增腔室310是高度为15微米～100微米、长为400微米～4000微米，宽为200微米～2000微米的长方体结构。
可选地，多个细胞处理单元并联设置，每个所述细胞处理单元对应一个所述捕获区域3061和所述旁路区域3062，相邻的捕获区域3061之间设置有所述E微阀控制区。
在上述实施方式中，可以同时捕获多个单细胞，有利于提高单细胞的捕获效率，从而较好地实现单细胞裂解以及单细胞扩增过程，能够准确地实现对单细胞的分析检测，有助于准确地获取肿瘤类器官细胞之间的异质性。
可选地，所述类器官培养单元和所述消化液流道302的数量分别为多个，多个所述类器官培养单元通过所述第一液体流道301依次串联，相邻的所述类器官培养单元之间设置所述A微阀控制区；每个所述类器官培养单元对应一个所述消化液流道302。
在上述实施方式中，多个类器官培养单元能够分别对类器官进行培养，较好地提高了类器官的培养效率。同时，通过消化液流道302，能够对各个类器官培养单元的类器官进行消化裂解，以较好地将类器官裂解为单细胞，有助于后续的单细胞捕获过程，结构简单，操作也非常方便。
可选地，所述微阀控制层1、微阀薄膜层2和处理层3分别采用PDMS（聚二甲基硅氧烷）材料，且所述微阀控制层1与所述微阀薄膜层2之间采用氧等离子体辅助键合，所述微阀薄膜层2与所述处理层3之间采用氧等离子体辅助键合。
在上述实施方式中，微阀控制层1、微阀薄膜层2和处理层3的材质有助于实现微流控芯片的功能，而且采用氧等离子体辅助键合的方式实现微阀控制层1与微阀薄膜层2之间以及微阀薄膜层2与处理层3之间的密封，密封效果较好，加工工业简单。
可选地，所述微阀薄膜层2由PDMS材料旋涂而成，厚度为15微米。这有助于快速地对微阀薄膜层2进行加工，也有助于微阀薄膜层2与微阀控制层1配合，以构成各个气体流道，从而实现对处理层3的各个微阀控制区的打开或者关闭，有利于处理层3的各个功能的实现。
可选地，所述主流道306通过多次弯折形成多个相互串联的连接子流道，每个子流道分别连接多个细胞处理单元。
在上述实施方式中，主流道306的结构设计合理，有利于同时连接多个细胞处理单元，从而提高单细胞捕获以及处理效率。
可选地，所述反应液流道307包括多个子反应液流道307，每个子反应液流道307的一端均连接所述第二液体入口104，另一端分别连接有一个所述捕获区域3061。
在上述实施方式中，反应液流道307设计合理，能够同时向多个细胞裂解腔室308内通入细胞裂解液，从而实现多个单细胞的裂解过程，也能够同时向多个终止裂解腔室309内通入终止裂解液，从而实现多个单细胞的终止裂解过程，还能够向多个扩增腔室310内通入扩增酶溶液，从而实现多个单细胞的扩增过程。
根据本申请的第二方面，提供一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的应用，应用于如第一方面所述的微流控芯片，包括：
从患者体内取得病灶样本，利用消化液处理获得肿瘤细胞，肿瘤细胞与凝胶混合获得凝胶混合液；例如，肿瘤细胞可以为胃癌细胞。
向类器官培养腔室303内注入凝胶混合液，放入培养箱中对凝胶进行固定，例如将芯片放入37℃培养箱半个小时以固定凝胶，随后从第一液体入口101注入无菌气体排出第一液体流道301内的残余凝胶混合液；然后，向类器官培养腔室303内通入培养基以进行培养。例如，可以经过第一液体入口101注入凝胶混合液，凝胶混合液在重力的作用下可注入至类器官培养腔室303。
向类器官培养腔室303通入类器官消化酶，以将类器官团消化成单细胞并形成单细胞悬凝液；然后，向单细胞悬凝液通入终止消化液，以终止消化。
对单细胞悬凝液中的单细胞进行捕获。
通过细胞裂解液对单细胞进行裂解并形成细胞裂解液体，持续注入细胞裂解液至充满细胞裂解腔室308，例如，将芯片置于65摄氏度的环境并持续10分钟以裂解细胞；再由扩增酶溶液对细胞裂解液体进行扩增以形成扩增产物。
可选地，所述肿瘤细胞与凝胶的比例为1：2；
所用类器官消化酶为胰蛋白酶，终止消化液为PBS缓冲液主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）。例如，胰蛋白酶为TrypLE Express。
在上述实施方式中，肿瘤细胞与凝胶的比例比较恰当，有助于对类器官进行培养；同时，胰蛋白酶能够较好地对类器官进行消化裂解过程，而PBS缓冲液能够快速终止类器官的消化裂解过程，控制方式比较简单。
在一个具体的实施方式中，微流控芯片的制作方法如下：
微阀控制层1：首先，采用N型4英寸硅片，利用SU-8胶光刻出微阀控制层1的平面结构，使用ICP干法刻蚀出对应深度的凹槽，以形成制作微阀控制层1的模具。然后，将液态PDMS倒入微阀控制层1的模具中，凝固后脱模取出，切割形成微阀控制层1。
处理层3：采用N型4英寸硅片，利用SU-8胶光刻出处理层3的平面结构，使用ICP干法刻蚀出对应深度的凹槽，并对处理层3不同区域凹槽的高度不同，再使用二次光刻，以形成制作处理层3的模具。将液态PDMS倒入槽中，凝固后脱模取出，切割形成处理层3。
微阀薄膜层2：将PDMS胶状物涂抹在匀胶机上的4英寸N型硅片上，通过控制转速来得到15微米厚度的PDMS薄膜。然后将其放入烘箱经过加热凝固，从硅片上脱模后，得到具有弹性的微阀薄膜层2。
芯片组装与键合：将微阀控制层1、微阀薄膜层2、处理层3经过超声清洗处理后，使用Plasma等离子机器处理表面，依次将三者键合在一起，经过高温烘烤后形成完整的微流控芯片。
需要说明的是，芯片使用前对芯片进行灭菌操作，即将芯片浸泡于75％的酒精中，使用注射器将酒精通过流道注满到芯片内部。静置6小时后，用PBS清洗，除去残留的酒精.在使用紫外光照过夜，后用于后续实验。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，包括微阀控制层、微阀薄膜层和处理层，所述微阀薄膜层设置于所述微阀控制层与所述处理层之间，且相邻的两层之间密封配合；
所述微阀控制层上设置有第一液体入口、第一液体出口、消化液入口、第二液体入口、细胞悬凝液出口、扩增产物出口、微阀进气口以及微阀控制结构；其中，所述第一液体入口、所述第一液体出口、所述消化液入口、所述第二液体入口、所述细胞悬凝液出口、所述扩增产物出口均贯穿至所述处理层；所述微阀控制结构包括相互独立的气体通道，每个所述气体通道连接有一个用于控制气体通道内气体压力的所述微阀进气口；所述气体通道与所述微阀薄膜层相配合以控制各个微阀控制区的打开或者关闭；
所述处理层朝向所述微阀薄膜层的一侧设置有类器官培养结构、单细胞捕获和扩增结构以及微阀控制区，所述类器官培养结构以及所述单细胞捕获和扩增结构分别设置有多个微阀控制区；所述类器官培养结构与所述单细胞捕获和扩增结构连通；所述类器官培养结构分别与所述第一液体入口、第一液体出口、消化液入口连通；所述单细胞捕获和扩增结构分别与所述第二液体入口、细胞悬凝液出口、扩增产物出口连通；
通过控制相应的微阀控制区打开或关闭，肿瘤细胞与凝胶混合形成的凝胶混合液能够由第一液体入口进入类器官培养结构中，以对肿瘤细胞进行培养，并能够由第一液体出口排出；类器官消化酶能够由消化液入口进入类器官培养结构中并将类器官团消化成单细胞，以形成单细胞悬凝液；单细胞悬凝液从类器官培养结构进入单细胞捕获和扩增结构中，以捕获单细胞；由第二液体入口进入的细胞裂解液对单细胞进行裂解并形成细胞裂解液体，再由第二液体入口进入反应液流道的扩增酶溶液对细胞裂解液体进行扩增以形成扩增产物，并能够由扩增产物出口排出扩增产物。
2.根据权利要求1所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，所述气体通道包括第一气体通道、第二气体通道、第三气体通道、第四气体通道、第五气体通道、第六气体通道和第七气体通道；
所述第一气体通道上设置有A控制微阀；第二气体通道设置有B控制微阀，所述第三气体通道设置有C控制微阀、D控制微阀、E控制微阀；所述第四气体通道设置有F控制微阀和G控制微阀；所述第五气体通道设置有H控制微阀；所述第六气体通道设置有I控制微阀；所述第七气体通道设置有J控制微阀；各个控制微阀与处理层上的各个微阀控制区相对应，且各个控制微阀与所述微阀薄膜层相配合以控制各个所述微阀控制区的打开或者关闭；
所述类器官培养结构包括第一液体流道、类器官培养单元和消化液流道，其中，所述第一液体流道的一端与第一液体入口连通，另一端与第一液体出口连通；所述消化液流道与所述消化液入口连通；
所述类器官培养单元包括类器官培养腔室、消化混合区、类器官裂解腔室，其中，类器官培养腔室分别与第一液体流道以及消化液流道连通；所述第一液体流道上设置有A微阀控制区，用于控制所述第一液体流道的打开或者关闭；消化液流道上设置有B微阀控制区，用于控制所述消化液流道的打开或者关闭；
打开A微阀控制区，肿瘤细胞与凝胶混合形成的凝胶混合液由第一液体入口进入第一液体流道并进入类器官培养腔室，再由第一液体入口向第一液体流道注入培养基，以对肿瘤细胞进行培养；
关闭A微阀控制区，打开B微阀控制区，由消化液入口进入消化液流道的类器官消化酶依次经过类器官培养腔室、消化混合区进入类器官裂解腔室，凝胶混合液与类器官消化酶在所述消化混合区混合并在类器官裂解腔室将类器官团消化成单细胞，以在类器官裂解腔室中形成单细胞悬凝液；
所述单细胞捕获和扩增结构包括主流道、反应液流道以及细胞处理单元，每个细胞处理单元包括细胞裂解腔室、终止裂解腔室以及扩增腔室；
所述主流道的一端与类器官裂解腔室连通，另一端与细胞悬凝液出口连通，所述主流道包括捕获区域和旁路区域，所述捕获区域与所述旁路区域并联，所述捕获区域包括入口端、捕获段和连通段和出口端，所述捕获区域的入口端、捕获段、连通段、出口端依次连通；所述旁路区域、所述细胞裂解腔室、所述终止裂解腔室、所述扩增腔室、所述扩增产物出口依次连通，且所述旁路区域与所述细胞裂解腔室之间设置有F微阀控制区；所述细胞裂解腔室与所述终止裂解腔室之间设置有H微阀控制区；所述终止裂解腔室与所述扩增腔室之间设置I微阀控制区；所述扩增腔室与所述扩增产物出口之间设置G微阀控制区；
所述主流道上设置有C微阀控制区、D微阀控制区和E微阀控制区，所述C微阀控制区位于所述主流道的靠近所述旁路区域以及所述捕获区域的入口端，用于控制所述主流道的打开或者关闭；D微阀控制区设置于所述旁路区域，且所述D微阀控制区位于所述旁路区域的出口端与所述旁路区域和所述细胞裂解腔室的连接点之间，用于控制所述旁路区域的打开或者关闭；所述E微阀控制区位于所述主流道的靠近所述旁路区域以及所述捕获区域的出口端，用于控制所述主流道的打开或者关闭；
反应液流道一端连接第二液体入口，另一端连接捕获区域，所述反应液流道与所述捕获区域的连接点位于所述连通段；所述反应液流道上设置有第六控制阀区，用于控制所述反应液流道的打开或者关闭；打开所述第六控制阀区，关闭所述C微阀控制区、D微阀控制区和E微阀控制区；
关闭所述F微阀控制区和G微阀控制区，单细胞悬凝液由消化液流道进入主流道，在流经捕获区域时，单细胞被捕获并封堵捕获区域，则单细胞悬凝液由旁路区域向细胞悬凝液出口流动；
关闭所述C微阀控制区和D微阀控制区，打开所述F微阀控制区和G微阀控制区，由第二液体入口进入的细胞裂解液经过反应液流道、捕获区域并携带被捕获的单细胞一同穿过所述旁路区域进入所述细胞裂解腔室；
关闭所述F微阀控制区和H微阀控制区，单细胞在所述细胞裂解腔室进行裂解；打开所述F微阀控制区和H微阀控制区，由第二液体入口进入反应液流道的终止裂解液带动细胞裂解腔室内的液体一起流入终止裂解腔室，关闭F微阀控制区和I微阀控制区，终止裂解液与细胞裂解液体充分混合，终止裂解；打开F微阀控制区和I微阀控制区，由第二液体入口进入反应液流道的扩增酶溶液带动终止裂解腔室内的终止裂解液一起流入扩增腔室，关闭F微阀控制区和J微阀控制区，进行扩增，预设时间后终止扩增，以形成扩增产物；打开F微阀控制区和J微阀控制区，由第二液体入口进入反应液流道的纯净水从所述扩增产物出口排出扩增产物。
3.根据权利要求2所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，多个细胞处理单元并联设置，每个所述细胞处理单元对应一个所述捕获区域和所述旁路区域，相邻的捕获区域之间设置有所述E微阀控制区。
4.根据权利要求2所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，所述类器官培养单元和所述消化液流道的数量分别为多个，多个所述类器官培养单元通过所述第一液体流道依次串联，相邻的所述类器官培养单元之间设置所述A微阀控制区；每个所述类器官培养单元对应一个所述消化液流道。
5.根据权利要求2所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，所述微阀控制层、微阀薄膜层和处理层分别采用PDMS材料，且所述微阀控制层与所述微阀薄膜层之间采用氧等离子体辅助键合，所述微阀薄膜层与所述处理层之间采用氧等离子体辅助键合。
6.根据权利要求5所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层由PDMS材料旋涂而成，厚度为15微米。
7.根据权利要求3所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，所述主流道通过多次弯折形成多个相互串联的连接子流道，每个子流道分别连接多个细胞处理单元。
8.根据权利要求7所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片，其特征在于，所述反应液流道包括多个子反应液流道，每个子反应液流道的一端均连接所述第二液体入口，另一端分别连接有一个所述捕获区域。
9.一种用于类器官培养以及检测的微流控芯片的应用，其特征在于，应用于如权利要求1至8任意一项所述的微流控芯片，包括：
从患者体内取得病灶样本，利用消化液处理获得肿瘤细胞，肿瘤细胞与凝胶混合获得凝胶混合液；
向类器官培养腔室内注入凝胶混合液，放入培养箱中对凝胶进行固定；然后，向类器官培养腔室内通入培养基以进行培养；
向类器官培养腔室通入类器官消化酶，以将类器官团消化成单细胞并形成单细胞悬凝液；然后，向单细胞悬凝液通入终止消化液，以终止消化；
对单细胞悬凝液中的单细胞进行捕获；
通过细胞裂解液对单细胞进行裂解并形成细胞裂解液体；再由扩增酶溶液对细胞裂解液体进行扩增以形成扩增产物。
10.根据权利要求9所述的用于类器官培养以及检测的微流控芯片的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞与凝胶的比例为1：2；
所用类器官消化酶为胰蛋白酶，终止消化液为PBS缓冲液。
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